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REMERCIEMENTS

« Caminante, no hay camino…

Todo pasa y todo queda, pero lo nuestro es pasar »

(Antonio Machado)

« Le vrai voyageur n’a pas de plan établi et n’a pas l’intention d’arriver »

(Lao-Tseu)

A l'issue de la rédaction de ce travail, je suis convaincue que la thèse est loin d'être un

travail solitaire. En effet, jamais je n'aurais pu effectuer ce travail doctoral sans le soutien d'un

grand nombre de personnes qui m’ont permis de progresser lors de cette phase délicate

« d’'apprentie-chercheuse », faisant preuve de générosité, de bonne humeur et d’intérêts à

l’égard de ma recherche.

Je tiens, en premier lieu, à remercier sincèrement Thomas MICHIELS et Rodrigue

ROSSIGNOL, rapporteurs de cette recherche, pour avoir accepté de lire et évaluer ce travail,

pour leurs remarques formulées avec bienveillance et leurs conseils avisés.

Je remercie également Olga CORTI, examinatrice, pour avoir pris le temps de me lire et

de m’écouter.

Un grand Merci également au Professeur Roland LIBLAU, président de ce jury, pour

m’avoir permis d’achever cette thèse en toute tranquillité et pour son écoute compréhensive

lors des « lab meetings » du mercredi matin.

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J’adresse toute ma gratitude à Marie-Christine MIQUEL, ma co-directrice : tu es une

personne formidable qui gagne à être connue ! Un énorme Merci pour ta gentillesse « vraie »,

tes phrases de déstresse (et non pas de détresse : « mangagénèse » n’a rien à voir avec

manganèse !), merci pour ton humour et tes nombreux conseils distribués au cours de ces 3

années, merci pour ton soutien indéfectible et ta Tolérance avec un grand « T ». Quoi qu’il

advienne, j’espère que nous resterons en contact, nous sommes voisines après tout ! Je te

souhaite de la joie, des rires, de la sérénité et du positif à venir.

Je tiens à exprimer mes plus vifs remerciements à Daniel DUNIA mon directeur de thèse.

Daniel, ¡ El Jefe ! No sé qué decirte, excepto ¡ MUCHAS GRACIAS ! Merci pour cet accueil

chaleureux dans ton équipe, ta patience, ta bonté et surtout pour ton humanité. Je ne suis pas

certaine de retrouver un chef aussi cool un jour et cela me fait bien de la peine … En plus, tu as

tout de suite su discerner qui j’étais vraiment… je crois que le surnom de « Charogne » va me

suivre un moment encore ! Cela fut un véritable plaisir de travailler et d’apprendre à tes côtés !

Je ne regrette rien de ces 4 années (stage de master et thèse) passées au sein de l’équipe 9

excepté, peut-être, le fait de la quitter ! L’avenir reste cependant riche de promesses. Je te sais

gré de ton soutien indéfectible lorsque j’ai décidé de faire la passerelle de médecine et de

m’avoir autorisée à faire différents stages, sans jamais sourciller. Tu es véritablement

généreux, ne change rien surtout. Je te souhaite, ainsi qu’à toute ta famille, vraiment

beaucoup de bonheur. Hasta pronto !

Marion (je ne sais toujours pas écrire ton nom, hi ! hi !), tu as été mon encadrante au

cours de mon master et de mes deux premières années de thèse avant de me laisser prendre

mon envol, quel courage à toi ! Je te remercie sincèrement pour tout ce que tu m’as enseigné

du point de vue scientifique (donc presque tout lol) ; tu as toujours été présente, à n’importe

quelle heure du jour et de la nuit, pour répondre à mes questions et me venir en aide, que ce

soit au sujet des manips, des analyses ou des présentations. Je t’en suis extrêmement

reconnaissante ! J’espère sincèrement que tu finiras par obtenir ce poste tant convoité, tu le

mérites amplement. Scientifique d’une grande qualité, tu es également d’une efficience hors

du commun (heureusement d’ailleurs que tu m’as transmis un peu de ta rapidité, et pourtant,

face à mon « cerveau lent » ce n’était pas gagné !). Je te souhaite de vivre des moments plein

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d’amour, surtout avec le petit bout de chou à venir (j’espère qu’il naîtra le 10 août, c’est une

très bonne date ;-) ).

J’exprime tous mes remerciements à l’ensemble des membres de mon jury de comité

de thèse, particulièrement à Catherine SOULA et Manuel ROJO pour leur disponibilité, leur

engagement et leurs remarques toujours justifiées et distillées avec tant de bienveillance. Je

remercie également Frédéric TAÏEB, Sylvie GUERDER et bien sûr mon parrain super génial

Renaud LESOURNE.

Je remercie, bien entendu, toute l’équipe de Pascale BELENGUER. Merci à toi, Pascale,

pour avoir cru en moi et avoir accepté de me prendre en stage lors de ce master GCD. Merci

de m’avoir offert la possibilité de vivre une superbe expérience : enseigner en TD et pour tout

le temps (précieux) que tu m’as accordé. Un grand merci à Noélie DAVEZAC pour toutes ses

bonnes idées que l’on pourrait croire sorties du chapeau d’une magicienne et pour ton

caractère affable. Laëtitia ARNAUNÉ, tout a commencé avec toi. Tu as su me donner l’envie

d’apprendre et surtout de travailler sur la mitochondrie. J’ai passé d’excellents moments sur la

plateforme TPE. Tu es et resteras une de mes meilleures prof. Merci pour ta douceur, ta

sensibilité et ta sincérité. Merci à Valérie MILS pour son écoute et à Marlène pour sa bonne

humeur inaltérable. Plein de bisous et de bonnes choses pour nos expatriés Thomas et Aurélie.

Plein de courage à toi Manounette qui est dans la dernière ligne droite pour achever ta thèse,

tu auras bien mérité de savourer cette réussite. Tu es réellement adorable, toujours prête à

rendre service (parfois trop). Je suis contente de t’avoir rencontrée.

Merci aux anciennes « Mimi’s » de l’équipe DGD (Charlotte et Caro). Vous débordez

d’énergie et, avec vous, c’est toujours de la franche rigolade. Plein de bonheur à vous deux au

cours de votre vie.

Je tenais à remercier chaleureusement le Professeur Hugues CHAP qui m’a gentiment

appuyée dans ma démarche pour entrer en école de médecine. Qu’elle que soit l’issue de ma

démarche, vous m’aurez été d’une aide précieuse. Je remercie également sincèrement

6

Charlotte CASPER et Melinda BENARD pour leur soutien, leur sympathie et le stage inoubliable

et si passionnant que j’ai pu réaliser « chez elles » en néonat. Merci aux professeurs PARIENTE

et COGNARD de l’hôpital Pierre Paul-Riquet pour m’avoir accueillie avec bienveillance dans

leurs unités. Merci également au docteur DUCHESNE pour avoir accepté ma présence, le temps

d’un stage d’observation dans son cabinet.

Merci à toutes les équipes du mercredi matin (RL, AS, NB, ReL) qui, tant bien que mal,

auront réussi à me faire apprécier l’immunologie (enfin presque…). Un grand merci pour

toutes vos critiques constructives et avisées.

Un grand merci au plateau d’imagerie : Sophie pour tes connaissances et ton accueil,

Danièle, tu es chou et TROP mignonne ne l’oublie jamais, Striiiiddddd (oui je l’ai piqué à Caro).

Merci pour ta patience (car il en fallait avec moi…), pour tes potins, tes voyages plein la tête

(même si parfois tu me faisais crever d’envie). Raïssa, qu’écrire ? Tu es un amour (et tellement

belle en plus).

Merci à tous les « petits » M1, M2 et BTS pour leur « visite » au sein de l’équipe. Alison,

Marianne, Florent, Dan… j’ai apprécié chacun d’entre vous, je vous souhaite le meilleur et

beaucoup de réussite pour la suite.

J’adresse également un énorme « beijo » à mon stagiaire pharmacien Joao. Merci pour

tout : tu es venu pour un stage, j’ai rencontré un véritable ami. Comme promis, je viendrai te

voir au Portugal.

En parlant d’amitié … que dire ? Par où commencer ? disons le collège/ lycée…

Alexis… pas besoin de parler, nous communiquons par télépathie de toute façon…

7

Manu, Pedro quel bonheur de vous avoir croisé sur ma route. 10 ans après je ris toujours

autant à vos côtés. Vous me manquez mais la distance n’altèrera jamais notre amitié. Je vous

adore, <3 Prenez soin de vous et de vos chéris (à très vite durant l’été, youpi !).

Nathalie, plein de bisous d’amour. Miss you !

La fine troupe de la licence à Orléans :

Pupuce allias Camille, tu es une fille géniale, pétillante, intelligente, boute en train (tu

as tout pour toi, dis donc), je t’adore et de toute façon nous sommes dans une « relation libre »

pour toujours. Vive l’amour vrai. A très bientôt <3.

Petit Loup, allias Quentin, piouf, comment dire « Mr Inspecteur des Fraudes », tu me

manques. Merci pour toute ta douceur et pour m’avoir soutenue contre vents et marées.

Chupa Chups allias Jeffrey, tu sais déjà tout…tu es un véritable ami, je ne t’oublierai

jamais, merci d’être là.

Safouille, ton nom rime avec poésie et courage, j’espère que tout va bien pour toi, je

suis là, quoiqu’il arrive !

Naïm, tu es adorable, je te souhaite tout le bonheur du monde Incha’Allah.

Et bien sûr tous les autres, Rififi (Nathanaël, qui a même fait un cours séjour dans ma

ville) Tom Tom, Julien, Paola, Etienne, Lakhdar…merci pour tout et surtout pour m’avoir

supportée durant 3 ans.

Mes amis du master 1, ma belle Khakha. Courage pour ta thèse tu y es presque. Sam

m’a jolie petite bourgeoise du 16ème , je t’envoie plein d’ondes positives.

Simon, mon frère d’âme… Je crois que nous sommes liés par les astres. Quand je suis

près de toi, je suis avec ma famille. Miss you, je viens très vite te voir sur Paris.

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Un bisou à Maxime (notre Australien), Adrien, Hafida, Camille, Amélie, Maral… du M2

GCD. Un gros boussa à Naj, hbiba, parti dans le grand nord, twahachtek bezaf <3.

Au cours de ce master, j’ai eu la chance de te découvrir, TOI, MA MIMI, ma choupi,

véritable petite boule d’amour. Tu es tellement bienveillante que l’on pourrait te canoniser

(Sainte Lucie CHADELLE ça sonne bien). Je suis vraiment plus qu’heureuse de t’avoir connue.

On s’est déjà tout dit… longue vie à notre amitié sincère (nous aurons plein de bébés chiens

dont des Léonberg, ils s’aimeront fort dans une maison en pierres). I love you so much sweety.

Un gros bisou à Arnaud qui est tout aussi chou, vous étiez fait pour vous rencontrer !

Puis arriva la thèse, et Anne, Maude, Maryse, Sophie… Les filles vous êtes géniales !

Le rat, merci pour tout et surtout pour le chien tête en bas ou à trois pattes, le bébé

cobra ou le bébé heureux, le salut du guerrier, la demi-vache, la pause de l’enfant, l’attaque

du dragon et la grenouille rouillée… Je crois que presque tout a été cité (ah non il reste le

bodyJam car, tout de même, c’est la vie !). Merci pour tous ces fous rires et ces discussions

intenses ! Prends soin de ton petit raton et du rat divin (si, si, ça compte quand même).

Boulette de riz, ou devrais-je dire baby ? Notre première rencontre eut lieu à la

plateforme TPE, et là, tout a commencé… Tu es une fille extraordinaire, drôle, juste et

ultrasensible (je passe sur ta maladresse), bref tu as fait craquer mon cœur. Merci pour ces 5

années (et oui déjà…) de partage, de soirées et d’échanges simples mais sincères. Je te

souhaite une vie de bonheur avec Jérôme. Tu seras une super dentiste, attentive. Tu ne feras

pas mal car ce n’est clairement pas dans ta nature ! Je suis vraiment heureuse d’avoir croisé

ta route, notre chemin commun ne s’arrête pas là.

Maryse, Namour, louloute, l’amoureuse ou que sais-je encore, lol ? Tu es intelligente,

battante, tu ne recules devant rien, et quelques soient les coups qui te sont portés, tu te relèves.

Je t’admire pour ça. Tu es l’une des personnes les plus réfléchies (parfois trop) que j’ai pu

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rencontrer dans ma vie. Tu es, en plus de tout ça, profondément généreuse. Tu possèdes une

belle âme, bref, tu as tout pour toi. Je te souhaite tout le bonheur du monde, vraiment, tu le

mérites. Tu seras toujours la bienvenue chez moi (purée ça ressemble trop à la chanson).

Sophie, pitchoune, maman chat, grâce à toi, je vis une superbe aventure avec les bébés

chats. Mais avant tout, tu fais preuve d’un énorme optimisme, de force et de magnanimité. Je

peux l’écrire sans craintes de me tromper, signer et persister, sous tes airs de petite comique

détachée se cache une fille en or. Ne change rien ! Merci notamment pour tous ces fous rires

(grâce à toi, j’ai des abdos en béton) et pour les inoubliables parties de jeux.

Michael, mon Bro, merci pour m’avoir permis d’admirer ces abdos durant 4ans (ça va

ne te la pète pas, c’est juste pour te faire plaisir) et merci pour toutes ces attaques de glaçons

que nous nous lançâmes allégrement dans la figure. Je te souhaite plein de bonnes choses à

venir.

Merci aussi à tous les autres thésards et post-doc présents et passés, Karim

(boussat),Gaëtan, Medhi, Jérémy, Nico, Delphine, Julien, Cléo, Christina, Marion, Anna, Lydia,

Alex, Johan… pour la bonne ambiance qui règne dans ce centre grâce à vous.

Je tenais à remercier les filles de l’équipe. Hélène (ou maman canard) tu n’as pas ton

pareil pour tous nous faire rire. Cécile tu sais mettre en confiance et assurer une bonne

ambiance. Elsa, plus dernièrement arrivée, tu es super sympa, forte et intelligente, je suis

contente de t’avoir connue.

Marine, petite sœur malgré moi, dommage je pars déjà… mais tu fus une très agréable

surprise, la petite cerise sur le gâteau avant mon départ. J’apprécie beaucoup ton caractère,

ton côté chipie hyper développé et ta force de vivre ! Tu vas y arriver, tu seras chez Cécé, hi !hi !.

Plein de bisous à toi.

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Émilie, ma jolie blondinette plus qu’adorable qui ne râle jamais. Merci ! Merci pour

toutes nos discussions philosopho-politico-psychologico-religieuses. Merci de m’avoir confié

Kiki, pour tous tes petits bruits et réflexions douteuses…J’ai plus qu’apprécié ta présence dans

ce bureau de thèse. Tu es une personne sur qui l’on peut compter les yeux fermés. Plein de

bisous.

Maman Anne, bon, j’ai envie de pleurer avant même d’écrire… Qu’est-ce que je pourrais

bien te raconter ? Il y aurait un bouquin à écrire hi ! hi ! Merci infiniment pour tout. Quel

bonheur de t’avoir découverte dans cette équipe. Tu es un petit kinder surprise comme ceux

dont tu nous gratifiais souvent. Je peux dire que, durant ces 3 années, tu m’as nourrie, parfois

habillée (d’une blouse tout du moins), une vraie maman quoi ! Merci pour tout cet amour, ta

patience (et oui, avec moi, il t’en a fallu), ta persévérance, ton écoute et ta compréhension. En

plus d’être la maman du labo, tu en es aussi la psychologue… L’écho « Maman Anne »

raisonnera encore longuement dans les couloirs, j’ai certes initié le mouvement mais la relève

est largement assurée. Quoiqu’il advienne, tu resteras à jamais gravée dans ma mémoire.

Grâce à toi ma première expérience professionnelle sera certainement aussi la meilleure…

Prends soin de mes petits frères (les vrais), n’oublie pas de serrer la vis, ils sont mignons mais

coquins.

Je remercie bien évidemment ma famille. Il n’y a pas l’espace, ici, pour vous dire tout

ce que je ressens pour vous… Si j’en suis là aujourd’hui c’est grâce à vous…Je vous aime de tout

mon cœur et je ne trouverais jamais de mots assez justes pour vous exprimer toute ma

gratitude.

Mémé Lucette, tu as été le soleil de ma petite enfance. Merci.

Maman, merci pour toutes nos ballades-discussions (avec Crapiche d’amour). Merci

pour ta joie de vivre et cette façon que tu as de toujours croire en moi. Merci d’être là, je t’aime.

Bisous à petit aiglon et merci pour toutes ses chocolatines miam !

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Mumu, cette thèse c’est aussi la tienne, merci infiniment pour tes heures non comptées

à refaire la mise en page, à me suivre pour mes devoirs depuis le collège, à me soutenir quand

je stresse et que je suis au bord du gouffre. Je t’aime très fort, tout est déjà dit.

Papa, mon héros, ma force, merci (le mot est trop faible) pour tout et notamment pour

ton soutien vital, j’espère t’avoir rendu fier et continuer à le faire. Je t’aime.

Enfin Christian (Mous, CriCri…), mon amour, merci pour ces 7 magnifiques années.

Merci de supporter mes craintes, mes peurs, mes angoisses sans jamais (ou presque) te

fatiguer. C’est aussi grâce à toi que j’en suis là. Le reste nous regarde…Je t’aime.

A Pépé Robert, à Tonton Nono

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Table des matières INTRODUCTION ........................................................................................................................ 33

I) La mitochondrie .................................................................................................................... 33

1. Les origines.................................................................................................................... 33

2. La découverte ; petit historique ................................................................................... 37

3. Structure et Fonctions .................................................................................................. 43

a. Structure .................................................................................................................... 43

b. Respiration cellulaire ................................................................................................. 49

c. Régulation du stress oxydant .................................................................................... 55

d. L’apoptose ................................................................................................................ 65

e. Régulation calcique ................................................................................................... 77

e.1. Généralités ................................................................................................................ 77

e.2. L’uniport calcique mitochondrial .............................................................................. 79

e.3. La signalisation calcique mitochondriale .................................................................. 83

f. Fonctions de synthèse ............................................................................................... 87

4. Dynamique mitochondriale et transport ..................................................................... 89

a. Généralités ............................................................................................................. 89

b. La fusion mitochondriale ........................................................................................ 93

c. La fission mitochondriale ........................................................................................ 99

d. Régulation de l’équilibre dynamique ................................................................... 101

e. Les moteurs du transport mitochondrial ............................................................. 107

f. Régulation du transport mitochondrial ............................................................... 113

g. Dynamique et transport, deux phénomènes étroitement liés ............................. 117

5. Adressage des protéines mitochondriales ................................................................ 121

II) Dysfonctionnements mitochondriaux & Neurodégénérescence ...................................... 131

1. Dysfonctions mitochondriales et perturbation de la dynamique, quelques exemples

de neuropathies ................................................................................................................. 131

a. La maladie d’Alzheimer ........................................................................................ 131

b. La maladie de Parkinson ...................................................................................... 137

c. La maladie de Huntington .................................................................................... 145

d. L’Atrophie Optique Autosomique Dominante et la maladie de Charcot-Marie-

Tooth de Type 2 .............................................................................................................. 151

2. La mitochondrie comme cible thérapeutique ........................................................... 157

a. Les antioxydants................................................................................................... 157

13

b. La créatine ............................................................................................................ 163

c. Conclusion............................................................................................................. 167

III) Mitochondries & Neuroprotection : rôle de la protéine X du Bornavirus ..................... 171

1. Présentation du Bornavirus ....................................................................................... 171

2. Fonctions de la protéine X .......................................................................................... 179

a. Adressage intracellulaire...................................................................................... 179

b. Rôle lors de l’infection .......................................................................................... 181

c. Rôle anti-apoptotique et dans la réponse aux interférons de type I .................... 183

3. Hspa9 : généralités et rôle dans les maladies neurodégénératives ......................... 191

OBJECTIFS DE LA THESE……………………………………………………………………………………………………..197

RESULTATS .............................................................................................................................. 203

I) Détermination du pouvoir neuroprotecteur de la protéine X dans des modèles in vitro et in

vivo de la Maladie de Parkinson et recherche des mécanismes moléculaires et cellulaires

sous-jacents. ........................................................................................................................... 205

1. Résumé et article ........................................................................................................ 205

2. Recherche des mécanismes moléculaires et cellulaires à la base du pouvoir

neuroprotecteur de la protéine X. .................................................................................... 223

a. Matériels et Méthodes ......................................................................................... 223

b. Résultats ............................................................................................................... 229

II ) Des mutants de la protéine X préférentiellement adressés à la mitochondrie : un potentiel

thérapeutique neuroprotecteur. ........................................................................................... 239

1. Résumé et article ........................................................................................................ 239

III) La protéine mitochondriale Hspa9 : un autre candidat neuroprotecteur ........................ 255

1. Sous-expression dans un modèle murin de la maladie de Parkinson ...................... 255

2. Son interaction avec la protéine X ............................................................................. 255

3. Son rôle neuroprotecteur ........................................................................................... 255

a. Matériels et Méthodes ......................................................................................... 257

b. Résultats ............................................................................................................... 263

4. Impact de la surexpression de la protéine hspa9 sur la dynamique mitochondrial 265

a. Matériels et Méthodes ......................................................................................... 265

b. Résultats ............................................................................................................... 267

5. Impact sur la bioénergétique ..................................................................................... 269

DISCUSSION ET PERSPECTIVES ............................................................................................... 271

RÉFÉRENCES ........................................................................................................................... 295

14

LISTE DES ABREVIATIONS :

a.a. : Acides Aminés

Ca2+]c : Concentration cytosolique en calcium

Ca2+]m : Concentration mitochondriale en calcium

3-NP : Acide 3-nitropropionique

6-OHDA : 6-hydroxydopamine

ABV : Bornavirus aviaire

ADN : Acide Désoxyribonucléique

ADNmt : ADN mitochondrial

ADP : Adénosine Diphosphate

AIF : Apoptosis Inducing Factor

ANT : Adénine Nucléotide Translocase

AODA : Atrophie Optique Dominante Autosomique

APAF1 : Apoptotic Protease Activating Factor 1

APP : Protéine précurseur de l’amyloïde

ARN : Acide Ribonucléique

ARNg : Acide Ribonucléique génomique

ARNm : Acide Ribonucléique messager

ARNr : Acide Ribonucléique ribosomique

ARNt : Acide Ribonucléique de transfert

ATP : Adénosine Triphosphate

ATPx : ATP synthase protéine

Aβ : Peptide beta-amyloïde

Bcl-2 : B cell lymphoma 2

BDNF : Brain-derived neurotrophic factor

BDV : Borna Disease Virus, Bornavirus

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Bid : BH3 Interacting Domain death agonist

C-ter : Région Carboxy-terminale

CaMKI : Protéine kinase dépendante de Ca2+/calmoduline I

CARD : Domaine de Recrutement des CAspases

CAT : Catalase

CDK1 : Cycline-dépendante 1

cGAMP : GMP-AMP cyclique

cGAS : GMP-AMP Synthase cyclique

CMT2A : Maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A

CoQ10 : Coenzyme Q10

COXx : Cytochrome Oxydase protéine

CREB : C-AMP Response Element-binding protein

CRM1 : Exportine Chromosomal Maintenance 1

CypD : Cyclophiline D

Cyt c : Cytochrome c

DA : Dopaminergique

DISC : Death-Inducing Signaling Complex

DMEM : Dulbecco's Modified Eagle's medium

DNAJC6 : DNAJ heat shock protein family (Hsp40)

DR3-6 : Death Receptor

DRP1 : Dynamin-related proteins 1

EGCG : épigallocatéchine 3-gallate

endoG : endonuclase mitochondriale G

ETC : Electron Transport Chain

FAD : Flavine Adénine Dinucléotide

FADD : Fas-Associated Death Domain

Fas : Apoptosis Stimulating Fragment

FBXO7 : F-box domain-containing protein 7

16

FCCP : Carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone

FIS1 : Protéine de fission mitochondriale 1

GED : Domaine effecteur de la GTPase ou domaine d’assemblage

Gpx : Glutathion peroxydase

Grx-2 : Glutaredoxine mitochondriale

GTP : Guanosine Tri Phosphate

H2DCFDA : Diacétate 2', 7'dichlorodihydrofluoresceine

HAP1 : Htt-associated protein 1

HBSS : Hank's balanced salt solution

HMGB1 : High–mobility group box 1

HR : Domaine Heptad-Repeat

Hsc : Heat shock cognate protein

Hsp : Heat shock protein

HSP : Heavy Strand Promoter

HtrA2 : High temperature requirement protein A2, Omi

Htt : Protéine Huntingtine

IAP : Protéines inhibitrices de l’apoptose

IL : Interleukine

IMM : Inner Mitochondrial Membrane, Membrane mitochondriale interne

IMS : Intermembrane Space, espace inter-membranaire mitochondrial

INF2 : Inverted Formin 2

INFs : Interférons

JNK : C-Jun N-terminal kinase`

JNK : Kinase C-Jun N terminale

Khc : Chaîne lourde de la kinésine-1

Klc : Chaîne légère de la Kinésine-1

KO : Knock Out

LECA : Last Eukaryotic Common Ancestor

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LETM1 : Leucine Zipper-EF-Hand Containing Transmembrane Protein 1

LGP2 : Laboratory of Genetics and Physiology-2

LRRK2 : Leucine-rich repeat Kinase 2

LSP : Light Strand Promoter

MA : Maladie d’Alzheimer

MAPL : Mitochondrial-anchored protein ligase

MARKs : Microtubule-Affinity Regulating Kinases

MAVS : Mitochondrial Antiviral Signaling Adaptor = IPS-1 : IFN- Promoter Stimulator 1

mCU : Uniport calcique mitochondrial

MDA5 : Melanoma Differentiation-Associated 5

MELAS : Mitochondrial Encephalomyopathie with Lactic Acidosis and Strokelike episodes

MET : Microscopie Electronique à Transmission

MFN : Mitofusine

MH : Maladie de Huntington

MH : Maladie de Huntington

MKK : Map Kinase

MOMP : Mitochondrial Outer Membrane Permeabilization

MP : Maladie de Parkinson

MPP : Mitochondrial Processing Peptidase

MPP+ : 1-methyl-4-phenylpyridinium

MPTP : 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine

MS : Sclérose en plaque

MTS : Mitochondrial Target Sequence, Séquence d’Adressage Mitochondrial

N-ter : Région Amino-terminale

NAD : Nicotinamide Adenine Dinucleotide

NCLX : Echangeur sodium-calcium mitochondrial

NDx : NADH Deshydrogénase protéine

NLR : Nucleotide Oligomerization Domain (NOD)-like Receptors

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NLS : Signal de Localisation Nucléaire

NMDA : N-méthyl-D-aspartique

OH/OL : Origins of heavy- and light-strand replication

OMA1 : Overlapping with the m-AAA protease 1

OMM : Outer Mitochondrial Membrane, Membrane externe mitochondriale

OPA1 : Optic Atrophy Protein 1

OXPHOS : Phosphorylations oxydatives

P450scc : Side-Chain Cleavage Protein 450

PARK : Parkin

PARL : Presenilins-Associated Rhomboïd-Like

PARP : poly-ADP-ribose polylérase

PARP-1 : Nuclear poly [ADP-ribose] polymerase 1

PBS : Phosphate Buffered Saline

PFA : Paraformaldéhyde

Pi : Phosphate Inorganique

PINK1 : PTEN-induced putative Kinase 1

PK : Protéines Kinases

PLA2G6 : Phospholipase A2

Prdx3 : Peroxyrédoxine III

PRR : Récepteur de reconnaissance des pathogènes

PTP : Pores de perméabilité transitoire

PTPC : Permeability Transition pore Complex

RdRp : RNA-dependent RNA polymerase

RE : Réticulum Endoplasmique

RLR : RIG-1 (Retinoic acid-Inductible Gene-1)-like Receptors

RNP : Particule ribonucléo-protéique

ROS : Reactive Oxygen Species, espèces réactives à l’oxygène

SENP5 : Sentrine-Spécifique 5

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SLA : Sclérose Latérale Amyotrophique

Smac : Second mitochondria- derived activator of caspase

Smac : Second Mitochondria-derived Activator of Caspase

SNC : Système Nerveux Central

SNCA : -synucléine

SOCE : Store-Operated Ca2+ Channels

SOD : Superoxyde Dismutase

SSB : Single Strand Binding protein

StAR : Steroidogenic Acute Regulatory protein

STING : Stimulator of IFN Genes

SUMO : Small Ubiquitin-Like Modifer

SYNJ : Synaptojanin

TFAM : transcription factor A mitochondrial

Tim : Translocase of the Inner Membrane, translocase de la membrane interne

TLR : Toll-like Receptors

TNF-α : Tumor Necrosis Factor α

Tom : Translocase of the Outer Membrane, translocase de la membrane externe

TRAIL-R : Tumor-necrosis-factor Related Apoptosis Inducing Ligand Receptor

TrxR : Thiorédoxine réductases

UCP : Protéine découplante

VDAC : Voltage-dependent anion channels

VPS : Vacuolar Protein Sorting

VSBV-1 : variegated squirrel 1 bornavirus

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LISTE DES ILLUSTRATIONS :

Tableau 1 : Caractéristiques morphologiques des différents types de mort cellulaire.

Figure 1 : Différents modèles actuellement proposés pour l’origine des mitochondries.

Figure 2 : Schématisation de l’origine commune à toutes les mitochondries et leurs

dérivés.

Figure 3 : Imagerie du réseau mitochondrial au 19ème siècle.

Figure 4 : Premières observations en Microscopie Electronique à Transmission (MET) de

« fibres intramitochondriales ».

Figure 5 : Schématisation de la structure mitochondriale.

Figure 6 : Micrographie électronique de fragments submitochondriaux.

Figure 7 : Schématisation de l’ADN mitochondrial humain.

Figure 8 : Représentation schématique du cycle de Krebs.

Figure 9 : Représentation schématique de la structure de la chaîne respiratoire

mitochondriale.

Figure 10 : Représentation simplifiée des voies de signalisations activées par les ROS.

Figure 11 : Représentation schématique des trois voies de signalisation apoptotiques.

Figure 12 : Rôle de la mitochondrie dans l’apoptose.

Figure 13 : Représentation schématique des protéines pro- et anti-apoptotique de la

famille des Bcl-2.

Figure 14 : Représentation de l’homéostasie calcique mitochondriale.

Figure 15 : Transformation du cholestérol en prégnénolone au sein de la mitochondrie.

Figure 16 : Principales protéines de fusion mitochondriales : les mitofusines 1 et 2 et OPA1.

Figure 17 : Modèle de la position des différents acteurs de la fusion sur les membranes

mitochondriales.

Figure 18 : Fonctions biologiques de la dynamique mitochondriale.

Figure 19 : Domaines identifiés dans la protéine de fission DRP1.

Figure 20 : Modèle de fission mitochondriale.

Figure 21 : Modifications post-traductionnelles des protéines de fusion et de fission

21

Figure 22 : Modèle de la régulation de DRP1 par différentes voies de phosphorylation.

Figure 23 : Machinerie du transport axonal des mitochondries.

Figure 24 : Structure du neurone et transport axonal.

Figure 25 : Des défauts dans la dynamique mitochondriale conduisent à un

dysfonctionnement neuronal.

Figure 26 : Représentation schématique du complexe TOM de l’OMM.

Figure 27 : Représentation schématique de la machinerie d’import mitochondrial.

Figure 28 : Réarrangements et couplages de différents complexes protéiques partenaires

afin de déclencher les interrupteurs fonctionnels distincts du complexe TIM23.

Figure 29 : Maladies neurodégénératives associées à des défauts mitochondriaux.

Figure 30 : Dysfonctionnements mitochondriaux dans la maladie d’Alzheimer.

Figure 31 : Rôle dans les dysfonctionnements mitochondriaux des principaux gènes

associés à la MP.

Figure 32 : Rôle de la protéine Htt dans le transport et la dynamique mitochondriale.

Figure 33 : Structures chimiques de différents antioxydants nutraceutiques.

Figure 34 : Mécanismes d’action de différents agents neuroprotecteurs dans les essais

cliniques de la MP.

Figure 35 : Représentation de la particule virale du BDV et son génome.

Figure 36 : Carte des signaux du trafic nucléocytoplasmique des protéines du BDV et de

leurs sites d’interactions

Figure 37 : Localisation subcellulaire de la protéine X.

Figure 38 : Séquence et structure de la protéine X.

Figure 39 : Reconnaissance des virus par l’intermédiaire des récepteurs RLR et voies de

signalisation menant à la production d’IFN-.

Figure 39 : Reconnaissance des virus par l’intermédiaire des récepteurs RLR et voies de

signalisation menant à la production d’IFN-.

Figure 40 : Diagramme schématique de la voie de signalisation apoptotique MAVS-MKK7-

JNK.

Figure 41 : Rôle multifonctionnel de la protéine Hspa9 (mortaline).

Figure 42 : Impact de la protéine X sur la respiration mitochondriale en conditions

physiologiques.

22

Figure 43 : Analyse de l’impact de la protéine X sur le potentiel de membrane, la

production de ROS et la production d’ATP en conditions physiologiques.

Figure 44 : Analyse de l’impact de la protéine X sur les fonctions mitochondriales en

conditions de stress oxydant.

Figure 45 : Interaction entre les protéines X et Hspa9.

Figure 46 : Schématisation de la plateforme microfluidique et vérification de la sous-

expression ou de la surexpression d’Hspa9 en Western Blot.

Figure 47 : La surexpression d’Hspa9 confère une capacité neuroprotectrice face à la

fragmentation axonale induite par la roténone.

Figure 48 : La surexpression d’Hspa9 entraine une filamentation du réseau mitochondrial

en conditions physiologiques.

Figure 49 : La surexpression d’Hspa9 protège aussi bien le potentiel de membrane

mitochondrial que l’expression de la protéine X en cas de stress oxydatif.

Figure 50 : Contrôle de la perméabilisation membranaire mitochondriale (MMP) par les

protéines virales.

Figure 51 : L’expression de la protéine X du BDV ne modifie pas les niveaux d’expression

d’OPA1 ou de DRP1 en conditions physiologiques ou en cas de stress oxydatif à

la roténone.

23

RESUMÉ

Le Bornavirus, un virus à ARN non cytolytique, persiste à vie dans le système nerveux

central des animaux infectés. Cette persistance virale est en grande partie liée à une protéine

virale non structurale appelée X, qui est adressée à la fois au noyau et à la mitochondrie, où

elle interfère avec la réponse antivirale et le déclenchement de l’apoptose. Notre équipe a

récemment prouvé que l'expression isolée de cette protéine suffisait à protéger les neurones

in vitro contre les effets d’une toxine de la chaîne respiratoire mitochondriale et qu’elle

permettait également de les protéger in vivo dans un modèle murin de la maladie de

Parkinson. Lors de ma thèse, nous avons tout d’abord démontré que la protéine X augmentait

la filamentation du réseau mitochondrial, aussi bien en conditions physiologiques qu’en cas

de stress oxydant. Cet effet est particulièrement intéressant compte tenu de l’importance de

la dynamique mitochondriale dans la physiopathologie des maladies neurodégénératives.

Si le potentiel thérapeutique de cette protéine virale est aujourd’hui bien établi, les

mécanismes moléculaires à l'origine de ses effets neuroprotecteurs sont loin d’être tous

compris, mais l'on sait qu'ils sont strictement dépendants de la présence de la protéine X dans

la mitochondrie. Dans ce contexte, le but de mon projet de thèse était de clarifier les

déterminants moléculaires responsables de l'adressage de la protéine X à la mitochondrie

et/ou au noyau, en lien avec ses capacités neuroprotectrices. Nous avons donc construit des

protéines de fusion entre différents mutants de la région amino-terminale de la protéine X et

la protéine GFP, dont nous avons étudié la localisation subcellulaire. Ainsi, nous avons mis en

évidence que cette région contenait des signaux chevauchants et interdépendants

responsables de l’import et l’export nucléaires, ainsi que de l’import mitochondrial. Nous

avons de plus identifié une mutation ponctuelle et une délétion conduisant à la localisation

quasi exclusive de la protéine X à la mitochondrie et augmentant son pouvoir

neuroprotecteur.

24

25

Enfin, nous avons recherché les partenaires mitochondriaux de la protéine X, afin de

mieux caractériser les bases de son potentiel neuroprotecteur. Nous avons ainsi mis en

évidence une interaction entre la protéine X et une protéine chaperonne mitochondriale

nommée Hspa9, récemment mise en cause dans la physiopathologie de nombreuses maladies

neurodégénératives, notamment la maladie de Parkinson. Nous avons montré que la présence

de la protéine X permettait de limiter la baisse d'expression d’Hspa9 provoquée par une toxine

mitochondriale, suggérant un lien fonctionnel entre ces deux protéines. Nous avons aussi

démontré que, comme pour la protéine X, la surexpression d’Hspa9 pouvait protéger des

neurones de la fragmentation axonale provoquée par une toxine mitochondriale

L’ensemble de ces résultats contribue à une meilleure compréhension des mécanismes

à la base du potentiel neuroprotecteur de la protéine X, ce qui pourrait favoriser le

développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

26

27

SUMMARY

Bornavirus, a non-cytolytic RNA virus establishes a long-lasting persistence in the

central nervous system of infected animals. Viral persistence is facilitated by the expression

of the non-structural X protein, which is addressed both to nucleus and mitochondria, where

it interferes both with cellular antiviral responses and the initiation of apoptosis. Our team

recently reported that the singled-out expression of the X protein could protect neurons

against toxins of the mitochondrial respiratory chain, both in vitro and in a mouse model of

Parkinson's disease (PD). During my Ph.D., we further demonstrated that the X protein

triggered enhanced filamentation of the mitochondrial network, in physiological as well as in

oxidative stress conditions. This effect is particularly interesting when considering the

importance of mitochondrial dynamics in the pathophysiology of neurodegenerative diseases.

Even if the therapeutic potential of this viral protein is now well established, the

underlying molecular and cellular mechanisms are far from being elucidated. It is however

clear that neuroprotection conferred by the X protein is strictly dependent on its

mitochondrial localization. In this context, the goal of my Ph.D. project was to clarify the

molecular mechanisms whereby the X protein is targeted to mitochondria and/or to the

nucleus, in link with its protective capabilities. We focused on the amino terminal residues of

X, by performing fusion proteins of various forms of these residues with GFP and by analyzing

their cellular localization. We demonstrated that this region contains overlapping and

interdependent signals for nuclear localization, nuclear export and mitochondrial targeting of

the X protein. We also identified a point mutation or deletion leading to an almost exclusively

mitochondrial localization of the X protein. As a consequence, these X mutants exhibited a

better neuroprotective function.

In order to get further insight into X-mediated neuroprotection, we also searched for

the cellular partners of X in mitochondria. We revealed a direct and specific interaction of the

X protein with the chaperone Hspa9, a protein that was recently shown to be involved in

28

29

neurodegenerative diseases, notably in PD’s patients. We observed that the down- regulation

of Hspa9 triggered by mitochondrial toxins was attenuated by the coexpression of X,

suggesting a functional link between these two proteins. We also demonstrated that Hspa9

overexpression could protect neurons from mitochondrial dysfunctions, similarly to the X

protein.

Altogether, these results have contributed to a better understanding of the

mechanisms underlying the neuroprotective potential of the X protein, which may favor the

development of novel therapeutic strategies.

30

31

32

Figure 1 : Différents modèles actuellement proposés pour l’origine des mitochondries.

(A-D) Modèles proposant l’acquisition des mitochondries par un hôte préalablement

eucaryote.

(E-G) Modèles qui proposent l’endosymbiose d’une mitochondrie ancestrale dans un hôte

procaryote, suivie d’une acquisition des caractères eucaryotes par cet hôte. Les acteurs

microbiens mis en cause sont dénommés (en noir) à côté de leur représentation schématique.

Les membranes lipidiques des Archéobactéries et des Eubactéries sont indiquées,

respectivement, en rouge et en bleu. D’après (Embley and Martin 2006).

33

INTRODUCTION

I) La mitochondrie

1. Les origines

L'origine des mitochondries et leur évolution demeure hypothétique, bien que leur

apparition ait été considérée possible il y a 2 milliards d'années. Cependant, le plus ancien

fossile eucaryote (une cellule possédant un noyau) est daté d'il y a 1,45 milliards d'années. On

peut supposer que les mitochondries sont approximativement aussi vieilles que les cellules

eucaryotes (Poole and Gribaldo 2014).

Il existe actuellement deux principales théories endosymbiotiques concurrentes sur

l'origine des mitochondries qui divisent le monde de la biologie de l'évolution. Elles diffèrent

en ce qui concerne la nature de l'hôte, les capacités physiologiques des mitochondries

originelles et les types d'interactions écologiques qui ont conduit à l'association physique

(symbiose) des deux partenaires (Figure 1) (Embley and Martin 2006).

L'opinion la plus répandue postule que l'hôte qui a acquis les mitochondries était une

cellule anaérobie contenant un noyau, un eucaryote à part entière, qui a été capable

d'absorber la mitochondrie activement par phagocytose. Ce point de vue est lié à l'idée que

l'endosymbiote mitochondriale était en aérobie obligatoire. Il est possible que sa physiologie

et son mode de vie ressemblaient aux espèces Rickettsia modernes et que l'avantage initial

de la symbiose pouvait être la capacité de l'endosymbiote à détoxifier de l'oxygène (O2)

l'hôte en anaérobie. Cependant, l'aspect "détoxification de l'oxygène" est problématique,

car les formes de l'oxygène qui sont toxiques pour les cellules en anaérobie sont des espèces

réactives de l'oxygène (ROS), comme le radical superoxyde O2-. Or, chez les eucaryotes, les

ROS sont produits dans les mitochondries en raison de l'interaction de l'O2 avec la chaîne

de transport d'électrons (ETC). En ce sens, les mitochondries ne résolvent pas le problème

des ROS mais le créent plutôt ; par conséquent, la protection contre l'O2 est un avantage

34

Figure 2 : Schématisation de l’origine commune à toutes les mitochondries et leurs dérivés.

(a) Différents types d’organites liés aux mitochondries (Hydrogenosomes, mitosomes…)

peuvent être retrouvés dans différents taxons de tous les super groupes eucaryotes, tels que

les Amoebozoa et Alveolata. (b) Le dernier ancêtre commun eucaryote (Last Eukaryotic

Common Ancestor LECA) contient une mitochondrie originelle facultative anaérobie d’origine

Alphaproteobacterienne. Les différents types d'organites liés aux mitochondries ont évolué

par la suite à partir de l'ancêtre commun en fonction de la niche écologique et de l'hôte

colonisé. D’après (Zimorski, Ku et al. 2014).

35

symbiotique peu probable. Cette vision traditionnelle ne tient pas compte de l'existence des

mitochondries anaérobies qui n'utilisent pas l'O2 comme accepteur final d'électrons et qui

sont présentes chez de nombreux invertébrés (comme chez le ver Fasciola hepatica et les

Mytilus edulis). Cette théorie ne prend pas non plus en considération les hydrogénosomes,

mitochondries sans ETC qui synthétisent l'ATP à partir de pyruvate via une simple

fermentation et qui se retrouvent chez certains protistes. En suivant cette thèse, il est difficile

d’expliquer pourquoi les mitochondries qui fonctionnent dans des conditions anaérobies sont

présentes dans tant de lignées différentes et comment elles ont été générées à partir

d'ancêtres dépendants de l'oxygène.

De plus, cette théorie suppose que l'hôte est un eucaryote et donc impose une

hypothèse corollaire : tous les descendants de la lignée hôte initiale, sauf celui qui a acquis les

mitochondries, se sont éteints.

Une autre théorie stipule que l'hôte qui a acquis les mitochondries était un

procaryote : une archéobactérie. Selon cette hypothèse la mitochondrie ancestrale serait

métaboliquement polyvalente, en condition anaérobie facultative (capable de vivre avec ou

sans oxygène), peut-être même ressemblante aux Rhodobacterales actuelles en ce qui

concerne leur physiologie et leur mode de vie. L'avantage initial de la symbiose pourrait être

la production de l’hydrogène (H2) par l’endosymbiote en tant que source d'énergie et

d'électrons pour l'archéobactérie. Ce type d'interaction physiologique (transfert d’H2 ou

syntrophie anaérobie) est couramment observé dans les populations microbiennes modernes.

Le mécanisme par lequel l’endosymbiote en est venu à résider dans l'hôte reste à déterminer

; mais il existe certains exemples connus où des procaryotes de la nature vivent en

endosymbiose dans d'autres procaryotes. Dans cette perspective, les diverses formes

aérobies et anaérobies des mitochondries sont considérées comme indépendantes, suite à

des spécialisations écologiques propres à leur lignée, et toutes issues d'un état ancestral en

anaérobie facultative (Zimorski, Ku et al. 2014). Comme cette théorie suppose que les

eucaryotes ont évolué à partir de l’endosymbiose mitochondriale dans un hôte procaryote,

36

Figure 3 : Imagerie du réseau mitochondrial au 19ème siècle.

Dessins histologiques de « bioblastes » dans des cellules musculaires (à gauche, en noir) et

dans des cellules du foie (à droite, en rouge) telles que décrites par Altmann (1890).

Illustrations d’après (O'Rourke 2010).

37

elle permet d’expliquer la diversité des mitochondries (aérobies, anaérobies,

hydrogénosomes …) chez toutes les lignées eucaryotes (Figure 2).

Comme les eucaryotes eux-mêmes, les mitochondries semblent n’être apparues

qu'une seule fois au cours de l'évolution. La meilleure preuve de l'origine unique des

mitochondries provient d’un ensemble de gènes clairement homologues et conservés dans

l'ADN mitochondriale de tous les groupes eucaryotes connus. En ce qui concerne les

hydrogénosomes (qui, généralement, ne contiennent pas d’ADN) et les mitosomes (organites

trouvés chez certains organismes unicellulaires eucaryotes qui n’ont jamais d’ADN (Leon-Avila

and Tovar 2004)), il existe deux preuves de leur ascendance commune avec les mitochondries.

Tout d’abord les mécanismes d’import des protéines mitochondriales sont conservés chez les

hydrogénosomes et les mitosomes (Pavel Dolezal 2006). Deuxièmement, toutes les lignées

connues d’eucaryotes qui possèdent des hydrogénosomes et des mitosomes sont des lignées

phylogénétiques sœur de celles portant des mitochondries (Zimorski, Ku et al. 2014).

2. La découverte : petit historique

Qui a découvert la mitochondrie ? Il n'existe pas de réponse simple à cette question.

Le processus d'identification de ces organites dura au moins un siècle et demi. Les premiers

scientifiques dont le nom est associé à la découverte de l'existence des mitochondries ont

travaillé au milieu du XIXème siècle. En 1857, Albert Von Kölliker décrit ce qu'il appelle des

« granules » dans des cellules musculaires. D'autres scientifiques de l'époque ont également

remarqué ces « granules » dans d'autres types cellulaires. Il est plus généralement accepté

que la « vraie » découverte des mitochondries eut lieu en 1886 lorsque le cytologiste

allemand Richard Altman identifia ces organites comme autonomes métaboliquement et

génétiquement et les surnomma "Bioblastes" (Figure 3). Il postula alors que ces structures

étaient les unités de base de l'activité cellulaire (O'Rourke 2010) (Altmann 1890).

En 1898, Carl Benda a quant à lui inventé le terme de « mitochondries » en le dérivant du

grec ancien : « mitos » signifiant « fil » et « chondros » qui signifie granule (Benda 1898).

38

39

De nombreux chercheurs ont commencé à travailler sur cet organite au cours des

décennies qui suivirent, et bon nombre d’entre eux ont découvert une fonction

mitochondriale primordiale dans la cellule. En 1912, un médecin biochimiste allemand nommé

Otto Heinrich Warburg émit l’hypothèse qu'une enzyme mitochondriale permettait

l’utilisation de l'oxygène. Selon lui, l’apparition du cancer serait due à un dysfonctionnement

mitochondrial ; au lieu de consommer de l’oxygène, les cellules fermenteraient le glucose. Il a

notamment démontré que le cyanure avait un effet sur la respiration cellulaire et il fut le

premier à observer que les cellules tumorales présentaient une altération du métabolisme et

de la bioénergétique (Alam, Lal et al. 2016) (Warburg 1928). De plus amples recherches furent

conduites par David Keilin qui démontra que l’état d’oxydation des cytochromes

(hémoprotéines responsables du transport d’électrons) était modifié lors de la respiration. Il

identifia plus tard l’existence du cytochrome c : petite hémoprotéine soluble associée à la

membrane interne de la mitochondrie (Wojtczak 2006).

L'adénosine triphosphate (ATP), le transporteur d'énergie chimique cellulaire, a été

isolé en 1929 par C.H. Fiske et Y. Subbarow (Fiske 2002). Cette molécule possède des liaisons

phosphoriques très riches en énergie lors de leur hydrolyse. En 1930, V.A. Engelhardt décrit

que la production de l'ATP est dépendante de la consommation d'O2 et perçoit de ce fait la

signification biologique de la respiration (Kalckar 1941). Ses données ont été complétées par

les résultats obtenus par H.M. Kalckar et V.A. Belitser qui ont introduit le concept de

phosphorylation (V.A. Belitzer 1939). Au cours du temps, l’ATP a été accepté comme étant

une source universelle d'énergie utilisée dans une grande variété de processus vitaux

(notamment dans les processus de l'activité musculaire). Effectivement, l’activité adénosine

triphosphatase de la myosine fut une découverte majeure promue par les biochimistes V.A.

Engelhardt et M.N. Lyubimova (V.A Engelhardt 1939).

Des préparations enrichies en mitochondries à partir de cellules hépatiques de rat

permirent, en 1950, à Eugene Kennedy et Albert Lehninger de montrer que la mitochondrie

est le siège du métabolisme oxydatif chez les eucaryotes. Ils émirent alors l'hypothèse que

40

Figure 4 : Premières observations en Microscopie Electronique à Transmission (MET) de

« fibres intramitochondriales ».

Portion de la ligne primitive d’un embryon de poulet fixé avec du tétroxyde d'osmium, puis

traité avec 0,5% d’acétate d'uranyle pendant 2 heures ; sections colorées avec de l'hydroxyde

de plomb. Les zones de faible densité dans les mitochondries contiennent de fines fibrilles

(flèches). La structure de ces fibres est sensiblement similaire à celle observée avec de l’ADN

purifié. D’après (Margit M. K. NASS 1963).

41

l'oxydation des acides gras, la phosphorylation oxydative et le cycle de Krebs se produisaient

dans un organite délimité par une membrane imperméable à certains solutés, et que cet

organite pouvait être la mitochondrie, cela avant même que des mitochondries

fonctionnellement et morphologiquement intactes n’aient encore été isolées. Parallèlement,

George Palade mit au point un procédé pour l'isolement des mitochondries en les purifiant

par centrifugation différentielle sur 0,88 M de saccharose (George H. Hogeboom 1948).

Kennedy testa alors immédiatement son hypothèse sur des mitochondries isolées, par cette

méthode, et obtint la preuve que toutes les réactions énumérées ci-dessus se produisaient

effectivement dans celles-ci (E.P. Kennedy 1949). Puis, en 1961, Peter D. Mitchell, prix Nobel

de chimie 1978, proposa une hypothèse chimiosmotique. Sa théorie suggérait que la synthèse

d’ATP se fait essentiellement grâce au gradient électrochimique situé de part et d’autre de la

membrane interne des mitochondries et que ce processus utilise l’énergie du NADH,H+

(Nicotinamide Adenine Dinucleotide) et du FADH2 (Flavine Adénine Dinucléotide) formés à

partir de la décomposition de molécules riches en énergie telles que le glucose (Mitchell

1961). Parallèlement, Paul Boyer développa la théorie du mécanisme de changement de

liaison, ou flip-flop, qui postule que la synthèse d'ATP [à partir d’Adénosine Diphosphate (ADP)

et d’un Phosphate Inorganique (Pi)] dépend d'un changement de conformation de l'ATP

synthase généré par la rotation de sa sous-unité gamma, découverte qui lui valut le prix Nobel

de chimie en 1997 (Shampo, Kyle et al. 2011).

Enfin, on doit la découverte de l'ADN mitochondrial à Margit M. K. Nass et Sylvan Nass,

d’une part, qui discernèrent, par microscopie électronique à transmission (MET), des « fils »

sensibles aux DNases à l'intérieur de la mitochondrie (Margit M. K. NASS 1963) (Figure 4).

D’autre part, l'ADNmt fut identifié grâce aux tests biochimiques effectués sur des fractions

mitochondriales hautement purifiées par Ellen Haselbrunner, Hans Tuppy et Gottfried Schatz

(G. Schatz 1964).

42

Figure 5 : Schématisation de la structure mitochondriale.

Les mitochondries sont délimitées par une double structure membranaire composée d’une

membrane interne et d’une membrane externe séparées par l’espace intermembranaire. La

membrane interne entoure la matrice mitochondriale et forme des circonvolutions appelées

crêtes. D’après academic.brooklyn.cuny.edu.

43

3. Structure et Fonctions

a. Structure

La fluctuation du nombre de mitochondries dans chaque cellule est importante,

puisque l’on peut observer d'une seule à 10.000 mitochondries pour certains types de cellules

spécialisées. Le nombre « typique » de mitochondries par cellules est d’environ 200. Ces

organites, de forme ellipsoïde ont des dimensions de 1-2 à 10 µm de long et de 0,5 à 1 µm de

large. Les mitochondries peuvent apparaître sous forme de sphères, de tiges ou de filaments,

mais leur architecture générale reste la même (Figure 5). Une double membrane les délimite.

La membrane externe mitochondriale (Outer Mitochondrial Membrane, OMM) est une

bicouche phospholipidique relativement simple, contenant des complexes protéiques appelés

porines qui la rendent perméable à des molécules d’environ 10 kiloDaltons (kDa) ou moins.

Cette membrane externe permet notamment le passage de l'oxygène, du pyruvate, de l'ATP

et d'autres molécules (ions, nutriments etc.). La membrane mitochondriale interne (Inner

Mitochondrial Membrane, IMM) est quant à elle seulement perméable à l'oxygène, au

dioxyde de carbone et à l'eau. Sa structure est extrêmement élaborée et inclut tous les

complexes du système de transfert d'électrons, de l’ATP synthase et des protéines de

transport. L’IMM possède de nombreux repliements que l’on appelle crêtes et qui

augmentent considérablement la surface totale de cette dernière.

Les membranes interne et externe sont caractérisées par une composition différente

en phospholipides et en protéines. Pour la membrane externe, le rapport protéines/lipides

est d'environ 50/50 ; elle permet surtout la séparation des mitochondries du reste de la

cellule mais également la création de « sites de contact », avec d’autres composants

cellulaires, essentiels pour la communication et le transport (Rowland and Voeltz 2012).

Dans la membrane interne, ce rapport protéines/lipides 80/20 est en faveur des protéines

dont une forte proportion est impliquée dans le métabolisme énergétique (en particulier

dans la composition de la chaîne respiratoire et la synthèse de l'ATP) (Taylor, Fahy et al. 2003).

44

Figure 6 : Micrographie électronique de fragments submitochondriaux.

Des petites sphères de 8,4 nm de diamètre, ou particules, semblent projetées au-dessus de la

surface de la membrane interne (flèches blanches). Il sera prouvé par la suite que ces

particules sont constituées par le complexe F1 de l’ATP synthase (Nicole Kresge 2006). D’après

(B. Chance 1963).

45

D’après l’observation de Green et Perdue en 1966, la surface extérieure de l’OMM et

la surface matricielle de l’IMM sont recouvertes de milliers de petites particules (Green DE

1966). Les particules de l’OMM furent décrites comme étant « sans tiges » et dénommées les

sous-unités de Parsons. Ces particules de Parsons sont censées être impliquées dans des

réactions d’oxydation et fournir les électrons à l’organite. Cependant, de récentes études

remettent en cause leur existence même.

Les particules situées sur le pourtour interne de l’IMM furent appelées sous-unités de

Fernandez-Moran, particules de transport d’électrons (ETP) ou oxysomes. Ces dernières ont

un diamètre de 8,4 nm et sont espacées par un intervalle régulier de 10 nm (FERNANDEZ-

MORAN 1962). Sur les premières micrographies au MET (utilisant des fragments obtenus par

traitements aux ultrasons de préparations de membrane interne), ces tige-boucles semblent

comme projetées au-dessus de la surface de l’IMM [Figure 6 (B. Chance 1963)]. Une agitation

douce de préparations de membranes isolées sépare ces particules de la membrane, il devient

ainsi possible d’obtenir deux fractions. Ces particules isolées catalysent l’hydrolyse de l’ATP

(la réaction inverse de celle catalysée par l’ATP synthase). Les IMM dépourvues de ces

particules peuvent encore transporter des électrons, ré-oxyder un porteur d’électrons, mais

ne peuvent plus faire la synthèse de l’ATP. Dans l’une des premières expériences de

reconstitution, Ephraïm Racker a montré que l’addition de particules isolées à des membranes

qui en avaient été dépourvues restaurait une synthèse d’ATP (dépendante de la chaîne de

transport des électrons). Nous savons aujourd’hui que cette structure en tige-boucle

correspond à la sous-unité globulaire F1 de l’ATP synthase, d’où son nom de particule F1 (Nicole

Kresge 2006).

L'espace entre les deux membranes est appelé espace inter-membranaire

mitochondrial (IMS). Avec l’IMM, il est le siège des réactions de phosphorylation oxydative et

mesure 40 à 70 Å de large. En raison de la présence des canaux dans l’OMM, le contenu de

l’IMS est assez similaire à celui du cytoplasme. La cavité au sein des crêtes est appelée l'espace

inter-crêtes, elle est en continuité avec l'IMS.

46

Figure 7 : Schématisation de l’ADN mitochondrial humain.

