les techniques chromatographiques- mémoire ich05

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Les techniques chromatographiques

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CHAPITRE VI : Les techniques chromatographiques

Introduction

Pour appréhender l’analyse d’un mélange complexe, l’étape de séparation des constituants

de ce mélange est primordiale. Cette étape, si elle remplit ces objectifs, permet la distinctionde tous les composés présents, en retenant différemment les produits de façon à assurer leurarrivée séquentielle au niveau du détecteur.

La chromatographie constitue la technique la plus utilisée en matière de séparation. Celle-ci peut être mise en œuvre sous différentes formes, en fonction surtout du type de phase

étudiée (liquide ou gazeuse). [5]

1. Général i tés sur l es méthodes chromatographiques

La chromatographie est un procédé de séparation des constituants d’un mélange. Elle est

devenue une méthode analytique de tout premier plan pour identifier et quantifier lescomposés d’une phase liquide ou gazeuse homogène. Le principe de base repose sur leséquilibres de concentration des composés présents, entre deux phases non miscibles dontl’une, dite stationnaire, est emprisonnée dans une colonne ou fixée sur un support et l’autre,dite mobile, se déplace au contact de la première. L’entraînement à des vitesses d ifférentes

des composés présents par la phase mobile conduit à leur séparation. De toutes les méthodesanalytiques instrumentales, la chromatographie est celle qui a le plus grand domaine

d’applicabilité et par là elle occupe une position dominante. [24]

1.1 Le processus chr omatographique

Lors du processus chromatographique, les composées du mélange à analyser (de

pressions de vapeur, de masses moléculaires, de solubilités et de chaleurs d’adsorption, etc.variées) se répartissent entre une phase fixe contenue dans une colonne et une phase mobileservent à transporter les solutés au travers de celle-ci. On suppose qu’il existe en tout point de

la colonne un équilibre thermodynamique caractérisé par un coefficient de partage K. lesdifférences d’affinité des solutés pour la phase stationnaire conduisent à des rétentionsdifférentes, de telle sorte que les composés arrivent individuellement, à des temps différents,

en sortie de la colonne. La rétention d’un soluté par la phase stationnaire sera d’autant plusélevé que le coefficient de partage sera élevé.

La détection des composés élués est obtenue par connexion de la colonne à un appareil

physique ou chimique capable de détecter les molécules sortant de la colonne en présence dela phase mobile. Pour identifier avec succès les composés présents dans l’échantillon, ils

doivent être séparés efficacement et la quantité de matières éluée doit être suffisante pour ê tredétectée par le détecteur. [5]


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1.2 L’apparei ll age chromatographique

L’appareillage se compose principalement d’un système d’injection de l’échantillon,d’une colonne permettant la séparation des solutés et d’un détecteur assurant la détection des

espèces séparées comme le montre la figure 1.

Figure 1 : Principales composantes d’un système chromatographique.

L’injecteur

Le système d’injection peut jouer plusieurs rôles, que l’échantillon soit solide, liquide ou

gazeux :

Un rôle d’interface qui permet d’introduire l’échantillon dans le chromatographe,

Un rôle de système de vaporisation dans le cas des liquides et des solides,

Un rôle d’organe de transfert dans la colonne chromatographique.

Plus précisément, un système d’injection idéal devrait possédait les caractéristiques

suivantes :

Assurer une récupération représentative de l’échantillon, sans discrimination,

Avoir une répétabilité et une justesse suffisantes pour permettre l’analyse

quantitative,

Avoir un volume mort minimum afin d’éviter l’élargissement de la banded’injection, mais néanmoins une capacité d’élution suffisante.

Différents types d’injecteurs existent. Certains sont spécifiques alors que d’autres sontd’un usage plus général.

La colonne

La colonne constitue une partie primordiale du système chromatographique, car c’estd’elle dont dépend le succès des séparations. Avec un bon équipement et de bonnes conditionsopératoires, l’analyse ne vaut que ce que valent la colonne et le détecteur. La séparationcomplète d’un mélange peut être obtenue suivant la sélectivité et l’efficacité de la colonneutilisée.

