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UNIVERSITE TOULOUSE III- PAUL SABATIER U.F.R Sciences

THESE

En vue de l’obtention du

DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE TOULOUSE

délivré par l’Université Toulouse III- Paul Sabatier

Discipline : Physiopathologie moléculaire, cellulaire et intégrée

Présentée et soutenue par

Carla SAMPAIO

Le 31 mars 2008

RÔLE DE GAB1 DANS L’INTERCONNECTION ENTRE LES VOIES Ras/MAPK ET PI3K EN AVAL DU RECEPTEUR DE L’EGF

Directeurs de thèse :

Pr. Jean-Pierre Salles et Dr. Patrick Raynal

JURY :

Pr. Bertrand Perret INSERM U563, Toulouse Président Dr. Jacques Nunès INSERM UMR 891, Marseille Rapporteur Pr. Gérard Mauco INSERM ERM 324, Poitiers Rapporteur Pr. Marie-Odile Jauberteau Faculté de Médecine EA 3842, Limoges Examinateur Dr. Patrick Raynal INSERM U563, Toulouse Examinateur Pr. Jean-Pierre Salles Université Paul SABATIER, Toulouse III Examinateur

INSERM U563 – Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan Département Lipoprotéines et Médiateurs Lipidiques

CHU Purpan, 31024 Toulouse, France

Je dédie ce travail

A mes parents,

A Christophe,

Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier les membres du jury :

Monsieur le Professeur Bertrand Perret, pour avoir accepté de présider ce jury. Je vous suis

également reconnaissante pour votre disponibilité et pour l’intérêt que vous avez porté à mon

travail tout au long de ma thèse.

Monsieur le Docteur Jacques Nunès et Monsieur le Professeur Gérard Mauco pour avoir

accepté d’être rapporteurs de ce cette thèse. Je les remercie pour le temps qu’ils ont consacré pour

juger ce travail. Merci de l’intérêt que vous avez porté à cette thèse.

Madame le Professeur Marie-Odile Jauberteau pour avoir accepté de juger ce travail en

tant qu’examinateur. Je tiens à vous exprimer ma respectueuse considération et ma sincère

gratitude. Merci d’avoir pris le temps de venir à Toulouse et pour votre gentillesse.

Monsieur le Professeur Jean-Pierre Salles et Monsieur le Docteur Patrick Raynal, mes

directeurs de thèse, pour m’avoir accueillie dans leur équipe.

Je remercie tous les membres passés et présents du labo 107 :

Merci à Marie et à Armelle pour votre participation pour le papier, pour votre motivation. Bonne

chance à toutes les deux autant sur le plan professionnel que personnel.

Merci à Alex pour tes conseils et également pour ta disponibilité. Bonne chance en Suisse pour ton

post-doc et dans la réalisation de tes projets personnels.

Merci à Audrey pour ta gentillesse, ta bonne humeur. Merci également pour le nouvel an très

réussi (tu remerciera Thibault également). Je te souhaite bonne chance pour la suite de ta thèse.

Merci à Marie-Anaïs pour ta gentillesse, ta spontanéité. J’espère que tu réussiras à avoir une

bourse de thèse. Je te souhaite le meilleur pour la suite. Et à Sophie que je remercie pour sa bonne

humeur. Je te félicite pour ton mariage.

Au milieu de toutes ces filles, il y a quand même deux représentants de la gente masculine. Tout

d’abord, le premier venu, le docteur Thomas. Je le remercie pour sa gentillesse, sa motivation, sa

bonne humeur, son écoute. Bonne chance pour la suite tant du point de vue professionnel que

Remerciements

personnel. Enfin, Jean-Philippe pour sa motivation et sa gentillesse. Je te souhaite bonne chance

pour la suite de ta carrière. Tes enfants sont vraiment mignons, profites en bien.

Je penses également à deux personnes qui sont passées au 107 : Delphine et Rana.

Je les remercie pour leurs encouragements, leur gentillesse, leur bonne humeur.

Bonne chance à toutes les deux : Delphine en Alsace et Rana entre la France et le Liban.

Après le 107, je tiens à remercier les autres personnes qui font partis du premier étage :

Merci tout d’abord à Nicole pour ta gentillesse, ta disponibilité et les conversations que nous

avons eu. Merci pour ta contribution pour le papier.

Je remercie également Clo pour tout ce que tu fais pour le labo, pour ton franc parlé, pour ta

disponibilité et ta gentillesse.

Merci à Monique pour autant de gentillesse, de disponibilité.

Je remercie également Fabienne, Muriel, Anne, Marianne, Sara et Hélène pour leur gentillesse et

leur bonne humeur quotidienne.

Merci à Safouane pour tes encouragements et tes bons conseils. Merci également pour ta

gentillesse.

Merci également à Françoise qui m’a aidé pour les transfections dans les HEK293. Merci pour ton

naturel et ta gentillesse.

Merci à Ama et à layal pour leur gentillesse et leurs encouragements.

Merci à Ronan pour sa gentillesse. Bonne chance pour la fin du master.

Je finirai par les expertes en lipidomique : Véronique et Justine. Merci pour votre naturel et votre

gentillesse.

Je remercie également deux personnes qui ont fait parti du premier étage : Michel Record et Caro.

Merci à tous les deux pour votre bonne humeur, votre simplicité. J’ai été contente de vous revoir

au congrès du GSO. Merci Caro pour nos longues conversations quand tu étais au bâtiment C. Je

te souhaite bonne chance pour la fin de ta thèse et pour ta soutenance. Tu es courageuse car tu fais

une thèse en étant maman de deux mignonnes petites filles. Bravo !

Remerciements

Je remercie également l’ensemble des personnes qui font parti du thème A :

Merci à Claudia pour ses encouragements et ce qui l’a caractérise avant tout, sa gentillesse.

Je remercie Aurélie, Pierre, Anne-Lise, Mihaela pour leur naturel, leur gentillesse et leur soutien.

Merci beaucoup.

Un grand merci également à Michel, Christine C., Christine P., Coco pour votre bonne humeur,

votre disponibilité, votre gentillesse.

Je remercies également le reste des membres du thème A : Xavier, François, Laurent, Eric, Gérald,

Véro, Jayati, Stéphane.

Un très grand merci à Yvette qui est toujours disponible pour nous tous. Merci pour ta gentillesse

et tes qualités humaines. Bonne chance pour la suite.

Je vous remercie tous pour vos encouragements.

Je vous souhaite à tous une bonne continuation, une bonne réussite. Bon courage et bonne chance

à tous les étudiants.

Je remercies également mes ami(e)s qui m’ont encouragé tout au long de ces quatre années

de thèse :

Merci à Faby pour ton écoute, d’avoir été toujours là pour moi. J’espère que je ne t’ai pas trop

embêtée avec mes ras le bol. Tu es une véritable amie. Merci d’être venue à ma soutenance. Merci

à Nico pour ses encouragements, et son soutien. Dommage que tu ne sois pas venu à ma

soutenance. J’espère qu’on aura bientôt l’occasion de se revoir.

Merci à Nath et Nico d’avoir pris votre journée pour venir m’encourager. Dommage que vous

n’ayez pas pu rester le soir. On se fera un restau à Limoges. Vivement le 26 juillet, tu vas être

magnifique dans ta robe Nathalie. J’ai intérêt d’emmener les mouchoirs. Je vous remercie encore

d’avoir été là.

Merci à Catherine que je n’avais pas vu depuis de nombreuses années. J’ai été vraiment contente

de te revoir. Merci d’être venue. Je te souhaite bon courage pour la fin de ta thèse. Tu y arriveras

sans problème.

Merci à Abdel et à Ibtissam (poupougne), que j’ai connu pendant mon année de DEA, pour votre

soutien. Merci Ibtissam d’être venue à ma soutenance. Vous avez un petit garçon magnifique. A

très bientôt à Limoges.

Remerciements

Un grand merci à mes ami(e)s de Dijon avec lesquels(lles) je n’ai pas eu l’occasion de fêter

ma réussite:

A Natacha qui est mon amie depuis plus de 15 ans, et avec qui j’ai passé de bons moments. Merci

pour tes appels qui m’ont détendu pendant que j’écrivais mon manuscrit.

A Rémy et à Emilie pour vos encouragements. Super moments sur msn. Elles sont belles tes photos

Rémy.

A Delph, JC et leur petit Gaby qui maintenant habitent assez loin de Dijon. J’espère avoir

l’occasion de venir voir votre maison. Merci pour votre soutien.

On fera la fête lors de ma venue sur Dijon.

Je remercie également Nono, Cris, Cédric et Céline pour vos encouragements. Il faut absolument

qu’on se revoie car ça fait un moment. Le temps passe vraiment vite.

Je pense également à Maha qui est partie en Palestine depuis plus d’un an. Bonne chance à toi.

J’espère pouvoir te revoir un jour. Merci également à Séverine pour tes encouragements. J’espère

qu’on pourra se revoir bientôt.

Merci à chacun pour votre amitié. Que cette amitié dure encore longtemps. Je vous souhaite à tous

beaucoup de bonheur.

Un grand merci à mes parents qui ont cru en moi, qui m’ont encouragé et qui ont fait des

sacrifices pour que je réussisse. C’est grâce à eux que j’ai réussi, je leur serais à tout jamais

reconnaissante. Je vous dois énormément. Encore merci ! Je vous aime.

J’ai une pensée particulière pour ma grand-mère qui aurait été très contente et fière.

Je remercie également mes futurs beaux parents pour être venus à ma soutenance après un

long voyage. Merci pour vos encouragements et votre soutien.

Enfin, un grand merci à Christophe pour ton amour, ta présence, tout ce que tu as fait pour

moi. Merci pour m’avoir tant aidé durant ces quatre années de thèse, de m’avoir soutenue.

Heureusement que tu étais là pour me préparer à l’oral. Je t’aime.

Toutes mes excuses aux personnes que j’ai oubliées.

Sommaire

Résumé……………………………………………………………………………….4 Abstract……...……………………………………………………………………….5 Abréviations……………………………………………………………………….…6 Liste des figures et des tableaux…………………………………………………….8 Introduction générale…………………………………………………..………...…10 Introduction bibliographique…………………………………………..……...…..12 Chapitre I: Les récepteurs à activité tyrosine kinase…………………..………...13 I. Généralités sur les récepteurs à activité tyrosine kinase……………………....……………...13

1. Introduction………………………………………………………………….....................13 2. Structure des RTK………………………………………………………………………..14

2.1. Le domaine extracellulaire……………………………………………….……..14 2.2. Le domaine transmembranaire………………………………………………….15 2.3. Le domaine intracellulaire et l’activité tyrosine kinase………………………...15

3. Activation des RTK………………………………………………………………………16 3.1. Dimérisation des récepteurs………………………………………………...…..16 3.2. Autophosphorylation des tyrosines………………………………………...…...18

II- Les récepteurs de la famille ErbB……………………………………………………..……...19 1. Introduction…………………………………………………………….………….…… 19

2. Structure des récepteurs ErbB…………………………………………………..………..19 3. Les ligands des récepteurs ErbB…………………………………………………………21 4. Dimérisation des récepteurs ErbB ………………………………………………………22 5. Rôles physiologiques des récepteurs ErbB ………………………………………………23 6. Transactivation des récepteurs ErbB………………………………………….…………25 7. Mécanismes de régulation de l’activation de l’EGFR …………………………….....…27 7.1 Régulation par des antagonistes de l’EGFR……………………………………27

7.2. Régulation par les protéines phosphatases……………………………………...28 7.3. Régulation par l’inhibition de l’activité catalytique par la PKC……………..…29 7.4 Régulation par endocytose dépendant de la clathrine………………………...…29

8. Les voies de signalisation activées par les récepteurs ErbB……………………...………30

Chapitre II : Les voies de signalisation Ras/MAPK et PI3K……...…33 I. La voie de signalisation des MAPK………………………………………………………..….. 33 1. La voie canonique Ras/MAPK…………………………………………………………...34

1.1. Présentation de la superfamille Ras ……………………………………………34 1.1.1. La protéine Ras……………………………………………...……….……….36

1

a. Structure des isoformes de Ras………………………….…..……….……….36 b. Modifications et localisation des isoformes de Ras …………………………37 c. Activation de Ras…………………………………………………………….38

d. Mécanismes de régulation négative de l’activation de Ras……………..……39 e. Effecteurs de Ras…………………………………………………….……….39 f. Invalidation de Ras chez la souris……………………………………….……41

1.2. Le module Raf/MEK/ERK……………………………………………………..42 1.2.1. La famille Raf……………………………………………………………….42 a. Structure des protéines de la famille Raf……………………………………..42 b. Activation de Raf1…………………………………………………………....43

c. Inhibition de Raf………………………………………………………………44 d. Invalidation des isoformes de Raf chez les souris………………….…………44 1.2.2. Les kinases MEK1/2………………………………………………………...45 1.2.3 Les kinases ERK1/2……………………………………………………….…46

1.2.4 Les substrats de ERK1/2……………………..……………………………...46 a. Substrats nucléaires………………………………………………………...…47

b. Substrats cytoplasmiques ………………………………………………….…47 1.2.5 Régulation de la voie des MAPK……………………………………………48

a. Les protéines dites scaffold…………………………………..………………49 b. Les régulateurs positifs et négatifs………………………………..…………51

c. Les phosphatases……………………………………………………………..52

II. Les protéines Gab et SHP2………………………………………………………………….…52 1. Les protéines Gab………………………………………………………………………...52

1.1. Structure et expression………………………………………………..……….52 1.2. Phosphorylation des protéines Gab……………………………………………54 1.3. Recrutement des protéines Gab…………………………………………….…55 1.4. Rôles fonctionnels des protéines Gab : études des KO………………….……55

2. La protéine phosphatase SHP2……………………………………………...……………56 3. Gab1, SHP2 et la voie des MAPK…………………………………………….…………57

III. La voie PI3K……………………………………………………………………..………….…59 1. Présentation de la famille des PI3K………………………………………...………….…59 2. Fonctions biologiques des différentes isoformes des PI3K……………………...…….…61 3. Mécanisme d’activation des PI3K de classe I……………………………………………62 4. Les 3- phosphoinosides ……………………………………………………….…….……63

4.1 Phosphatidylinositol 3-phosphate (PI3P)………………………….……….……64 4.2 Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate (PI3,4P2)………………………….……64 4.3 Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP3)……………….…………..……64 4.4 Phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate (PI3,4P2)…………………………….…65

5. La sérine/thréonine kinase Akt……………………………………………..………….…65 5.1. Structure et expression de Akt……………………………………..…….……66 5.2 Mécanisme d’activation de Akt………………………………….……….……67 5.3 Effets biologiques de l’activation de la voie PI3K/Akt………….……….……68

6. Régulation des PI3K………………………………………………………..……….……70 7. Gab1, SHP2 dans l’activation de la voie des PI3K………………………………………72

IV. Interconnection entre les voies Ras/MAPK et PI3K…………………………………...……73 1.Régulation de la voie MAPK par la voie PI3K……………………………..……………74 2.Régulation de la voie PI3K par la voie Ras/MAPK………………………………...……75

2

Chapitre III : Implications des récepteurs ErbB dans les cancers…..77 I. Dérégulations des récepteurs ErbB dans les cancers…………………………………………77

II. Inhibiteurs des ErbB en thérapie anti-cancéreuse…………………………………...………81

1. Les anticorps monoclonaux…………………………………………………………………..81 2. Les inhibiteurs de l’activité kinase………………………………………………..………….84 3. Autres inhibiteurs…………………………………………………………………………….85

III. Phénomène de résistance………………………………………………………………..……86 Résultats expérimentaux……………………………………………………….88 Rôle conditionnel de PI3K dans l’activation de la voie Ras/MAPK en fonction du mode de recrutement du module Gab1/SHP2……………….………………….89 I. Introduction……………………………………………………………………...………….89 II. Résultats……………………………………………………………………………….……90 III. Conclusion………………………………………………………………………...……...106 Perspectives.........................................................................................................108 Références bibliographique...............................................................................112

3

Résumé

Résumé

Mes travaux de thèse se sont portés sur l’étude des voies de signalisation cellulaire induites

par le récepteur de l’EGF (EGFR) et plus particulièrement sur l'activation de la voie Ras/MAPK en aval de l’EGFR. L’EGFR joue des rôles fondamentaux en terme de prolifération, de différenciation et de survie cellulaire, notamment au cours du développement embryonnaire de multiples organes.