Malgré ses 37 gènes, seules 13 protéines sont codées par l'ADN mitochondrial, toutes

impliquées dans la phosphorylation oxydative. Parmi les autres gènes, 22 gènes codent pour

des ARN de transfert et 2 pour des ARN ribosomiques qui sont nécessaires à la traduction des

protéines. La région non codante, D-Loop, est impliquée dans la régulation de la réplication

de l'ADNmt et contient le site d’origine de la réplication et de la transcription (OH/OL= Origins

of heavy- and light-strand replication ; LSP= Light Strand Promoter/ HSP= Heavy Strand

Promoter).

D’après https://themitoblog.wordpress.com/tag/mitochondria-blog.

47

L’IMM délimite ce qui est communément nommé matrice mitochondriale qui contient

des granules denses (300-500 Å), des ribosomes et de l'ADN mitochondrial (ADNmt). Les

granules sont constitués de sels minéraux insolubles et sont considérés comme des sites de

liaison des ions divalents, notamment Mg2+ et Ca2+. La matrice est le siège de nombreuses

voies métaboliques telles que le cycle de Krebs ou l’oxydation des acides gras.

L'ADNmt diffère de l'ADN nucléaire à plusieurs égards : sa teneur en guanine et

cytosine est plus élevée, par conséquent sa densité de flottaison est également plus élevée.

Comme l’ADN nucléaire, l’ADNmt est double-brin mais il est sous forme circulaire. On sait

aujourd’hui que l'ADNmt n’est pas libre au sein de la matrice mitochondriale mais qu’il est

disposé dans des structures appelées nucléoïdes. Il peut y avoir de 2 à 7 répétitions d’ADNmt

dans chaque nucléoïde, maintenues par la protéine TFAM (transcription factor A,

mitochondrial) qui est aussi nécessaire pour la transcription de l’ADNmt (Ngo, Lovely et al.

2014). Des protéines impliquées dans la réplication de l'ADNmt sont souvent associées à ces

structures, comme par exemple, la polymérase POLG de l'ADNmt, les protéines de liaison à

l'ADN mtSSB (Single Strand Binding protein) et une hélicase appelée Twinkle. Il est fréquent

qu’il y ait plus d’un nucléoïde par mitochondrie puisque chaque mitochondrie (selon les types

cellulaires) possède entre 10 et 100 molécules d’ADNmt (Alexeyev, Shokolenko et al. 2013).

La quantité de l'information génétique portée par l'ADN mitochondrial ne suffit pas à

coder l'ensemble des protéines et des enzymes présentes dans cet organite. Chez les

Hommes le génome mitochondrial a une taille comprise entre 16,2 et 16,7 kb et encode 13

des sous-unités de la chaîne de transport des électrons : ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5 et

ND6 (complexe I) ; Cytb (complexe III) ; COXI, COXII, COXI (complexe IV) ; ATP6 et ATP8

(complexe V) ainsi que pour 22 ARN de transfert (ARNt) et 2 ARN ribosomiques (ARNr) (Figure

7) (Maureen J. Bibb 1981) (S. Anderson 1981). Ce génome contient une importante région

non codante : la boucle de « déplacement » (D-loop). Celle-ci comprend deux portions

hypervariables, qui, grâce à des variants spécifiques, permettent d’étudier le mode de

transmission de ce génome hérité par la mère (R E Giles 1980). Elle est également la région

de contrôle où les facteurs de réplication et de transcription (codés par l’ADN nucléaire)

48

Figure 8 : Représentation schématique du cycle de Krebs.

Le cycle de Krebs ou cycle du citrate a lieu dans la mitochondrie chez les eucaryotes. Il

comporte huit réactions enzymatiques décomposables en réactions simples. Les huit enzymes

mises en jeu sont les suivantes : 1) Aconitase, 2) Isocitrate Déshydrogénase, 3) α Cétoglutarate

Déshydrogénase, 4) Succinyl-CoA Synthétase, 5) Succinate Déshydrogénase (complexe II de la

chaîne respiratoire), 6) Fumarase,7) Malate Déshydrogénase, 8) Citrate Synthase. Cette étape

finale du catabolisme oxydatif des carbohydrates (glucose…) et des acides gras assure la

production de la plus grande part des besoins énergétiques de la cellule grâce à la formation

de coenzymes réduits (NADH+H+ et FADH2) qui seront réoxydés dans la chaîne respiratoire.

β oxydation

1

2

3

4 5

6

7

8

49

initient la réplication et la transcription de ce génome d'origine bactérienne (Kucej and Butow

2007). Longtemps, l’ADNmt n’a semblé avoir pour seul rôle que d’encoder des protéines clés

associées à la chaîne respiratoire afin de générer la grande majorité de l'ATP cellulaire.

Cependant, il apparaît aujourd’hui clairement que le génome mitochondrial possède un rôle

majeur dans le développement cellulaire, en particulier dans la différenciation cellulaire, et

dans la médiation de nombreux autres processus cellulaires.

b. Respiration cellulaire

Pour résumer, les mitochondries sont des organites cellulaires semi-autonomes,

considérés comme les descendants de protéobactéries endosymbiotiques qui, non seulement

hébergent des processus métaboliques tels que la synthèse de stéroïdes hormonaux, mais

régulent également les réponses aux dommages cellulaires. Cependant leur fonction la plus

connue reste la respiration ; c’est à dire la production d’ATP (fournisseur universel d’énergie)

grâce à la consommation d’oxygène. Les réactions de phosphorylations oxydatives (OXPHOS)

réalisées dans l’IMM [ou plus précisément au niveau des crêtes mitochondriales, (Cogliati,

Enriquez et al. 2016)] permettent la transformation de l’énergie contenue dans les nutriments

en énergie utilisable par la cellule. La dégradation des nutriments permet de fournir à la chaîne

respiratoire du pouvoir réducteur sous forme de NADH + H+ et de FADH2.

Ces équivalents réduits sont produits grâce au cycle de Krebs ayant lieu dans la

matrice mitochondriale. Ce dernier est la deuxième étape de la respiration aérobie après la

glycolyse et avant les réactions d’OXPHOS de l’ETC. Il participe au métabolisme des glucides,

des lipides et des protéines. Cette voie métabolique produit des substrats énergétiques qui

assurent l’essentiel des besoins en énergie de la cellule. Ce cycle repose sur la modification

d’une molécule de citrate par l’intermédiaire d’enzymes et de cofacteurs. Il comporte huit

réactions enzymatiques décomposables en réactions simples. Le cycle génère ainsi huit

molécules différentes dont un nouveau citrate à la fin du cycle. Dans l’ordre, il produit

d’abord du citrate, puis de l’isocitrate, de l’alphacétoglutarate, du succinyl CoA, du succinate,

du fumarate, du malate, de l’oxaloacétate et finalement du citrate régénéré (Figure 8).

50

Figure 9 : Représentation schématique de la structure de la chaîne respiratoire

mitochondriale.

La chaîne respiratoire est située dans la membrane interne de la mitochondrie. Elle est

composée de quatre complexes protéiques : le complexe I (NADH déshydrogénase), le

complexe II (succinate déshydrogénase), le complexe III (ubiquinone cytochrome c

oxydoréductase) et le complexe IV (cytochrome c oxydase). Le transfert des électrons depuis

les équivalents réduits (NADH+H+ et FADH2) le long des complexes permet le pompage des

protons par les complexes I, III et IV vers l’espace intermembranaire créant ainsi un gradient

électrochimique. Le retour des protons dans la matrice par l’ATP synthase permet de coupler

la respiration à la synthèse d’ATP.

51

Le NADH + H+ et le FADH2 sont réoxydés par transfert de leurs électrons sur un

accepteur final : l’oxygène. Cette étape est réalisée par l’intermédiaire de l’ETC sur laquelle

les électrons vont transiter en fonction de leur potentiel d’oxydo-réduction (Figure 9). Ainsi,

le NAD+ ayant une faible affinité pour les électrons, sa forme réduite, le NADH+H+, peut

facilement perdre deux électrons, alors que l’O2, possède une très forte affinité pour les

électrons et capture facilement ceux des autres molécules. Il va donc s’établir, le long de la

chaîne respiratoire, un gradient de potentiel d’oxydoréduction et les électrons vont transiter

de molécules à faible potentiel (telles que le NAD+ qui a un potentiel de – 320 mV) vers des

molécules à fort potentiel (telles que l’oxygène qui a un potentiel de + 816 mV) (Huttemann,

Lee et al. 2008).

La chaîne respiratoire mitochondriale est constituée de cinq complexes protéiques,

eux-mêmes composés de différentes sous-unités codées soit par le génome nucléaire soit par

le génome mitochondrial. Il s’agit du complexe I (NADH deshydrogénase), complexe II

(succinate deshydrogénase), complexe III (ubiquinol cytochrome c oxydoréductase), complexe

IV (cytochrome c oxydase) et complexe V (ATP synthase). Au niveau des complexes I, III et IV,

le transfert des électrons s’accompagne d’un pompage de protons de la matrice vers l’espace

intermembranaire, générant ainsi une force protomotrice qui est la somme du gradient de pH

et du potentiel membranaire d’environ -150 mV (négatif du côté matriciel). Ce gradient

électrochimique est ensuite utilisé par l’ATP synthase pour la phosphorylation de l’ADP en ATP

(Figure 9) (Campanella, Parker et al. 2009).

Plus précisément, lorsque le NADH + H+ arrive au niveau de l'ETC, il est

immédiatement oxydé en NAD+ par le complexe I. Ses protons (ions hydrogène) sont

relargués dans la matrice et ses électrons sont capturés. La NADH deshydrogénase catalyse

le transfert de ces deux électrons à l’ubiquinone, ce qui permet la translocation de quatre

protons au travers de la membrane et participe ainsi à la force protomotrice (Sazanov 2007).

Le complexe I est constitué d’environ 45 sous-unités, 38 d’entre elles sont codées par le

génome nucléaire, tandis que 7 autres sont codées par le génome mitochondrial. La NADH

deshydrogénase est l’enzyme la plus grande et la plus complexe de l’ETC. Quatorze sous-

52

53

unités centrales représentent sa structure et peuvent être affectées à des modules

fonctionnels pour l'oxydation du NADH, la réduction de l'ubiquinone et le pompage des

protons. En outre, cette enzyme mitochondriale comprend 30 sous-unités accessoires,

entourant ses sous-unités centrales et qui ne sont pas directement liées à la conservation de

l'énergie (C. Wirth 2016).

L'activité succinate déshydrogénase du complexe II est essentielle pour assurer, à la

fois, le fonctionnement du cycle de Krebs et de l’ECT. L’oxydation du succinate permet la

réduction de son cofacteur le FAD en FADH2 qui est ensuite ré-oxydé par le coenzyme Q10

(ubiquinone). Ce complexe mitochondrial est le moins étudié et le plus petit des cinq

complexes mitochondriaux de l’ETC. Il est constitué de quatre sous-unités codées par l’ADN

nucléaire (Huang and Millar 2013).

Tout comme le complexe I, le complexe III, aussi appelé cytochrome bc1, possède un

rôle central dans l’établissement du gradient électrochimique entre la matrice et l’IMS. En

effet, cette enzyme catalyse le transfert de deux électrons de l’ubiquinol (forme réduite de

l’ubiquinone) au cytochrome c ; cette étape est associée au transfert de 4 protons de la

matrice vers l’espace inter-membranaire (Trumpower 1990). L’ubiquinol cytochrome c

oxydoréductase possède une structure dimérique où chaque monomère est composé de 11

sous-unités dont 3 seulement possèdent une activité catalytique (Hagras and Stuchebrukhov

2016).

La phase finale de l’ETC est l'oxydation du cytochrome c (préalablement réduit par

les complexes II et III) couplée à la réduction de l'O2 en deux molécules d’H2O. Lors de cette

étape, 4 protons sont consommés et 4 autres sont transloqués de la matrice vers l’IMS. Cette

réaction est catalysée par la cytochrome c oxydase (complexe IV). Son isoforme humaine est

composée de 13 sous-unités dont trois (COX I, COX II et COX III) sont codées par le génome

mitochondrial et forment le noyau fonctionnel du complexe enzymatique (Youfen Li 2006).

54

55

Enfin le complexe V ou ATP synthase va synthétiser de l'ATP à partir d'ADP et d’un Pi

dans la matrice mitochondriale en utilisant l'énergie fournie par le gradient électrochimique

de protons (Roderick A. Capaldi 1994). Elle est constituée de deux sous-complexes. La partie

F0 est intégrée à la membrane interne mitochondriale et conduit les protons depuis l’espace

intermembranaire vers la matrice. Le segment F1, quant à lui matriciel et au contact de la

membrane interne, utilise la force protomotrice pour convertir l’ADP en ATP (Jonckheere,

Smeitink et al. 2012).

En plus des dimères de complexes d’OXPHOS, des super-complexes ou respirasomes,

ont été rapportés chez les eucaryotes comme formant une structure supramoléculaire

englobant deux ou trois des complexes respiratoires I, III et IV, super-complexes d’une grande

importance fonctionnelle (Boekema and Braun 2007). Cet agencement des composants

OXPHOS rendrait possible une augmentation des taux de transfert des électrons due à une

canalisation efficace des substrats, comme cela a été montré in vitro pour le transfert

d'électrons entre les complexes I et III (Hermann Schagger 2000). Une organisation en

supercomplexe a également été décrite pour l'ATP synthase avec des transporteurs

d’ADP/ATP et de Pi permettant ainsi un apport et une élimination efficaces des substrats et

des produits de la synthèse d'ATP (Chen, Ko et al. 2004).

c. Régulation du stress oxydant

Il existe plusieurs sources de ROS, molécules hautement réactives, dans une cellule.

Elles sont générées en tant que sous-produits de la respiration aérobie et par divers autres

processus cataboliques et anaboliques (Halliwell 1991). Cependant, les mitochondries

demeurent le principal producteur de ROS, dont la majeure partie est générée au niveau de

l’ETC (R.G. Hansford 1997) (Chance, Sies et al. 1979). En effet, il va y avoir une fuite d’électrons

hors de la chaîne respiratoire et ces derniers peuvent réagir avec l'oxygène pour produire des

anions superoxyde (O2•−). Ces derniers peuvent être, par la suite, convertis en peroxyde

d'hydrogène (H2O2) ou en radicaux hydroxyle (•OH) lors de diverses réactions

d’oxydoréduction (Murphy 2009). Les complexes I et III sont fréquemment considérés comme

56

Figure 10 : Représentation simplifiée des voies de signalisations activées par les ROS.

L’O2•− est généré des deux côtés de l’IMM et il est donc présent au niveau de la matrice

mitochondriale et de l’IMS. L’O2•− peut être ensuite converti en H2O2 par des superoxydes

dismutases (SOD1 dans l’IMS et SOD2 dans la matrice). Le peroxyde d'hydrogène résultant

peut alors traverser les membranes et entrer dans le cytosol afin de promouvoir diverses voies

de signalisation redox. L’O2•− non transformé peut également jouer ce rôle et traverser

l’OMM grâce au canal anionique voltage dépendant (Voltage-Dependent Anion

Channel,VDAC). L’O2•- et l’H2O2 peuvent également oxyder ou modifier d'autres molécules

dans les mitochondries qui seront libérées / exposées au cytoplasme (seconds messagers

sensibles au potentiel redox; X). L’O2•− peut également réagir avec l’oxyde d’azote (NO), et

produire le peroxynitrite (ONOO•−) très réactif. Le peroxyde d'hydrogène peut être éliminé

par voies enzymatiques de la glutathion peroxydase (GPx) ou de la peroxyrédoxines III (Prdx3)

dans la matrice mitochondriale.

57

les principaux sites de production de ROS, mais des études plus récentes indiquent qu'au

moins dix autres enzymes mitochondriales, dont le complexe II, y contribuent aussi

(Anderson, Bowman et al. 2014) (Quinlan, Orr et al. 2012) (Holbrook 2000). Il est d’ailleurs

très probable que les différents sites de production de ROS possèdent des rôles de

signalisation distincts et que les sites de production changent eux-mêmes en fonction des

conditions physiologiques.

En plus d'être générées au cours du métabolisme cellulaire dans la mitochondrie, les

ROS peuvent être produites en réponse à divers stimuli environnementaux tels que les

facteurs de croissance, des cytokines inflammatoires, les rayonnements ionisants, les UV, des

oxydants chimiques, des composants chimiothérapeutiques, une hypoxie, des toxines et des

métaux de transition (Hussain, Hofseth et al. 2003) (O'Neill and Wardman 2009) (McMillan,

Leatherman et al. 2008).

Une fois produites, les ROS réagissent avec les lipides, les protéines et les acides

nucléiques et causent des dommages oxydatifs à ces macromolécules. Les ROS vont

provoquer notamment une variété de lésions dans l'ADN, telles que l’oxydation des bases de

l'ADN, des sites abasiques et des cassures dans les brins de la double hélice, ce qui conduit

finalement à une instabilité génomique (Dizdaroglu, Jaruga et al. 2002). Tous ces dommages

dans les cellules entraînent le vieillissement et plusieurs maladies liées à l’âge, y compris des

maladies cardiovasculaires, des troubles neurologiques et du diabète (R.G. Hansford 1997;

Cui, Kong et al. 2012). Si la mitochondrie est considérée comme l’une des principales sources

de ROS intracellulaires, elle en est surtout la cible principale. Les ROS peuvent avoir une action

directe sur le fonctionnement mitochondrial. Par exemple, l’O2•− peut réagir avec l’oxyde

d’azote (NO) et produire le peroxynitrite (ONOO•−) qui va inhiber la chaîne respiratoire et

endommager différents composants mitochondriaux (complexes de l’ETC, l’IMM, l’ADNmt…)

(Figure 10) (Rafael Radi 2002).

Le paradoxe des radicaux libres en biologie est qu’ils constituent des espèces

extrêmement dangereuses, susceptibles d'engendrer un nombre considérable de maladies,

58

59

tout en restant indispensables à la vie. Ils remplissent, en effet, de très nombreuses fonctions

utiles qui, mis à part la phagocytose, ont été découvertes récemment. Les radicaux libres

participent au fonctionnement de certaines enzymes, à la transduction de signaux cellulaires,

à la défense immunitaire contre les agents pathogènes, à la destruction par apoptose des

cellules tumorales, au cycle cellulaire, à la différentiation cellulaire, au fonctionnement de

certains neurones, à la fécondation de l'ovule, à la régulation des gènes (phénomène appelé

contrôle redox des gènes) etc… (Horvath, Andrews et al. 2009) (Piao, Lee et al. 2016) (Leloup,

Magnan et al. 2006) (Diano, Liu et al. 2011; Yang, Bazhin et al. 2013) (Agarwal, Allamaneni et

al. 2005; Benani, Troy et al. 2007; Andrews, Liu et al. 2008) (KH. Al-Gubory 2016) (Mei-Chi

Chang, Sin-Yuet Yeung et al. 2016) (Figure 10). Des études suggèrent également que

l'homéostasie redox est liée à la dynamique mitochondriale (phénomènes de fission et fusion

des membranes mitochondriales) dépendant du type cellulaire et du tissu (Willems, Rossignol

et al. 2015).

De fait, les cellules utilisent de nombreuses stratégies antioxydantes et consomment

beaucoup d'énergie pour maintenir les ROS à un niveau non cytotoxique. Certains composés

antioxydants non enzymatiques comme les vitamines E (tocophérol) et C (ascorbate) ou les

caroténoïdes apportés par les aliments, agissent en piégeant les radicaux et en captant les

électrons libres, les transformant en molécules ou en ions stables (Cobley, McHardy et al.

2015) (Krinsky 1989).

Les mitochondries possèdent un rôle primordial dans cette régulation du stress

oxydatif. Premièrement, le débit de production de ROS se fait en fonction du flux d’électrons

dans la chaîne respiratoire et du degré de réduction des transporteurs d’électrons, mais la

production de ROS semble moins liée au flux d’électrons qu’au potentiel de membrane

intrinsèque. En effet, une relation directe a été mise à jour entre le potentiel de membrane et

la production d’anion superoxyde (Korshunov, 1997). Deuxièmement, la mitochondrie

possède un bon nombre de systèmes antioxydants enzymatiques ou non enzymatiques.

Elle contient notamment de l’ubiquinone (ou Coenzyme Q10, CoQ10) qui, comme

60

61

expliqué ci-dessus, est un co-facteur essentiel dans l’ETC en agissant comme accepteur des

électrons provenant des complexes I et II. Outre cette fonction énergétique importante, le

CoQ10 est aussi considéré comme étant l’agent antioxydant membranaire le plus efficace

après l’α-tocophérol. Son caractère lipophile fait que le CoQ10 est présent dans les

membranes biologiques. Au même titre que l’α-tocophérol, il est un puissant inhibiteur de la

peroxydation lipidique grâce à la capture d’un radical lipidique peroxyle (LOO•). (Cillard,

1980). Il ne faut pas non plus perdre de vue, qu’au niveau des crêtes de l’IMM et dans l’IMS,

le cytochrome est un piégeur d’anion superoxyde.

Les principales enzymes antioxydantes sont la superoxyde dismutase (SOD), la

glutathion peroxydase (Gpx) et la catalase (CAT). Il en existe d’autres ayant des propriétés

antioxydantes telles que les peroxyredoxines. Grâce aux propriétés redox des métaux, les

SODs et les CATs réalisent respectivement la dismutation de l’O2•−’en H2O2 et en O2 et la

dismutation du H2O2 en H2O et en O2. Leur activité réductrice est indépendante du pouvoir

réducteur du NADH (ou du NADPH). Les peroxydases catalysent la réduction du H2O2 en H2O

et des peroxydes organiques en alcool grâce au pouvoir réducteur du NADH (ou du NADPH).

Il existe 3 isoformes de SOD chez les mammifères : une forme cytosolique et nucléaire

associée aux ions cuivres et zinc, une forme mitochondriale associée au métaux de

transition dont le manganèse (SOD Mn) et une forme extracellulaire (McCord and Fridovich

1969). La forme mitochondriale permet la dismutation quasi spontanée de l’anion superoxyde

au niveau de l’ETC. En effet l’O2•− produit au sein de l’IMS ou au niveau de la matrice

mitochondriale sera converti en H2O2 par SOD1 et SOD2 respectivement (Figure 10). Si la SOD

Mn semble indispensable à la vie, ce n’est pas le cas pour la forme cytosolique malgré le rôle

important de cette dernière dans l’élimination des ROS (Li, Huang et al. 1995).

On dénombre actuellement 4 isoformes de glutation peroxydase (GPx) dans les cellules

des mammifères, mais c’est la GPx1 qui est la plus abondante dans le cytosol où elle

prédomine ; dans les mitochondries, elle est moins abondante mais présente. Avec la GSH

réductase, une enzyme à flavine utilisant le NADPH, la GPx1, codée dans le noyau et importée

62

63

dans les mitochondries, permet un cycle de réduction du peroxyde d'hydrogène (Knopp, Arndt

et al. 1999) (Arai, Imai et al. 1996).

La glutaredoxine mitochondriale (Grx-2), découverte par Gladyshev et al. en 2001,

possède des fonctions encore mal connues mais elle réduit l’H2O2 et les hydroperoxydes

organiques en utilisant le glutathion comme co-facteur (Gladyshev VN, Liu A et al. 2001)

(Fernando, Lechner et al. 2006).

Les thiorédoxine réductases (TrxR) interviennent aussi dans la dégradation des

peroxydes lipidiques et du peroxyde d’hydrogène ainsi que dans la régénération du radical

ascorbyle en acide ascorbique. Les deux thiorédoxine réductases des mammifères, TrxR-1 et

TrxR-2 (mitochondriale) catalysent la réduction par le NADPH du disulfure des thiorédoxines

oxydées. En coopération avec ces dernières, elles contribuent à la régulation des potentiels

redox cytosoliques et mitochondriaux (Gromer, Johansson et al. 2003).

On trouve également dans la mitochondrie une catalase (mitCAT) traduite par les

ribosomes mitochondriaux, mais aussi une catalase importée du cytosol. Ainsi, les CATs furent

d’abord considérées comme les enzymes principales qui permettent à la mitochondrie de

maintenir en dessous de 10-7 M la concentration en H2O2 (Chance and Oshino 1971) (B.

Chance, H. Sies et al. 1979). Après contestation, leur présence dans la mitochondrie fut

démontrée dans le cœur et dans le foie par des critères biochimiques et immunochimiques

(R. Radi, JF. Turrens et al. 1991) (Salvi, Battaglia et al. 2007). Le gène mCAT est codé par l’ADN

mitochondrial (Schriner SE, Linford NJ et al. 2005). Aujourd'hui, on sait que les enzymes

thiolées sont plus impliquées que la catalase dans la protection de la mitochondrie, mais

comme dans le cas de la SOD mitochondriale, la fusion de la catalase à une séquence

peptidique ciblant les mitochondries augmente considérablement son activité protectrice.

Enfin, la peroxyrédoxine III (Prdx3) est une peroxydase spécifique de la mitochondrie

qui intervient dans la régulation de l’apoptose de la cellule. Elle est synthétisée dans le cytosol

64

Apoptose Nécrose Autophagie

Atrophie

Condensation et marginalisation de la

chromatine nucléaire (a)

Lobulation de la membrane plasmique

Dilatation cellulaire

Pycnose nucléaire

Formation de vacuoles intracytoplasmiques (vacuoles

autophagiques ou phagosomes) au sein desquelles les cellules « s’autodigèrent »

Pycnose nucléaire

Formation de corps apoptiques

Lésions des organites

Rupture de la membrane cellulaire

Disparition des structures nécessaires à la synthèse protéique (réticulum

endoplasmique, appareil de Golgi, polyribosomes)

Phagocytose des débris cellulaires

Réaction inflammatoire

NB :

Organites et membranes cellulaires

longtemps préservées (b)

Pas de réaction inflammatoire

Atteinte de cellules isolées, éparses

NB :

Atteinte de groupes de

cellules

NB :

Longue préservation de mitochondries

Pas de réaction inflammatoire

Atteinte des cellules isolées et éparses

Tableau 1 : Caractéristiques morphologiques des différents types de mort cellulaire.

(a) La condensation de la chromatine est associée biochimiquement à une fragmentation

ordonnée, internucléosomique de l'ADN nucléaire

(b) La préservation des organites permet la production d'énergie nécessaire au processus

apoptotique. De plus, celle de la membrane plasmique fait qu'il n'y a pas ou peu de libération

de macromécules intracellulaires et donc pas ou peu de réactions inflammatoires.

65

pour être transférée dans les mitochondries. Des expériences sur des cellules HeLa ont

démontré que le manque de Prdx3 augmente la concentration intracellulaire en peroxyde

d’hydrogène, notamment dans les mitochondries, et sensibilise les cellules à l’apoptose

provoquée par la staurosporine ou le TNF-α (Chang, Cho et al. 2004).

En résumé, les systèmes protéiques Trx-2, Grx-2a, Prdx3 et MnSOD sont des systèmes

spécifiques des mitochondries permettant une protection efficace de la cellule contre le stress

oxydatif induit par les ROS.

d. L’apoptose

Le terme d'apoptose a été proposé en 1972 par Kerr et al. pour qualifier un type de

mort cellulaire présentant des caractéristiques morphologiques bien différentes de celles de

la nécrose ou de l’autophagie (Tableau 1) (Kerr, Wyllie et al. 1972). Il a été ensuite rapidement

démontré que l'apopotose est une "mort cellulaire programmée", résultant de l'activation

d'un programme génétique de "suicide", jusque-là quiescent. Ce programme peut être mis en

œuvre lorsque la cellule est privée de facteurs de survie (les facteurs neurotrophiques pour le

système nerveux par exemple) ou lorsqu'elle est sévèrement endommagée (Horvitz 1999).

L'apoptose se distingue aussi de la nécrose par le fait qu'il s'agit d'un processus actif,

consommateur d'énergie.

L'apoptose a un rôle physiologique essentiel. Au cours du développement, elle assure

l'élimination des cellules produites en excès (système nerveux : minimum 50 % des neurones

au début du développement) (Brill, Torchinsky et al. 1999) (Kristiansen and Ham 2014). A l'âge

adulte, le processus apoptotique :

maintient l'équilibre cellulaire au sein des tissus dont les cellules se renouvellent en

permanence,

élimine les cellules non viables,

66

Figure 11 : Représentation schématique des trois voies de signalisation apoptotiques.

Les deux voies principales de l’apoptose, voies extrinsèque et intrinsèque, sont initiées par la

fixation d’un ligand sur un récepteur de mort ou un stress (hypoxie, toxines, radiations etc…)

respectivement. La voie perforine/granzyme dépendante est activée par les cellules T

cytotoxiques. Chaque voie (exceptée celle du granzyme A) active sa propre caspase initiatrice

(8, 9 ou 10) qui à son tour active la caspase-3 exécutrice. La phase d’exécution résulte en des

modifications cytomorphologiques caractéristiques telles que la condensation

chromatinienne, la formation de vésicules cytoplasmiques et de corps apoptotiques et enfin

la phagocytose de ces derniers par les cellules parenchymateuses adjacentes ou des

macrophages.

67

élimine les cellules "dangereuses" telles que des cellules infectées, des cellules

précancéreuses, ou encore des cellules immunitaires activées alors qu'une réaction

immunitaire n'a pas, ou plus, lieu d'être (Norbury and Hickson 2001).

Inversement, la dérégulation des voies apoptotiques a des conséquences pathologiques : soit

le processus est déficitaire, entraînant notamment des cancers et des maladies autoimmunes,

soit il est activé ; pour ce qui est du système nerveux, les exemples bien connus sont ceux des

accidents vasculaires cérébraux et des pathologies neurodégénératives "classiques" (Maladies

d’Alzheimer et de Parkinson…) (Reed 2002) (Ethell and Buhler 2003). L’induction de l’apoptose

se produit à l’issue d’une phase de latence, réversible, qui, en cas de déséquilibre, déclenche

la phase d’exécution.

Le choix entre quiescence ou induction du programme apoptotique dépend donc de

l'équilibre fonctionnel entre des signaux inhibiteurs et des signaux activateurs, intra ou

extracellulaires et du type cellulaire. Par ailleurs les signaux proapoptotiques peuvent aussi

induire une nécrose ou une autophagie cellulaire. En fait, le mode d'exécution de la mort

cellulaire dépend avant tout du type et de la sévérité des signaux inducteurs ainsi que de l'état

fonctionnel de la cellule (Zeiss 2003).

Le mécanisme de l’apoptose, complexe et sophistiqué, implique une cascade

d’évènements moléculaires nécessitant de l’énergie (Figure 11). Jusqu’au début du 21ème

siècle, le monde de la recherche s’accordait à considérer deux voies principales de

signalisation apoptotique :

La voie extrinsèque ou voie des récepteurs de mort [superfamille des récepteurs

du facteur de nécrose tumorale (TNF)] ;

La voie intrinsèque dite mitochondriale.

Nous savons qu’il existe un lien entre ces deux voies de signalisation et que des

molécules d’une de ces voies peuvent influencer l’autre voie (Igney and Krammer 2002). Il

existe également une voie supplémentaire impliquant les cellules T cytotoxiques qui induisent

68

69

la mort cellulaire en sécrétant des perforines et des granzymes. Cet axe perforine/granzyme

peut induire l’apoptose via les granzymes B ou A. Les voies extrinsèque, intrinsèque et

granzyme B convergent vers la même phase terminale, ou phase d’exécution. Cette phase est

initiée par le clivage de la caspase-3 et se traduit par une fragmentation de l’ADN, la

dégradation du cytosquelette et des protéines nucléaires, la formation de corps apoptotiques,

l'expression de ligands pour les récepteurs des cellules phagocytaires et enfin, la phagocytose.

La voie granzyme A active l’apoptose de façon caspase-indépendante par dommages sur l'ADN

simple brin (Martinvalet, Zhu et al. 2005).

Les caspases, appartenant à la famille des protéases à cystéine, sont très souvent

exprimées sous forme de proenzymes inactives qui, une fois activées, peuvent, à leur tour,

actionner d’autres procaspases, permettant ainsi l’initiation d’une cascade de protéases.

Quelques procaspases peuvent également s’agréger et s’autoactiver. Cette cascade

protéolytique, dans laquelle une caspase peut activer d’autres caspases, amplifie la voie de

signalisation apoptotique et ainsi aboutit rapidement à la mort cellulaire. Les caspases

catalysent l’hydrolyse de la liaison peptidique du côté carboxyle des résidus aspartate, bien

que chacune d’entre elles possède des sites de reconnaissance différents sur une grande

variété de substrats, tels que les lamines nucléaires ou la poly-ADP-ribose polymérase (PARP).

Une fois les caspases activées, il semble y avoir un engagement irréversible vers la mort

cellulaire. A ce jour, dix caspases majeures ont été identifiées et classées comme suit selon

leur fonction :

les caspases -2,-8,-9,-10 sont initiatrices

les caspases -3,-6,-7 sont exécutrices (ou effectrices)

et les caspases -1,-4,-5 sont inflammatoires (Galluzzi, Lopez-Soto et al. 2016) (Rai,

Tripathi et al. 2005).

D’autres caspases ont été décrites, comme la caspase-11, impliquée dans la

régulation de l’apoptose et la maturation des cytokines lors d’un choc septique, ou la

caspase-14, qui est fortement exprimée dans les tissus embryonnaires mais pas chez l’adulte

(Kang, Wang et al. 2002) (Hu, Snipas et al. 1998). Lors de l’apoptose, les pro-caspases sont

70

Figure 12 : Rôle de la mitochondrie dans l’apoptose.

Dans des cellules saines, Apaf-1 est sous une forme auto-inactivée et les procaspases-9 et 3/7,

liées par les IAPs (protéines inhibitrices de l’apoptose, X-IAP= IAP liée au chromosome X)

restent inactives. A la suite d’un signal apoptotique les protéines BH3-only sont, soit

surexprimées trancriptionnellement, soit activées par des modifications post traductionnelles.

Puis ces dernières vont lier les protéines Bcl2 anti-apoptotiques afin d’annuler leurs effets

inhibiteurs ou vont activer directement Bax/Bak. Des interactions lipides-protéines pourraient

également être impliquées dans l’activation de Bax/Bak menant à leur oligomérisation et

entraînant le relargage du Cyt c, Smac, d’Omi/HtrA2, de l’endoG et de l’AIF. Le Cyt c va ensuite

lier Apaf-1 pour former l’apoptosome induisant l’activation de la caspase-9. Smac et

Omi/HtrA2 vont se fixer sur les IAPs pour les inhiber.

71

clivées protéolytiquement pour générer une petite et une grande sous-unité, qui vont

s’associer pour former un hétérotétramère, forme active de l’enzyme.

La voie extrinsèque (voie des récepteurs de mort) est enclenchée depuis le milieu

extracellulaire suite à la fixation de ligands sur les récepteurs de mort transmembranaires

respectifs tels que Fas, TNF, TRAIL-R (Tumor-necrosis-factor Related Apoptosis Inducing

Ligand Receptor) et DR3-6 (Death Receptor). Une fois activé, chaque récepteur peut former

un complexe de signalisation induisant la mort (Death-Inducing Signaling Complex, DISC) grâce

au recrutement de l’adaptateur FADD (Fas-Associated Death Domain) et des procaspases 8 ou

10, qui, une fois activées, vont hydrolyser les caspases effectrices 3 et 7.

La voie apoptotique intrinsèque est aussi appelée mitochondriale. L’implication

essentielle de la mitochondrie est, non seulement, de contenir le site où les protéines anti-

apoptotiques et pro-apoptotiques interagissent et déterminent le destin de la cellule. Mais la

mitochondrie constitue également le lieu d’origine des signaux qui initient l’activation des

caspases au travers des mécanismes variés. Dans la voie intrinsèque, la perméabilisation de la

membrane externe (Mitochondrial Outer Membrane Permeabilization, MOMP) conduit à la

libération des protéines pro-apoptotiques de l'IMS vers le cytosol. C’est un événement

essentiel pour l'activation de la caspase initiatrice et donc pour le déclenchement de

l'apoptose. Par exemple, le cytochrome c (Cyt c) est un composant clef du complexe de

l’apoptosome : une fois dans le cytosol il va interagir avec le facteur APAF1 (Apoptotic

Protease Activating Factor 1) permettant ainsi l’activation de la caspase-9 initiatrice (Figure

12). Après le relargage du Cyt c de l’IMS dans le cytosol, les protéines mitochondriales Smac

(Second mitochondria- derived activator of caspase) et Omi (ou HtrA2, high temperature

requirement protein A2) sont à leur tour libérées. Elles peuvent alors se fixer sur les protéines

inhibitrices de l’apoptose (IAPs) et ainsi annuler les effets inhibiteurs de ces dernières sur

l’activité des caspases (Figure 12). Il est établi que la séparation spatiale de protéines

mitochondriales et de leurs partenaires/cibles cytosoliques est un mécanisme de sécurité afin

de prévenir l’activation inadéquate de l’apoptose dans des cellules saines. La voie

mitochondriale réagit en réponse à des stimuli de mort induits par des dommages à l’ADN,

72

Figure 13 : Représentation schématique des protéines pro- et anti-apoptotique de la

famille des Bcl-2

Liste des protéines de la famille Bcl-2 partageant les mêmes domaines BH1 (jaune), BH2

(rouge), BH3 (violet) et BH4 (orange). D’après commons.wikimedia.org.

73

des agents chimiothérapeutiques, les radiations UV etc... Dans certains types cellulaires, la

voie apoptotique extrinsèque initiée par le ligand Fas peut s’entremêler à la voie intrinsèque

grâce au clivage de la protéine cytosolique Bid (BH3 Interacting Domain death agonist) qui va

résulter en une protéine tronquée tBid. Cette dernière va transloquer à la mitochondrie et

entraîner le relargage du Cyt c (Luo, Budihardjo et al. 1998).

La MOMP est un processus très régulé et contrôlé par des membres pro et anti-

apoptotiques de la famille des homologues Bcl-2 (B cell lymphoma 2). Cette grande famille

peut être divisée en deux classes : la famille des protéines Bcl-2 anti-apoptotiques [telles que

Bcl-2 (bloque le relargage du Cyt c), Bcl-XL, Bcl-w…] et celle des protéines pro-apoptotiques

(telles que Bax, Bak et Bok) (Cory and Adams 2002). Il existe également un groupe plus

hétérogène de protéines ne partageant qu’un motif BH3 (BH3-only : Puma, Bid, Bad…) qui

vont bloquer les protéines Bcl-2 anti-apoptotiques et ainsi agir comme des protéines pro-

apoptotiques (Youle and Strasser 2008) (Figure 13). Le couple Bax/Bak possède un rôle

crucial dans l’induction de l’apoptose, il apparaît que les protéines BH3 et les protéines anti-

apoptotiques Bcl-2 sont les seuls régulateurs positifs et négatifs de Bax/Bak. De plus, ni

l’activation des protéines BH3 ni la suppression des protéines pro-survie Bcl-2 n’est suffisante

pour tuer les cellules par apoptose en l’absence de Bax et Bak. Cela suggère que Bax/Bak sont

des cibles régulatrices clefs vers lesquelles de nombreux signaux intracellulaires convergent

afin de déterminer le destin de la cellule (Doerks, Copley et al. 2002). Dans les cellules saines,

Bax est localisée dans le cytosol en tant que monomère. Lors de l’apoptose, Bax transloque à

la mitochondrie et forme des oligomères afin de perméabiliser les membranes

mitochondriales (Annis, Soucie et al. 2005). Bak, quant à lui, réside de façon permanente dans

l’OMM mais va subir une série de modifications conformationnelles lors de l’apoptose (Alsop,

Fennell et al. 2015). Deux modèles sont proposés pour l’activation de Bax/Bak par les

protéines BH3-only. Selon certaines études, Bax et Bak sont inactifs et leur activation est

menée préférentiellement par Bim pour Bax et tBID pour Bak mais également par d’autres

protéines BH3-only comme Puma (Sarosiek, Chi et al. 2013). Cependant, les résultats

d'autres études suggèrent que les deux protéines Bax et Bak sont constitutivement actives

mais qu’elles sont contrôlées par la machinerie anti-apoptotique. Dans ce scénario, la MOMP

se produit lorsque les protéines BH3 libèrent Bax ou Bak des protéines anti-apoptotiques

74

75

(Willis, Chen et al. 2005). Cependant, nous ne savons pas encore exactement comment les

oligomères Bax/Bak induisent la perméabilisation membranaire et la libération du Cyt c. Une

hypothèse propose que la perméabilité membranaire puisse provenir d’une augmentation

soudaine de l’IMM due à l’ouverture du pore multiprotéique de perméabilité transitoire

(Permeability Transition pore Complex, PTPC) au niveau du site de contact entre l’OMM et

l’IMM. La composition moléculaire exacte de ce complexe n’est pas claire. Il est supposé

contenir VDAC, sur la membrane externe, l’Adénine Nucléotide Translocase (ANT, dans la

membrane interne), et la cyclophiline D (CypD, une isomérase peptidyl-prolyl de la matrice)

(Baines, Kaiser et al. 2005). L’ouverture du PTPC conduirait à un gonflement de la matrice, une

dépolarisation de la membrane (ΔΨm), une rupture ultérieure de la membrane externe et une

libération non sélective des protéines de l'IMS (Kroemer, Galluzzi et al. 2007). Cependant, des

analyses génétiques suggèrent que cette ouverture est vraisemblablement une conséquence

de l'apoptose et non l’inverse, probabilité renforcée par les études qui ont démontré que, sans

VDAC, CypD ou ANT, les cellules meurent « normalement » après traitement déclenchant

l’apoptose (Kokoszka, Waymire et al. 2004) (Nakagawa, Shimizu et al. 2005). En outre, la

libération du Cyt c se produit en l'absence de dépolarisation mitochondriale, sans perte de

l'intégrité de la membrane externe (Kluck, Green et al. 1997). Un autre modèle suggère que

l'interaction de Bax et BAK activés avec des lipides de l’OMM conduit au repliement de cette

membrane et, à terme, à la formation de pores lipidiques transitoires ou de micelles inverses,

permettant ainsi la libération des protéines de l’IMS (Hardwick and Polster 2002) (Schafer,

Quispe et al. 2009).

Lors de la MOMP, il n’y a pas que le Cyt c, Smac ou encore HtrA2 qui soient libérés dans

le cytosol mais également l’endonuclase mitochondriale G (endoG) ainsi que le facteur AIF

(Apoptosis Inducing Factor) (Figure 12). L’endoG est une endo-exonucléase de l’IMM et de la

matrice mitochondriale qui facilite la dégradation de la chromatine nucléaire (Li, Luo et al.

2001). Le facteur AIF est une oxydoréductase liant le FAD (Flavin-Adenine Dinucleotide). Il est

localisé dans l’IMM avec sa région N-terminale exposée à la matrice et sa queue C-terminale

dans l’IMS. Lors de l’apoptose, une protéolyse entre les acides aminés (a.a.) 101 et 102

produit un facteur AIF soluble (tAIF). Son signal de localisation nucléaire (Nuclear Localization

Signal, NLS) en permet l’adressage au noyau où il pourra interagir avec l’ADN et entraîner sa

76

77

condensation et sa dégradation en fragments de 50 kb (Figure 12) (Arnoult, Gaume et al.

2003).

Pour résumer, la mitochondrie participe activement à la mort cellulaire programmée

chez les vertébrés grâce à différents mécanismes, notamment par le relargage de protéines

cytotoxiques variées. Ainsi, le Cyt c est requis pour l’activation des caspases et Smac et

Omi/HtrA2 bloquent les effets inhibiteurs des IAPs. La libération du Cyt c et des autres

protéines de l’IMS est régulée par un équilibre subtil entre les protéines pro et anti-

apoptotiques de la famille Bcl-2. Des interactions protéine-lipides sont également mises en

jeu et le tout converge vers l’activation de Bax et Bak. Les oligomères de Bax et Bak induisent

la perméabilité de la membrane externe mitochondriale.

e. Régulation calcique

e.1. Généralités

La régulation du calcium notamment par les mitochondries est un élément clef dans

la vie de la cellule. L’homéostasie calcique mitochondriale est importante pour la production

d’énergie nécessaire à l’activité cellulaire, pour le contrôle de la concentration calcique

cytosolique et elle détermine également le destin cellulaire en déclenchant ou empêchant

l’apoptose. La signalisation à base de calcium est un mécanisme universel grâce auquel des

messagers extracellulaires modifient l'activité des cellules cibles. Celles-ci sont alors capables

de décoder des changements intracellulaires en concentration de Ca2+ (amplitude, durée,

fréquence et localisation), ce qui va générer des réponses aussi diverses que la prolifération

ou la mort cellulaire. Ces signaux calciques contrôlent des processus biologiques, aussi bien

à court terme, qui se produisent en quelques millisecondes (comme la contraction musculaire

et la neurotransmission), qu’à long terme, qui nécessitent plusieurs jours, comme la

prolifération cellulaire et le développement d'organes (Berridge, Bootman et al. 2003). En

effet, on observe dans les cellules eucaryotes un système complexe qui comprend des

78

79

protéines capables de détecter des changements de niveau intracellulaire en Ca2+ (et donc de

déclencher une cascade de signalisation par l'intermédiaire d’effecteurs), ainsi que des

mécanismes homéostatiques sophistiqués constitués de canaux Ca2+ sur la membrane

plasmique et des organites, des protéines tampons du Ca2+ et des systèmes d’extrusion et de

séquestration calcique (Saris and Carafoli 2005). Le développement de sondes calcique

génétiquement codées et ciblées vers des compartiments intracellulaires spécifiques a permis

de mettre en lumière le rôle de deux organites: le réticulum endoplasmique (RE) et les

mitochondries (Demaurex and Frieden 2003). Bien entendu, presque tous les autres organites

jouent un rôle, certes moindre, dans la signalisation calcique : l’appareil de Golgi (Zatti, Burgo

et al. 2006), les vésicules sécrétoires (Mitchell, Pinton et al. 2001), les lysosomes et les

peroxysomes (Drago, Giacomello et al. 2008). Néanmoins, le RE est la principale réserve

intracellulaire de Ca2+, alors que les mitochondries initient et décodent les signaux calciques

en absorbant ou en libérant des ions Ca2+.

e.2. L’uniport calcique mitochondrial

Aujourd’hui il est largement accepté que l’absorption du Ca2+ se fait par l’intermédiaire

de l’uniport calcique mitochondrial (mCU) (Santo-Domingo and Demaurex 2010). Les

premières études sur des mitochondries isolées ont révélé que le complexe mCU catalysait

l'absorption passive du Ca2+ à travers l’IMM, entraîné par le potentiel mitochondrial (Δψm)

négatif généré par la chaîne respiratoire. Des études électrophysiologiques ultérieures ont

démontré que le mCU est un canal transmembranaire hautement sélectif du Ca2+ (Kirichok,

Krapivinsky et al. 2004). Récemment, il a été suggéré que chaque mitochondrie peut exprimer

plus d'une unité mCU et une voie alternative d'influx du Ca2+ (un antiport Ca2+/H+) a été

proposée. Dans la plupart des cellules, la concentration cytosolique du calcium à l’état basal

est d’environ 100nM et le Δψm est de – 180mV. Ainsi, d’après une étude mathématique, la

concentration du calcium mitochondrial ([Ca2+]mit) devrait être de 0,1M à l’équilibre

électrochimique (Pozzan, Magalhaes et al. 2000). Toutefois, cette valeur n’est jamais

atteinte en raison de l'existence de mécanismes d’exclusion du Ca2+ grâce aux échangeurs

Ca2+/H+ et Ca2+/Na+ (comme l'échangeur sodium-calcium mitochondrial, NCLX) (Figure 14)

80

Figure 14 : Représentation de l’homéostasie calcique mitochondriale.

Les flèches représentent les flux ioniques ; flèches rouges : flux calcique ; flèches bleues : flux

protonique ; flèche jaune : flux sodique ; flèche verte : flux potassique. Pour le cas de LETM1,

les deux hypothèses sur sa fonction sont affichées. Les cadres verts représentent les

principaux mécanismes entrainant une hausse de la [Ca2+] mitochondriale (voir texte). CCE =

Capacité d’Entrée du Calcium, PM = Membrane Plasmique. D’après (Contreras, Drago et al.

2010)

81

(Palty, Silverman et al. 2010). Ainsi, le niveau basal de calcium dans la matrice mitochondriale

est loin de l'équilibre électrochimique grâce à un cycle limité d’entrée et de sortie des ions

calciques. Le coût en énergie de ce cycle est relativement modeste, puisque le mCU a une

relativement faible affinité pour le Ca2+ (Kd d’environ 10-20 µM), et donc le taux d'absorption

du calcium mitochondrial, en particulier dans des conditions de repos, est extrêmement lent

(Gunter and K.K. 2001). Cependant, l’absorption mitochondriale du calcium est considérée

comme un mécanisme de sauvegarde mis en action lorsque des élévations pathologiques de

Ca2+ se produisent. Une absorption mitochondriale rapide du Ca2+ dans les cellules intactes

dépend de la position relative des mitochondries et des sites de relargage et d’influx calcique.

En effet, l’absorption de Ca2+ à travers le mCU se produit uniquement lorsque les

mitochondries sont exposées à des hautes concentrations de calcium cytosolique ([Ca2+]c) :

au-dessus du niveau micromolaire. De telles concentrations ne se produisent que

transitoirement pendant le pic cytosolique d’élévation globale en Ca2+, ou au niveau des sous-

compartiments cellulaires situés près des canaux d’entrée et de libération calcique. La

proximité des mitochondries avec des sites de libération calcique est également prouvée par

le lien physique existant entre les mitochondries et le RE et par l'identification de protéines

agissant comme attaches entre les deux organites (Csordas, Renken et al. 2006). C’est le cas

de la protéine chaperonne grp75 (Hspa9) reliant VDAC1 et IP3R (Récepteur à l’Inositol tri

phosphate sur le RE) (Szabadkai, Bianchi et al. 2006), et de la mitofusine-2, exprimée sur les

surfaces du RE et des mitochondries, qui forme des homodimères ou des hétérodimères avec

la mitofusine-1 (mitochondries) (de Brito and Scorrano 2009) (Figure 14).

La liaison des ions Ca2+ sur le côté cytosolique du canal mCU est le principal

déclencheur de l'activation de ce dernier, probablement via sa modulation allostérique

(Gunter and Pfeiffe 1990). Il est également suggéré que les ions Ca2+ peuvent moduler le

mCU via une interaction Ca2+ calmoduline. Une inhibition de l'uniport aux plus hautes

concentrations cytosoliques en Ca2+ a également été rapportée. Ainsi les effets biphasiques

du Ca2+ sur le mCU pourraient éviter une accumulation excessive de calcium dans les

mitochondries (Moreau, Nelson et al. 2006).

82

83

Malgré de nombreuses études sur le sujet, l’identification moléculaire du mCU reste

débattue. L’équipe de Graeter considèrait les protéines découplantes 2 et 3 (UCP2 et 3)

fondamentales pour l’absorption calcique (Trenker, Malli et al. 2007), mais ces résultats ont

été contestés par plusieurs études dans lesquelles une absorption mitochondriale en Ca2+

normale a été mesurée dans quatre tissus différents de souris knock-out (KO) pour UCP2 et 3

(Csordas, Renken et al. 2006). Cependant, le phénotype normal des souris UCP2 ou UCP3 KO

n'exclut pas un rôle de ces molécules dans l’absorption calcique mitochondriale : l’absence

d’une de ces protéines de transport pourrait être compensée par une régulation à la hausse

des autres protéines impliquées afin de préserver la fonction. Un autre candidat pour jouer le

rôle de mCU serait le récepteur à Ryanodine (RyR) de type 1 qui a été identifié par MET et

western blot dans l’IMM de mitochondries isolées à partir de cellules cardiaques de rat

(Altschafl, Beutner et al. 2007). Comment une protéine dotée d’une séquence de ciblage

spécifique de la membrane du RE pourrait se retrouver dans la membrane mitochondriale

interne demeure un mystère aujourd’hui non résolu. Il a également été postulé que la

protéine LETM1 (Leucine Zipper-EF-Hand Containing Transmembrane Protein 1) de l’IMM

pourrait être un antiport Ca2+/H+ catalysant ainsi l’absorption des ions calciques (Jiang, Zhao

et al.). Cependant, d’autres auteurs pensent que l’effet de la sous-expression ou de la sur-

expression de LETM1 sur le transport mitochondrial calcique pourrait être un effet secondaire

dû à la diminution ou l’augmentation de l’activé antiport K+/H+ qu’aurait LETM1 (Figure 14).

Plusieurs rapports ont décrit la modulation de l'activité mCU par des protéines kinases (PK), la

PKD et les isoformes β/δ de la PKC seraient inhibitrices, tandis que l’isoforme ζ de la PKC

activerait le mCU (Koncz, Szanda et al. 2009) (Pinton, Leo et al. 2004).

e.3. La signalisation calcique mitochondriale

Les mécanismes d’absorption calcique par les mitochondries ont attiré beaucoup

d’attention récemment en raison, notamment, du rôle central des mitochondries dans le

métabolisme et dans la mort cellulaire. La concentration en [Ca2+]c dans des conditions de

repos correspond à un état basal qui dépend exclusivement de l’équilibre entre les taux

d’afflux et d’efflux au niveau de la membrane plasmique. Toute modification de l’activité ou

de la concentration des autres membres de la « boîte à outils calcique » (par exemple, des

84

85

protéines tampons, des pompes des organites, etc.) affectent les niveaux de Ca2+ cytosolique

de façon transitoire et n’a aucun effet sur sa concentration à long terme. Un signal cytosolique

de Ca2+ (par exemple, une augmentation de [Ca2+]c) peut être dû à : une entrée de Ca2+ de la

matrice extracellulaire (par la membrane plasmique), une libération de Ca2+ des réserves

intracellulaires ou une combinaison des deux. En fin de signal, le niveau basal calcique est

retrouvé par l’action des pompes ou antiports Ca2+ au détriment d’une consommation

d’énergie. La capacité des mitochondries à agir comme tampon calcique a des conséquences

très importantes sur le patron des signaux calciques cytosoliques (Rios 2010). Dans les cellules

excitables, les mitochondries localisées au voisinage de canaux opérateurs calciques

dépendant du potentiel (Voltage Operated Ca2+ Channels, VOCs) sur la membrane plasmique

permettent le tamponnage des ions Ca2+ entrants (Figure 14). Cette régulation de la

concentration calcique diminue le volume des microdomaines Ca2+ locaux (haute

concentration calcique très localisée), générés autour de ces canaux ouverts, et par

conséquent limite l’ampleur de l’exocytose (Montero, Alonso et al. 2000). Les mitochondries

ont un effet opposé sur les canaux calciques SOCE (Store-Operated Ca2+ Channels). Dans ce

cas, celles situées à proximité des canaux SOCE (ou ORAI) soutiennent leur activité en

réduisant l’effet rétroactif négatif (feedback) qu’ont les ions Ca2+ sur ces canaux (Gilabert and

Parekh 2000).

Au niveau cellulaire, la régulation mitochondriale de la [Ca2+]c peut avoir des

conséquences différentes selon la localisation des mitochondries dans les cellules. Dans les

cellules acineuses du pancréas, les mitochondries agissent en tant que « pare-feu » qui

empêche la propagation des vagues de Ca2+ cytosolique générées dans la région apicale,

divisant ainsi la cellule en deux compartiments fonctionnels capables d’engendrer des signaux

calciques cytosoliques distincts (Park, Ashby et al. 2001). Dans les cellules HeLa cependant, les

mitochondries agissent comme « relais calcique » en donnant les ions Ca2+ capturés au RE

pour empêcher l’appauvrissement en Ca2+ de ce dernier (Arnaudeau, Kelley et al. 2001). Dans

ce cas, les mitochondries permettent également le transport direct du Ca2+ de la membrane

plasmique au RE en évitant de faire intervenir le cytosol (Jousset, Frieden et al. 2007).

86

87

Si la concentration en Ca2+ cytosolique est régulée par la mitochondrie, cette dernière

est sensible au passage d’ions calcium. Une augmentation de la concentration de Ca2+ libre

dans la matrice mitochondriale ([Ca2+]mit) active plusieurs déshydrogénases (pyruvate

déshydrogénase, isocitrate déshydrogénase, oxoglutarate déshydrogénase) et des

transporteurs comme la citrine, activations qui vont résulter en une augmentation de la

respiration et donc de la production d’ATP. Ainsi, le niveau de [Ca2+]mit régule la synthèse

d’ATP en fonction des besoins énergétiques de la cellule (SatruStegui, Pardo et al. 2007).

Cependant, une augmentation prolongée de calcium mitochondrial peut induire l’ouverture

des pores de perméabilité transitoire (PTP) conduisant au gonflement des mitochondries, au

relargage du Cyt c et donc à la mort cellulaire par apoptose (Giorgi, Romagnoli et al. 2008)

(Voir paragraphe I.3.d. L’apoptose).

f. Fonctions de synthèse

Non seulement les mitochondries sont le site de la respiration cellulaire, de la

régulation de l’apoptose ainsi que de l’homéostasie calcique, mais elles sont également

essentielles pour la biosynthèse des hormones stéroïdes.

Six classes d'hormones stéroïdes, qui sont toutes indispensables à la vie des

mammifères, sont fabriquées à partir du cholestérol par l'intermédiaire de voies de

biosynthèses complexes. Ces dernières sont initiées par des enzymes spécialisées, tissus-

spécifiques et détectées dans les mitochondries. Ces hormones comprennent les

glucocorticoïdes (cortisol, corticostérone) et les minéralocorticoïdes (aldostérone) produites

dans le cortex surrénalien; les estrogènes (estradiol), les progestatifs (progestérone) et les

androgènes (testostérone, la dihydrotestostérone) produites dans les gonades, et enfin les

calciferols (1,25-dihydroxyvitamine D) produites dans le rein (Papadopoulos and Miller

2012) (Malloy and Feldman 2010).

88

Figure 15 : Transformation du cholestérol en prégnénolone au sein de la mitochondrie.