Le détecteur

Le détecteur est un appareil ou dispositif de mesure physicochimique. [5]

DétecteurColonne Injecteur Fluide

vecteur

Injection du mélange Séparation


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1.3 L es grandeurs fondamentales de la chromatographie

Deux approches, dites théories cinétique et thermodynamique, ont été introduites pourdécrire les processus chromatographiques. Celles-ci donnent lieu à deux catégories de

grandeurs fondamentales, les grandeurs thermodynamiques et les grandeurs cinétiques.a) Les grandeurs thermodynamiques

Les grandeurs thermodynamiques caractérisent la rétention des solutés.

Le coeff i cient (ou constante) de distr i bution de Nernst (K)

C’est le paramètre physicochimique de base en chromatographie qui quantifie le

rapport de concentration de chaque composé entre les deux phases en présence.

1)

Les valeurs de K sont très variables. Elles sont grandes lorsque la phase mobile est un

gaz, et petites lorsque les deux phases sont à l’état condensé. Chaque composé n’occupantqu’un espace limité de la colonne et de plus avec une concentration variable, les valeursvraies de CS et de CM ne sont pas accessibles mais leur rapport est constant.

Les grandeurs de rétent ion

Pour traduire quantitativement la rétention, une des grandeurs suivantes est utilisée :

Le temps de rétention : il correspond au temps mis par le composé pour être

élué par la colonne chromatographique. Plus exactement, il représente le tempsécoulé entre l’instant de l’injection et celui qui correspond sur lechromatogramme au maximum du pic qui lui est lié. Dans le cas idéal estindépendant de la quantité injectée. Il se décompose en deux termes, le temps

mort, ( ) temps nécessaire pour parcourir les volumes vides de la colonne(en pratique, c’est le temps de passage d’un composé non retenu) et le temps

passé dans la phase stationnaire,

La différence entre le temps de rétention et le temps mort est désignée par le

temps de rétention réduit du composé

2)


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Le volume de rétention (ou d’élution) VR : il correspond au volume de phasemobile nécessaire pour éluer le composé. Sur le chromatogramme, il correspondau volume de la phase mobile qui s’est écoulé entre l’instant de l’injection etcelui correspondant au maximum du pic. Si le débit D de la phase mobile est

stationnaire,

3)

Le facteur de capacité (ou de rétention) k ’ : c’est le temps passé par le soluté dansla phase stationnaire par rapport à celui passé dans la phase mobile. Il est définien régime isocratique. Ce n’est pas une constante, bien qu’il ne varie pas avec le

débit ou la longueur de la colonne, car il dépend des conditions opératoires.Dans la mise au point des séparations on fait en sorte que k ’ ne dépasse pas 10,afin de ne pas trop allonger le temps de passage des composés.

4)

Avec :

: Volume de la phase i,: Temps du soluté passé dans la phase i,

i : Désigne la phase S (stationnaire) ou M (mobile).

La sélecti vitéet la résolut ion

Ces deux grandeurs définissent la position relative de deux piques

chromatographiques.

La sélectivité α (ou facteur de séparation) mesure la différence d’énergie libre

de dissolution des solutés. Il ne peut, par définition, être inférieur à 1,

5)


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La résolution R caractérise la séparation des pics. Il traduit numériquement la

plus ou moins bonne séparation entre deux composés, il est calculé à partir duchromatogramme.

6)

ω1 et ω2 étant les largeurs à la base des pics 1 et 2,N : Nombre de plateaux théoriques.

En pratique, une séparation totale est obtenue pour une résolution de 1.

b) L es grandeurs cinétiques

L’aspect cinétique de la chromatographie concerne la largeur et la finesse des picschromatographiques. Le pic étant considéré comme gaussien, la f inesse s’exprime par le

nombre N de plateaux théoriques de la colonne selon la relation suivante :

7)

Avec :L : longueur de la colonne,H : Hauteur d’un plateau théorique (HEPT ; Hauteur Équivalente à un Plateau Théorique).