L’activité biologique de l’EGFR est étroitement liée à sa capacité à initier des voies de signalisation telles que la voie Ras/ Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPK) et la voie des phosphoinositide-3-kinases (PI3K). De plus, la dérégulation de l’EGFR, sa surexpression ou des mutations oncogéniques sont retrouvées dans de nombreuses tumeurs solides (les glioblastomes, les cancers du sein, les cancers ovariens, etc...) et sont corrélées à un mauvais pronostic. Ainsi, la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu dans ces voies de signalisation permettrait d’identifier de nouvelles cibles potentielles aboutissant à une pharmacologie anti-tumorale. Le but de notre travail a été de rechercher dans quelles conditions la PI3K participe à l’activation de la voie Ras/MAPK en réponse à l’EGF. Nous avons alors proposé un modèle selon lequel la dépendance de la voie Ras/MAPK vis-à-vis de PI3K, en réponse à l’EGF serait en fait conditionnée par le mode de recrutement du module Gab1/SHP2. En effet, nous avons montré que selon la force du signal ou la quantité d’EGFR mobilisés, le module Gab1/SHP2 est soit recruté par le domaine PH de Gab1 qui présente une affinité spécifique pour le PIP3, soit par l’intermédiaire de la protéine adaptatrice Grb2, rendant ainsi l’activation des MAPK dépendante ou pas de la voie PI3K.

De plus, nous avons montré que ce mécanisme de recrutement de Gab1 est retrouvé dans les cellules de glioblastomes résistantes aux inhibiteurs de l’EGFR. Ainsi, dans les cellules de glioblastomes qui présentent une activation résiduelle de l’EGFR, ce mécanisme de recrutement de Gab1 devient nécessaire pour activer efficacement la voie Ras/MAPK, ce qui pourrait alors expliquer la résistance aux inhibiteurs de l’EGFR. Dans ce cas là, les inhibiteurs de PI3K combinés aux inhibiteurs de l’EGFR vont permettre d’inhiber l’activation de la voie Ras/MAPK.

Ainsi, la protéine adaptatrice Gab1 a pu être identifiée comme étant la protéine centrale dans

l’activation de la voie Ras/MAPK induite par l’EGFR. De ce fait, Gab1 pourrait potentiellement devenir une cible thérapeutique de choix dans une stratégie anti-tumorale dirigée contre certaines tumeurs solides comme par exemple les glioblastomes, permettant ainsi de ralentir la croissance tumorale et à terme une diminution de la masse tumorale.

4

Abstract

Abstract

My thesis work fell on the study of signalling pathways induced by the EGF (Epidermal Growth

Factor) receptor (EGFR) and more particularly on the activation of the Ras/MAPK pathway

downstream of EGFR. EGFR plays fundamental roles in proliferation, differentiation and cell

survival, particularly during embryonic development of multiple organs.

The biological activity of EGFR is closely linked to its ability to initiate signalling pathways such

as the Ras/ Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPK) and the phosphoinositide-3-kinase (PI3K)

pathways. In addition, dysregulation of EGFR, its overexpression or oncogenic mutations are found

in many solid tumors (glioblastoma, breast cancer, ovarian cancer…) and are correlated with a poor

prognosis. Thus, understanding the molecular mechanisms involved in these signalling pathways

would identify new targets leading to a potential anti-tumor pharmacology.

The goal of our work was to seek conditions when PI3K is involved in the activation of the

Ras/MAPK pathway in response to EGF. We then proposed a model according to which the

dependence of the Ras/MAPK pathway towards PI3K in response to EGF is in fact determined by

the mechanism of recruitment of Gab1/SHP2 module. Indeed, we have shown that depending on the

signal strength or the amount of EGFR mobilized, the Gab1/SHP2 module is either recruited

through the Gab1PH domain which displays a specific affinity for the PIP3, either through the

adaptor protein Grb2, thus making the activation of MAPK dependent or no of the PI3K pathway.

In addition, we have shown that this mechanism of Gab1 recruitment is found in glioblastoma cells

resistant to EGFR inhibitors. Thus, in glioblastoma cells where there is a residual activation of

EGFR, the mechanism of Gab1 recruitment becomes necessary to activate effectively the

Ras/MAPK pathway, which could explain the resistance to EGFR inhibitors. In this case, PI3K

inhibitors combined with EGFR inhibitors will help to inhibit the activation of the Ras/MAPK

pathway.

Thus, the docking protein Gab1 has been identified as the central protein to the activation of the

Ras/MAPK pathway induced by EGFR. As a result, Gab1 could potentially become a therapeutic

target in an anti-tumor strategy against some solid tumors such as glioblastomas, thus slowing

tumor growth and ultimately a reduction of the tumor mass.

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Abréviations

ABREVIATIONS

ADAM: A Disintegrin and Metalloprotease ADN: Acide désoxyribonucléique AMPc: Adénosine monophosphate cyclique ARN: Acide ribonucléique ATP: Adénosine Trisphosphate CR: Conserved Region CRD: Cystein-rich domain CREB: cAMP response element-binding CNK: Connector Enhancer of KSR EGF: Epidermal Growth Factor EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor EPO: Erythropoïétine Eps15: EGFR pathway substrate 15 ERK : Extracellular-Regulated Kinase FGF: Fibroblast growth factor FGFR: Fibroblast growth factor receptor FYVE: Fab1p, YOTB, Vps27p, EEA1 Gab: Grb2-adapter binder GAP: GTPase Activating Protein GEF: Guanine Nucleotide Exchange Factor GDP: Guanosine diphosphate GH: Growth hormone GHR: Growth hormone receptor GM-CSF: Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor Grb2: Growth Factor Receptor binding Homology 2 GSK3: Glycogen Synthase Kinase 3 GTP: Guanosine Trisphosphate GTPase: Guanosine triphosphate hydrolase HB-EGF: Heparin-Binding Epidermal Growth Factor HGF: Hepatocyte Growth Factor HGFR: Hepatocyte Growth Factor receptor HRS: Hepatocyte growth factor regulated tyrosine kinase substrate Hsp: Heat Shock Protein Ig: Immunoglobuline IGF-1: Insuline Growth-1 IL: Interleukine KO: Knock out KSR: Kinase Supprossor of Ras MAPK: Mitogen-Activated Protein Kinase MAPKK: MAPK Kinase MAPKKK: MAPKK Kinase MEK: MAPK/ERK Kinase MK: MAPK-activated protein kinases MBD: Met Binding Domain MDCK: Madin-Darby canine kidney MKP: MAPK Phosphatase MNK: MAPK interacting kinases MORG1: MAPK Organizer mTOR: mammalian target of rapamycin

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Abréviations

MP1: MEK Partner 1 MSK: Mitogen- and stress activated kinases) NF: Neurofibromine NF1: Neurofibromatose de type 1 NFkB: Nuclear factor κB NGF: Nerve Growth Factor NRG: Neuréguline PDGF: Platelet Derived Growth Factor PDK: Phosphatidylinositol-dependent kinase PH: Pleckstrin Homology PI: Phosphatidylinositol PI3,4,5P3: Phosphatidylinositol 3,4,5 triphosphatase PI3,4P2: Phosphatidylinositol 3,4 biphosphatase PI3K: Phosphoinositide 3-Kinase PI3P: Phosphatidylinositol 3 Phosphatase PI4,5P2: Phosphatidylinositol 4,5 biphosphate PKA, PKB, PKC: Protein Kinase A, B, C PLC, PLD: Phospholipase C, D PP: Protein phosphatase PRD: Paired domain PTB: Phosphotyrosine Binding PTEN: Phosphatase and tensin homolog PTK: Protéine Tyrosine Kinase PTP: Phosphotyrosine Phosphatase RA: Ras Associating RASSF: Ras-association domain family 1 RBD: Ras Binding Domain RCPG: Récepteur Couplé aux Protéines G RIN: Ras and Rab Interactor RSK: Ribosomal S6 Kinase RKIP: Raf kinase inhibitor protein RTK: Récepteur à activité Tyrosine Kinase SH2: Src Homology 2 SH3: Src Homology 3 SHIP2: SH2 domain-containing Inositol 5-Phosphatase SHP2: SH2 domain-containing Phosphatase 2 SHPS-1: SHP Substrate SIRP: Signal-Inhibitor Regulatory Protein Sos: Son of Sevenless SPRED: Sprouty- related proteins with EVH1 domains Spry: Sprouty STAT: Signal transducer and activator of transcription Sur8: Suppressor of Ras TGFα: Transforming Growyh Factor α TKI: Tyrosine kinase inhibitor VEGF: Vascular Epidermal Growth Factor

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Liste des figures et tableaux

LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX Figures : Figure 1: Classification des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK), représentés suivant leurs caractéristiques structurales Figure 2: La liaison du ligand stabilise la formation de dimères activés Figure 3: Modèle de stimulation des tyrosines kinases par dimérisation des récepteurs Figure 4: Structure schématique des récepteurs ErbB Figure5: Mécanisme d’hétérodimérisation des récepteurs ErbB, exemple de l’hétérodimère ErbB2/ErbB3 Figure 6: Activation des récepteurs ErbB indépendante du ligand, exemple de l’EGFR Figure 7: Mécanismes de transactivation des récepteurs ErbB par les RCPG Figure 8: Mécanisme de régulation par endocytose de l’EGFR Figure 9: Schéma représentant les résidus phosphotyrosines spécifiques et la liaison des protéines de la signalisation aux récepteurs ErbB Figure 10: Les voies de signalisation des MAP kinases Figure 11: Le cycle des GTPases Figure 12: Structure des isoformes de Ras : HRas, NRas, KRas4A et KRas4B Figure 13: Modifications et localisation des protéines Ras Figure 14: Effecteurs de Ras et leurs réponses biologiques correspondantes Figure 15: Structure des trois isoformes de Raf. Figure 16: Schéma récapitulatif de l’activation de la voie des MAPK Figure 17: Les substrats des MK Figure 18: Activation de la voie des MAPK dans des compartiments cellulaires variés. Figure 19: Les protéines scaffold impliquées dans la voie des MAPK Figure 20: Liste des protéines scaffold (à gauche) et des régulateurs négatifs et positifs (à droite) de la voie des MAPK Figure 21: Structure schématique des protéines Gab1, Gab2 et Gab3 humaines et des résidus tyrosine impliqués dans une interaction protéique Figure 22: Représentation schématique de la protéine phosphatase SHP2 Figure 23: Les différentes classes de PI3K Figure 24: Les voies de synthèse des PI Figure 25: Les différents effecteurs des PI3K de classe I Figure 26: Structure des trois isoformes humaines de Akt/PKB Figure 27: Représentation schématique du mode d'activation de Akt et de certaines voies de signalisation activées par Akt Figure 28: Modèle de la régulation de l’activation de PI3K par la protéine phosphatase SHP2 Figure 29: Schéma de l’activation des voies Ras/MAPK et PI3K en réponse à l’EGF et de l’interconnection entre ces deux voies Figure 30: Mécanismes selon lesquels l’EGFR devient oncogénique Figure 31: Classification des différents anticorps monoclonaux (murin, chimérique, humanisé et humain) Figure 32: Schéma illustrant le rôle conditionnel de la PI3K dans l’activation de la voie Ras/MAPK en fonction du mode de recrutement du module Gab1/SHP2

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Liste des figures et tableaux

Tableaux : Tableau 1 : Les récepteurs ErbB et leurs ligands connus Tableau 2 : Conséquences biologiques de l’invalidation des gènes codant pour les récepteurs ErbB ou pour leurs ligands dans des organes Tableau 3 : Liste des antagonistes de l’EGFR Tableau 4: Protéines tyrosine phosphatases régulant l’EGFR Tableau 5: Conséquences biologiques de l’invalidation des gènes codant pour les protéines Ras Tableau 6: Conséquences biologiques de l’invalidation des gènes codant pour les sous-unités des PI3K Tableau 7: Liste des protéines régulant l’activité de la sérine/thréonine kinase Akt/PKB Tableau 8: Conséquences biologiques de l’invalidation des gènes codant pour les protéines PTEN et SHP1 et 2 Tableau 9: Dérégulations des récepteurs de la famille ErbB retrouvées dans les cancers Tableau 10: Mutations de l’EGFR Tableau 11: Liste d’anticorps monoclonaux anti-ErbB utilisés en thérapie anti-cancéreuse Tableau 12: Liste d’inhibiteurs de l’activité kinase des récepteurs ErbB utilisés en thérapie anti-cancéreuse

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Introduction générale


Les récepteurs à activité tyrosine kinase intrinsèque (RTK) constituent une grande famille de

récepteurs. Ces récepteurs sont généralement activés par dimérisation après fixation du ligand,

entraînant alors un changement conformationnel permettant ainsi une augmentation de leur activité

tyrosine kinase. Une fois activés, les RTK vont être capables d’initier diverses voies de

signalisation, leur permettant d’induire de nombreux effets biologiques tels que la prolifération et la

différenciation, ou encore la migration cellulaire. Les RTK, notamment un des plus étudiés

actuellement, le récepteur de l’EGF (epidermal growth factor) qui fait partie de la famille des

récepteurs ErbB, induisent de nombreuses voies de signalisation mitogènes et en particulier, les

voies Ras/MAPK (mitogen-activated protein kinase) et PI3K (phosphoinositide-3 kinase). Ces deux

voies jouent un rôle dans de nombreuses fonctions cellulaires comme la prolifération, la survie ou

la différenciation. Sur le plan physiopathologique, une hyperactivation ou diverses altérations de

l’EGFR ou d’acteurs de ces deux voies sont associées à de nombreuses pathologies, notamment les

cancers. Ainsi, ces différentes observations font de ces récepteurs ou des acteurs de ces voies de

signalisation des cibles privilégiées en thérapie anti-cancéreuse.

Ce manuscrit portera plus particulièrement sur l’étude des 2 voies de signalisation majeures,

les voies Ras/MAPK et PI3K, induites par le récepteur de l’EGF. D’ailleurs, ces deux voies sont

étroitement liées. Il semble de plus que deux acteurs majeurs communs à ces 2 voies, interviennent

dans les interconnections entre ces deux voies : la protéine adaptatrice Gab1 et la protéine

phosphatase SHP2.

Ainsi, comme nous le verrons dans ce manuscrit, les voies Ras/MAPK et PI3K présentent de

nombreuses connexions entre elles et peuvent agir l’une sur l’autre par un réseau complexe de

rétrocontrôles positifs ou négatifs, démontrant ainsi que la signalisation induite par les RTK est loin

d’être linéaire. De ce fait, si on agit sur une seule de ces 2 voies, il peut y avoir des conséquences

majeures sur la deuxième, soulignant donc l’importance de leur régulation et du maintien de leur

intégrité.

Dans un premier chapitre de l’introduction bibliographique, nous nous intéresserons tout

d’abord aux récepteurs à activité tyrosine kinase et plus particulièrement aux récepteurs ErbB. Nous

décrirons leur structure, leur mode de fonctionnement. Nous nous intéresserons également aux

voies de signalisation induites par les récepteurs ErbB. Ensuite dans un deuxième chapitre, nous

traiterons en détail de deux voies qui sont induites par l’EGFR : la voie Ras/MAPK (Mitogen-

Activated Protein Kinase) et la voie PI3K (phosphoinositides-3-kinase). Nous nous intéresserons

également dans ce chapitre à la protéine adaptatrice Gab1 et à la protéine phosphatase SHP2 et nous

aborderons l’importance de ces deux protéines dans l’activation de ces deux voies. Nous

10


terminerons ce chapitre par les interconnections entre les voies Ras/MAPK et PI3K. Le troisième

chapitre sera consacré à l’implication physiopathologique des récepteurs ErbB notamment dans les

pathologies cancéreuses. Nous traiterons des dérégulations de ces récepteurs, des différents

composés utilisés pour inhiber les récepteurs ErbB et enfin nous nous intéresserons aux résistances

aux inhibiteurs anti-ErbB développées par les cellules.

D’après la littérature, il existe des interconnections entre la voie Ras/MAPK et la voie PI3K.