Au sein de la mitochondrie, l’étape initiale de la stéroïdogenèse est initiée par la protéine StAR

permettant l’import du cholestérol à l’IMM où ce dernier est clivé en prégnénolone par la

protéine P450scc. Une augmentation de la concentration calcique cytosolique améliore

l’absorption du cholestérol et la formation de pouvoir réducteur NADH et NADPH. NADPH est

également formé à partir du NADH par l’intermédiaire de la nucléotide nicotinamide

transhydrogénase (TH). La NADPH permet la réduction des équivalents de la P450 via le

système adrénodoxine réductase/adénoxine (AD).

89

La biosynthèse de ces hormones stéroïdes et du stérol 1,25- dihydroxyvitamine D

s’effectue à partir du cholestérol. Les mitochondries des cellules stéroïdogènes des glandes

surrénales, des gonades, du placenta et du cerveau contiennent l’enzyme de clivage de la

chaîne latérale du cholestérol appelée P450scc (side-chain cleavage) et ses deux partenaires

pour le transfert d’électrons : la ferredoxine et la ferredoxine réductase (Figure 15). L’enzyme

P450scc, située sur l’IMM, convertit le cholestérol en prégnénolone (précurseur des hormones

stéroïdiennes) et son activité détermine la capacité stéroïdogénique nette, de sorte qu'elle

permet la régulation globale de la stéroïdogenèse. Il existe d’autres enzymes stéroïdogéniques

mitochondriales comme la déshydrogénase hydroxystéroïde-3β, la hydroxylase-11β et

l’adolstérone synthase (Miller 2013).

L’apport du cholestérol au sein de la mitochondrie se fait via la protéine régulatrice de

stéroïdogenèse (StAR, Steroidogenic Acute Regulatory protein) (Figure 15) qui coopère avec

un complexe multi-composant, le « transduceosome », sur l’OMM. Il est très probable que

StAR soit immobilisée et activée sur l’OMM par l’intermédiaire de la translocase de l’OMM

Tom20 (Translocase of the Outer Membrane) (Bose, Lingappa et al. 2002). Les composants du

« transduceosome » sont la protéine de translocation (TSPO), VDAC, la protéine associée à

TSPO 7 (PAP7) et la sous-unité régulatrice 1 de la protéine kinase (PRKAR1A). Cependant, la

manière exacte dont ces protéines interagissent avec le cholestérol et permettent son

déplacement jusqu’à l’IMM reste floue (Miller 2013).

4. Dynamique mitochondriale et transport

a. Généralités

Le cytoplasme de presque toutes les cellules eucaryotes contient des mitochondries,

bien qu'il y ait au moins une exception : le protiste Chaos carolinensis. Ces organites sont

particulièrement abondants dans les cellules (ou régions subcellulaires) qui sont associées à

des processus actifs (cellules musculaires, neurones). Aujourd’hui, l’imagerie cellulaire en

90

Figure 16 : Principales protéines de fusion mitochondriales : les mitofusines 1 et 2 et OPA1.

Les différents domaines présents sur les protéines de fusion mitochondriale sont représentés

ici : les domaines GTPases sont en bleu avec leurs motifs G distincts (barre noire). Les motifs

coiled-coil (CC), également nommés répétition heptadique (HR), sont en jaune. Les domaines

transmembranaires (TM) sont représentés en rouge. La région riche en prolines (PR), en vert,

impliquée dans l’interaction protéine-protéine n’est présente que dans MFN2. Le MTS de la

protéine OPA1 est représenté en violet et le site de clivage par la protéase MPP se trouve sur

le résidu 88. La région de l’épissage alternatif d’OPA1 est représentée en noir (Spl.Reg). La

séquence primaire en a.a. de chaque isoforme d’OPA1 est également décrite. D’après (Liesa,

Palacin et al. 2009)

91

temps réel et la MET permettent une analyse fine de la morphologie, de la distribution et du

comportement mitochondrial à très hautes résolutions spatiale et temporelle et dans un large

spectre d’organismes et de tissus.

Contrairement à l’image classique des livres de cours, les mitochondries ne sont pas

ces organites ovoïdes distribués dans toutes les cellules, mais sont organisées en réseaux au

sein desquels la morphologie des mitochondries varie selon le type cellulaire et les conditions

physiologiques : ces organites peuvent être nombreux et isolés et apparaître sous forme

punctiforme ou, au contraire, interconnectés en un large réseau filamenteux.

L’interconnexion et la dynamique des mitochondries sont déterminées par des

évènements constants de fusion et de fission. Cette dynamique mitochondriale est nécessaire

à toutes les fonctions de l’organite, de la respiration et de la régulation des espèces actives de

l’oxygène à la distribution et à l’hérédité mitochondriale, au remodelage mitochondrial lors

des processus développementaux et à la coordination du programme de mort cellulaire grâce

au relargage des facteurs pro-apoptotiques de l’IMS.

La machinerie de la dynamique mitochondriale est constituée, entre autres, de trois

grandes guanosines triphosphatases (GTPases), appartenant à la famille des dynamines, qui

permettent la fusion et la division des membranes mitochondriales (Figure 16). Etant donné

que cette machinerie est hautement conservée au cours de l’évolution, elle peut être

étudiée aussi bien chez les levures que chez les mammifères. Parmi celles-ci, les mitofusines

(Fzo1 chez les levures, et MFN1 et MFN2 chez les mammifères) sont de grandes GTPases

dont le rôle est crucial pour la fusion de l’OMM. La protéine OPA1 (Optic Atrophy Protein 1

ou Mgm1 chez la levure) qui se trouve dans l’IMS et l’IMM, est requise pour la fusion de

cette dernière. Enfin, la protéine DRP1 (Dynamin-related proteins 1) chez les mammifères

(Dnm1 chez la levure) s’assemble à la surface de l’OMM pour entrainer la fission

mitochondriale.

92

Figure 17 : Modèle de la position des différents acteurs de la fusion sur les membranes mi-

tochondriales.

La fusion mitochondriale requiert l’interaction séquentielle des membranes externes puis

internes. Les GTPases de l’OMM (Fzo1 chez la levure/ MFN 1 et 2 chez les mammifères)

forment un complexe oligomérique en cis et en trans via des interactions des domaines

GTPase et des régions heptadiques afin de connecter deux mitochondries adjacentes. La

GTPase de l’IMM (Mgm1/OPA1) forme des complexes oligomériques en cis et en trans pour

fusionner les IMMs des deux mitochondries ainsi reliées. D’après (Hoppins, Lackner et al.

2007).

93

b. La fusion mitochondriale

Les mitofusines possèdent deux domaines transmembranaires dans l’OMM, une

courte boucle dans l’IMS et la majeure partie de la protéine (dont les queues amino-et

carboxy-terminales) fait donc face au cytosol. La région cytosolique amino-terminale (N-ter)

contient un domaine GTPase dynamine-like et une répétition heptadique (par sept, également

nommé domaine Heptad-Repeat, HR) tandis que la région carboxy terminale (C-ter)

cytosolique ne contient qu’une seule région heptadique. Les régions heptadiques sont

sensées former des structures coiled-coil (superhélice ) jouant un rôle primordial dans la

fusion des membranes.

Chez l’homme, MFN1 est une protéine de 741 a.a. dont la région C-ter contient un

domaine transmembranaire et un domaine coiled-coil 2 (HR2) (Figure 16). Ce domaine HR2

permet d’initier la première étape de la fusion mitochondriale, notamment le rapprochement

de deux mitochondries adjacentes via une structure coiled-coil dimérique et antiparallèle

(Figure 17) (Koshiba, Detmer et al. 2004).

Ce dimère peut être homotypique (MFN1-MFN1) ou hétérotypique (MFN1-MFN2). Il

est suggéré que l’activité GTPase pourrait fournir l’énergie nécessaire pour la fusion des

OMMs. La proportion distincte des complexes hétéro et homotypique pourrait avoir un rôle

sur l’efficacité de fusion de l’OMM puisque, in vitro, MFN1 présente une activité GTPase plus

importante que MFN2 (Ishihara, Eura et al. 2004). La formation de ces trois complexes suggère

que le taux de fusion mitochondriale engendré par les mitofusines est spécifique de chaque

tissu (Rojo, Legros et al. 2002) (Santel, Frank et al. 2003). En effet, bien que ces deux protéines

soient très largement exprimées, MFN2 présente un patron d’expression spécifique de

certains tissus, contrairement à MFN1. Ainsi, le muscle squelettique possède le plus haut

rapport en dimères MFN1-MFN2. La région N-ter de MFN1 contient le domaine de liaison au

GTP ainsi qu’un autre domaine coiled-coil (Koshiba, Detmer et al. 2004). Le domaine GTP

possède cinq motifs à GTPase, de G1 à G5 (Figure 16). G1, G2 et G3 forment le centre

catalytique, G1 lie une molécule de GTP et G3 coordonne l’hydrolyse d’un ion Mg2+. Les boîtes

G4 et G5 permettent quant à elles la conformation spécifique pour la liaison du GTP (et non

94

95

pas l’ATP par exemple) (Bourne, Sanders et al. 1991). L’activité GTPase de ce domaine est

nécessaire pour l’activité de fusion de MNF1 (Ishihara, Eura et al. 2004).

Chez l’homme, MFN2 a une taille de 757 a.a. et possède les mêmes domaines

fonctionnels que MFN1 (Figure 16) (Rojo, Legros et al. 2002). Contrairement à MFN1, MFN2

est également présente au niveau du RE dont elle contrôle la morphologie ainsi que son

interaction avec les mitochondries (de Brito and Scorrano 2008). La région C-ter de cette

protéine qui contient le domaine transmembranaire et le domaine HR2 est également

responsable de son adressage mitochondrial (Rojo, Legros et al. 2002). Comme pour MFN1,

son activité GTPasique est cruciale pour son activité de fusion et son domaine GTPase contient

cinq boîtes G.

La protéine OPA1 contrôle à la fois la fusion mitochondriale et la morphologie des

crêtes de l’IMM (Delettre, Lenaers et al. 2000). Cette protéine possède 8 isoformes (Figure

16), elle est localisée dans l’IMS sous forme soluble ou alors fortement fixée sur l’IMM. OPA1

possède, sur les 150 premiers résidus de sa région N-tem, un signal de localisation

mitochondriale (Mitochondrial Target Sequence, MTS) caractérisé par une région riche en a.a.

chargés positivement. Cette région présente également trois sites de clivage potentiels par la

peptidase mitochondriale (MPP, Mitochondrial Processing Peptidase) qui enlève la séquence

MTS lors de l’import mitochondrial de la protéine (Delettre, Lenaers et al. 2000; Akepati,

Muller et al. 2008). A la suite du MTS se trouve un domaine transmembranaire potentiel (exon

1 et 2) qui permettrait l’ancrage d’OPA1 à l’IMM (Olichon, Elachouri et al. 2007). Le premier

domaine coiled-coil d’OPA1 est localisé après le domaine transmembranaire (résidus 210-254

pour l’isoforme 1), il est impliqué dans des interactions protéine-protéine. OPA1 possède un

second domaine coiled-coil dans sa région C-ter, après le domaine GTPase. Il est considéré

comme le domaine effecteur de la GTPase (GED ou domaine d’assemblage). Le domaine GED

est impliqué dans l’oligomérisation et l’activation des dynamines (Praefcke and McMahon

2004). En fait, il est suggéré que ces deux domaines coiled-coil soient responsables de la

formation de complexes homotypiques entre les protéines OPA1. Ces oligomères d’OPA1

pourraient expliquer le recrutement d’isoformes courtes d’OPA1 (isoformes 3,5,6 et 8) par des

96

Figure 18 : Fonctions biologiques de la dynamique mitochondriale.

La fusion et de fission mitochondriales sont importantes pour de nombreuses fonctions

biologiques. La fission est requise pour la répartition des mitochondries lors de la division

cellulaire, pour le relargage des facteurs pro-apoptotiques, pour la distribution intracellulaire

de ces organites et leur recyclage par mitophagie. La fusion des mitochondries est importante

pour la dissipation de l’énergie métabolique grâce à la transmission du potentiel de membrane

le long des filaments de mitochondrie. Elle permet également un phénomène de

complémentation (cf : texte). D’après (Westermann 2010).

97

isoformes plus longues (1,2,4 et 7) afin de permettre la fusion de l’IMM (Song, Chen et al.

2007). Le domaine GED pourrait également être responsable de l’interaction d’OPA1 avec les

mitofusines 1 et 2. Le domaine GTPase d’OPA1 contient 3 motifs G et possède un rôle

indispensable pour l’activité de cette protéine (Olichon, Landes et al. 2007). La régulation de

l’expression d’OPA1 et de ses isoformes est très complexe : il existe un épissage alternatif très

important mais également une régulation protéolytique après la traduction (Delettre, Griffoin

et al. 2001) (Olichon, Elachouri et al. 2007). L’induction de l’apoptose, une diminution du

niveau d’ATP ou une dissipation du potentiel de membrane mitochondrial induisent toutes un

clivage d’OPA1 en isoformes courtes, conduisant à la fragmentation du réseau

mitochondrial (Song, Chen et al. 2007) (Duvezin-Caubet, Jagasia et al. 2006). Il est

intéressant de noter que le retour d’un potentiel de membrane normal induit une restauration

de la fusion, avec une réexpression des isoformes longues d’OPA1. Ces données suggèrent

que les isoformes longues sont indispensables pour la fusion de l’IMM médiée par OPA1.

Cependant, nous savons, aujourd’hui, que les isoformes courtes sont également requises

pour cette fusion. En effet, le mutant isoforme 1 d’OPA1 non clivable ne suffit pas à

induire la fusion mitochondriale dans des cellules KO pour OPA1, alors que l’expression des

isoformes 3 et 5 (courtes) restaure la capacité de cette isoforme 1 non clivable à fusionner les

mitochondries (Olichon, Elachouri et al. 2007) .

Des mutations et des délétions peuvent survenir occasionnellement dans l’ADN

mitochondrial, entraînant une coexistence des mitochondries avec de l’ADN sauvage et

d’autres avec de l’ADN muté au sein d’une même cellule. Hériter de ces mutations peut

entraîner des maladies mitochondriales graves telles que la MELAS (Mitochondrial

Encephalomyopathie with Lactic Acidosis and Strokelike episodes). Il s’est développé dans la

cellule un mécanisme de défense ayant pour base la fusion mitochondriale.

Ce phénomène est appelé processus de complémentation. Les mitochondries

contenant de l’ADN endommagé peuvent fusionner avec d’autres mitochondries saines au

sein de la même cellule, permettant un mélange avec de l’ADN sauvage et une compensation

des défauts des mitochondries endommagées en partageant des molécules d’ARN ou des

98

Figure 19 : Domaines identifiés dans la protéine de fission DRP1.

Les domaines GTPasiques sont indiqués en bleu avec les motifs G distincts indiqués par les

barres noires (G1, G3 et G4). La région en superhélice (CC) ou GED est représentée en jaune.

Le domaine du milieu est coloré en brun. L'insertion de 37 acides aminés qui se trouvent dans

le variant d'épissage 1 (isoforme du cerveau) généré par épissage alternatif est également

représentée et est située dans la région divergente (en noire). D’après (Liesa, Palacin et al.

2009).

99

protéines (Nakada, Inoue et al. 2001). La fusion entre deux mitochondries peut aussi sauver

deux mitochondries avec des mutations dans différents gènes grâce au phénomène de cross-

complémentation et peut mitiger les dommages environnementaux au travers de l’échange

de protéines et de lipides. Ainsi, la fusion mitochondriale peut maximiser la capacité

d’oxydation en réponse à un stress toxique, tant que la contrainte est inférieure à un seuil

critique (Figure 18).

c. La fission mitochondriale

Aux côtés de ces phénomènes de fusion, la fission mitochondriale est nécessaire au

bon fonctionnement de la mitochondrie. Cette dernière permet notamment le recyclage des

mitochondries lorsqu’elles sont trop endommagées et intervient dans les capacités de

transport des mitochondries en modifiant leur taille (Figure 18).

Chez les mammifères, la machinerie de fission est notamment composée de DRP1, une

protéine soluble, contenant un domaine GTPase dans sa région N-ter ainsi qu’un domaine GED

impliqué dans son auto-assemblage dans sa région carboxy terminale (Figure 19). L’expression

de DRP1 est variable, il en existe plusieurs isoformes, chez l’homme, l’isoforme 3 est

prédominante. Les tissus présentant un haut niveau d’expression de DRP1 sont le cerveau, le

muscle squelettique et le cœur. Des niveaux intermédiaires d’expression de DRP1 sont

détectés dans les testicules, les reins et le pancréas, tandis qu’il est faiblement exprimé dans

le foie et la rate (Smirnova, Shurland et al. 1998) (Yoon, Pitts et al. 2001). Chez l’homme, il

existe un variant spécifique du cerveau généré par un épissage alternatif (Figure 19). La

localisation de DRP1 est principalement cytosolique mais une proportion importante de la

protéine est détectée sur la mitochondrie où elle apparaît plus particulièrement sous forme

de points au niveau des sites de scission.

Il est intéressant de noter que la scission membranaire par les dynamines classiques

100

Figure 20 : Modèle de fission mitochondriale.

Étape 1 : DRP1 est à l’équilibre actif/inactif à la surface des mitochondries et dans le cytosol.

La formine INF2 liée au RE est inactive. Étape 2 : L’interaction entre les mitochondries et le RE

active INF2 qui va polymériser des filaments d’actine. Les extrémités des filaments d’actine

pointent vers la mitochondrie et induisent ainsi une constriction de la membrane. Cette

construction déplace l’équilibre de DRP1 sur les OMMs des mitochondries. Étape 3 : DRP1

s’assemble en anneau en forme de spirale au niveau du site de constriction. L’activité GTPase

de DRP1 amplifie davantage le phénomène de constriction jusqu’à conduire à la fission. Étape

4 : après la fission, les mitochondries et le RE se séparent, ce qui entraîne l’inactivation de INF2

et donc la dépolymérisation de l’actine. D’après (Korobova, Ramabhadran et al. 2013).

101

est facilitée par la génération de tension sur cette membrane, d’autant plus que l’anneau

d’oligomères DRP1 formé autour de mitochondrie a un plus petit diamètre que la

mitochondrie en elle-même. Aujourd’hui, la machinerie de fission mitochondriale est bien

mieux décrite chez la levure que chez l’homme. Cependant, nous savons que chez les

mammifères et en conditions basales, le recrutement de DRP1 du cytosol vers la mitochondrie

est dépendant de la dynéine et des microtubules (Varadi, Johnson-Cadwell et al. 2004).

En revanche, en présence d’inhibiteurs des complexes respiratoires de l’ETC ou de

cyclosporine A (qui bloque la formation du PTP) le recrutement de DRP1 à la mitochondrie ne

se fait plus par l’intermédiaire des microtubules, mais plutôt par le cytosquelette d’actine

fibrillaire (De Vos, Allan et al. 2005). Plus récemment encore, il a été démontré que la fission

s’effectuait préférentiellement au niveau des sites de contacts entre la mitochondrie et le RE.

La formine INF2 (Inverted Formin 2) présente sur la surface du RE est activée et va permettre

polymérisation de l’actine. Cette dernière va fournir la force nécessaire sur l’OMM pour initier

la constriction mitochondriale et permettre l’assemblage en anneau de DRP1 (Figure 20)

(Korobova, Ramabhadran et al. 2013). Il est très probable qu’il existe plusieurs mécanismes

par lesquels la fission est médiée par DRP1. Chez les mammifères, DRP1 interagit avec la

protéine FIS1 (mitochondrial Fission 1) : il a été démontré que la surexpression de FIS1

promeut la fission mitochondriale alors que sa déplétion produit un réseau mitochondrial

interconnecté (Yoon, Krueger et al. 2003) (James, Parone et al. 2003). Un autre candidat

possible en tant que facteur alternatif de fission est la protéine de fission mitochondriale

(MFF). MFF contient des répétitions héptadiques et un domaine transmembranaire imbriqué

dans l’OMM en C-ter. De plus, une déplétion de cette protéine va atténuer la division

mitochondriale (Gandre-Babbe and van der Bliek 2008).

d. Régulation de l’équilibre dynamique

La fusion et la fission mitochondriale ont des activités antagonistes. Par conséquent,

leurs activités respectives doivent être étroitement contrôlées pour conserver le juste

102

Figure 21 : Modifications post-traductionnelles des protéines de fusion et de fission.

La séquence MTS de la protéine de fusion OPA1 est clivée par la peptidase matricielle MPP

après son import au sein de l’IMM. Les isoformes longues d’OPA1 vont subir un clivage

alternatif par les protéases PARL, matricielle mAAA, intermembranaire iAAA et OMA1 afin de

générer des isoformes solubles indispensables au bon fonctionnement de la protéine.

L’ubiquitine ligase MARCH5 ubiquitinyle les mitofusines, DRP1 et FIS1. DRP1 est sumoylée par

la ligase MAPL et désumoylée par la protéase SENP5. Trois kinases, CDK1/cyclin B, PKA et

CaMKIα phosphorylent DRP1 et ce dernier est déphosphorylé par la calcineurine.

103

équilibre requis pour moduler le degré d’inter-connectivité mitochondriale en fonction des

changements de conditions physiologiques.

Bien que la machinerie de la dynamique mitochondriale soit hautement conservée, les

mécanismes qui contrôlent son activité semblent être très différents selon les organismes,

voire même selon les types cellulaires. Chez les mammifères, il existe de nombreuses voies de

signalisation modulant la machinerie de la dynamique mitochondriale.

La protéine OPA1, de par l’existence de nombreuses isoformes, est soumise à une

régulation complexe. Ainsi, pour la formation des isoformes courtes d’OPA1, de nombreuses

protéases sont impliquées telles que PARL (Presenilins-Associated Rhomboïd-Like), quelques

protéases AAA et la métallo-endopeptidase OMA1 (Overlapping with the m-AAA protease 1)

(Griparic, Kanazawa et al. 2007) (Figure 21). Il est possible que l’expression spécifique de

certains tissus de ces protéases contribue au patron d’expression complexe d’OPA1. Nous

savons déjà que le clivage par la protéase de l’IMM, OMA1, est induit dans des mitochondries

endommagées ayant un faible m (Ehses, Raschke et al. 2009) (Head, Griparic et al. 2009).

Comme les isoformes longues et courtes sont nécessaires pour la fusion, une complète

conversion d’OPA1 en isoformes courtes annule la machinerie de fusion des mitochondries

défectueuses. Cette activité contribue très certainement au contrôle qualité des

mitochondries en prévenant la fusion de mitochondries trop endommagées avec des

mitochondries saines.

L’ubiquitine ligase MARCH5 de l’OMM s’associe et ubiquitinyle DRP1, FIS1 mais égale-

ment les mitofusines (John, Shang et al. 2005) (Dimmer, Jakobs et al. 2005). Une perte de

MARCH5 est associée à une élongation des mitochondries et entraîne la sénescence (Chen,

McCaffery et al. 2007). De plus, l’ubiquitine ligase MIB a été identifiée comme interagissant

avec MFN1 et diminuant la fusion mitochondriale par un mécanisme encore inconnu (Eura,

Ishihara et al. 2006).

104

Figure 22 : Modèle de la régulation de DRP1 par différentes voies de phosphorylation.

Il existe trois kinases décrites à ce jour induisant la phosphorylation de DRP1 (CaMKI, PKA et

Cdk1/cycline B). Chez l’homme, l’isoforme de DRP1 spécifique du cerveau est activée par

l’ajout d’un phosphate sur son résidu Serine 616, alors que la phosphorylation du résidu Serine

637 par la PKA va avoir l’effet inverse. Cette dernière phosphorylation est réversible grâce à

la calcineurine. Il a été démontré que l’isoforme 3 de DRP1 était activée par une

phosphorylation de son résidu Serine 600 induite par CaMKI.

105

La ligase ancrée à la mitochondrie MAPL (Mitochondrial-anchored protein ligase)

attache un motif SUMO (Small Ubiquitin-Like Modifer) à DRP1 afin de stimuler la fission

mitochondriale (Legros, Malka et al. 2004). C’est la protéase Sentrine-Spécifique 5 (SENP5) qui

retire ce signal SUMO de DRP1 (Zunino, Schauss et al. 2007) (Figure 21). L’activité de DRP1

peut également être modifiée réversiblement par la phosphorylation. Trois protéines kinases

ont été identifiées comme étant des agents phosphorylant différents résidus sérine (Ser) de

DRP1 : la kinase cycline-dépendante 1 (CDK1)-cyclin B (Taguchi, Ishihara et al. 2007), la

protéine kinase dépendante du cAMP (PKA) (Cribbs and Strack 2007) et la protéine kinase

dépendante de Ca2+/calmoduline I (CaMKI) (Han, Lu et al. 2008). Chez l’homme, la

CDK1/cycline B phosphoryle la Ser 616 (Ser 585 chez le rat), ce qui active la fission

mitochondriale (Taguchi, Ishihara et al. 2007). La PKA phosphoryle, quant à elle, la sérine 637

(Ser 656 chez le rat), une étude a démontré que, sur l’isoforme DRP1 du cerveau, cette

phosphorylation bloquait l’interaction entre les domaines GED et GTPase de DRP1 et qu’elle

était donc accompagnée d’une diminution de son activité GTPasique (Chang and Blackstone

2007). Une autre étude a également mis en évidence que cette phosphorylation réduisait la

fission mitochondriale (Cribbs and Strack 2007). La calcineurine phosphatase est responsable

de la déphosphorylation de cette Ser 637 (Cereghetti, Stangherlin et al. 2008). La

phosphorylation de la Ser 600 de l’isoforme 3 de DRP1 par la kinase CaMKI est observée

après l’induction d’un influx calcique au travers des canaux VOCC suite à l’élévation du niveau

potassique extracellulaire. Cette phosphorylation va augmenter la liaison de DRP1 aux

mitochondries (Figure 22) (Han, Lu et al. 2008).

Finalement, la dynamique mitochondriale est contrôlée au niveau transcriptionnel ou

grâce à la régulation de l’assemblage des complexes des mitofusines, etc… (Ishihara, Eura et

al. 2004) (Karbowski, Norris et al. 2006). En conclusion, les cellules de mammifères possèdent

un large répertoire de facteurs de régulation différents afin de moduler la dynamique

mitochondriale en réponse à des signaux très variés.

106

Figure 23 : Machinerie du transport axonal des mitochondries.

Les mitochondries sont transportées le long des microtubules axonaux par la kynésine-1 vers

l’extrémité « + » et par la dynéine vers l’extrémité « - ». Les forces liées à l'action des myosines

cytoplasmiques (par exemple la myosine V) peuvent moduler le transport à longue distance

des mitochondries sur les microtubules et pourraient être impliquées dans le transport local.

D’après (Saxton and Hollenbeck 2012).

107

e. Les moteurs du transport mitochondrial

Le transport mitochondrial est requis pour distribuer des mitochondries dans toute la

cellule. Dans la plupart des cellules, les mitochondries sont très mobiles et se déplacent le long

des rails du cytosquelette. Leur transport dépend du cytosquelette d'actine dans la levure

(Fehrenbacher, Yang et al. 2004) et à la fois du cytosquelette d'actine et des microtubules dans

les cellules de mammifères (Ligon and Steward 2000). Ce transport a lieu grâce à la génération

de forces par des protéines motrices (Hollenbeck and Saxton 2005).

Sur la base de similitudes structurelles, les protéines motrices sont classées en trois

familles : les myosines, les kinésines et les dynéines (Berg, Powell et al. 2001) (Wickstead

and Gull 2006). Les mouvements des organites induits par les myosines sont effectués sur

les filaments d’actine : par exemple, la myosine V dirige sa cargaison vers l’extrémité « + »

de la cellule (orienté à l’opposé du corps cellulaire) alors que la myosine VI permet un

déplacement vers l’extrémité «-» (orientée vers le corps cellulaire). Sur les microtubules, les

kinésines déplacent les organites vers l’extrémité « + » et les dynéines permettent un

mouvement rétrograde vers l’extrémité « - » (Figure 23) (Hirokawa, Noda et al. 2009)

(Lister, Roberts et al. 2004). La chaîne lourde de chaque type de protéines motrices possède

un domaine N-ter (appelé tête) spécifique et conservé selon la famille, qui génère une force

induisant le mouvement grâce à des cycles d’hydrolyse d'ATP. Ce domaine permet

également la liaison au cytosquelette et le changement de conformation de la protéine

motrice (Carter, Cho et al. 2011). Les séquences non conservées des tiges de ces protéines

motrices facilitent généralement l’homodimérisation en superhélice des chaînes lourdes, ce

qui permet au moteur de «marcher». Cela s’effectuera suite à des cycles alternatifs de

liaison d’une des deux chaînes lourdes au filament, de telle sorte qu'une des têtes de la

protéine motrice reste toujours attachée au « câble » (Vale and Milligan 2000). Ces

séquences de la tige et de la queue (C-ter) des protéines motrices fournissent très

certainement des sites de liaisons à des molécules adaptatrices permettant la liaison des

cargos à leurs moteurs et la régulation de ce transport (Akhmanova and Hammer 2010).

108

Figure 24 : Structure du neurone et transport axonal.

Représentation schématique d'un neurone périphérique avec son corps cellulaire (cell body)

qui intègre les signaux provenant des neurones présynaptiques et un axone transportant le

potentiel d’action depuis le soma vers les terminaisons synaptiques. Le développement des

neurones et leur fonction reposent sur un transport efficace à longue distance de composants

cytoplasmiques, y compris des vésicules (jaune), des mitochondries (rouge) et des endosomes

(orange) le long de l'axone. Le but principal de ce type de transport est d'acheminer des

organites et d'autres matériaux nouvellement synthétisés depuis le corps cellulaire vers la

terminaison axonale (transport antérograde) pour la réalisation de leurs différentes fonctions,

ainsi que de faire revenir les organites défectueux vers le corps cellulaire (transport

rétrograde) pour leur dégradation et leur recyclage. Ces deux formes de transport à longue

distance utilisent des protéines motrices qui attachent le « cargo » et le poussent le long des

microtubules (vert) vers leurs extrémités positives + (orienté à l’opposé du corps cellulaire) ou

vers leurs extrémités négatives - (orientées vers le corps cellulaire). D’après (Saxton and

Hollenbeck 2012).

109

L’adaptation de mécanismes spécifiques pour le transport à longue distance et le

positionnement des mitochondries ont dû être cruciaux pour le développement de grandes

cellules ayant des exigences métaboliques élevées et localisées loin du corps cellulaire, telles

que les neurones.

Le mouvement des mitochondries dans les axones est initié par les moteurs de kinésine

et de dynéine le long des microtubules dont l’extrémité « + » s’oriente vers les terminaisons

synaptiques (Figure 24). Des études fonctionnelles et biochimiques indiquent que la kinésine-

1 est le principal moteur mitochondrial antérograde (Barkus, Klyachko et al. 2008) mais il

existe des preuves sur cultures de tissus et sur des lignées de neuroblastomes, montrant que

les moteurs kinésine-3 Kif1b et Klp6 peuvent aussi transporter les mitochondries et donc,

qu’ils pourraient certainement le faire également dans les axones (Tanaka, Sugiura et al.

2011). Des approches similaires indiquent que la dynéine cytoplasmique serait le moteur

rétrograde principal des mitochondries (Pilling, Horiuchi et al. 2006). Fait intéressant, l'analyse

génétique de la kinésine-1 et de la dynéine chez la drosophile a révélé que ces moteurs

pourtant opposés pouvaient en fait être interdépendants (Martin, Iyadurai et al. 1999). Bien

que des mutations de la dynéine inhibent seulement le transport mitochondrial rétrograde,

des mutations de la kinésine-1 inhibent à la fois le mouvement antérograde et rétrograde des

mitochondries (Pilling, Horiuchi et al. 2006).

Les axones contiennent des filaments d'actine courts qui sont de polarité mixte (non

monodirectionnels, Figure 23) ce qui soulève des questions sur la façon dont les myosines

contribuent au transport mitochondrial (Bridgman 2004). Une hypothèse suggère que les

myosines assurent une fonction auxiliaire aidant les mitochondries à retourner sur une piste

de microtubules lorsque les kinésines et dynéines se désengagent, ou lorsqu’il y a de petites

régions axonales sans microtubules (Hollenbeck and Saxton 2005). Une autre possibilité, sug-

gérée par le mouvement complexe en deux dimensions des organites pigmentaires au sein

des mélanocytes, est que l'engagement de la myosine avec les filaments d'actine perturbe le

110

111

mouvement mitochondrial le long des microtubules, aidant ainsi les mitochondries à s’arrêter

aux destinations appropriées (Gross, Tuma et al. 2002). Ce point de vue est soutenu par des

études sur des neurones de drosophile en culture, dans lesquels la réduction du niveau de

myosine V augmente l'efficacité du transport mitochondrial dans les deux sens, avec un

avantage net pour le transport antérograde. Une réduction de la myosine VI a des effets

similaires, mais favorise les mouvements rétrogrades (Schwarz 2013).

La mobilité des mitochondries diffère de celle des autres organites de par ses

paramètres uniques : en effet, il existe deux populations de mitochondries au sein des axones,

celles dites stationnaires et celles qui se déplacent tout le long de l’axone (Chada and

Hollenbeck 2004) (Miller and Sheetz 2004) (Yu, Lee et al. 2015). De plus, la signalisation à partir

de certains sites spécifiques le long du neurone peut réguler le mouvement (et les pauses) des

mitochondries (Ruthel and Hollenbeck 2003). De nombreuses protéines sont capables de fixer

les protéines motrices et de les lier à diverses cargaisons, de réguler leur activité motrice ou

d’effectuer les deux. Différentes kinases affectent le trafic axonal des organites. Celles-ci

comprennent les kinases MARKs (Microtubule-Affinity Regulating Kinases), également

connues sous le nom de kinases Par-1 ((Mandelkow, Thies et al. 2004), les kinases cycline-

dépendantes (Holzbaur 2010), les récepteurs à activité tyrosine-kinase (Chada Hollenbeck,

2004) et les kinases phosphoinositide 3 (Malaiyandi, Honick et al. 2005). Des études utilisant

des systèmes in vitro non neuronaux ont montré que la protéine tau, une protéine associée

aux microtubules, limite la longueur de « pas » des moteurs et, en fonction de l'isoforme de

la protéine tau, peut limiter l'accès des kinésines aux microtubules, de sorte que le transport

antérograde est biaisé (Dixit, Ross et al. 2008). Dans les cellules de neuroblastome et les

cellules ganglionnaires de la rétine, une concentration élevée d'une isoforme non

phosphorylable de la protéine tau modifie le transport des mitochondries et d’autres

organites, limitant ainsi leur présence dans les neurites (Mandelkow, Thies et al. 2004). Une

autre possibilité pour moduler l'accès des protéines motrices aux microtubules dans les

neurones est l’induction de modifications post-traductionnelles sur la tubuline modifiant ses

propriétés de liaison (Reed, Cai et al. 2006). Des mécanismes plus spécifiques de la régulation

du transport des organites impliquent la phosphorylation directe des sous-unités des

protéines motrices. La kinase C-Jun N terminale (JNK), qui influe sur la répartition des vésicules

112

113

dans les neurones (Byrd, Kawasaki et al. 2001), phosphoryle la chaîne lourde de la kinésine-1

(Khc), réduisant ainsi son affinité pour les microtubules (Morfini, You et al. 2009). La kinase

glycogène synthase 3 (Morfini, Szebenyi et al. 2004) et la caséine kinase (Pigino, Morfini et al.

2009) peuvent phosphoryler la chaîne légère de la kinésine-1 (Klc), ce qui se traduit par une

affinité réduite de kinésine-1 pour le cargo et une inhibition du transport axonal. Des iso-

formes spécifiques d'épissage de Klc peuvent s’associer aux mitochondries et leur hyperphos-

phorylation coïncide avec la distribution aberrante des mitochondries dans des cellules culti-

vées (De Vos, Severin et al. 2000). Des travaux récents sur la caytaxine, une protéine impliquée

dans l'ataxie humaine, ont montré qu'elle se lie à la Klc, s’associe avec les mitochondries et

influence la distribution de ces dernières dans les neurites (Aoyama, Hata et al. 2009).

En résumé, il reste beaucoup de questions importantes non élucidées sur les

mécanismes de transport des mitochondries. Comment les moteurs sont-ils liés aux

mitochondries ? Comment les interactions moteur-filaments sont-elles contrôlées ? Pour

l’instant, les liens identifiés entre la kinésine-1 et les mitochondries comprennent les protéines

Miro, Milton et syntabuline. Un complexe d'ancrage des mitochondries aux microtubules

identifié serait composé, entre autres, de la syntaphiline et la LC8. Nous savons que des

facteurs de régulation tels que le Ca2+, les kinases, la protéine tau et Miro influencent la liaison

et la fonction motrice.

f. Régulation du transport mitochondrial

La compréhension des mécanismes spécifiques régulant le transport à longue distance

des mitochondries nécessite l’identification moléculaire de leurs connexions structurelles

avec les protéines motrices qui les déplacent et avec les protéines qui leurs servent de points

d'ancrage fixes.

Pour le mouvement rétrograde, la chaîne intermédiaire de la dynéine (DIC) est un

candidat phare pour la liaison du moteur à son/ses cargos. La DIC peut se lier à la fois à la

114

115

chaîne lourde de la dynéine cytoplasmique et au complexe activateur de cette dernière, la

dynactine, qui contient notamment les sous-unités P150 (Glued), ARP1, ou P50 et plusieurs

autres protéines (Vaughan and VaUee 1995).

Des études ont démontré que la dynéine et la dynactine s’associaient à la mitochondrie

(Varadi, Johnson-Cadwell et al. 2004; Pilling, Horiuchi et al. 2006). L'inhibition génétique des

composants de la dynactine chez la drosophile provoque une dégénérescence des axones et

un transport axonal mitochondrial défectueux (Haghnia, Cavalli et al. 2007). Bien que ces

observations confirment l'idée selon laquelle une interaction entre la dynéine et les

mitochondries est médiée par sa chaine intermédiaire et la dynactine, une preuve directe fait

encore défaut.

La syntabuline, d'abord identifiée comme une protéine de liaison à la syntaxine, a été

décrite comme étant un agent de liaison entre la kinésine et les mitochondries. Elle se lie à la

kinésine-1, peut être associée aux mitochondries et la perturbation de sa fonction inhibe

spécifiquement le transport antérograde de ces dernières (Cai, Gerwin et al. 2005). Une autre

protéine de liaison à la syntaxine, la syntaphiline (Kang, Tian et al. 2008). La syntaphiline est

transportée le long de l'axone en même temps que les mitochondries ; elle peut se lier aux

microtubules et s’associe fortement aux mitochondries stationnaires, mais pas aux

mitochondries motiles (Kang, Tian et al. 2008). Remarquablement, la chaîne légère de la

dynéine (LC8), qui a de nombreux partenaires de liaison (Rapali, Radnai et al. 2011), facilite les

interactions entre la syntaphiline et les microtubules (Chen, Gerwin et al. 2009).

L’abaissement des niveaux d'expression de la syntaphiline ou de la LC8 réduit la fraction de

mitochondries axonales stationnaires, ce qui suggère que ces protéines génèrent des liens

statiques entre les mitochondries et les microtubules (Chen, Gerwin et al. 2009) (Kang, Tian

et al. 2008). Une autre protéine multi-fonctionnelle s’associant aux mitochondries neuronales

est la protéine de liaison à Ran (Ran-binding protein 2, RanBP2). RanBP2 s’assemble

également avec un complexe qui comprend l’isoforme kinésine-1 spécifique des neurones

116

117

(Cai, Singh et al. 2001). Toutefois, l'importance de ces fonctions dans la circulation des

mitochondries neuronales reste à être élucidée (Chen, Gerwin et al. 2009) (Kang, Tian et al.

2008).

Nous savons également que le Ca2+ contrôle le transport mitochondrial via la kinésine-

1. Il est connu, depuis un certain temps, que l'activité neuronale régule le mouvement et la

distribution mitochondriale (Chang, Honick et al. 2006) (Hollenbeck and Saxton 2005) mais le

rôle régulateur du Ca2+ a été quelque peu controversé. Cependant, de nombreuses études

penchent en faveur d’une très probable régulation de la motilité mitochondriale en fonction

des flux calciques. Des études dans des neurones de vertébrés ont montré que l’élévation

calcique médiée par les neurotransmetteurs peut inhiber la mobilité des mitochondries sans

affecter celle des autres organites (Mironov 2006) (Rintoul and Reynolds 2010). Des travaux

ont montré que, dans des axones myélinisés, une activité électrique soutenue stoppe le

mouvement des mitochondries à proximité des pompes ioniques de la membrane plasmique ;

et que l’activité de la pompe et une concentration calcique cytosolique élevée en sont

responsables (Zhang, Ho et al. 2010) (Ohno, Kidd et al. 2011). Des cribles génétiques chez la

drosophile montrent que la protéine Miro (GTPase Rho-like de l’OMM liant le Ca2+) et la

protéine Milton (liant les mitochondries et la kinésine) jouent un rôle dans le transport

synaptique des mitochondries. Les protéines Miro et Milton forment un complexe avec la

chaîne lourde de la kinésine-1 qui relie ce moteur aux mitochondries et régule les effets du

Ca2 + sur le mouvement mitochondrial (Wang and Schwarz 2009) (Figure 23).

g. Dynamique et transport, deux phénomènes étroitement liés

Inéluctablement, il existe un lien fort entre la dynamique mitochondriale et la

distribution de ces organites. Les cellules défectueuses pour la division mitochondriale

contiennent des mitochondries hautement interconnectées qui s’accumulent généralement

dans des zones restreintes, laissant de grandes régions cellulaires dépourvues en

mitochondries. Une distribution mitochondriale appropriée dépend de la capacité du réseau

118

Figure 25 : Des défauts dans la dynamique mitochondriale conduisent à un dysfonctionne-

ment neuronal.

(A) Dans les neurones « normaux », les mitochondries parcourent de longues distances à

partir du corps cellulaire vers les dendrites et les terminaisons axonales, où elles jouent un

rôle important dans la production d'ATP et l'homéostasie calcique. (B) En l'absence de fusion,

la population mitochondriale fragmente, une partie d’entre elle présente des défauts

ultrastructuraux et dysfonctionne (rouge). Les mitochondries présentent secondairement un

défaut de transport qui empêche leur bonne distribution à la périphérie. (C) En l'absence de

fission, les mitochondries sont excessivement longues et interconnectées, certaines montrent

un dysfonctionnement (rouge). Ces grandes mitochondries se regroupent au sein du corps

cellulaire et ne sont pas efficacement transportées vers les prolongements neuronaux. (D)

Des défauts primaires de la motilité mitochondriale empêchent la distribution des

mitochondries à la périphérie. (E) En absence de mitotophagie, les mitochondries anormales

(rouge) s’accumulent. D’après (Chen and Chan 2009).

119

à se fissionner en unités transportables. De toute évidence, c'est particulièrement important

dans les grandes cellules telles que les neurones (Figure 25). Par conséquent, les protéines

DRP1, MFN1/2 et OPA1 sont cruciales pour permettre une dispersion mitochondriale

appropriée dans l’ensemble des neurites. Dispersion nécessaire pour le maintien des épines

et des synapses dendritiques dans lesquelles la demande énergétique est particulièrement

élevée (Li, Okamoto et al. 2004) .

Ainsi, des souris KO pour DRP1 présentent des anomalies graves du développement,

en particulier dans le cerveau et le cervelet (Ishihara, Nomura et al. 2009) (Wakabayashi,

Zhang et al. 2009). De même, des neurones mutants pour DRP1 en culture primaire montrent

à la fois une accumulation des mitochondries dans le corps cellulaire, et seulement quelques

mitochondries agglomérées et irrégulièrement réparties dans les neurites (Ishihara, Nomura

et al. 2009). Cela confirme qu’une carence en DRP1 empêche une distribution mitochondriale

neuronale appropriée pouvant conduire à des maladies neurodégénératives (voir section II.1.

Dysfonctionnements mitochondriaux et Neurodégénérescence) Un modèle de souris MFN2

KO conditionnels, développe une dégénérescence spécifique des neurones de Purkinje du

cervelet. Les mitochondries de ces neurones sont bien fragmentées mais ne parviennent pas

au bout des dendrites longues et très ramifiées caractéristiques des neurones de Purkinje.

Cela indique que la fusion peut également influencer la distribution mitochondriale (Chen,

McCaffery et al. 2007). De plus, dans des fibroblastes embryonaires de souris KO pour MFN1

ou 2, les mitochondries perdent leur mouvement directionnel et semblent bouger de façon

aléatoire dans le cytosol, suggérant qu’elles sont détachées des microtubules (Chen, Detmer

et al. 2003). Enfin, OPA1 possède également un rôle important dans la distribution

mitochondriale. Il a été montré que lorsque OPA1 est sous exprimé dans des neurones

corticaux de rats, la répartition dendritique des mitochondries est altérée (voir section II.1.d.)

(Bertholet, Millet et al. 2013).

120

121

5. Adressage des protéines mitochondriales

Nos connaissances sur les principes généraux de l'importation de protéines dans les

mitochondries proviennent principalement d'études génétiques et biochimiques menées sur

l’organisme modèle de la levure du boulanger (Saccharomyces cerevisiae). Cependant, la

grande majorité des machineries protéiques impliquées sont hautement conservées chez les

eucaryotes supérieurs. Il est largement accepté que l’import de précurseurs protéiques au

sein de la mitochondrie se fait de façon post traductionnelle. Les ribosomes impliqués dans

la traduction des ARN messagers (ARNm) codant pour les précurseurs des protéines

mitochondriales sont retrouvés à proximité de la membrane externe de la mitochondrie

(MacKenzie and Payne 2004). Des signaux spécifiques, tant au sein de la région 3’ non traduite

que dans les régions codantes de ces ARNm ont été identifiés afin de médier leur ciblage à ces

ribosomes spécifiques (Margeot, Garcia et al. 2005). Chez la levure, le recrutement de ces

ARNm à la surface mitochondriale implique la protéine Puf3 et les protéines récepteurs de

l’OMM Tom20 et Tom70 (Eliyahu, Pnueli et al. 2010) (Gadir, Haim-Vilmovsky et al. 2011(Gadir,

Haim-Vilmovsky et al. 2011).

L’adressage des précurseurs de protéines aux mitochondries et leur aiguillage dans les

différents sous compartiments mitochondriaux nécessitent la présence d’une séquence

spécifique d’import mitochondrial : le signal MTS. Ordinairement, ce signal se trouve dans la

région amino-terminale du précurseur. Très souvent, ces séquences présentent une hélice

amphipathique (molécule présentant une face hydrophile et une face hydrophobe) avec une

charge nette positive et sont formées de 15 à 55 a.a. (Vogtle, Wortelkamp et al. 2009). En

général, ces préséquences N-ter sont enlevées après l'importation par l’action de la peptidase

mitochondriale (MPP) et d'autres protéases (Mossmann, Meisinger et al. 2012). Une

exception intéressante est l'hélicase HMI1, qui est canalisée vers les mitochondries par une

structure analogue à un MTS mais cette fois située dans la région C-ter (Lee, Sedman et al.

1999). Il existe également des signaux internes, souvent moins bien définis, qui ciblent les

protéines vers différentes destinations au sein de la mitochondrie.

122

Figure 26 : Représentation schématique du complexe TOM de l’OMM.

Le complexe TOM contient les récepteurs initiaux Tom20 et Tom70 (jaune). Le complexe de

base de TOM forme le pore protéique conducteur et inclut les protéines Tom5, Tom6, Tom7,

Tom22 et Tom40. Les noms des sous-unités Tom reflètent leur poids moléculaire. D’après

(Rapaport 2002).

Tom40

123

Pour éviter un mauvais repliement et une agrégation, les segments hydrophobes des

protéines précurseurs mitochondriales sont souvent protégés du milieu aqueux cytosolique

par des chaperonnes dédiées (Heat shock protein, Hsp70, Hsp90), qui les accompagnent à la

surface de l'organite (Zara, Ferramosca et al. 2009). Les récepteurs de la membrane externe

Tom20 et Tom70 servent de sites d'amarrage initial pour les protéines mitochondriales et

fonctionnent comme des points de "contrôle qualité" qui ne permettent l'accès aux

mitochondries que si la protéine donnée contient un signal de ciblage approprié. Excepté

certaines protéines α-hélicoïdales de la membrane externe, pratiquement tous les

précurseurs entrent dans les mitochondries en passant par une porte d'entrée commune

formée par les translocases de l’OMM: le complexe TOM (Figure 26) (Model, Meisinger et al.

2001). La translocase Tom40 est l'élément central du complexe TOM, il est intégré dans la

membrane externe dans une conformation β-cylindrique (β-barrel) et forme des pores

aqueux, dans lesquels les protéines précurseurs mitochondriales peuvent passer.

Des sous-unités supplémentaires soutiennent ou modulent la structure et/ou la

fonction quaternaire du complexe TOM, tels que les récepteurs : Tom20, Tom70/Tom71,

Tom22, et les petites protéines Tom5, Tom6 et Tom7. Les récepteurs primaires Tom20 et

Tom70/Tom71 se lient sélectivement aux différentes sous-unités des protéines précurseurs

mitochondriales (Brix, Dietmeier et al. 1997).

Tom20 reconnaît principalement le signal MTS en se fixant sur la face hydrophobe de

l’hélice amphipathique (Saitoh, Igura et al. 2007). Les protéines avec des signaux MTS

hydrophobes internes sont quant à elles préférentiellement liées par Tom70 et Tom71 (Wu

and Sha 2006). Le récepteur central Tom22 est essentiel pour l'intégrité du complexe TOM et

expose des domaines de liaison aux MTS à la fois dans le cytosol et l'IMS (Shiota, Mabuchi et

al. 2011). Une fois la translocation au travers de l’OMM effectuée, différentes voies de

transport sont spécifiquement requises pour l’acheminement des protéines mitochondriales

à leur destination finale.

124

Figure 27 : Représentation schématique de la machinerie d’import mitochondrial.

Différents signaux de ciblage codés sur les protéines précurseurs leur permettent d’emprunter

des voies de transport spécifiques selon leur localisation finale dans la mitochondrie. Après la

translocation des précurseurs à travers la membrane externe grâce au complexe TOM, diffé-

rentes voies d’import mitochondrial vont diverger dans l’IMS. La biogenèse des protéines β-

barrel de la membrane externe requiert la présence de petites protéines chaperonnes Tim de

l'IMS et la machinerie de tri et d’assemblage des précurseurs (SAM). Les protéines de l'IMS qui

contiennent des signaux riches en cystéines (CxnC) sont importées via la voie MIA. Les pro-

téines support de la membrane interne (carriers) sont transportées à l'aide des petites pro-

téines Tims et de la translocase 22 de l’IMM (complexe TIM22). Les protéines contenant un

MTS « canonique » (dans la préséquence) sont insérées dans l’IMM ou importées dans la ma-

trice par la translocase 23 de la membrane interne (complexe TIM23 ; préséquence translo-

case). La translocation de précurseurs dans la matrice nécessite le moteur d’importation PAM.

Les signaux MTS sont ensuite clivés par action de la peptidase mitochondriale (MPP) lors de

l'importation. Δψm = potentiel de membrane à travers la membrane mitochondriale interne.

D’après (Dudek, Rehling et al. 2013).

125

Dans les cellules eucaryotes, les protéines "β-barrel" (localisées à l’origine sur la

membrane externe des bactéries à Gram négatif) se trouvent exclusivement dans les

membranes externes des organites endosymbiotes (mitochondries, plastes), car ces derniers

proviennent d’ancêtres procaryotes. La porine, Tom40, Sam50 et Mdm10 sont les protéines

β-barrel de l’OMM. Les précurseurs β-barrel sont reconnus par les récepteurs du complexe

TOM et guidés à travers le pore Tom40 par une série de liaisons à des sites hydrophobes

(empêchant l’agrégation des précurseurs) (Esaki, Kanamori et al. 2003). Par la suite, les

protéines précurseurs sont remises à des complexes de protéines chaperonnes solubles de

l'IMS, formés par les petites protéines Tim (Figure 27). L’intégration des protéines β-barrel à

partir de l’IMS dans le côté inférieur de l’OMM est déclenchée par un signal spécifique

d'importation. Cette séquence de ciblage a été appelée signal-β et se compose d'un acide

aminé polaire (lysine ou glutamine), d’une glycine invariante et deux acides aminés

hydrophobes (Kutik, Stojanovski et al. 2008). Guidées par ce signal-β, les protéines

précurseurs sont livrées à des petites chaperonnes Tims au complexe SAM (Sorting and

Assembly Machinery) de l’OMM pour leur structuration et leur insertion dans la bicouche

lipidique (Figure 27) (Kutik, Stojanovski et al. 2008).

De nombreuses protéines de l’IMS contiennent des résidus multiples de cystéines qui

sont impliqués dans la formation de ponts disulfure, comme pour les protéines Tim9 et

Tim10, ou dans la liaison de cofacteurs et d'ions métalliques, comme pour la protéine Cox17.

Ces résidus cystéines se trouvent généralement dans des motifs caractéristiques, de type

CX3C ou Cx9C (Figure 27). Un signal de localisation à l’IMS (Mitochondrial IMS Sorting Signal,

MISS) autour de ces motifs cystéines a été décrit et permet l’adressage des protéines de

l’IMS via la voie MIA (Mitochondrial Intermembrane space import and Assembly) (Figure 27)

(Sideris, Petrakis et al. 2009). Le récepteur d'importation Mia40 et l’oxydase sulfhydryle Erv1

sont les composants basiques essentiels de la machine MIA qui fonctionne comme un sys-

tème relais à base de ponts disulfure. En effet, la protéine Mia40 forme des ponts disulfures

intermoléculaires transitoires avec les protéines cibles entrantes, dès qu'elles sortent du

complexe TOM, les piégeant ainsi dans l'IMS (Muller, Milenkovic et al. 2008).

126

Figure 28 : Réarrangements et couplages de différents complexes protéiques partenaires

afin de déclencher les interrupteurs fonctionnels distincts du complexe TIM23.

Le potentiel de membrane Δψm permet le transfert de séquences MTS chargées positivement

du complexe TOM au pore TIM23 dans un processus impliquant Tim21. Pour l'intégration des

pré-protéines dans l’IMM, le complexe TIM23-Tim21 (TIM23 SORT) s’associe à des

supercomplexes de la chaîne respiratoire, composés de la sous-unité bc1 du cytochrome et

de la cytochrome c oxydase (COX). La translocation protéique matricielle nécessite le

recrutement et l'activation du moteur d'importation PAM. Dans le modèle de travail illustré

ici, Pam 17 enlève Tim21 du complexe de base TIM23 et déclenche avec Tim44 la liaison du

module PAM16-Pam18. Ensuite, Pam 17 lui-même est libéré au cours des étapes ultérieures

d'assemblage du complexe PAM. Dans le complexe PAM activé, mtHsp70 coopère avec les

protéines Pam16-Pam 18, Tim44 et Mge1 afin d’importer les pré-protéines dans la matrice

mitochondriale de façon dépendante de l’hydrolyse d’ATP. D’après (Dudek, Rehling et al.

2013).

127

L’IMM est l'une des membranes les plus riches en protéines. Les protéines intégrales

de cette membrane traversent la bicouche phospholipidique dans une conformation en hélice

α et se distinguent principalement par la présence ou l'absence de MTS dans la région N-term

de leurs formes « précurseurs ». La majorité de ces protéines appartiennent à la famille des

transporteurs métabolites mitochondriaux, comme les transporteurs ATP/ADP ou du

phosphate. Plusieurs protéines de l’IMM qui ne disposent pas de MTS contiennent plusieurs

signaux d'importation internes chevauchant leurs segments transmembranaires. Ces derniers

coopèrent pour diriger le ciblage mitochondrial et l'intégration des protéines matures dans la

membrane. Ces protéines sont guidées par de petites chaperonnes Tim au travers de l'IMS et

sont ensuite intégrées dans l’IMM par le complexe Translocase 22 (complexe TIM22) de façon

dépendante du potentiel de membrane (Δψm) (Rehling, Brandner et al. 2004).

Enfin, de nombreuses protéines sont directement transmises depuis le complexe de

TOM à la translocase 23 de la membrane interne (complexe TIM23), sans avoir recours à des

chaperonnes solubles de l’IMS (Vogtle, Wortelkamp et al. 2009). Selon leur séquence d’import

mitochondrial, le complexe TIM23 médie soit la translocation des précurseurs dans la matrice,

soit leur sortie latérale dans la membrane interne (Figure 28). En effet, des signaux de sortie

hydrophobes en aval de la séquence MTS induisent le dégagement latéral des protéines dans

la membrane interne de la mitochondrie par un mécanisme d'arrêt de transfert (Bohnert,

Rehling et al. 2010). Les trois sous-unités principales formant le cœur catalytique du complexe

TIM23 sont : Tim23, Tim17 et Tim50. Tim23 forme un pore au sein de l’IMM qui permet la

traversée des protéines de manière Δψm dépendante (Truscott, Kovermann et al. 2001).

Tim17 est quant à lui impliqué dans la stabilisation et la régulation du canal formé par Tim23

et dans la sortie différentielle des pré-protéines (Martinez-Caballero, Grigoriev et al. 2007). Il

a été proposé que Tim50 permet le maintien du canal Tim23 dans un état fermé pour

empêcher la fuite d'ions et la dissipation du Δψm en l'absence de préprotéine (Meinecke,

Wagner et al. 2006).

La reconstitution des complexes TIM23 en protéoliposomes a directement démontré

que l'énergie dérivée du Δψm est suffisante pour l'insertion dans la membrane interne de

128

129

protéines contenant un signal d'arrêt de transfert hydrophobe adjacent au MTS (van der Laan,

Meinecke et al. 2007). Pour une translocation complète de préprotéines solubles (ou de

grands domaines hydrophiles de protéines membranaires ancrées) dans la matrice, l'activité

Δψm-dépendante de TIM23 ne suffit pas. De l'énergie supplémentaire provenant de l'hydro-

lyse de l'ATP dans la matrice mitochondriale est nécessaire. Les étapes d’import des protéines

dans la matrice de façon ATP-dépendante nécessitent la présence du moteur d’import associé

aux membranes : PAM (Presequence transclocase-Associated import Motor). La force per-

mettant l’entrée des préprotéines dans la matrice mitochondriale est fournie par l’activité

ATPase de la protéine chaperonne mtHsp70 également appelée mortaline ou Hspa9 (Liu,

D’Silva et al. 2003). La protéine Hsp70mt est recrutée et régulée aux canaux TIM23 par plu-

sieurs co-chaperonnes : Pam18 (Tim14), Pam16 (Tim16), Mge1, Tim44 et Pam17 (Figure 28).

