TD 4b: PCR
Le principe de la PCR (rappel)
pcrwin.zip
Choix des séquences d’amorces
• Amplification de 5’ vers 3’
Exercice n°6
Détermination de la tailleoptimale des amorces
• Spécificité de l’hybridation assurée par– T° hybridation– longueur de l’amorce
• Longueur optimale de l’amorce fonction de la complexité du génome
Exercice n°7
Hybridation amorce-matriceChoix de la température
– Tm: t° où 50% de l’ADN est double brin– Zone d’accrochage: de 13 à 25 nucléotides– formule empirique Tm = 4(G+C) + 2(A+T)– Température d’hybridation: Tm - 4°C– Un mésappariement est possible, mais pas n’importe où– Tm baisse de 1 à 1,5°C par % de non homologie
Exercices n°8, 21
Exercice n°9
Amplifier l’ARN: la RT-PCR
A
BA
A
Reverse transcriptase
ADN polymerase
Amplification cyclique
Quantifier l’ADN:la PCR quantitative
96 Replicates
-1.00E-01
4.00E-01
9.00E-01
1.40E+001 6
11 16 21 26 31 36
Cycle Number
Analyse temps réel
Analyse point Final
Detection de fluorescence au cours d’une PCR
Les chimies fluorescentes
http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Life_Science/Molecular_Biology/PCR/Product_Lines/Quantitative_PCR.html
La chimie Taqman
5’3’
5’5’3’
5’
Amorce sens
Amorce anti-sens
Sonde TaqMan®
R Qp
FRET
Quenching
L’activité exonucléasique de la polymérase décrochele reporter qui émettra de la fluorescence après
excitation par un laser à 500 nm
R
p3'
p3'
p3'
p3'
QR
QR
Q
QR ProbeForward Primer
3' 5'
5' 3'
Reverse Primer
5'
5'
R = ReporterQ = Quencher
Polymerisation
3' 5'
5' 3'
5'
5'
Déplacement de la sonde
3' 5'
5' 3'
5'
5'
Clivage
3' 5'
5' 3'
5'
5'
Polymerisation terminée
Système de détection
Intégré dans un seul instrument
Détection en temps réel des produits de PCR
Detection de lafluorescence
PCRde L'échantillon
Preparation Analyse spécifique à l'application
ABI Prism 7700
Plusieurs types de fluorophorespossibles
Ct: cycle au cours duquel démarre la phase exponentielle de la PCR
-2.00E-02
0.00E+00
2.00E-02
4.00E-02
6.00E-02
8.00E-02
1.00E-01
20 22 24 26 28 30
96 replicats
CYCLE SEUIL(Ct)
Seuil de Détection(Threshold)
Cycles
Phase exponentielle
Equation de l’amplification de la PCR
Xn = Xo x (1 + Ex)n
Xn = nombre de cibles au cycle nXo = nombre initial de molécules ciblesEx = efficacité de la PCRn = nombre de cycles de PCR
• Ct est proportionnel au nombre de cibles àamplifier
• Ct est reproductible d’une amplification àl’autre
Dilutions au 1/5è
Conditions pour une PCR quantitative multiplex sur ABI Prism 7700 (Maïs)
• Tampon d’enzyme• Nucléotides: dATP, dCTP, dGTP, dUTP• Uracile N-Glycosylase (UNG)• Chlorure de magnésium• Oligonucléotides: LTP1 et LTP2• Sonde TaqMan LTP: VIC 5’-----------------3’ TAMRA• Oligonucléotides: 35S1 et 35S2• Sonde TaqMan 35S: FAM 5’-----------------3’ TAMRA• ADN polymérase• ADN génomique (100 ng)• Eau distillée stérile (qsp 25 μl)
Conditions d’amplification
•2 Températures : Chimie TaqMan®
•Tm des amorces : 60°C
•Tm de la sonde : + 7 à 12 °C
Collection des données Activation del'AmpliTaq Gold
Activation del'UNG
UNG: uracyle N-glycosylase:évite unecontamination par le produit pré-amplifié
Détermination d’une courbe standard
Pente efficacité de la PCR (p=3,32 -> E=100%)
Ct = a x log (Qté ADN cible) + b
Ex = [10(1/a) - 1] x 100
Efficacité identique pour deuxéchantillons: dosage comparatif possible
Réference
Gène 1
Gène 2
Pente : -3,44
E = 95%
Ech 2
Ct gène 1
Ct gène ref
Qté gène 1 Qté gène ref
Application: dosage de transgènes• Préparation d’une gamme étalon
– détermination de la quantité d’ADN total– détermination de la quantité d’ADN transgénique
quantité ADN total (ng) 200 100 50 25 5 2,5quantité ADN transgénique (ng) 4 2 1 0,5 0,1 0,05
Ct
log (Qté ADN total (ng))
Ct
log (Qté ADN transgénique (ng))
Ct = a x log (Qté ADN total) + b
Ct = a’ x log (Qté ADN transgénique) + b’
% d’OGM contenu dans l’échantillon = Qté d’ADN transgénique/Qté totale d’ADN x 100
Amplification d’un gène de référence Amplification d’une séquence du transgène
Exercice n°35
Utilisation: détection de SNP(single nucleotide polymorphism)
VICVIC FAMFAM
2 sondes allèle spécifiques
FAMFAM TAMRAVICVIC TAMRAAllele 2Allele 2
Allele 1Allele 1FAMFAM TAMRAVICVIC TAMRA
Clivage inefficace en cas de mismatch