td 4b: pcr - montpellier.inra.fr · détermination de la taille optimale des amorces •...
TRANSCRIPT
![Page 1: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/1.jpg)
TD 4b: PCR
![Page 2: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/2.jpg)
Le principe de la PCR (rappel)
pcrwin.zip
![Page 3: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/3.jpg)
Choix des séquences d’amorces
• Amplification de 5’ vers 3’
Exercice n°6
![Page 4: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/4.jpg)
Détermination de la tailleoptimale des amorces
• Spécificité de l’hybridation assurée par– T° hybridation– longueur de l’amorce
• Longueur optimale de l’amorce fonction de la complexité du génome
Exercice n°7
![Page 5: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/5.jpg)
Hybridation amorce-matriceChoix de la température
– Tm: t° où 50% de l’ADN est double brin– Zone d’accrochage: de 13 à 25 nucléotides– formule empirique Tm = 4(G+C) + 2(A+T)– Température d’hybridation: Tm - 4°C– Un mésappariement est possible, mais pas n’importe où– Tm baisse de 1 à 1,5°C par % de non homologie
Exercices n°8, 21
![Page 6: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/6.jpg)
![Page 7: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/7.jpg)
Exercice n°9
![Page 8: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/8.jpg)
Amplifier l’ARN: la RT-PCR
A
BA
A
Reverse transcriptase
ADN polymerase
Amplification cyclique
![Page 9: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/9.jpg)
Quantifier l’ADN:la PCR quantitative
96 Replicates
-1.00E-01
4.00E-01
9.00E-01
1.40E+001 6
11 16 21 26 31 36
Cycle Number
Analyse temps réel
Analyse point Final
Detection de fluorescence au cours d’une PCR
![Page 10: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/10.jpg)
Les chimies fluorescentes
http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Life_Science/Molecular_Biology/PCR/Product_Lines/Quantitative_PCR.html
![Page 11: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/11.jpg)
La chimie Taqman
5’3’
5’5’3’
5’
Amorce sens
Amorce anti-sens
Sonde TaqMan®
R Qp
FRET
Quenching
![Page 12: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/12.jpg)
L’activité exonucléasique de la polymérase décrochele reporter qui émettra de la fluorescence après
excitation par un laser à 500 nm
R
p3'
p3'
p3'
p3'
QR
QR
Q
QR ProbeForward Primer
3' 5'
5' 3'
Reverse Primer
5'
5'
R = ReporterQ = Quencher
Polymerisation
3' 5'
5' 3'
5'
5'
Déplacement de la sonde
3' 5'
5' 3'
5'
5'
Clivage
3' 5'
5' 3'
5'
5'
Polymerisation terminée
![Page 13: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/13.jpg)
Système de détection
Intégré dans un seul instrument
Détection en temps réel des produits de PCR
Detection de lafluorescence
PCRde L'échantillon
Preparation Analyse spécifique à l'application
ABI Prism 7700
![Page 14: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/14.jpg)
Plusieurs types de fluorophorespossibles
![Page 15: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/15.jpg)
Ct: cycle au cours duquel démarre la phase exponentielle de la PCR
-2.00E-02
0.00E+00
2.00E-02
4.00E-02
6.00E-02
8.00E-02
1.00E-01
20 22 24 26 28 30
96 replicats
CYCLE SEUIL(Ct)
Seuil de Détection(Threshold)
Cycles
Phase exponentielle
![Page 16: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/16.jpg)
Equation de l’amplification de la PCR
Xn = Xo x (1 + Ex)n
Xn = nombre de cibles au cycle nXo = nombre initial de molécules ciblesEx = efficacité de la PCRn = nombre de cycles de PCR
![Page 17: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/17.jpg)
• Ct est proportionnel au nombre de cibles àamplifier
• Ct est reproductible d’une amplification àl’autre
Dilutions au 1/5è
![Page 18: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/18.jpg)
Conditions pour une PCR quantitative multiplex sur ABI Prism 7700 (Maïs)
• Tampon d’enzyme• Nucléotides: dATP, dCTP, dGTP, dUTP• Uracile N-Glycosylase (UNG)• Chlorure de magnésium• Oligonucléotides: LTP1 et LTP2• Sonde TaqMan LTP: VIC 5’-----------------3’ TAMRA• Oligonucléotides: 35S1 et 35S2• Sonde TaqMan 35S: FAM 5’-----------------3’ TAMRA• ADN polymérase• ADN génomique (100 ng)• Eau distillée stérile (qsp 25 μl)
![Page 19: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/19.jpg)
Conditions d’amplification
•2 Températures : Chimie TaqMan®
•Tm des amorces : 60°C
•Tm de la sonde : + 7 à 12 °C
Collection des données Activation del'AmpliTaq Gold
Activation del'UNG
UNG: uracyle N-glycosylase:évite unecontamination par le produit pré-amplifié
![Page 20: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/20.jpg)
Détermination d’une courbe standard
Pente efficacité de la PCR (p=3,32 -> E=100%)
Ct = a x log (Qté ADN cible) + b
Ex = [10(1/a) - 1] x 100
![Page 21: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/21.jpg)
Efficacité identique pour deuxéchantillons: dosage comparatif possible
Réference
Gène 1
Gène 2
Pente : -3,44
E = 95%
Ech 2
Ct gène 1
Ct gène ref
Qté gène 1 Qté gène ref
![Page 22: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/22.jpg)
Application: dosage de transgènes• Préparation d’une gamme étalon
– détermination de la quantité d’ADN total– détermination de la quantité d’ADN transgénique
quantité ADN total (ng) 200 100 50 25 5 2,5quantité ADN transgénique (ng) 4 2 1 0,5 0,1 0,05
Ct
log (Qté ADN total (ng))
Ct
log (Qté ADN transgénique (ng))
Ct = a x log (Qté ADN total) + b
Ct = a’ x log (Qté ADN transgénique) + b’
% d’OGM contenu dans l’échantillon = Qté d’ADN transgénique/Qté totale d’ADN x 100
Amplification d’un gène de référence Amplification d’une séquence du transgène
Exercice n°35
![Page 23: TD 4b: PCR - montpellier.inra.fr · Détermination de la taille optimale des amorces • Spécificité de l’hybridation assurée par – T° hybridation – longueur de l’amorce](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022021911/5c1cf20b09d3f2590e8b9dcc/html5/thumbnails/23.jpg)
Utilisation: détection de SNP(single nucleotide polymorphism)
VICVIC FAMFAM
2 sondes allèle spécifiques
FAMFAM TAMRAVICVIC TAMRAAllele 2Allele 2
Allele 1Allele 1FAMFAM TAMRAVICVIC TAMRA
Clivage inefficace en cas de mismatch