Pam18 actionne l’activité ATPase d’Hsp70mt (Pais, Schilke et al. 2011). Pam16 forme un com-

plexe stable avec la protéine Pam18, ce qui est déterminant pour le recrutement de ce

dernier aux sites d’import des protéines mitochondriales (D'Silva, Schilke et al. 2008).

En outre, il a été suggéré que Pam16 contrôlait l'activité de Pam18 et donc participait directe-

ment à la régulation du cycle de réaction d’Hsp70mt (Li, Dudek et al. 2004). Mge1 est égale-

ment cruciale pour l’importation des protéines matricielles, car elle interagit avec Hsp70mt de

façon ATP dépendante afin d’activer l'association dynamique d’Hsp70mt avec le complexe

cœur TIM23 (D'Silva, Liu et al. 2004) . La protéine Hsp70mt joue également un rôle très im-

portant dans le contrôle qualité des protéines entrant dans la matrice (Goswami, Chittoor et

al. 2010).

130

Figure 29 : Maladies neurodégénératives associées à des défauts mitochondriaux.

Chacune de ces pathologies affecte généralement plusieurs régions du cerveau dont les prin-

cipales touchées sont indiquées. D’après (Chen and Chan 2009).

131

II) Dysfonctionnements mitochondriaux & Neurodégénérescence

1. Dysfonctions mitochondriales et perturbation de la dynamique, quelques

exemples de neuropathies

La grande complexité du fonctionnement des mitochondries, leur double origine

génétique, le mode particulier de leur transmission et leur répartition dans tout l’organisme,

sont à l'origine de l’incroyable diversité des présentations cliniques des maladies

mitochondriales. Ici, nous nous intéressons plus particulièrement aux maladies

neurodégénératives qui présentent des dysfonctionnements mitochondriaux. En effet, de

nombreux arguments suggèrent qu’il existe une implication décisive et conjointe des défauts

de la bioénergétique, de la dynamique et du transport mitochondrial dans la pathogénèse des

maladies d’Alzheimer (MA), de Parkinson (MP) et d’Huntington (MH) (liste non exhaustive).

D’autres maladies neurodégénératives sont, quant à elles, causées directement par des

mutations dans des protéines actrices de la dynamique mitochondriale. C’est le cas de

l’Atrophie Optique Dominante Autosomique (AODA) ou encore la maladie de Charcot-Marie-

Tooth de type 2 (CMT2A), induites respectivement par des mutations dans les protéines de

fusion de l’IMM (OPA1) et de l’OMM (MFN2) (Figure 29).

a. La maladie d’Alzheimer

La maladie d'Alzheimer (MA), maladie neurodégénérative la plus courante chez les

personnes âgées, provoque des dysfonctionnements cognitifs et une perte de mémoire,

pour aboutir à la démence. On estime que 10% de la population planétaire âgée de plus de

60-65 ans pourrait actuellement être affectée par la MA et que dans les 20 prochaines

années, il pourrait y avoir plus de 30 millions de personnes touchées par cette maladie.

Divers événements moléculaires complexes ont été associés à la pathogenèse de la MA qui

est classiquement divisée en deux sous-types, en fonction de l'âge d’apparition familiale et

132

Figure 30 : Dysfonctionnements mitochondriaux dans la maladie d’Alzheimer.

Les zones du cerveau affectées par la maladie d'Alzheimer (en premier lieu l'hippocampe et le cortex cérébral) présentent une accumulation extracellulaire de plaques ß-amyloïdes et les neurones en dégénérescence contiennent des enchevêtrements neurofibrillaires intracellulaires typiques (NFT). L’APP et l’Aβ peuvent affecter la fonction mitochondriale par différents mécanismes. L’APP est ciblée vers les mitochondries, où elle forme des complexes avec les translocases des membranes externe et interne (TOM et TIM). En conséquence, l'importation de protéines mitochondriales, telles que les sous-unités de la chaîne respiratoire, est réduite, ce qui est associé à une augmentation de la production de radicaux libres et à une activité réduite de la chaîne de transport d'électrons. D'autres aspects du métabolisme amyloïde impliquent les mitochondries : l’Aβ intramitochondrial interagit avec l'alcool déshydrogénase se liant à l'amyloïde-β (ABMA) pour produire des ROS. L’Aβ interagit également avec la cytochrome c oxydase, diminuant ainsi l'activité du complexe IV. Elle interagit également directement avec la cyclophiline D (CypD), un composant du pore de la perméabilité mitochondriale transitoire (MPTP). Cette interaction rend le canal plus sensible au Ca2+ et stimule son ouverture, augmentant ainsi la perméabilité de la membrane mitochondriale interne (IM) et aboutissant éventuellement à la rupture de la membrane mitochondriale externe (OM). En conséquence, la dérégulation de l'ouverture du MPTP entraîne un trouble fonctionnel qui déclenche la mort cellulaire. D’après (de Castro, Martins et al. 2010).

133

sporadique. La forme familiale, 5-10% des cas, est une forme héréditaire autosomique

dominante caractérisée par des mutations dans le gène de la protéine précurseur de

l'amyloïde (APP) et/ou des gènes de la préséniline 1 et 2 (affectant, entre autres, l'activité de

la gamma sécrétase) et se caractérise par une apparition précoce de la maladie (avant 55 ans).

Les cas sporadiques représentent 90-95% de tous les cas de MA et commencent,

généralement, à un âge plus avancé (≥ 65ans) (Meraz-Rios, Franco-Bocanegra et al. 2014).

Les principaux éléments pathologiques présents dans les cerveaux de patients MA sont

la présence d'enchevêtrements neurofibrillaires intracellulaires, la formation de plaques

séniles extracellulaires et la perte neuronale dans le cortex. Les plaques séniles sont des

dépôts extracellulaires composés principalement de deux formes de peptides beta-amyloïde

toxiques d’une longueur de 40 ou 42 acides aminés (Aβ1-40/ Aβ1-42) dérivés de l’APP suite à des

clivages séquentiels par les sécrétases β et γ sécrétase [un complexe protéique comprenant

les présénilines 1 et 2, la nicastrine, la protéine antérieure du pharynx défectueuse 1 et

l’enhancer de la préséniline 2 (Kimberly, LaVoie et al. 2003)]. La forme Aβ1-42 est celle qui a le

plus de propension à s’aggréger pour former les plaques amyloïdes. Bien que le mécanisme

pathologique exact de la MA soit encore inconnu, l'hypothèse dominante est que la

production d’Aβ en excès entraîne son aggrégation et ainsi une toxicité cellulaire. Les

oligomères d'Aβ diffusent dans le parenchyme cérébral et les vaisseaux sanguins. Ce sont des

neurotoxines puissantes : elles bloquent le fonctionnement du protéasome, inhibent l'activité

mitochondriale, modifient le niveau intracellulaire en Ca2+ et stimulent les processus

inflammatoires (Figure 30). Parmi les mécanismes figure en particulier la perte des fonctions

physiologiques liées aux formes non-toxiques d’Aβ, dont l’interaction avec les voies de

signalisation qui régulent la phosphorylation de la protéine Tau, une protéine associée aux

microtubules. L’hyperphosphorylation de cette dernière perturbe son activité de régulation

du transport axonal et conduit à l'accumulation d'enchevêtrements neurofibrillaires et

d’espèces toxiques de la protéine Tau soluble (LaFerla 2010).

Plusieurs études ont démontré que le stress oxydatif était un facteur important dans

l'initiation et la progression de la maladie. L'accumulation anormale d’Aβ et de protéine Tau

134

135

hyperphosphorylée semble promouvoir un déséquilibre redox (Figure 30), entraînant un

stress oxydatif neurotoxique. Différents éléments ont également suggéré que le stress

oxydatif pouvait augmenter la production et l'agrégation des Aβ et faciliter la polymérisation

et la phosphorylation de la protéine tau sur des sites spécifiques, conduisant alors à un cercle

vicieux favorisant l’initiation et la pérennité de la MA (Zhao and Zhao 2013). Une

augmentation des ROS stimule la transcription de gènes pro-inflammatoires, le relargage de

chimiokines et de cytokines telles l’IL-1, l’IL-6 et le TNF- (Buchholz, Behringer et al. 2007).

Cet état neuro-inflammatoire conduit à l'activation de la microglie et des astrocytes,

qui produisent à leur tour une grande quantité de ROS, de sorte que la neuroinflammation

peut être perçue à la fois comme une cause et une conséquence d’un stress oxydatif

chronique. L’interaction entre le stress oxydant et la neuroinflammation favoriserait la

production d’Aβ toxique, qui, sous forme fibrillaire, active la voie de signalisation de protéines

kinases (PKC, MAPK) et la production de superoxyde dans la microglie (Lull and Block 2010).

En plus d’une production élevée de ROS, une dérégulation de l’homéostasie calcique

est observée dans les modèles animaux de MA et dans des échantillons de cerveaux de

patients MA (Supnet and Bezprozvanny 2010) (Figure 30). Comme expliqué précédemment,

une absorption mitochondriale rapide de ce cation est observée lors d’une importante

augmentation cytosolique en Ca2+, un événement crucial dans le système nerveux central

(SNC) étant donné le rôle du calcium dans la neurotransmission, la plasticité synaptique à

court et long terme et dans la régulation de la transcription (Wojda, Salinska et al. 2008)

(Soderling 2000; Sabatini, Oertner et al. 2002). Une diminution de la capacité de tamponnage

du Ca2+ est démontrée dans le SNC de façon proportionnelle à l’âge, et les mitochondries y

sont bien sûr impliquées (Buchholz, Behringer et al. 2007). De plus, une dérégulation de

l’homéostasie calcique potentialise l’excitotoxicité, un phénomène intimement lié à la

neurodégénérescence (Wojda, Salinska et al. 2008) (Celsi, Pizzo et al. 2009).

Enfin, des anomalies dans la structure mitochondriale sont également détectées dans

136

137

le cerveau des patients atteints de la MA (Walsh and Selkoe 2007). De plus, lorsque des

neurones sont exposés à un milieu conditionné par des cellules exprimant de manière stable

des formes d'APP ayant des mutations sur les sites de clivage des sécrétases générant la forme

hautement amyloïdogène (Aβ42), on observe une augmentation de la fission mitochondriale,

une perte du nombre d’épines dendritiques et finalement la mort cellulaire (Janus, Pearson et

al. 2000). Cette augmentation de la fission mitochondriale a été attribuée à la présence de

niveaux élevés en DRP1 S-nitrosylé (SNO-DRP1), qui possède une activité de fission augmentée

en raison d’une amélioration de sa capacité de dimérisation. De plus, des niveaux accrus de

SNO DRP1 ont été trouvés dans des échantillons de cerveau de patients atteints de MA et dans

des modèles de souris MA. Ces données suggèrent que les effets cytotoxiques de l’Aβ

résultent, en partie, de la production d'oxyde nitrique conduisant à l'activation de DRP1 (Cho,

Nakamura et al. 2009). En revanche, une autre étude a révélé que des fibroblastes de patients

atteints d’une MA sporadique expriment des niveaux inférieurs de DRP1 et affichent des

mitochondries allongées formant des réseaux collapsés et périnucléaires (Wang, Su et al.

2008) (Wang, Su et al. 2009). La même équipe a cependant montré que la surexpression de

l’APP dans des neuroblastomes entraînait un réseau mitochondrial très fragmenté, une

diminution d’OPA1 mais également de DRP1 et un défaut dans la différenciation neuronale.

L’ensemble de ces données indique qu’il existe très certainement une perturbation de la

dynamique mitochondriale dans les neurones des patients MA.

b. La maladie de Parkinson

Une perte progressive des neurones dopaminergiques dans la substance noire conduit

à la maladie de Parkinson (MP). La MP est la deuxième maladie neurodégénérative la plus

fréquente, elle touche environ 2% de la population âgée de plus de 60 ans et 4% de celle âgée

de plus de 80 ans (Giasson and Lee 2000). De plus, 90-95% des cas de MP sont idiopathiques

(maladie se déclenchant indépendamment de tout autre état pathologique et dont la cause

est inconnue). La signature anatomo-pathologique de la maladie est l’accumulation de dépôts

de protéines fibreuses dans le cytoplasme des neurones (corps de Lewy, inclusions

intraneuronales enrichies en -synucléine) et de fibres nerveuses (neurites de Lewy) dans le

138

139

cerveau. On note aussi la perte sélective des neurones dopaminergiques (neurones DA) de la

substance noire (projetant dans le striatum) et de l’aire tegmentale ventrale. La DA libérée

dans le striatum influence les mouvements volontaires. La dégénérescence des neurones DA

entraîne donc les principaux symptômes de la MP : un tremblement au repos, une rigidité

musculaire, une bradykinésie, un déséquilibre postural et un pas instable caractéristique.

L’utilisation des pesticides ou herbicides, le monoxyde de carbone, l’exposition à des

solvants organiques ou au disulfide de carbone, les infections virales et bactériennes etc… sont

tous considérés comme étant des facteurs favorisant la MP (Schapira and Jenner 2011).

De nombreuses études chimiques et génétiques mettent en évidence l’implication

des mitochondries. Des drogues, telles que le MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-

tetrahydropyridine) ou la roténone, qui inhibent le complexe I de l’ETC, produisent à des

symptômes équivalents à ceux de la MP, chez l’homme ou chez des modèles animaux.

Cependant environ 10% des cas sont génétiques, et de nombreux gènes impliqués ont été

identifiés. Trois gènes ont été associés à une transmission autosomique dominante de la

maladie de Parkinson : SNCA (-synucléine), LRRK2 (Leucine-rich repeat Kinase 2) et VPS35

(Vacuolar Protein Sorting 35). Neuf autres gènes, PARK2 (Parkin 2), DJ-1 (ou PARK7), PINK1

(PTEN-induced putative Kinase 1), ATP13A2 (ATPase type 13A2), HTRA2 (serine peptidase

2/OMI) FBXO7 (F-box domain-containing protein 7), PLA2G6 (Phospholipase A2), SYNJ1

(synaptojanin 1 ou PARK20), DNAJC6 (DNAJ heat shock protein family (Hsp40) member C6),

VPS13C (vacuolar protein sorting 13C) sont associés à une forme MP autosomique récessive

d’apparition précoce (Bonifati 2014). Ces cas de MP génétiques présentent un tableau

clinique très hétérogène. Les mutations dans PARK2, PINK1 et DJ1 entraînent un phénotype

similaire à celui observé pour les cas de MP idiopathiques. Les autres formes autosomiques

récessives conduisent à une maladie plus sévère, une mauvaise réponse au traitement

actuel et des signes cliniques additionnels tels que la dystonie et des défauts cognitifs.

140

Figure 31 : Rôle dans les dysfonctionnements mitochondriaux des principaux gènes associés

à la MP.

De nombreux gènes associés à la MP, Parkin, PINK1 etc impliquent un rôle de la mitochondrie.

La sérine protéase HTRA2-OMI est synthétisée en un précurseur inactif contenant un signal

MTS. En réponse à l’activation, après un stress, de la voie de signalisation kinase MEKK3-p38,

HTRA2/OMI est phosphorylée par p38 de façon dépendante de PINK1 et est importée dans

l’IMS. Elle va se lier à la protéine Hax-1 (famille de Bcl-2) ce qui va entraîner sa protéolyse par

la protéase PARL. HTRA2/OMI est certainement impliquée dans la dégradation de protéines

mal conformées de l’IMS et elle prévient l’oligomérisation de la forme activée de BAX de

l’OMM, empêchant ainsi l’apoptose. En cas de stress oxydatif, PINK1 interagit avec la

chaperonne mitochondriale TRAP1. Une fois phosphorylée, TRAP1 inhibe le relargage du

Cytochrome c et permet la conformation correcte et le bon assemblage des protéines

mitochondriales. DJ1 est une chaperonne cytosolique qui va migrer à la mitochondrie en cas

d’oxydation de certain résidus cystéine. Dans le cytoplasme, DJ-1 empêche l’agrégation et la

toxicité de l’-synucléine (-syn). Dans les mitochondries, il a été suggéré qu’elle protège le

complexe I de l’ETC d’un stress oxydatif. Grâce à PINK1, la Parkine est recrutée à l’OMM des

mitochondries défectueuses et permet leur autophagie. D’après (de Castro, Martins et al.

2010).

141

Toutes ces protéines sont impliquées de façon directe ou indirecte dans le contrôle

qualité ou le fonctionnement mitochondrial (Figure 31). PINK1, une kinase régulée par un

signal N-ter MTS canonique, et Parkin coopèrent pour le contrôle qualité des mitochondries

(la mitophagie voir introduction I.4.c.) (Pickrell and Youle 2015). PINK1 est constitutivement

réprimée dans les mitochondries saines par l’intermédiaire de son import dans l’IMM et sa

dégradation par la protéase rhomboïde PARL. En présence de signaux forçant le découplage

des mitochondries, l’import des protéines dans l’IMM est arrêté et PINK1 s’accumule à l’OMM.

PINK1 va ainsi marquer les mitochondries défectueuses et, grâce à son activité kinase, va

recruter la protéine Parkin cytosolique à l’OMM. Ainsi Parkin va ubiquitinyler les protéines de

l’OMM et entraîner l’élimination des mitochondries endommagées par mitophagie (Narendra,

Tanaka et al. 2008). Ce processus implique également très certainement FBX07 (Burchell,

Nelson et al. 2013). Il a également été démontré que Parkin, PINK1 et DJ-1 forment un

complexe ubiquitine ligase E3 fonctionnel qui promeut l’ubiquitylation et la dégradation des

protéines mal conformées (Xiong, Wang et al. 2009). PINK1 et Parkin jouent également un rôle

dans la voie de signalisation du trafic vésiculaire qui adresse les composants mitochondriaux

endommagés aux lysosomes (McLelland, Soubannier et al. 2014). Enfin HTRA2/omi, une

serine protéase mitochondriale, et PINK1 appartiennent à une même voie mitochondriale de

détection au stress (Plun-Favreau, Klupsch et al. 2007).

L’-synucléine et LRRK2 (serine/thréonine Kinase) sont partiellement localisées à la

mitochondrie (Nakamura, Nemani et al. 2008) (Esteves and Cardoso 2016), cette dernière

pouvant avoir un rôle dans l’homéostasie mitochondriale en contrôlant des voies de

signalisation impliquées dans la traduction protéique. Enfin, LRRK2 est associée à des

fonctions cellulaires variées telles que l’autophagie, la dynamique mitochondriale et la

polymérisation microtubulaire (Esteves and Cardoso 2016).

Le stress oxydatif est suggéré comme étant la cause principale de la maladie de

Parkinson, qu’elle soit idiopathique ou génétique. En effet, les patients MP présentent un

niveau élevé de lipides, de protéines et d’ADN oxydés associé à un niveau réduit de glutathion

(Nakabeppu, Tsuchimoto et al. 2007) (Zeevalk, Razmpour et al. 2008). En raison de la présence

142

143

d’enzymes génératrices de ROS telles que l’oxydase tyrosine monoamine et l’hydroxylase, les

neurones DA sont particulièrement exposés au stress oxydatif. Les neurones DA de la voie

nigro-striée contiennent également du fer qui catalyse la réaction de Fenton où des radicaux

superoxydes et le peroxyde d’hydrogène sont formés et peuvent contribuer à accroître le

stress oxydant (Halliwell 1992). Comme la production de ROS entraîne la peroxydation des

lipides tels que la cardiolipine et déclenche le relargage du Cyt c, initiant ainsi l’apoptose, et

que les neurones DA génèrent plus de ROS que les autres, ils ont plus sensibles à une

augmentation de stress oxydatif, jusqu’à la dégénérescence. Cette théorie est confortée par

le fait qu’une exposition chronique à la roténone chez l’homme ou une injection de MPTP chez

l’animal entraîne préférentiellement la cytotoxicité des neurones DA (Betarbet, Sherer et al.

2002). Des déficiences de la chaîne respiratoire des neurones DA sont plus marquées chez les

patients MP que chez les individus contrôle du même âge (Bender, Krishnan et al. 2006). Des

cellules de patients comportant des mutations dans le gène parkin présentent une diminution

de l’activité du complexe I (Muftuoglu, Elibol et al. 2004).

Des mutations dans le gène PINK1 induisent notamment des dysfonctionnements

mitochondriaux incluant une formation excessive de ROS (Gandhi, Wood-Kaczmar et al. 2009).

L’-synucléine, possède un rôle central dans la pathogénèse de la MP sporadique ainsi

que dans les formes familiales. Elle s’accumule à des niveaux élevés dans les corps de Lewy et

dans les neurites dystrophiques. En outre, des mutations ponctuelles ou une triplication du

gène de l’-synucléine ont été reliées à des formes héréditaires dominantes de MP suggérant

que cette maladie peut à la fois résulter d’une augmentation pathologique de la fonction

normale de cette protéine où d’un gain d’une fonction anormale et toxique (Zarranz, Alegre

et al. 2004) (Singleton, Farrer et al. 2003). L’-synucléine présente une grande variété

d’assemblages allant des oligomères préfibrillaires à des fibrilles matures. Cependant, le

mécanisme par lequel l’-synucléine conduit à la dégénérescence neuronale reste inconnu.

Les oligomères préfibrillaires solubles ont une moindre efficacité sur la perturbation de

l’intégrité membranaire et la cytotoxicité que les fibrilles matures (Pieri, Madiona et al. 2016).

En outre, des études sur la surexpression de l’-synucléine sauvage ou de ses forme mutantes

144

145

familiales dans des modèles de culture cellulaire ou de souris transgéniques ont rapportés des

changements cellulaires y compris des anomalies mitochondriales comme une activité réduite

du complexe respiratoire IV et une fragmentation de l’ANDmt (Martin, Pan et al. 2006). Cette

protéine, bien que principalement cytosolique, semble interagir avec les membranes

mitochondriales et inhiber également le complexe I de l’ECT (Devi, Raghavendran et al. 2008).

Quant à elle, la chaperonne DJ-1 joue un rôle dans la redistribution des mitochondries

et prévient l’agrégation et la toxicité de l’-synucléine en cas de stress oxydant (Junn, Jang et

al. 2009). Elle est enrichie au niveau des mitochondries, c’est une protéine sensible au

potentiel redox et une peroxydase atypique ("peroxidoxin-like") qui piège l’H2O2. Des souris

KO pour cette protéine accumulent plus de ROS et présentent des mitochondries fragmentées

(Irrcher, Aleyasin et al. 2010).

c. La maladie de Huntington

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative héréditaire fatale

se traduisant par une chorée, des mouvements involontaires et des troubles cognitifs. Ces

symptômes résultent de la perte sélective de neurones épineux GABAergiques de taille

moyenne dans le striatum, qui contrôlent différents circuits impliqués dans le mouvement, la

mémoire et les émotions. La MH est d'évolution lente et progressive, à partir de 40 à 50 ans,

et les patients survivent pendant environ 15-20 ans à partir de l'apparition de la maladie

(Reddy, Mao et al. 2009). Plus rarement, elle se manifeste sous une forme précoce avec

l’apparition de premiers symptômes entre 15 et 25 ans. Alors que plusieurs gènes ont été

associés à la MP et la MA, la MH est une maladie autosomique dominante causée par

l'expansion d’une répétition trinucléotidique [cytosine, adénine et guanine (CAG)] dans un

seul gène, codant la Huntingtine (Htt). Htt est une très grande protéine de 350 kDa qui est

exprimée de manière ubiquitaire dans le cerveau et les tissus périphériques. Elle agit en tant

que protéine d'échafaudage qui régule des voies de signalisation et le trafic vésiculaire et des

organites. Bien que la plupart du temps Htt soit cytoplasmique, elle est également détectée

146

147

à des concentrations plus faibles dans plusieurs compartiments subcellulaires tels que la

membrane plasmique, le noyau, le réticulum endoplasmique, le Golgi et les mitochondries. Si

la présence d’une répétition polyglutamine de moins de 35 fois dans la région N ter de Htt est

normale et ne provoque pas de maladie, un étirement anormal de 36-39 résidus glutamine

résulte en une pénétrance incomplète de la maladie, et 40 résidus ou plus entraîne une

pénétrance complète de la MH (Bossy-Wetzel, Petrilli et al. 2008) .

Chez les patients huntingtoniens et des souris transgéniques modèles, plusieurs

éléments prouvent que l'expression du mutant Htt (mtHtt) est associée à des

dysfonctionnements mitochondriaux (Bossy-Wetzel, Petrilli et al. 2008). En effet, des

échantillons de cerveau post-mortem de patients MH présentent une activité réduite des

complexes respiratoires mitochondriaux II, III et IV (Gu, Gash et al. 1996) et l’on détecte chez

les personnes exposées à l'acide 3-nitropropionique (3-NP), un inhibiteur sélectif du complexe

II, un dysfonctionnement moteur similaire à celui observé chez les patients MH (Rubinsztein

2002). En outre, plusieurs effets néfastes de la mtHtt mutante sur les mitochondries ont été

signalés, notamment :

une réduction du taux d'ATP dans les terminaisons synaptiques, (Orr, Li et al. 2008),

une dépolarisation mitochondriale à des concentrations calciques pourtant faibles

(Panov, Gutekunst et al. 2002),

une sensibilité accrue à la surcharge en Ca2+ et en N-méthyl-D-aspartique (NMDA)

conduisant à l'apoptose neuronale (Fernandes, Baimbridge et al. 2007),

un seuil réduit pour l’ouverture du mPTP et la libération du cytochrome c (Choo,

Johnson et al. 2004).

Aux côtés des déficits bioénergétiques, la mtHtt peut également affecter négativement

les mitochondries en modifiant la transcription des gènes. Ainsi, mtHtt se lie au suppresseur

de tumeur p53 et augmente son expression, ce qui conduit alors à une activation de la trans-

cription de ses cibles mitochondriales : les pro-apoptotiques Bax et Puma. Depuis que l’on sait

que la perte de p53 prévient la neurodégénérescence médiée par mtHtt chez la drosophile

148

Figure 32 : Rôle de la protéine Htt dans le transport et la dynamique mitochondriale

Le mouvement des mitochondries dans les neurones est bi-directionnel et complexe. La

protéine Htt sauvage participe à la régulation des transports antérograde et rétrograde des

mitochondries en interagissant avec plusieurs médiateurs. Htt stimule le trafic mitochondrial

en se liant à HAP1, qui, à son tour, permet une interaction avec les protéines motrices dynéine-

dynactine et kinésine. La phosphorylation de Htt agit comme un interrupteur moléculaire en

faveur du transport mitochondrial antérograde par rapport au transport rétrograde : lorsque

Htt est phosphorylée, la kinésine-1 est recruté et favorise le transport antérograde;

inversement, lorsque Htt est déphosphorylée, la kinésine-1 se détache du complexe qui

permute vers un transport rétrograde. En plus de la migration, les mitochondries subissent

des cycles de fusion et de fission continuels. Étant donné que Htt interagit avec la dynamine,

on peut spéculer que Htt pourrait réguler la fission en interagissant avec DRP1. D’après (de

Castro, Martins et al. 2010).

149

(Bae, Xu et al. 2005), nous pouvons facilement supposer qu’une modification de l'activité

transcriptionnelle de p53 déclenche une dysfonction mitochondriale et ainsi la perte

neuronale. Les mitochondries sont d’autant plus impliquées que PPARGC1A [PGC-1,

récepteur proliferatoractivated peroxysomes (PPAR) -g coactivateur 1] est un autre gène

dont l'expression semble être régulée par mtHtt. En interagissant avec le promoteur et en

interférant avec l'expression du gène PPARGC1A dépendante de CREB, mtHtt réprime la

transcription de ce dernier (Cui, Jeong et al. 2006). En effet, PGC-1 est un co-activateur

nucléaire qui joue un rôle majeur dans la biogenèse mitochondriale ; par conséquent, son

inhibition limite la capacité des neurones vulnérables à répondre de façon adéquate aux

besoins énergétiques.

Parmi les nombreux défauts mitochondriaux observés dans la MH, des études récentes

ont indiqué que le trafic mitochondrial était également affaibli le long des axones et dendrites,

ce qui pourrait jouer un rôle important dans cette pathologie. La protéine Htt sauvage semble

de plus réguler le trafic des vésicules d'endocytose en se liant à la protéine HAP1 (Htt-

associated protein 1) (voir (Li, Orr et al. 2010) pour revue) (Figure 32). Ce complexe protéique

peut agir comme une plate-forme d'arrimage qui interagit avec les moteurs moléculaires

dynéine, dynactine et kinésine. Il régule le transport des mitochondries et des vésicules

contenant une neurotrophine, le brain-derived neurotrophic factor (BDNF), le long des

microtubules (McGuire, Rong et al. 2006) (Gauthier, Charrin et al. 2004). De plus, la

phosphorylation de la Htt semble agir comme un commutateur moléculaire pour le transport

bidirectionnel dans les neurones. L’interaction anormale de mtHtt avec des protéines motrices

semble être la principale cause des défauts de transport en perturbant la formation de

complexes du trafic et entrave le transport vésiculaire (Gauthier, Charrin et al. 2004).

Cependant, les agrégats de mtHtt pourraient également en agir comme un barrage physique

(Chan 2006) ou en séquestrant les composants de la machinerie de transport microtubulaire

(Orr, Li et al. 2008) , (Trushina, Dyer et al. 2004). De plus, le transport mitochondrial est

particulièrement sensible au trafic intracellulaire des autres organites et un transport

mitochondrial défectueux affecte la transmission neuronale, provoque des dommages

synaptiques, qui in fine, entraînent une perte neuronale sélective. De fait, non seulement

mtHtt bloque le mouvement mitochondrial, mais induit un déséquilibre dans la fission et la

150

151

fusion mitochondriales (Figure 32) au profit de la fragmentation qui participe de la cytotoxcité

induite par mtHtt (Wang, Lim et al. 2009). Étant donné que mtHtt interagit avec les dynamines

1 et 2 (Kaltenbach, Romero et al. 2007) et que son modèle de distribution dans les

mitochondries présente des similitudes frappantes avec DRP1 (Panov, Gutekunst et al. 2002),

il est possible que cette dernière puisse aussi former un complexe avec Htt. Ainsi, on peut

émettre l'hypothèse que l’Htt sauvage régulerait les événements de fission en interagissant

avec DRP1, alors que mtHtt modifierait l'assemblage et la fonction de ces complexes,

conduisant finalement à des déséquilibres de la dynamique mitochondriale.

Comme décrit précédemment, la fragmentation mitochondriale est une réaction au

stress classique qui favorise la séparation et l'élimination des mitochondries dysfonctionnelles

par autophagie. Fait intéressant, l'autophagie est une voie de dégradation majeure pour

mtHtt, et l'induction pharmacologique de l'autophagie semble avoir une efficacité

thérapeutique pour les maladies neurodégénératives causées par des protéines agrégées,

telles que dans la MH (Rubinsztein 2002) (Sarkar and Rubinsztein 2008).

d. L’Atrophie Optique Autosomique Dominante et la maladie de

Charcot-Marie-Tooth de Type 2

Des mutations dans la protéine mitochondriale OPA1 sont la principale cause de

l’Atrophie Optique autosomique Dominante (AOD), qui se traduit par une dégénérescence des

cellules ganglionnaires de la rétine conduisant à une atrophie du nerf optique (Delettre,

Lenaers et al. 2000) (Alexander, Votruba et al. 2000). L’AOD est la forme d'atrophie optique

héréditaire parmi les plus fréquentes, avec une prévalence estimée à environ 1/10 000-1/50

000 individus. Bien que la dégénérescence du nerf optique reste la caractéristique

déterminante de l’AOD, jusqu'à 20% des patients présentant des mutations OPA1 peuvent

également développer des complications neurologiques extra-oculaires supplémentaires

(« AOD+ » syndrome), comprenant la surdité, l'ataxie, la myopathie, la neuropathie

périphérique et l’ophtalmoplégie externe progressive (Yu-Wai-Man, Griffiths et al. 2010).

L'AOD a une pénétrance incomplète et une expressivité intra et interfamiliale variables, elle

152

153

est habituellement diagnostiquée dans l'enfance, mais des formes congénitales et tardives

(après 60 ans) sont aussi décrites. À ce jour, plus de 200 mutations d'OPA1, le plus souvent

spécifiques à certaines familles, ont été identifiées. Huit loci ont été associés à l’AOD,

impliquant au moins trois protéines membranaires mitochondriales, OPA1, OPA3 et OPA7

(Lenaers, Hamel et al. 2012). Des mutations dans la protéine OPA1 de l’IMM sont responsables

de la maladie chez la majorité des patients AOD (75%), tandis que des mutations dans la

protéine de l’OMM OPA3 sont observées chez une population mineure (1%). Comme indiqué

précédemment, OPA1 médie la fusion des membranes mitochondriales et est également

impliquée dans le maintien de la structure des crêtes de l’IMM, qui permet la formation des

super complexes de l’ETC et qui prévient la libération du cytochrome c dans le cytoplasme au

cours de l'apoptose. La plupart des mutations pathologiques de OPA1 provoquent une haplo

insuffisance. En accord avec cette hypothèse, les souris KO OPA1 hétérozygotes montrent une

dégénérescence du nerf optique qui progresse avec l'âge (Williams, Morgan et al. 2011). Les

mécanismes par lesquels l'inactivation des fonctions de OPA1 contribue à la pathogénèse AOD

restent à être élucidés.

Les données sur des lignées cellulaires non neuronales, telles que des cellules HeLa,

des fibroblastes embryonnaires de souris et des fibroblastes de la peau des patients atteints

d’AOD, suggèrent que l'altération de la morphologie des mitochondries, des fonctions

mitochondriales et/ou une sensibilité accrue à l'apoptose, pourrait être impliquées (Landes,

Leroy et al. 2010). De plus, la diminution de l’expression d’OPA1 dans des neurones corticaux

de rat en culture primaire entraîne, outre la fragmentation attendue des mitochondries, par

ailleurs moins abondantes au niveau des dendrites, une diminution de l’expression des

complexes de l’ETC, une chute du m et de la quantité de ROS (Bertholet, Millet et al. 2013).

La fonction d’OPA3, impliquée dans 1% des cas d’AOD, est encore mal comprise, mais

il semblerait qu’OPA3 contrôle la fission mitochondriale de façon indépendante de DRP1 (Ryu,

Jeong et al. 2010). La fonction d’OPA7 quant à elle est actuellement inconnue.

Des mutations d’autres acteurs de la dynamique mitochondriale peuvent entraîner

154

155

d’autres types de maladies neurodégénératives, c’est le cas de la maladie de Charcot-Marie-

Tooth de type 2 (CMT2). Ce trouble hétérogène, qui est caractérisé par une faiblesse

musculaire distale et une perte sensorielle, présente une étiologie génétique multiple,

comprenant des mutations dans MFN2 (Reilly, Murphy et al. 2011), une protéine de l’OMM

importante pour la fusion. Certains patients CMT2 porteurs de mutations de MFN2 souffrent

également d'atrophie optique, de surdité, de dysfonctionnement cognitif, d’anomalies

cérébrales et cérébelleuses, de parésie des cordes vocales, de scoliose et de parkinsonisme

(Verhoeven, Claeys et al. 2006) (Chung, Kim et al. 2006) (Banchs, Casasnovas et al. 2008)

(Brockmann, Dreha-Kulaczewski et al. 2008). Bien que les mécanismes par lesquels la perte

de fonction MFN2 conduit à la CMT2 ne soient pas clairement définis, cette dernière

provoque une diminution de la quantité d'ADNmt et une augmentation du taux de

mutations et délétions dans celui-ci, ce qui aboutit finalement à des défauts de la respiration

aérobie chez la souris (Chen, Vermulst et al. 2010). De plus, le déficit en MFN2 peut

également se manifester au niveau du transport axonal de ces dernières (Misko, Jiang et al.

2010). Cela pourrait entraîner l'accumulation de mitochondries endommagées et/ou une

localisation inappropriée de ces organites, produisant un déficit énergétique localisé. En

effet, chez la souris, MFN2 joue un rôle crucial dans le mouvement des mitochondries et une

altération de la distribution mitochondriale est observée dans les neurones KO pour MFN2.

Une question fréquemment posée est de comprendre comment des mutations dans deux

protéines nécessaires pour la fusion mitochondriale peuvent entraîner deux maladies avec

une spécificité tissulaire aussi différente. Les réponses possibles prennent en compte les

motifs différentiels d'expression de MFN2 et OPA1, les différences fonctionnelles entre ces

deux protéines (Frezza, Cipolat et al. 2006) (de Brito and Scorrano 2008), la différence entre

des défauts de fusion de la membrane externe ou interne et enfin la redondance

fonctionnelle entre MFN1 et MFN2 (Chen, Detmer et al. 2003) (Chen, Chomyn et al. 2005).

En résumé, les mutations dans les protéines OPA1 ou MFN2 peuvent avoir un impact sur un

large éventail de tissus, bien au-delà du nerf optique et des nerfs périphériques. Néanmoins,

les symptômes qui se chevauchent dans les familles AOD et CMT2 suggèrent que des

mutations dans OPA1 et MFN2 peuvent affecter certains tissus d'une manière similaire.

Des mutations dans la protéine GDAP1 (ganglioside-induced differentiation-

156

157

associated protein 1) peuvent également causer des variantes sévères de la maladie de

Charcot-Marie-Tooth (Palau 2009). GDAP1 est une protéine de l’OMM qui a été impliquée

dans la fission mitochondriale, bien que le rôle exact de cette protéine dans la division de ces

organites soit moins bien compris que celui de DRP1 (Niemann, Wagner et al. 2009) (Estela,

Pla-Martin et al. 2011). Des études récentes ont rapporté deux cas dans lesquels les patients

CMT portent des mutations dans les deux protéines MFN2 et GDAP1 (Vital, Latour et al. 2012).

Parce que MFN2 est une protéine de fusion et GDAP1 une protéine de fission, il est surprenant

de constater que, dans ces deux cas, les symptômes soient plus sévères que ceux des patients

avec des mutations dans une seule des deux protéines. Dans un de ces deux cas, la

morphologie des mitochondries est normale, mais la combinaison du découplage de la

respiration, résultant de la mutation dans MFN2 et des défauts du complexe I dus à la

mutation dans GDAP1, conduit à des déficiences respiratoires additives (Cassereau,

Casasnovas et al. 2011). La morphologie mitochondriale normale apparente chez ces patients

est compatible avec une restauration de la morphologie de type sauvage observée dans les

cellules de levure mutantes manquant à la fois de la capacité de fission et de fusion. Cela

souligne la nécessité d'un équilibre entre ces activités opposées, qui régulent de façon

antagoniste la morphologie mitochondriale (Sesaki and Jensen 1999). Cependant, les défauts

de respiration observés chez ces patients démontrent clairement l'importance de la division

et de la fusion mitochondriale au-delà de la seule régulation de la forme de ces organites.

Dans un autre cas pour lequel les deux protéines MFN2 et GDAP1 étaient mutées, une

élongation mitochondriale a été observée dans les axones, ce qui suggère que la fusion se

produit à des taux relativement plus élevés que la fission (Vital, Latour et al. 2012)

2. La mitochondrie comme cible thérapeutique

a. Les antioxydants

Comme nous venons de le voir, il existe une grande variété de maladies neuro-

dégénératives qui présentent des symptômes et des pathologies distinctes. La grande

158

Figure 33 : Structures chimiques de différents antioxydants nutraceutiques.

159

majorité des cas sont sporadiques et, par conséquent, le défi consiste à découvrir les causes

sous-jacentes de la neurodégénérescence dans le but de prévenir ou de ralentir ces troubles.

Le stress oxydatif est reconnu comme un facteur commun dans de nombreuses maladies

neurodégénératives et dans les processus dégénératifs liés à l'âge dans leur ensemble. En

effet, de nombreuses études ont fourni des preuves convaincantes reliant le stress oxydatif

neuronale à la maladie de Parkinson (Navarro and Boveris 2009), la maladie d'Alzheimer (MA)

(Nunomura, Perry et al. 2001), la sclérose latérale amyotrophique (SLA) (Mitsumoto, Santella

et al. 2008) et la sclérose en plaques (MS) (Ghabaee, Jabedari et al. 2010). C’est donc

logiquement que les antioxydants naturels ont rapidement attiré l'attention en tant que

candidats pour des essais cliniques dans la neurodégénérescence.

Certains nutraceutiques sont bien connus, comme l’épigallocatéchine 3-gallate (EGCG)

du thé vert et le resvératrol du raisin, tandis que d'autres sont inconnus de la majorité des

consommateurs. Les structures chimiques des composés naturels étudiés sont présentées sur

la Figure 33. Bien que ces composés soient structurellement différents, chacun d'entre eux

possède des propriétés neuroprotectrices et anti-oxydantes.

Il est établi que l'EGCG protège des neurones granulaires du cervelet de rat en culture

contre le stress oxydatif induit par un inhibiteur de Bcl-2, le HA14-1 (Schroeder, Kelsey et al.

2009). D'autres études ont montré des résultats similaires, où l’EGCG atténue

considérablement le stress oxydatif et la mort neuronale induite par le peroxyde d'hydrogène

dans des neurones moteurs (Koh, Kwon et al. 2004), des cellules N18D3 hybrides entre des

neuroblastomes de souris et des neurones ganglionnaires des racines dorsales (Koh, Kim et al.

2004), des neurones du ganglion spiral (Xie, Liu et al. 2009) et des neurones ganglionnaires de

la rétine (Zhang, Safa et al. 2007). L’EGCG protège aussi les cellules de neuroblastome humain

SH-SY5Y de la toxicité de l’APP, de la 3-hydroxykynurénine ou de la 6-hydroxydopamine (6-

OHDA) (Levites, Amit et al. 2002) (Jeong, Kim et al. 2004) (Avramovich-Tirosh, Reznichenko et

al. 2007). De plus, l'EGCG réduit considérablement la toxicité induite par le peptide béta-

amyloïde dans des neurones d'hippocampe, en inhibant l’oligomérisation et la formation de

fibrilles Aß (Choi, Jung et al. 2001) (Bastianetto, Yao et al. 2006). Enfin, l'EGCG protège des

160

161

neurones dopaminergiques primaires de la toxine mitochondriale MPP+ (1-methyl-4-

phenylpyridinium) (Stull, Polan et al. 2002). Ainsi, l'EGCG exerce in vitro des effets

neuroprotecteurs significatifs contre une large gamme de dommages oxydants et dans

différentes cellules neuronales. Cet antioxydant nutraceutique préserve également la survie

et la fonction neuronale dans plusieurs modèles in vivo de neurodégénérescence. Par

exemple, l'administration orale d'EGCG protège les souris contre la toxicité dopaminergique

provoquée par la neurotoxine MPTP. Le traitement de l'EGCG empêche la perte des neurones

dopaminergiques de la Substance Noire pars compacta (SNpc ) induite par la MPTP et préserve

les niveaux de dopamine du striatum chez la souris (Levites, Weinreb et al. 2001). D'une

manière similaire, l'EGCG a un effet protecteur dans un modèle de souris de la SLA familiale.

L’administration par voie orale de l'EGCG à des souris transgéniques exprimant un mutant

G93A humain du gène SOD1 (Cu, Zn-superoxyde dismutase) retarde significativement

l'apparition des symptômes et prolonge modérément leur durée de vie (Koh, Lee et al. 2006)

(Xu, Chen et al. 2006).

Le resvératrol est un antioxydant polyphénolique retrouvé dans de nombreux types de

raisins et est surtout connu pour ses bienfaits cardiovasculaires (Sadruddin and Arora 2009).

Cependant, le resvératrol montre également une activité neuroprotectrice significative in vitro

et in vivo. Dans divers modèles de culture, le resvératrol protège des cultures organotypiques

d'hippocampe de la privation en oxygène-glucose (Zamin, Dillenburg-Pilla et al. 2006), des

neurones primaires mésencéphaliques de rat du tert-butyle hydroperoxyde (Karlsson, Emgard

et al. 2000), et des neurones granulaires du cervelet de la toxicité induite par le MPP+ (Alvira,

Yeste-Velasco et al. 2007) ou une carence en KCl (Magnifico et al. , 2013). In vivo, le resvératrol

atténue significativement la neurodégénérescence hippocampique et les difficultés

d'apprentissage dans un modèle de la MA et de tauopathie chez des souris transgénique (Kim,

Nguyen et al. 2007). En outre, le resvératrol réduit également les dégâts oxydatifs et préserve

la dopamine striatale dans un modèle de MP chez le rat (6-OHDA) (Khan, Ahmad et al. 2010).

Il existe bien entendu d’autres antioxydants présentant des vertus neuroprotectrices

tels que la curcumine, les acides rosmarinique, carnosique, etc… [voir revue

162

Figure 34 : Mécanismes d’action de différents agents neuroprotecteurs dans les essais

cliniques de la MP.

La rasagiline présente des propriétés neuroprotectrices en diminuant l'apoptose

mitochondriale en agissant sur le pore de perméabilité mitochondriale transitoire (MPT), de

la caspase-3 et de PARP-1 (nuclear poly [ADP-ribose] polymerase 1), la translocation de la

glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH), et la fragmentation de l'ADN

nucléaire. Elle augmente aussi l’expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-XL au

travers de la protéine kinase C (PKC) et diminue l’expression des pro-apoptotiques Bad et Bax.

La minocycline chélate les métaux et inhibe la réponse inflammatoire. La créatine inhibe

l’activation du MPT et réprime l’accumulation du Fer (Fe2+). D’après (Seidl and Potashkin

2011).

163

(Kelsey, Wilkins et al. 2010)]. Etant donné l'énorme potentiel des antioxydants nutraceutiques

en tant que nouveaux agents thérapeutiques de la neurodégénérescence, il existe plusieurs

essais cliniques avec ces composés. L’EGCG a été testé en phase II pour la MP (Hôpital Xuanwu,

Beijing, Chine) et pour le stade précoce de la MA (Université Charite, Berlin, Allemagne). De

même, le resvératrol est testé dans un essai de phase II pour améliorer les performances de

la mémoire chez les personnes âgées (McKnight Brain Institute, University of Florida,

www.clinicaltrials.gov/). Enfin, l'innocuité et la tolérance de la curcumine sont à l'étude chez

des patients atteints de MA en phase II (Ringman, Frautschy et al. 2005). Malheureusement à

l’heure actuelle aucun de ces traitements n’a obtenu de résultats probants.

b. La créatine

La créatine est un composé guanidine azoté d'origine naturelle impliqué dans

l'approvisionnement en énergie des cellules musculaires et nerveuses. Après son absorption

par le cerveau et le muscle squelettique, la créatine se transforme en phosphocréatine PCr

par les créatines kinases cytosolique et mitochondriale. La PCr sert au tamponnage de l'ATP

dans les tissus à forts besoins énergétiques tels que le muscle squelettique et le cerveau. La

supplémentation en créatine réduit la dysfonction mitochondriale et exerce des effets

neuroprotecteurs dans de nombreux modèles de maladies neurodégénératives, y compris la

MP et la MH (Adhihetty and Beal 2008) (Beal 2011). La créatine protège contre la déplétion

en glucose, la carence en sérum et contre des toxines mitochondriales telles que le 3-NP (3-

nitropropionate), le MPP+ et la 6-OHDA (Chaturvedi and Beal 2008). Il est montré que la

supplémentation en créatine protège les neurones dopaminergiques de la SNpc et protège de

l'épuisement en dopamine au niveau du striatum dans le modèle MP chez la souris induit par

le MPTP (Matthews, Ferrante et al. 1999). L’administration de la créatine protège également

contre l’excitotoxicité induite par le NMDA, le malonate, l’Aß et l’acide iboténique et réduit la

taille des infarctus ischémiques cérébraux chez les rongeurs (Chaturvedi and Beal 2008). Par

ailleurs, cette molécule exerce des effets neuroprotecteurs synergiques lorsqu'elle est

administrée avec le nicotinamide, un inhibiteur de cyclooxygénase-2 et la minocycline (Figure

164

165

34) (Klivenyi, Gardian et al. 2003). In vivo, la créatine améliore les performances motrices,

réduit l'atrophie et l’agrégation de la mtHtt dans le striatum, réduit les dysfonctionnements

mitochondriaux et améliore la survie de souris transgéniques modèles de la MH (Andreassen,

Dedeoglu et al. 2001) (Dedeoglu, Kubilus et al. 2003). De plus, il a été constaté que la

combinaison de la créatine avec un autre composé bioénergétique, le CoQ10, produit des

effets neuroprotecteurs additifs dans des modèles rongeurs de MP et MH (Yang, Calingasan

et al. 2009).

Plusieurs essais cliniques utilisant la créatine ont été réalisés dans des maladies

neurodégénératives comme la MP et la MH. Un premier essai pilote chez des patients

parkinsoniens de 60 ans sur 2 ans (traités avec une dose de créatine de 20g/jour pendant 6

jours puis 2g/jour pendant 6 mois et enfin 4g/jour) a mis en évidence une amélioration de

l'humeur des patients sans effets secondaires importants d’après échelle d’évaluation unifiée

pour la maladie de Parkinson (Unified Disease Rating Scale de Parkinson, UPDRS) (Bender,

Koch et al. 2006). De plus, La supplémentation en créatine (20 g/jour pendant 5 jours puis

4g/jour pendant 11 semaines) associée à un entraînement physique améliore l’endurance

musculaire et la force du haut du corps chez les patients parkinsoniens (Hass, Collins et al.

2007).

Une étude clinique de phase II randomisée en double aveugle (Neuroprotective

Exploratory Trials) testant la synergie de la créatine (10g/jour) et de la minocycline

(200mg/jour) administrées pendant 12 mois chez des patients parkinsoniens hommes ou

femmes, a montré une réduction des scores UPDRS avec 91% de patients tolérant la créatine

et 77% la minocycline (Investigators 2006).

Compte tenu de ces résultats, un essai clinique de phase III à grande échelle a été initié

par le NINDS NET aux USA (Beal 2011) (Couzin 2007). Cet essai randomisé examine 1720

patients parkinsoniens à un stade précoce, avec 10 g/jours de créatine ou un placebo sur 51

centres médicaux aux États-Unis et au Canada. Ces patients ont été étudiés lors des 7

dernières années, mais les résultats s'avèrent peu concluants à ce jour.

166

167

Afin d'évaluer l'innocuité et la tolérance de la créatine dans la MH, un essai clinique de

phase II a été réalisé sur 64 sujets, à 8 g/jour de créatine pendant 16 semaines (Hersch,

Gevorkian et al. 2006). La dose a été bien tolérée et permet une diminution de la

concentration en 8-hydroxy-2-désoxyguanosine, un marqueur de stress oxydatif dans le

sérum des patients, jusqu’au taux basal. De plus, un essai clinique avec des doses plus élevées

de créatine (30 g/jour) a montré certaines améliorations dont le ralentissement de l'atrophie

corticale observée chez les patients MH.

De plus, la créatine a été administrée à des patients ayant d’autres maladies

neuromusculaires telles que la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA). Dans l’ensemble, la

créatine est bien tolérée et n’induit pas d’effet secondaire. Une dose de 5 à 10 g par jour a été

associée à une augmentation significative de la force musculaire au niveau des extrémités

supérieures, mais n’avait pas amélioré la survie des patients ni ralenti la progression de la

maladie de façon significative.

Dans leur ensemble, ces résultats indiquent clairement que la créatine est un agent

prometteur pour une utilisation thérapeutique dans une variété de maladies

neurodégénératives telles la maladie de Huntington et de Parkinson.

c. Conclusion

Bien que les maladies neurodégénératives se manifestent dans des types de neurones

distincts, le stress oxydatif et la suppression des signaux de survie neuronaux sont communs

à la plupart de ces pathologies et semblent être des cibles très pertinentes pour un traitement

thérapeutique. Dans l'ensemble, les maladies neurodégénératives manquent d'options de

traitements efficaces. Bien que les MA et MP reçoivent ces dernières années une plus grande

attention par le biais de fonds importants pour la recherche, nous ne disposons encore que

de thérapies palliatives et aucune n’arrive à stopper ou du moins ralentir significativement la

pathologie. D'autres, comme la SLA, ont un pronostic encore plus grave, le décès du patient

168

169

survenant généralement 2 à 5 ans après le diagnostic. Le Riluzole, seule drogue à avoir été

approuvée, ne prolonge la vie que de deux à trois mois.

Aux côtés des antioxydants et de la créatine, plusieurs traitements sont à ce jour en

cours d’essai pour ces maladies neurologiques progressives. C’est le cas de la Rasagiline

(Figure 34), de l’ubiquinone (Spindler, Beal et al. 2009) et du régulateur transcriptionnel PGC-

1 impliqué dans la biogénèse mitochondriale et la respiration cellulaire (Chen, Horng et al.

2012). Ces molécules ont toutes en commun de cibler la mitochondrie pour tenter de

compenser les dysfonctionnements observés. Malheureusement, aucune n’a encore montré

une efficacité significative.

170

171

III) Mitochondries & Neuroprotection : rôle de la protéine X du Bor-

navirus

1. Présentation du Bornavirus

Le virus de la maladie de Borna (Borna Disease Virus, BDV) appartenant à la famille des

Bornaviridae et à l’ordre des Mononegavirales est un virus dont le génome est composé d’une

molécule d’ARN de polarité négative non segmentée. Le BDV fut pendant longtemps le seul

membre de sa famille, mais récemment deux nouveaux virus génétiquement apparentés ont

été découverts. Le Bornavirus aviaire (ABV) a été détecté chez les Psittacidés comme l'agent

responsable d'une maladie appelée « dilatation fatale du proventricule » (Staeheli, Rinder et

al. 2010). Un Bornavirus infectant les reptiles (RBV) a été également été identifié par une

étude de séquençage d’ADN de serpent d’Afrique sauvage (Stenglein, Leavitt et al. 2014).

Le BDV est hautement neurotrope et infecte en particulier des structures du système

limbique comme l’hippocampe et le cortex chez une grande variété d’hôtes. En effet, à l’heure

actuelle, l’infection naturelle par le BDV a été mise en évidence chez de nombreux

mammifères, dont le cheval, le mouton, le chat, le chien, l’écureuil et différents types de

rongeurs sauvages. Les conséquences de l’infection sont très hétérogènes et dépendent,

entre autres, de l’espèce infectée, de la souche virale et de l’intensité de la réponse immune.

L’infection par le BDV est le plus souvent asymptomatique et des études épidémiologiques

indiquent qu’il existe une prévalence non négligeable du BDV chez les chevaux « sains »

(Hagiwara, Momiyama et al. 1997). En revanche, la forme la plus étudiée en clinique

vétérinaire, appelée maladie de Borna « classique », est plus aiguë. Chez les animaux adultes

immunocompétents, l’infection provoque des syndromes médiés par la réponse immune de

l’animal incluant un comportement moteur stéréotypé, des dyskinésies, dystonies, ataxies et

paralysies. La paralysie, conséquence assez commune, est suivie, dans 60 à 80%, de la mort

de l’animal dans un délai de 5 semaines. La guérison spontanée est possible mais très souvent

accompagnée de désordres comportementaux présents tout au long de la vie de l’animal

(Kinnunen, Palva et al. 2013). L’homme peut également être infecté : entre 2011 et 2013, trois

172

Figure 35 : Représentation de la particule virale du BDV et son génome

Le brin d’ARN non segmenté de polarité négative du BDV fait environ 8,9 kb et code pour six

protéines : la glycoprotéine G, la protéine de matrice M, la phosphoprotéine P, la nucléopro-

téine N et la polymérase L sont présentes dans la particule virale, alors que la protéine X est

non structurale. L'ARN polymérase ARN dépendante virale (L) lie le génome dans sa région 3’,

puis transcrit successivement chacun des gènes à partir de signaux d'initiation et de terminai-

son de la transcription. Les ARNm sont coiffés et polyadénylés après leur synthèse. Un des

ARNm code pour les protéines M, G et L grâce à un épissage alternatif. Les flèches violettes

représentent les 3 sites d'initiation de la transcription. D’après http://viralzone.expasy.org.

173

éleveurs d'écureuils (Sciurus variegatoides) ont développé une encéphalite avec des signes

cliniques similaires et sont morts 2 à 4 mois après l'apparition des symptômes. Grâce à

l'utilisation d'une approche de métagénomique incorporant du séquençage de nouvelle

génération et de la PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR), la présence d'un virus BDV

jusqu'alors inconnu, le VSBV-1 (variegated squirrel 1 bornavirus) a été détecté dans les

échantillons des cerveaux des trois patients et chez un écureuil d’élevage (Hoffmann, Tappe

et al. 2015). Durant de nombreuses années, l’infection par le BDV chez l’homme fut associée

à l’apparition de troubles neuropsychiatriques (Lipkin, Briese et al. 2011). Cependant ces

résultats restent très controversés. Une étude récente comparant des échantillons d’individus

sains avec des patients présentant des signes psychiatriques (anxiété, trouble bipolaire,

dépression, schizophrénie etc) a conclu à l’absence d’association claire entre des maladies

psychiatriques et le BDV (Hornig, Briese et al. 2012). Il existe tout de même dans le génome

humain des séquences intégrées apparentées au BDV ; il s’agirait d’une souche très ancienne

ayant coexisté avec les mammifères il y a environ 65 millions d’années (Horie, Honda et al.

2010).