Dans certains modèles cellulaires, sous certaines conditions, il a été admis que l’activation de la

voie Ras/MAPK pouvait être dépendante de la voie PI3K en réponse à l’EGF. Pourtant, cette

observation n’a pas été retrouvée dans certains types cellulaires. Au vu de ces contradictions, il

semblerait que l’activation de la voie Ras/MAPK par la voie PI3K dépende de la force du signal ou

du type cellulaire considéré. De plus, le mécanisme moléculaire mis en jeu lors de cette dépendance

n’a pas été identifié. Le but de ce travail de thèse a donc consisté à identifier le mécanisme

moléculaire qui permet à la PI3K de participer à l’activation de la voie Ras/MAPK selon la force du

signal de stimulation. Nous avons donc réussi à démontrer que la dépendance de la voie Ras/MAPK

vis-à-vis de PI3K est conditionnée par le mode de recrutement du module Gab1/SHP2. En effet,

nous avons montré que lors de stimulation de forte intensité, le module Gab1/SHP2 est recruté par

l’intermédiaire de la protéine adaptatrice Grb2, ce qui rend alors l’activation de la voie Ras/MAPK

indépendante de PI3K. Au contraire, lors de stimulation de forte intensité, le module Gab1/SHP2

est recruté par l’interaction du domaine PH de Gab1 avec les produits de PI3K, ce qui rend alors

l’activation de la voie ras/MAPK dépendante de PI3K. De plus, nos résultats suggèrent que cette

activation des MAPK dépendante de la PI3K par le mode de recrutement du module Gab1/SHP2

pourrait être impliquée dans la résistance à un inhibiteur de l’EGFR observée dans des lignées de

glioblastomes.

Les résultats obtenus ont donc permis de démontrer que la protéine adaptatrice Gab1 et la

phosphatase SHP2 jouent un rôle important dans l’activation des voies Ras/MAPK et PI3K.

De plus, les protéines Gab1 et SHP2 interviennent lors des processus cancéreux, donc elles

pourraient devenir des cibles thérapeutiques de choix. Ainsi, en ciblant le recrutement du module

Gab1/SHP2 à la membrane, l’activation de Ras/MAPK serait inhibée, ce qui devrait entraîner une

diminution de la prolifération cellulaire.

11

Introduction bibliographique

12

Introduction bibliographique Chapitre I : Les récepteurs à activité tyrosine kinase

Chapitre I : Les récepteurs à activité tyrosine kinase

I. Généralités sur les récepteurs à activité tyrosine kinase.

1. Introduction

Les récepteurs à activité tyrosine kinase intrinsèque (RTK) également appelés récepteurs des

facteurs de croissance, sont des glycoprotéines transmembranaires composées d’un domaine

extracellulaire très variable capable de fixer le ligand, d’un domaine transmembranaire permettant

l’ancrage dans la membrane cellulaire et d’un domaine intracellulaire (cytoplasmique) qui renferme

l’activité tyrosine kinase et permet la transduction du signal au sein de la cellule. L’activité

enzymatique des RTK est localisée dans le cytoplasme et permet le transfert du phosphate γ de

l’ATP vers l’hydroxyle des tyrosines des protéines cibles et/ou du récepteur lui-même, c’est ce

qu’on appelle l’autophosphorylation. Les RTK sont d’importants régulateurs de la communication

intercellulaire, ils jouent en effet un rôle important dans le contrôle de nombreux processus

biologiques, tels que le cycle cellulaire, la migration cellulaire, le métabolisme, la croissance, la

prolifération et la différenciation cellulaire (Ullrich and Schlessinger, 1990; Zwick et al., 2002). Ces

récepteurs membranaires sont des composants essentiels des voies de signalisation cellulaires qui

sont actives durant le développement embryonnaire et l’homéostasie cellulaire chez l’adulte. Les

RTK sont une famille de 58 récepteurs de surface cellulaire de type I comportant des

caractéristiques structurales et fonctionnelles similaires (Schlessinger, 2000). Selon leur

organisation structurale, ces récepteurs se regroupent en plusieurs familles. Vingt familles de RTK

ont été décrites jusqu’à présent (figure 1). Parmi ces différentes familles, on distingue les récepteurs

à l’insuline (IR), les récepteurs aux facteurs de croissance de l’épiderme (EGFR), les récepteurs aux

facteurs de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR), les récepteurs aux facteurs de croissance de

l’endothélium vasculaire (VEGFR) et les récepteurs aux facteurs de croissance des fibroblastes

(FGFR).

1313


Figure 1: Classification des récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK), représentés suivant leurs caractéristiques structurales. Abréviations: AB: boîte acide, CadhD: domaine de type cadhérine, CRD : domaine riche en cystéine, DiscD: domaine de type discoidine, EGFD : domaine de type EGF (facteur de croissance épidermique), FNIII: domaine de type fibronectine type III, IgD: domaine de type immunoglobuline, KrinD : domaine de type kringle, LRD: domaine riche en leucine. D’après (Blume-Jensen and Hunter, 2001).

2. Structure des récepteurs RTK

Les RTK sont composés de trois domaines distincts : le domaine extracellulaire, le domaine

transmembranaire et le domaine intracellulaire.

2.1. Le domaine extracellulaire

Le domaine extracellulaire des RTK, qui permet la fixation de ligands est très diversifié et très

glycosylé. Ce domaine extracellulaire présente une variété d’éléments conservés tels que les

domaines de type immunoglobuline (IgD), de type fibronectine III (FNIII), de type facteur de

croissance épidermique (EGFD), riche en cystéine et riche en leucine. Ces différents domaines

déterminent la spécificité de la liaison au ligand. En effet, la liaison du ligand au domaine

extracellulaire provoque des changements conformationnels qui induisent et stabilisent la

dimérisation du récepteur (Heldin, 1995).

1414


2.2. Le domaine transmembranaire

Le domaine transmembranaire est constitué d’un seul segment de 22 à 26 acides aminés,

organisé en une seule hélice. Le domaine transmembranaire est caractérisé par une séquence

hydrophobe dont la fonction est l'ancrage du récepteur à la membrane. Des mutations ont été

identifiées dans les domaines transmembranaires d’au moins deux familles de RTK, fibroblast

growth factor receptor (FGFR) et epidermal growth factor receptor (EGFR) aboutissant à une

activation constitutive du récepteur par une dimérisation indépendante du ligand (Sternberg and

Gullick, 1989; Webster and Donoghue, 1996). Même si ce domaine ne joue pas un rôle dans

l’activation du récepteur, il pourrait jouer un rôle au niveau de sa conformation et de la stabilisation

des récepteurs dimériques.

2.3. Le domaine intracellulaire et l’activité tyrosine kinase

Le domaine intracellulaire se compose d’une région juxta-membranaire suivie par le domaine

catalytique tyrosine kinase et terminé par la région carboxy-terminale. Ces régions contiennent des

sous-domaines régulateurs influençant négativement ou positivement la liaison du substrat et la

phosphorylation, ainsi que les sous-domaines impliqués dans la dimérisation et/ou dans les

changements structuraux pendant l’activation de la kinase après la liaison du ligand. La longueur et

la séquence des domaines juxta-membranaire et carboxy-terminal varient suivant les RTK et

contiennent des sites de phosphorylation tyrosine et sérine/thréonine. Ces sites peuvent être

phosphorylés par le récepteur lui-même (autophosphorylation) ou par des protéines kinases

(Hubbard, 2002).

Il a été établi que le domaine tyrosine kinase comporte onze sous-domaines majeurs (I à XI). Les

domaines I à V forment le domaine de liaison à l’ATP, complexé aux ions Mn2+ ou Mg2+. Les

domaines VI et VII sont dotés de l’activité phospho-transférase. Les kinases possèdent une boucle

d’activation comprenant les sous-domaines VII et VIII comportant entre une et trois tyrosines.

L’activité kinase est cruciale pour l'activation des voies de transduction aboutissant à l'induction des

réponses cellulaires comme la survie, la prolifération et la différenciation (Hubbard and Till, 2000).

Un domaine tyrosine kinase intact est absolument nécessaire dans la signalisation du récepteur. En

effet, des mutations d’un seul résidu dans ce domaine peuvent entraîner la perte de la fonction du

récepteur.

1515


3. Activation des RTK

3.1. Dimérisation des récepteurs

L’élément déclencheur de l’activation des RTK est la fixation du ligand, qui conduit à la

dimérisation non covalente des récepteurs.

Les RTK sont présents à la surface cellulaire sous forme d’une seule chaîne polypeptidique et

monomérique en l’absence de ligand. L’exception à cette règle est la famille HGFR et la famille des

récepteurs à l’insuline. Ainsi, le récepteur aux facteurs de croissance des hépatocytes (famille

HGFR), possède une chaîne α liée par un pont disulfure à une chaîne β dans le domaine

extracellulaire donc ce récepteur se trouve déjà sous forme de dimère. Les récepteurs à l’insuline et

IGF-1 possèdent deux chaînes α extracellulaires, chacune d’entre elles étant liée à une chaîne β par

un pont disulfure, pour former un hétéro-tétramère α2β2 (Schlessinger, 2000).

L’interaction du ligand avec le domaine extracellulaire conduit donc à la dimérisation du récepteur

et à la formation d’un complexe protéique généralement constitué de deux chaînes de récepteurs et

de deux molécules de ligands. Ainsi, les complexes EGF-EGFR et FGF-FGFR montrent une

stoechiométrie 2 :2 (ligand-récepteur) (Lemmon et al., 1997; Plotnikov et al., 1999). Dans le cas du

complexe FGF-FGFR, les interactions FGF-FGFR ne sont pas suffisantes pour stabiliser le dimère

FGFR, qui nécessite des molécules d’héparine qui sont essentielles à la stabilité du complexe

(Spivale-Kroizman et al 1994). Par contre, des études menées sur le ligand GH et son récepteur

GHR ont montré que GH se fixe sur son récepteur avec une stoechiométrie 1 :2 (ligand-récepteur).

Le ligand se fixe simultanément sur deux récepteurs (Kossiakoff and De Vos, 1998). La liaison du

ligand va stabiliser le dimère actif stimulant ainsi l’activité tyrosine kinase. Il a été proposé que des

dimères actifs existent même en l’absence de liaison du ligand puisque l’autophosphorylation des

RTK peut être augmentée par des inhibiteurs des protéines tyrosines phosphatases ou par une

surexpression du récepteur même en absence de liaison du ligand (Schlessinger, 2000). L’existence

de différents états d’équilibre entre dimères actifs et inactifs est représentée dans la figure 2.

1616


Figure 2 : La liaison du ligand stabilise la formation de dimères activés. Les récepteurs monomériques (vert) sont en équilibre avec les récepteurs dimériques inactifs (vert) ou actifs (bleu). Les récepteurs dimériques actifs existent dans une conformation compatible avec la trans-autophosphorylation et la stimulation de l’activité protéine tyrosine kinase. La fixation de ligand stabilise la formation de dimère actif. D’après (Schlessinger, 2000).

La dimérisation non covalente des RTK, induite ou stabilisée par la fixation de ligand, est le

mécanisme déclencheur de l’autophosphorylation des tyrosines (Heldin, 1995; Ullrich and

Schlessinger, 1990). La fixation de ligand au domaine extracellulaire peut induire un réarrangement

structural des récepteurs hétérotétramèriques (exemple du récepteur à l’insuline), facilitant

l’autophosphorylation des tyrosines dans le domaine cytoplasmique. Dans certains cas, la

dimérisation est certes nécessaire pour l’activation tyrosine kinase mais n’est pas suffisante

(Bennasroune et al., 2004). Par exemple, dans le cas du récepteur tyrosine kinase Eph, la

dimérisation est suffisante pour l’autophosphorylation des récepteurs, à la condition d’une

organisation des récepteurs en tétramère pour susciter toutes les réponses biologiques dans la cellule

(Stein et al., 1998). De plus, dans le cas du FGFR, l’activation du récepteur nécessite aussi la

coopération avec certains protéoglycanes de la matrice extracellulaire pour stabiliser le complexe .

Dans la plupart des cas, la dimérisation des RTK est probablement suffisante pour la transduction

du signal.

De plus, une boucle activatrice est présente dans les domaines tyrosine kinase cytoplasmiques. En

conformation dite fermée, la boucle masque le site de liaison à l’ATP, réduisant ainsi l’activité

catalytique de la protéine. Lorsque les résidus tyrosines appartenant à la boucle sont phosphorylés

par un récepteur voisin (trans-autophosphorylation), elle se stabilise dans une conformation dite

ouverte permettant alors la fixation de l’ATP et la phosphorylation.

1717


3.2. Autophosphorylation des tyrosines

L’augmentation de l’activité catalytique intrinsèque du récepteur et la création de sites de

fixation dans le domaine intracellulaire, afin de recruter les protéines de signalisation, sont les deux

étapes clés de l’activation des récepteurs. Pour la plupart des RTK, la réalisation de ces deux étapes

nécessite l’autophosphorylation des résidus tyrosines du domaine intracellulaire, permise par

l’oligomérisation des récepteurs déclenchée par la fixation du ligand. L’autophosphorylation des

résidus tyrosines de la boucle activatrice du domaine tyrosine kinase génère des sites de fixation

pour les protéines de signalisation pouvant reconnaître les séquences contenant des

phosphotyrosines. L’autophosphorylation des tyrosines peut être cis, dans ce cas la phosphorylation

est effectuée par le récepteur lui-même ou trans où la phosphorylation s’effectue entre les

récepteurs. La cis-autophosphorylation est probablement due à un changement conformationnel

provoqué par la fixation de ligand sur le récepteur. La transautophosphorylation ne nécessite aucun

changement conformationnel: le simple effet de proximité engendré par la dimérisation suffit à

déclencher la phosphorylation des tyrosines (Hubbard and Till, 2000). A partir de ces structures,

Hubbard et al. ont établi un modèle de stimulation de l’activité tyrosine kinase par dimérisation des

récepteurs (figure 3) (Hubbard et al., 1998).

Figure 3: Modèle de stimulation des tyrosines kinases par dimérisation des récepteurs. La boucle activatrice des RTK est relativement mobile et adopte de nombreuses conformations. La conformation majoritaire (rouge) interfère avec la fixation de substrat et donc empêche la fixation d’ATP. En vert, la conformation de la boucle activatrice est compatible avec la fixation d’ATP. En l’absence de ligand, la probabilité de trans-autophosphorylation est faible. La fixation de ligand au domaine extracellulaire augmente la concentration de récepteur et permet ainsi la trans autophosphorylation de la boucle activatrice et déplace l’équilibre vers une conformation active permettant la fixation de substrat et d’ATP. D’après (Hubbard et al., 1998)

1818


II- Les récepteurs de la famille ErbB

1. Introduction

Les récepteurs ErbB appartiennent à la famille des RTK de classe I. Les récepteurs ErbB

sont exprimés dans la quasi-totalité des tissus non hématopoïétiques. Ils sont impliqués dans

différents processus biologiques tels que la prolifération, la différenciation, le contrôle du

métabolisme cellulaire, la migration et la survie cellulaire. Des altérations des récepteurs ErbB

telles que des mutations oncogéniques ou des surexpressions sont retrouvées dans de nombreux

cancers, en particulier des tumeurs solides (cancer du sein, du poumon, etc …). Ces récepteurs

suscitent donc un grand intérêt en tant que cibles dans les thérapies anti-cancéreuses (Blume-Jensen

and Hunter, 2001; Schlessinger, 2000).

Chez le nématode C. elegans, un seul orthologue de l’EGFR a été identifié, Let23, comptant un

seul ligand (Lin-3). Chez la drosophile un seul orthologue de l’EGFR a également été identifié,

DER, et celui-ci est activé par quatre ligands différents (Vein, Spitz, Gurken et Argos) (Leahy,

2004). Chez les mammifères, cette famille comprend quatre récepteurs qui sont : ErbB1/HER1 ou

EGFR, ErbB2/HER2 (Neu chez le rat), ErbB3/HER3 et ErbB4/HER4.

L’EGFR a été le premier récepteur de cette famille à avoir été identifié et cloné par Carpenter en

1978, et il est codé par le proto-oncogène ErbB1 (Carpenter et al., 1978). L’EGFR est une

glycoprotéine de 170 kDa composée d’une seule chaîne polypeptidique de 1186 acides aminés.

L’EGFR a été détecté dans le noyau de nombreuses lignées cellulaires où il peut fonctionner

comme un facteur de transcription pour l’activation de gènes impliqués dans le processus de

prolifération. Lin et al. (2001) ont montré qu’après la stimulation par l’EGF à la surface cellulaire,

l’EGFR migre dans le noyau où il peut lier une séquence consensus riche en AT et augmenter ainsi

la transcription de gènes par une région riche en proline. En utilisant la technique

d’immunoprécipitation de la chromatine, ils ont montré que l’EGFR est associé à la région

promotrice du gène codant pour la cycline D1 in vivo, une protéine qui peut jouer un rôle clef dans

la mitogenèse (Fickova, 2002; Lin et al., 2001;Wong and Chang, 2001).