Le paramètre influençant la valeur de N concerne essentiellement ω, en effet, onconstate expérimentalement qu’un accroissement du temps de rétention ne modifie que

modérément le nombre de plateaux théoriques.

c) La vi scosi téet la perte de charge

La perte de charge en colonne est donnée en première approximation par la loi deDarcy :

8)


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Avec :Perte de charge en pascal (Pa),

Viscosité de la phase mobile (Pa.s) (*),L : Longueur de la colonne (m),µ : Vitesse linéaire de la phase mobile (m.s-1),

Diamètre des particules de phase stationnaire (m),Facteur de résistance à l’écoulement (nombre sans dimension dont la valeur dépend de la

méthode de remplissage de la colonne et de la sphéricité ou de la non-sphéricité de la phasestationnaire).(*) Dans de nombreuses tables, les viscosités sont données en centipoise (cP). On a :1 cP = 10-3 Pa.s [5] [24] [25] [26]

1.4 Le chromatogramme

Le chromatogramme (figure 2) est une courbe qui traduit la variation au cours du temps

d’un paramètre relié à la concentration instantanée du soluté en sortie de la colonne. Le temps(ou très rarement le volume d’élution) est porté en abscisse et la concentration (l’intensité dusignal de détection) en ordonnée. La ligne de base correspond au tracé obtenu en l’absence ducomposé élué. La séparation est complète quand le chromatogramme présente autant de picschromatographiques revenant à la ligne de base qu’il y a de composés dans le mélange àanalyser. [24]

Figure 2 : Les caractéristiques d’un chromatogramme. [27]


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1.5 Analyse quantitati ve par chromatographie

Pour calculer la concentration massique d’un composé responsable d’un pic sur lechromatogramme il faut réunir deux conditions :

Disposer d’un échantillon authentique du composé que l’on veut doser, à usage deréférence, pour déterminer la sensibilité du détecteur à son égard,

Disposer d’un moyen logiciel ou autre pour connaître soit les hauteurs soit les aires

des différents pics d’élution d’intérêt.

Toutes les méthodes de quantification en chromatographie sont donc des méthodes

comparatives et non pas absolues.

Pour un réglage donné de l’appareil, on admet qu’il existe pour chaque pic du

chromatogramme une relation linéaire entre son aire (ou sa hauteur) et la quantité du composéresponsable de ce pic dans l’échantillon injecté. Cette relation est valable pour une plage de

concentrations qui dépend du détecteur employé. On traduit cette hypothèse par :

9)

Avec :: Masse du composé i injecté dans la colonne,

: Coefficient de réponse absolu du composé i,: Aire du pic d’élution du composé i.

Le coefficient absolu (à ne pas confondre avec le coefficient de partage), dépend duréglage du chromatographe. Ce n’est pas un paramètre intrinsèque du composé.

Pour calculer le coefficient d’un composé i, il faut, d’après cette relation, connaître

l’aire et la masse traversant la colonne. Or cette masse est difficile à déterminer avec

précision, car elle dépend à la fois de la seringue et de l’injecteur (en CPG) ou de la boucled’injection (en CL).

Il existe plusieurs méthodes qui permettent de calculer la concentration d’un soluté

séparé par la colonne :

Méthode de l’étalonnage externe,

Méthode de l’étalonnage interne,

Méthode par normalisation interne.


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Dans notre cas on utilisera la méthode de l’étalonnage externe.

Méthode de l’étalonnage externe

Cette méthode permet de calculer la teneur (en termes de concentration ou de

pourcentage massique) d’un ou plusieurs constituants apparaissant séparés sur lechromatogramme, même en présence d’autres composés donnant des pics non résolus. Facilede mise en œuvre, elle correspond à l’application d’un principe commun à beaucoup dedosages.

Le procédé repose sur la comparaison de deux chromatogrammes obtenus

successivement sans changer les conditions de réglage de l’appareil. Le premier est unchromatogramme de référence acquis à partir d’une solution de référence (conc. C réf ) dans unsolvant, du composé qui fait l’objet du dosage. On injecte un volume V de cette solution et onrepère sur le chromatogramme l’aire A

réf du pic correspondant. Le second résulte de

l’injection d’un volume identique V de l’échantillon en solution, contenant le composé à

doser (conc. Céch). Soit Aéch l’aire du pic correspondant. Puisque les volumes injectés sontégaux, il y a proportionnalité entre les aires, qui dépendent des masses injectées, et lesconcentrations correspondantes ( ). La relation (8) appliquée aux deuxchromatogrammes conduit à la relation (9) caractéristique de cette méthode :

et

Soit :

10 )

L’étalonnage est possible avec un seul point de mesure (la « droite d’étalonnage » passedonc par l’origine). La précision sera meilleure si les concentrations des solutions deréférence et de l’échantillon sont du même ordre de grandeur. Il s’entend que les réglages del’appareil ne doivent pas être modifiés entre les injections.

