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  • UNIVERSIT DU QUBEC MONTRAL

    IDENTIFICATION DES FACTEURS DE TRANSCRIPTION LIANT LE

    PROMOTEUR DE L'APOLIPOPROTINE D EN ARRT DE CROISSANCE

    CELLULAIRE

    MMOIRE

    PRSENT

    COMME EXIGENCE PARTIELLE

    DE LA MATRISE EN BIOLOGIE

    PAR

    LOUIS-CHARLES Jr LEYROS

    OCTOBRE 2006

  • UNIVERSIT DU QUBEC MONTRAL Service des bibliothques

    Avertissement

    La diffusion de ce mmoire se fait dans le respect des droits de son auteur, qui a sign le formulaire Autorisation de reproduire et de diffuser un travail de recherche de cycles suprieurs (SDU-522 - Rv.01-2006). Cette autorisation stipule que conformment l'article 11 du Rglement no 8 des tudes de cycles suprieurs, [l'auteur] concde l'Universit du Qubec Montral une licence non exclusive d'utilisation et de publication de la totalit ou d'une partie importante de [son] travail de recherche pour des fins pdagogiques et non commerciales. Plus prcisment, [l'auteur] autorise l'Universit du Qubec Montral reproduire, diffuser, prter, distribuer ou vendre des copies de [son] travail de recherche des fins non commerciales sur quelque support que ce soit, y compris l'Internet. Cette licence et cette autorisation n'entranent pas une renonciation de [la] part [de l'auteur] [ses] droits moraux ni [ses] droits de proprit intellectuelle. Sauf entent contraire, [l'auteur] conserve la libert de diffuser et de commercialiser ou non ce travail dont [il] possde un exemplaire.

  • REMERCIEMENTS

    Mes premiers remerciements iront mon directeur de matrise ric Rassart qui m'a

    fait bnficier de l'exprience acquise dans son laboratoire ainsi que de son encadrement

    qu'il m'a procur. J'ai eu l'honneur de faire partie de son quipe de recherche en biologie

    molculaire, o tout au long de mon cheminement, j'ai su dvelopper l'autonomie et la

    persvrance, tout en profitant de ses connaissances scientifiques.

    J'adresse galement un remerciement au Dr Elsy Edouard pour ses nombreux conseils

    et nos conversations scientifiques et Manuel Buscarlet pour sa supervision lors de mon

    stage.

    Je tiens remercier vivement Sonia Do Carmo pour m'avoir permis de travailler sur

    son projet de doctorat et pour l'encouragement continu qu'elle m'a su apporter.

    Je pense prsent deux personnes: Vronique Voisin et Sverine Landais, pour

    avoir t l pour moi tout au long de ma matrise mais surtout lors de mon sjour d'un mois

    l'hpital.

    Je remercie aussi, toute l'quipe du laboratoire de biologie molculaire. Ils ont tous,

    leurs manires, rendu agrable mon sjour dans ce laboratoire. Particulirement, mes amis

    Patrick Charbonneau et Piotr Bansky, qui sans eux la remise de ce mmoire n'aurait pas eu

    lieu dans les dlais prvus.

    Je n'oublie pas non plus mes chers parents, Louis-Charles et Annette Levros et mes

    frres, Louis-Patrick, Louis-Phil.lippe et Louis-Richard. J'ai une dette incomparable envers

    eux et tout particulirement Mlanie Thomas, grce elle, j'ai pu poursuivre ce chemin

    difficile.