2. Structure des récepteurs ErbB

Les récepteurs ErbB sont composés de trois domaines (figure 4):

- Un domaine extracellulaire de 621 acides aminés contenant le site de liaison pour le ligand.

Ce domaine comprend quatre régions (Warren and Landgraf, 2006):

1919


1. la région I (L1) est importante dans la dimérisation induite par le ligand (Fernandes

et al., 2001)

2. les régions II (S1 ou CR1) et IV (S2 ou CR2) sont riches en cystéines (Abe et al.,

1998) et sont liés par un pont disulfide intra-chaîne, contenant 22 et 20 résidus

cystéine.

3. la région III (L2)

Les régions I et III sont impliquées dans la fixation des ligands et les régions II et IV sont impliqués

dans la dimérisation induite par la fixation de ligand.

Le domaine extracellulaire de ces récepteurs est peu conservé dans cette famille suggérant que ces

récepteurs membranaires ont des spécificités différentes dans la liaison du ligand (Olayioye et al.,

2000; Yarden and Sliwkowski, 2001).

- Un domaine intracellulaire (ou cytoplasmique) de 542 aa contenant un domaine catalytique

tyrosine kinase, un domaine juxta-membranaire et une longue queue C-terminale. Le domaine

juxtamembranaire est une région régulatrice importante. Cette région est sujette à des

phosphorylations par des protéines kinases comme la protéine kinase C (PKC) permettant

d’atténuer ou de moduler la signalisation par les récepteurs ErbB. La queue C terminale contient

d’une part cinq sites d’autophosphorylation (Tyr 992, Tyr 1068, Tyr 1086, Tyr 1168 et Tyr 1173)

qui lient spécifiquement les protéines contenant les domaines SH2 ou PTB, d’autre part au moins

trois motifs d’internalisation, et également des sites pour la transphosphorylation, l’activation

protéolytique et la dégradation (Fernandes et al., 2001). Le domaine intracellulaire est fortement

conservé bien que celui-ci contienne des substitutions d’acides aminés inactivant l’activité tyrosine

kinase. L’activité catalytique des récepteurs ErbB réside dans le domaine tyrosine kinase. En effet,

l’inhibition de celui-ci élimine l’activité biologique des récepteurs ErbB. Il existe un motif dans le

domaine juxtamembranaire qui peut lier les protéines G hétérodimériques (Wells, 1999).

- Un domaine transmembranaire hydrophobe de 24 aa qui connecte les deux autres domaines.

2020


Figure 4: Structure schématique des récepteurs ErbB. Le domaine extracellulaire est composé de quatre régions, homologues deux à deux, appelées L1 et L2 (région I et III) et S1 et S2 (région II et IV) riche en cystéine. S’ensuivent le domaine transmembranaire, le domaine juxtamembranaire, le domaine tyrosine kinase et un domaine C-terminal qui porte les sites majeurs de phosphorylation sur tyrosine D’après (Burgess et al., 2003).

3. Les ligands des récepteurs ErbB

Les récepteurs ErbB sont activés par la liaison d’une famille de ligands contenant un domaine

EGF-like (Holbro and Hynes, 2004). Douze ligands sont actuellement connus pour ces quatre

récepteurs offrant un grand nombre de combinaisons possibles aboutissant ainsi à une grande

diversité des voies de signalisation (Gullick, 2001).

Les ligands des récepteurs ErbB peuvent être divisés en trois groupes (tableau 1). Le premier

groupe comporte 3 ligands spécifiques de l’EGFR qui sont l’epidermal growth factor (EGF), le

transforming growth factor α (TGF-α) et l’amphiréguline (AR). Le second groupe comporte la beta-

celluline (BTC), l’heparin-binding epidermal growth factor (HB-EGF) et l’épiréguline (EPR), qui

montrent une spécificité double en liant l’EGFR et ErbB-4. Le troisième groupe est composé des

neurégulines (NRGs) et peut être sub-divisé en trois sous-groupes basés sur leur capacité à lier

ErbB-3 et ErbB-4 (NRG-1 et NRG-2) ou seulement ErbB-4 (NRG-3 et NRG-4) (Carraway et al.,

1997; Harari et al., 1999; Normanno et al., 2006; Zhang et al., 1997). On ne connaît pas de ligand se

fixant au domaine extracellulaire du récepteur ErbB2 (Citri et al., 2003). L’EGF est parmi les

premiers facteurs de croissance à avoir été découvert. L’EGF a été initialement isolé des glandes

sous-maxillaires des souris (Cohen, 1962).

2121


EGFR (ErbB1) Erb2 Erb3 ErbB4

EGF NRG1 NRG1

TGFα NRG2 NRG2

AR NRG3

HB-EGF NRG4

BTC HB-EGF

EPR BTC

EPR

Tableau 1. Les récepteurs ErbB et leurs ligands connus. Abréviations : EGF : Epidermal Growth Factor ; HB-EGF : Heparin Binding EGF-like factor; TGF-α : transforming growth factor α; AR: amphiréguline; EPR : épiréguline ; NRG : neurégulines ; BTC : beta-celluline.

Tous ces ligands sont de petites protéines solubles (d’environ 55 aa) qui dérivent par protéolyse de

précurseurs membranaires (Massague and Pandiella, 1993). Le clivage de ces précurseurs

membranaires est dû à l’intervention de métalloprotéases appartenant aux familles ADAM, en

réponse à divers stimuli en particulier à l’activation des récepteurs couplés aux protéines G. La

structure tridimentionnelle des ligands est caractérisée par l’existence d’un domaine EGF-like et de

trois ponts disulfures intramoléculaires. Le domaine de liaison au récepteur contient d’autres motifs

structuraux comme des domaines Ig-like, des sites de liaison à l’héparine et des sites de

glycosylation (Yarden and Sliwkowski, 2001).

4. Dimérisation des récepteurs ErbB

Les récepteurs de la famille ErbB sont activés après la fixation de ligand entraînant l’homo ou

l’hétérodimérisation. Il existe des interactions directes entre les récepteurs dimérisés mise en avant

par la boucle de dimérisation formée dans le domaine II. La structure de l’EGFR, de ErbB3 et de

ErbB4 inactifs est caractérisée par les interactions intramoléculaires entre les domaines II et IV qui

maintiennent les domaines de fixation du ligand en conformation fermée (ou auto-inhibée).

Cependant, dans le cas du récepteur ErbB2 la même caractéristique n’est pas observée. En effet, le

domaine extracellulaire de ErbB2 adopte une conformation ouverte similaire à celle des autres

récepteurs ErbB activés par la fixation du ligand. Dans cette conformation ouverte, les interactions

fortes entre les domaines I et III ne permettent aucune liaison du ligand, ce qui peut expliquer

l’absence d’affinité de ErbB2 pour un ligand. ErbB2 se trouve donc dans une conformation

2222


favorable à la dimérisation (Citri et al., 2003; Marmor et al., 2004). En ayant une conformation

ouverte, ErbB2 est capable d’interagir avec les autres récepteurs ErbB expliquant ainsi son rôle de

co-récepteur avec les autres récepteurs ErbB en absence de liaison directe avec le ligand. En effet,

ErbB2 est le partenaire favori pour l’hétérodimérisation avec les autres récepteurs ErbB (Graus-

Porta et al., 1997). Les hétérodimères contenant le récepteur ErbB2 ont des caractéristiques

particulières, comme une endocytose plus lente qui induit alors un signal plus prolongé et plus

puissant, ce qui permet une prolifération cellulaire plus importante.

Figure 5 : Mécanisme d’hétérodimérisation des récepteurs ErbB, exemple de l’hétérodimère ErbB2/ErbB3. Le domaine extracellulaire de chaque récepteur ErbB consiste en quatre regions (I à IV). (a) En absence de ligand, le domaine extracellulaire de ErbB3 et de EGFR (non montré ici) est dans une conformation fermée qui ne permet pas la dimérisation. (b) Après fixation du ligand, ErbB3 ou l’EGFR se trouve en configuration ouverte. Les domaines I et III sont impliqués dans la liaison du ligand, et ensuite la boucle de dimérisation située dans le domaine II est exposée. (c) et permet alors l’interaction récepteur-récepteur. ErbB2 se trouve en conformation ouverte qui est similaire à l’état de ErbB3 et de l’EGFR activés par le ligand. D’après (Hynes and Lane, 2005).

Le récepteur ErbB3 quant à lui ne possède pas d’activité tyrosine kinase, bien que le

domaine tyrosine kinase soit très conservé parmi les récepteurs ErbB (Guy et al., 1994). Sans une

activité tyrosine kinase fonctionnelle, ErbB3 doit s’apparier avec un autre récepteur ErbB pour

pouvoir participer à la transduction du signal. Le partenaire favori de ErbB3 est le récepteur ErbB2

et le complexe ErbB2/ErbB3 provoque le plus fort signal prolifératif (Citri et al., 2003).

5. Rôles physiologiques des récepteurs ErbB

Les récepteurs ErbB sont exprimés dans des tissus d’origine épithéliale, mésenchymateuse et

neuronale où ils jouent des rôles dans le développement, la prolifération et la différenciation

(Olayioye et al., 2000). L’EGF et son récepteur sont aussi impliqués dans le développement

2323


embryonnaire précoce et dans le renouvellement des cellules souches dans des tissus normaux

comme la peau, le foie et l’intestin (Campbell and Bork, 1993; Salomon et al., 1990).

L’utilisation de modèles de souris transgéniques a permis de définir le rôle des récepteurs ErbB

et de leurs ligands dans le développement de différents organes (tableau 2).

Le knockout (KO) de l’EGFR provoque la mort des souris au stade embryonnaire ou juste après

la naissance. De plus, les souris invalidées du gène codant l’EGFR présentent des anomalies du

développement épithélial et de différents organes tels que le cerveau, la peau, les poumons ou le

tractus gastrointestinal (Miettinen et al., 1995; Sibilia et al., 1998; Sibilia and Wagner, 1995). Les

souris egfr-/- présentent aussi une neurodégénérescence sévère et progressive suggérant que

l’EGFR joue un rôle dans la prolifération et/ou la différenciation des astrocytes et dans la survie de

neurones post-mitotiques (Sibilia et al., 1998). Des souris invalidées des gènes codant pour ErbB2

et ErbB4 présentent quant à elles des défauts du système nerveux et des anomalies du coeur

provoquant la mort (Gassmann et al., 1995; Lee et al., 1995; Leu et al., 2003). De plus,

l’invalidation du gène codant pour ErbB2 provoque l’arrêt du développement des oligodendrocytes

et l’arrêt de la formation de myéline (Park et al., 2001). L’invalidation du gène codant pour ErbB3

provoque la mort des souris au stade embryonnaire. Cette mort est due à des défauts de formation

de la valve cardiaque (Erickson et al., 1997). Les récepteurs ErbB jouent également un rôle essentiel

dans l’organisme adulte. Par exemple, ils jouent un rôle important dans le développement des

glandes mammaires pendant la puberté et la grossesse (Marmor et al., 2004). Des KO des gènes

codant les ligands des récepteurs ErbB ont montré que les ligands jouent un rôle important dans le

développement de certains organes (Normanno et al., 2006) (tableau 2). Contrairement aux KO des

récepteurs ErbB, les KO des ligands des récepteurs ErbB n’induisent pas de mort embryonnaire

(Normanno et al., 2006).

Des KO conditionnels ont donc confirmé l’importance des récepteurs ErbB dans le

développement du système cardiovasculaire (ErbB2 en particulier), du système nerveux (ErbB3,

ErbB4), des glandes mammaires ainsi que des épithéliums en général (Casalini et al., 2004; Holbro

and Hynes, 2004). Chez l’adulte, ces récepteurs restent impliqués dans le fonctionnement normal de

ces organes.

2424


Cible mutée localisation des défauts

EGFR Épiderme, glande mammaire, poumon, pancréas, intestine, système nerveux central

ErbB-2 Glande mammaire, Coeur, système nerveux central

ErbB-3 Cœur, système nerveux central

ErbB-4 Glande mammaire, Coeur, système nerveux périphérique et central

EGF Prostate, système nerveux périphérique et central

TGF-α Epiderme, prostate, yeux

HB-EGF système nerveux central

AR/EGF/TGF-α Tractus gastrointestinal

Tableau 2 : conséquences biologiques de l’invalidation des gènes codant pour les récepteurs ErbB ou pour leurs ligands dans des organes. (Normanno et al., 2006)

6. Transactivation des récepteurs ErbB

La stimulation de la phosphorylation de l’EGFR peut se produire après le traitement par des

stimuli non physiologiques, incluant l’hyperosmolarité, le stress oxydatif, le stress mécanique, la

lumière UV et les γ-irradiations. En complément des stimuli non physiologiques, l’activation du

récepteur peut aussi être induite par les chemokines, par des molécules d’adhésion cellulaire et des

RCPG (Gschwind et al., 2004) (figure 6).

Figure 6 : Activation des récepteurs ErbB indépendante du ligand, exemple de l’EGFR. L’EGFR peut être activé par des signaux qui viennent des récepteurs aux cytokines, des intégrines, de la dépolarisation de la membrane, du stress cellulaire et des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). D’après (Gschwind et al., 2004)

2525


Transactivation des récepteurs ErbB par les RCPG (figure 7)

L’activation des RCPG par des agonistes tels que l’endothéline, l’acide lysophosphatidique,

la bradykinine ou la thrombine peut provoquer la phosphorylation de l’EGFR permettant ainsi

l’activation de voies de signalisation comme la voie des MAPK.

Figure 7: Mécanismes de transactivation des récepteurs ErbB par les RCPG . (Yarden and Sliwkowski, 2001)

Les RCPG peuvent activer indirectement Src (probablement par l’intermédiaire de Pyk2) qui peut

phosphoryler l’EGFR sur des résidus tyrosines autres que ceux phosphorylés par la kinase de

l’EGFR (Arteaga et al., 2002; Carpenter, 1999). L’activation de l’EGFR dépend alors de Src. En

plus des kinases Src, les kinases sérine/thréonine PKC (protéine kinase C) peuvent être impliquées

dans la transactivation de l’EGFR. Dans les cardiomyocytes, les cellules PC-12 et les cellules HEK-

293, la transactivation de l’EGFR est strictement dépendante de l’activité de la PKC (Fischer et al.,

2003; Kodama et al., 2002; Tsai et al., 1997; Venkatakrishnan et al., 2000). Cependant, dans des

systèmes cellulaires différents comme les cellules musculaires lisses, les fibroblastes cellulaires, les

cellules PC-12, les concentrations intracellulaires en calcium sont nécessaires à la transactivation de

l’EGFR. Dans ce cas, l’activation des récepteurs ErbB par les RCPG est dépendante du calcium

intracellulaire. La tyrosine kinase Pyk2 qui pourrait être activée par le calcium serait impliquée dans

la transactivation de l’EGFR (Fischer et al., 2003; Keely et al., 2000; Soltoff, 1998).

Les RCPG peuvent également activer des métalloprotéases (identifiées comme des membres

de la famille ADAM) qui vont alors cliver le pro-ligand (comme la proHB-EGF), ce qui va

2626


permettre la libération du ligand mature (comme l’HB-EGF). La libération de facteurs de croissance

matures active alors l’EGFR ainsi que les voies de signalisation.

De plus, il a été montré que les hormones stéroïdiennes peuvent avoir un effet positif sur la

signalisation des récepteurs ErbB en activant la transcription des gènes codant pour les ligands des

récepteurs ErbB (Yarden and Sliwkowski, 2001).

De nombreuses études ont montré que la transactivation de l’EGFR se fait dans des types de

cellules variées, telles que les cellules musculaires lisses, les kératinocytes, ou les cellules PC12

(Daub et al., 1997; Eguchi et al., 1998; Zwick et al., 1997).

7. Mécanismes de régulation de l’activation de l’EGFR

L’activité de l’EGFR comme celle des autres RTK doit être hautement régulée afin de

permettre une activité cellulaire normale et une réponse aux nombreuses stimulations par des

facteurs de croissance. En effet, une expression anormale ou un dysfonctionnement de l’EGFR est

responsable de plusieurs pathologies et désordres du développement. Par conséquent, afin de

permettre au signal induit par l’EGFR d’être régulé, la cellule met en place des mécanismes de

régulation négative.