La précision du dosage est évidemment améliorée en calculant la moyenne des aires

obtenues à partir de plusieurs injections identiques, mais, quitte à faire plusieurs mesures, ilest alors préférable de procéder à un étalonnage multipoints (multilevel calibration). Pour cela

on injecte des volumes égaux d’une série de solutions étalons. Les résultats d’analyse sontdirectement obtenus à partir de la courbe d’étalonnage . [24]


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1.6 Les di fférents types de chromatographie

Les méthodes chromatographiques se différencient dans un premier temps par l’état de la phase mobile. On parlera de chromatographie en phase gazeuse lorsque la phase mobile sera

un gaz, de chromatographie en phase liquide lorsqu’elle sera un liquide. Chacun de ces typesde chromatographie se subdivise dans un second temps suivant le processus de rétention misen œuvre. La chromatographie est dite :

D’adsorption lorsque le mécanisme de rétention est l’adsorption sur un support

poreux solide (phase stationnaire),

De partage lorsque le mécanisme de rétention est la dissolution du soluté dans une phase stationnaire liquide,

Ionique lorsque le mécanisme de rétention conduit à la séparation d’ions ou de

molécules ionisables. [5]

2. La Chromatographi e en Phase Gazeuse (CPG)

La Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) s’applique aux composés gazeux ou

susceptibles d’être vaporisés par chauffage sans décomposition. Elle permet ainsi l’analyse demélanges éventuellement très complexes, de nature et de volatilités diverses. Sescaractéristiques en font la technique séparative la plus utilisée pour l’analyse des COV et des

polluants atmosphériques.

On distingue deux types de chromatographie :

La chromatographie gaz-liquide ou de partage, dans laquelle la phase stationnaire estun liquide non volatil,

La chromatographie gaz-solide ou d’adsorption, dans laquelle les phases stationnairessont constituées par des solides adsorbants tels que la silice, l’alumine ou des

adsorbants polymères. [5]

2.1 Descri ption du chromatographe

L’appareillage se compose principalement d’un système d’injection de l’échantillon,

d’une colonne permettant la séparation des solutés et d’un détecteur assurant la détection desespèces séparées comme le montre la figure 3.


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Thermostats

Seringue

Colonne

Four

Détecteur

Enregistreur

Intégrateur ou

ordinateur

Vers un

dibimètre

Thermostat de colonnne

Ventilateur

Injecteur Manodétendeur

Manomètre

Bouteille de gaz

comprimé

Figure 3 : Schéma d’une installation de CPG.

Un appareil CPG réunit dans un bâti unique, outre les trois modules c lassiques, injecteur,

colonne et détecteur, un four thermostaté qui permet de porter, si nécessaire, la colonne à unetempérature élevée. La phase mobile qui entraîne l’échantillon dans la colonne est un gaz,

appelé gaz vecteur. Les débits, contrôlés avec précision, permettent une grande répétabilitédes temps de rétention.

L’analyse débute à l’instant où on introduit une très petite quantité de l’échantillon, sous

forme liquide ou gazeuse, dans l’injecteur, le flux gazeux traversant l’injecteur le ramène entête de colonne. Celle-ci se présente comme un tube de faible section enroulé sur lui-même,de 1 à plus de 100 m de longueur suivant les cas et contenant la phase stationnaire. Cettecolonne est placée dans une enceinte à température régulée. Elle peut servir à des milliersd’injections successives. La phase gazeuse qui a traversée la colonne passe dans un détecteur

avant de sortir à l’air libre.