  • TABLE DES MATIRES

    LISTE DES FIGURES VI

    LISTE DES TABLEAUX VII

    LISTE DES ABRVIATIONS VIII

    LISTE DES SYMBOLES XI

    RSUM XII

    INTRODUCTION 1

    CHAPITRE 1 TATS DES CONNAISSANCES 2

    1.1 Historique 2

    1.2 Structure de la protine 2

    1.3 Rles de l'apoD 3

    1.3.1 Le cholestrol 4

    1.3.2 L'acide arachidonique 4

    1.3.3 Les sous-produits de l'hme 5

    1.3.4 Rle multiple de l'apoD 5

    1.4 Expression gnique de l'apoD 6

    1.4.1 Expression tissulaire 6

    1.4.2 Expression cellulaire 6

    1.4.3 Expression associe aux pathologies 7

    1.4.4 Induction de l'apoD in vifro 9

    1.5 Structure du promoteur et du gne 10

    1.5.2 Caractrisation du SRE et de la bote CArG 14

    1.6 Les facteurs de transcription 14

    1.6.1 Rles des facteurs de transcription 15

    1.6.2 Les facteurs de transcription nuclaires rsidents 16

    1.6.3 Les facteurs de transcription liant le SRE 16

    1.7 Conclusion 20

  • IV

    CHAPITRE II MATRlELS ET MTHODES 21

    2.1 Culture cellulaire et induction de l'arrt de croissance 21

    2.2 Extraction des ARN totaux 21

    2.3 Dosage des ARN 22

    2.4 Hybridation de type Northern 22

    2.4.1 Gel d'agarose au formaldhyde 22

    2.4.2 Marquage radioactif d'une sonde d' ADN 23

    2.4.3 Hybridation et lavage des membranes 23

    2.5 Extraction de protines partir de cellules en culture 24

    2.5.1 Extrait cytoplasmiques (CYT) 24

    2.5.2 Extrait nuclaire (NE) 24

    2.5.3 Extraction de protines nuclaires par la mthode rapide 25

    2.5.4 Extraction de protines brutes 25

    2.5.5 Dosage des protines 26

    2.6 Retard sur gel 26

    2.7 Marquage radioactif des oligos 27

    2.8 Purification et identification des protines nuclaires 28

    2.8.1 Purification des protines nuclaires sur billes de fer couples la streptavidine 28

    2.8.2 Coloration au nitrate d'argent 2 8

    CHAPITRE III RSULTATS 29

    3.1 Induction gnique de l'apoD en arrt de croissance 29

    3.2. Analyse de la liaison des squences SRE du promoteur de l'apoD 31

    3.2. Analyse de la liaison des squences SRE du promoteur de l'apoD 32

    3.2.1 Liaison du SRE par des protines extraites par la mthode rapide 32

    3.2.2 Liaison du SRE par des protines extraites par la mthode de Dignam 36

    3.3 Purification des protines liant le SRE sur retard sur gel. 39

    3.4 Purification des protines nuclaires sur billes de fer couples la streptavidine 39

    3.5 Analyse du squenage des protines nuclaires purifies .44

    3.5.1 LePARP-l 44

    3.5.2 Les protines hn RNP A/B ou CBF-A .44

  • v

    3.5.3 Le hnRNP U 46

    3.5.4 Le Kif4 46

    3.5.5 Le BUB3 46

    CHAPITRE IV DISCUSSION 47

    4.1 Liaisons spcifiques au niveau du SRE1 47

    4.2 Purification des protines nuclaires avec la squence biotinyle SRE l-EBS couple aux

    billes de streptavidine 48

    4.3 Le PARP-\ 49

    4.3.1 L'ADP-ribosylation 49

    4.3.2 Implication du PARP-l dans l'apoptose et l'arrt du cycle cellulaire 50

    4.3.3 PARP-l : modulateur transcriptionnel 51

    4.4 Les hnRNPs 51

    4.4.1 Rles des hnRNPs 52

    4.4.2 HnRNP AIB ou CBF-A 52

    4.4.3 Le CBF-A et l'lment cis EBS 53

    4.4.4 Le CBF-A et la bote CA.rG 54

    4.4.5 Le hnRNP U 54

    4.5 Interaction de Kif4 et de PARP-l 55

    4.6 Interaction de BUB3 et de PARP-\ 56

    4.7 Analyse des protines non-spcifques 57

    CHAPITRE V CONCLUSION ET PERSPECTIVES FUTURES 59

    BIBLIOGRAPHIE 61

  • LISTE DES FIGURES

    Figure Page

    1.1 Structure du gne de l'apolipoprotineO humaine Il

    1.2 Retard sur gel des squences SREJ et 2 du promoteur du gne de l'apoO en prsence d'extraits nuclaires provenant de cellules NIH/3T3 13

