RICHER Pierre/ RAOUI Zakaria 01/10/21 M. Chollet-Krugler Chimie analytique

Diapo disponible mais contenu manquant / formules pas à connaître mais à savoir exploiterRevoir cours de l’année dernière sur les titrages pour le TD de la semaine prochaine4 cours sur la chromatographie : méthode d’analyse très répandue

MÉTHODES DESÉPARATIONS

CHROMATOGRAPHIQUESPlan des différents coursI- Généralités sur les méthodes chromatographiquesII- Théorie de la chromatographieIII- Analyse quantitative et qualitativeIV- Chromatographie liquide Haute performance : CLHPV- Chromatographie en phase gazeuse CPG

Plan de ce cours:I- Qu’est-ce que la chromatographie?II - Classification des méthodes chromatographiquesIII- Le chromatographeIV - ApplicationsV- Terminologie générales

I. Qu’est-ce qu’une chromatographie ?

● Méthode de séparation, d’identification et de quantification d’espèces chimiques présentesdans un mélange complexe; (méthode très répandue et applications très générales).

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● Séparation basée sur les différences d’affinités qui peuvent présenter deux ou plusieurscomposés pour 2 phases non miscibles (toujours): (chaque composé aura une affinité différente vis àvis des 2 phases)

○ Fixe appelée phase stationnaire/fix = PS (solide ou liquide fixé sur un support solidec’est à dire qu’on peut immobiliser sur la surface d’un solide)

○ Mobile appelée phase mobile = PM (liquide ou gaz ou fluide supercritique)● Mise en jeu de plusieurs processus physicochimiques pour la rétention.

Ex : Molécule organique soluble avec la phase stationnaire

Dans la colonne (voir schéma) :- Phase stationnaire en verte (à l’intérieur de la colonne)- Phase mobile en noir- Phase stationnaire, le soluté est en rouge (extrait qui a été déposé)

Chaque soluté n’aura pas la même affinité pour la phase stationnaire et la phase mobile.Il y a 2 constituants dans le mélange, les particules noires vont être élués moins vite car elles ont plusd’affinités pour la phase stationnaire.

Quelques dates importantes :1906 : Découverte de phénomène chromatographie par M. TSWETT

● Séparation de pigments végétaux colorés sur une colonne remplie de carbonate de calciumpulvérulent, les pigments sont élués avec de l’éther de pétrole (observation de bandes coloréesqui se détachent) ;

● A donné son nom à la chromatographie (du grec chroma signifie “couleur” et graphein signifie“écrire”)

1940 : MARTIN et SYNGE développent la pratique et la théorie de la chromatographie, prix Nobel reçuen 1952

1955 : Première chromatographie gazeuse (MARTIN et JAMES) (première appareillage commercialiser)

1967 : Début de la chromatographie liquide haute performance (HUBER et HUZSMAN)

Pourquoi il y a séparation ?- Au cours d’une chromatographie, chaque constituant du mélange (appelé solutés, ou analytes)

● il y a une séparation car au cours de la chromatographie chaque constituant du mélange (soluté)est soumis à une force de rétention (exercée par la PS) et à une force de mobilité exercée parla PM.

● Mise en jeu d’un processus physicochimique différents en fonction de la nature de l’analyte● Plus le trajet de séparation est long, plus les constituants seront séparés les uns les autres.

Cette force de rétention et de mobilité est propre à chaque constituant (on parle de constante dedistribution). Chaque constituant aura sa propre constante de distribution vis à vis des deux phases.

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Comment identifier un soluté dans un mélange ?● Comparaison de son niveau de migration avec celui d’une espèce chimique connue ou espèce

de référence (témoin) en se plaçant dans les mêmes conditions expérimentales, parfoisaléatoire (échantillon déposés sur des plaques de silice afin d’effectuer des comparaisons)

○ 2 composés peuvent avoir le même temps de rétention donc c’est aléatoire.● Autre manière plus sûre : couplage avec une technique d’analyse complémentaire

(spectrométrie de masse qui est très utilisée en couplage avec la chromatographie, spectrométrieinfrarouge, spectrométrie RMN…)

II. Classification des méthodes chromatographiques

Plusieurs critères :

A. Selon les modalités de migration

2 méthodes :

- Chromatographie sur colonne ou chromatographie d’élution :PS maintenue dans un tube étroit (colonne) et PM y progresse par gravité ou sous pression. Chaquecomposé est récupéré (élué) en sortie de la colonne à des instants différents.