Parmi les principaux détecteurs utilisés, on peut citer : Détecteur à Ionisation de Flamme

(FID), Détecteur à Capture d’Électrons (ECD) et le Détecteur à émissionatomique. [5] [24] [28]


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2.2 Le four

Il est destiné à recevoir les colonnes et à les porter à la température désirée qui peut êtreajustée au degré près. Pour que celle-ci soit parfaitement homogène, le four possède un

volume important et son atmosphère est brassée par un système de ventilation.Très fréquemment on lui adjoint un dispositif de programmation qui pendant une

chromatographie permet d’augmenter progressivement la température en fonction du temps,améliorant ainsi de manière très efficace les séparations. [27]

3. La Chromatographie L iquide Haute Performance (HPLC)

3.1 Aspect général de l’ HPLC

Dans la chromatographie haute performance la phase mobile parcourt la colonne qui peut

contenir des granulés poreux (colonne remplie) ou recouverte à l'intérieur d'un film mince(colonne capillaire) - phase stationnaire -.

A l'instant initial, le mélange à séparer est injecté à l'entrée de la colonne où il se dilue

dans la phase mobile qui l'entraîne à travers la colonne. Les constituants du mélange injecté sedéplacent tous moins vite que la phase mobile et leurs vitesses de déplacement sontdifférentes. Ils sont ainsi élués de la colonne les uns après les autres et donc séparés.

Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un enregistreur permet d'obtenir un

tracé appelé chromatogramme. L'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limitée par ces pics etla prolongation de la ligne de base permet de mesurer la concentration de chaque soluté dansle mélange injecté.

Son champ d’application recouvre une grande partie du doma ine de la chromatographieen phase gazeuse auquel s’ajoute celui de l’analyse des composés thermosensibles ou de

masses moléculaires à la fois très grandes et même polaires. Son succès est dû à la possibilitéd’agir de manière très précise sur la sélectivité entre les composés par le choix de la colonneet de la composition de l’éluant, c'est-à-dire en exploitant les interactions soluté/phasemobile/phase stationnaire. L’efficacité des colonnes est moindre qu’en CPG, mais l’utilisation

de phases chirales ou des nouvelles phases stationnaires opérant suivant plusieurs modes, lestechniques par appariement d’ions ainsi que d’interaction hydrophobe accroissent encore plus

les possibilités de la HPLC. Les pressions de pompage élevées, ainsi l’utilisation de colo nnesde microparticules qui minimisent le temps des cinétiques d’adsorption, de partage,d’exclusion ou d’affinité des molécules tout en augmentant la vitesse de flux de la phasemobile.

Ces phases, constituées de la réunion de microparticules sphériques dont le diamètre est

compris entre 2 et 5 micromètres ou de matériaux monolithiques poreux conduisent à une perte de charge importante dans la colonne. I l faut donc exercer sur la phase mobile une forte


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pression pour obtenir un débit convenable. Pour marquer cette particularité de la technique, lalettre P du sigle HPLC a pendant longtemps correspondu au mot pression.

La migration forcée d’une phase liquide au contact d’une phase stationnaire se retrouve

dans plusieurs techniques chromatographiques. La particularité de la HPLC est de faireintervenir des mécanismes d’échange soluté/phase mobile/phase stationnaire basés sur lescoefficients d’adsorption ou de partage. [25] [29] [30]

3.2 Conc eption générale d’un appareil d’ HPLC

Une installation d’HPLC (figure 4) comporte divers modules spécialisés, ces modules

sont reliés entre eux par l’intermédiaire de canalisations de très faible diamètre interne (0,1mm) pour assurer la circulation de la phase mobile.

Figure 4 : Schéma d’une installation d’HPLC.

3.2.1 Le réservoi r de solvant (éluant)

Il contient la phase mobile en quantité suffisante. Plusieurs flacons d'éluant (solvants

de polarités différentes) sont disponibles pour pouvoir réaliser des gradients d'élution(mélange de plusieurs solvants à des concentrations variables) à l'aide de la pompe doseuse

3.2.2 Le dégazage

La présence, dans les solvants, des gaz ambiants (N2, O2, CO2...), dissous en quantiténon négligeable, peut perturber les séparations par modification de la compressibilité des

éluants et formation éventuelle de bulles. En outre le dioxygène abrège la vie des colonnes etest gênant pour les détecteurs électrochimiques ou photométriques UV. Il est donc préférablede dégazer les solvants, soit avec des ultrasons soit par barbotage d’hélium, soit par diffusion

en les faisant passer dans un long tube de petit diamètre en polymère perméable aux gaz.