    1.3 Classification fonctionnelle des facteurs de transcription ayant une action positive 16

    3.1 Induction de l'expression gnique de l'apoO aprs deux jours dans les cellules NIH/3T3 en arrt de croissance 29

    3.2 Induction de l'expression gnique de l'apoO aprs trois jours dans les cellules NfHJ3T3 en arrt de croissance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

    3.3 Retard sur gel de la squence SREI du promoteur du gne de l'apoO en prsence d'extrait brut provenant de cellules NIH!3T3 en croissance et arrt de croissance 33

    3.4 Retard sur gel de la squence SREl du promoteur du gne de l'apoO en prsence d'extraits provenant de cellules NIH!3T3 obtenus par la mthode rapide . . . . . 34

    3.5 Retard sur gel de la squence SREI du promoteur du gne de l'apoD en prsence d'extraits provenant de cellules NIH/3T3 obtenus par la mthode de Oignam .. 36

    3.6 Purification des protines nuclaires sur billes de fer couples la streptavidine . 40

  • LISTE DES TABLEAUX

    Tableau Page

    1. Sites et orientation de l'lment cis : Ets-Binding-Site (EBS), retrouves sur le promoteur du gne de l'apoD, dans la rgion -2128 +66 et ayant pour squence CCGGA/T ou CAGGA . 39

    II Peptides sequencs par spectromtrie de masse (MS/MS) de bandes excises du gel SDS-PAGE 12% (Figure 3.6) . 41

    III Liste des protines identifies en condition de croissance (NE+) et d'arrt de croissance (NE-) et leurs squences en a.a. des peptides tryptiques obtenus par MS/MS . 42

  • A a.a. AA ADP ADN ADNc AlF AMPc AP Apo APP APRE ARNhn ARNm ATP BBP BC BSA BUB3 C CB CBF-A CETP ChiP CK CNS CQ CREB CS CT CTP Ctrl CYT DAG DEX DRA DRT OTT E47

    LISTE DES ABRVIATIONS

    Adnine Acide amin Acide arachidonique Adnosine diphosphate Acide dsoxyribonuclique Acide dsoxyribonuclique complmentaire Facteur induisant l'apoptose Adnosine 3',5'-monophosphate cyclique Protine activatrice Apolipoprotine Alternance de purines et de pyrimidines lment de rponse de phase aigu ARN htrogne Acide ribonuclique messager Adnosine triphosphate Protine liant la biline Complexe binaire Albumine de srum bovin Budding uninhibited by benzimidazo!es 3 Cytosine Complexe binaire Facteur liant la bote CArG Protine de transfert d'ester de cholestrol Immunoprcipitation de la chromatine et amplification par PCR Casine kinase Comptition non spcifique Complexe quaternaire lment de rponse au AMPc Comptition spcifique Complexe tertiaire Cytosine triphosphate Contrle Extrait cytoplasmique Diacy Iglycrol Dexamthasone Acide docosahenoique Dihydroxytestostrone Dithiothritol Squence reconnue par TAL-l

  • IX

    EBS ECL EDTA EGTA E3M2H ERE ETS Exp FSE G GAPDH GCDFP GRE GTP HCOV HDL HnRNP HRE IK IL INS IRF Ka Kb KDa Kif4 KLF2 LCAT LDL MAD MOPS MRE NAD NE NF NFKB NP NPC Oligo OPN 32p

    PDAPP

    PADPr PAGE PARP

    Site d

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