Dans cette partie, quatre mécanismes de régulation seront décrits:

- les antagonistes de l’EGFR

- l’inhibition par les protéines tyrosines phosphatases

- l’inhibition de l’activité catalytique par la PKC

- par des mécanismes d’endocytose dépendants de la clathrine

7.1. Régulation par des antagonistes de l’EGFR

Il existe des antagonistes de l’EGFR qui régulent l’activation de l’EGFR. Chez la

drosophile, il existe la protéine Argos (antagoniste) qui est sécrétée par la cellule après stimulation.

Argos inhibe alors l’activité de DER (homologue de l’EGFR) par compétition avec Spitz (agoniste)

(Casci and Freeman, 1999). Dans les cellules de mammifères, on retrouve la décorine, un

protéoglycane riche en leucines, qui agit comme un antagoniste de l’EGFR (Iozzo et al., 1999). La

décorine inhibe la dimérisation et l’activation de l’EGFR.

2727


Tableau 3 : Liste des antagonistes de l’EGFR (Ledda and Paratcha, 2007). 7.2. Régulation par les protéines phosphatases

Les protéines tyrosine phosphatases (PTP) jouent un rôle important dans le contrôle de

l’activité des RTK et dans les voies de signalisation qu’elles régulent. Les PTP déphosphorylent les

sites de régulation du récepteur résultant alors dans l’inactivation de l’activité enzymatique du

récepteur. Ainsi, la phosphatase PTP1B permet la diminution de l’activation de l’EGFR (Lammers

et al., 1993). Les fibroblastes de souris déficients en PTP1B montrent une phosphorylation

augmentée et sous-tenue de l’EGFR après stimulation (Haj et al., 2003). SHP1 a aussi été identifiée

comme une phosphotyrosine phosphatase qui régule négativement l’EGFR. Ainsi, le recrutement de

la tyrosine phosphatase SHP1 sur la Tyr1173 de l’EGFR, un site majeur d’autophosphorylation du

récepteur, se traduit par la déphosphorylation du récepteur et la terminaison des signaux émis lors

de sa stimulation (Keilhack et al., 1998).

Tableau 4: Protéines tyrosine phosphatases régulant l’EGFR (d’après (Ostman and Bohmer, 2001)).

2828


7.3. Régulation par l’inhibition de l’activité catalytique par la PKC

L’activation de la protéine kinase C (PKC) par des récepteurs couplés aux protéines G, par

PDGF (Platelet Derived Growth Factor), ou par des phorbol-esters entraîne une phosphorylation sur

de multiples résidus sérine et thréonine dans le domaine juxtamembranaire de l’EGFR. La

phosphorylation de l’EGFR par PKC, entraîne une inhibition de l’activité tyrosine kinase et une

inhibition de la fixation de l’EGF au domaine extracellulaire (Cochet et al., 1984; Davis and Czech,

1985).

7.4 Régulation par endocytose dépendant de la clathrine

Dans ce type de mécanisme de régulation négative, l’ubiquitination joue un rôle important

(figure 8). En effet, lors de l’étape initiale d’endocytose, l’ubiquitination du récepteur permet son

adressage aux vésicules à clathrine et l’assemblage de ces dernières. Ainsi, les récepteurs de l’EGF

une fois phosphorylés vont recruter une ubiquitine ligase E3, Cbl qui possède un domaine RING

finger (de Melker et al., 2001; Haglund et al., 2003). Cbl va ubiquitiner l’EGFR et s’associer avec

la protéine CIN85 (Cbl-interacting protein of 85kDa) et les endophilines. L’EGFR va ensuite

phosphoryler et induire l’ubiquitination de Eps15 (EGFR pathway substrate 15) et de l’epsine

(Confalonieri et al., 2000; Polo et al., 2002). Cette dernière va ensuite interagir avec la protéine AP2

(Adaptator Protein 2), la clathrine et le PI4,5P2. L’epsine et Eps15 peuvent ensuite lier l’EGFR qui

est ubiquitinylé. Dans les endosomes précoses, HRS (Hepatocyte growth factor Regulated tyrosine

kinase Substrate) va lier le PI3P par leurs domaines FYVE et va pouvoir former un complexe avec

les protéines STAM (Signal Transduction Adaptator Molecule) et Eps15 qui vont interagir avec

l’EGFR (Bache et al., 2003). Ensuite, l’EGFR va soit être recyclé à la membrane cellulaire ou va

aller dans les corps multivésiculaires. Dans les corps multivésiculaires, HRS va interagir avec la

protéine TSG101 (Tumour Susceptibility Gene 101), qui fait partie du complexe ESCRTI

(Endosomal Sorting Complex Required for Transport I). Suite à cette interaction, l’EGFR va aller

dans les vésicules intraluminales des corps multivésiculaires et enfin, l’EGFR va pouvoir être

dégradé dans les lysosomes par de multiples protéases.

2929


Figure 8: Mécanisme de régulation par endocytose de l’EGFR. L’internalisation et la dégradation sont contrôlées par le recrutement au récepteur activé d’une ubiquitine ligase, la protéine Cbl. Le récepteur est ainsi ubiquitinylé, puis dégradé ou recyclé à la membrane plasmique (Le Roy and Wrana, 2005). Cbl est soit recrutée directement sur l’EGFR ou indirectement par Grb2 (Waterman et al., 2002). Il

a été montré que les EGFR internalisés sont enzymatiquement actifs, hyperphophorylés et associés

à Shc, Grb2 et mSos (mammalian son-of-sevenless) ce qui mène à l’activation de la voie

Ras/MAPK (Haugh et al., 1999a; Wang and Moran, 1996). Des EGFR localisés dans les endosomes

peuvent activer Ras aussi efficacement que les récepteurs localisés à la surface mais l’activation de

PLCγ est restreinte à la surface cellulaire (Haugh et al., 1999b). Les homodimères EGFR/EGFR

activés sont relativement stables et demeurent liés à Cbl et sont alors rapidement dégradés tandis

que les hétérodimères EGFR/ErbB2 sont moins stables et non couplés aux endosomes précoces

provoquant la dissociation de Cbl du complexe récepteur. Ces récepteurs sont alors recyclés à la

membrane cellulaire (Lenferink et al., 1998; Marmor and Yarden, 2004). Les récepteurs ErbB2,

ErbB 3 et ErbB4 ne possèdent pas de site de liaison pour Cbl donc c’est une autre E3 ligase, NRdp1

(neuregulin receptor degradation protein-1) qui intervient dans la dégradation de ces récepteurs

(Diamonti et al., 2002; Qiu and Goldberg, 2002).

8. Les voies de signalisation activées par les récepteurs ErbB

En plus de leur rôle dans le contrôle de l’activité tyrosine kinase, l’autophosphorylation des

tyrosines des récepteurs ERbB est importante pour le recrutement et l’activation de nombreux

3030


effecteurs (Figure 9). Les effecteurs interagissent avec les récepteurs ErbB grâce à leurs domaines

SH2 ou PTB qui lient les sites d’autophosphorylation des tyrosines des récepteurs ErbB. Après le

recrutement des effecteurs, différentes voies de signalisation peuvent être initiées. Les différentes

protéines recrutées peuvent être des protéines adaptatrices comme Shc, Crk, Grb2, ou des kinases

comme PI3K, Src (Olayioye et al., 2000).

Les principales voies de signalisation induites par les récepteurs ErbB sont: la voie Ras/MAPK

et la voie des phosphoinositide 3 kinase (PI3K). Ces deux voies seront décrites en détail dans le

chapitre II. Les récepteurs ErbB initient également des voies de signalisation qui impliquent la

PLCγ, des GTPases comme Rho et Rac, des isoformes de STAT, des protéines G hétérodimériques,

la PLD et la tyrosine kinase cytoplasmique Src.

Figure 9: Schéma représentant les résidus phosphotyrosines spécifiques et la liaison des protéines de la signalisation aux récepteurs ErbB (d’après (Schulze et al., 2005)).

- La voie Ras/MAPK est une voie importante qui régule la prolifération cellulaire et la

survie. Le complexe formé par la protéine adaptatrice Grb2 et Sos lie soit directement le récepteur

ou soit par association avec la protéine adaptatrice Shc.

- La voie PI3K est impliquée dans la croissance cellulaire, la résistance à l’apoptose,

l’invasion et la migration cellulaire (Scaltriti and Baselga, 2006; Vivanco and Sawyers, 2002). Le

3131


principal mécanisme qui conduit à l’activation de la PI3K dépendante de l‘EGFR est la dimérisation

du récepteur avec ErbB3. En effet, les sites d’ancrage pour la sous-unité régulatrice p85 de la PI3K

sont absents sur l’EGFR, tandis qu’au contraire les sites d’ancrage pour la p85 sont abondants sur

ErbB3 (Prigent and Gullick, 1994). La sous-unité p85 peut interagir avec l’EGFR via la protéine

Gab1 (Mattoon et al., 2004).

- La voie des STAT (Signal transducers and activators of transcription): les protéines STAT

interagissent avec les résidus phosphotyrosines via leurs domaines SH2. Une fois activées, ces

protéines vont se dimériser et vont alors se transloquer au noyau pour permettre l’expression de

gènes cibles spécifiques (Haura et al., 2005).

- La kinase Src : Src est le membre prototype d’une famille de neuf gènes de tyrosines

kinases non récepteurs qui joue un rôle critique dans la régulation de la prolifération cellulaire, la

migration, l’adhésion cellulaire, l’angiogénèse et la fonction immune (Summy and Gallick, 2006;

Yeatman, 2004). La kinase Src, qui est localisée dans le cytosol, active une série de substrats tels

que la FAK (Focal Adhesion Kinase), la PI3K et les STAT (Summy and Gallick, 2006; Yeatman,

2004). L’interaction entre l’EGFR et la kinase Src est complexe. La kinase Src peut être impliquée

dans la résistance des thérapies via une interaction indépendante ou une association avec d’autres

récepteurs.

-La phospholipase C γ (PLC γ) hydrolyse le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate pour

donner du inositol 1,3,5 trisphosphate et du diacylglycérol. Le inositol 1,3,5 trisphosphate est

important pour le relarguage du calcium intracellulaire et le diacylglycérol permet l’activation de la

protéine kinase C (Patterson et al., 2005; Scaltriti and Baselga, 2006). L’activation de la protéine

kinase C peut mener à l’activation des MAPK et des JNK (c-Jun NH2 terminal kinase)

(Schonwasser et al., 1998). La PLC γ1 est l’isoforme de la PLC γ qui peut interagir directement

avec l’EGFR (Chattopadhyay et al., 1999). Mais en 2005, Schulze et al n’ont par réussi à mettre en

évidence l’interaction de PLC γ1 avec l’EGFR (Schulze et al., 2005). De même, ils n’ont pas réussi

à mettre en évidence la liaison de SHP1 sur l’EGFR ou de la kinase Chk sur ErbB2 ou également de

la protéine Grb7 sur ErbB3. L’interaction de ces protéines avec les récepteurs ErbB a pourtant été

mise en évidence par d’autres études.

Les résultats négatifs obtenus par Schulze et al peuvent s’expliquer par le fait que les liaisons de

PLC γ, de Grb7, de SHP1 et de Chk sur les récepteurs sont des liaisons de faible affinité. De plus, il

est possible que les différences d’interaction des protéines avec les récepteurs soient dues au type

cellulaire utilisé et ainsi qu’au niveau d’expression des protéines.

3232

Introduction bibliographique Chapitre II : Les voies de signalisation Ras/MAPK et PI3K

Chapitre II : Les voies de signalisation Ras/MAPK et PI3K

I. La voie de signalisation des MAPK

La voie de signalisation des MAPK est extrêmement bien conservée au cours de l’évolution.

Cette voie est impliquée dans le contrôle de nombreux processus fondamentaux tels que la

prolifération cellulaire, l’apoptose, la différenciation, et la migration cellulaire (Chong et al., 2003;

O'Neill and Kolch, 2004; Wellbrock et al., 2004). La stimulation des récepteurs à activité tyrosine

kinase mène à l’activation de petites protéines appelées Ras GTPases qui à leur tour activent les

MAPKKK. Ces dernières ainsi activées phosphorylent et activent en cascade les MAPKK. Elles

vont activer à leur tour les MAPK par la phosphorylation de résidus thréonine et tyrosine. Chez les

mammifères, il existe sept familles de MAPK codées par 14 gènes différents: les familles définies

comme les MAPK classiques comprenant ERK1/2 (Extracellular Signal-Regulated Kinase),

JNK1/2/3 (c-Jun N terminal Kinase) ou SAPK (Stress-Activated Protein Kinase), p38α, β, γ, ERK5

et les familles dites MAPK atypiques comprenant ERK3, ERK4, ERK7 et NLK (Cuevas et al.,

2007). Ces sept grandes familles définissent donc sept voies de signalisation des MAPK contrôlant

de nombreux processus cellulaires comme la morphogénèse des tissus, la prolifération cellulaire, la

différentiation, la survie cellulaire, les réponses immunes et l’adaptation cellulaire (Chang and

Karin, 2001; Pearson et al., 2001).

Figure 10: Les voies de signalisation des MAP kinases. (Coulombe and Meloche, 2007). Dans cette partie, la voie de signalisation Ras/MAPK sera développée en détail. Ainsi, nous nous

intéresserons tout d’abord, à la protéine Ras qui est le principal acteur dans l’activation de cette

33


voie, puis ensuite, nous nous intéresserons au module Raf/MEK/ERK, en traitant entre autre des

substrats des MAPK, de la régulation de la voie des MAPK.

1. La voie canonique Ras/MAPK

1.1. Présentation de la famille Ras

La superfamille des protéines Ras est une famille de petites GTPase (Guanosine

triphosphate hydrolase) comprenant une vingtaine de membres répartis en plusieurs sous- familles.

Ce sont des petites protéines monomériques capables de lier du GDP ou du GTP, qui ont été très

conservées au cours de l'évolution (Colicelli, 2004). Chez l’homme, environ 150 de ces petites

protéines de signalisation sont exprimées et servent à réguler la croissance, la mobilité cellulaire, la

morphogenèse et le trafic membranaire. Cette superfamille comprend 5 sous-groupes: Ras, Rho,

Ran, Rab et Arf qui sont associées à des fonctions spécifiques.

- La famille Ras: La famille Ras (Ras sarcoma) est composée de 36 membres. Ras activé

interagit avec de nombreux effecteurs qui régulent des voies de signalisation, qui contrôlent

l’expression du gène et la régulation de la prolifération cellulaire, ainsi que la différenciation et la

survie. La voie des MAPK demeure la voie de signalisation passant par Ras la mieux identifiée

(Repasky et al., 2004).

- La famille des Rho: Les protéines de cette famille régulent l’organisation de l’actine, la

progression du cycle cellulaire et l’expression de gène (Etienne-Manneville and Hall, 2002). Vingt

membres ont été identifiés, dont RhoA, Rac1 et Cdc42 étant les plus étudiés. Certaines de ces

protéines sont membranaires et d’autres sont principalement cytoplasmiques. Ainsi, la protéine

RhoB est localisée sur les endosomes et la protéine Cdc42 sur le réticulum endoplasmique. Leur

localisation peut dépendre de leur interaction avec d’autres protéines comme les GDI (guanine

nucleotide dissociation inhibitors) et cette localisation peut être régulée au cours du cycle des

GTPases. Bien que les protéines Miro aient été en premier décrites comme des protéines Rho, il est

apparu que ces protéines constituent un groupe à part entière (Wennerberg and Der, 2004). Les

protéines Miro sont localisées au niveau de la mitochondrie (Wennerberg et al., 2005).

- La famille Rab: Les protéines Rab (Ras-like proteins in brain) comprennent 61 membres.

Elles régulent le transport vésiculaire et sécrétoire (Pereira-Leal and Seabra, 2001; Zerial and

McBride, 2001). Les protéines Rab vont être localisées dans des compartiments spécifiques selon

34


leurs fonctions (Zerial and McBride, 2001). Rab5 est localisée dans les endosomes précoces et

régulent le transport médié par des vésicules recouvertes de clathrine.

- La famille Ran: Les protéines Ran (Ras-like nuclear) sont les protéines GTPases les plus

abondantes dans les cellules et les mieux connues de part leur fonction essentielle dans le transport

nucléocytoplasmique des ARN et des protéines (Weis, 2003). La protéine Ran-GTP nucléaire

interagit avec les importines, les exportines ou avec des protéines cargo. Ces protéines interviennent

dans la réplication de l’ADN et dans l’assemblage de l’enveloppe nucléaire (Li et al., 2003).