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3.2.3 L a pompe pour éluants

Toute installation de HPLC comporte au moins une pompe pour forcer le passage de la phase mobile à travers la colonne dont le remplissage est très compact. Il en résulte une

pression importante au niveau de l’injecteur. Celle-ci peut atteindre 20 MPa selon le débitimposé à la phase mobile ou sa viscosité ainsi que selon la nature de la phase stationnaire. Ces pompes débitmétriques comportent généralement deux pistons en série fonctionnant enopposition pour éviter les interruptions de débit dues au remplissage du cylindre.

3.2.4 L ’ injecteur

L’injection d’un volume précis de l’échantillon en tête de colonne doit se faire en temps

bref afin de perturber le moins possible le régime de circulation de la phase mobile qui doitêtre stable de la colonne au détecteur. On utilise pour ce faire, une vanne haute pression à

plusieurs voies, manuelle ou motorisée dans le cas des injecteurs automatiques, placée justeavant la colonne. Il s’agit d’une pièce de précision (figure 5) qui doit résister à des pressions

pouvant dépasser 30 MPa. Elle fonctionne en deux temps :

Dans la position chargement, où seule la communication entre pompe et colonne estassurée, l’échantillon est introduit à pression atmosphérique à l’aide d’une seringue

dans un petit volume tubulaire appelé boucle. Celle-ci, dont il existe tout un choixde volumes, est soit extérieure, soit intégrée dans le corps de la vanne,

Dans la position injection, l’échantillon est inséré dans le flux de phase mobile parrotation de 60° d’un levier qui permet d’inverser le sens de circulation dans la

boucle. Une reproductibilité des volumes n’est atteinte que si la boucle a ététotalement remplie par l’échantillon. Le volume prélevé avec la seringue est donctoujours largement supérieur à celui de la boucle.

Figure 5 : Schéma d’un injecteur à boucle.

3.2.5 La colonne

La colonne se présente comme un tube, le plus souvent en acier, dont la longueur et le

diamètre présentent des différences selon les modèles. Les colonnes « standard » ont undiamètre interne (DI) d’environ 4,5 mm et la longueur de 100 mm.

La colonne doit avoir une efficacité suffisante ; une colonne courte permettra d’aller plus vite et une colonne étroite se traduira par une économie de phase mobile. Ainsi pour une


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colonne standard, le débit est de l’ordre de 1 ml/min, quelques goutes suffisent pour éluer tousles composés.

La colonne est souvent précédée d’une précolonne, dite colonne de garde, courte (0,4

cm à 1 cm), remplie de la même phase stationnaire, ce qui sert à retenir certaines impuretés.On augmente ainsi la durée de vie de la colonne principale en préservant ses performances.

Les colonnes utilisées en HPLC se caractérisent par leur géométrie et par la nature des phases qu’elles contiennent. Elles sont remplies par voie humide sous pression.

Elles sont en général courtes et droites. Les colonnes analytiques ont des longueurs

moyennes de 10 à 25 cm (l’utilisation de colonnes courtes de 10 cm est justifiée par unremplissage par des particules de 3 µm qui améliorent l’efficacité mais augmentent la perte decharge). Les diamètres sont de 1 ; 4,6 et 8 mm selon le mode de chromatographie utilisé :

1 mm : Chromatographie à microdébit (à vitesse linéaire constante, la diminutiondu diamètre de la colonne réduit la valeur du débit nécessaire) ;

4,6 mm : Correspond au diamètre de la chromatographie analytique classique ; 8 mm : Correspond au domaine de la chromatographie semi-préparative.

Ces colonnes sont en acier inoxydable capable de résister aux fortes pressions. Afind’éviter l’apparition de parcours préférentiels de la phase mobile dans la colonne, celles-ci

peuvent être en matériau souple (polyéthylène) et soumises à une compression radialemécanique externe.

Le choix d’une colonne doit être fait en fonction de la nature chim ique de la phasestationnaire, de sa rétentivité, de la taille des particules de la silice et de ses dimensions. Lechoix de la phase stationnaire est l’étape la plus importante et doit tenir compte de lasolubilité de l’échantillon et des propriétés chimiques des analytes visés.