Le mode de contamination par le BDV est encore mal compris, mais de nombreux

arguments suggèrent qu'il pourrait se transmettre par voie olfactive, puis qu'il remonterait

par transport axonal rétrograde jusqu’au SNC. Dans les neurones, le BDV se réplique, se

dissémine efficacement et persiste sans effet cytopathique durant toute la vie de l'animal. Les

neurones infectés ne présentent pas d’altération morphologique notable (Gosztonyi and

Ludwig 1995). Cependant, un grand nombre d’études suggèrent que le BDV perturbe la

plasticité synaptique, ce qui pourrait expliquer l’origine des troubles du comportement et de

la cognition observés chez les animaux infectés. En particulier, le BDV affecterait l’excitabilité

des neurones par l’intermédiaire d’une modulation des cascades de signalisation (Charlier,

Wu et al. 2013). Les travaux du laboratoire n’ont pas révélé d’altération notable du

cytosquelette, bien que des modifications aient été mises au jour dans l’expression de

protéines associées à la dynamique des réseaux d’actine et de microtubules, ainsi que dans

des protéines clés de l’organisation des vésicules synaptiques (telles que la synapsine1, la

stathmine et GAP-43) (Suberbielle, Stella et al. 2008). De plus, l’infection provoque un déficit

dans les phénomènes de renforcement et de potentialisation de l’activité neuronale : une

174

Figure 36 : Carte des signaux du trafic nucléocytoplasmique des protéines du BDV et de leurs

sites d’interactions

Les protéines N, X, P et L, impliquées dans la réplication du BDV, sont schématisées sous forme

de rectangle : la protéine N (p40 et p38) est en bleu, la protéine X en noir, la protéine P en

violet et la protéine L en orange. Sur chaque protéine du BDV représentée ci-dessus, les

bandes verticales rouges indiquent la localisation de leurs signaux d'import nucléaire (NLS) et

les bandes verticales vertes la localisation de leurs signaux d'export nucléaire (NES). Les

annotations « S » dans la protéine P indiquent le positionnement de ses sites de

phosphorylation. Les bandes horizontales, au-dessus ou en dessous des protéines du BDV

représentent le positionnement de leurs sites d’interactions avec les autres protéines du BDV

(la couleur de la bande est corrélée à celle du rectangle de la protéine correspondante).

D’après (Honda and Tomonaga 2013).

175

forme de plasticité synaptique impliquée dans les processus d’apprentissage et de

mémorisation (Volmer, Prat et al. 2007). Contrairement à la plupart des virus à ARN, le BDV

se réplique dans le noyau des cellules infectées. Avec un génome de 8,9Kb, le BDV est le virus

le plus compact de l’ordre des Mononegavirales (Figure 35).

Grâce à son ARN polycistronique, un chevauchement de ses transcrits et un épissage

alternatif, le BDV code pour 6 protéines malgré la taille réduite de son génome. Le BDV se

compose de cinq protéines structurales, la nucléoprotéine (N, 40 kDa), la phosphoprotéine (P,

23 kDa), la protéine de matrice (M, 16 kDa), la glycoprotéine (G, 57 kDa) la grande protéine (L,

180 kDa), et il exprime une protéine non structurale, la protéine X (10 kDa). Parmi ces

protéines structurales, la N, la P et la L sont essentielles à la réplication virale et la

transcription. L’ARN génomique du BDV (ARNg) est encapsidé dans le complexe

ribonucléoprotéique (RNP) (figure 35) (Schwemmle 1998) (Rudolph, Kraus et al. 2003), qui est

constitué de la protéine N et du complexe de l'ARN polymérase dépendante de l’ARN viral

(RdRp). Le complexe RdRp se compose des protéines P et L qui permettent la réplication et la

transcription du génome viral.

La N est la composante majeure de la RNP du BDV et elle encapside l’ARNg. Il existe

deux isoformes de la N, p40 et p38, traduits respectivement à partir du premier et du second

codon AUG de son ARNm. Les deux protéines N sont détectées à la fois dans le noyau et dans

le cytoplasme (Pyper and Gartner 1997). Étonnamment, quand p40 est exprimée seule, elle

se localise exclusivement au noyau (Kobayashi, Shoya et al. 1998). Par contre, lorsque p38 est

traduite sans p40, elle est repérée dans le cytosol uniquement (Kobayashi, Kamitani et al.

2001). Cette différence de localisation subcellulaire des protéines p40 et p38 peut s’expliquer

par la présence de signaux NLS (Nuclear Localisation Signal) et NES (Nuclear Export Signal)

(Figure 36). Le NLS de p40 se trouve dans la région N-ter (P3KRRLVDDA11) alors que p38 ne

présente pas de NLS (Kobayashi, Shoya et al. 1998). De plus, P40 possède un NES canonique

riche en leucines ((L128TELEISSIFSHCC141), qui est également présent dans la p38. L’export

nucléaire de la protéine N est réalisé par la principale exportine CRM1 qui reconnaît cette

séquence NES (Kobayashi, Kamitani et al. 2001). Grâce à ses séquences NLS et NES, p40 peut

176

177

effecuer la navette entre le noyau et le cytosol, alors qu’exprimée seule, p38 est localisée

exclusivement au cytosol en raison de l’absence d’un NLS. Quand p40 et p38 sont exprimées

simultanément, l’intéraction entre les deux protéines N, p40 et p38, permet l’import efficace

de p38 dans le noyau.

La P est une protéine multifonctionelle du BDVet une composante essentielle de la

RNP. Elle joue un rôle critique dans l'encapsidation de l'ARNg et en tant que facteur co-

transcriptionnel de la L (Schwemmle 1998). Comme d’autres phosphoprotéines virales, la P

est phosphorylée par diverses kinases cellulaires au niveau de plusieurs résidus sérine

(Schwemmle 1997). Son site de phosphorylation principal est situé sur la sérine S28 (et S26 chez

certaines souches), cible de la protéine kinase Cε (PKC). Il existe également des sites mineurs

de phosphorylation sur les sérines S70 et S86 pour la caséine kinase II (CKII). La phosphorylation

de la protéine P par la PKC permet, d’une part, de détourner cette dernière de ses substrats

naturels et est d’autre part requise pour diminuer l’acétylation de certaines lysines des

histones H2B et H4 lors de l’infection par le BDV (Bonnaud, Szelechowski et al. 2015). Cette

étude a d’ailleurs démontré que le BDV, grâce à cette baisse d’acétylation, pourrait contrôler

sa propre réplication et dissémination afin de persister à long terme au sein de la cellule hôte

(Bonnaud, Szelechowski et al. 2015). Cependant, contrairement à d'autres phosphoprotéines

virales, l'activité de cofacteur de la polymérase assurée par la protéine P est régulée

négativement par la phosphorylation (Schmid, Mayer et al. 2007).

La P est efficacement transportée vers le noyau car elle contient deux NLS à ses

extrémités amino- et carboxy-terminales (P29RPRKIPR36 et P181PRIYPQLPSAPT193,

respectivement) (Kamitani, Ono et al. 2003) (Shoya, Kobayashi et al. 1998) (Schwemmle, Jehle

et al. 1999). La protéine P sert de "plaque tournante" moléculaire pour les protéines du BDV

(Figure 35). Elle interagit avec la N au niveau de sa partie C-terminale (a.a. 197-201)

(Schwemmle 1998). Elle interagit également avec la protéine X au travers des a.a. 72-87, qui

chevauchent la région de liaison à une protéine hôte (aa 77-86), appelée boîte HMGB1 (High

mobility group box 1), et les sites de phosphorylation pour CKII (Schwemmle 1998). Lorsque

les protéines X et P sont exprimées simultanément, la P est principalement localisée dans le

178

αX

αX

αX

Figure 37 : Localisation subcellulaire de la pro-

téine X.

Cellules COS transfectées avec un plasmide expri-

mant la X (détection de la X en vert par immuno-

fluorescence).

Photos représentatives des différents adressages

intracellulaires de cette protéine.

179

cytosol (Kobayashi, Zhang et al. 2003). La phosphorylation de P ne modifie pas sa localisation

subcellulaire. Cependant, des substitutions d'alanines pour des sérines au niveau des sites de

phosphorylation par la CKII affaiblissent l'interaction de P avec X, ce qui entraîne une rétention

nucléaire de la P en présence de la X (Kobayashi, Zhang et al. 2003). P forme des homo-

oligomères à travers une région (a.a. 135-172) qui chevauche celle liant la protéine L (aa 135-

183) et le signal NES dépendant de l’exportine CRM1 riche en méthionine

(M145KTMMETMKLMMEKVDLLYAS165)(Schwemmle 1998) (Yanai, Kobayashi et al. 2006). Cette

oligomérisation de P est essentielle à l’activité ARN polymérase de la protéine L (Schneider,

Blechschmidt et al. 2004). L est une protéine de 190 kDa contenant les motifs caractéristiques

d'une RdRp virale (Briese, Schneemann et al. 1994). La L est phosphorylée par des kinases de

la cellule hôte et interagit avec la P (Walker and Lipkin 2002). Elle est localisée dans le noyau

des cellules infectées par le BDV, mais également quand elle est exprimée seule (Walker,

Jordan et al. 2000). Le NLS de L est situé dans sa partie médiane (R844VVKLRIAP852) (figure 36)

(Walker and Lipkin 2002).

2. Fonctions de la protéine X

a. Adressage intracellulaire

La protéine X est une petite protéine de 10 Kda (87 aa, Figure 38) localisée à la fois

dans le noyau, le cytosol et la mitochondrie (Figure 37). Elle est également détectée dans les

inclusions nucléaires virales présentes dans les cellules infectées (vSPOTs) tout comme les

composants de la ribonucléoparticule. Dans sa région N-ter, la protéine X possède un signal

NLS non conventionnel, au sein duquel se trouve une séquence ressemblant fortement à un

NES riche en leucine (R6LTLLELVRRNGN19) (Figure 36) (Wolff, Unterstab et al. 2002). L’import

nucléaire de cette protéine se fait par l’intermédiaire de sa liaison à l’importine , sa séquence

NLS étant localisée dans ses 20 premiers a.a. (Wolff, Unterstab et al. 2002). Jusqu'à présent, il

était considéré que la protéine X n'était pas soumise à une activité d’export nucléaire, malgré

la présence d'une séquence NES putative (Honda and Tomonaga 2013). Comme nous le

verrons plus loin, mes travaux de thèse ont permis de rejeter cette hypothèse et d'identifier

le signal NES avec précision.

180

Figure 38 : Séquence et structure de la protéine X.

(A) Séquence en acides aminés de la protéine X. (B) Structure modélisée de la protéine X en

utilisant le logiciel d’analyse PSIPRED (protein sequence analysis workbench). En rose est re-

présentée l'hélice prédite dans la partie amino-terminale de la X. D’après (Fujino, Horie et

al. 2012) et (Szelechowski, Betourne et al. 2014).

BDV X

B)

A)

181

Enfin, les 20 premiers résidus N-terminaux de la X semblent également contenir un

signal de localisation mitochondrial de la X, car ils contiennent une petite hélice (Figure 38)

(Poenisch, Burger et al. 2009).

Son site d’interaction avec la P chevauche avec le NLS et a été cartographié au niveau

des résidus 3 à 16 (Wolff, Pfleger et al. 2000) (Malik, Kishi et al. 2000). Ce lien entre les

protéines X et P facilite l’export nucléaire de la P (Yanai, Kobayashi et al. 2006) (Kobayashi,

Zhang et al. 2003). En effet, la P est efficacement retenue dans le cytosol des cellules infectées

par le BDV uniquement quand l’expression de X est détectable (Kobayashi, Zhang et al. 2003).

La protéine X interagit aussi avec une protéine chaperonne de l’hôte : la heat shock cognate

70 (Hsc70) aussi appelée Hspa8 (Hayashi, Horie et al. 2009). Le site d'interaction avec Hsc70

est situé dans la région N-terminale de X (aa 1-16) et chevauche le site de liaison de P et le

NLS. P interfère de façon compétitive avec la liaison de Hsc70 à X, liaison qui est nécessaire à

l'import nucléaire de X (Hayashi, Horie et al. 2009). Lors de l’infection, la traduction de X est

supprimée en l'absence de P, il est donc supposé que l'expression de P précède celle de X

(Watanabe, Ohtaki et al. 2009). Au stade précoce de l'infection par le BDV et en l'absence de

X, la P est transloquée vers le noyau par l'intermédiaire de ses NLS. La X est alors traduite et

importée dans le noyau par l’intermédiaire de son NLS et de son interaction avec Hsc70. Dans

le noyau, l’interaction entre les protéines P et X déplace la chaperonne Hsc70, ce qui résulte

en l’export nucléaire du complexe formé par X et P.

b. Rôle lors de l’infection

Bien que la protéine X soit un régulateur négatif de la polymérase du BDV, cette

protéine est essentielle à la propagation du virus (Schneider, Naegele et al. 2003) (Poenisch,

Wille et al. 2007) (Poenisch, Unterstab et al. 2004). La X interagit préférentiellement avec la P

lorsqu'elle se trouve sous forme monomérique et interfère alors avec l’oligomérisation de

cette dernière, qui est nécessaire pour une réplication efficace du BDV (Schneider,

Blechschmidt et al. 2004). De plus, la protéine X séquestre la P dans le cytosol, ce qui contribue

182

183

également à l’effet négatif que possède la X sur la réplication du BDV (Kobayashi, Zhang et al.

2003). Enfin, en plus des protéines virales, des protéines de l’hôte peuvent aussi moduler la

réplication du BDV dans le noyau. HMGB1, une protéine constitutive de la chromatine qui se

lie à la RNP du BDV, est requise pour la réplication virale. Même si l’interaction entre HMGB1

et la RNP est brève et instable, elle suffit à réguler la réplication. Comme le site d’interaction

de la P avec HMGB1 chevauche celui de la X, cette dernière peut affecter la liaison P-HMGB1

et ainsi la réplication. La chaperonne Hsc70 liant la protéine X intervient aussi dans la

réplication du BDV (Hayashi, Horie et al. 2009). En effet, nous l’avons vu, l'interaction Hsc70-

X conduit à une réduction de liaison entre X et P, ce qui augmente le niveau de P dans le noyau

et peut réguler la réplication du BDV.

Cependant, sous certaines conditions, la X peut aussi stimuler plutôt qu’inhiber la ré-

plication du BDV. Bien que le mécanisme reste spéculatif, la X pourrait séquestrer l’excès de

protéine P qui résulterait, dans le cas contraire, en une inhibition du complexe polymérase

(Poenisch, Staeheli et al. 2008). En effet, il a été démontré que la stœchiométrie entre N et P

influence fortement l’activité polymérase (Schneider, Naegele et al. 2003). L’ensemble de ces

données suggère donc que la protéine X peut avoir à la fois des fonctions inhibitrices ou acti-

vatrices de la réplication du BDV, en fonction de la cinétique de l'infection.

c. Rôle anti-apoptotique et dans la réponse aux interférons de type I

Très souvent, l’infection par les virus déclenche la mise en route de mécanismes intra-

cellulaires permettant d’inhiber l’un des premiers mécanismes de défense des cellules

hôtes qu'est l’apoptose. Ainsi, l'absence de perte cellulaire détectable lors de l’infection par

le BDV suggère qu’il est capable d'interférer avec l'induction de l'apoptose dans des lignées

cellulaires d'origine neuronale ou non neuronale (Unterstab, Ludwig et al. 2005) (Poenisch,

Burger et al. 2009). Parmi les mécanismes de défense primaire de l’hôte contre une infection

virale se trouve également la réponse aux interférons. Nous savons que l’infection par le BDV

supprime la réponse aux interférons de type 1 (IFN) / via l’inhibition de la kinase TBK-1

(TANK-binding Kinase 1) par la protéine P (Figure 39) (Unterstab, Ludwig et al. 2005). De plus

184

185

il a été déterminé que la protéine X inhibe également la réponse aux IFN de type 1 (Wensman,

Munir et al. 2013) ainsi que l’apoptose (Poenisch, Burger et al. 2009).

Plus précisément, il a été démontré que la protéine X, localisée à la mitochondrie,

conférait une résistance à l’apoptose dépendante des caspases grâce à l’inhibition de la voie

apoptotique mitochondriale. De plus, l’activité anti-apoptotique de la X limite la mort

neuronale dans le cerveau des animaux infectés de manière persistante (Poenisch, Burger et

al. 2009). Cette activité est dépendante de la localisation mitochondriale de la protéine

X puisque l’annulation du signal MTS de la X (mutant XA6A7) stimule l'apoptose dans le cerveau

de rats nouveau-nés infectés par le BDV-XA6A7 (Poenisch, Burger et al. 2009). Plusieurs

protéines virales bloquant l’apoptose contiennent des MTS "Bcl-2 like", qui permettent leur

insertion dans l’OMM. Ces signaux sont habituellement localisés au niveau de la région C-ter

de la protéine et sont composés de résidus d'ancrage positivement chargés en amont et en

aval des domaines transmembranaires (Everett, Barry et al. 2000). La protéine X ne possède

clairement pas de MTS "Bcl-2 like", suggérant qu'elle n’interfère probablement pas avec

l'activité des membres pro-apoptotiques de la famille Bcl-2. La seule structure secondaire de

la protéine X qui a été prédite par divers algorithmes est une hélice amphipathique courte

située à proximité de l'extrémité N-terminale (Figure 38) suivie par une extension de résidus

chargés positivement en aval. Cette structure a montré une certaine similitude avec des MTS

et autres séquences qui interviennent dans l'importation de protéines cellulaires dans l’IMM

ou l'IMS (Pfanner and Geissler 2001).

Au cours d'une infection virale, le système immunitaire inné utilise des récepteurs de

reconnaissance des pathogènes (PRR) pour détecter des motifs moléculaires associés à ces

pathogènes. Les PRR activent les voies de transduction qui permettent le déclenchement des

réponses immunitaires et inflammatoires telles que la production d’IFNs, de cytokines

inflammatoires et de chimiokines (Takeuchi and Akira 2008). Il existe trois types de PRR : les

Toll-like Receptors (TLR), les Nucleotide Oligomerization Domain (NOD)-like Receptors (NLR)

et les RIG-1 (Retinoic acid-Inductible Gene-1)-like Receptors (RLR). Les RLR incluent trois

récepteurs : le RIG-1, le MDA5 (Melanoma Differentiation-Associated 5) et le LGP2 (laboratory

186

Figure 39 : Reconnaissance des virus par l’intermédiaire des récepteurs RLR et voies de si-

gnalisation menant à la production d’IFN-.

Les ARNs et ADNs viraux cytosoliques sont reconnus par les récepteurs RIG-1, MDA5, DAI. RIG-I et MDA5 reconnaissent les ARN viraux double brin courts ou longs (ARNdb) ou de l'ARN simple brin avec un 5'-triphosphate (ARNss) par l'intermédiaire de leur domaine ARN hélicase C-terminal. Puis, leurs deux domaines de recrutement de caspases N-terminaux (CARDS) interagissent avec le domaine CARDS N-terminal de la protéine mitochondriale de signalisation antivirale (MAVS). MAVS reçoit des signaux provenant des RLRs via son domaine CARDS et transmet ensuite le signal à des protéines en aval par l'intermédiaire d'autres régions incluant une région riche en proline qui interagit avec les facteurs TRAF2 et TRAF3 (Tumor necrosis factor Receptor-Associated Factor 2/3) et une région centrale qui interagit avec les récepteurs TRADD (Tumor necrosis factor receptor Associated-Death Domain) et TRAF6. TRAF2 et TRAF3 interagissent avec l’activateur TANK (TRAF family member Associated NF-κB activator). TANK recrute un complexe kinase composé de TBK1 (TANK-Binding Kinase 1) et IKKε, qui phosphoryle IRF3 et active ainsi la transcription de l'IFN-β. TRADD interagit avec TRAF3 et Rip 1, alors que TRAF6 interagit avec Rip1. Rip1 transmet le signal entre la protéine FADD et le complexe

IKK/IKKß, conduisant à l'activation du facteur de transcription NF-kB. Les interactions entre LGP2 et MAVS ou RIG-I antagonisent la signalisation RIG-I/MAVS. NLRP1 localisée aux mitochondries interagit avec MAVS et entraine entraîne son inhibition. MFN2 interagit avec MAVS via sa région heptade et interfère avec les interactions entre MAVS et diverses molécules en aval. Les protéines ATG5/Atg12 (Autophagic regulator protein Conjugate) inhibent également la signalisation de MAVS. Plusieurs protéines virales inhibent les signaux de MAVS. La protéine non structurale 1 (NS1) du virus de la grippe, par exemple, peut interférer avec l'interaction entre MAVS et RIG-I. MAVS est clivée par des protéases virales, comme NS3/4A du virus de l'hépatite C et les protéines 3C du virus de l'hépatite A. D’après (Ohta and Nishiyama 2011)

187

of Genetics and Physiology-2) (Kang, Gopalkrishnan et al. 2002) (Kovacsovics, Martinon et al.

2002) (Yoneyama, Kikuchi et al. 2005) ( Figure 39 ). Excepté LGP2, les RLR se composent d’un

domaine RNA hélicase à boîte DExD/H, d’un domaine répresseur C-ter et de deux domaines

de recrutement des caspases en N-ter (CARD). LGP2 ne possède pas de domaine CARD mais

contient un domaine hélicase ARN et un domaine répresseur C-ter.

Les deux hélicases à ARN (RIG-1 et MDA5) lient les acides ribonucléiques produits par

les virus et interagissent avec la protéine MAVS (Mitochondrial Antiviral Signaling Adaptor)

également nommée IPS-1 (IFN- Promoter Stimulator 1), Cardif ou VISA. Cette interaction se

traduit par la régulation en aval de plusieurs facteurs de transcription clés tels que le facteur

de régulation de l’interféron 3 (IRF3), IRF7 et NF-B (Xu, Wang et al. 2005) (Seth, Sun et al.

2005) (Xu et al., 2005;. Seth et al, 2005). L'activation de ces facteurs de transcription déclenche

une cascade de signalisation antivirale médiée, en partie, par la production d'interférons de

type I et l'induction consécutive de plusieurs centaines de gènes antiviraux (Figures 39 et 40)

(Samarajiwa, Forster et al. 2009). D’ailleurs, de nombreux virus expriment des protéines

inhibitrices de ces voies de signalisation afin d’échapper à la défense de l’hôte (Figure 39).

Nous savons que MAVS se localise dans les membranes des peroxysomes et induit

rapidement l'expression d'un sous-ensemble de gènes antiviraux, y compris la vipérine, afin

d’activer une réponse antivirale précoce (Dixit, Boulant et al. 2010) (Xu, Holko et al. 2009). Fait

intéressant, il a été démontré que MAVS est aussi localisée sur la membrane externe des

mitochondries (Seth et coll., 2005) (Figure 39). En outre, des rapports suggèrent que deux

autres protéines mitochondriales: la protéine STING (Stimulator of IFN Genes) qui réside

principalement dans l'ER, et MFN2 sont impliquées dans la signalisation RLR en tant que

transducteurs de signaux ou de protéines interagissant avec MAVS (Figure 39) (Ishikawa and

Barber 2008) (Yasukawa, Oshiumi et al. 2009) (Zhong, Yang et al. 2008). Lors d’une infection

par des virus à ADN, la protéine cyclique GMP-AMP Synthase (cGAS) va détecter l’ADN virale

et entrainer la dimérisation de l’AMP et du GMP afin de former du GMP-AMP cyclique

(cGAMP). cGAMP lie à son tour la protéine STING ce qui entrainera la phosphorylation du

facteur de transcription IRF3 via TBK1 (Figure 39).

188

Figure 40 : Diagramme schématique de la voie de signalisation apoptotique MAVS-MKK7-

JNK.

MAVS est un point de convergence critique de la réponse de l'hôte à l'infection par un virus à

ARN. En engageant RIG-I ou MDA5, MAVS forme un signalosome mitochondrial conduisant in

fine à l'induction de l'interféron de type 1 et de cytokines inflammatoires. De plus, MAVS

recrute la MAP kinase MKK7 au sein des mitochondries. MKK7 induit ensuite la

phosphorylation de JNK2 sur ses thréonine-183 et tyrosine-185. Enfin, JNK2 initie l'apoptose

des cellules hôtes infectées par un virus, atténuant ainsi un préjudice inflammatoire

subséquent. Nous savons que la protéine P du Bornavirus inhibe l’activation d’IRF3 via son

interaction avec TBK1 et il s’avère que la protéine X bloque l’apoptose induite par la voie

MAVS. D’après (Huang, Liu et al. 2014).

BDV X

BDV P

189

Un autre aspect important de l’immunité innée a été mis en exergue : l’apoptose

mitochondriale peut également se déclencher par l’intermédiaire de la signalisation des

récepteurs RLR et de la protéine MAVS (Hiscott, Lin et al. 2006) (Rintahaka, Wiik et al. 2008)

(Fuertes Marraco, Scott et al. 2011). Cette fonction de MAVS est indépendante de la voie de

signalisation aux IFNs, elle recrute la Map Kinase 7 (MKK7), au niveau des mitochondries, qui

phosphoryle ensuite la c-Jun N-terminal kinase 2 (JNK2) et active ainsi la voie de l'apoptose

(Huang, Liu et al. 2014) (Figure 40). Fait très intéressant, il a été montré que la protéine X

interagissait directement avec MAVS dans les mitochondries, cette interaction inhibe la mise

en route de la mort cellulaire programmée (par une surexpression de la protéine MAVS)

(figure 40) sans affecter la production d'IFN de type I et l'activité de NF-B (Li, Song et al.

2013). Ainsi, nous pouvons suggérer que le mutant non mitochondrial de la protéine X, XA6A7,

ne possède plus de propriétés anti-apoptotiques car il ne peut plus interagir avec MAVS au

sein de la mitochondrie et ainsi bloquer l'apoptose induite par cette dernière.

Étonnamment, il a été démontré la même année que la protéine X interfère avec la

voie de signalisation IFN de type I dans des cellules épithéliales d’adénocarcinome infectées

par le virus Sendaï ou sous stimulation exogène par ARN double brin (ARNdb) (Wensman,

Munir et al. 2013), probablement grâce à son interaction avec la protéine MAVS, mais elle n’a

pas d’effet sur cette voie lorsque les cellules sont infectées par le virus de la grippe (Unterstab,

Ludwig et al. 2005). En revanche, la protéine P du BDV ne semble pas être en mesure

d'interférer avec la signalisation IFN de type I lors d’une stimulation exogène (ARNdb et IFN-

), alors qu’elle le peut au travers de son interaction avec TBK-1 dans des cellules infectées

par le virus de la grippe (Unterstab, Ludwig et al. 2005). Pour conclure, les protéines X et P

jouent un rôle différent et très certainement complémentaire dans l’évasion du BDV face à la

réponse antivirale des cellules hôtes. Cependant la protéine X joue un rôle d’autant plus

important qu’elle module le programme de mort cellulaire et que son adressage

mitochondrial est indispensable pour la persistance du virus et sa réplication non cytolytique

(Li, Song et al. 2013) (Poenisch, Burger et al. 2009). C’est notamment grâce à ces propriétés

que l’équipe a souhaité tester le potentiel rôle neuroprotecteur de la protéine X dans un

modèle murin de MP.

190

Figure 41 : Rôle multifonctionnel de la protéine Hspa9 (mortaline).

La chaperonne Hspa9 est impliquée dans une multitude de voies de signalisation dans les cellules. Principalement localisée dans la mitochondrie, elle prend part à l’import mitochondrial des protéines matricielles de façon dépendante de l'ATP. Elle est également détectée au niveau du RE, de l’appareil de Golgi et à la surface des membranes plasmiques. Hspa9 possède également un rôle dans la cancérogénèse via son effet inhibiteur sur le facteur de transcription p53. Elle intervient aussi dans la composition des exosomes et des endosomes. Il a été suggéré que la protéine Tau était relarguée des neurones par l’intermédiaire d’exosomes et que cette sécrétion pourrait aider à l’expansion des pathologies à protéine Tau (Lee et al., 2012; Saman et al., 2012). Les altérations de l’expression d’une des isoformes d’Hspa9 mises en évidence dans le cerveau de patient MA pourraient influencer la composition des vésicules exosomaux et endosomaux et contribuer à la dispersion des protéines Tau pathologiques. Des modèles MA ont également montré des problèmes d’importation mitochondriale d’Hspa9, ainsi qu'une surproduction de ROS et une vulnérabilité des mitochondries au stress environnemental. Par ailleurs, Hspa9 possède très certainement un rôle dans la pathogénèse de la

maladie de Parkinson, en interagissant avec des protéines impliquées dans la MP comme l’-

synucléine (-syn) ou DJ-1. En effet, des mutations dans cette protéine ont été identifiées chez des patients MP et la surexpression de ces mutants dans des modèles cellulaires entraîne des dysfonctionnements mitochondriaux comme une surproduction de ROS. D’après (FlachbartovÁ and Kovacech 2013).

191

3. Hspa9 : généralités et rôle dans les maladies neurodégénératives

Au sein de l’équipe nous avons déterminé une interaction directe entre la protéine X

et Hspa9 (voir résultats). En effet, cette protéine potentiellement neuroprotectrice a fait

parler d’elle ces dernières années, en tant que protéine chaperonne mitochondriale

également nommée mtHsp70, Mortaline ou Grp75.

Hspa9 est une protéine de 679 acide aminés détectée dans plusieurs compartiments

sub-cellulaires tels que le réticulum endoplasmique, les mitochondries, l'appareil de Golgi, les

vésicules cytoplasmiques et le cytosol (Ran, Wadhwa et al. 2000) (Wadhwa, Kaul et al. 1993c)

(Wadhwa, Pereira-Smith et al.). Selon sa localisation subcellulaire, elle a de multiples

partenaires de liaison, y compris p53, FGF-1, l'IL-1 receptor type 1, GRP94, VDAC, NADH

déshydrogénase, Mge1, Tim44 et Tim23, et elle est impliquée dans des voies de signalisation

diverses (Wadhwa, Takano et al. 1998) (Mizukoshi, Suzuki et al. 1999) (Schwarzerc, Barnikol-

Watanabe et al. 2002) (Wadhwa, Takano et al. 2005) (Sacht, Brigelius-Flohe et al. 1999)

(Takano, Wadhwa et al. 2001).De plus, la biogenèse mitochondriale ainsi que l’expression

d’Hspa9 est induite par des radiations ionisantes, la carence en glucose, le calcium et les

hormones thyroïdiennes (Resendez, Attenello et al. 1985) (Sadekova S and T. Y.-K. Ch 2009)

(Craig, Chesley et al. 1998).

Comme nous l’avons vu précédemment, Hspa9 est l'une des protéines qui participent

activement à l'importation de protéines mitochondriales à travers l’IMM dans la matrice

mitochondriale (figure 41). La majorité de la mortaline cellulaire se trouve ainsi dans la matrice

mitochondriale (Burbulla, Krebiehl et al. 2010). Comme toutes les chaperonnes, elle est

responsable du contrôle qualité protéique : elle interagit avec les protéines dépliées (natives

néosynthétisées) ou mal repliées (dénaturées) tout en empêchant leur agrégation (Gosslau,

Ruoff et al. 2001). Ces mécanismes de contrôle qualité assurent un environnement protéique

cellulaire normal (Lu, Lee et al. 2011).

192

193

Ainsi, la mortaline est impliquée dans les processus tumoraux, bien que le mécanisme

moléculaire reste peu clair. Une analyse en immunofluorescence comparant des cellules

normales et immortelles a révélé, que chez la souris, Hspa9 est distribuée dans le cytoplasme

des cellules normales et plutôt dans la région périnucléaire dans des cellules immortelles

(Kaul, Yaguchi et al. 2003). La co-localisation de la mortaline et de p53 a été détectée au niveau

périnucléaire dans de nombreux types de cellules cancéreuses (adénocarcinome colorectal

humain, glioblastomes ou carcinomes hépatocellulaires) (figure 41). Cette interaction permet

la séquestration cytoplasmique de p53 (Kaul, Aida et al. 2005) (Lu, Lee et al. 2011), ce qui

l’inactive et conduit à l'inhibition de l'activation transcriptionnelle de ses gènes cibles et à

l’immortalisation cellulaire (Wadhwa, Taira et al. 2002a). La mortaline jouerait également un

rôle dans l'endocytose médiée par les protéoglycanes à héparane sulfate (Wittrup, Zhang et

al. 2010) et dans l'exocytose (figure 41) (Shelton, Huang et al. 2012).

Cependant c’est son rôle dans les maladies neurodégénératives qui nous intéresse

particulièrement ici. Comme rappelé précédemment, le stress oxydatif joue un rôle primordial

dans la neurodégénérescence. Une analyse protéomique des protéines oxydées a été

effectuée dans différentes régions du cerveau de souris modèles de la MA knock-out pour

l’isoforme E4 de l’Apolipoprotéine, ce qui augmente le risque de MA. Cette analyse a montré

que l'oxydation des protéines totales dans l'hippocampe de ces animaux transgéniques était

environ deux fois plus élevée que chez les animaux témoins. Hspa9 a été identifiée comme

étant l'une des six protéines les plus sensibles à l'oxydation (Choi, Forster et al. 2004).

L’analyse de l'expression des protéines dans des échantillons de cerveau de patients

Alzheimer a révélé différentes isoformes d’Hspa9. L'une de ces isoformes est augmentée dans

les hippocampes de ces patients (Osorio, Sullivan et al. 2007).

Par ailleurs, l'exposition à des niveaux sub-létaux d’Aß conduit à des défauts dans le

ciblage mitochondrial de la mortaline et d'autres composants de la machinerie d'importation

mitochondriale, ce qui entraîne une modification de la morphologie mitochondriale, une

diminution du potentiel de membrane mitochondrial, une augmentation des niveaux de ROS

194

195

(figure 41) et une vulnérabilité accrue à l'oxygène et à la carence en glucose (Sirk, Zhu et al.

2007).

De plus, des changements dans l’expression d’Hspa9 ont été corrélés à l'effet toxique

de la roténone sur les neurones dopaminergiques dans la maladie de Parkinson (Jin, Hulette

et al. 2006). Les taux de mortaline sont réduits dans le cerveau des patients, ainsi que dans les

fractions mitochondriales isolées d’un modèle cellulaire de MP (Jin, Hulette et al. 2006; De

Mena, Coto et al. 2009). En outre, la mortaline interagit avec des protéines liées à cette

maladie telles que DJ-1 et l’α-synucléine (figure 41) (Jin, Li et al. 2007) (Liu, Liu et al. 2005). Le

rôle d’Hspa9 dans son étiologie a également été appuyé par l'identification de trois allèles du

gène mortaline : deux faux-sens (R126W et P509S) et une insertion de 17pb dans l'intron 8

(De Mena, Coto et al. 2009). Un quatrième variant de la mortaline (A476T) a ensuite été

identifié chez des patients parkinsoniens en Allemagne (Burbulla, Krebiehl et al. 2010). Pour

définir la fonction de ces variants d’Hspa9 associés à la MP, les auteurs les ont surexprimés

dans des modèles cellulaires neuronaux et non neuronaux. Ces variants présentent une

importation normale dans les mitochondries, mais provoquent un phénotype mitochondrial

anormal, qui se manifeste par une augmentation des taux de ROS dans les cellules ainsi que

par une diminution du potentiel de membrane mitochondrial par rapport aux cellules témoins

surexprimant Hspa9 sauvage.

Enfin, par différentes approches protéomiques, Chiasserini et ses collègues ont

confirmé la diminution de l’expression d’Hspa9 dans un modèle Parkinson chez le rat généré

par l’inhibition du complexe I de l’ETC en injectant de la 6-hydroxy-dopamine dans le faisceau

médian du télencéphale (Chiasserini, Tozzi et al. 2011).

Considérant le rôle central que semble avoir Hspa9 dans les maladies

neurodégénératives, il est probable que l’interaction entre la protéine X et Hspa9 explique,

du moins en partie le rôle neuroprotecteur de la protéine X mis en exergue par notre équipe.

196

197

OBJECTIFS DE LA THESE

198

199

Les maladies neurodégénératives sont caractérisées par la perte de populations

neuronales spécifiques associées, pour la plupart, à une altération de fonctions cognitives

et/ou locomotrices. Cette appellation regroupe un grand nombre de maladies humaines, dont

les maladies d’Alzheimer et de Parkinson. Leur prévalence croissante dans nos populations

vieillissantes pose un réel problème de santé publique, d’autant plus que les connaissances

sur leurs origines, qu’elles soient génétiques et/ou environnementales, ainsi que des

mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués restent très limitées. Il est cependant clair

aujourd’hui que la dégénérescence de l’axone précède le plus souvent la destruction du corps

cellulaire, un phénomène connu sous le terme de "mort cellulaire rétrograde". L'élucidation

des mécanismes moléculaires sous-jacents est un champ de recherche très actif, qui a permis

l’émergence d’une hypothèse majeure plaçant des dysfonctionnements mitochondriaux au

cœur, voire à l'origine, de ce phénomène.

Comme nous l’avons constaté dans l’introduction, même si l’étiologie des maladies

neurodégénératives reste mal comprise, l’implication centrale de la mitochondrie est

désormais bien établie. Dans ce contexte, mon équipe de recherche a récemment établi que

la protéine X du BDV possédait des propriétés neuroprotectrices remarquables dans des

modèles in vitro et in vivo de la maladie de Parkinson. La localisation mitochondriale de la

protéine X est apparue nécessaire à son pouvoir neuroprotecteur, néanmoins les mécanismes

moléculaires qui en sont à l'origine sont loin d’être tous connus. C’est pourquoi mon projet de

thèse visait à une meilleure compréhension des propriétés de cette protéine, en particulier

dans les mitochondries, afin de déterminer ses mécanismes d’action dans les neurones et

d’affiner les pistes thérapeutiques.

Mon projet s’est organisé autour des 3 objectifs suivants :

I) Analyser de façon détaillée l’impact de la protéine X sur les fonctions cellulaires de

la mitochondrie. Nous avons étudié des paramètres classiques comme la

respiration, le potentiel de membrane ou la synthèse d'ATP. Nous avons également

analysé l’impact de la protéine X sur la dynamique du réseau mitochondrial. Tous

ces paramètres ont été évalués en conditions physiologiques ou après induction

200

201

d'un stress oxydatif, mimant le déclenchement des dommages neuronaux observés

dans les stades précoces de neurodégénérescence.

II) Déterminer les différents signaux intrinsèques de localisation subcellulaire de la

protéine X et potentialiser son adressage mitochondrial.

III) Analyser la contribution éventuelle de la protéine Hspa9, un partenaire direct de la

protéine X, à ses effets neuroprotecteurs.

202

203

RESULTATS

204

205

I) Détermination du pouvoir neuroprotecteur de la protéine X dans des

modèles in vitro et in vivo de la Maladie de Parkinson et recherche des

mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents.

Ce travail a fait l’objet d’un article publié dans NatureCommunications en octobre 2014 :

« A viral peptide that targets mitochondria protects against neuronal degeneration in

models of Parkinson’s disease »

Marion Szelechowski, Alexandre Bétourné, Yann Monnet, Cécile A. Ferré, Anne Thouard,

Charlotte Foret Jean-Michel Peyrin, Stéphane Hunot and Daniel Gonzalez-Dunia.

NATURE COMMUNICATIONS, 5:5181, DOI: 10.1038/ncomms6181

1. Résumé et article

Nous l’avons vu, actuellement toutes les pathologies neurodégénératives restent

incurables. A l’heure actuelle, les traitements existants ne permettent, au mieux, que de

ralentir la progression de la mort neuronale et d’apporter un minimum de confort au patient.

Malgré le rôle prépondérant des altérations mitochondriales dans la neurodégénérescence,

toutes les molécules visant à maintenir les fonctions mitochondriales n’ont pas démontré une

efficacité significative en phase clinique.

Le Bornavirus est neurotrope et persistant chez l’animal infecté, sa réplication dans les

neurones in vivo ou dans des cellules en culture n’est pas associée à une cytotoxicité

manifeste. Poenish et ses collaborateurs ont démontré que cette propriété était due à la

protéine X, non structurale du BDV. La protéine X isolée permet une protection de différents

206

207

types cellulaires contre des stimuli apoptotiques extrinsèques ou intrinsèques uniquement

proportionnellement à sa localisation mitochondriale (Poenisch, Burger et al. 2009).

Dans ce contexte, mon équipe d'accueil a cherché à utiliser la protéine X du Bornavirus

afin de prévenir efficacement la neurodégénérescence, que ce soit dans des neurones

d’embryon de rat en culture primaire exposés à la roténone, ou dans un modèle murin de MP

créé par intoxication aiguë au MPTP.

Grâce à un système culture neuronale en chambre microfluidique permettant de

compartimenter et de séparer physiquement l’environnement des corps somatiques de celui

des prolongements axonaux (Peyrin et al., 2011), notre équipe a démontré que la protéine X

protégeait de la fragmentation axonale induite par la roténone, premier signe de l’apoptose.

En effet, cette toxine mitochondriale, appliquée sur les extrémités des axones, va entraîner

un stress oxydatif localisé puis la dégénérescence axonale, ce qui va conduire progressivement

à l’apoptose du corps cellulaire : ce phénomène est appelé Dying Back (rev in Adalbert et al.,

2013 (Adalbert, R., and Coleman, M. P. (2013) Review: Axon pathology in age-related

neurodegenerative disorders. Neuropathol Appl Neurobiol 39, 90-108) ; Magnifico et al.,

2013).

Dans ce modèle in vitro de stress oxydatif, l’expression de la protéine X permet de

sauvegarder le potentiel de membrane mitochondrial et de limiter la production de ROS à un

niveau basal, et, in fine, de freiner la dégénérescence axonale.

Fait particulièrement intéressant, la protéine X, produite localement après injection

lentivirale, protège également, in vivo, les neurones dopaminergiques de la destruction

déclenchée par l’injection intra péritonéale de la toxine MPTP, qui est transformée, par les

cellules gliales, en un autre poison du complexe I de l’ETC mitochondriale.

208

209

Cependant, l’injection stéréotaxique dans la substance noire de lentivecteurs

exprimant la protéine X est une procédure très invasive n’ayant aucun avenir thérapeutique.

C’est pourquoi notre équipe a développé un peptide (PX3) de 29 a.a. dérivé de la région C-ter

de la protéine X. PX3 comporte également une séquence de ciblage mitochondrial,

permettant aussi le passage des membranes cellulaires (Mitochondrial-penetrating peptide

(REF Yousif et al). Nous avons observé que ce peptide présentait les mêmes propriétés

neuroprotectrices, à la fois in vitro et in vivo, que la protéine X. De plus, in vivo, le peptide se

montre également efficace après simple administration par voie intra-nasale.

Lors de mon arrivée au laboratoire, les résultats mentionnés ci-dessus venaient d'être

obtenus. Ma contribution à ce travail a consisté à évaluer les effets de la protéine X et du

peptide sur la morphologie des mitochondries. J’ai ainsi démontré que la protéine X et le

peptide PX3 entraînaient tous deux une augmentation de la longueur des mitochondries,

autrement dit une filamentation mitochondriale, en conditions physiologiques, et que cette

capacité était conservée en cas de stress oxydatif. De plus, cet effet est accompagné d'une

inhibition de la phosporylation de la protéine de fission DRP1 au niveau de son résidu Serine

616. Cette élongation du réseau mitochondrial confère très certainement aux neurones une

capacité de réponse supplémentaire au stress oxydatif, grâce à la dilution des molécules

endommagées et à un phénomène de complémentation inter-mitochondriale.

ARTICLE

Received 1 Apr 2014 | Accepted 5 Sep 2014 | Published 21 Oct 2014

A viral peptide that targets mitochondria protectsagainst neuronal degeneration in modelsof Parkinson’s diseaseMarion Szelechowski1,2,3, Alexandre Betourne1,2,3, Yann Monnet4,5,6,7, Cecile A. Ferre1,2,3, Anne Thouard1,2,3,

Charlotte Foret1,2,3, Jean-Michel Peyrin8,9,*, Stephane Hunot4,5,6,7,* & Daniel Gonzalez-Dunia1,2,3

Mitochondrial dysfunction is a common feature of many neurodegenerative disorders,

notably Parkinson’s disease. Consequently, agents that protect mitochondria have strong

therapeutic potential. Here, we sought to divert the natural strategy used by Borna disease

virus (BDV) to replicate in neurons without causing cell death. We show that the BDV X

protein has strong axoprotective properties, thereby protecting neurons from degeneration

both in tissue culture and in an animal model of Parkinson’s disease, even when expressed

alone outside of the viral context. We also show that intranasal administration of a cell-

permeable peptide derived from the X protein is neuroprotective. We establish that both the

X protein and the X-derived peptide act by buffering mitochondrial damage and inducing

enhanced mitochondrial filamentation. Our results open the way to novel therapies for

neurodegenerative diseases by targeting mitochondrial dynamics and thus preventing the

earliest steps of neurodegenerative processes in axons.

DOI: 10.1038/ncomms6181

1 INSERM UMR 1043, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan (CPTP), Toulouse, F-31300, France. 2 CNRS UMR 5282, Toulouse, F-31300, France.3 Universite Toulouse III Paul Sabatier, Toulouse, F-31300, France. 4 ICM, Paris, F-75013, France. 5 Sorbonne Universites, UPMC Universite Paris 06, UM 75,ICM, Paris, F-75005, France. 6 CNRS, UMR 7225, ICM, Paris, F-75013, France. 7 Inserm, U 1127, ICM, Paris, F-75013, France. 8 CNRS UMR 8256, BiologicalAdaptation and Ageing, Paris, F-75005, France. 9 Sorbonne Universites, UPMC Universite Paris 06, UMR 8256, B2A, Biological Adaptation and Ageing,Institut de Biologie Paris Seine, Paris, F-75005, France. * These authors contributed equally to this work. Correspondence and requests for materials should beaddressed to D.G.-D. (email: daniel.dunia@inserm.fr).

NATURE COMMUNICATIONS | 5:5181 | DOI: 10.1038/ncomms6181 | www.nature.com/naturecommunications 1

& 2014 Macmillan Publishers Limited. All rights reserved.

The progressive loss of structure and function of neurons inneurodegenerative diseases, including Parkinson’s disease(PD), involves mitochondrial dysfunction and early

axonal degeneration1–3. Accordingly, agents that could protectmitochondrial functions may have broad therapeuticimplications, especially considering that we still lack efficienttherapies to block neuronal demise in the early stages ofneurodegeneration. Viruses, as obligatory parasites, haveevolved highly specific means to hijack cellular pathways. Tooptimize the survival in their host, many viruses express factorsthat block or delay the death of infected cells, by acting notably atthe mitochondrial level, thereby suppressing one of the mostancient antiviral mechanisms4. For neurotropic viruses,protecting infected neurons from excessive damage or deathmakes theoretical sense to facilitate viral spread and persistence,given the poor regenerative capacity of neurons. For instance,rabies virus neurovirulence is inversely correlated with itscapacity to kill infected neurons5. In addition, delayed axonaldegeneration in slow Wallerian degeneration (Wlds) mutant micehas been shown to favour infection by neurotropic viruses thatspread in the central nervous system (CNS) using axonaltransport6. This has led to the hypothesis that some virallyencoded products may be used as tools to retard or suppressneurodegeneration7,8. Ideally, however, such tools should targetaxonal degeneration, which has been shown to precede cell bodydeath in various neurodegenerative diseases, notably PD3. Theidentification of factors able to retard axonal degeneration maytherefore come from the study of viruses that replicate whilecausing minimal damage to neurons.

A case in point is Borna disease virus (BDV), a neurotropicRNA virus that persists in the brain of many animal specieswithout causing damage to neurons9. BDV non-cytolyticreplication depends on the expression of an 87 amino acidsviral protein called X10. This non-structural protein was initiallydescribed as an important regulator of viral RNA synthesis andof polymerase complex assembly in the nucleus of infectedcells11–13. Later, it was shown that X represents the firstmitochondrion-localized protein of an RNA virus that inhibitsrather than promotes induction of apoptosis, thereby favouringnon-cytolytic viral persistence10 and escape to mitochondrialantiviral signalling protein-mediated host cell defence14. It wastherefore tempting to investigate whether the X protein couldprotect neurons against neurodegenerative insults.

In this study, we examine the capacity of BDV infection, as wellas of the isolated expression of the X protein, to protect againstmitochondrial respiratory complex I toxins, which induceoxidative stress and neurodegeneration15–17. We use orientedprimary cultures of neurons grown in microfluidic chambers todemonstrate that the X protein displays selective and strongaxoprotective properties. We also report that the isolatedexpression of the X protein is able to protect dopaminergicneurons of the nigrostriatal pathway from degeneration in amouse model of PD. In addition, we find that the neuroprotectionconferred by the X protein results from enhanced mitochondrialfilamentation. Finally, we identify a cell-permeable peptidederived from the X protein that recapitulates all our findingsobtained with the full-length protein. Importantly, in vivoneuroprotection with this peptide can be achieved uponintranasal administration, thereby opening the way to noveltherapies for neurodegenerative diseases.

ResultsBDV protects from rotenone-induced axonal fragmentation.To test the neuroprotective potential of BDV infection upon adirect axonal or somatic insult, we used oriented primary

neuronal cultures grown in microfluidic devices, which permit thestrict physical separation and fluidic isolation of somatodendriticand axonal compartments. Consistent with our previous find-ings18–20, we observed that direct somatic application ofrotenone, a mitochondria complex I targeting toxin, led torapid (o4 h) and massive cell death and axonal degeneration,which was moderately but consistently reduced by BDV infection(Supplementary Fig. 1). In contrast, axonal application ofrotenone triggered axonal fragmentation, followed by a slowretrograde propagation of the degenerative process towards thecell body. Consequently, cell death was only evidenced at 24 and48 h (Supplementary Fig. 1), illustrating the advantages of thissetup to model the dying-back pattern of neurodegeneration21.In this experimental paradigm, neuroprotection provided byBDV infection was still observed and even increased whencompared with direct somatic injury. To specifically focus onaxonal protection upon a localized insult by rotenone, we thuschose the 16 h time point, that is, before any signs of neuronaldeath. Observation of the axonal chambers revealed thattreatment with rotenone for 16 h triggered extensive axonaldegeneration (Fig. 1a, compare upper and lower panels).Strikingly, BDV infection almost entirely abrogated rotenone-induced axonal fragmentation (Fig. 1a,b). A similar protectionafforded by BDV infection against axonal fragmentationwas observed after axonal treatment with mitochondria-penetrating peptide (MPPþ ), the active form of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), another complex Itargeting toxin that induces oxidative stress and which is widelyused to model PD-like neurodegeneration in rodents andprimates22 (Fig. 1c). Since rotenone and MPPþ toxins werealso reported to inhibit tubulin assembly by binding to tubulin,we used colchicine to inhibit microtubule polymerization anddistinguish between both activities. Infection did not protectagainst colchicine-induced axonal fragmentation (Fig. 1d),showing that BDV specifically protects axons from complex Iinhibition.

BDV X protein mediates axonal protection. To dissect themechanism supporting the neuroprotective properties of BDVand to test the role of the X protein in axonal protection, we nextcompared the protective effects of a recombinant wild-type (wt)BDV (BDV-Xwt) with a recombinant BDV in which the X proteinhad been mutated to abrogate its mitochondrial localization(BDV-XA6A7)10. Consistent with the results shown above,infection with BDV-Xwt strongly protected against rotenone-induced axonal fragmentation. In contrast, there was noprotection with BDV-XA6A7 (Fig. 2a), establishing that themitochondrial localization of the X protein is mandatory foraxonal protection. To test whether the X protein could elicitneuroprotection by itself, we constructed lentiviral vectors (LVs)expressing green fluorescent protein (as a control) or variousBDV proteins: the nucleoprotein (N), the phosphoprotein (P), thewt X protein (Xwt) or the XA6A7 mutant. Neurons grown inmicrofluidic devices were transduced with the different LV andaxonal fragmentation was assayed 16 h after rotenone exposure ofaxons. Expression of Xwt alone conferred similar level of axonalprotection as infection with BDV (Fig. 2b). In addition, none ofthe other viral proteins induced similar protection. Here again,experiments using the LV-XA6A7 mutant established that themitochondrial localization of the X protein was required foraxonal protection. Confocal microscopy analysis of neuronstransduced with LV-Xwt and co-localization studies withmitochondrial Tom20 protein confirmed that the X proteinindeed localizes to the mitochondria, even when expressed alone(Fig. 2c,d).

ARTICLE NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms6181

2 NATURE COMMUNICATIONS | 5:5181 | DOI: 10.1038/ncomms6181 | www.nature.com/naturecommunications

& 2014 Macmillan Publishers Limited. All rights reserved.

BDV X protein preserves mitochondrial parameters. Bothrotenone and MPPþ block the formation of the electrochemicalgradient across the inner mitochondrial membrane (DCm).Using JC-1 as a DCm indicator, we observed that BDV-Xwt, butnot the XA6A7-mutated virus, prevented the time-dependent lossof DCm in the axonal compartment of microfluidic neuronalcultures upon rotenone exposure, as evidenced by a decrease inthe red/green fluorescence intensity ratios (Fig. 3a,b). Likewise, wtBDV also prevented rotenone-induced oxidative stress and burstof reactive oxygen species (ROS) production (Fig. 3c,d), whereasthe XA6A7-mutated virus had lost this property. The X protein isthus able to buffer mitochondrial dysfunctions triggered bycomplex I toxins and to preserve neurons from the resultingoxidative stress.

The X protein reduces neuronal loss in MPTP-treated mice.We then tested the neuroprotective properties of the X proteinin vivo using the MPTP intoxication mouse model of PD23,24.LVs expressing either wt (LV-Xwt) or its non-mitochondrialmutant (LV-XA6A7) were introduced by stereotaxic injection inthe substantia nigra pars compacta (SNpc), 2 weeks beforeMPTP intoxication. Immunofluorescence analysis using an anti-BDV X antibody was performed to confirm the distribution of the

injected LV. Expression of the X protein was strong and waslimited to the SNpc and in a restricted surrounding brainarea (Fig. 4a). Moreover, confocal analysis of the co-localizationwith tyrosine hydroxylase (TH) revealed that a high proportionof TH-positive dopaminergic neurons in the SNpc alsoexpressed the X protein (Fig. 4b). Three weeks after MPTPintoxication, the survival of nigrostriatal dopaminergic neuronswas assayed by TH immunodetection in the striatum (axonalprojections) or SNpc (cell bodies). As expected, intra-peritoneal (i.p.) MPTP intoxication induced a bilateral lesionof the nigrostriatal pathway, which was evidenced by a decreasein striatal TH immunostaining (Fig. 4c, compare upperand lower panels). The unilateral injection of LVs allowed us toevaluate the level of striatal protection for each mouse bycomparison with the contralateral, non-injected side (Fig. 4d).This analysis was further complemented by the enumerationof surviving TH-positive neurons in the ipsilateral SNpc(Fig. 4e,f). MPTP-intoxicated mice that had been injected withLV-XA6A7 displayed a general loss of striatal fibres and loss ofTH-positive neurons (Fig. 4d,f). In contrast, mice receivingLV-Xwt were remarkably protected against MPTP toxicity,with a preservation of ipsilateral striatal fibres and an almostcomplete protection of ipsilateral TH-positive neurons in theSNpc (Fig. 4d,f).

Axo

nal f

ragm

enta

tion

inde

x

0.3

0.2

0.1

0+ Rot

soma (4 h)+ Rot axon

(16 h) – Rot

***Mock BDV

+ R

ot a

xon

BDV

0.3

0.2

0.1

0+ MPP+– MPP+

***

+ Colchicine– Colchicine

Axo

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x

MockBDV

MockBDV

MockBDV

0.3

0.2

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0

Axo

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ragm

enta

tion

inde

x

0.4

– R

ot

0.04 0.03

βIII-Tub

BDV

0.21 0.07

Figure 1 | BDV infection protects against rotenone-induced axonal fragmentation. (a) Representative example of confocal imaging of rotenone

(Rot)-induced axonal fragmentation. Oriented neuronal cultures grown in microfluidic devices were mock- or BDV-infected (BDV) and treated (þRot

Axon) or not (�Rot) for 16 h with 1mM rotenone added in the axonal chambers. The axonal network was stained for bIII-tubulin (Tub; green) to

assess axonal morphology and for BDV nucleoprotein (red) to reveal infection. Inserts show the fragmentation indexes, calculated as described in the

Methods section. (b) Quantification of axonal fragmentation, following 1 mM rotenone added either for 4 h directly in the somatic chamber (þRot Soma) or

for 16 h in the axonal chamber (þRot Axon). n¼4 independent experiments. (c,d) BDV infection protects from axonal fragmentation induced by

toxins that target the mitochondria, but not against toxins that induce cytoskeleton damage. Quantification of axonal fragmentation in microfluidic-based

oriented neuronal cultures, either mock or BDV infected, that were treated by axonal application during 16 h of (c) the respiratory complex I toxin

MPPþ (10mM) or (d) the tubulin polymerization inhibitor colchicine (10 mM). n¼ 3 independent experiments. Scale bars, 10mm. Data are represented as

mean±s.d. ***Po0.001; Mann–Whitney test.

NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms6181 ARTICLE

NATURE COMMUNICATIONS | 5:5181 | DOI: 10.1038/ncomms6181 | www.nature.com/naturecommunications 3

& 2014 Macmillan Publishers Limited. All rights reserved.