- La famille Arf: Les protéines de la famille Arf (ADP ribosylation factor) sont impliquées

dans la régulation du transport vésiculaire. La protéine Arf1 est la mieux caractérisée (Memon,

2004).

Les petites protéines G existent sous deux états conformationnels dépendants de la nature du

nucléotide fixé et correspondant à des états fonctionnels différents de la protéine, la forme liée au

GTP étant active alors que la forme liée au GDP est inactive. Seule la forme active est capable de

fixer les effecteurs (Bishop and Hall, 2000; Repasky et al., 2004). Le passage entre ces deux états

est extrêmement contrôlé et régulé par des voies différentes (le cycle des GTPases) (figure 11). Ce

cycle est régulé par deux classes de protéines : les protéines GAP (GTPases Activating proteins),

favorisant l’activité GTPasique des petites protéines G, permet la formation de la forme inactive lié

au GDP (Bernards and Settleman, 2004) et les protéines GEF (Guanine Exchange Factor) qui

permettent la formation de la forme active liée au GTP (Schmidt and Hall, 2002). La comparaison

des structures tridimentionnelles des états liés au GDP ou au GTP montre essentiellement que deux

régions de la protéine changent en fonction du nucléotide; on appelle ces régions switch I et II. Ces

deux structures ne sont pas figées dans la conformation liée au GDP alors qu’elles sont stabilisées

dans une position précise sous forme GTP. Les deux régions switch forment le domaine effecteur

de Ras et des GTPases. Les effecteurs interagissent au niveau de ces deux régions. Il existe une

classe de protéines inhibitrices appelées GDI (guanine nucleotide dissociation inhibitors), faisant

partie d’une sous-classe de petites GTPases. Le rôle précis de ces protéines dans le cycle des

GTPases n’est pas très clair.

35


Figure 11 : Le cycle des GTPases. Le cycle des GTPases est contrôlé par deux classes principales de protéines régulatrices: les GEF (Guanine-nucleotide-Exchange Factors) qui permettent la formation de la forme active liée au GTP, et les GAP (GTPase-Activating Proteins) qui permettent la formation de la forme inactive liée au GDP. Il existe une autre classe d’inhibiteurs, les GDI (Guanine nucleotide Dissociation Inhibitors) (Bernards and Settleman, 2004). 1.1.1. La protéine Ras a. Structure des isoformes de Ras

Le prototype de la famille des petites protéines G est l’oncogène Ras, qui est une petite protéine de

21 kDa. Chez les mammifères, il existe quatre isoformes de la protéine Ras codées par trois gènes

différents : H-Ras, N-Ras et K-Ras4A et 4B (figure 12).

Figure 12 : Structure des isoformes de Ras : HRas, NRas, KRas4A et KRas4B. Les Ras

possèdent un domaine G et une région hypervariable (HVR) (Schubbert et al., 2007).

36


Les 85 premiers acides aminés sont identiques dans les quatre protéines et permettent la liaison de

la guanosine diphosphate (GDP) et de la guanosine triphosphate (GTP). Le domaine G est composé

de la boucle P, qui lie le γ-phosphate du GTP, et du switch I et II, régulant la liaison aux régulateurs

et aux effecteurs de Ras.

b. Modifications et localisation des isoformes de Ras

Les isoformes de Ras ont une forte homologie entre elles. Les différences se situent au niveau

de la région hypervariable (HVR). Cette région qui comprend 25 aa, est importante pour les

modifications post-traductionnelles permettant le transport de protéines Ras nouvellement

synthétisées de la membrane plasmique à la surface cytosolique du réticulum endoplasmique ou à

l’appareil de Golgi (Hancock and Parton, 2005; Rajalingam et al., 2007). Les protéines Ras sont

produites sous forme de précurseurs cytoplasmiques qui subissent plusieurs modifications post-

traductionnelles incluant la farnésylation, la palmitoylation, la protéolyse et la carboxyméthylation.

La première modification de Ras décrite est la farnésylation sur un motif CAAX en C terminal qui

est essentielle pour sa fonction biologique. La farnésylation n’est pas suffisante pour permettre la

localisation des protéines Ras à la membrane plasmique, chacune des trois isoformes de Ras

subiront alors d’autres modifications. Ainsi, H-Ras et N-Ras seront palmitoylées sur des résidus

cystéine alors que la localisation de K-Ras à la membrane plasmique sera favorisée par sa région

polybasique (figure 13).

La technique FRET (fluorescence resonance energy transfer) a révélé que les protéines Ras

activées peuvent être détectées sur des membranes intracellulaires diverses telles que les

membranes de l’appareil de Golgi, du réticulum endoplasmique et des endosomes (Burke et al.,

2001; Chiu et al., 2002; Jiang and Sorkin, 2002; McKay and Morrison, 2007). Bien que les

protéines Ras subissent la farnésylation et la carboxylméthylation les localisant au niveau du

réticulum endoplasmique (Choy et al., 1999), K-Ras est restreint à la membrane plasmique.

Cependant quand la région polybasique est phosphorylée, K-Ras se localise dans d’autres

compartiments cellulaires tels que l’appareil de Golgi, le réticulum endoplasmique et la

mitochondrie (Bivona et al., 2006; Fivaz and Meyer, 2005). L’ubiquitination va contribuer à leur

localisation intracellulaire (Jura and Bar-Sagi, 2006; Jura et al., 2006). Les mono et diubiquitination

sélectives de H-Ras et N-Ras, mais pas de K-Ras sont déterminées par leur région hypervariable, et

nécessite la farnésylation et la palmitoylation. L’ubiquitination des protéines Ras stabilise leur

association avec les endosomes et module leur capacité à interagir avec Raf et à activer la voie des

MAPK (Jura and Bar-Sagi, 2006; Jura et al., 2006).

37


Figure 13 : Modifications et localisation des protéines Ras. Les protéines Ras sont synthétisées dans le cytosol et farnésylées par une proteinfarnesyl transferase (PFT) sur des résidus cystéine du motif CAAX (A est un acide aminé aliphatique et X est un autre acide aminé). Le clivage du tripeptide AAX et la méthylation s’effectue à la surface cytosolique du réticulum endoplasmique et sont médiés par Rce 1 (Ras converting enzyme 1) et par Icmt (Isoprenylcysteine carboxylmethyl transferase), respectivement. H-Ras et N-Ras subissent une palmitoylation dans la région hypervariable (HVR) sur l’appareil de Golgi pour atteindre la membrane plasmique via le transport vésiculaire, tandis que K-Ras atteint la membrane plasmique par une voie non caractérisée. La dépalmitoylation de H-Ras et N-Ras provoquent la localisation de ces deux isoformes dans l’appareil de Golgi (Rajalingam et al., 2007).

c. Activation de Ras

Suite à la stimulation des récepteurs à activité tyrosine kinase, des tyrosines phosphorylées du

récepteur vont servir de sites d’ancrage à des protéines adaptatrices à domaine SH2 comme Grb2

(growth factor receptor binding Homology 2) ou Shc (Schlessinger, 2000). Par ses deux domaines

SH3, Grb2 est constitutivement associée au domaine carboxy terminal riche en proline de Sos (Son

of sevenless), le facteur d’échange de la petite protéine G Ras. Ainsi, la liaison de Sos au récepteur

par l’intermédiaire de Grb2 permet sa relocalisation membranaire proche de son substrat qu’elle va

activer. Les GEF de Ras se répartissent en trois familles: Sos, GRF et GRP. Alors que Sos1 et Sos2

sont exprimées de façon ubiquitaire, Ras-GRF et Ras-GRP sont abondantes dans le cerveau. Sos

existe dans un état auto-inhibé, de ce fait, les interactions avec Ras modulent l’activité de Sos. La

liaison de Ras-GDP au site allostérique de Sos qui est distal au site catalytique induit une faible

activité du GEF qui permet alors la production de Ras-GTP (Sondermann et al., 2004). Ras-GTP lie

alors avec une plus forte affinité le même site. Des mutations de Sos qui interrompent leur auto-

inhibition ont été récemment identifiées chez les patients ayant le syndrome de Noonan (Roberts

and Der, 2007; Tartaglia et al., 2007).

38


En parallèle de cette voie canonique Grb2/Sos, il existe d’autres voies qui permettent

d’activer Ras. Ainsi, des études ont permi d’identifier des protéines telles que les protéines PI3K,

Gab1 et SHP2 qui jouent des rôles majeurs dans l’activation de Ras (Kiyatkin et al., 2006; Yart et

al., 2001). Les protéines Gab1, SHP2 et PI3K et leurs rôles seront détaillés dans ce chapitre.

d. Mécanismes de régulation négative de l’activation de Ras

Les protéines GAP ont un rôle important dans la régulation de Ras. Ces protéines permettent

d’interrompre le signal produit par l’activation de Ras. Il existe au moins 160 gènes humains qui

codent pour des protéines GAP. Le premier membre de la famille des GAP à avoir été identifiée est

la protéine p120GAP. Cette dernière a été la première protéine découverte comme interagissant

avec le domaine effecteur de Ras (Adari et al., 1988; Rajalingam et al., 2007). La protéine

p120GAP peut s’associer au récepteur PDGF activé par ses domaines SH2 ou par l’intermédiaire

d’une protéine adaptatrice p62Dok (Cooper and Kashishian, 1993; Di Cristofano et al., 1998). En

plus d’un domaine catalytique, cette protéine possède des domaines SH2, SH3 et PH, et des motifs

liant les phospholipides. Les protéines GAP sont régulées par des interactions intramoléculaires.

Ainsi, le domaine PH de p120 RasGAP régule l’activité de son domaine catalytique (Vos et al.,

2003). La protéine p120 RasGAP semble être régulée par protéolyse et est degradée par clivage par

certaines caspases (Yang and Widmann, 2001).

D’autres protéines GAP ont été identifiées comme par exemple, la neurofibromine. Cette

dernière est codée par le gène suppresseur de tumeur NF1. Des mutations dans ce gène sont

responsables d’une maladie génétique héréditaire qui est la neurofibromatose de type I (NFI)

(Rajalingam et al., 2007). La neurofibromine est phosphorylée sur plusieurs sites dans sa région C

terminale par la protéine kinase A. Cette phosphorylation permet l’interaction de la neurofibromine

avec les protéines 14-3-3 et est corrélée avec une réduction de l’activité Ras-GAP (Feng et al.,

2004). La neurofibromine subit une dégradation protéolytique rapide par ubiquitination (Cichowski

et al., 2003). Cette régulation de la neurofibromine peut s’expliquer par une augmentation de la

durée et de l’intensité de l’activation de Ras. Des études ont montré que des phospholipides et des

acides gras ont des effets inhibiteurs sur l’activité catalytique de la neurofibromine et de la p120

RasGAP (Bollag and McCormick, 1991; Tsai et al., 1989).

e. Effecteurs de Ras

L’activation de récepteurs comme les RCPG, les RTK ou les intégrines par différents ligands

provoque l’activation de protéines Ras qui recrutent alors un certain nombre d’effecteurs (figure

39


14). La liaison de ces effecteurs aux protéines Ras déclenche des cascades de signalisation bien

distinctes. Les effecteurs de Ras sont caractérisés par la présence d’un domaine RBD (Ras-Binding

Domain) ou un domaine RA (Ras Associating).

Figure 14 : Effecteurs de Ras et leurs réponses biologiques correspondantes (Malumbres and Barbacid, 2003).

En 1993, la protéine kinase Raf a été identifiée comme étant un effecteur majeur de Ras

(Chong et al., 2003). Les protéines Raf sont les premières kinases de la cascade des MAPK. L’autre

effecteur majeur de Ras est la protéine PI3K. En effet, il existe une interaction directe entre la sous-

unité catalytique p110 de PI3K avec la protéine Ras activée (Rodriguez-Viciana et al., 1994;

Sjolander et al., 1991). Cette interaction se fait grâce à un domaine RBD que possède la PI3K.

Parmi les isoformes de Ras, H-Ras est l’activateur le plus puissant de la PI3K comparé à K-Ras

(Yan et al., 1998).

La protéine Ras compte également parmi ses effecteurs des protéines de la famille des GEF.

Parmi ces derniers, on peut citer les protéines de la famille RalGEF qui possèdent un domaine RA.

Cette famille est composée des protéines RalGDS, RGL, RGL2 (aussi appelée Rlf) et RGL3 qui

sont des facteurs d’échange spécifiques des GTPases RalA et RalB. Les RalGEF jouent un rôle

important dans la transformation cellulaire. L’interaction entre RalGEF et Ras conduit à l’activation

des protéines RalA et RalB (Boettner and Van Aelst, 2002; Feig, 2003). Les protéines Ral régulent

l’endocytose et l'exocytose, l’organisation de l’actine et l’expression de gènes.

40


La protéine Tiam1 (T lymphoma invasion and metastasis protein 1) a été caractérisée comme

étant une protéine GEF spécifique de Rac possédant un domaine RBD qui interagit avec Ras,

permettant ainsi l’activation de Ras et de Rac (Lambert et al., 2002).

La protéine RIN1 est un autre effecteur de Ras comportant un domaine RA. Trois membres de

cette famille sont connus: RIN1, RIN2 et RIN3. La protéine RIN1 est cytosolique, tandis que les

protéines RIN2 et RIN3 sont localisées dans des vésicules endocytiques. L’activation de Ras peut

mener à l’activation de Rab5 via RIN1 provoquant alors l’endocytose.

La PLCε a été identifiée comme une protéine se liant à la protéine Ras grâce à son domaine

RBD. La PLCε est activée par différents facteurs de croissance comme le PDGF et l’EGF d’une

manière dépendante de Ras et de Rap1 (Jin et al., 2001; Song et al., 2002). Une rapide activation de

la PLCε se fait par l’intermédiaire de la protéine Ras tandis que la protéine Rap1 conduit à une

activation soutenue de la PLCε (Song et al., 2002). La PLCε a un rôle important dans la progression

des carcinomes (Bai et al., 2004).

Les protéines de la famille RASSF (1-6) (RAS association domain family) quant à elles

possèdent un domaine RA n’ayant pas de fonction catalytique. Parmi ces protéines RASSF, les

protéines Nore1 (Novel Ras Effector 1) également appelées RASSF5, RASSF1, RASSF2 et

RASSF4 sont des effecteurs de Ras. Les membres de la famille RASSF fonctionnent comme des

suppresseurs de tumeur. Une expression ectopique de la protéine Nore1 induit l’apoptose

dépendante de Ras (Vos et al., 2003). La formation du complexe H-Ras-RASSF1C et l’expression

transitoire de RASSF1C provoque la mort cellulaire qui est augmentée par la co-expression de Ras

activée (Vos et al., 2000). Les complexes Ras/Nore et Mst1 (mammalian Ste 20-like kinase) sont

impliquées dans des processus apoptotiques (Khokhlatchev et al., 2002).

Parmi les effecteurs de Ras, on peut également citer la protéine AF6 (également appelée

Afadin) et la protéine PKCζ qui sont impliquées, respectivement, dans des processus cellulaires

comme l’adhérence cellulaire et la transcription (Rajalingam et al., 2007). Moscat et al ont

démontré des interactions directes entre la protéine Ras et la protéine PKCζ in vitro et in vivo

(Diaz-Meco et al., 1994).

f. Invalidation de Ras chez la souris

L’invalidation de N-ras, de H-ras ou la double invalidation de H-ras, N-ras n’a pas de

conséquence sur le développement. Les souris invalidées de ces gènes sont viables et fertiles. Au

contraire, l’invalidation de K-ras provoque la mort embryonnaire avec des défauts de la croissance,

une atrophie du foie et l’anémie (Esteban et al., 2001 ; Rajalingam et al., 2007). K-Ras est donc

essentiel dans le développement embryonnaire de la souris. L’invalidation spécifique de l’isoforme

41


K-ras4A n’a pas de conséquence au niveau du développement, par conséquent, l’isoforme K-ras4B

est la seule isoforme de Ras à être impliquée dans la survie cellulaire au cours du développement

(Plowman et al., 2003).

Tableau 5: Conséquences biologiques de l’invalidation des gènes codant pour les protéines Ras. (Malumbres and Barbacid, 2003).