3.2.6 L e détecteur

Le détecteur utilisé doit réunir un certain nombre de qualités : donner pour chaquecomposé détecté une réponse proportionnelle à sa concentration instantanée, être sensible et

avoir peut de bruit de fond, être stable dans le temps.Les modes de détection les plus courants reposent sur les propriétés optiques des

composés : absorption, fluorescence et indice de réfraction.

Dans notre présent travail, on utilisera le détecteur ultraviolet-visible.


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Le détecteur UV-visible

La détection est basée sur la loi de Lambert-Beer :

11)

Avec :

: Absorptivité molaire,l : Épaisseur de solution traversée,C : Concentration du soluté dans l’effluant.

L’absorbance A de la phase mobile est mesurée en sortie de la colonne, à la longueur

d’onde λ ou plusieurs longueurs d’onde dans l’UV ou le visible. La phase mobile ne doit pas,

ou très peut, absorber par elle-même. L’intensité de l’absorption dépend du coefficientd’absorption molaire , ce qui rend impossible, par la simple observation d’un

chromatogramme, de se faire une idée de la concentration des espèces repérées, même demanière très approximative.

La détection UV correspond donc à une détection sélective. Selon la longueur d’onde

utilisée, on distingue :

La détection monochromatique (celle utilisée dans notre cas),

La détection polychromatique.

Pour la détection monochromatique, le modèle de base se compose d’une source au

deutérium ou à vapeur de mercure, d’un monochromateur pour isoler une bande passanteétroite (10 nm) ou une raie, d’une cellule à circulation d’un volume de quelques µl et d’un

moyen de détection optique. [24][25] [27] [30]

3.3 La phase mobile

Le solvant (phase mobile) joue un rôle très important dans la chromatographie liquide,

car il accroît les performances de cette technique ; chaque application particulière exige que

soit sélectionné un solvant adéquat.

Il existe deux types de qualités requises du solvant en chromatographie en phase liquide :

ils concernent les aspects pratiques et l’optimisation de la résolution ; par aspects pratiques,nous entendons les facteurs qui déterminent la convenance de tel solvant à une applicationdonnée ; par optimisation de la résolution, nous voulons parler de l’obtention d’une séparation

adéquate d’un échantillon en un temps acceptable.

Un solvant doit nécessairement maintenir la stabilité de la colonne, être compatible avec

le détecteur, solubiliser suffisamment l’échantillon et ne pas gêner sa récupération.


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D’après l’équation (6), la résolution dépend du facteur de séparation α, le nombre de

plateaux de la colonne N et du facteur de capacité . Le solvant a une influence importantesur chacun de ces facteurs. Le nombre de plateaux, N, varie avec la viscosité du solvant,tandis que α et sont des fonctions de ses propriétés thermodynamiques. Les variations de la

vitesse moyenne de migration d’un pic avec la composition du solvant dépendent de sa forced’élution : aux solvants très élutifs correspondent de faibles valeurs de , alors que des

solvants peu élutifs donnent des valeurs plus élevées. La sélectivité α, quant à elle, varie avecla composition du solvant de façon plus complexe.

Dans la chromatographie inverse, chaque séparation nécessite une polarité de la phase

mobile qui lui est propre. Chaque solvant ayant une polarité donnée, on ajuste la polaritéglobale de la phase mobile en mélangeant plusieurs solvants miscibles. A cette compositionde phase mobile correspond une force éluante qui caractérise le pouvoir d’entraîner les

solutés. Il faut ajuster la force éluante en fonction des solutés à séparer. Pour cela, on peut

utiliser un solvant pur ou un mélange de solvants.

Dans certains cas il est utile de faire varier la force éluante au cours de l’analyse. Si le

mélange de différents solvants varie au cours de la séparation, on réalise alors un gradientd’élution, car la meilleure force éluante pour le début de l’analyse n’est pas forcément adaptée

pour une bonne séparation des solutés sortant en fin de chromatogramme.

Ces deux modes sont utilisés pour des analyses en chromatographie à polarité de phase

normale ou inversée. Dans la pratique on préfère, si c’est possible, travailler en modeisocratique. C’est un compromis entre le temps d’analyse, qui est plus long dans le mode

isocratique et le temps d’équilibre obligatoire, en utilisant un gradient d’élution. Cet équilibreest nécessaire avant chaque nouvelle injection pour obtenir un chromatogrammereproductible.