Identification of a neuroprotective X-derived peptide. Despitethese encouraging results, stereotaxic injection of neuroprotectivecompounds is invasive and cannot be envisioned as a convenienttherapy25,26. Therefore, we asked whether small-cell-permeablepeptides derived from the X protein could exhibit similarproperties and be neuroprotective following systemicadministration. In silico analysis of the X protein sequence didnot reveal any homology with other viral or cellular proteins thatwould point to a particular domain involved in neuroprotection.Structure modelling (Supplementary Fig. 2) predicts a highlydisordered protein, except for a short N-terminal aliphatic alphahelix, that carries both nuclear and mitochondrial localizationdomains27. Thus, we synthesized three peptides covering theentire amino-acid sequence of the X protein to test each of themseparately for neuroprotection (Fig. 5a). To ensure their targetingto mitochondria, we coupled these peptides with a MPP sequence(F-R-Cha-K-F-R-Cha-K, Cha, cyclohexylalanine), which wasshown to allow both translocation of the plasma membraneand mitochondrial targeting with high specificity28. Since itsoriginal description, this MPP has been shown to allow themitochondrial-specific delivery of a wide array of cargos,including fluorescent labels or drugs29,30, and its mitochondrialtargeting properties have been observed by solid-statenuclear magnetic resonance31. We took advantage of the factthat the BDV X antibody also recognizes the PX3 peptide,corresponding to the C-terminal part of the X protein (Fig. 5a)to confirm that the MPP sequence indeed allowed itsmitochondrial accumulation within 90 min of incubation in

the medium of cultured neurons (Fig. 5b). The antibody,however, did not recognize the PX1 or PX2 peptides. Wenext assayed protection against rotenone-induced axonalfragmentation using our microfluidic neuronal culture model.Remarkably, peptide PX3 provided protection similar to that offull-length X protein (Fig. 5c). The other peptides did not exhibitany protection, suggesting that the neuroprotective property ofthe X protein resides entirely within its 29 amino-acid C-terminalsequence.

Intranasal administration of PX3 is neuroprotective in vivo.We next examined whether PX3 could be protective in the MPTPmouse model of PD, similarly to our findings with the full-lengthX protein. We first assessed neuroprotection upon direct deliveryof the peptides in the CNS by intra-cerebroventricular (ICV)injection. When compared with lesions observed in MPTP-intoxicated mice that had been injected with the PX2 peptide, weobserved that ICV injection of PX3 peptide led to 40% and 53%protection against MPTP-induced loss of striatal TH fibres andSNpc TH-positive neurons, respectively, (Supplementary Fig. 3).In order to explore a more convenient systemic route ofadministration, we then performed intranasal instillations of thepeptide. Indeed, the intranasal route is known to bypass theblood–brain barrier through olfactory- and trigeminal-associatedextracellular pathways, allowing entry of agents to the CNS, asshown for insulin-like growth factor-1 (ref. 32). Moreover,intranasal intoxication by MPTP constitutes a new route of

Axo

nal f

ragm

enta

tion

inde

x

0.3

0.2

0.1

0

0.4

#

Mock BDV-Xwt BDV-XA6A7

Axo

nal f

ragm

enta

tion

inde

x

0.3

0.2

0.1

0

0.4

Mock BDV GFP N P Xwt XA6A7

Lentiviral vectors

##

Tom20 X Merge Tom20

X

Merge

Distance (μm)

Flu

ores

cenc

ein

tens

ity 200

100

00 50 100 150 200

Figure 2 | BDV X protein mediates axonal protection even when expressed alone outside of the viral context. (a) Neurons grown in microfluidic

devices were either mock treated or infected with wt recombinant BDV (BDV-Xwt) or recombinant BDV bearing mutations in the mitochondrial targeting

sequence of X protein (BDV-XA6A7). Axonal fragmentation was quantified after treatment with 1mM rotenone that was added in the axonal chamber for

16 h. (b) Analysis of axonal fragmentation in neurons transduced with LVs expressing independently each indicated protein (GFP or viral proteins N, P, X and

mutant XA6A7) and treated with 1 mM rotenone in the axonal chamber for 16 h. Results obtained using mock- or BDV-infected neurons are also indicated in

the figure for comparison. Each symbol in a,b refers to the fragmentation index calculated for one microfluidic culture and horizontal bars refer to the

means. n¼ 3 independent experiments. #Po10�4; Kruskal–Wallis test. (c,d) Analysis of X protein localization in mitochondria. Confocal imaging of

neurons transduced with the LV expressing the X protein and stained for mitochondrial Tom20 (green) and BDV X (red). Right panel shows the merged

image. (d) Enlarged picture of the white box shown in c. To better appreciate co-localization, below the pictures are plotted the intensity profiles of green

and red fluorescent signals along the portion of the axon located above the white arrow. Scale bars, 10 mm (c) and 5 mm (d).

ARTICLE NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms6181

4 NATURE COMMUNICATIONS | 5:5181 | DOI: 10.1038/ncomms6181 | www.nature.com/naturecommunications

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toxin delivery in the brain that mimics environmental exposure toneurotoxins33, further demonstrating the ability of chemicals toget from the olfactory bulb to the nigrostriatal pathway, as shownrecently using Matrix-assisted laser desorption/ionization(MALDI) mass spectrometry imaging34. To determine whetherdelivery of PX3 peptide into the brain could also be achieved byintranasal administration, we performed experiments usingradiolabelled PX3, and analysed its distribution in severalperipheral organs and in the CNS (Table 1). Followingintranasal administration, we detected PX3 in the periphery,notably in the lung, intestine and kidney, probably resulting frompeptide spill over to the respiratory and digestive tracts duringintranasal administration. As anticipated, the highest levels in theCNS were evidenced in the olfactory bulb. In addition, PX3 wasdetected in all sites of the brain and spinal cord, with a markedpreference for the striatum and mesencephalon, demonstratingthat the PX3 peptide could indeed bypass the blood–brain barrierand target the brain region of interest for us, that is, thenigrostriatal pathway. We next challenged the effect of PX3 onMPTP-induced neurodegeneration. Since dopaminergic neuronalinsult occurs mainly within the first 4 days after acute MPTP

intoxication23, we intranasally delivered the peptides daily, oneday before i.p. MPTP intoxication and during the following 4days. No adverse reaction or clinical signs were noted with thedaily intranasal application of PX2 or PX3 peptides. Histologicalanalysis of the brains 3 weeks after MPTP intoxication revealedthat mice of the control group, which had received the non-protective PX2 peptide, displayed a marked loss of TH-positiveneurons (Fig. 6a,b) and striatal dopaminergic fibres (Fig. 6c,d).Strikingly, when mice had received the PX3 peptide, the lesionswere reduced by 40%, both in the striatum and the SNpc(Fig. 6b,d).

Both X and PX3 induce mitochondrial elongation. Theunderlying mechanism of protection conferred by the X proteinand PX3 against mitochondrial poisoning was investigated fur-ther. Confocal microscopy analysis revealed that neuronsexpressing the X protein exhibited a marked increase in mito-chondrial elongation (Fig. 7a). The same analysis was repeated inneurons expressing XA6A7 or treated with the PX3 peptide, bothunder basal conditions and after rotenone-induced oxidative

0.3

0.2

0.1

0

JC-1

fluo

resc

ence

(590

/530

nm

)

0 2 6 16

Rotenone incubation time (h)

#

MockBDV XwtBDV XA6A7

RO

S a

mou

nt (

a.u.

)

100

50

0

150

#

MockBDV XwtBDV XA6A7

+ Rot + tBHP– Rot

Mock BDV Xwt BDV XA6A7 Mock BDV Xwt BDV XA6A7

– Rot + Rot (16 h)

Mock BDV Xwt BDV XA6A7

– R

ot+

Rot

+ t

BH

P

cH2DCFDA

0.26 0.25 0.27 0.08 0.27 0.08

Figure 3 | BDV X protein protects from rotenone-induced oxidative stress. (a) Representative example of confocal analysis of axonal chambers of

microfluidic devices loaded with the mitochondrial membrane potential (DCm) indicator JC-1. Neurons were mock treated, infected with wt recombinant

BDV (BDV-Xwt) or recombinant BDV bearing mutations in the mitochondrial targeting sequence of X protein (BDV-XA6A7). They were either left untreated

(�Rot) or treated with 1mm Rotenone (þ Rot) added for 16 h in the axonal chamber. The JC-1 signals for JC-1 monomeric form (green fluorescence) and

aggregated form (red fluorescence) are shown, together with the merged image (bottom panels). Inserts show the resulting red/green fluorescent ratio,

whose drop upon rotenone exposure is indicative of mitochondrial depolarization. (b) Time-course analysis of DCm (JC-1 fluorescence ratio) in the axonal

chambers of microfluidic cultures of mock-, BDV-Xwt- and BDV-XA6A7-infected neurons after axonal treatment with 1 mM rotenone, showing that only BDV-

Xwt stabilizes the mitochondrial membrane potential. n¼ 3 independent experiments. (c) Representative example of confocal analysis of axonal chambers

of microfluidic devices loaded with the reactive oxygen species (ROS) indicator H2-CFDA (green). Neurons were treated as described above. The positive

control, that is, treatment with the ROS inducer tert-butyl hydroperoxide (tBHP) is also shown. (d) Quantification of ROS amounts (integrative fluorescence

intensity measurements, expressed in arbitrary units (a.u.)). n¼ 3 independent experiments. Scale bars, 5 mm (a,c). Data are represented as mean±s.d.

#Po10�4; Kruskal–Wallis test.

NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms6181 ARTICLE

NATURE COMMUNICATIONS | 5:5181 | DOI: 10.1038/ncomms6181 | www.nature.com/naturecommunications 5

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stress. Quantitative analysis of mitochondria size distributionconfirmed that the expression of X or PX3, but not mutant XA6A7,resulted in a more filamentous network under basal conditions,with a 60% decrease of short, fragmented mitochondria (o2mm)and a four- to fivefold increase in long mitochondria (48mm;Fig. 7b). Importantly, when a similar analysis was undertakenafter rotenone exposure, we observed that both the X protein andthe PX3 peptide significantly reduced rotenone-induced mito-chondrial fission (Fig. 7c), thus preserving the presence of elon-gated mitochondria.

Both X and PX3 reduce Drp1S616 phosphorylation. We nextassessed whether the enhanced mitochondrial elongation stimu-lated by X or PX3 could result from changes in the expressionand/or activation of proteins involved in mitochondrial fission orfusion processes. We did not find any significant difference in theexpression levels of the fusion proteins Optical Atrophy 1 andmitofusins 1 and 2 or in the fission protein Fis1 (Data not

shown). We next focused on the dynamin-related protein 1(Drp1) because of its central role in the regulation of mito-chondrial morphology in neurons2. Confocal microscopyanalyses suggested that expression of total Drp 1 was notaffected by the expression of Xwt (Fig. 8a). Strikingly, however,levels of Drp1 phosphorylation at serine 616 residue (Drp1S616), aphosphorylation site known to regulate mitochondrial fission35,were strongly reduced in X-expressing or PX3-treated neurons,but not with the non-mitochondrial XA6A7 mutant (Fig. 8b,c).Following treatment with rotenone, we observed increasedDrp1S616 phosphorylation associated with enhanced mito-chondrial fission. Here again, the rotenone-induced increasedDrp1S616 phosphorylation was selectively reduced by Xexpression or PX3 treatment.

DiscussionDuring chronic neurodegenerative diseases such as PD orAlzheimer’s diseases, neuronal loss usually proceeds through a

Sal

ine

MP

TP

LV-XA6A7 LV-Xwt

TH

OD

rat

io (

rela

tive

toco

ntra

late

ral s

tria

tum

)

LV-Xwt

Ipsi Contra

LV-XA6A7

Sal

ine

MP

TP

Ipsi Contra

***

TH

+ n

euro

nal c

ount

s (in

SN

pc)

**

Saline MPTP

0

2,000

4,000

6,000

Saline MPTP

Sham

LV-XwtLV-XA6A7

Sham

LV-XwtLV-XA6A7

SNpc

VTA

0.5

1.0

1.5

2.0

0

Ipsilateral (+LV-Xwt)

Contralateral

BDV X

TH

TH X Merge

Figure 4 | The X protein protects against dopaminergic system degeneration in the MPTP mouse model of PD. (a) Immunofluorescence analysis upon

ipsilateral (Ipsi) injection of LV-Xwt in the SNpc. Brains sections were stained with a BDV X antiserum (red) and tyrosine hydroxylase (TH; green) to

reveal dopaminergic neurons. (b) Enlarged picture of the white box in a is shown, allowing to appreciate the co-localization between staining for TH and X.

(c) Representative photomicrographs of striatal sections immunostained for TH from saline- (top) or MPTP-intoxicated (bottom) mice, which were

unilaterally injected (ipsilateral side) with LVs expressing wt (LV-Xwt) or mutated (LV-XA6A7) X proteins. (d) Quantification of striatal TH immunoreactivity

(optical density, OD). For each mouse, data are expressed as the ratio of OD between the ipsilateral and the contralateral (Contra; non-injected) side, that

is, any ratio 41 is indicative of neuroprotection. (e) Representative photomicrographs of midbrain sections immunostained for TH from the same

animals shown above. The contours of the SNpc are delineated (dotted line) and the ventral tegmental area (VTA) above it, indicated. (f) Enumeration of

surviving THþ dopaminergic neurons in the ipsilateral SNpc. The horizontal bars represent the mean number of THþ neurons. The investigator performing

all quantifications was blinded to the treatment groups during the whole analysis process. Each symbol represents one animal. n¼ 3 independent

experiments. Scale bars, 100mm (a,e), 15 mm (b) and 250mm (c). **Po0.01; ***Po0.001; Mann–Whitney test.

ARTICLE NATURE COMMUNICATIONS | DOI: 10.1038/ncomms6181

6 NATURE COMMUNICATIONS | 5:5181 | DOI: 10.1038/ncomms6181 | www.nature.com/naturecommunications

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protracted dying-back pattern in which dysfunction of nerveendings and axonal demise long precedes neuronal cell bodydestruction36. Thus, protecting nerve endings from degeneration

appears an important goal in order to achieve efficientneuroprotection in the brain. Although several approaches havebeen undertaken to specifically buffer axonal stress, such astreating with neurotrophins or increasing antioxidant defences37,they have yielded unequal success because of the dual role ofthese molecules in both axonal damage and signalling. Here, ourdata show that the X protein promotes a specific axoprotectiveeffect and significant neuroprotection in a mouse model of PD,notably by modulating mitochondrial dynamics.

Our results made a critical distinction between protectionagainst somatic cell death, which was only modest in vitro, andthe strong axonal protection conferred by the X protein thattranslated thereafter in efficient protection in the animal model.Our initial observations were facilitated by the use of orientedcultures grown in microfluidic chambers. With this setting, theretrograde propagation of the degenerative process towards thecell body of neurons upon axonal exposure to rotenone isdelayed, presumably because it is buffered by the anterogradetransport of undamaged material, thus deferring somaticdegeneration38,39. The differences between somatic versusaxonal protection conferred by the X protein or the PX3peptide are likely owing to the fact that the molecularmechanisms involved in somatic and axonal degeneration differsignificantly21,40,41. Axons are enriched in anti-apoptotic

#

F-R-Cha-K-F-R-Cha-K

MPP MPP_X1–29 (PX1)

MPP_X30–59 (PX2)

MPP_X59–87 (PX3)A

xona

l fra

gmen

tatio

n in

dex

0.3

0.2

0.1

0

0.4

Mock PX1 PX2 PX3

0 5 16 87

αHelix

30 min

1 μM

2 μM

90 min

PX3 Tom20 Merge

Flu

ores

cenc

ein

tens

ity

PX3

240 min

Distance (μm)

00 50 100 150 200

100

200

Figure 5 | A peptide covering the carboxy-terminal 29 amino acids of X protein displays axoprotective properties similar to that of the full-length

protein. (a) Design of MPP-X peptides. Top, schematic representation of the X protein. Black bars indicate the limits of each peptide. Bottom, the same

mitochondrial targeting, cell-permeable sequence (MPP) was added to each part of the X protein to obtain PX1, PX2 and PX3 peptides. The MPP sequence

is shown on the left (Cha, cyclohexylalanine). (b) The PX3 peptide enters neurons and is targeted to mitochondria. Neurons were grown on glass coverslips

for 9 days (5� 104 cells for each 12-mm-diameter coverslip). PX3 was added to the culture medium at different concentrations (1 or 2 mM) for various

durations (30–240 min). Cells were processed for immunodetection of the peptide (using the anti-BDV X mouse polyclonal serum, green) and

mitochondria network (anti-Tom20, red) and analysed by confocal microscopy. The lower panels show an enlarged portion of an axonal process. To better

appreciate co-localization, below the pictures are plotted the intensity profiles of green and red fluorescent signals along the portion of the axon highlighted

by the white line. (c) Analysis of rotenone-induced axonal fragmentation. Neurons grown in microfluidic devices were either mock treated or treated

with the different peptides (2 mM). Axonal fragmentation was quantified after treatment with 1 mM rotenone that was added in the axonal chamber for

16 h. Each symbol refers to the fragmentation index calculated for one microfluidic culture and horizontal bars refer to the means. n¼ 3 independent

experiments. Scale bars, 10mm (top panels), 5 mm (bottom panels). #Po10�4; Kruskal–Wallis test.

Table 1 | Tissue concentrations of [125I]-labelled PX3peptide following intranasal administration.

pmol g� 1*

Peripheral tissuesLung 5.84±1.68Heart 2.81±0.85Liver 2.04±0.40Intestine 6.27±0.92Kidney 5.82±1.55

Central nervous systemOlfactory bulb 8.16±1.12Cortex 2.18±0.75Hippocampal formation 3.14±0.34Striatum 5.33±2.00Ventral mesencephalon 4.52±0.11Dorsal mesencephalon 3.99±1.38Cerebellum 2.61±0.31Spinal cord 3.55±0.30

*Data are represented as mean±s.e.m. n¼7 animals.

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signalling molecules, such as the NADþ signalling pathway,which controls axonal fate after local insults42,43. Similar to thefindings reported here, NADþ protects axons, but not the soma,upon global and/or local insults19,44.

Mitochondrial network dynamics plays a major role inmitochondria quality control and has emerged as a central actorin neurodegeneration45–47. Generally, the mitochondrial networkbecomes fragmented in response to stress, in order to facilitatemitophagy of damaged mitochondria, whereas a filamentousnetwork ensures a better response to oxidative stress, boththrough dilution of stress molecules and compensatorymechanisms48,49. We observed that mitochondrial elongationstimulated by the X protein or the PX3 peptide was accompaniedby reduced Drp1S616 phosphorylation. Since Drp1 phospho-rylation occurs in the cytoplasm and it is recruited at the outermitochondrial membrane for fission, it is puzzling that only themitochondrial-targeted X, as opposed to the mutant protein,was able to decrease Drp1S616 phosphorylation. In addition,co-immunoprecipitation experiments did not reveal anyinteraction between Drp1 and X proteins (data not shown). Wetherefore postulate that the X protein may induce modificationsof the activity of cellular kinases through mitochondria–cytoplasm cross talk. Phosphorylation of Drp1S616 is mediatedby multiple kinases, including CDK1 during mitosis35, ERK1/2under high glucose conditions50 or PKCd during hypertension51.

Interestingly, very recent results showed that CDK5 is involved inthe phosphorylation of Drp1S616 in cultured rat neurons52.Alternatively, the impact of the X protein on Drp1S616

phosphorylation may be secondary to its action on therespiratory chain by buffering ROS production and preservingmembrane potential, which also are likely to impact onmitochondrial fission. Thus, a full understanding of themolecular mechanisms whereby the X protein acts on thisbalance of kinase activities and on Drp1S616 phosphorylationclearly requires further research.

Importantly, we showed that the C-terminal end of the Xprotein, enclosed within PX3, was able to protect againstneurodegeneration in vitro and in vivo at levels comparable tothe full-length protein. We cannot however totally exclude thepossibility that other parts of the protein may also be effective.Indeed, we could not formally show that PX1 and PX2 peptideswere actually delivered to cells because of a lack of reagents todetect them. However, the well-established flexibility andversatility of the MPP transporter also present in PX1 and PX2suggest that it most likely the case. Notwithstanding suchpossibility, the intranasal administration of PX3 markedlyreduced axonal damage and neuronal loss in the MPP mousemodel of PD. This relatively minimally invasive method holdsgreat promise for future therapeutics. Often, efficient drugcandidates in vitro were found to exert little impact on the

PX2

PX3

**

PX2

PX3MP

TP

Sal

ine

PX3

0

10,000

7,500

Saline MPTP

***

Str

iata

l TH

OD

0.1

0.2

PX2 PX3

Sal

ine

MP

TP

TH

+ n

euro

nal c

ount

s (in

SN

pc)

0.3

Saline MPTP

PX2

PX30

2,500

5,000

Figure 6 | Intranasal administration of PX3 protects neurons from neurodegeneration in MPTP-treated mice. (a) Representative photomicrographs

of striatal TH immunostaining from saline-treated or MPTP-intoxicated mice that had received intranasal administration of PX2 or PX3 peptides.

(b) Quantification of striatal TH immunoreactivity (optical density, OD). (c) Representative photomicrographs of mesencephalic sections immunostained

for TH from the same animals. The contours of the SNpc are delineated (dotted line) (d) Enumeration of surviving THþ dopaminergic neurons in the

whole SNpc. The investigator performing the quantifications was blinded to the treatment groups during the whole analysis process. Each symbol

represents one animal. n¼ 3 independent experiments. Scale bars 100mm (a), 250mm (c). **Po0.01; ***Po0.001; Mann–Whitney test.

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8 NATURE COMMUNICATIONS | 5:5181 | DOI: 10.1038/ncomms6181 | www.nature.com/naturecommunications

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outcome of neurodegenerative diseases in animal models or inclinical trials because of their inability to be adequately deliveredacross the blood–brain barrier. The identification of anatomicalroutes connecting the nasal passages, the brainstem and the spinalcord has paved the way for new treatment paradigms of CNSdiseases by intranasal administration, using drug candidates suchas peptides53 or liposome-encapsulated molecules54.

Neurodegenerative diseases represent a considerable human,societal and economic burden, which is continually growing withthe ageing of populations worldwide. Many emerging experi-mental neuroprotection strategies aimed at controlling apoptosisact at the level of post-mitochondrial effectors, such as caspaseinhibition or by preventing mitochondrial membrane permeabi-lization55. Thus, there is a clear window of opportunity fortargeting upstream phenomena such as the regulation ofmitochondrial homeostasis and oxidative stress injury,especially when considering the growing evidence of the role of

MergeTub Tom20 MergeTub Tom20

Mock + LV-Xwt

Mito

. siz

e re

part

ition

(%

)

#

MockLV-XwtLV-XA6A7

– RotPX3

#

# ##

+ Rot (2 h)

Mito

. siz

ere

part

ition

(%

)

#

#

##

# # #

0

20

80

100

60

40

< 2 μm < 4 μm < 6 μm < 8 μm > 8 μm

§

0

20

80

100

60

40

< 2 μm < 4 μm < 6 μm < 8 μm > 8 μm

MockLV-XwtLV-XA6A7PX3

Figure 7 | The X protein and PX3 trigger filamentation of the

mitochondrial network both under basal conditions and after oxidative

stress. (a) Representative example of a confocal analysis of non-

transduced neurons (Mock) and of neurons transduced with the LV

expressing X (LV-Xwt). Neurons were stained for neuronal bIII-tubulin (Tub;

red) and the mitochondrial marker Tom20 (green). Lower panels show a

higher magnification of the boxed area to illustrate the impact of the X

protein on mitochondrial elongation. (b,c) Analysis of mitochondria (Mito.)

size distribution in control neurons (Mock), in neurons transduced with LVs

expressing either Xwt (LV-X) or XA6A7 (LV-XA6A7), as well as in neurons

treated with PX3. Analysis was performed (b) without treatment (�Rot) or

(c) after rotenone (Rot) treatment (10 nM) for 2 h (þ Rot). Data were

obtained from at least 15 neurons in each group and for each experiment,

and are expressed as mean±s.d. n¼ 3 independent experiments. The

investigator performing the quantification was blinded to the treatment

groups during the whole analysis process. Scale bars, 5 mm. #Po10�4;

yPo10� 3; Kruskal–Wallis test.

Moc

k

– Rot + Rot (2 h)

pDRP1(S616)

Mock

LV-Xwt

LV-XA6A7

0

1

2

PX

3

#

+ Rot– Rot

PX3

1.5

0.5

§

§ §

Moc

k

Tom20 DRP1 Merge

Tom20 DRP1 Merge

Rel

ativ

e pD

RP

1(n

orm

aliz

ed o

n βI

II-T

ub)

LV-X

wt

LV-X

A6A

7LV

- X

wt

a

b

c

Figure 8 | The X protein and PX3 block Drp1S616 phosphorylation both

under basal conditions and after oxidative stress. (a) Representative

example of a confocal analysis of immunostaining for the mitochondrial

marker Tom20 (green) and total Drp1 (red) in control neurons (Mock) or in

neurons transduced with the LV expressing Xwt (LV-Xwt). Merged images

are show on the right. Similar results were observed for at least 20 cells for

each experiment. n¼4 independent experiments. (b) Confocal analysis of

immunostaining for phospho-Drp1S616. Analysis was performed under basal

conditions (� Rot) or after rotenone (Rot) treatment (10 nM) for 2 h

(þ Rot 2 h). (c) Quantitative analysis of phospho-Drp1S616, showing that

Xwt protein or PX3 block rotenone-induced Drp1S616 phosphorylation. Scale

bars, 10mm. Each measure was obtained by measuring the integrative

intensity of three randomly chosen fields, normalized on total bIII-tubulin

(Tub) staining of the same area, using ImageJ software and fixed thresholds.

Data are expressed as mean±s.d. n¼ 6 independent experiments.

#Po10�4; yPo10� 3; Kruskal–Wallis test.

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NATURE COMMUNICATIONS | 5:5181 | DOI: 10.1038/ncomms6181 | www.nature.com/naturecommunications 9

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mitochondrial dynamics in neurodegeneration56. Our findingsshow that the X protein and the PX3 peptide target a majorculprit in neurodegeneration. These virus-derived peptidestherefore define a new class of neuroprotective agents withgreat potential for the treatment of patients suffering from PD.Moreover, the effects of PX3 peptide may be therapeuticallybeneficial in other diseases where impaired mitochondrialdynamics or function is central to disease pathogenesis.

MethodsAnimals. Eight-week-old male C57BL/6 mice (Charles River Laboratories) wereprovided with food and water ad libitum and maintained in a temperature-con-trolled environment in a 12/12 h light–dark cycle. Animal handling and care wasperformed in accordance with the European Union Council Directive 86/609/EEC,and experiments were performed following the French national chart for ethics ofanimal experiments (articles R 214- 87 to 90 of the ‘Code rural’). Our protocolreceived approval from the local committee on the ethics of animal experiments(permit number: 13CB-U1043 DD-11), and all efforts were made to minimizeanimal numbers and suffering.

Cells and virus strains. HEK-293T cells (ATCC CRL-3216) were passaged 1:10twice a week in DMEM (Gibco) supplemented with 10% fetal calf serum (Gibco),2 mM L-glutamine (GE Healthcare) and 0.2 mg ml� 1 geneticin (Gibco). Cell-released virus stocks were prepared as described57,58 using Vero cells (ATCC CCL-81) infected with either BDV (Giessen strain He/80) or recombinant virusesexpressing wt or mutated X (rBDV-LRD-Xwt and rBDV-LRD-XA6A7, a kind giftfrom U. Schneider, Freiburg University, Germany). Timed pregnant Sprague–Dawley female rats were purchased from Janvier Labs. Primary cortical neuronswere prepared from rat embryos at gestational day 17. After dissection, cortextissue was dissociated by a 15-min incubation at 37 �C in PBS containing10 U ml� 1 Papain (Worthington) followed by a gentle dissociation in PBScontaining 1.5 mg ml� 1 bovine serum albumin (BSA) and 1.5 mg ml� 1 trypsininhibitor (from chicken egg, Sigma-Aldrich). After centrifugation through a 4%BSA cushion, neurons were plated on culture dishes coated with 0.5 mg ml� 1 poly-DL-ornithine (overnight, Sigma-Aldrich) and 5 mg ml� 1 laminin (2 h, Roche).Neuronal cultures were maintained in complete neuronal culture mediumcomposed of serum-free Neurobasal (Gibco) supplemented with 2 mML-glutamine, 100 mg ml� 1 penicillin/streptomycin (Gibco) and 2% B-27supplement (Gibco).

Microfluidic culture chambers and neuronal culture setting. Microfluidicchips were prepared as described elsewhere18,19. In brief, culture chambers weremoulded with polydimethylsiloxane (Sylgard 184, Dow Corning; 9:1 ratio withcuring agent), which was poured into resin SU-8 silicon masters having acomplementary positive relief pattern of the cell culture compartments andmicrochannels. The resulting elastomeric polymer prints were detached andreservoirs were created using a biopsy puncher. After cleaning with isopropanoland air-drying, polymer prints and glass coverslips were treated for 1 min with anair plasma generator. Both elements were then bonded together, hydrated withsterile water, sterilized under ultraviolet for 15 min and coated with poly-DL-ornithine and laminin. Primary neuronal cultures prepared as described abovewere adjusted to a final concentration of 5� 107 cells per ml and cell suspensionswere seeded in the somatic chambers by introducing 3 ml in the upper reservoir.After 1 or 2 min, when neurons had attached to the substrate, reservoirs were filledwith complete neuronal culture medium. A 10-ml differential medium volume wasmaintained between the somatic and axonal chambers to ensure a permanenthydrostatic flux. Neurons were infected with the different cell-free BDV strainsdescribed above 1 day after plating or they were transduced with LVs 3 days afterplating.

Construction and production of LVs. The genes encoding BDV N (nucleopro-tein), P (phosphoprotein), X, mutated XA6A7 (ref. 10) or green fluorescent proteinwere amplified by PCR and cloned into the pTrip LV backbone (kind gift fromDr P. Charneau, Pasteur Institute, Paris) using BamHI and XhoI restriction sites,downstream the constitutive cytomegalovirus enhancer/chicken b-actin (CAG)promoter. To produce the LVs, 10 T150 flasks plated with 1.2� 107 HEK-293Tcells each were transfected with packaging plasmids psPAX2 and pMD2.G (bothfrom Addgene), and pTrip expressing the different genes (respectively 14.6, 7.9 and22.5 mg of endotoxin-free prepared plasmids mixed with 100 ml of GeneJuice(Merck) for each T150). Culture medium was removed the next day and replacedby warm OptiMEM (Gibco). Supernatants were collected 48 and 72 h posttransfection, cleared by low-speed centrifugation and filtered using a 0.45-mm filter,and lentiviral particles were purified by ultracentrifugation through a 20% sucrosecushion (25,000 r.p.m., 2 h, 4 �C; SW32Ti rotor, Beckman Coulter). Ice-cold PBSwas added to each centrifugation tube and lentivector-containing pellets were let toswell under gentle agitation overnight at 4 �C, before being recovered, aliquotedand stored at � 80 �C. Lentivector titres were determined by counting foci 72 h

after transduction of HEK-293T cells with serial dilutions. In all our experiments,titres varied from 8� 108 to 3� 109 TUs per millilitre, and LVs were used at amultiplicity of transduction of 5 (TUs of vector for each cell) for in vitro neuronaltransductions.

Induction of axonal or somatic oxidative stress. Twelve-day-old neuronal cul-tures were subjected to oxidative stress by adding the respiratory chain complex Iinhibitors rotenone (1mM, diluted in DMEM containing 1 g l� 1 glucose (Invi-trogen), supplemented with 2 mM glutamineþ 1% penicillin/streptomycinþ 2%B-27þ 1% N2 supplements (Invitrogen)) or MPPþ (1-methyl-4-phenylpyr-idinium ion, 10mM in complete neuronal culture medium). The microtubuleinhibitor colchicine (10 mM, complete neuronal culture medium) was used as anon-mitochondrial stress control. Toxins were added in the somatic or axonalchambers for somatic or axonal stress, respectively.

Immunofluorescence and imaging in microfluidic chambers. Neurons in themicrofluidic cultures were fixed for 40 min at room temperature with PBS con-taining 4% paraformaldehyde (PFA), permeabilized using PBSþ 0.1% TritonX-100 during 20 min, rinsed with PBS and blocked for 2 h with PBSþ 2.5% normalgoat serumþ 3% BSA (blocking buffer). Incubation for at least 2 h at room tem-perature with primary antibodies diluted in blocking buffer was followed, afterextensive washes in PBS, by 1 h incubation at room temperature with fluorescentlyconjugated secondary antibodies diluted in PBS. For TOPRO3 staining, somaticchambers were incubated with TOPRO3 (1:1,000 in PBS; Invitrogen) for 10 minand then rinsed twice in PBS. All times for incubations and washes were reducedby 50% for neurons grown in standard coverslips. Fluorescence-based analyses andmeasurements were performed on either Zeiss LSM-510 or Zeiss LSM-710 invertedconfocal microscopes with a � 40 objective (� 63 objective for the analysis ofmitochondrial network morphology and quantification of phospho-Drp1S616

immunoreactivity). Immunofluorescence analyses of Drp1 were performed usinganti-phospho-Drp1S616 (Cell Signaling Technologies, diluted 1:1,000). Quantifica-tion of fluorescence intensities was performed using the threshold-based fluores-cence quantification module of ImageJ software. All data were normalized onbIII-tubulin staining.

Analysis of axonal fragmentation. The analysis of axonal degeneration wasadapted from the image segmentation method described by Kilinc et al.18 Theanalysis was performed both by phase contrast observation and afterimmunostaining of axonal bIII-tubulin (Sigma-Aldrich, diluted 1:1,000). Intactaxons present linear phase contrast morphology and a homogeneous tubulinstaining delineating the axon shaft, whereas blebbed or severed axons exhibit afragmented morphology and punctate tubulin network. For each microfluidicculture, the total bIII-tubulin staining area was measured on four randomly chosenfields in low-density axonal areas of the axonal chamber (MetaMorph softwareanalysis, fixed thresholds). Low-density axonal areas were preferred for imageanalysis because an extensive overlap of neuronal processes would complicate thedefinitive identification of individual axons. Then, the number of tubulin spots offragmented axons was manually counted (Imaris software, Spot counting for‘clicking’ records), and the ratio between the number of spots and the total stainingarea was defined as a fragmentation index.

To control for infection or transduction efficiencies, immunostaining for BDVantigens (using homemade rabbit antisera raised against N, P or X proteins) wereperformed together with bIII-tubulin. To ensure that the hydrostatic flux hadindeed prevented drugs from diffusing back to the somas through the channels,TOPRO3 (Invitrogen) staining was performed in somatic chambers and nuclearintegrity was checked for each culture. The observation of 425% fragmented/deadnuclei in control or axonal-damaged cultures was an exclusion criterion.

Synthesis and use of X-derived peptides. Peptides covering the N-terminal(PX1, aa 1–29), middle (PX2, aa 30–59) or C-terminal (PX3, aa 59–87) parts ofBDV X protein (GenBank: ABW81015.1) coupled to the MPP sequence weresynthesized to 495% (in vitro studies) or 499% (in vivo studies) purity (Geno-sphere Biotechnologies). For in vitro experiments, neurons were grown for 12 daysbefore replacing the medium by fresh complete neuronal culture medium con-taining 2 mM of the peptides. The cultures were maintained for 90 min at 37 �C, 5%CO2 before any treatment or analysis to ensure peptide penetration into neuronalmitochondria. For ICV delivery, peptides were injected as described below. Forintranasal peptide delivery, each mouse was cradled in a vertical position and thepeptide solution (1 mg ml� 1 solution in saline: H2Oþ 0.9% NaCl) was appliedusing a pipette and tip. A quantity of 10 ml drops were placed onto the mice nostrilsand then absorbed by the mouse daily from the day before to the third day afterMPTP intoxication.

Determination of PX3 content in organs and brain structures. Radioiodinationof PX3 peptide (499% pure) was performed with [125I] using a Bolton–Hunterprocedure (Custom Iodination service, PerkinElmer, Billerica, USA). The[125I]-labelled PX3 (initial specific activity: 2,200 Ci mmol� 1) was further purifiedby high-pressure liquid chromatography to eliminate remaining unbound iodine.

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On the day of each experiment, the activity (c.p.m. per microlitre) of the labelledpeptide was determined by replicate sampling and counting using a 1,450Microbeta Trilux counter (PerkinElmer). Intranasal delivery of the PX3 peptidewas performed as described above. One hour after the last peptide administration,a detailed necropsy was performed on each animal, exercising care to avoidcross-contamination of tissues. After gross dissection of several peripheralorgans, discrete brain areas were microdissected under magnifying glasses with arazor blade and forceps (Fine Science Tools) by using a micropunch technique.Control animals received the same volume of saline intranasally and wereprocessed similarly. The weight of each dissected tissue was determined with aprecision balance before gamma counting. Tissue concentrations (picomolesper gram of tissue) were calculated using the specific activity of the administered[125I]-PX3, after subtraction of background radioactivity, corresponding toresults of the counting of each corresponding organ (or brain area) from controlanimals.

Stereotaxic surgery. Unilateral stereotaxic injections of LVs were performed intothe SNpc of 8-week-old mice at the following coordinates: Anterior-Posterior (AP)� 2.6 mm relative to Bregma, Medial-Lateral (ML) þ 1.2 mm and Dorsal-Ventral(DV) � 4.4 mm from the dura. Each mouse was injected with 1.106 TUs of vectorsin a volume of 1 ml at the flow rate of 0.1 ml min� 1 using a 10-ml microsyringe(Hamilton). Mice were rested post operation for 2 weeks before MPTP intoxica-tion. For ICV delivery of peptides, cannulas (Phymep) were stereotaxicallyimplanted into the lateral ventricle through a hole drilled in the skull at the fol-lowing coordinates: AP 0.0 mm relative to Bregma, ML þ 1.0 mm, and DV� 2.0 mm from skull. Dental cement was used to fix the cannula guide to the skull(polycarboxylate, Sigma-Aldrich) and to prevent occlusion. Mice were rested postoperation for 2 weeks before peptide delivery and subsequent MPTP intoxication.Peptide was injected through the cannulas by fixation of an injector (Phymep)connected to a peristaltic pump, the day before and every day for 3 days afterintoxication (2 nmol in 2 ml for each injection, injection rate: 0.5 ml min� 1).

MPTP intoxication and tissue processing. For MPTP intoxication, mice wereinjected i.p. four times at 2 h intervals with either 18.5 mg kg� 1 MPTP-HCl (as freebase, Sigma-Aldrich, ref. no. M0896) or a corresponding volume of 0.9% NaClsolution. Mice were kept for 3 weeks to ensure lesion stabilization before killing.Mice were anaesthetized with a mixture of ketamine hydrochloride (100 mg kg� 1,i.p.) and xylazine (15 mg kg� 1, i.p.) dissolved in isotonic saline sterile solution orwith sodium pentobarbital (150 mg kg� 1, i.p.), and transcardiacally perfused at aflow rate of 5 ml min� 1 with PBS (20 ml) followed by ice-cold 4% PFA (100 ml).After extraction from the skull, brains were further post fixed overnight in fresh 4%PFA solution and cryoprotected with 30% sucrose in phosphate buffer. Brains werethen frozen by immersion in � 30 �C isopentane and kept at � 80 �C until furtherprocessing. Series of striatal and mesencephalic coronal sections (20-mm thick)were collected using a freezing microtome (Thermo Scientific) and stored in PBScontaining 0.3% sodium azide.

Immunohistochemistry and image analysis. For immunohistochemical staining,free-floating brain sections were first quenched for 5 min in 20% (v/v) methanoland 1% (v/v) hydrogen peroxide diluted in PBS, then blocked for 30 min in a 4%solution of BSA diluted in PBS-0.3% Triton X-100 and incubated overnight at 4 �Cwith a primary antibody directed against TH (1:500 dilution, US Biological). Afterextensive washing in PBS, the sections were incubated for 1 h with biotinylatedsecondary antibody (1:250 dilution; Vector Laboratories). Staining was visualizedby the ABC method (Vector Laboratories) with 3,30-diaminobenzidine as theperoxidase substrate. TH-positive neurons were quantified stereologically on reg-ularly spaced sections covering the whole SNpc. The SNpc was delineated59 andTH-positive cell bodies were counted by bright-field microscopy, using a Leitzmicroscope equipped with image analysis software (Mercator, ExploraNova, LaRochelle, France). Of note, the analysis was focused on the SNpc, since ventraltegmental area dopaminergic neurons are much less sensitive to MPTP59. StriatalTH optic densitometry was quantified using the MCID software (MCID analysis7.0). Staining background measured in the cerebral cortex was subtracted fromstriatal density measurements. The investigator performing the quantification wasblinded to the treatment groups during the whole analysis process.

Analysis of mitochondrial membrane potential. Axons were stained with JC-1dye (2mM in PBS; Life Technologies) following recommendations of the manu-facturer. In brief, JC-1 was added to the culture medium for 45 min at 37 �C, 5%CO2, washed twice with PBS and analysed by confocal microscopy using 488 nmexcitation together with 530 and 585 nm band-pass emission filters, while main-taining the cells at 37 �C and 5% CO2. Total fluorescence intensity was measuredfor each emission band pass with fixed thresholds, and ratios between ‘red’(585 nm, aggregated JC-1) and ‘green’ (530 nm, monomeric JC-1) were determinedfor each culture (means of four randomly chosen fields for each microfluidicculture).

Measurement of ROS production. The culture medium was removed from theaxonal or somatic chambers and replaced by pre-warmed PBS containing carboxy-20,70-dichlorodihydrofluorescein diacetate (5 mM in PBS; Life Technologies) for45 min at 37 �C, 5% CO2. After two washes in PBS, cultures were returned to warmculture medium for 30 min. Cells were fixed and the integrative fluorescence wasmeasured on three randomly chosen fields for each axonal chamber. Tert-butylhydroperoxide (Life Technologies) was used as a positive control of ROS detection.ROS amounts were detected by fluorescence (excitation/emission: 495/529 nm) andquantified by measuring integrative emission signal intensities for each culture(mean of four randomly chosen fields for each microfluidic culture, using ZeissLSM-510 confocal).

Analysis of mitochondrial network morphology. Neurons were grown for 9 daysat low density on 12–mm–diameter glass coverslips placed in 24-well plates(5� 104 cells in each well). Transduction with LVs was performed on day 3,whereas peptide was added to the medium on day 9. Neurons were left untreated orsubjected to rotenone treatment (5–100 nM for 2 h, diluted in PBS), rinsed, fixedand directly stained for neuronal marker (bIII-tubulin) and mitochondria (Tom20,Santa Cruz Biotechnology). Confocal pictures were taken and blinded to theinvestigator before image analysis. The sizes of mitochondria in all neuronalextensions of randomly selected neurons were determined using ImageJ softwareand mitochondria were classified in size categories (ranging from o2 mm to48 mm). Each category was expressed as percentages relative to the size of the totalmitochondrial network for a given neuron.

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AcknowledgementsThis work was supported by grants from INSERM, ANR-10-Blanc-1322 (D.G.-D. andJ.-M.P.), ANR-12-EMMA-0016-01 (D.G.-D. and S.H.), ‘Investissements d’avenir’ pro-gramme ANR-10-IAIHU-06 (S.H.), Inserm Transfert CoPoC fund (D.G.-D. and S.H.),the Fondation pour la Recherche Medicale (‘Equipe FRM 2009’, D.G.-D.) and the CNRS(D.G.-D.). We thank M. Poenisch, U. Schneider and P. Staeheli for their insightfuldiscussions and gift of reagents; C. Rampon for mouse stereotaxy facility usage; M.A.Daussion and personnel of UMS006 for their expert care of mice; S. Allart and D. Sapedefor their technical assistance at the imaging facility of INSERM UMR 1043; J.F. Eleouetand Y. Gaudin for their input in the analysis of X structure; P. Belenguer and M.C.Miquel for their feedback on mitochondrial network analysis and comments on themanuscript; and E.C. Hirsch, R. Liblau, A. Saoudi and C.E. Malnou for their criticalreading of the manuscript and editorial comments.

Author contributionsM.S. participated to the design and coordination of the study, carried out in vitroexperiments, helped to set up in vivo models, analysed data, performed statistical ana-lyses, drafted and wrote the manuscript. A.B. performed in vivo studies including ste-reotaxy, mouse perfusion and brain processing, and contributed to data analysis. Y.M. setup the in vivo models, performed stereotaxy, mouse perfusion, brain processing, tissueimmunohistochemistry, THþ neuronal counting and data analysis. A.T. and C.F. per-formed molecular biology and cell culture, and were in charge of the construction andproduction of LVs. C.A.F. performed analyses of mitochondrial function and mor-phology. J.M.P. set up and developed initial neuronal cultures in the microfluidic devices,contributed to data analysis and provided a critical reading of the manuscript. S.H. set upthe in vivo models, performed data analyses and gave critical feedback on the in vivoexperiments and on the manuscript. D.G.-D. conceived, designed and supervised theproject, performed part of in vivo experiments and wrote the manuscript.

Additional informationSupplementary Information accompanies this paper at http://www.nature.com/naturecommunications

Competing financial interests: The authors declare no competing financial interests.

Reprints and permission information is available online at http://npg.nature.com/reprintsandpermissions/

How to cite this article: Szelechowski, M. et al. A viral peptide that targets mitochondriaprotects against neuronal degeneration in models of Parkinson’s disease. Nat. Commun.5:5181 doi: 10.1038/ncomms6181 (2014).

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2. Recherche des mécanismes moléculaires et cellulaires à la base du

pouvoir neuroprotecteur de la protéine X.

Si le pouvoir neuroprotecteur de la protéine X du BDV est désormais acquis, de

nombreuses inconnues subsistent sur son mode d'action et ses effets au sein des neurones.

Néanmoins, nous avons démontré qu’ils étaient strictement dépendants de la présence de la

protéine X dans les mitochondries, qui conduit à une filamentation accrue du réseau

mitochondrial. Je me suis donc intéressée aux modalités d’adressage subcellulaire de la X que

nous verrons dans le paragraphe II) et à l’effet de cette protéine sur le fonctionnement

cellulaire et notamment mitochondrial. J’ai ainsi analysé son impact sur la bioénergétique

mitochondriale dans les neurones. J'ai mesuré divers paramètres, dont la respiration, le

potentiel de membrane et la production de ROS (cette fois sur l’ensemble des neurones et

non pas uniquement sur leurs segments axonaux distaux), en conditions basales ou après

induction d’un stress oxydant.

a. Matériels et Méthodes

• Cultures de neurones primaires

Les cortex d'embryons de rat (E17, Sprague-Dawley) sont disséqués, sous loupe

binoculaire, et incubés dans du PBS contenant 10U/ml de papaïne (Worthington) durant 15

minutes à 37°C. Ensuite, pour arrêter la digestion, ce milieu est remplacé par du PBS contenant

1,5 mg/ml d’albumine de sérum bovin et 1,5mg/ml d'inhibiteur de trypsine (Sigma), puis le

tissu est dissocié avec une Pasteurette de 1,5ml. La suspension cellulaire est ensuite filtrée à

70 µM, puis centrifugée à 1000rpm pendant 10min. Après un nouveau passage dans du milieu

Neurobasal (Gibco), les cellules sont déposées sur un coussin de 4mL de BSA 4% puis soumises

à centrifugation à 1000rpm, 10 minutes. Les neurones sont ensemencés sur des boîtes de

cultures contenant éventuellement des lamelles de verre, préalablement recouvertes de

poly-ornithine (0,5mg/mL) et de laminine (20µg/mL) (Roche), ou en plaques de 24 puits (250

000 neurones/puits) ou encore dans des plaques 96 puits noirs à fond transparent (30 000

224

225

neurones/puits) et cultivés à 37°C et 5% de CO2 dans du milieu Neurobasal (Gibco),

supplémenté avec 0,5mM de glutamine, 1% de pénicilline/streptomycine (PS) et 2% de

supplément B-27 (Invitrogen).

• Transduction

Trois jours après leur mise en culture, les neurones primaires sont transduits avec des

lentivecteurs exprimant soit la protéine X (LV-X), le mutant XA6A7 (LV-XA6A7) ou la GFP (LV-GFP)

avec une multiplicité de transduction de 3. La construction des lentivecteurs est détaillée dans

(Szelechowski, Betourne et al. 2014) et (Ferre, Davezac et al. 2015).

• Induction de stress oxydatif

Un stress oxydatif est induit par addition de roténone, un inhibiteur du complexe I de

la chaîne respiratoire. Les neurones sont incubés 2h avec 20nM de roténone dans du Hank's

balanced salt solution (HBSS) + 1% SVF pour la mesure de la respiration mitochondriale et avec

20, 50, 100, 500 ou 1000nM de roténone pendant 4h pour les mesures du potentiel de

membrane.

• Mesure de la respiration mitochondriale

La consommation d’oxygène est mesurée grâce à l’analyseur de flux extracellulaire

nommé SeaHorse (XF24 analyzer, Bioscience). Dans chaque puits de mesure, une sonde

contenant un fluorophore sensible à la concentration d’O2 est immergée à environ 200 µm

des cellules, permettant une analyse en temps réel. Le jour de l'expérience, les neurones sont

équilibrés durant 1h à 37°C dans du milieu DMEM sans rouge phénol complémenté avec

10mM glucose, 2mM glutamine, 2mM pyruvate à pH 7,4. Les drogues sont diluées dans ce

même milieu et injectées par système approprié à une concentration finale de :

Oligomycine, 0,6 µM,

FCCP, 6 µM,

226

227

Roténone, 50 nM,

Antimycine, 50 nM.

• Mesure du potentiel de membrane

Après 10 jours de culture en plaque 24 puits (250 000 cellules/puits), le milieu de

culture des neurones est remplacé par du HBSS contenant 2µM de sonde JC-1 (Invitrogen)

pendant 30min à 37°C, 5% de CO2. Après plusieurs rinçages en HBSS, l'émission de

fluorescence (excitation à 485nm, lecture à 530nm (vert) et 590nm (rouge)) est mesurée grâce

au VarioSkan (Thermo Scientific). Le rapport des valeurs obtenues (Rouge/Vert) est utilisé

comme indicateur du niveau du potentiel de membrane (explications dans résultats). Les

mesures sur des neurones incubés avec 100µM de FCCP (entraînant une chute drastique du

m), pendant 4 h 30 servent de témoins négatifs.

• Mesure de la production de ROS

Les neurones en plaque 24 puits (250 000 cellules/puits) sont cultivés durant 10 jours.

Ils sont ensuite incubés avec du HBSS + Ca2+/Mg contenant 25µM de la sonde diacétate 2',

7'dichlorodihydrofluoresceine (H2DCFDA, Invitrogen) pendant 30 minutes à 37°C, 5% de CO2.

En présence de ROS, la fluorescéine réduite à l’état basal est oxydée et émet alors à 520nm

après une excitation à 492nm (vert). Après plusieurs lavages en HBSS préchauffé, l'émission

est mesurée dans chaque puits grâce au VarioSkan.

• Mesure de la production d’ATP

La détection de l’ATP en luminescence se fait avec le Kit Promega (CellTiter-Glo

Luminescent Cell Viability Assay). Une fois le réactif CellTiter-Glo formé selon les indications

du fabricant, 100 µL du réactif sont ajoutés au 100 µL de milieu dans lequel se trouvent les

neurones. La plaque est mise sous agitation pendant 5 minutes à l’abri de la lumière, puis

laissée 10 minutes à température ambiante pour stabiliser le signal luminescent. La

228

229

luminescence est ensuite mesurée au luminomètre (Logiciel MikroWin 2000). Le peptide PX3

(1 mg/mL, 231 µM) est dilué à 0,1 ; 0,3 ; 0,4 ; 0,5 et 0,6µM, puis incubé 24 heures avant la

mesure d’ATP en milieu « cortex » sur les neurones.

b. Résultats

b.1. La protéine X n’a pas d’effet clair sur les activités

mitochondriales liées à la respiration et la production de ROS en conditions physiologiques.

• Analyse de la respiration

Nous avons utilisé des neurones primaires transduits avec des vecteurs lentiviraux exprimant

la protéine X (LV-X) ou la GFP (LV-GFP). Après avoir vérifié par immunofluorescence l’efficacité

de la transduction par ces vecteurs lentiviraux (données non présentées), nous avons réalisé

des mesures de taux de consommation d'O2, en temps réel, en utilisant un analyseur de flux

extracellulaires, le Seahorse.

Cet appareil permet ainsi de mesurer directement la consommation d'O2 de neurones

corticaux en culture primaire. Cette sonde dispose également d’un système d’injection grâce

auquel nous pouvons soumettre les mitochondries à différents stress. L’injection de

différentes drogues à des concentrations choisies dans le milieu cellulaire résulte en une

courbe de respiration, spécifique de la culture analysée (Figure 42). Chronologiquement, les

drogues utilisées sont :

- l’oligomycine, un inhibiteur de l’ATP-synthase, qui entraîne une forte réduction du

flux d'électrons au travers de la chaîne respiratoire et donc de la consommation d’O2.

En raison de l’existence de fuite de protons au travers de l’IMS, ce flux n'est pas

totalement stoppé. La part de respiration nécessaire à la production d’ATP (ou

efficacité de couplage) résulte de la différence entre la respiration basale et la

consommation d'O2 résiduelle.

230

Figure 42 : Impact de la protéine X sur la respiration mitochondriale en conditions

physiologiques.

En culture primaire, la consommation d'O2 de neurones transduits par des vecteurs LV-X et

LV-GFP a été évaluée au cours du temps. Les cadres de couleur indiquent les différents

paramètres de la respiration mitochondriale. Les barres d'erreurs représentent les écarts-

types de 2 expériences indépendantes, avec, pour chacune, 4 à 6 réplicats expérimentaux.

231

- le FCCP (Carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone), permet de

mesurer la capacité respiratoire maximale. Ce protonophore, composé aromatique

hydrophobe, dissipe le potentiel de membrane en perméabilisant les membranes

mitochondriales. Pour compenser ce phénomène le transfert d'électrons et la

consommation d'O sont alors à leur maximum.

- la roténone et l'antimycine, qui inhibent, respectivement, les complexes I et III de la

chaîne respiratoire. Plus aucune réaction d'oxydoréduction des substrats (NADH et

FADH2) n’est possible et la respiration mitochondriale est alors complètement stoppée.

La mesure de consommation d’O2 résiduelle correspond à la respiration cellulaire non

mitochondriale.

Nos résultats montrent que la présence de la protéine X dans les neurones primaires

ne semble pas avoir d'effet notable sur leur niveau de respiration basal et sur l’efficacité de

couplage entre la chaîne respiratoire et la production d’ATP. Les neurones, exprimant la pro-

téine X, montreraient toutefois une respiration basale et une capacité respiratoire maximale

légèrement supérieure, bien que cette différence ne soit pas statistiquement significative (Fi-

gure 42). En conditions physiologiques, la protéine X semble donc ne pas avoir d’effet ma-

jeur sur la respiration cellulaire.

• Analyse du potentiel de membrane

Le potentiel de membrane mitochondrial (ΔΨm) est un bon indicateur de l’intégrité

des membranes mitochondriales et de la fonctionnalité de la respiration. Nous nous sommes

donc également intéressés à l’impact de la protéine X sur ce paramètre, mesuré sur les neu-

rones dans leur ensemble, par la sonde fluorescente JC-1, qui pénètre dans les mitochondries.

La sonde JC-1 émet un signal de fluorescence dans le vert (V) (529nm), sous sa forme

monomérique, et un signal dans le rouge (R) (590nm) sous l’effet de la même excitation,

lorsqu’elle se trouve agrégée. Puisque cette agrégation dépend du ΔΨm et qu'elle est réver-

sible, toute modification du ΔΨm sera décelée par une variation du rapport des niveaux de

232

Figure 43 : Analyse de l’impact de la protéine X sur le potentiel de membrane, la production

de ROS et la production d’ATP en conditions physiologiques.

(A) Analyse du potentiel de membrane mitochondrial à l'aide de la sonde JC-1, représentée

par les rapports d’émission Rouge/Vert. Les valeurs indiquent les moyennes et écarts-types

de 7 expériences indépendantes. (B) Analyse de la production de ROS dans les neurones, en

utilisant la sonde H2DCFDA (unités arbitraires). Les valeurs représentent 4 points

expérimentaux par expérience et écarts-types ? pour 4 expériences indépendantes. (C)

Expériences réalisées avec Marine Fraisse (Ingénieure d’étude, CPTP). Analyse en

luminescence de la production d’ATP par les neurones (Kit Promega). Les valeurs (unités

arbitraires) sont normalisées par rapport aux données obtenues pour les neurones non traités

(0µM), 5 points expérimentaux par expérience et écarts-types pour 3 expériences

indépendantes (test statistique de Mann Whitney, *= p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,005).

Production d'ATP

µM PX3

Ra

tio

to

0µ

M P

X3

0 0.

1 0.

3 0.

4 0.

5 0.

6 0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

******

**

*****

C)

233

fluorescence R/V.

Nous avons appliqué la sonde JC-1 à des neurones en culture primaire non transduits

(NT), ou transduits par LV-X ou LV-XA6A7, (le mutant non adressé à la mitochondrie de la

protéine X décrit dans (Poenisch, Burger et al. 2009)). Dans tous les cas, les rapports R/V

étaient d’environ 7 (Figure 43, A), suggérant qu’aucune différence de ΔΨm n’est imputable à

la protéine X ni à son mutant non mitochondrial dans des conditions physiologiques. En

témoin positif, les neurones ont été traités par du FCCP (voir Figure 44), conduisant à une

chute drastique du ΔΨm dans les trois conditions.

• Analyse de la production de ROS

Nous avons ensuite comparé la production de ROS dans des neurones primaires non

transduits (NT), ou transduits par le LV-X ou le LV- XA6A7 à l'aide de la sonde H2DCFDA. Aucune

différence n’a pu être observée, que les neurones soient transduits ou non, et qu'ils expriment

la protéine X ou le mutant XA6A7 (Figure 43,B).

• Analyse de la production d’ATP

Pour terminer, nous avons étudié l’impact du peptide neuroprotecteur PX3 dérivé de

la protéine X sur la production d’ATP. Différentes concentrations de PX3 (de 0,1 à 0,6µM) sont

appliquées durant 24 heures sur les neurones avant la mesure de production d’ATP globale

(kit Promega). Nous remarquons une relation de proportionnalité entre la quantité de pX3

appliquée et la production d’ATP (Figure 43, C), jusqu’à atteindre un palier (données non

présentées). Le peptide dérivé de la X semble ainsi augmenter la production d’ATP, et donc

d’énergie, dans les neurones.

234

Figure 44 : Analyse de l’impact de la protéine X sur les fonctions mitochondriales en condi-

tions de stress oxydant.