1.2. Le module Raf/MEK/ERK

1.2.1. La famille Raf

a. Structure et expression des protéines de la famille Raf

Chez les mammifères, la famille Raf (Rapidly Accelerated Fibrosarcoma) est composée de

trois membres qui sont les protéines A-Raf, B-Raf et C-Raf ou Raf1. La protéine Raf1 qui a été très

étudiée constitue le prototype de cette famille. La protéine Raf1 est exprimée de façon ubiquitaire

dans la plupart des tissus, tandis que les protéines A-Raf et B-Raf sont respectivement surexprimée

dans les tissus urogénitaux (exemple : les reins, ovaire, prostate) et dans le tissu neural, testiculaire,

splénique et hématopoiétique (Jaiswal et al., 1996).

Ces trois membres sont des protéines sérine/thréonine kinases possédant de très fortes

homologies de séquence localisées dans les trois régions dénommées CR (Conserved Region) qui

correspondent à des domaines fonctionnels de la protéine. La région N terminale CR1 contient une

structure dite en doigt de zinc. Cette région contient deux domaines de liaison à Ras: le domaine de

liaison à Ras (domaine RBD pour Ras binding domain) et le domaine CRD riche en cystéine. Le

domaine CR2 est riche en résidus sérine et thréonine dont la phosphorylation est nécessaire à

l'activation de Raf. Le domaine CR3 carboxy-terminal correspond au domaine kinase de Raf. Ce

domaine possède aussi plusieurs sites de phosphorylation contrôlant l’activité de Raf, notamment

les sites du segment d’activation (Avruch et al., 2001; Wellbrock et al., 2004) (figure 15).

42


Figure 15 : Structure des trois isoformes de Raf. La kinase Raf est exprimée chez l’homme sous trois isoformes A-Raf, B-Raf et C-Raf ou Raf1. Les kinases Raf possèdent trois régions conservées, les régions CR1, CR2 et CR3. La région CR1 contient le domaine liant Ras (RBD) et le domaine riche en cystéine (CRD). La phosphorylation du résidu S43 de Raf1 bloque la liaison de Raf1 à Ras. La région CR2 de Raf1 contient un des sites de liaison à la protéine chaperone 14-3-3, le résidu sérine 259. Les deux autres sites de laison à la protéine 14-3-3 sont les résidus S233 et S621. La région CR3 contient le domaine catalytique. La région se trouvrant en amont de la région CR3 contient le résidu Y341 qui est conservé chez A-Raf (Y302), mais chez B-Raf la tyrosine est remplacée par un acide aspartique (D448) et le résidu S338 qui est conservé dans toutes protéines Raf (S299 pour A-Raf et S445 pour B-Raf), mais le résidu S445 est constitutivement phosphorylé. Le domaine catalytique contient les deux sites de phosphorylation du segmant d’activation T491 et S494 qui sont conservés chez A-Raf et chez B-Raf. (D’après (Wellbrock et al., 2004)).

b. Activation de Raf1

La forme inactive de Raf1 est une forme auto-inhibée qui provient de l’association terminale

de la partie amino-terminale de Raf avec le domaine kinase carboxy-terminal. La structure de Raf1

est stabilisée par la protéine chaperone 14-3-3, liée à deux résidus sérine phosphorylés, sérine 259 et

sérine 621 (Tzivion et al., 1998). La sérine 259 est phosphorylée par PKA et par Akt, et la sérine

621 est phosphorylée par PKA. De plus, le résidu sérine 233 lorsqu’il y est phosphorylé devient

également un site de liaison à la protéine chaperone 14-3-3. Lorsque la protéine Ras est activée, elle

s’associe avec la région RBD de Raf1, ce qui relocalise la protéine Raf du cytosol vers la membrane

plasmique. L’implication de protéines phosphatases (PP) dans l’activation de Raf1 a été bien

établie. PP1 et PP2A régulent positivement l’activité de Raf en déphosphorylant le site de liaison de

la protéine chaperone 14-3-3 à Raf permettant alors l’interaction de Raf1 avec Ras et son

recrutement à la membrane (Abraham et al., 2000; Jaumot and Hancock, 2001; Rodriguez-Viciana

et al., 2006). Le résidu équivalent à la sérine 259 a été consevé chez A-Raf (sérine 214) et chez B-

Raf (sérine 364). Deux autres sites doivent être phosphorylés pour permettre l’activation de Raf1

43


(S338 et Y341). Le résidu S338 est phosphorylé par les kinases PAK1 et PAK2, activées par les

protéines Rho et Cdc42 et par la PI3K. Le résidu Y341 est phosphorylé par Src. Ces

phosphorylations sont nécessaires et agissent en synergie pour permettre l’activation complète de

Raf1. Elles joueraient un rôle dans le maintien de Raf1 à la membrane. Les résidus S338 et Y341

sont conservés chez A-Raf (résidus S299 et Y302) et semblent être nécessaires à son activation. Par

contre B-Raf possède un résidu chargé négativement, D448, qui mime la phosphorylation du résidu

Y341 chez Raf1. L’équivalent du résidu S338 de Raf1 est la S445 qui est constitutivement

phosphoryléé. Ces modifications expliquent pourquoi B-Raf est activé plus facilement que Raf1 ou

A-Raf. Enfin, l’activation de Raf1 se termine par la phosphorylation de la boucle d’activation de

son domaine kinase au niveau des résidus T491 et S494 du segment d’activation du domaine

kinase. La mutation de ces résidus bloque l’activation de Raf1. Les kinases qui permettent leur

phosphorylation n’ont pas été identifiées. Ces résidus sont conservés entre les trois isoformes de

Raf (résidus T452 et T455 pour A-Raf et T 491 et S601 pour B-Raf) et sont nécessaires pour

l’activité kinase de Raf.

Il existe des différences dans l’activation des isoformes de Raf. Ainsi, la protéine Raf-1 est

activée par les protéines H-Ras, K-Ras, et N-Ras (Hamilton and Wolfman, 1998). Cependant, la

protéine K-Ras est l’activateur le plus puissant de Raf1 (Voice et al., 1999). En revanche, la

protéine B-Raf est activée aussi bien par Ras que par Rap1.

c. Inhibition de Raf

L’arrêt d’activation de Raf-1 par détachement de Ras vient de sa phosphorylation sur le résidu

sérine 43 ce qui diminue l’affinité de Ras pour Raf-1 (Dumaz et al., 2002; Wu et al., 2005). Il a été

montré que les kinases ERK1/2 induisent une boucle de rétrocontrôle qui inhibe Raf par

phosphorylation du résidu sérine 43 ainsi que d’autres résidus.

d. Invalidation des isoformes de Raf chez les souris

L’invalidation de A-raf conduit, soit à une mortalité après la naissance à la suite de

malformations de l’appareil digestif, soit à des souris viables et fertiles avec cependant des

dysfonctionnements neuronaux. L’invalidation de A-raf ne provoque aucune modification au niveau

de la mort cellulaire ni chez l’embryon, ni chez l’adulte (Pritchard et al., 1996). L’invalidation de B-

raf ou raf-1 par contre provoque une létalité embryonnaire associée à une augmentation de la mort

cellulaire. Dans le cas de B-raf, l’arrêt du développement embryonnaire est du à la mort des cellules

endothéliales qui provoque une hémorragie massive (Wojnowski et al., 1997). Dans le cas de Raf-1,

44


les embryons meurent à la suite de défauts du développement des vaisseaux sanguins, du placenta,

du cerveau et du foie. Ces résultats montrent que B-Raf et Raf-1 jouent un rôle important dans la

survie des cellules embryonnaires durant le développement et dans la résistance cellulaire aux

stimuli apoptotiques. La différence dans les phénotypes associés aux invalidations de B-raf et raf-1

indique que ces deux gènes ont des fonctions spécifiques en fonction des lignées embryonnaires.

Raf1 régule la formation du cytosquelette en modulant l’état de polymérisation de la vimentine

(Janosch et al., 2000).

1.2.2. Les kinases MEK1/2

Les protéines kinases MEK1 (45 kDa) et MEK2 (47 kDa) présentent 80% d’homologie entre

elles et diffèrent au niveau de leur extrémité carboxy-terminale (Zheng and Guan, 1993). En plus de

leur domaine kinase, les protéines kinases MEK possèdent trois domaines importants: un domaine

de liaison aux MAPK (domaine D) qui contient des résidus basiques et hydrophobes qui

interagissent avec le domaine CD des MAPK, qui lui contient des résidus acides, un domaine

d’export nucléaire NES et un domaine riche en proline qui permet l’interaction avec des protéines à

domaine SH3 (Chen et al., 2001c). Les kinases MEK1/2 sont phosphorylées par la protéine Raf sur

deux résidus sérine (Jaumot and Hancock, 2001; Zheng and Guan, 1994). Les trois isoformes de

Raf n’activent pas les protéines kinases MEK avec la même efficacité. En effet, l’isoforme A-Raf

est celle qui active le moins efficacement les kinases MEK, elle active préférentiellement la kinase

MEK1 (Wu et al., 1996). L’isoforme B-Raf présente quant à elle la meilleure affinité de liaison à

MEK1/2 et présente la plus forte activité kinase envers les kinases MEK (Marais et al., 1997; Papin

et al., 1998; Pritchard et al., 1995). La kinase Raf-1, quant à elle, active aussi bien MEK1 que

MEK2. Les MEK1/2 contribuent de manière distincte à la régulation de l’activité ERK et à la

progression en phase G1/S du cycle cellulaire (Ussar and Voss, 2004). Les kinases MEK1 et MEK2

font partie de la rare famille de protéines kinases à double spécificité capables de phosphoryler

aussi bien les résidus sérines et thréonines que tyrosines.

L’invalidation de MEK2 chez la souris n’a pas d’effet sur le développement ni sur l’activation

des kinases ERK1/2, ce qui pourrait s’expliquer par un effet compensatoire de MEK1 (Belanger et

al., 2003). En revanche, l’invalidation de MEK1 provoque la mort embryonnaire (Giroux et al.,

1999).

45


1.2.3. Les kinases ERK1/2

Les protéines kinases ERK1/2 sont des sérine/thréonine kinases, et ont été les premiers

membres de la famille des MAPK à avoir été caractérisés. Les MAPK sont généralement exprimées

dans tous les types cellulaires, et régulent des réponses spécifiques qui diffèrent d’un type cellulaire

à un autre.

Les MAPK possèdent à leur extrémité carboxy-terminale un domaine CD (Common Doking) qui

permet d’interagir avec leurs substrats au niveau de sites de fixation formés par des résidus basiques

comme le domaine D de MEK. Les MAPK sont activées par la phosphorylation de leurs résidus

thréonine et sérine permettant une boucle d’activation par les protéines kinases MEK.

Tandis que l’invalidation du gène codant la protéine ERK2 provoque la létalité embryonnaire

précoce, l’invalidation du gène codant la protéine ERK1 n’a pas d’effet sur le développement

général de la souris ni sur la croissance cellulaire (Pages et al., 1999).

Une fois activées, les protéines kinases ERK1/2 vont phosphoryler et activer des substrats qui

peuvent se localiser dans différents compartiments sub-cellulaires.

Figure 16: Schéma de l’activation de la voie des MAPK.

1.2.4. Les substrats de ERK1/2

Une fois activées, les MAPK se détachent de MEK et vont phosphoryler de nombreux substrats

sur les résidus sérine/thréonine du motif Pro-X-Thr/Ser-Pro, dans différents compartiments sub-

cellulaires, comme par exemple la protéine calnexine du réticulum endoplasmique, la

46


phosphoplipase A2 cytosolique, la carbamyl phosphate synthetase mitochondriale, les protéines du

cytosquelette (neurofilaments et paxilline) ou encore des substrats nucléaires (Chen et al., 2001c;

Jaumot and Hancock, 2001). Le domaine permettant l’interaction des MAPK avec leurs substrats

est le domaine D, ainsi que la séquence FXFP (English et al., 1999).

a. Substrats nucléaires

Suite à l’activation des protéines kinases ERK1/2 ainsi que de leur migration nucléaire, ces

dernières peuvent alors phosphoryler plusieurs facteurs de transcription tels que Elk1, Myc, SAP1,

SAP2, MEF2, NF-AT, Paax 6, SRC-1. Les facteurs de transcription sont alors capables d’activer la

transcription de gènes tels que c-Fos, p21, la cycline D qui interviennent dans le contrôle de la

prolifération en permettant notamment la progression en phase G1 du cycle cellulaire (Chambard et

al., 2007; Janknecht et al., 1993; Treisman, 1996).

b. Substrats cytoplasmiques

Les MAPK permettent la phosphorylation et l’activation de protéines kinases cytoplasmiques,

appelées MAPK-activated protein kinases (MK). La famille des MK comprend les protéines RSK

(90-kDa ribosomal S6 kinases), les protéines MSK (mitogen- and stress-activated kinases), les

protéines MNK (MAPK interacting kinases), les protéines MK2 et 3 (MAPK-activated protein

kinases 2 et 3, aussi appelées MAPKAP-K2 et 3), et les protéines MK5 (MAPK-activated protein

kinase 5, appelée MAPKAP-K5).

Les protéines RSK, MSK, et MNK représentent toutes les trois des substrats de ERK1/2.

Tandis que les protéines MSK et MNK sont activées par les voies ERK1/2 et p38MAPK, les

membres de la famille RSK sont uniquement activés par les kinases ERK1/2 (Frodin and

Gammeltoft, 1999). Les protéines RSK ont un rôle dans la régulation transcriptionnelle, la

régulation du cycle cellulaire et la survie cellulaire. Immédiatement après leur activation et leur

translocation, les protéines RSK et les kinases ERK sont capables de phosphoryler des facteurs de

transcription contribuant alors à l’induction de gènes de réponse précoce (Thomson et al., 1999).

Les facteurs de transcription SRF (Serum Response Factor) CREB (cAMP response element-

binding protein) sont des substrats des protéines RSK qui participent à cette réponse précoce

(Bruning et al., 2000; Roux and Blenis, 2004; Sassone-Corsi et al., 1999; Xing et al., 1996). Les

protéines RSK sont également impliquées dans la survie cellulaire dépendante des MAPK en

inactivant la protéine pro-apoptotique Bad et en activant le facteur de transcription anti-apoptotique

CREB (Bonni et al., 1999). La protéine RSK 1 est aussi impliquée dans la survie cellulaire par

47


l’activation du facteur de transcription NF-kappaB (Ghoda et al., 1997). Les protéines MSK sont

localisées dans le noyau des cellules suggèrant qu’elles phosphorylent préférentiellement des

substrats nucléaires. En effet, elles régulent la transcription de divers gènes en phosphorylant des

facteurs de transcription et des protéines nucléaires. Les protéines MNK régulent notamment la

synthèse protéique en phosphorylant le complexe eIF4F (eukaryotic initiation factor 4 F) (Roux and

Blenis, 2004; Sonenberg and Dever, 2003) (figure 17).

Figure 17: Les substrats des MK. Sous activation, les protéines kinases RSK, MSK et MNK phosphorylent des substrats et régulent des processus biologiques comme la prolifération, la survie cellulaire. La liste des substrats indiquée n’est pas exhaustive. (Roux and Blenis, 2004)

1.2.5. Régulation de la voie des MAPK

L’intensité et la durée d’activation des MAPK jouent un rôle majeur dans sa réponse. La

différenciation des PC12 est l’exemple le plus utilisé pour illustrer la relation entre l’intensité de

stimulation des MAPK et la réponse biologique. Notamment, dans ce modèle cellulaire, la

stimulation transitoire des MAPK avec l’EGF permet la prolifération cellulaire alors que

l’activation soutenue des MAPK suite à la stimulation par le NGF entraîne la différenciation

cellulaire (Marshall, 1995). Ainsi, des protéines d’échafaudage, des régulateurs négatifs et positifs

et des phosphatases interviennent dans l’intensité, la durée et la localisation de la signalisation des

ERK.

48


a. Les protéines d’échafaudage

Ces protéines jouent un rôle important dans la transduction du signal (Kolch, 2005; Morrison

and Davis, 2003). Ces protéines vont servir de véritables plateformes d’ancrage facilitant

l’activation des MAPK. Les protéines qui contribuent à l’activation spatio-temporelle de ERK sont

KSR1 (Kinase Suppressor of Ras 1), MP-1 (MEK-partner 1), Sef et Paxilline (figures 18 et 19).

Figure 18: Activation de la voie des MAPK dans des compartiments cellulaires variés. (McKay and Morrison, 2007).