- Chromatographie planaire ou de développement :PS présente à la surface d’un support plat (ex : plaque de silice) et PM se déplace à travers la PS parcapillarité.Pas d’étape d’élution mais il est possible de récupérer les composés par grattage de la plaque

(→ pas de récupération des composés en sortie de colonne pour cette méthode)

Rq : Le composé vert a le rapport frontal le plus élevé et le temps d’élution/ de rétention le plus faible

B. Selon la nature de la PM

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3 catégories :● Liquide : chromatographie en phase liquide : CPL (LC, Liquid Chromatography)● Gazeuse : chromatographie en phase gazeuse : CPG (GC, Gas chromatography)● Fluide supercritique (ex: CO2 très utilisé) : chromatographie en Phase Supercritique : CFS (SFC,

Supercritical Fluid Chromatography)(supercritique : à la fois les propriétés d’un gaz et celle d’un liquide)

C.Selon la nature de la phase stationnaire (PS)

4 catégories :

Liquide : liquide fixé sur un support solide inerte (surface greffée)Solide :- *adsorbant solide (silice)- *résine échangeuses d’ions (polymère chargé)- *solide poreux

D.Selon le phénomène physicochimique

6 catégories :

● Chromatographie de partage (très répandu en pharmacie) (différence de solubilité dans les 2phases selon leur coefficient de partage) Il faut que la PS soit liquide

● Chromatographie d'adsorption (formation de liaisons entre les solutés et la surfaceadsorbante, coefficient d’adsorption)

● Chromatographie par échanges d’ions (séparation des composés ioniques par desinteractions électrostatiques avec des composants de charges opposées, coefficient d’échangesd’ions)

● Chromatographie d’exclusion diffusion (séparation en fonction de la taille des molécules, c’estle coefficient de diffusion mis en jeu) utilisé pour un solide poreux.

● Chromatographie par formation de paires d’ions (interactions électrostatiques + effetshydrophobes)

● Chromatographie d’affinité (interactions spécifiques avec le ligand) stérique par exemple.

Le choix du procédé de séparation chromatographique dépend de :- la structure- la masse molaire- des propriétés physico-chimique- du caractère ionique de la molécule à séparer

(encouragement à regarder le tableau ci-dessous : c’est un résumé)

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III. Le chromatogramme

Si détecteur en sortie de colonne ; l’enregistrement appelé chromatogramme, traduit la variation dela concentration en soluté au cours du temps.

Ce que l’on observe :● On a déposé trois constituants en haut de la colonne et en sortie de colonne (à gauche) on

observe 3 pics correspondant aux 3 constituants. Chacun de ces pics possède un pic qui lui estpropre et est défini par un temps de rétention qui lui est propre. On va pouvoir donc déterminer letemps de rétention pour faire l’identification de chaque pic et grâce à ce temps de rétention, onva pouvoir effectuer de l’analyse qualitative.

● La deuxième information importante est qu’on a aussi accès à la surface des pics et l’air despics sera exploité pour pouvoir faire de l’analyse quantitative (accès à la surface du pic parintégration)

*Série de pics :- Position des pics (Tr) sur l’axe permet l’analyse qualitative- Aire des pics exploitée pour l’analyse quantitative

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IV. Domaines d’applications

● Très répandues car couvrent tous les domaines de l’analyse (pharmaceutique, toxicologique,biochimique, agroalimentaire,...)

● 45% chiffre d’affaires de l’instrumentation de l’analyse moléculaire

V. Terminologie générale de la chromatographie

Soluté (composé, analyte): toute substance constituant d’un mélange, séparée par chromatographie

Phase mobile ou éluant : le vecteur, liquide ou gazeux, qui déplace le soluté au travers de la PS

Phase stationnaire : le produit, qui par ses affinités avec les solutés va permettre leur séparation quandla PM les déplace (constituée d’un support).

Support : une particule inerte, de diamètre variable qui porte la PS (PS=support + molécule greffée sur cesupport)

Remplissage : l’ensemble des produits (adsorbant , support, PS …) qui garnissent une colonne dechromatographie

Colonne chromatographique : tube de diamètre et longueur variable, en verre, en métal, ou autresubstance à l’intérieur duquel s’opèrent les séparations chromatographiques.2 types:➔ Colonne remplie : l’ensemble des produits garnissent entièrement la colonne➔ Colonne capillaire : la PS tapisse la paroi interne de la colonne sous forme d’un film (surtout

pour la chromatographie en phase gazeuse)- Elles ont des propriétés différentes

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THÉORIE DE LACHROMATOGRAPHIE

Partie compliqué : bien comprendre la définition dechaques paramètres

Questions :- Pour quelle raison les composés sont-ils séparés en sortie de colonne ?- Pour quelle raison les pics s’élargissent-ils ?- Comment améliorer une séparation chromatographique ?

→ Conclusion : 2 paramètres primordiaux en chromatographie : rétention et largeur du pic

I. Paramètres caractérisant la rétention

HPLC (chromatographie en phase liquide haute performance)Température : température de la colonneDétecteur UV importantTm : temps mort

A.Temps de rétention tR (indice) (figure 2, tra = 3 min)7

Utilisé en chromatographie de partage, ionique d'absorption

● TRa : temps écoulé entre l’introduction du composé A sur la colonne et le moment ou la substancesort à sa concentration maximale

● TR : dépend du composé et des conditions expérimentales/ d’analyse (colonne, t°, PS, débit, PM,etc)

B.Volume de rétention ou volume d’élution VR (fig 2, Vra = 3 x 2= 6 mL)

(Toutes les formules surlignées en orange ne seront pas à connaître : il faut savoir les utiliser)

● VRa : volume de la PM nécessaire pour éluer le composé A à sa concentration maximale. (mL)● Si D est le débit de la PM :