En début d’analyse, la force éluante doit être suffisamment faible pour retarder quelques

temps les composés peu retenus. Puis progressivement, en changeant la composition de la phase mobile, on augmente la force é luante pour entraîner les solutés ayant plus d’affinitéavec la phase stationnaire. Pour faire varier la force éluante, on utilise des pompes capables decréer un mélange de solvant automatiquement. [26] [29] [30]

3.4 La phase stati onnai re

Ces phases sont essentiellement constituées par de très fines particules poreuses (silice ou

alumine), de forme irrégulière ou homogène. Elles peuvent également être recouvertes parimprénation ou greffage.

La phase stationnaire est retenue à l’intérieur de la colonne par un disque poreux en acier

inoxydable fritté, dont la porosité est suffisamment faible pour retenir les plus fines particules.Outre sa nature, sa caractéristique essentielle est sa granulométrie exprimée par le diamètre

moyen des grains en micromètres.


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On peut utiliser trois types de phases stationnaires : les supports microporeux, les

supports pelliculaires qui sont superficiellement poreux et les phases greffées par des chaineshydrocarbonées en C18 (colonnes C18) qui correspondent à une phase stationnaire liée à unmatériau inerte comme la silice qui est peu résistant aux pH basiques. De ce fait, il est

recommandé de n’utiliser ces colonnes de silice greffée que dans des limites de pH de l’ordrede pH 2 à pH 8. Enfin, des rétentions parasites de composés basiques conduisent à augmenterla trainée des pics. [24] [25]

3.5 Avantages et inconvénients de l’HPL

Les avantages présentés par l’HPLC comparé à la chromatographie basse pression sont :

Temps d’analyse devisé par 10 à 50,

Reproductibilité élevée,

Quantification simplifiée,Dégradation négligeable des produits biologiques,

Résolution élevée en accord avec le nombre de plateaux théoriques de la colonne,

Faible besoin en échantillon par analyse (10 - 100 µl),

Les capacités d’automatisation de ces systèmes.

Néanmoins il subsiste quelques inconvénients comme :

Durée de vie des colonnes,

Obligation d’utiliser des solvants de qualité HPLC,

Coûts du système, du consommable (colonne, solvants, …) et de son exploitation.[25]

3.6 Di fférence CPG / HPLC

L’HPLC peut s’appliquer à tous les produits solubles, contrairement à la chromatographie

en phase gazeuse (CPG), en liquide, une interaction est possible entre le soluté et la phasemobile. Cette interaction peut modifier les valeurs du coefficient de partage K et du facteur decapacité k’.

Les différences importantes entre la CPG et l’HPLC sont liées à des paramètres physiques qui interviennent dans la séparation :

Les liquides sont incompressibles, le volume d’un liquide peut être considérer nevariant pas avec la pression,

La viscosité des liquides est environ 100 fois plus grande que celle des gaz,

Les coefficients de diffusion molaire du soluté dans la phase mobile sont 10 000 à

100 000 fois plus petits dans les liquides que dans les gaz.


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Conséquence des différences CPG / HPL C

En HPLC, la vitesse de la phase mobile est constante en tout point de la colonne. Il n’y a

pas de variation d’efficacité le long de la colonne, comme en CPG. La hauteur théorique d’un plateau est la même à l’entrée ou à la sortie de la colonne. [26] [29]

Tableau 1 : Quelques caractéristiques des chromatographies CPG & HPLC.

CPG rempli e CPG capill aire HPLC

Longueur de la colonne 2 à 5 m 10 à 50 m 0,05 à 0,3 m

Diamètre interne de la col onne 2 mm 0,10 à 0,53 mm 4,6 mm

Débi t de l a phase mobi le 20 à 30 cm3 /min 1 à 2 cm3 /min 1 à 5 cm3 /min

Pression en tête de la col onne 1 à 5.105 Pa 0,5 à 1.10 5 Pa 50.105 à 150.105 Pa

Granulométr ie du rempl issage 100 à 600 µm vide 3 à 10 µm

Nombre de plateaux théor iques parmètr e de col onne

1 000 à 2 000 500 à 2 000 10 000 à 50 000

les techniques chromatographiques- mémoire ich05

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