Ces analyses ont été réalisées sur des neurones primaires non transduits ou transduits par des

vecteurs LV-X ou LV-GFP. (A) Analyse du potentiel de membrane mitochondrial à l'aide de la

sonde JC-1, représentée par les rapports d’émission R/V après incubation avec une gamme de

concentrations de roténone ou du FCCP. Les valeurs indiquent les moyennes et écarts-types

de 4 expériences indépendantes avec 4 points/conditions (test statistique de Mann Whitney,

*= p<0,05, **=p<0,01). (B) Première expérience de mesure de la consommation d’O2 après

une pré-incubation des neurones pendant 2 h dans un milieu contenant 20nM de roténone, 4

à 6 réplicats expérimentaux, écart-types obtenus pour les valeurs des réplicats.

0 10 20100

5001000

FCCP0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Rel

ativ

e JC

1NT

X

Hspa9

rotenone

0 10 20100

5001000

FCCP0.00

0.25

0.50

0.75

1.00R

elat

ive

JC1

NT

X

Hspa9

rotenone

0 10 20100

5001000

FCCP0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Rel

ativ

e JC

1

NT

X

Hspa9

rotenone

0 10 20100

5001000

FCCP0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Rel

ativ

e JC

1

NT

X

Hspa9

rotenone

0 10 20100

5001000

FCCP0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Rel

ativ

e JC

1

NT

X

Hspa9

rotenone

0 10 20100

5001000

FCCP0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Rel

ativ

e JC

1

NT

X

Hspa9

rotenone

0 10 20100

5001000

FCCP0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Rel

ativ

e JC

1

NT

X

Hspa9

rotenone

0 10 20100

5001000

FCCP0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Rel

ativ

e JC

1

NT

X

Hspa9

rotenone Roté none nM

Potentiel de Membrane

** * p=0,07

A)

B)

235

b.2. La protéine limite la perte du ΔΨm en cas de stress oxydant

Pour déterminer si la protéine X protège la respiration mitochondriale en condition de

stress oxydant, nous avons traité les neurones LV-X et LV-GFP avec de la roténone avant de

réaliser les mêmes expériences que précédemment.

• Analyse du potentiel de membrane

Nous avons tout d’abord évalué l'effet d’un stress oxydant sur le ΔΨm à l'aide de la sonde JC-

1. Les neurones NT présentent une réduction dose-dépendante du ΔΨm en réponse à la roté-

none, de -20% à 20nM à un plateau de -50% à 1000nM (Figure 44, A). De façon intéressante,

les neurones LV-X ne montrent pas de diminution de ΔΨm sous l’influence de 20nM de roté-

none et à partir de 100nM de roténone, la perte du ΔΨm atteint 25%, valeur qui n’augmente

pas pour des doses de roténone croissantes (jusqu’à 1µM). Ces résultats suggèrent que la pro-

téine X limite la perte du ΔΨm en réponse à un stress oxydatif même lorsque celui-ci est di-

rectement appliqué sur les corps cellulaires des neurones ainsi que sur les dendrites et les

axones (ce qui affecte une très grande proportion de mitochondries).

• Analyse de la respiration

Dans un second temps, à l'aide du SeaHorse, nous avons révélé que la respiration ba-

sale des neurones, qu’ils expriment la protéine X ou la GFP, est divisée par un facteur 2.5,

après traitement par la roténone (Figure 44, B par rapport à la Figure 42). En outre, les neu-

rones témoins montrent une diminution progressive de leur consommation d'O2 et ne répon-

dent plus à aucune drogue, suggérant que la roténone a affecté la viabilité cellulaire. En re-

vanche, les neurones exprimant la protéine X semblent maintenir un profil de réponse

aux drogues, similaire à celui observé en conditions physiologiques, même si la capacité

respiratoire maximale ne dépasse pas la consommation basale. Ce résultat est prélimi-

naire puisque cette expérience a été réalisé une seule fois, nécessitant, bien entendu, une

mise au point et une confirmation lors d’expériences complémentaires. Cela indiquerait

236

237

néanmoins qu’une partie au moins des neurones transduits avec la X conservent une activité

respiratoire capable de répondre aux drogues mitochondriales ajoutées dans le milieu.

Nous concluons, cependant, de l’ensemble de ces expériences qu’il semblerait que les

neurones exprimant la protéine X soient plus résistants aux dysfonctionnements

mitochondriaux induits par la roténone.

238

239

II ) Des mutants de la protéine X préférentiellement adressés à la mi-

tochondrie : un potentiel thérapeutique neuroprotecteur.

1. Résumé et article

Ce travail a fait l’objet d’un article publié dans The FASEB Journal en avril 2016 :

« Manipulation of the N-terminal sequence of the Borna disease virus X protein improves its

mitochondrial targeting and neuroprotective potential »

Cécile A. Ferré, Noélie Davezac, Anne Thouard, Jean-Michel Peyrin, Pascale Belenguer,

Marie-Christine Miquel, Daniel Gonzalez-Dunia et Marion Szelechowski

The FASEB Journal, 30 :1524, doi: 10.1096/fj.15-279620

Si le potentiel thérapeutique de la protéine X est maintenant bien démontré, nous

l’avons vu, les mécanismes moléculaires à l'origine de cet effet neuroprotecteur sont loin

d’être tous connus. Cependant, nous savons que ses propriétés neuroprotectrices dépendent

de sa localisation mitochondriale. Nous avons donc souhaité déterminer les modalités de son

adressage mitochondrial en établissant une cartographie des signaux de localisation

subcellulaire de la protéine X, afin de pouvoir optimiser sa localisation mitochondriale et

possiblement son pouvoir neuroprotecteur.

En 2002, les 20 premiers acides aminés de la protéine X ont été décrits comme une

séquence de liaison à l’importine α (Wolff, Unterstab et al. 2002) et en 2009, la même

séquence a été assimilée à un signal de ciblage mitochondrial (MTS) (Poenisch, Burger et al.

2009). Nous avons donc examiné plus en détail cette région amino-terminale et fusionné

différentes portions de cette séquence à la protéine reportrice eGFP.

240

241

Nous avons observé que la séquence N-ter des résidus 5-16, hélice alpha

particulièrement riche en a.a. leucine, est capable d’adresser la GFP à la mitochondrie. Cette

même séquence ressemble fortement à un signal canonique inverse CRM1 spécifique

(exportine principale) et possède, en effet, des propriétés NES : elle permet un meilleur export

nucléaire de la GFP et est sensible à l’action de la Leptomycine B, un inhibiteur spécifique de

l’exportine CRM1).

De façon surprenante, la séquence N-ter 1-16 de la X perd la capacité d’adresser la GFP

à la mitochondrie. Curieusement, lorsque le résidu aspartate en position 4 est muté en alanine

(a.a. 1-16/D4A), la séquence MTS résultante est encore plus efficace. De plus, une protéine X

portant une mutation ponctuelle ou une délétion au niveau de ce résidu démontre également

un adressage mitochondrial plus efficace, au détriment de sa fraction nucléaire. Ces mutants

ne sont d’ailleurs plus capables de fixer l’importine , ce qui annule presque totalement le

ciblage nucléaire.

Nous avons par la suite prouvé que les mutants X, plus mitochondriaux, présentaient

une plus grande efficacité neuroprotectrice dans le modèle in vitro de stress oxydatif à la

roténone appliqué sur des neurones primaires en chambres de culture microfluidiques.

The FASEB Journal • Research Communication

Manipulation of the N-terminal sequence of the Bornadisease virus X protein improves its mitochondrialtargeting and neuroprotective potential

Cecile A. Ferre,*,†,‡ Noelie Davezac,‡,§ Anne Thouard,*,†,‡ Jean-Michel Peyrin,{,k

Pascale Belenguer,‡,§ Marie-Christine Miquel,‡,§,k Daniel Gonzalez-Dunia,*,†,‡,1

and Marion Szelechowski*,†,‡,1

*INSERM, Unite Mixte de Recherche (UMR) 1043, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan(CPTP), Toulouse, France; †Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), UMR 5282,Toulouse, France; ‡Universite Toulouse III Paul Sabatier, Toulouse, France; §CNRS UMR 5547, Centrede Biologie du Developpement, Toulouse, France; {CNRS UMR 8256, Biological Adaptation and Aging,Institut de Biologie Paris Seine, Universite Pierre et Marie Curie, Paris, France; and kUniversite Pierre etMarie Curie, Sorbonne Universites, Paris, France

ABSTRACT To favor their replication, viruses expressproteins that target diverse mammalian cellular pathways.Due to the limited size of many viral genomes, such pro-teins are endowed with multiple functions, which requiretargeting to different subcellular compartments. One sa-lient example is theXprotein ofBornadisease virus, whichis expressed both at the mitochondria and in the nucleus.Moreover, we recently demonstrated thatmitochondrial Xprotein is neuroprotective. In this study, we sought toexamine the mechanisms whereby the X protein transitsbetween subcellular compartments and to define itslocalization signals, to enhance its mitochondrial accumu-lation and thus, potentially, its neuroprotective activity.Wetransfected plasmids expressing fusion proteins bearingdifferent domains of X fused to enhanced green fluores-cent protein (eGFP) and compared their subcellular lo-calization to that of eGFP. We observed that the 5–16domain of X was responsible for both nuclear export andmitochondrial targeting and identified critical residues formitochondrial localization. We next took advantage ofthesefindings and constructedmutantXproteins thatweretargeted only to themitochondria. Suchmutants exhibitedenhanced neuroprotective properties in compartmentedcultures of neurons grown in microfluidic chambers,thereby confirming the parallel between mitochondrialaccumulation of the X protein and its neuroprotectivepotential.—Ferre C. A., Davezac, N., Thouard, A., Peyrin,J. M., Belenguer, P., Miquel, M.-C., Gonzalez-Dunia, D.,Szelechowski, M. Manipulation of the N-terminal se-quence of the Borna disease virus X protein improves itsmitochondrial targeting and neuroprotective potential.FASEB J. 30, 1523–1533 (2016). www.fasebj.org

Key Words: subcellular addressing • neuroprotection • nuclearexport

As obligatory intracellular parasites, the survival ofviruses within their host depends on their ability to hi-jack cellular mechanisms for their intracellular trans-port, for the expression of their genes, and to escapecellular antiviral responses aimed at the rapid clearanceof infected cells (1, 2). To achieve such functions, viralproteins are often targeted to different subcellularcompartments, including the nucleus, the endoplasmicreticulum, and the mitochondria. As a matter of fact,many cellular pathways, including cellular transcrip-tion, IFN signaling, or tumorigenesis were discovered orbetter understood through their targeting by viruses(3–5). Moreover, because of the small size of their ge-nomes, viruses often express a limited set of proteinsthat are endowed with several functions in differentcompartments and whose intracellular addressing de-pends on the tight regulation of specific localizationsignals (6, 7). For instance, the HIV-1 Rev protein pos-sesses both nuclear localization (NLS) and nuclear ex-port (NES) signals that specifically address Rev to itsdifferent subcellular localization sites during the viralreplication cycle and whose regulation results from anelaborate masking strategy, that allows only the NLS orthe NES to be active at a given time (8–10). Anotherinteresting example is the Borna disease virus (BDV) Xprotein, which is targeted to both the nucleus and themitochondria of infected cells, where it exerts differentfunctions.

BDV is a highly neurotropic, negative-stranded RNA vi-rus that efficiently persists in the brains of infected animalsor in cultured cells, including primary neuronal cultures,Abbreviations: BDV, Borna disease virus; BSA, bovine serum

albumin; CDK, cyclin-dependent kinase; COS, CV-1 in originwith SV40 genes; COX, cytochrome oxidase; CRM1, chromo-somal maintenance 1 (exportin 1); DRP, dynamin-related pro-tein; eGFP, enhanced green fluorescent protein; FCS, fetal calfserum; HEK, human embryonic kidney; LMB, leptomycin B;

(continued on next page)

1 Correspondence: CPTP, INSERM UMR 1043, CNRS UMR5282, Universite Toulouse III, CHU Purpan, BP3028, 31024Toulouse Cedex 3, France. E-mail: daniel.dunia@inserm.fr(D.G.-D.); mszelechowski@gmail.com (M.S.)doi: 10.1096/fj.15-279620

0892-6638/16/0030-1523 © FASEB 1523

without triggering any cytotoxicity (11). Its compactgenome (8.9 kb) encodes only 6 proteins, among which5 (nucleoprotein, phosphoprotein, matrix protein, viralpolymerase, and glycoprotein) are responsible for particlestructure and viral replication. BDV also encodes a smallnonstructural protein of 87 amino acids termed X (for10 kDa), which plays multiple roles in the viral replicationcycle. BDV replication occurs in the nucleus, which is anoriginal feature of a Mononegavirales, and the fraction ofX protein that resides in the nucleus regulates viral RNAsynthesis and polymerase complex assembly (12–14). TheX protein has also been shown to interfere with cellularpathways when located in the mitochondria. In non-neuronal, BDV-infected cells, X inhibits the aggregation ofthe mitochondrial antiviral-signaling protein (MAVS) atthe mitochondrial membrane, thereby preventing MAVS-dependent activation of type I IFN (15) and confersresistance to Fas-induced cell death (16). Moreover, werecently demonstrated that isolated expression of X inneurons induces enhanced filamentation of the mito-chondrial network and provides protection against mito-chondrial dysfunctions during neurodegeneration (17).Hence, studying the modalities of X protein traffickingbetween nucleus and mitochondria may represent agood model for obtaining further information aboutcellular nucleus/mitochondria crosstalk. It may alsoprovide important information about the regulation ofX accumulation in the different subcellular compart-ments that are also important during infection, to allowefficient BDV persistence.

Our recent results have established that X-mediatedneuroprotection is dependent on its mitochondrial local-ization. The X protein has been shown to modulate mito-chondrial dynamics and to promote the ability to managecellular stresses in axons (17). These mito-protectiveproperties are particularly interesting, considering thecentral role played by mitochondrial dysfunctions in mostneurodegenerative disorders (18). In fact, we recentlydemonstrated the strong neuroprotective potential of theX protein and of X-derived peptides in an intoxication-based mouse model of Parkinson’s disease (17). To date,however, the sequences responsible formitochondrial andnuclear targeting of X have not been accurately defined,but seem to be all contained within its N-terminal part.Indeed, the aa 1–20 were described as a noncanonicalimportin-a-dependent NLS (19), whereas the aa 1–16 se-quence was proposed to promotemitochondrial targeting(16). Therefore, a precise determination of the residuesthat are critical for each intracellular addressing function isstill needed.

In the present study, we reasoned that improving themitochondrial localization of the X protein could en-hance its therapeutic potential. Thus, we sought todecipher themolecular bases of X protein intracellularaddressing.

MATERIALS AND METHODS

Construction of X N terminus–enhanced green fluorescentprotein fusion proteins

Complementary oligonucleotide sequences corresponding tovarious lengths of the N terminus of the BDV X sequence weredesigned to create 59-BamHI and 39-NheI sticky ends after hy-bridization, allowing their ligation into the peGFP-N1 plasmid(Clontech Laboratories, Mountain View, CA, USA). The com-plementary oligonucleotides weremixed to a final concentrationof 1 pM/ml in 50 mM NaCl, 1 mM Tris-HCl, and 0.1 mM EDTAand incubated at 95°C for 5min, followed by a gradual cool-downto room temperature. The peGFP-N1 plasmid was subjected todigestion by the restriction enzymes BamHI and NheI (New Eng-landBiolabs, Ipswich,MA,USA).The resultingopenplasmid andhybridized oligonucleotides were ligated by T4 DNA ligase(Thermo Scientific–Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).Competent E. coliDH5a bacteria (cat. no. C29251; New EnglandBiolabs) were transformed with the different constructions. DNAfrom recombinant plasmids were prepared with Nucleospinmini or maxi kits (Macherey-Nagel, Hoerdt, France). Sequencesinserted upstreamof enhanced greenfluorescent protein (eGFP)were verified by sequencing (Table 1).

Construction and expression of X mutants

The genes encoding wild-type or mutated BDV X proteins wereamplified by PCR and cloned into either the pCAGGS plasmid(20) for transfection inmammaliancells or into thepTrip lentiviralvector backbone (kindly provided by Dr. P. Charneau, PasteurInstitute, Paris, France), downstream of the constitutive cytomeg-alovirus (CMV) enhancer/chicken b-actin (CAG) promoter.XD2–4 andXA4mutantgeneswereobtainedbyPCRby inserting therespectivemutations in the 59-stranded oligonucleotide. Lentiviralvectorswereproducedby transfectionofhumanembryonickidney(HEK)293T cells with the second-generation packaging plasmidspsPAX2 and pMD2.G (Addgene plasmids 12260 and 12259, bothprovided by D. Trono, Ecole Polytechnique Federale, Lausanne,Switzerland) and pTrip expressing the different X proteins (17).Gene transfer titers were determined on transduced HEK293Tcells by indirect immunofluorescence.

Cell culture and protein expression

COS-7 cells (ATCCCRL-1651), with their large, spread-out shapethat facilitates the determination of the different subcellularcompartments, were grown at 37°C, 5% CO2 in RPMI medium(Thermo Scientific–Life Technologies) supplemented with2 mM L-glutamine (Thermo Scientific–Life Technologies), 10%fetal calf serum (FCS), and 100 mg/ml penicillin/streptomycin(Thermo Scientific–Life Technologies). Protein expression inthe COS-7 cells was determined by transfection with GeneJuicereagent (cat. no. 70967-4; Millipore, Guyancourt, France). Thecells were seeded on 12 mm-diameter glass coverslips in 24-wellplates at 20,000 cells per well. Twenty-four hours later, the plas-mids were mixed with Genejuice [1 ml Genejuice and 0.5 mgplasmid diluted in 25 ml OptiMem (Thermo Scientific–LifeTechnologies) per well] and the resulting preparation was addeddirectly into the culture medium. The cells were fixed and ana-lyzed after 48 h.HEK293T cells (ATCCCRL-3216)were grown inDMEMsupplementedwith 10%fetal calf serum(FCS), 100mg/mlpenicillin/streptomycin, and 0.2 mg/ml geneticin (all fromThermo Scientific–Life Technologies). Primary cortical neuronswereprepared fromSprague-Dawley rat embryos at gestationald17by the papain dissociation method (17, 21). In brief, cortices were

(continued from previous page)MAVS, mitochondrial antiviral signaling protein; MTS,mitochondria targeting sequence; NES, nuclear exportsignal; NLS, nuclear localization signal; NOA1, nitric oxide-associated 1; Tom20, translocase of outer mitochondrialmembrane 20

1524 Vol. 30 April 2016 FERRE ET AL.The FASEB Journal x www.fasebj.org

dissected and incubated for 15 min at 37°C in PBS containing10 U/ml papain (cat. no. LK003178; Worthington, Lakewood,NJ, USA), followed by gentle dissociation in PBS containing1.5 mg/ml bovine serum albumin (BSA) and 1.5 mg/ml trypsininhibitor (cat. no. T2011; Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallav-ier, France). The cells were filtered through a 4% BSA cushionbycentrifugationandplatedonculturedishes thathadbeencoatedwith poly-DL-ornithine (cat. no. P-8638; 500 mg/ml concentration;ThermoScientific–LifeTechnologies) and laminin (cat. no. 23017-015; 5 mg/ml concentration; Thermo Scientific–Life Technolo-gies). Cortical neurons were maintained at 37°C in 5% CO2and cultured in serum-free Neurobasal medium (ThermoScientific–Life Technologies) supplemented with 2 mML-glutamine, 100 mg/ml penicillin/streptomycin, and 2% B-27supplement (cat. no. 17504-044; Thermo Scientific–Life Tech-nologies). Expression of the isolated X protein (or control pro-teins) in primary cortical neurons was performed by lentiviralvector transduction at d 3 by using a multiplicity of transductionof 3.

Immunofluorescence and imaging

Neurons and COS-7 cells were fixed with PBS containing 4%paraformaldehyde preheated to 37°C, for 15 min at room tem-perature. The cells were subsequently permeabilized with PBScontaining 0.25% Triton-X100 for 5 min, rinsed twice with PBS,andblocked for at least 1hwithPBS containing2.5%normal goatserum and 5%BSA. The cells were incubated for 2 h at 37°C withprimary antibodies diluted in blocking solution [anti-bIII-tubulin(cat. no. T5076; 1:500 dilution; Sigma-Aldrich), anti- translocaseof outer mitochondrial membrane 20 (Tom20; cat. no. sc-11415;1:500 dilution; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX,USA), anti-cyclin B1 (clone V152, cat. no. MA1-155; 1:200 dilution; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), anti-phospho-DRP1S616

(cat. no. 4494; 1:1,000 dilution; Cell Signaling Technologies,Danvers, MA, USA), and anti-X (1:1,000 dilution; homemadeantiserum], rinsed twice for 10min each in PBS containing 0.1%

TritonX-100andonce inPBS, and then incubated45minat roomtemperature with Alexa-conjugated fluorescent secondary anti-bodies (cat. nos. A11034; A11029; A11037; A11032; 1:500 dilutionin PBS; Sigma-Aldrich). After several washes in PBS, the cells weremounted in Vectashield medium containing DAPI (Vector Lab-oratories, Burlingame, CA, USA). All microscopy analyses andmeasurements were performed on an inverted SP8 confocal mi-croscope (Leica Microsystems, Nanterre, France) fitted with a363 objective. Images were analyzed with ImageJ software (Na-tional Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Colocalizationanalyses were performed with the JACoP (Just Another Colocali-zationPlug-In; Image J) (22)on z slices (aminimumof8 z slices foreach cell). The percentages of colocalization were assessed bydetermining theMander’s coefficients, byusing afixed threshold.Mander’s coefficients represent the number of pixels that arepositive for both designated wavelengths (in this case, the fluo-rescence corresponding to X/eGFP and Tom20 staining) di-vided by the total number of pixels positive for one wavelength(eGFP fluorescence), thus reflecting fractions (mitochondrialfractions of X/eGFP). Fluorescence intensities were evaluatedby the integrative fluorescence intensity with the ImageJ soft-ware. For nuclear fraction analysis, the nucleus of each cell wasdrawnmanually based on theDAPI signal for each z slice. eGFPor X staining fluorescence wasmeasured both in the whole celland inside the nucleus. For phospho-DRP1S616 quantifications,whole-cellfluorescence intensity wasmeasured inbIII-tubulin+

cells.

Inhibition of nuclear export

Nuclear export was inhibited in COS-7 cells by the addition ofthe exportin 1 [chromosomal maintenance 1 (CRM1)] inhibitorleptomycinB(LMB; cat.no.L2913;Sigma-Aldrich) for6h, addeddirectly to the culture medium at a concentration of 20 ng/ml.For eachexperiment, nuclear export inhibitionwas controlledbythe analysis of cyclin B1 intracellular localization, which switchesfrom mostly cytosolic to fully nuclear localization upon LMBtreatment (data not shown).

TABLE 1. Sequences of primers used for the X-eGFP fusion constructs

Name Corresponding aa sequence Forward, 59–39 Reverse, 59–39

X1–20 MSSDLRLTLLELVRRLNGNGTIE ctagcATGAGTTCCGACCTCCGGCTGACATTGCTTGAATTAGTCAGGAGGCTCAatgGCAACGGGACCATCGAG

gatcCTCGATGGTCCCGTTGCcatTGAGCCTCCTGACTAATTCAAGCAATGTCAGCCGGAGGTCGGAACTCATg

X5–16 MLRLTLLELVRRL ctagcATGCTCCGGCTGACATTGCTTGAATTAGTCAGGAGGCTC

gatcGAGCCTCCTGACTAATTCAAGCAATGTCAGCCGGAGCATg

X1–16 MSSDLRLTLLELVRRL ctagcATGAGTTCCGACCTCCGGCTGACATTGCTTGAATTAGTCAGGAGGCTC

gatcGAGCCTCCTGACTAATTCAAGCAATGTCAGCCGGAGGTCGGAACTCATg

X1–16/S2A MASDLRLTLLELVRRL ctagcATGGCTTCCGACCTCCGGCTGACATTGCTTGAATTAGTCAGGAGGCTC

gatcGAGCCTCCTGACTAATTCAAGCAATGTCAGCCGGAGGTCGGAAGCCATg

X1–16/S3A MSADLRLTLLELVRRL ctagcATGAGTGCTGACCTCCGGCTGACATTGCTTGAATTAGTCAGGAGGCTC

gatcGAGCCTCCTGACTAATTCAAGCAATGTCAGCCGGAGGTCAGCACTCATg

X1–16/AA MAADLRLTLLELVRRL ctagcATGGCTGCCGACCTCCGGCTGACATTGCTTGAATTAGTCAGGAGGCTC

gatcGAGCCTCCTGACTAATTCAAGCAATGTCAGCCGGAGGTCGGCAGCCATg

X1–16/D4A MSSALRLTLLELVRRL ctagcATGAGTTCCGCTCTCCGGCTGACATTGCTTGAATTAGTCAGGAGGCTC

gatcGAGCCTCCTGACTAATTCAAGCAATGTCAGCCGGAGAGCGGAACTCATg

X1–16/AAA MAAALRLTLLELVRRL ctagcATGGCTGCTGCTCTCCGGCTGACATTGCTTGAATTAGTCAGGAGGCTC

gatcGAGCCTCCTGACTAATTCAAGCAATGTCAGCCGGAGAGCAGCAGCCATg

DETERMINANTS OF BDV X PROTEIN MITOCHONDRIAL IMPORT 1525

Coimmunoprecipitation and Western blot analysis

HEK293T cells were seeded in 10 cm-diameter culture dishes(1.53 106 cells per dish) and transfected the following day with5 mg plasmid and 15ml GeneJuice reagent (Millipore). Two daysafter transfection, thecellswere lysed inRIPAbuffer [50mMTris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% NP40, 0.5% sodium desoxy-cholate, and 0.1% SDS]. For each immunoprecipitationexperiment, 40 ml of protein G-conjugated magnetic beads(cat. no. 1614023; Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France) werepreincubated overnight with 9 ml anti-CRM1 (cat. no. sc-5595;SantaCruzBiotechnology)or5ml anti-importin-a (cat. no. I1784;Sigma-Aldrich) antibodies in 500 ml of RIPA buffer, under mildagitation. Beads were then washed 3 times with RIPA buffer andincubated with the cellular extracts for 4 h at room temperatureunder mild agitation. After 3 washes, beads were incubated with30 ml loading buffer for Western blot analysis [23 Laemmlibuffer: 50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 10% glycerol, 0.4%bromophenol blue, and 200 mM DTT]. Samples were loaded inNuPAGE gels (Thermo Scientific–Life Technologies), run inMES buffer [2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid; ThermoScientific–Life Technologies] and transferred onto nitrocel-lulose membranes (cat. no. 10600002; GE Healthcare, Velizy-Villacoublay, France) that were subsequently blocked withblocking buffer (MB-070; Rockland Immunochemicals, Lim-erick, PA, USA). The proteins were then revealed by sub-sequent incubations with primary antibodies (anti-CRM1, 1:250 dilution; anti-importin, 1:250 dilution; anti-X, 1:10,000dilution) diluted in Tris-buffered saline [50 mMTris-HCl (pH7.6) and 150 mM NaCl) containing 5% BSA (Sigma-Aldrich),followed by infrared fluorochrome-conjugated secondary an-tibodies (cat. nos. 20067 and 20077; Biotium, Hayward, CA,USA; cat. no. 115-655-174, Alexa Fluor 790-conjugated affinity-pure goat anti-mouse IgG, light chain–specific; JacksonImmunoResearch, Suffolk, United Kingdom; respectively,1:15,000 and 1:50,000 dilutions in blocking buffer). Mem-branes were ultimately scanned with the infrared Odysseyimager (Li-Cor, Lincoln NE, USA).

Assessment of neuroprotection in oriented primaryneuronal cultures

Primary cortical neurons were seeded in microfluidic devices(17, 23) and transduced 3 d later with lentiviral vectorsexpressing wild-type X protein or the mutants XA6A7 (as acontrol), XD2–4, orXA4.Ond 12, the neurons were subjected tooxidative stress by the replacement of culture medium by a1 mM solution of the mitochondrial complex I inhibitorrotenone (cat. no. 45656; Sigma-Aldrich) in DMEM contain-ing 1 g/l glucose+1% B27+1% N2 supplements (ThermoScientific–Life Technologies)+2 mM L-glutamine+100 mg/mlpenicillin/streptomycin, for 16 h. This treatment was per-formed in fluidically isolated axonal chambers for inductionof axonal mitochondrial stress. Axonal fragmentation wasthen assessed (17, 23). In brief, neurons were stained for bIII-tubulin, and the number of tubulin spots corresponding tofragmented axons was manually pointed and counted withImaris software (Bitplane, Concord, MA, USA), whereas totalbIII-tubulin staining was assessed with ImageJ software foreach image, thereby defining a fragmentation index. Photo-graphs were taken of 4 randomly chosen fields of each micro-fluidic culture in the axonal chamber. The transductionefficiency was controlled by immunostaining for BDVX protein,which was performed together with bIII-tubulin. TO-PRO3 (cat.no. T3605; Thermo Scientific–Life Technologies) staining wasalso performed in the somatic chambers, to verify the nuclearintegrity of each culture and ensure that the hydrostatic flux hadbeen maintained throughout the rotenone treatment.

Statistical analyses

Results are presented as means 6 SD. Data were analyzed byMann-Whitney U tests, as indicated in the figure legends, withPrism software (GraphPad, La Jolla, CA, USA).

RESULTS

The N terminus of BDV X protein contains multiplelocalization signals responsible for itsintracellular distribution

In both neuronal and non-neuronal cells, X is differentiallydistributed between themitochondria, the nucleus, and, to alesserextent, thecytoplasm(seeAncillaryFig. 1,DryadDigitalRepository, http://datadryad.org/resource/doi:10.5061/dryad.1rs12). This distribution is observed whether X isexpressedaloneorduring viral infectionandmay result fromthe action of the different localization signals present withinits N terminus. Indeed, the X-encoding sequence bears anunconventional importin-a-binding motif residing within its20 N-terminal amino acids—MSSDLRLTLLELVRRLNGNA(Fig. 1A)—that drives its nuclear translocation (19). More-over, although X does not contain any mitochondrial tar-geting sequence (MTS), the amino acids at positions 6–16form a short amphipathic a helix, and sequence 1–16 hasbeen proposed to be responsible for X mitochondrial local-ization (16). The N-terminal sequence of X also containsseveral leucine residues, which form a highly hydrophobicdomain characteristic of a putative NES commonly recog-nized by the karyopherin receptor called CRM1, even ifthe exact consensus sequence is somehow reversed inthe X sequence [L(X)3–4L(X)2–3LXL (L for leucine, Xfor any other amino acid)] (24). However, consistentwith this observation, the NetNES algorithm (24) de-tected a putative NES sequence between residues 5 and16 of X, and we were able to coimmunoprecipitate the Xprotein with CRM1 (see Ancillary Fig. 2, Dryad). Hence,the 20 N-terminal residues of X seem to contain over-lapping sequences that could mediate nuclear import,export, and mitochondrial targeting.

The X5–16 sequence mediates mitochondrial targeting

As X is mostly nuclear and mitochondrial, we first in-vestigated which amino acids within its N-terminal se-quence were specifically responsible for the NLS andMTSactivities. To this end, we fused alternate fragments of dif-ferent lengths derived from the X N-terminal sequence[aa1–20(pX1–20-eGFP),1–16(pX1–16-eGFP),or5–16(pX5–16-eGFP)] to a reporter gene (eGFP) (Fig. 1A). We nexttransfected COS-7 cells with the resulting plasmids andanalyzed the localization of eGFP in transfected cells (Fig.1B). We assessed mitochondrial accumulation by quanti-fying eGFP colocalization with the mitochondrial translo-case of the outermembrane Tom20 (Fig. 1C). The controleGFP plasmid (peGFP-N1), which does not present anyMTS, was used to set the background. TheX1–20-eGFP andX1–16-eGFP fusion proteins unexpectedly exhibited a dif-fuse and nonmitochondrial fluorescence pattern verysimilar to that of the control, with respective colocalization

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means of 9.1 and 7.6%, vs. 9.2% for the control (P = 0.97and 0.17, respectively; Mann-Whitney U tests). Even moresurprising, theadditionofdomainX5–16 toeGFPefficientlytargeted the fluorochrome to the mitochondrial network,with amean of 46% (P, 1024, Mann-WhitneyU test) of theeGFP signal colocalizing with Tom20. Moreover, the dis-tribution of eGFP in cells transfected with pX5–16-eGFPshowed a strong variability, from mostly mitochondrial(.70% colocalization with Tom20) for 20% of cells, tonomitochondrial (,20% colocalization) for 25% of cells.

This profile was actually similar to that induced by theprototypical MTS of the mitochondrial cytochromeoxidase subunit (COX)-10 (part of respiratory complexIV), which is commonly used to target fluorochromes tomitochondria (seeAncillaryFig. 3,Dryad).Thus, ourfindingsshow that the domain 5–16 from the X protein is theonly one that enables mitochondrial targeting, as effi-ciently as a conventional MTS sequence and demonstratethat the X5–16 sequence per se mediates mitochondrialtargeting.

The X5–16 sequence is a CRM1-dependent NES

We next determined the nuclear localization of eGFP inCOS cells transfected with pX1–20-eGFP, pX1–16-eGFP,pX5–16-eGFP, or peGFP-N1 as a control (Fig. 1B, D). Asexpected for a protein with a molecular mass inferior to60 kDa, eGFP diffuses passively throughout the nuclearpore complexes (25, 26). Indeed, we observed that;45%ofeGFP signal localized in the nucleus upon transfection ofpeGFP-N1. A similar distribution was observed with plas-mids encodingX1–20-eGFPandX1–16-eGFP fusionproteins(41 and 43%, respectively). In contrast, we observed a sig-nificant 30% decrease of eGFP nuclear localization whenwe transfected the X5–16 fusion construct (mean of 33%nuclear signal; P , 1024, Mann-Whitney U test). To testwhether this decrease was because of an active nuclearexport mediated by this sequence, we treated cells withLMB, a specific CRM1 inhibitor. Treatment with LMB ledto a remarkable 30% increase of the nuclear eGFP fractioninCOS cells transfectedwith pX5–16-eGFP (43%; P, 1024,Mann-Whitney U test), up to a value similar to that of thecontrol cells, thereby confirming the functionality of theCRM1-dependentNESpresent in theX5–16 sequence (Fig.2A). We observed the same phenomenon with the X1–20-eGFP construct, which also contains the NES sequence(41 vs. 52% with LMB; P , 1024, Mann-Whitney U test).Thus, overlapping NES and MTS functions are containedwithin the same amino acid sequence of X protein. LMBtreatment also induced a strong 55% loss ofmitochondrialtargeting of X5–16-eGFP (Fig. 2B; 19% colocalization vs.45% without treatment; P, 1024, Mann-Whitney U test),suggesting a crosstalk between the X5–16 nuclear exportand mitochondrial targeting functions.

The aspartate residue in position 4 is deleterious forthe mitochondrial targeting function of theX5–16 sequence

We next wondered why the X1–20 and X1–16 sequences,although they contained the X5–16 sequence, did notensure eGFP targeting to the mitochondria. The onlydifference between X1–16 and X5–16 is the presenceof an SSD amino acid sequence at residues 2–4 (alsopresent in X1–20), upstream of the sequence that weidentified as being both an NES and an MTS. To in-vestigate the involvement of each of these amino acidsin the loss of MTS activity, we replaced them withalanine residues, either alone or in combination, andfused these new constructions at the N terminus ofeGFP (Fig. 3A). Mutations of serine residues in position2 or 3 (pX1–16/S2A-eGFP and pX1–16/S3A-eGFP) had no

Figure 1. The 5–16 domain of the BDV X protein allowsmitochondrial targeting and reduces nuclear localization. A)Amino terminal sequence of the X protein. The differentpredicted structural and functional domains are highlighted.B) Representative examples of confocal imaging of COS-7cells transfected with eGFP fusion protein constructs bearingvarious parts of the X protein: X1–20-eGFP, X1–16-eGFP, X5–16-eGFP, and eGFP as a control. Cells were stained for themitochondrial protein Tom20 (red) and the nucleus wasstained with DAPI (cyan). eGFP expression appears in green.Images shown are maximal intensity projections. Scale bars,10 mm. C) Analysis of the colocalization of eGFP withmitochondria in COS-7 cells after transfection with theX-eGFP fusion proteins. The mitochondrial fraction wasmeasured in 10 individual z slices for each cell, using theJACoP feature of ImageJ software, which determined thenumber of Tom20+ pixels among total eGFP+ pixels for eachcell. Thus, the mitochondrial fraction represents the ratiobetween Tom20/eGFP double-positive pixels and total eGFPpixels for each z slice of a cell. D) Analysis of the nuclearcolocalization of eGFP in the same experiment. For each cell,eGFP fluorescence was quantified in the whole cell and in thenucleus, delimited by DAPI staining. Nuclear fraction repre-sents the ratio between nuclear and total eGFP fluorescence foreach z slice of a cell. C, D) Each dot represents the mean ratioof all z slices for one cell; pink lines: mean values for each group(n = 4 independent experiments, 20 cells/group and perexperiment, 8–10 z slices analyzed per cell). ***P , 0.001;****P , 1024, Mann-Whitney U test.

DETERMINANTS OF BDV X PROTEIN MITOCHONDRIAL IMPORT 1527

impact oneGFPdistribution (Fig. 3B).However,mutationof the aspartate residue in position 4 (pX1–16/D4A-eGFP),or of all 3 amino acids (pX1–16/AAA-eGFP), drasticallymodified the distribution of the eGFP fusion proteins andenabled their mitochondrial targeting. Quantitative analy-sis of eGFP signals in cells transfectedwithpX1–16/D4A-eGFPand pX1–16/AAA-eGFP revealed levels of both nuclearexport andmitochondrial localization, similar to those ofthe X5–16-eGFP construct, and a strong dispersion ofmitochondrial localization (Figs. 1C,D and 3C,D). Theseobservations demonstrate that the aspartate residue inposition 4 is deleterious to the mitochondrial targetingfunction of X5–16 sequence.

Generation of mutants of the X protein with enhancedmitochondrial localization

As our main goal was to modify the full-length X proteinsubcellular distribution, we next assessed whether our ob-servations with eGFP fusion constructs would also holdtrue using the whole X protein. Indeed, the N-terminalsequence of X, besides bearing the above-identified tar-geting sequences, also contains the interacting domainswith the viral phosphoprotein and the cellular constitutiveheat shock cognate 70 protein (27). Thus, the interplaybetween these sequences and the binding to proteinpartners could contribute to the balance between nuclearand mitochondrial localization of the protein during vi-ral replication (28). To ascertain the role of the SSD se-quence in the intracellular distribution of the full-lengthX protein, we constructed mutants of the X proteinbearing either the deletion of the whole SSD sequence(XD2–4), so as to obtain anN-terminal sequence similar tothe X5–16-eGFP protein or the single replacement of theD4 residue by an alanine (XA4). Both XD2–4 and XA4mutants displayed enhanced mitochondrial localizationwith, respectively, 67 and 82% of colocalization betweenXandTom20 staining (P,1024 for both,Mann-WhitneyU test), as compared to 52% for wild-type X protein (Fig.4A, B). Similar to our previous observations with the eGFPfusion constructs, this enhanced mitochondrial targetingwas accompanied by reduced nuclear localization, as only15% of X remained in the nucleus for the 2 mutants,compared to 25% for wild-type X (P , 1024, Mann-

Whitney U test, Fig. 4C). The variability in intracellularaddressing among cells was also strongly decreased. As theresidues 1–20 were shown to be responsible for nuclearimport of X protein through a direct interaction withimportin-a (19), we assessed the ability of importin-a tobind to wild-type and mutant X proteins (Fig. 4D). Al-though wild-type X protein was coimmunoprecipitatedwith importin-a, neither mutant was pulled down, sug-gesting that the D2-4 or D4A mutations lead to loss ofnuclear import. Thus, deletion or targeted neutral muta-tion of the D-amino acid at position 4 of the N terminus ofthe X protein abolishes its binding with importin-a andenhances its mitochondrial targeting.

Expression of XD2–4 and XA4 mutants trigger enhancedmitochondrial filamentation in neurons

In a recent study, we have shown that X expression inneurons promotes enhanced filamentation of the mito-chondrial network (17). It was therefore tempting to assesswhether mutant X proteins that are more efficiently tar-geted to mitochondria would also affect mitochondrialmorphology. Indeed, mitochondria form a dynamic net-work with continuous fusion and fission phenomena,which allow adaptation to energetic needs, regulate mito-chondrial transport or trigger apoptosis in cases of severedefects (18, 29). Mitochondrial fusion and fission arecontrolled by large GTPases, like optic atrophy (OPA)-1,that, together with mitofusins (MFN)-1 and -2 promotefusion, opposite to the profission dynamin-related protein(DRP)-1 or Fis 1. X-induced hyperfilamentation was asso-ciated with a decrease of DRP1 phosphorylation at Ser616

residue (DRP1S616), reflecting a decrease of its fission ac-tivity (17). To test the impact of mutant X proteins onmitochondrial morphology, we constructed lentiviral vec-tors enabling the expression of wild-type X, XD2–4, XA4, orthe previously described nonmitochondrial XA6A7 mutant(16) inprimary corticalneurons. Immunostaininganalysesof X and Tom20 confirmed that both XD2–4 and XA4mutants exhibited enhanced mitochondrial localization inprimary neuronal cultures, similar to that in COS-7 cells(Fig. 5A; see also Ancillary Fig. 4, Dryad). Moreover, themitochondria appeared very filamentous in neuronsexpressing XD2–4 or XA4 proteins (at least as much as in

Figure 2. The 5–16 domain ofBDV X protein is an unconven-tional CRM1-dependent nuclearexport signal. Quantification ofGFP nuclear (A) and mitochon-drial (B) fractions in COS-7 cellstransfected with pX1–20-eGFP,pX5–16-eGFP, or peGFP-N1 as acontrol, following treatment withLMB to inhibit CRM1-dependentnuclear export. Each dot repre-sents the mean value for 1 cell;horizontal lines: mean values foreach group (n = 4 independentexperiments, 20 cells/group perexperiment, 8–10 z slices ana-lyzed per cell). ***P , 0.001;****P , 1024, Mann-WhitneyU test.

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neurons expressing the wild-type X protein). DRP1S616

phosphorylation levels were hardly detectable in neuronsexpressing the mutant X proteins (Fig. 5B). Indeed,DRP1S616 phosphorylation levels were decreased by 59, 69,and 78% for wild-type X, XD2–4, and XA4, respectively, incomparison to the control nontransduced neurons (Fig.5C). Hence, the impact of X on mitochondrial morphol-ogy, leading to a more filamentous network, is associatedwith a decreasedDRP1-basedfission activity and appears tocorrelate with the proportion of X protein that colocalizeswith themitochondrial network. The impact of X expressionon mitochondrial morphology was assessed in only primarycultured neurons. Indeed, analysis of such an impact onmitotic cells (such as COS-7 cells) would require using syn-chronized cells, because the morphology of the mitochon-drial network is dependent on the cell cycle.

Enhanced mitochondrial localization enableshigher neuroprotection

In earlier work, we had demonstrated that X is neuro-protective against mitochondrial stresses in models of

neurodegeneration (17). Mitochondrial dynamics isclosely related to the ability of neurons to manage stressor to undergo apoptosis (30, 31) and have emerged asa central actor in neurodegeneration (32–35), with en-hanced filamentation being considered as neuro-protective (34, 36, 37). We thus speculated that enhancedmitochondrial filamentation conferred by the XD2–4 andXA4 mutants could also result in enhanced neuro-protective properties. To assess the neuroprotective po-tential of X mutant proteins, we used oriented primaryneuronal cultures grown in microfluidic devices, whichpermit the strict physical separation and fluidic isolationof the somatodendritic and axonal compartments. Thisculture setup allows for modeling the dying-back patternof neurodegeneration in response to direct axonal insultand has been used extensively to demonstrate the neu-roprotective potential of X (17, 23, 38, 39). Neuronsgrown in microfluidic-based culture devices were trans-duced with lentiviral vectors expressing X, XD2–4, XA4, or

Figure 3. The aspartate residue in position 4 is responsiblefor the absence of mitochondrial targeting by the 1–16 domainof BDV X protein. A) The mutations inserted into X1–16sequence to construct new fusion proteins with eGFP. Alanineresidues were introduced to replace the residues in positions2–4 of X, either independently (S2A, S3A, D4A) or together(AAA) in the X1–16 sequence, and each mutant was fused toeGFP in the peGFP-N1 plasmid. B) Representative examples ofmaximum-intensity projection images of COS-7 cells trans-fected with the above-mentioned plasmids and stained forTom20 (red) and DAPI (cyan), 48 h after transfection. eGFPfluorescence is shown in green. Scale bars, 10 mm. C, D)Quantification of eGFP mitochondrial (C) and nuclear (D)fractions in COS-7 cells transfected with pX1–16/D4A-eGFP,pX1–16/AAA-eGFP, or pX1–16-eGFP as a control. Each dotrepresents the mean value for 1 cell; pink lines: mean valuesfor each group (n = 4 independent experiments, 25 cells/group per experiment, 8–10 z slices analyzed per cell). ***P ,0.001, Mann-Whitney U test.

Figure 4. Mutation or deletion of the aspartate residue inposition 4 in the full-length X protein leads to reducednuclear import and improved mitochondrial localization. A)Representative examples of maximum-intensity projectedimages of COS-7 cells transfected with plasmids expressingfull-length X protein or the XD2–4 or XA4 mutants. Cells werestained for X protein (green), Tom20 (red), or DAPI (cyan).Scale bars, 10 mm. B, C) Quantification of X mitochondrial(B) and nuclear (C) fractions in COS-7 cells transfected withplasmids described in (A). Each dot represents the meanvalue for 1 cell; pink lines: mean values for each group (n = 6independent experiments, 20 cells per group per experiment,8–10 z slices analyzed per cell). ****P , 1024, Mann-WhitneyU test. D) Coimmunoprecipitation analysis of X and importin-ain HEK293T cells transfected with the plasmids described in(A). Cells were lysed 48 h after transfection, and cell lysateswere used for immunoprecipitation with an anti-importin-aantibody, followed by protein G-coupled magnetic beads.Nontransfected HEK293T cells were used as a control (mock).Total cell lysates (input, top) were analyzed by Western blotagainst importin-a and BDV X proteins. Bead eluates (bottom)were also analyzed by Western blot against importin-a and BDVX proteins.

DETERMINANTS OF BDV X PROTEIN MITOCHONDRIAL IMPORT 1529

thenonmitochondrial XA6A7 as a control. Theywere thensubjected to axonal treatment with rotenone, and theresulting axonal fragmentation was quantified 16 h later,as has beendescribed (17). In agreement with our earlierstudy, wild-type X protein conferred a strong (80%)axonal protection (Fig. 6). Indeed, the axonal fragmen-tation in X-expressing neurons upon rotenone exposurewas dramatically reduced (by ;6 times), because itincreased only 3-fold as opposed to 17-fold in controlneurons. The XD2–4 and XA4 mutants were even moreprotective, as the axonal fragmentation was reduced by 8and 9 times, respectively. Indeed, fragmentation was in-creased by a modest 1.5-fold after rotenone exposure forXD2–4-expressing neurons, and the XA4 protein con-ferred a striking complete protection from rotenoneaxonal damage.

DISCUSSION

The goal of this study was tomap the different intracellulartransport signals within BDV X sequence, to enhance itsmitochondrial addressing and thereby to possibly improveits neuroprotective potential. In this study, we demon-strated that the 5–16 domain of the X protein carries 2

overlapping targeting signals—an NES and an MTS—andthat the D4 residue is essential for nuclear targeting. TheMTS sequence present in the X protein indeed enabledmitochondrial targetingwith almost the sameefficacy thanthe COX10-MTS control, whereas the addition of theN-terminal SSD sequence of X (X2–4) totally abrogatedmitochondrial targeting of eGFP (as observed with theX1–16-eGFP and X1–20-eGFP constructs). Indeed, the 5–16sequence presents hydrophobic residues immediately fol-lowed by positively charged residues, as observed for mostMTS (40, 41).Our results also suggest an interdependencebetween nuclear and mitochondrial localization of X.The deletion, or mutation, of the D4 residue within theX sequence actually induced a loss of interaction withimportin-a, thus possibly explaining the decreasednuclear localization. Moreover, these modifications ofthe X N-terminal sequence also enhanced the mito-chondrial localization of the protein, which can beexplained by a better mitochondrial import as a con-sequence of the loss of an acid residue in the MTS.Indeed, such a situation was found for several proteinsthat possess dual and competitive localization—inparticular, between endoplasmic reticulum and mito-chondria (42, 43). Since X is known to reach thenucleus in the course of viral replication, the SSDsequence may enable the balancing of the targeting of

Figure 5. Enhanced mitochondrial localization of mutant Xproteins has an enhanced impact on mitochondrial networkmorphology. Primary cortical neurons were transduced withlentiviral vectors expressing wild-type or mutated X proteins.A) The subcellular distribution of the X and mitochondrialnetwork were analyzed by immunofluorescence analysis ofBDV X protein and Tom20. B) Representative examplesof maximum intensity projection confocal images of primarycortical neurons expressing wild-type X or the XD2–4 and XA4mutants that display enhanced mitochondrial localization.The previously described nonmitochondrial mutant of X(XA6A7)(16) is shown as a control. Cells were stained for theneuronal marker bIII-tubulin (b-tub, red) and the phosphor-ylated form of DRP1 on S616 residue (pDRP1, green). Scalebars, 10 mm. C) The intensity of pDRP1S616 fluorescence perneuron was quantified in 6 z slices for each neuron(integrative density, ImageJ software) and the means of 10neurons were measured for each case in each experiment. Foreach experiment, images were randomly chosen amongduplicate cultures on 2 different coverslips (n = 7 indepen-dent experiments). Data are means 6 SD. *P , 0.05, Mann-Whitney U test.

Figure 6. Enhanced mitochondrial localization of mutantX proteins confers higher neuroprotective capacity. Orientedneuronal cultures grown in microfluidic devices were trans-duced or not (mock) with lentiviral vectors expressing wild-typeX or mutants XD2–4, XA4, or XA6A7. After 12 d of culture,neurons were subjected to an axonal treatment with rotenone,and the resulting axonal fragmentation was assessed. A)Representative examples of images from the axonal chambersof neuronal cultures after axonal treatment with 1 mM rotenonefor 16 h. B) Axonal fragmentation (based on b-tubulinstaining) was quantified (17). Axonal fragmentation indexesare represented as means of the fragmentation indexes of 4images acquired randomly within the axonal chamber of eachoriented neuronal culture. Each point represents an in-dependent neuronal culture (n = 4 independent experi-ments). Data are the means 6 SD. **P , 0.01, Mann-WhitneyU test.

1530 Vol. 30 April 2016 FERRE ET AL.The FASEB Journal x www.fasebj.org

neosynthesized X between nuclear and mitochondrialcompartments (Fig. 7). Indeed, the X protein playsimportant roles during the viral infection, both in thenucleus, as a cofactor for the polymerase, and in themitochondria, to protect cells during viral replication.The possible impact of an almost exclusively mito-chondrial X, such as that described in this study, isdifficult to predict in the context of BDV infection. Thelack of cofactor activity normally mediated by theX protein in the nucleus may indeed be deleterious forviral fitness but, conversely, cells would be better pro-tected from virus-mediated death.

Our experiments using LMB, together with ourobservation of a coimmunoprecipitation between Xand CRM1, revealed that the N-terminal sequence ofX contains a bona fide CRM1-dependent NES, whichdiffers slightly from the prototypical sequence (24),similar to many other efficient NES described in theliterature (see Ancillary Fig. 2C, Dryad). Moreover,our data suggested that the NES function is necessaryfor efficient mitochondrial targeting. Nuclear andmitochondrial localization of X protein may there-fore be tightly linked, and a sequential transport mayeven occur, at least for part of the X protein, first intothe nucleus and then into the mitochondria (Fig. 7).Such an indirect intracellular routing has been reportedfor themitochondrialmatrixGTPasenitric oxide-associated1(NOA1), which exhibits a comparable nucleomitochondrial-addressing pathway (44). As for the X protein, NOA1 doesnot contain a canonical CRM1-specificNES sequence, butthe authors stressed the fact that such a signal could befound by orienting the NOA1 sequence from the C to theN terminus. Then, NOA1 presents the sequence 236-LDPLLADPLDL-226, which indeed perfectly matches theconsensus NES (24). The same holds true for the domainwithin residues 7–16of theXprotein: 16-LRRVLELLTL-7.One could therefore hypothesize that the presence of areverse and still active CRM1-dependent NES may confer

this nucleus-to-mitochondria routing property, which re-mains to be further explored.

Hence, despite its 10 kDa size, which would allow apassive diffusion through the nuclear membranes, theregulation of the intracellular trafficking of the X pro-tein relies on its ability to bind to active cellular trans-porters. A comparable situation has been observed forother viral proteins that are endowed with functionsrequiring their active addressing to different subcellularcompartments. For instance, the Tat protein of HIV-1,which is approximately the same size as X, was shown totraffic from the nucleus to the plasma membrane—andeven through the membranes from cell to cell—by anonconventional active transport machinery [reviewedin ref. 45].

The discovery and understanding of core principles incellular biology have long benefited from the conflictingrelationship of viruses with their host cells. Conversely, theidentificationof the translocation signal sequencespresentin viral proteins has helped to better the understanding ofthe modalities of protein trafficking between the dif-ferent subcellular compartments. For instance, the firstNLS was detected within the Simian virus 40 large Tantigen (46), whereas the leucine-rich NES was first char-acterized in the HIV-1 Rev protein and in the cyclic-AMP-dependent protein kinase inhibitor (47). Knowledge aboutthe cellular impact of X shuttling between nucleus and mi-tochondria could similarly contribute to the elucidation ofthe cellular bases of mitochondrial management of cellularstress, thereby providing another example of the impor-tanceof studyingvirus–host interactions todeciphercellularpathways.

Based on our results with eGFP fusion proteins, wewere able to design 2 mutant X proteins that exhibitenhanced mitochondrial localization through theloss of an acidic residue (D4) which is both deleteri-ous for the MTS sequence and critical for the bindingof the protein with importin-a, thus a priori for itsability to be actively transported within the nucleus.Moreover, this work surprisingly points out that themore X is located in mitochondria, the less the cyto-solic DRP1 is activated. In addition, the kinases re-sponsible for DRP1’s activating phosphorylation onS616 are cyclin-dependent kinase (CDK)-1 and -5,which have been shown to trigger mitochondrial fis-sion during mitosis as well as in response to stressesin postmitotic neurons (48–50). It would thereforebe important to analyze in detail the impact of Xexpression on mitochondria/cytosol and mitochondria/nucleus crosstalk. For instance, it was recently shown thatthe cyclin B1/Cdk1 complex could be actively im-ported within mitochondria to mediate antiapoptoticfunctions through phosphorylation of P53 (51) andregulation of ATP-synthase activity (52). Thus, a bettercharacterization of X binding partners in mitochon-dria and in the nucleus will undoubtedly be one of thekeys to understand the X-mediated impact on mitochon-drial physiology. Indeed, competition between bindingpartnersofXhasactuallybeenproposedasamechanismfornucleocytoplasmic shuttling of viral components duringinfection (27). Similarly, differential binding with yet un-identified cellular partners ofX could account formodifiedmitochondrial addressing and, as a consequence, of

Figure 7. Hypothetical model of BDV X protein trafficking inthe cell. Solid lines: active protein transport pathways; dashedlines: passive diffusion. Light gray boxes: different sequencesignals. The action of CRM1 inhibition (by LMB) and ofmutations in the importin-a binding motif (D2-4 and D4A) inthe X N-terminal sequence are also represented.

DETERMINANTS OF BDV X PROTEIN MITOCHONDRIAL IMPORT 1531

enhanced mitochondrial filamentation and neuro-protective potential.

Last, in our study, these hypermitochondrial X mu-tants displayed enhanced neuroprotective properties,further stressing the importance of efficient mito-chondrial targeting for potential therapeutics againstneurodegenerative disorders using the X protein orderived peptides. Moreover, the enhanced neuro-protective potential of the X mutants correlated wellwith decreased fission activity, through decreased levelsof DRP1-activating phosphorylation, thereby confirmingour initial observations of a parallel between the impact ofthe X protein on the filamentation of the mitochondrialnetwork and its ability to protect from axonal damage,both in vivo and in vitro (17).Thisfindingalso confirms thegrowing view that mitochondrial dynamics regulationgoverns most mitochondrial functions—in particular, theability to respond to stressesand todecidebetweenapoptosisand survival—and, in turn, emphasizes the importance oftargeting mitochondrial dynamics in further developmentof efficient therapeutics for mitochondria-based patholo-gies, especially neurodegenerative disorders.

The authors thank A. Betourne, R. Liblau, C. E. Malnou, andA. Saoudi (all from INSERM UMR 1043, Toulouse, France)for critical reading of the manuscript and insightful editorialcomments; S. Allart and A. Canivet (CPTP Imaging platform)for technical assistance; E. Bonnaud (INSERM UMR 1043) forhelp in preparing primary neuronal cultures; and C. Didier(Centre National de la Recherche Scientifique, Toulouse,France) for the gift of the anti-cyclin B1 antibody. This workwas supported by institutional grants from INSERM andCentre National de la Recherche Scientifique (to D.G.D.),funds from Project ANR-12-EMMA-0016-01 (to D.G.D. andJ.M.P.), the INSERM Transfert CoPoC Fund (to D.G.D.), andfunds from European Research Area Networks (ERA-NET)–Network of European Funding for Neuroscience Research(NEURON) MicroDeg (to J.M.P.). The authors declare noconflicts of interest.

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Received for publication August 25, 2015.Accepted for publication December 8, 2015.

DETERMINANTS OF BDV X PROTEIN MITOCHONDRIAL IMPORT 1533

253

254

Figure 45 : Interaction entre les protéines X et Hspa9.