C.Temps mort : Tm (fig 2, Tm = 1 min)

● Tm: temps que met la PM (ou un soluté non retenue sur la PS) pour traverser la colonne

En CPG, le Tm correspond au temps de rétention de substances non retenues comme l’air ou leméthane.Le pic n’a pas forcément une forme précise

D.Volume mort : Vm (fig 2, Vm = 2 mL)

● Vm : Volume de la PM nécessaire pour traverser la colonne pendant le temps tm, correspondantau volume occupé par la phase mobile dans une colonne (volume interstitiel)

● Vm peut être aussi calculé à partir de la porosité epsilon ε qui caractérise une colonnechromatographique et du volume interne de la colonne V int (volume d’un cylindre)

E. Vitesse linéaire de la PM (fig 2, u = 15 cm/min)

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La Pm est caractérisée par sa vitesse linéaire u : distance parcourue dans la colonne de longueur L parunité de temps :

L et VM sont des caractéristiques de la colonne, si on augmente le débit on augmente la vitesse.

F. Volume et temps de rétention réduits V’r ET t’R (fig 2, t’Ra = 2min et V’Ra = 4 mL)

● t’RA : temps passé par le composé A dans la PS, ne tient pas compte du temps TM que met lecomposé pour parcourir les interstices de la colonne :

G.Coefficient (constante) thermodynamique de distribution(partage) K

Faire attention, dans le cours il y aura deux K qui n’ont pas la même signification

Toutes les séparations chromatographiques sont basées sur les différences de répartition des solutésentre la PM et la PS

Pour le soluté A, le coefficient de distribution K caractérise l’équilibre de A entre les deux phases :

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H. Facteur de rétention k ou k’ (facteur de capacité, Fig 2 k’A =2) elle utilise k’

k’ : rapport de la quantité d’un même soluté entre la PS et la PM :

paramètre β = rapport de phases = constante qui caractérise une colonne

Détermination expérimentale à partir du chromatogramme

k’ : aussi rapport du temps passé par une espèce dans la PS sur le temps passé par cette mêmeespèce dans la PM. Détermination expérimentale à partir du chromatogramme

(formule bcp utilisée)

k’ < 1 : le composé sort trop tôtk’ = 1 - 5 : idéalk’ > 20 : durée d’élution trop longue

A partir des relations (1) et 2) : nouvelle expression qui relie les paramètres expérimentaux au coefficientthermodynamique de distribution K, expression valable pour une chromatographie idéale (rapport Cs /Cm constant durant toute l'élution)Si le produit n’a aucune affinité pour la PS : K = 0 et donc Vr=Vm

II. Largeur des pics en chromatographie

Pics d’élution ressemblent beaucoup aux courbes d’erreurs de Gauss : étalement symétrique desvitesses d’élution autour d’une valeur moyenne.

→ Paramètres caractéristiques d’un pic gaussien :

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On prend différentes largeurs à différentes hauteurs du pic.

A. Asymétrie de pic- En théorie : pic d’élution = courbe de Gauss- En réalité : asymétrie de pic observée

B. Modèle des plateaux théoriques - notion d’efficacité

● L'efficacité d’une colonne dépend du degré d’élargissement du pic.● Différentes théories avancées pour modéliser la chromatographie mais aucune strictement valable● N : chiffre l’efficacité d’une colonne :

○ + N est élevé + la colonne est efficace (et donc pic étroit (σ petit))○ + le pic est large, - la colonne est efficace

Théorie de Martin et Synge en 1952 :

● Colonne de N plateaux théoriques = colonne divisée en N petits disques cylindriques successifs.

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● Chaque plateau théorique représente une étape pendantlaquelle se produit des échanges du composé entre les PSet PM

● Cela suppose que l’état d’équilibre du soluté est atteintentre la PM et la PS avant le passage au plateau suivant,et qu’il n’y a pas de diffusion longitudinale

→ N déterminé à partir d’un chromatogramme, selon les formules (1), (2) ou (3)

2σ = largeur du pic au point d’inflexion

ATTENTION : Tr, ω, δ et σ doivent être exprimés avec la même unité→ Pour calculer N, on choisit généralement le pic correspondant au composé le plus retenu.

Si on remarque que le N d’une colonne diminue, on doit penser à changer cette colonne car elle devientmoins efficace (voir figure 6).

C.Hauteur équivalente à un plateau théorique H (ou HEPT)

Connaissant la longueur de la colonne L et le nombre de plateaux théoriques N, on définit H = hauteuréquivalente à un plateau théorique. Plus le nombre de plateaux est élevé, plus la colonne est efficace.

Pic chromatographique d’allure gaussienne :

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Relation (1) et (2) : —> toujours pas à apprendre

Plus H est faible, plus la dispersion est faible, plus l’étalement de la bande est réduit, plus le pic estétroit.

Valeurs de H :- 0,1 à 1 mm en CPG- Environ 10 microns en CLHP

Exemple : comparaison schématique de 2 colonnes d’efficacité différente :

Pics extrêmement fins quand il y a un nombre de plateaux importants (plus le nb de plateaux estimportants dans la colonne plus le pic est étroit).

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