A) Expression relative de la protéine Hspaç (mortalin) dans des neurones embryonnaires corticaux de rats non transduits (en blanc) ou transduits avec la protéine X (en noir). En cas de stress oxydatif à la roténone, l’expression d’Hspa9 diminue d’environ 50%, mais de 20% uniquement si les neurones expriment la protéine X (n=3). B) Immunoprécipitation de la protéine Hspa9 dans des cellules HEKs non transduites (NT) ou exprimant la protéine (X) et mise en évidence d’une interaction avec la protéine X par western blot. C) Interaction directe entre X et Hspa9 identifiée par expérience de GST pull-down où la GST-Hspa9 lie la protéine X du BDV mais pas la protéine contrôle N du BDV. Expériences réalisées par Marion Szelechowski et Anne Thouard, INSERM U1043, CPTP.

A)

B) IP : Hspa9 INPUT

NT NT X

X

Hspa

GST-Hspa9

pull down

X N X N

hspa9

Input

C)

255

III) La protéine mitochondriale Hspa9 : un autre candidat

neuroprotecteur

1. Sous-expression dans un modèle murin de la maladie de Parkinson

Nous l’avons vu dans l’introduction, la mortaline est sous exprimée dans un modèle

Parkinson obtenu chez le rat par injection de 6-hydroxy-dopamine (Chiasserini, Tozzi et al.

2011). Nous avons ensuite voulu confirmer ces observation dans un modèle in vitro de MP

induit par un inhibiteur du complexe I de la chaîne respiratoire (la roténone) sur des neurones

corticaux de rat en culture primaire. En effet, nous avons observé, par western blot sur

mitochondries isolées, une diminution de l’expression d’Hspa9 (Figure 45, A). Fait

particulièrement intéressant, lorsque les neurones expriment la protéine X, cette perte

d’Hspa9 est limitée d’un facteur 1,5 (Figure 45, A).

2. Son interaction avec la protéine X

Dernièrement il a été suggéré qu’Hspa9 détenait une fonction de protection contre la

neurodégénérescence (Burbulla, Krebiehl et al. 2010) (Wadhwa, Taira et al. 2002a). Etant

donné que la protéine X semble limiter la diminution de l’expression d’Hspa9, du moins dans

notre modèle, et qu’elle interagit, lors de son trafic nucléocytoplasmique, directement avec

Hspa8 (protéine homologue d’Hspa9), l’équipe a voulu déterminer si ces deux protéines

interagissaient. Dans un premier temps, une expérience de spectrométrie de masse a pu

mettre en évidence que la X interagissait avec Hspa9 et cela a été confirmé par

immunoprécititation contre Hspa9 suivie d’un western blot pour les protéines Hspa9 et X. Puis

une expérience de pull down a permis de montrer que cette interaction était directe (Figure

45, B).

3. Son rôle neuroprotecteur

Sur la base de ces résultats, il nous a semblé important de préciser l’impact de la

256

257

surexpression d’Hspa9 dans le modèle in vitro de la MP que nous utilisons. En effet, il a été

démontré, ces dernières années, que la surexpression d’Hspa9 permettait une protection

dans un modèle in vitro de MA, et que la surexpression de la mortaline empêchait la mort

cellulaire médiée par l’Aß dans des cellules de neuroblastome, mettant en jeu notamment la

fragmentation mitochondriale (Park, Shin et al. 2014).

a. Matériels et Méthodes

• Construction de lentivecteurs Hspa9, Scramble, et shHspa9

Les lentivecteurs exprimant l’ARN "small hairpin" dirigé contre Hspa9 et le témoin

négatif, "scramble", ont été dessinés et produits par la société OriGene. Le gène Hspa9 a été

amplifié par PCR à partir d’extrait de cellules HEK (Human Embryonic Kidney 293T). Une fois

amplifiée, la séquence Hspa9 a été clonée dans le plasmide, vecteur lentiviral, pTrip

(aimablement fourni par le Dr. P . Charneau, Institut Pasteur, Paris, France) en aval de

l’enhancer constitutif du cytomégalovirus (CMV) et du promoteur chicken –actin (CAG). Les

vecteurs lentiviraux ont été produits par co-transfection de cellules HEK 293T avec les

plasmides d'encapsidation de deuxième génération : psPAX2 et pMD2.G (plasmides Addgene

12260 et 12259, fournis par D. Trono, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Suisse) et le

plasmide pTRip exprimant Hspa9. Les lentivecteurs ont ensuite été récoltés comme décrit

dans (Szelechowski, Betourne et al. 2014)

• Cultures de neurones primaires en chambres de culture microfluidiques et transduction

Les chambres de culture microfluidiques ont été préparées comme précédemment

décrit dans : (Magnifico, Saias et al. 2013). Brièvement, les chambres de culture ont été

moulées avec du polydiméthylsiloxane versé dans un masque de résine de silicone SU-8 ayant

pour motif, en relief positif, des compartiments de culture cellulaire séparés par des micro-

canaux (design et réalisation par l’équipe de Jean-Michel Peyrin, CNRS UMR 8256, UPMC,

Paris, France). Les impressions de polymères élastomères résultantes ont été détachées et les

réservoirs ont été créés manuellement à l'aide d'un punch à biopsie. Après avoir été nettoyées

258

Figure 46 : Schématisation de la plateforme microfluidique (A) et vérification de la sous-ex-pression ou de la surexpression d’Hspa9 en Western Blot (B).

Cf Matériels et Méthodes.

1ml 2ml 5ml 1ml 2ml 5ml 10ml 0ml 1ml 2ml 5ml 10ml

LV-scr LV-shHspa9 LV-Hspa9

actine

Hspa9

A)

B)

02468

101214161820

0 µl 1 µl 2 µl 5 µl 10 µl

Rat

io t

o 0m

l LV

-Hsp

a9

LV-Hspa9

surexpression d'Hspa9

259

par de l’isopropanol, les puces et les lamelles de verre (Thermo Scientific) sont traitées 1

minute par un pinceau plasmatique. Ces deux éléments sont ensuite liés ensemble, les

chambres et canaux sont hydratés avec de l'eau stérile, stérilisés sous UV pendant 15 minutes

et recouverts de poly-ornithine (12h) puis de laminine (4h). Les cultures de neurones primaires

sont préparées comme décrit ci-dessus et sont ajustées à une concentration finale de 5x107

cellules/ml, puis 3ml de suspension cellulaire (150 000 neurones) sont ensemencés dans les

chambres somatiques (par le réservoir supérieur). Au bout de 1 ou 2 minutes, lorsque les

neurones se sont fixés au substrat, les réservoirs sont remplis avec du milieu complet de

culture neuronale. Un volume différentiel moyen de 10ml est maintenu entre les chambres

somato-dendritiques et les chambres axonales pour assurer un flux hydrostatique permanent.

Les neurones sont transduits, 3 jours après l’ensemencement, avec des vecteurs lenti-

viraux dilués dans le milieu de culture des chambres somatiques et exprimant la protéine

Hspa9 (LV-Hspa9), un shHspa9 (small hairpin RNA dirigé contre Hspa9, LV-shHspa9) ou un

shRNA scramble comme témoin négatif (LV-scr) (Figure 46, A).

• Mesure de la neuroprotection après induction d’un stress oxydatif

Après 12 jours, les neurones en culture primaire orientée sont soumis à un stress oxy-

datif par traitement à la roténone pendant 16 heures (2 mM en milieu low-glucose,(qui permet

de révéler l’effet de la roténone) soit du DMEM avec 1g/L de glucose (Invitrogen) supplémenté

avec 0,5mM de glutamine + 1% de pénicilline/streptomycine + les suppléments : 2% B-27 +

1% N2 (Invitrogen)). La toxine a été ajoutée dans les chambres somatique ou axonale pour

induire, respectivement, un stress somatique ou axonal (Figure 46, A).

Pour évaluer l’effet neurotoxique, la fragmentation axonale est ensuite mesurée,

comme décrit dans (Szelechowski, Betourne et al. 2014). En bref, après immunodétection de

la III-tubuline , les spots de tubuline correspondant aux axones fragmentés ont été détectés

puis dénombrés grâce à une macro sous le logiciel ImageJ créée par Astrid Canivet (Ingénieure

de Recherche, plateau d’imagerie du Centre de Physiopathologies de Toulouse-Purpan). La

260

261

surface totale de III-tubuline est mesurée par le logiciel ImageJ également pour chaque

image. Ainsi le nombre de spots divisé par la surface totale de III-tubuline définit un index de

fragmentation (Magnifico et al., 2013). Les photographies ont été prises au hasard dans 4

champs différents de la chambre axonale de chaque chambre de culture microfluidique. Un

marquage au DAPI (Vector) a été réalisé dans les chambres somatiques afin de vérifier la via-

bilité cellulaire et s’assurer qu’il n’y a pas eu de fuite de roténone (maintien du flux hydrosta-

tique) lors du traitement axonal (les chambres de culture présentant plus de 20% de noyaux

pycnotiques sont retirées de l’analyse).

• Confirmation de la surexpression ou de la sous-expression d’Hspa9

Afin de vérifier l’efficacité des constructions lentivirales 700 000 neurones corticaux

de rat en culture primaire (J9) ensemencés sur des boîtes de culture de 10cm de diamètre

sont transduits avec 1ml, 2ml, 5ml ou 10ml de LV-Hspa9, de LV-scr ou de LV-shHspa9. Trois jours

après, ces neurones sont lysés dans du tampon RIPA [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 150 mM,

NP40 à 1%, désoxycholate de sodium à 0,5% et 0,1% de SDS]. Pour le dépôt sur gel

d’électrophorèse, 10ml de tampon Laemmli [Tampon 5X Laemmli : 50 mM Tris-HCl (pH 6.8),

2% SDS, 10% glycérol, 0.4% bleu de bromophénol, et 200 mM DTT] sont ajoutés à 40ml de

solution protéique. Les échantillons sont déposés sur gel polyacrylamide (Ready Gels Bio

rad), la migration effectuée dans du tampon MES [2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid;

Thermo Scientific–Life Technologies] puis les protéines sont transférées sur une membrane

de nitrocellulose (cat. no. 10600002; GE Healthcare). Cette dernière est ensuite incubée avec

du tampon de blocage durant 1 heure (MB-070 ; Rockland Immunochemicals). Les protéines

sont révélées par des incubations successives avec des anticorps primaires (anti actine 1 : 100

000 (sigma), anti-Hspa9 1 : 2000 (OriGene)) dilués dans ½ de TBS et ½ de tampon de blocage,

suivies de trois rinçages au TBS-Tween 0,1% et de trois rinçages au TBS seul. Puis la membrane

est incubée avec des anticorps secondaires Alexa Fluor-680 et 770 (dilués à 1 : 15 000, Jackson

ImmunoResearch). Après rinçages, la membrane est scannée avec l’imageur Odyssey (Li-Cor).

Pour chaque condition, l’intensité de la bande correspondant à la protéine Hspa9 est

normalisée sur celle correspondant à l’actine afin de pouvoir comparer les quantités relatives

262

Figure 47 : La surexpression d’Hspa9 confère une capacité neuroprotectrice face à la fragmentation axonale induite par la roténone.

Les neurones primaires en cultures orientées en chambres microfluidiques ont été transduits ou non (Empty) avec des lentivecteurs exprimant la protéine Hspa9 wild-type, un shHspa9 (ARN interférent dirigé contre Hspa9) ou un témoin négatif de l’interférence à ARN et de la transduction : scramble (scr). Après 12 jours de culture, les neurones ont été soumis à un stress oxydatif par application axonale de roténone et la fragmentation axonale résultante a été évaluée. (A) Exemples représentatifs d’images des chambres axonales de neurones non traités ou traités avec 2µM de roténone pendant 16h. (B) La fragmentation axonale (basée sur

l’immunodétection de la III-tubuline) est quantifiée. Les index de fragmentation axonale représentés résultent de la moyenne des index de fragmentation de 4 images acquises de façon aléatoire à l'intérieur de la chambre axonale de 2 ou 3 chambres microfluidiques. Chaque point représente une culture indépendante (n=3 expériences indépendantes). Test statistique de Mann Whitney, *= p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,005)

A)

B) ***

Em

pty Scr

Hsp

a9

ShH

spa9

Em

pty Scr

Hsp

a9

ShH

spa9

Em

pty Scr

Hsp

a9

ShH

spa9

0.0

0.2

0.4

0.6

Ax

on

al F

rag

me

nta

tio

n In

de

x

NT Rote Soma Rote Axon

** *

263

en Hspa9. La sous-expression d’Hspa9 par phénomène d’interférence à ARN est effective

puisque dès 1ml de LV-shHspa9 déposé sur 700 000 neurones, la protéine Hspa9 n’est plus

détectable en Western Blot. De plus, dans ces conditions, l’expression de la mortaline est

doublée (Figure 46, B).

b. Résultats

Comme décrit dans « Matériels et Méthodes », les neurones non transduits (NT,

exprimant la protéine Hspa9 endogène), les neurones sur-exprimant ou sous-exprimant Hspa9

(LV-Hspa9 et LV-shHspa9 respectivement), ou les neurones témoins (LV-scr) sont soumis à un

traitement axonal à la roténone (2µM) et la fragmentation résultante a été quantifiée 16

heures plus tard, comme précédemment décrit. Nous remarquons, d’ores et déjà, que les

neurones sous exprimant Hspa9 sont moins denses et présentent une fragmentation axonale

initiale avant tout traitement à la roténone (Figure 47 A et B). Cela est attendu étant donné

l’importance des chaperonnes dans le bon fonctionnement cellulaire en général. Lorsque le

stress est appliqué sur les somas, l’ensemble des axones est fragmentés, et ce, quelle que soit

la condition (Figure 47,B). De façon intéressante, la surexpression d’Hspa9 (au minimum d'un

facteur 2), confère une forte protection des axones (75%) par rapport aux neurones témoins

Empty ou LV-scr. En effet, la fragmentation axonale, dans les neurones sur-exprimant Hspa9

lors de l'exposition à la roténone, est considérablement réduite (par 4), car elle n’augmente

quasiment pas (par rapport aux neurones non traités, NT) alors qu’elle est multipliée par 4

pour les neurones contrôles (Figure 47, B).

264

265

4. Impact de la surexpression de la protéine hspa9 sur la dynamique mitochondriale

a. Matériels et Méthodes

• Immunofluorescence et imagerie

Les neurones sont fixés pendant 20 minutes à température ambiante avec du PBS

contenant 4% de paraformaldéhyde (PFA). Les cellules sont ensuite perméabilisées avec du

PBS + 0,25% de Triton-X100 pendant 15 minutes sous agitation et rincées avec du PBS. Le

blocage des sites non spécifiques est réalisé par incubation dans du PBS + 2,5% de sérum de

chèvre et 5% de BSA pendant au minimum 1 heure. Les cellules sont incubées pendant 2

heures à 37°C dans les solutions d’anticorps primaires, puis rincées deux fois 10 minutes dans

du PBS-Triton-X100 0,1% et une fois dans du PBS. Après incubation durant 45 minutes à

température ambiante dans les solutions d’anticorps secondaires (Sigma), elles sont rincées

de la même façon. Les lamelles sont montées avec du milieu Vectashield contenant du DAPI

(Vector). Les anticorps primaires sont dilués dans du tampon de blocage aux dilutions

suivantes : anti-βIII-tubuline au 1/500 (Sigma), anti-Tom20 au 1/500 (Santa Cruz

biotechnology), les anticorps secondaires au 1/500 dans du PBS.

Toutes les analyses et mesures basées sur la microscopie de fluorescence ont été

réalisées sur un microscope confocal inversé SP8 (Leica) avec un objectif 63X.

• Analyse du réseau mitochondrial

Les neurones ont été cultivés pendant 9 jours à faible densité sur lamelles de verre de

12 mm de diamètre placées dans des plaques de 24 puits (5x104 cellules dans chaque puits).

La transduction par LV-Hspa9 se fait au jour 3. Le réseau mitochondrial des neurones non

transduits et LV-Hspa9 est analysé par immunodétection de la protéine mitochondriale Tom20

et par microscopie confocale. Les tailles des mitochondries, choisies aléatoirement dans les

prolongements neuronaux, ont été déterminées à l'aide du logiciel ImageJ et les

mitochondries ont été classées en fonction de leur taille (variant de <2 µm à > 8 µm), et

266

Figure 48 : La surexpression d’Hspa9 entraine une filamentation du réseau mitochondrial en

conditions physiologiques.

A) Exemple représentatif de d’images acquises au microscope confocal de neurones non

transduits (Empty) et des neurones transduits avec un lentivecteur exprimant Hspa9 (LV-

Hspa9). Les neurones sont marqués avec la III-tubuline neuronale (rouge) et la protéine

mitochondriale Tom20 (vert). Les panneaux inférieurs présentent un plus fort grossissement

de la zone encadrée pour illustrer les effets de la surexpression de la protéine Hspa9 sur

l’allongement mitochondrial. B) Analyse de la distribution des tailles des mitochondries dans

les neurones contrôles (NT en noir) et les neurones transduits avec Hspa9 (Hspa9 en gris). Les

données sont obtenues à partir de 14 neurones au minimum par condition pour une

expérience. Les expériences 2 et 3 sont en cours d’analyse.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

< 2 < 4 < 6 < 8 > 8

Ré

par

titi

on

de

la t

aille

de

s m

ito

cho

nd

rie

s (%

)

μm

Hspa9

NT

Tom 20 βIII tub βIII tub Tom 20 Merge Merge

+ LV-Hspa9 Empty

A)

B)

267

décomptées. Les pourcentages des différentes catégories de tailles mitochondriales sont

calculés pour chaque neurone, à raison de 14 à 16 neurones par conditions sur une

expérience.

b. Résultats

En accord avec les observations effectuées par (Park, Shin et al. 2014) dans un modèle

de MA, la surexpression d’Hspa9 entraîne un accroissement de taille, ou filamentation, du

réseau mitochondrial. En effet, l’analyse du réseau mitochondrial en microscopie confocale

révèle qu’il y a moins de mitochondries ponctiformes (moins 25% de mitochondries < 2µm) et

apparition de très grandes mitochondries (> 8µm) dans les neurites des neurones

surexprimant Hspa9 par rapport aux neurones contrôles (Figure 48, A et B). Il y a également 4

fois plus de mitochondries de taille intermédiaire (4µm < taille > 6µm) dans les neurones

surexprimant Hspa9. La seule observation montre que les somas des neurones surexprimant

Hspa9 présentent des mitochondries plus filamenteuses (Figure 48, A), bien que cela n’ait pas

été quantifié. Cette première expérience réalisée en conditions physiologiques demande à

être confirmée, mais les images prises pour les expériences n°2 et 3 semblent indiquer la

même tendance. Ces expériences ont également été réalisées en cas de stress oxydatif

engendré par la roténone et sont en cours d’analyse.

Nous l’avons vu, il existe une interaction directe entre la protéine X et la protéine

Hspa9 et, en cas de stress oxydatif, la protéine X empêche une diminution de l’expression

d’Hspa9. La surexpression d’Hspa9 permet, à elle seule, une surfilamentation du réseau

mitochondrial. Ainsi, la stabilisation d’Hspa9 par la X pourrait expliquer, du moins en partie,

l’effet de cette dernière sur la dynamique mitochondriale. Il serait par la suite intéressant de

regarder l’effet de la surexpression d’Hspa9 sur la phosphorylation de l’acteur de fission Drp1

comme cela a été fait pour la protéine X.

268

Figure 49 : La surexpression d’Hspa9 protège aussi bien le potentiel de membrane

mitochondrial que l’expression de la protéine X en cas de stress oxydatif.

Comparaison du potentiel de membrane mitochondrial de neurones surexprimant Hspa9

(minimum X2) ou exprimant la protéine virale X, à l'aide de la sonde JC-1, après incubation des

neurones avec une gamme de concentrations de roténone ou du FCCP (100µM). Les valeurs

indiquent les moyennes et écarts-types de 4 expériences indépendantes avec 4

points/conditions (test statistique de Mann Whitney, *= p<0,05, **=p<0,01).

0 10 20 100

500

1000

FCCP

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Re

lativ

e J

C1

NT

X

Hspa9

rotenone (nM)

** p=0.07 *

269

5. Impact sur la bioénergétique

Puisque Hspa9 possède le même impact que la protéine X sur la taille des

mitochondries, nous avons souhaité tester si elle agissait de manière semblable sur la

propriété bioénergétique mitochondriale de maintien du potentiel de membrane en cas de

stress oxydatif. Parallèlement aux expériences décrites ci-dessus réalisées avec des neurones

non transduits ou exprimant la protéine X, nous avions également surexprimé la mortaline

dans des neurones soumis à un stress à la roténone. Grâce à la sonde JC-1 (Mat. et Mét. I) 3)

a)) nous avons pu observer que le potentiel de membrane des neurones surexprimant Hspa9

se comportait exactement comme celui des neurones exprimant la protéine X en cas de stress

oxydatif (Figure 49). Comme la X, la surexpression d’Hspa9 permet le maintien de 70% du

ΔΨm (pour des doses de 100 à 500nM de roténone) et d’au moins 65% du ΔΨm pour un

traitement à 1µM de roténone, alors que les neurones témoins (NT) n’ont préservé que 50%

de leur ΔΨm (Figure 49).

Pris dans leur ensemble, nos résultats confirment l’importance de l’interaction entre

ces deux protéines, notamment de la stabilisation de l’expression d’Hspa9 par la protéine X

pour une protection des neurones. Nous pourrions extrapoler le fait que la perte d’expression

d’Hspa9 dans notre modèle in vitro de MP est aussi bien compensée par le doublement de

l’expression initiale d’Hspa9 que par une préservation de cette dernière grâce à la présence

de la X.

270

271

DISCUSSION ET PERSPECTIVES

272

Figure 50 : Contrôle de la perméabilisation membranaire mitochondriale (MMP) par les

protéines virales.

Un certain nombre de polypeptides viraux modulent l'apoptose, soit en favorisant, soit en

inhibant la MMP. Ce contrôle peut être exercé directement sur les mitochondries ou sur des

étapes en amont/aval de la cascade apoptotique.

ADV, adenovirus; AEV, avian encephalomyelitis virus; ASFV, African swine fever virus; BLV,

bovine leukemia virus; BCV, baculovirus; CMV, cytomegalovirus; EBNA, Epstein–Barr nuclear

antigen; EBV, Epstein–Barr virus; Env, envelope glycoprotein complex; FMDV, foot-and-

mouth disease virus; FPV, fowlpox virus; cHV-68, cherpesvirus 68; HBV, hepatitis B virus; HBx,

HBV X protein; HCV, hepatitis C virus; HHV-8, human herpesvirus 8; HIV-1, human

immunodeficiency virus 1; HPN, herpesvirus pan; HPO, herpesvirus papio; HPV, human

papillomavirus; HTLV-1, human T lymphotropic virus 1; HVS, herpesvirus saimiri; IAV,

influenza A virus; KSBcl-2, Kaposi sarcoma Bcl-2; M, matrix protein; MXV, myxoma virus; NS,

non structural protein; ORF, open reading frame; P, phosphoprotein P; PPVO, parapoxvirus

ORF virus; PTPC, permeability transition pore complex; PLV, poliovirus; RID, receptor

internalization and degradation complex; SARS-CoV, severe acute respiratory syndrome

coronavirus; VACV, accinia virus; vIAPs, viral inhibitor of apoptosis proteins; vICA, viral

inhibitor of caspase-8 activation; vMAP, viral mitochondrial antiapoptotic protein; Vpr, viral

protein R; VSV, vesicular stomatitis virus; WDSV, Walleye dermal sarcoma virus; WNV, West

Nile virus. D’après (Galluzzi, Brenner et al. 2008).

273

La protéine X est-elle un bon candidat neurothérapeuthique ?

Aujourd’hui encore, les causes des maladies neurodégénératives demeurent irrésolues

tant l’on constate de facteurs familiaux et/ou génétiques conjugués aux facteurs

environnementaux liés à l’histoire de vie. Le risque de développer la maladie d’Alzheimer

progresse significativement avec le vieillissement et devient important après 60 ans (2,7% de

patients Alzheimer âgés de 60 ans et 15% des plus de 85ans), ce qui n’est pas forcément le cas

pour les autres maladies neurodégénératives. Les mécanismes intimes de ces maladies sont

encore inégalement identifiés. Les liens entre les symptômes et les anomalies de connexion

neuronale, les mécanismes de mort cellulaire et de dégénérescence axonale sont encore

débattus.

Les stratégies thérapeutiques tentent de répondre, par leur diversité, au faisceau de

symptômes de ces maladies. En dépit des prodigieux progrès des neurosciences, il s’agit

cependant davantage de traitements symptomatiques, d’adaptation et de préservation de

l’autonomie que de guérison. Si ces prises en charge contribuent à améliorer le quotidien de

milliers de patients, l’enjeu de la neuropharmacologie est bien la mise au point de traitements

curatifs. C’est dans ce contexte que notre équipe a découvert le potentiel neuroprotecteur de

la petite protéine non structurale X du BDV.

Comme la X, il existe de nombreuses protéines virales possédant des propriétés anti-

apoptotiques (Figure 50). La plupart des virus codent pour des homologues des protéines anti-

apoptotiques Bcl-2 qui sont localisés préférentiellement à la mitochondrie et interagissent

avec les molécules proapoptotiques telles que Bax (ou ses homologues). C’est le cas de la

protéine E1B19K, codée par l’adénovirus humain 5 (HAdV), qui contient des domaines BH1- et

BH3-like. Elle bloque l’apoptose (mort cellulaire programmée) médiée par les récepteurs TNF-

en liant et en inhibant le changement conformationel de Bax par tBid, en aval de l’activation

de la caspase-8 et en amont de celle de la caspase-9 (Perez and White 2000) (introduction

I). 3).d)) (Figure 50). La protéine FPV309, exprimée par le virus de la variole aviaire, contient

274

275

des domaines BH1 et BH2 hautement conservés ainsi qu’un domaine BH3-like, interagit avec

Bax et inhibe l’apoptose (Banadyga, Gerig et al. 2007) (Figure 50). Paradoxalement, la protéine

X ne possède aucun domaine conservé, que ce soit avec la machinerie apoptotique eucaryote

ou avec des protéines d’autres virus, même avec ceux qui appartiennent aussi à l’ordre des

Mononegavirales.

Cela fait d’elle un candidat particulier dont les mécanismes d’action exacts restent à

identifier. Cependant, son effet neuroprotecteur dépend de sa localisation mitochondriale et

nous avons pu montrer, au cours de mon travail de thèse, que la protection est d’autant plus

efficace que la localisation mitochondriale de la X est améliorée (Ferre, Davezac et al. 2015).

Cette propriété est particulièrement intéressante en raison du rôle central de la mitochondrie

dans les maladies neurodégénératives (pour revue (Bratic and Larsson 2013)). Les

phosphorylations oxydatives le long de l’ETC sont la source principale d’énergie dans la cellule.

Des troubles dans le métabolisme énergétique de la mitochondrie conduisent à une réduction

d’ATP, une altération de l’homéostasie calcique et une production excessive de ROS. Nous

l’avons vu, l’ensemble de ces évènements joue un rôle important lors du vieillissement et dans

les maladies neurodégénératives. Ainsi, l’exposition aiguë à des taux élevés d’oxydants,

particulièrement en présence de calcium, favorise la perméabilisation de la mitochondrie, le

découplage des phosphorylations oxydatives, avec des conséquences drastiques sur la

production d’énergie et contribue à la mort cellulaire par les voies de la nécrose et/ou de

l’apoptose (Beal 2005).

D’autres protéines ou composants viraux ont été utilisés en tant qu’agents

neuroprotecteurs notamment dans la maladie de Parkinson. C’est le cas de l’ARN non codant

p137, dérivé du transcrit 2.7 du cytomégalovirus humain qui peut prévenir et sauver les

neurones dopaminergiques de la mort cellulaire, in vitro et dans des modèles animaux de la

maladie de Parkinson (Kuan, Poole et al. 2012). Tout comme la protéine X, p137, dans un

contexte viral, joue un rôle anti-apoptotique lors de l’infection. Il a été démontré qu’il

protégeait l'activité du complexe I mitochondrial et la production d’ATP (Poole, Kuan et al.

2016). Pour faciliter son passage à travers la barrière hémato-encéphalique, cet ARN p137 a

276

277

été fusionné à un peptide dérivé de la glycoprotéine du virus de la rage. Ceci a permis d’obtenir

un effet neuroprotecteur par une simple administration périphérique intraveineuse de cet

agent, 3 jours après le début d'une lésion dopaminergique réalisée par injection de 6-

hydroxydopamine dans la substance noire (Kuan, Poole et al. 2012). Notre équipe a également

développé un peptide dérivé de la protéine X (PX3) qui, fusionné à la séquence MPP

(mitochondrial targeting, cell-permeable sequence) : F-R-Cha-K-F-R-Cha-K (Cha,

cyclohexylalanine), permet un effet neuroprotecteur dans un modèle murin de Parkinson, par

simple administration par voie intranasale. Cependant, dans ce cas précis, PX3 doit être

appliqué préventivement à la lésion dopaminergique induite par injection intrapéritonéale de

MPTP (Szelechowski, Betourne et al. 2014).

Quel est l’impact de la protéine X sur le fonctionnement mitochondrial ?

Dans les pathologies neurodégénératives, comme la maladie de Parkinson, les

neurones meurent suite à un processus de mort cellulaire programmée, « suicide », appelé

apoptose. Plusieurs études, in vivo et in vitro, ont montré que cette étape tardive de

destruction somatique était précédée de phénomènes précoces de dysfonctionnements

synaptiques et de dégénérescence axonale. L’analyse morphologique des neurones montre

que la dégénérescence s’effectue, progressivement, des terminaisons nerveuses vers le soma

(« Dying back pattern ») (Ozturk, Cengiz et al. 2013). Grâce au système de culture en chambres

microfluidiques (Peyrin, Deleglise et al. 2011) que nous avons utilisé, permettant une

compartimentalisation efficace des axones et des somas, l’équipe a pu démontrer que la

protéine X protégeait de cette fragmentation axonale suite à un stress oxydatif appliqué sur

les axones. Cette protection pouvait s’expliquer, du moins en partie, par le maintien du

potentiel de membrane mitochondrial ainsi que par une limitation de la production de ROS

(Szelechowski, Betourne et al. 2014). Au cours de mon travail de thèse, nous avons également

démontré que la X permettait également le maintien du m lorsque, à l’inverse, le stress

oxydatif était directement appliqué sur les corps cellulaires neuronaux et l’ensemble de leurs

neurites. Cette observation conforte les arguments en faveur du pouvoir neuroprotecteur

de la protéine X. Il semblerait que cette dernière permette également une protection des

278

279

paramètres de la respiration mitochondriale en cas de stress oxydatif, ces résultats restant

cependant à être confirmés et consolidés.

En conditions physiologiques, la protéine X ne semble pas avoir d’impact sur la

production de ROS, ni sur la respiration, malgré une tendance, non significative, à

l’augmentation de la capacité respiratoire maximale. Cependant le PX3, et probablement la

protéine X native, permettent une meilleure production d’ATP et donc d’énergie, en

conditions basales. Il reste maintenant à évaluer si la protéine X, ses mutants X2-4, XA4 et le

peptide sont capables de compenser les défauts énergétiques (baisse d’ATP) observés en cas

de stress oxydatif et entraînant des dysfonctions neuronales (Tiwari, Belenghi et al. 2002;

Wang and Michaelis 2010) .

Cet effet sur la production d’énergie serait d’autant plus important que nous

connaissons le rôle vital de l’ATP dans la plupart des réactions de synthèse, dans le

fonctionnement de la pompe Na-K de la membrane plasmique et dans le transport actif des

molécules. Une insuffisance dans la production d’ATP due à des dysfonctions mitochondriales

pourrait être un mécanisme central conduisant à la mort neuronale dans un large spectre de

maladies neurodégénératives. Cependant, un défaut d'énergie n'a jamais été directement

démontré dans les neurones affectés par ces maladies, ni lors de dégénérescence dans les

modèles expérimentaux, bien qu’un tel déficit de production d’ATP mitochondrial affecte la

croissance dendritique (Oruganty-Das et al., 2012). Par conséquent, en dépit de preuves

indirectes, on ne sait pas si un défaut de la production d’énergie se produit réellement dans

les neurones sensibles, en particulier de façon localisée dans des micro-domaines, et s’il est

responsable de leur mort. De toute évidence, nous avons besoin d'une compréhension

beaucoup plus approfondie de la façon dont les changements mitochondriaux conduisent à

un défaut énergétique. Cela requerrait de savoir faire la distinction entre les effets de la

morphologie, du transport, du turnover et de la formation de ROS mitochondriaux sur la

fonction bioénergétique. De plus, dans de nombreux cas, les défauts énergétiques observés

pourraient ne pas être un évènement initial, mais plutôt un effet secondaire, en aval des voies

280

Figure 51 : L’expression de la protéine X du BDV ne modifie pas les niveaux d’expression

d’OPA1 ou de DRP1 en conditions physiologiques ou en cas de stress oxydatif à la roténone.

Expériences réalisées par Marion Szelechowski. (A) Analyse en western blot d’extraits

protéiques préparés à partir de neurones en culture primaire non transduits (mock) ou

transduits avec les lentivecteurs exprimant la X native ou le mutant XA6A7 (LV-Xwt ou LV- XA6A7).

(B) Analyse semi-quantitative du western blot (Odyssey InfraRed imaging, LiCor Biosciences)

afin de déterminer la quantité relative d’OPA1 et de DRP1. Le ratio OPA1/DRP1 est représenté

pour 3 expériences indépendantes. L’actine est utilisée comme contrôle de charge protéique

et la protéine X comme témoin d’efficacité de la transduction.

281

de signalisation apoptotique (Pathak, Berthet et al. 2013). En effet, pour déterminer si des

changements dans la bioénergétique mitochondriale contribuent à la neurodégénérescence,

nous devons d'abord comprendre quels sont les besoins énergétiques « normaux » pour la

fonction et la survie neuronale et déterminer, si et comment, les niveaux d'énergie sont

modifiés lorsque les mitochondries sont compromises. Grâce à l’utilisation de nouvelles

techniques (senseurs fluorescents), une étude a pu fournir une mesure précise de la

production d’ATP mitochondrial, notamment au niveau des terminaisons nerveuses, régions

affectées dès le début de la neurodégénérescence. Pathak et al. ont pu définir les seuils

énergétiques nécessaires pour soutenir les différentes phases du cycle des vésicules

synaptiques (exocytose, endocytose…) et ils ont montré que, dans des conditions

physiologiques, l’ATP mitochondrial se disperse rapidement entre les boutons synaptiques,

même dans ceux où la mitochondrie est absente. Ils ont également montré qu’une inhibition

chronique ou aiguë de la chaîne respiratoire provoque une baisse des niveaux d’ATP

mitochondrial en dessous du seuil nécessaire pour l’endocytose, en particulier lorsque la

consommation d’énergie est accrue par une plus grande activité neuronale. Ainsi il a été

prouvé qu’un déficit mitochondrial, résultant de la perte de la protéine NDUFS4 (sous unité

du complexe I de l’ETC, mutée dans le syndrome de Leigh ou encéphalomyopathie) peut

provoquer une défaillance énergétique dans les neurones (Pathak, Shields et al. 2015).

Dans tous les cas, l’ensemble des effets de la protéine X observés sur la bioénergétique

mitochondriale est très certainement dû à l’impact de cette protéine sur la dynamique

mitochondriale en tant que telle. En effet, nous avons déterminé que la X, ainsi que son dérivé

PX3, entraînaient une filamentation accrue du réseau mitochondrial des neurones corticaux

de rats, aussi bien en conditions physiologiques qu'en cas de stress oxydatif. Ce processus

favoriserait ce qui est communément appelé "phénomène de complémentation

mitochondriale". Cette complémentation mitochondriale suppose que les produits de

l’ADNmt et autres composants matriciels sont échangés et partagés entre les mitochondries

et que ces dernières fonctionnent en réalité comme une unité cellulaire dynamique unique

dans les cellules vivantes (Sato, Nakada et al. 2009). Nous le savons, l’application d’un stress

oxydatif sur les neurones entraîne une surproduction de ROS qui va, entre autres, provoquer

une accumulation de mutations sur l’ADNmt. Or, les mitochondries dont l'ADN est muté

282

Figure 52 : L’expression de la protéine X du BDV diminue la quantité d’ARNm de la

kinase Cdk1

Expériences réalisées par Marion Szelechowski. Reverse transcription des ARN

messagers de neurones non transduits (NT) ou exprimant la X ou la XA6A7 puis PCR

quantitative dirigée contre Cdk1. Lés quantités rélativés d’ARN Cdk1 sont comparéés à

celles des neurones non transduits (normalisé à 1) pour 8 expériences indépendantes. Les

neurones transduits avec XA6A7 préséntént uné mêmé quantité d’ARN Cdk1 qué lé contrôlé

NT alors que les neuronés éxprimant la X éxprimént 2,5 fois moins d’ARN Cdk1.

283

peuvent fusionner avec d'autres mitochondries ayant de l’ADN de type sauvage, ce qui leur

permet de compenser les défauts des mitochondries endommagées en partageant leurs

composants aussi longtemps que le taux de mutation reste inférieur à 80-90% par cellule

(Nakada, Inoue et al. 2001). Les nucléoïdes mitochondriaux ne semblent pas échanger d’ADN

(Schon and Gilkerson 2010), mais, grâce à la fusion, les mitochondries se complètent

mutuellement et partagent leurs ARNs, protéines et lipides matriciels. Ainsi, une amélioration

de la filamentation du réseau mitochondrial peut atténuer les effets des dommages

environnementaux à la faveur de ces échanges inter-mitochondriaux. Elle maximise donc la

capacité d'oxydation en réponse à un stress toxique, tant que la contrainte est inférieure au

seuil critique du neurone.

De façon surprenante, la protéine X n’agit pas sur l’expression des principaux acteurs

de fission et de fusion : DRP1 et Opa1 respectivement (Figure 51 A et B). En revanche, notre

équipe avait démontré que la présence de la protéine X dans les neurones diminuait la

phosphorylation de la serine 616 de DRP1 et donc son activation (Szelechowski, Betourne et

al. 2014). Nous savons que cette phosphorylation est effectuée par la kinase Cdk1 (Cyclin-

dependent kinase 1), en particulier pour l’isoforme 1 DRP1 du cerveau, or dans des neurones

exprimant la X, l’ARNm de Cdk1 est 2,5 fois moins transcrit (ou moins stable) que dans des

neurones non transduits ou transduits avec le mutant XA6A7 non mitochondrial (Figure 52).

Ainsi, il semblerait que la protéine X agisse sur l’activation de DRP1 via une action sur la kinase

Cdk1. Cependant le mécanisme moléculaire mis en jeu reste à être déterminé.

Lors d’une première expérience, nous avons également montré que l’expression de la

protéine X ou de la présence de PX3 permet un maintien des mitochondries sous leur forme

filamenteuse dans un modèle murin, in vitro, d’atrophie optique dominante autosomique

(données non montrées). En effet, les travaux précédents de nos collaborateurs ont montré

que la sous-expression de l’acteur de fusion OPA1, par ARN interférence, entraînait non

seulement une fragmentation mitochondriale, mais affectait également leur fonctionnement

et leur distribution le long des dendrites ainsi que la croissance dendritique et la

synaptogenèse (Bertholet, Millet et al. 2013). Nous avons donc cherché à savoir si l’application

284

Figure 53 : Les mutants plus mitochondriaux de la X : XA4 et X2-4 entraînent une

filamentation du réseau mitochondrial en conditions basales.

Analyse de la distribution de la taille des mitochondries dans les neurones contrôles (NT) ou

dans les neurones transduits avec les lentivecteurs exprimant la X, le mutant non

mitochondrial XA6A7, témoin négatif, et les deux mutants plus XA4 et X2-4. Les données

représentent 1 expérience, 2 puits/ conditions, 10 à 12 neurones/puits.

0

10

20

30

40

50

60

70

NT XA6A7 X Xdelta2-4 XA4

% d

es m

ito

cho

nd

ries

Taille des mitochondries< 2 µm

< 4 µm

< 6 µm

< 8 µm

> 8 µm

285

de X, ou de peptide dérivé, pouvait compenser les conséquences de la diminution d’OPA1. De

fait, les premières expériences montrent que non seulement la X, et le peptide, permettent

de restaurer une taille mitochondriale normale dans ce modèle de neurodégénérescence mais

également de limiter la perte de l’arborisation dendritique. Ces résultats confirment le rôle

central de la dynamique mitochondriale dans le processus neurodégénératif et la pertinence

des stratégies thérapeutiques ciblant ce phénomène.

De plus, lors de ma thèse, nous avons observé que les neurones exprimant les mutants

plus mitochondriaux XA4 ou X2-4 possédaient encore moins de DRP1 activé que les neurones

exprimant la protéine X native (Ferre, Davezac et al. 2015). Néanmoins, lors d’une première

expérience, nous n’avons pas observé, chez ces neurones exprimant les mutants X plus

mitochondriaux, une plus grande proportion de mitochondries sous forme filamenteuse par

rapport aux neurones exprimant la X native (Figure 53). La persistance de petites

mitochondries ponctiformes dans les neurones exprimant la X ou ses mutants, pourrait être

expliquée par l’importance de la fission en particulier pour générer de nouveaux organites et

faciliter le contrôle qualité. En effet, l'élimination indispensable par autophagie des

mitochondries endommagées, la mitophagie, semble être intimement liée à l’équilibre entre

les processus de fission et de fusion mitochondriales. Une étude de la dynamique

mitochondriale sur des fibroblastes a montré qu'à partir d’une mitochondrie « mère », une

mitochondrie « fille » sur cinq est dépolarisée et éliminée par autophagie (Twig, Elorza et al.

2008). La mitophagie peut être inhibée par un mutant DRP1 dominant négatif (dont l’activité

GTPase est inhibée), ce qui suggère que la fission est nécessaire pour cet évènement (Twig,

Elorza et al. 2008). En résumé, les mitochondries défectueuses peuvent être toxiques en

générant des quantités excessives de ROS, en consommant de l'ATP par inversion de l’activité

ATP synthase et en interférant avec de nombreux d'autres processus métaboliques. Ainsi, les

faibles dommages mitochondriaux peuvent être corrigés par complémentation, mais les

mitochondries gravement endommagées, surtout en cas de stress oxydatif, pourraient

contaminer d'autres mitochondries et sont donc éliminées par mitophagie suite à différents

mécanismes (Gomes, Di Benedetto et al. 2011) (Head, Griparic et al. 2009; Wang, Winter et

al. 2011). Un autre argument contribuant à expliquer la persistance de la fission est qu’un

enchevêtrement important de mitochondries, fortement interconnectées dans des neurones

286

Figure 54 : Dynamique mitochondriale en temps réel sur cellules HeLa sauvages ou expri-

mant la protéine X ou ses mutants plus mitochondriaux X2-4 et XA4.

Des cellules HeLa sauvages et des lignées polyclonales Hela exprimant la X (HeLa X) ou ses

mutants plus mitochondriaux (HeLa X2-4 et XA4) sont transduites avec un lentivecteur

exprimant la protéine fluorescente dendra adressée à la mitochondrie. 3 jours après, leur

dynamique mitochondriale est analysée en temps réel grâce au microscope Spinning Disk

(Zeiss). Du FCCP (250 µM) est ajouté au milieu des cellules puis rincé (3 fois). La refusion est

considérée comme complète lorsque 90% des mitochondries ne se trouvent plus sous forme

fragmentée (ponctiforme).

HeLa XA4

é tat

basal

+ FCCP

250uM

3-4min

HeLa

Temps

apré s

rinçage

Refusion (11 min 50)

Refusion (3 min 22)

Refusion (2 min 10)

HeLa X HeLa XΔ2-4

Refusion (1 min 40)

287

déficients pour la fission, empêche leur mouvement efficace, en particulier, dans les dendrites

et les synapses (Verstreken, Ly et al. 2005) (Li, Okamoto et al. 2004) . La protéine X et ses

mutants plus mitochondriaux inhibent très certainement l’activité de DRP1 sans pour autant

l’annuler complétement.

Pour mieux comprendre les effets directs de la protéine X sur la dynamique

mitochondriale, j’ai pu, à la fin de ma thèse, réaliser des expériences pilotes par imagerie

cellulaire en temps réel sur cellules vivantes. Pour ce faire, j'ai utilisé des lignées de cellules

HeLa exprimant constitutivement la protéine X, ou ses mutants X2-4 et XA4, dans lesquelles j’ai

transduit un lentivecteur exprimant la protéine fluorescente Dendra fusionnée au signal MTS

de la protéine COX10. Grâce à la fluorescence verte présente au sein des mitochondries, j'ai

donc pu suivre leur dynamique en temps réel à l’aide d'un microscope confocal "spining-disk".

J’ai également réalisé des traitements avec le protonophore FCCP (250µM), afin d’entraîner

une fission complète et réversible de l’ensemble du réseau mitochondrial, avant de rincer les

cellules et d’observer le temps de « refusion » des mitochondries (Figure 54). Nous avons

constaté que ce dernier paramètre se produisait de façon plus rapide dans les cellules

exprimant la X, et que cette propriété était encore accentuée lorsque les cellules exprimaient

des mutants de la X plus mitochondriaux. La protéine X semble donc accélérer la dynamique

mitochondriale. Cependant, le FCCP est a été utilisé à des concentrations très élevées (250µM)

lors de ces expériences initiales, afin d’obtenir une fission de l’ensemble des mitochondries

en très peu de temps (2 à 4 min), et des expériences complémentaires sont nécessaires pour

vérifier dans quelle mesure il s’agit d’un effet dose-dépendant. Il reste encore à déterminer si

les mécanismes entrant en jeu avec ce traitement passent toujours par une inhibition de la

fusion mitochondriale à la suite de la dissipation du m (Legros, Lombes et al. 2002).

Une perturbation de l’homéostasie calcique neuronale est impliquée dans les troubles

cognitifs liés à l’âge et notamment dans la MA. Nous l’avons vu, avec le temps, les neurones

sont confrontés à une augmentation du stress oxydatif et à un défaut du métabolisme

énergétique ; ces derniers compromettent la fonction des protéines contrôlant l’excitabilité

des membranes et la dynamique calcique subcellulaire (Bezprozvanny and Mattson 2008). Le

288

289

Ca2+ est un composant central régulant les fonctions mitochondriales en participant à la

production d’ATP, au contrôle redox et à l’apoptose (Brookes, Yoon et al. 2004). Le rôle de la

régulation de la morphologie mitochondriale par le Ca2+ a de nombreuses fois été testé. C’est

ainsi qu’il a été démontré que la thapsigargine (un inhibiteur des pompes SERCA, SR/RE ca2+-

ATPase) entraînait une fragmentation mitochondriale réversible due à une augmentation de

Ca2+ dans les mitochondries (Hom, Gewandter et al. 2007). Cette fragmentation, dans des

cellules de foie de rat, est rapide (maximum 10 minutes), ce qui rendrait intéressante

l’utilisation de cet outil sur des cellules HeLa exprimant la X ou ses mutants plus

mitochondriaux. Nous pourrions voir si l’expression de ces protéines ralentirait la

fragmentation des mitochondries ou encore permettrait une refilamentation rapide du réseau

mitochondrial après rinçage de la thapsigargine. Nous serions alors en mesure de définir si la

protéine X du BDV possède un effet bénéfique sur l’homéostasie calcique.

L’interaction entre la protéine X et la chaperonne Hspa9 est-elle nécessaire au pouvoir

neuroprotecteur de la protéine X ?

Nous avons pu l’observer, la protéine X entraîne une hyperfilamentation du réseau

mitochondrial. Une première hypothèse est que la X induirait un faible stress préalable au sein

de la mitochondrie, les préparant ainsi à être plus réactives face à un stress oxydatif.

Alternativement, la filamentation du réseau mitochondrial pourrait être due à l’interaction de

la protéine X avec Hspa9. Nous avons observé que la surexpression d’Hspa9 permettait

également une élongation des mitochondries, le maintien du m et de l’intégrité axonale

en cas de stress oxydatif. Il a récemment été montré que la protéine DnaJC3 (Hsp40mt), un

membre mitochondrial de la famille des protéines DnaJ et co-chaperonne d’Hspa9, induisait

la fragmentation mitochondriale dans des cellules HeLa de façon dépendante de DRP1 (Elwi,

Lee et al. 2012). Curieusement, la mutation ponctuelle H121Q dans son domaine DnaJ, qui

abroge son interaction et l’activation d’Hspa9, élimine cette induction de la fragmentation.

Dans cette étude, cependant, il a été suggéré que la perte ou un excès de protéine DnaJA3

dans les mitochondries entraînait l’inhibition d’Hspa9. Ce phénomène apparemment délétère

pour les fonctions du réseau des chaperonnes mitochondriales, donc du contrôle qualité des

290

291

mitochondries, induirait la fragmentation mitochondriale (Elwi, Lee et al. 2012).

L’identification de protéines spécifiques du complexe chaperonne DnaJA3-Hspa9, dont les

défauts dans l’import ou la conformation entraînent l’activation de DRP1, permettrait de

clarifier le lien entre les chaperonnes mitochondriales et la machinerie de la dynamique

mitochondriale.

Hspa9 est un candidat prometteur pour la neuroprotection (cf introduction), son

interaction et sa stabilisation, par la protéine X, plaide en faveur de l’effet neuroprotecteur de

cette dernière. Fait très intéressant, des études biochimiques sur des cellules HeLa ont pu

démontrer une localisation importante de la mortaline au niveau de la jonction entre les

canaux calcique du réticulum endoplasmique et des mitochondries (Szabadkai, Bianchi et al.

2006). De plus, cette protéine a la capacité d’améliorer l’accumulation mitochondriale en Ca2+

et elle potentialise la liaison entre l’OMM, via MFN 2, et le récepteur IP3R du réticulum

endoplasmique (Szabadkai, Bianchi et al. 2006). Ces éléments sont en faveur d’une meilleure

réponse et d’un meilleur contrôle de l’homéostasie calcique des cellules exprimant la protéine

X face à un stress oxydatif.

La protéine X interagit très certainement avec Hspa9 au niveau de sa région amino-

terminale puisque c’est à cet endroit qu’elle le fait avec son homologue Hspa8. Or, si le peptide

PX3 est dérivé de la région carboxy-terminale de la X, le signal MPP, lui-même fusionné en N-

ter, est sûrement pris en charge par Hspa9 lors de son import mitochondrial. A ce jour, nous

n’avons pas pu établir de lien direct entre le PX3 et la mortaline.

Nous avons longuement et vainement tenté de réaliser un mutant de la protéine X

n’interagissant plus avec la mortaline dans le but de vérifier si cette interaction était

indispensable à son pouvoir neuroprotecteur. Malheureusement, Hspa9 étant une

chaperonne impliquée dans l’import et le contrôle qualité des protéines mitochondriales, il

était techniquement très difficile de réaliser un mutant X ne se liant plus à Hspa9 tout en

conservant sa localisation mitochondriale.

292

293

Cependant, il reste plusieurs autres hypothèses à explorer pour expliquer le

mécanisme moléculaire à l’origine du pouvoir neuroprotecteur de la protéine X et de PX3. De

par sa structure désorganisée, il est possible que la protéine X interagisse avec de nombreuses

autres protéines mitochondriales. De fait, d’autres partenaires directs de la protéine X ont

d’ores et déjà été identifiés (par spectrométrie de masse et western blot après une co-

immunoprécipitation contre la protéine X) : c’est le cas de la sous-unité 5 de l’ATP synthase,

de la porine VDAC de l’OMM ou encore de la chaperonne mitochondriale Hspa60.

Pour conclure, ce travail de thèse a permis de définir quels étaient les signaux de

localisation subcellulaire de la protéine X, d’améliorer son adressage mitochondrial et par là

même, son pouvoir neuroprotecteur. En outre, nous avons pu acquérir quelques données

concernant l’impact de la protéine X sur le fonctionnement mitochondrial, notamment sur la

dynamique de ces organites en conditions physiologiques ou de stress oxydatif. Finalement,

l’importance que pourrait avoir l’interaction entre la protéine X du BDV et la chaperonne

Hspa9 a été mise en exergue.

294

295

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TITLE:

MOLECULAR AND CELLULAR MECHANISMS AT THE BASIS OF THE NEUROPROTECTIVE POTENTIAL OF BORNAVIRUS X "MITOCHONDRIAL" PROTEIN

_________________________________________________________________________________

Abstract:

Bornavirus, a non-cytolytic RNA virus establishes a long-lasting persistence in the central nervous system of

infected animals. Viral persistence is facilitated by the expression of the non-structural X protein, which is

addressed both to nucleus and mitochondria, where it interferes both with cellular antiviral responses and

the initiation of apoptosis. Our team recently reported that the singled-out expression of the X protein could

protect neurons against toxins of the mitochondrial respiratory chain, both in vitro and in a mouse model of

Parkinson's disease (PD). During my Ph.D., we further demonstrated that the X protein triggered enhanced

filamentation of the mitochondrial network, in physiological as well as in oxidative stress conditions. This

effect is particularly interesting when considering the importance of mitochondrial dynamics in the

pathophysiology of neurodegenerative diseases.

Even if the therapeutic potential of this viral protein is now well established, the underlying molecular and

cellular mechanisms are far from being elucidated. It is however clear that neuroprotection conferred by the

X protein is strictly dependent on its mitochondrial localization. In this context, the goal of my Ph.D. project

was to clarify the molecular mechanisms whereby the X protein is targeted to mitochondria and/or to the

nucleus, in link with its protective capabilities. We focused on the amino terminal residues of X, by performing

fusion proteins of various forms of these residues with GFP and by analyzing their cellular localization. We

demonstrated that this region contains overlapping and interdependent signals for nuclear localization,

nuclear export and mitochondrial targeting of the X protein. We also identified a point mutation or deletion

leading to an almost exclusively mitochondrial localization of the X protein. As a consequence, these X

mutants exhibited a better neuroprotective function.

In order to get further insight into X-mediated neuroprotection, we also searched for the cellular partners of

X in mitochondria. We revealed a direct and specific interaction of the X protein with the chaperone Hspa9, a

protein that was recently shown to be involved in neurodegenerative diseases, notably in PD’s patients. We

observed that the down-regulation of Hspa9 triggered by mitochondrial toxins was attenuated by the co-

expression of X, suggesting a functional link between these two proteins. We also demonstrated that Hspa9

overexpression could protect neurons from mitochondrial dysfunctions, similarly to the X protein. Altogether,

these results have contributed to a better understanding of the mechanisms underlying the neuroprotective

potential of the X protein, which may favor the development of novel therapeutic strategies.

AUTEUR : Cécile FERRÉ

TITRE : Mécanismes moléculaires et cellulaires à la base du pouvoir neuroprotecteur de la protéine "mitochondriale" X du Bornavirus

DIRECTEURS DE THESE : Docteur Daniel Dunia, Docteur Marie-Christine Miquel

LIEU ET DATE DE SOUTENANCE : 22 juin 2016, Toulouse__________________________________________________________________________________

RESUME :

Les maladies neurodégénératives constituent un enjeu humain, sociétal et économique majeur, dont l’importance croît

avec le vieillissement des populations. Cette dénomination regroupe un grand nombre de maladies neurologiques,

comme les maladies d'Alzheimer, de Parkinson ou la sclérose latérale amyotrophique (SLA). L'étiologie de ces

maladies est complexe et reste encore mal comprise. Néanmoins, elles résultent vraisemblablement d'une combinaison

de facteurs génétiques et environnementaux et se caractérisent toutes par la dégénérescence d’une population

neuronale spécifique. Les mitochondries jouent un rôle primordial dans l’apport énergétique, la régulation calcique ou la

gestion du stress cellulaire et sont directement impliquées dans le déclenchement de la mort cellulaire programmée (ou

apoptose). L'implication centrale de cet organite dans les pathologies neurodégénératives a logiquement suscité un

ciblage croissant des fonctions mitochondriales dans les nouvelles approches thérapeutiques envisagées ces dernières

années. Des curcuminoïdes ont par exemple été testés pour contrer les effets dus au stress oxydatif, mais les résultats

restent encore à être améliorés. L'utilisation de facteurs anti-apoptotiques dérivés de virus représente une piste très

prometteuse. En effet, l’apoptose des cellules infectées représente la "première ligne" de défense de l’hôte contre une

invasion virale. En réponse à ce mécanisme de défense, de nombreux virus expriment divers facteurs (protéines,

ARN ...) dont la fonction est de bloquer le processus apoptotique, en particulier en ciblant la mitochondrie, favorisant

ainsi la réplication virale au sein de la cellule. Dans ce contexte, notre équipe a établi que la protéine X du Bornavirus

possède de remarquables propriétés neuroprotectrices. Si le potentiel thérapeutique de cette protéine virale est

maintenant démontré, les mécanismes moléculaires à l'origine de cet effet neuroprotecteur étaient à ce jour inconnus.

Au cours de ma thèse, nous avons contribué à une meilleure compréhension de la biologie de cette protéine au sein

de la cellule et en particulier dans les mitochondries. Nous avons déterminé ses séquences d’adressages

intracellulaires ainsi que son impact sur la dynamique mitochondriale et sur certains paramètres de la bioénergétique

mitochondriale tels que le potentiel de membrane mitochondrial, la respiration cellulaire et la production d’ATP

(énergie de nos cellules). L’ensemble de ces connaissances devrait nous permettre d'améliorer sa capacité

neuroprotectrice. __________________________________________________________________________________

MOTS-CLES : neurodégénérescence, mitochondrie, apoptose, Bornavirus, Biothérapie

DISCIPLINE ADMINISTRATIVE : Biologie cellulaire - Virologie

__________________________________________________________________________________

INSERM UMR 1043, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan

Equipe : Pathogénie des infections virales du système nerveux central adulte et en développement

CHU Purpan – BP 3028

31024 Toulouse Cedex 3

France