Les protéines KSR (KSR1 et KSR2) sont des protéines multi-domaine qui interagissent avec

Raf, MEK et ERK et facilite l’activation de ERK à la membrane plasmique. KSR1 est controlée par

des interactions protéiques et des évenements de phosphorylation/déphosphorylation. Dans les

cellules au repos, KSR1 est séquestrée dans le cytosol par la protéine 14-3-3, et est associée avec

IMP (Impedes Mitogenic signal propagation) qui est une E3-ubiquitine ligase et la phosphatase

PP2A. Lorsque le RTK est stimulé, Ras induit la phosphorylation de la sérine 392 en stimulant la

liaison de la sous-unité B de PP2A aux sous-unités A et C qui sont constitutivement associées à

KSR. KSR perd alors son affinité pour 14-3-3 et est transloquée à la membrane plasmique (Cacace

et al., 1999; Muller et al., 2001). KSR facilite la phosphorylation de MEK par l’intermédiaire de

Raf et augmente la production de ERK activée qui peut phosphoryler des substrats nucléaires et

cytoplasmiques.

La protéine MP1 est une petite protéine localisée dans les endosomes tardifs qui interagit avec

une protéine adaptatrice p14 fortement conservée qui réside sur la face cytoplasmique des

endosomes (Wunderlich et al., 2001). MP1 se fixe spécifiquement à MEK1 et ERK1, mais pas à

49


ERK2 et MEK2 ni à Raf (McKay and Morrison, 2007). L’extinction de p14 par transfection de

siRNA diminue fortement l’activation de la voie MAPK en réponse à l’EGF et empêche son

activation dans les endosomes (Teis et al., 2002). MP1 se lie à MORG-1 (MAPK Organizer), une

protéine composée de 7 domaines WD40. En plus de MP1, MORG1 s’associe in vitro aux kinases

MEK1/2, ERK1/2, B-Raf et Raf-1 et se comporte comme une protéine d’échafaudage (Vomastek et

al., 2004). La fonction de MORG1 semble être spécifique du stimulus, il affecte l’activation de

ERK par l’acide phosphatidique et les esters de phorbols mais pas par l’EGF ou le PDGF

(Vomastek et al., 2004).

Une autre protéine d’échafaudage, Sef est quant à elle présente dans l’appareil de Golgi (Torii

et al., 2004). Sef lie les protéines MEK activées et permet à MEK de phosphoryler et d’activer

ERK. Cependant, ERK activée reste associée à MEK sur Sef empêchant alors l’entrée de ERK dans

le noyau. ERK peut alors seulement phosphoryler leurs substrats cytoplasmiques.

La protéine paxilline qui est aussi une protéine d’échafaudage est un composant intégral des

points focaux d’adhésion (Ishibe et al., 2003). La paxilline interagit constitutivement avec MEK, et

en réponse à l’ HGF elle lie aussi Raf1 activée et ERK inactive (Ishibe et al., 2003). La liaison de

ERK inactive avec la paxilline est dépendante de Src. Une fois liée et activée, ERK phosphoryle la

paxilline ce qui permet la liaison de FAK (Focal Adhesion Kinase) à la paxilline et permet alors

l’activation de PI3K et de Rac (Ishibe et al., 2004; Kolch, 2005).

Figure 19 : Les protéines d’échafaudage impliquées dans la voie des MAPK. (Dhanasekaran et al., 2007).

50


b. Les régulateurs positifs et négatifs

Figure 20 : Liste des protéines d’échafaudage (à gauche) et des régulateurs négatifs et positifs (à droite) de la voie des MAPK (McKay and Morrison, 2007).

Deux protéines identifiées comme des régulateurs positifs des protéines kinases ERK1/2 sont

les protéines Sur8 (suppressor of ras) et CNK (connector enhancer of KSR). La protéine Sur-8

permet d’augmenter l’activation de Raf en améliorant l’interaction de Ras avec Raf (Li et al., 2000).

Cinq isoformes des protéines CNK (CNK1, CNK2A, CNK2B, CNK2C et CNK3) sont retrouvées

chez les mammifères. Ces protéines facilitent la cascade d’activation de ERK.

Des régulateurs négatifs ont également été identifiés: ce sont les protéines Erbin, Sprouty,

SPRED (Sprouty-related proteins with EVH1 domains) et RKIP (Raf kinase inhibitor protein).

La protéine Erbin interagit avec Ras et empêche donc la liaison de Raf à Ras activée (Dai et al.,

2006; Huang et al., 2003). Une autre classe de protéines inhibitrices contient les protéines Sprouty

et SPRED. Lors de l’activation du récepteur, la kinase Src phosphoryle une tyrosine dans la région

N-terminale de Sprouty (Li et al., 2004b). Cette tyrosine phosphorylée peut lier et séquestrer le

complexe Grb2/Sos empêchant ainsi l’activation de Ras (Hanafusa et al., 2002), ou peut aussi lier et

séquestrer l’ubiquitine ligase Cbl, empêchant alors l’ubiquitination du récepteur à l’EGF et sa

dégradation (Wong et al., 2002). Les protéines Sprouty peuvent également se lier directement à la

protéine Raf induisant ainsi sa séquestration et empêchant l’activation de la voie Ras/MAPK

(Sasaki et al., 2003). Le motif fixant la protéine Raf est conservé dans les quatre isoformes de

sprouty et dans les deux isoformes de SPRED (Sasaki et al., 2003).

La protéine RKIP interagit avec le domaine kinase des protéines MEK et Raf empêchant

l’interaction de Raf avec MEK (Yeung et al., 2000). La protéine RKIP se dissocie de Raf pendant la

51


stimulation mitogène afin de permettre l’activation de MEK (Yeung et al., 1999). Cette dissociation

est partiellement régulée par la phoshorylation de RKIP.

c. Les phosphatases

La régulation négative des MAPK peut se faire par l’intervention de phosphatases. Il existe

trois familles de phosphatases qui peuvent déphosphoryler les MAPK : les sérine/thréonine

phosphatases comme PP2A capables de déphosphoryler Raf et MEK, les phosphatases tyrosines

spécifiques comme PTP-SL, STEP ou HePTP et les phosphatases à double spécificité MKP (MAP

Kinases Phosphatases), puisqu'elles sont capables de déphosphoryler les résidus tyrosine et

thréonine (Kondoh and Nishida, 2007). La famille des MKP peut être divisée en trois groupes

(Farooq and Zhou, 2004; Kondoh and Nishida, 2007) : type I (MKP1, PAC1, MKP2,hVH3), type II

(MKP3, MKP-X, MKP 4, MKP5) et type III (MKP7,M3/6,VHR). Les MKP de type I sont

localisées dans le noyau, d’ailleurs ces MKP sont impliquées dans le rétrocontrôle négatif de la

signalisation MAPK (Farooq and Zhou, 2004; Kondoh and Nishida, 2007). La liaison de ERK1/2

au domaine MKB de MKP-3 augmente son activité phosphatase (Camps et al., 1998; Muda et al.,

1998). Alors que la déphosphorylation des MAPK semble être un moyen d’inactivation efficace, la

phosphorylation peut aussi être un moyen pour inactiver la voie MAPK. En effet, ERK1/2 vont

phosphoryler la protéine Sos et MEK1/2, ce qui provoque la dissociation des différents modules de

la cascade et par conséquent l’inactivation de la voie MAPK (Dong et al., 1996; Eblen et al., 2004).

II. Les protéines Gab et SHP2

Bien que la voie de signalisation Shc/Grb2 /Sos soit une voie bien acceptée pour son rôle

majeure dans l’activation de la voie Ras/MAPK, certains laboratoires dont le notre ont montré que

la protéine adaptatrice Gab1 et la protéine phosphatase SHP2 jouent un rôle clef dans l’activation de

la voie Ras/MAPK.

1. Les protéines Gab

1.1. Structure et expression des protéines Gab

Chez les mammifères, la famille des protéines Gab est composée des protéines Gab1, Gab2 et

Gab3, chez la drosophile de la protéine DOS (daughter of sevenless) et chez C. elegans de la

52


protéine Soc1 (suppressor of clear). Ce sont des protéines multi-adaptatrices car elles possèdent de

nombreux motifs permettant des interactions protéine-protéine.

Gab1 a été le premier membre des protéines Gab à avoir été identifié chez les mammifères

(Holgado-Madruga et al., 1996). Gab1 est une protéine qui est ubiquitaire puisqu’elle est retrouvée

dans le cerveau, le cœur, le foie, les poumons, le pancréas, le rein, l’utérus et dans les tissus

hématopoiétiques (Holgado-Madruga et al., 1997; Wolf et al., 2002). Elle est impliquée dans de

nombreuses réponses cellulaires telles que la prolifération, la migration, la morphogénèse, la

transformation et l’apoptose (Yart et al., 2003).

L’expression de Gab2 suit la même répartition que celle de Gab1. Toutefois, Gab2 est plus

fortement détectée dans des lignées de progéniteurs myélo-monocytaires (telles que les cellules

BAF3), mais elle est absente des progéniteurs des mégacaryocytes et des cellules érythroïdes

humaines et murines ainsi que des lymphocytes T (Bouscary et al., 2001; Gu et al., 1998; Wolf et

al., 2002). Elle est impliquée dans les réponses allergiques.

Gab3 est essentiellement détectée dans les tissus hématopoïétiques (notamment dans la rate et

le thymus) et dans de nombreuses lignées de cellules hématopoïétiques (Wolf et al., 2002). Cette

protéine est impliquée dans la différenciation des macrophages.

Les protéines Gab présentent une grande homologie de structure entres elles. Elles possèdent

un domaine PH à leur extrémité amino-terminal, un domaine central riche en proline (PRD : Proline

Rich Domain) et de multiples tyrosines, sérines ou thréonines phosphorylables (figure 21).

Y 324 CrkL

Y 409 CrkL/PLCγ

Y 48 Grb2

Y 242 CrkL Y 259 CrkL

Y 307 CrkL/PLCγ Y 317 CrkL/PLCγ

Y 373 CrkL/PLCγ Y 406 CrkL/PLCγ Y 447 PI3K Y 472 PI3K

Y 589 PI3K Y 627 SHP2 Y 659 SHP2

Domaine PH

Séquence (PPPRPPKP)

Séquence (PxxRxxKP)

MBS

MBD

Y 49 Grb2

Y 249 CrkL Y 266 CrkL

Y 452 PI3K Y 476 PI3K

Y 584 PI3K Y 614 SHP2 Y 643 SHP2

Site 14.3.3

Y 48 Grb2

Y 414 PI3K Y 393 PI3K

Y 506 PI3K Y 533 SHP2 Y 393 SHP2

Gab1 (694 aa) Gab3 (586 aa) Gab2 (676 aa)

Site 14.3.3

PRD

Figure 21: Structure schématique des protéines Gab1, Gab2 et Gab3 humaines et des résidus tyrosine impliquées dans une interaction protéique.

53


Le domaines PH est l’élément structural le plus conservé parmi les membres de la famille Gab. Le

domaine PH lie spécifiquement les PI(3,4,5)P3 produits par la PI3K. Le domaine PH est nécessaire

à la localisation membranaire des protéines Gab.

Le domaine PRD contient des séquences riches en proline impliquées dans des interactions

protéine-protéine :

- des séquences consensus (PXXP) de fixation au domaine SH3 carboxy-terminal de Grb2.

La séquence PPPRPPKP est nécessaire à l’interaction de Gab1 avec le domaine SH3 de Grb2 (Lock

et al.,2001). Elle permet aussi à Gab2 de se lier à Grb2. Cette séquence est d’ailleurs la seule qui

soit conservée au sein des protéines Gab2 et Gab3.

- Un motif atypique qui permet également l’interaction de Gab1 et de Gab2 avec le domaine

SH3 carboxy-terminal de Grb2. Ce motif permet également la fixation des protéines Gab au

domaine SH3 carboxy-terminal de l’adaptateur Mona/Gads, in vitro, mais seule Gab3 est capable

d’interagir avec Mona in vivo (Bourgin et al., 2002; Lewitzky et al., 2001; Lock et al., 2000).

Dans cette région, il existe également un domaine MBD (Met Binding Domain) responsable de la

liaison du récepteur Met phosphorylé à la protéine Gab1. La séquence d’acides aminés nécessaire

pour une interaction directe entre Gab1 et Met est appelée MBS (Met binding site). Le MBS

comprend 13 acides aminés. Les protéines Gab2 et Gab3 ne possèdent pas de MBS, et par

conséquent elles ne peuvent pas avoir de liaison directe avec le récepteur Met ou d’autres

récepteurs.

1.2. Phosphorylation des protéines Gab

Les protéines Gab possèdent de nombreux résidus tyrosine constituant des sites potentiels de

fixation pour les domaines SH2 de différentes molécules. Ainsi, les protéines Gab1 et Gab2

possèdent plusieurs sites de fixation pour les domaines SH2 appartenant aux protéines CrkL et

PLCγ (Sakkab et al., 2000) tandis que Gab3 en est dépourvue (Wolf et al., 2002). Les protéines

Gab1, Gab2 et Gab3 possèdent trois motifs conservés susceptibles d’interagir avec les domaines

SH2 de la sous-unité p85 de la PI3K, ainsi que deux sites d’interaction avec la tyrosine phosphatase

SHP2 (mais seul le site Y627 semble être requis in vivo). Un site de liaison au domaine SH2 de

Grb2 a été également identifiée dans le domaine PH mais sa signification fonctionnelle n’est pas

connue.

La phosphorylation de Gab1 est induite par les protéines kinases Src dans les cellules MDCK

(Shinohara et al., 2001), en réponse à l’HGF. Les protéines Src s’associent constitutivement à Gab2

dans les hépatocytes de rat, et le phosphorylent après une courte stimulation par l’EGF (Kong et al.,

2003). La phosphorylation des tyrosines des protéines Gab peut donc être induite par les kinases

54


Src. Une fois phosphorylées sur des résidus tyrosines, les protéines Gab peuvent devenir le substrat

des protéines kinases, Akt ou ERK, qu’elles ont participé à activer, et être phosphorylées à nouveau

sur des sérine et thréonine. Ce deuxième type de phosphorylation semble impliquer les protéines

Gab dans une boucle de rétrocontrôle qui peut être soit négative soit positive (Roshan et al., 1999).

1.3. Recrutement des protéines Gab

Le seul mécanisme de recrutement direct d’une protéine Gab par un récepteur est celui décrit

pour Gab1 et le récepteur Met (récepteur de l’Hepatocyte Growth Factor) dans les cellules

épithéliales MDCK, en réponse à l’HGF. La protéine Gab1 possède un domaine MBD, qui est

impliqué dans la liaison directe de Gab1 sur la tyrosine 1349 phosphorylée du récepteur Met

(Maroun et al., 1999b; Maroun et al., 2000; Weidner et al., 1996). La protéine Gab1 peut aussi se

fixer indirectement à Met par l’intermédiaire de la protéine adaptatrice Grb2. Cette interaction

implique la fixation du domaine SH2 de Grb2 à la tyrosine 1356 phosphorylée de Met, ainsi que

l’interaction de ses domaines SH3 avec les séquences riches en prolines de Gab1 (Maroun et al.,

1999a; Maroun et al., 1999b). Ce mécanisme est celui qui est le plus classiquement décrit pour le

recrutement indirect des protéines Gab en réponse à divers stimuli. Ainsi, les protéines Gab1 et

Gab2 sont recrutées par le récepteur de l’EGF activé via la protéine adaptatrice Grb2. L’association

entre le récepteur de l’EGF et Gab1 est abolie par la seule mutation de Gab1 ou du récepteur de

l’EGF, au site de leur interaction avec Grb2 (Holgado-Madruga et al., 1996; Rodrigues et al., 2000).

La protéine Gab1 ainsi que Gab2 peuvent être recrutées auprès de leur récepteur après activation

des récepteurs (Ingham et al., 2001; Lehr et al., 2000; Nishida et al., 1999). Ce mécanisme implique

le domaine PH des protéines Gab, qui lie spécifiquement les PI(3,4,5)P3 produits par la PI3K et

entraîne leur recrutement au voisinage de la membrane plasmique. Cette translocation permet aux

protéines Gab d’être localisées à proximité des récepteurs ou des kinases susceptibles de les

phosphoryler. Le rôle du domaine PH dans le recrutement de Gab1 est mieux compris pour la

signalisation du récepteur de l’EGF (Gu and Neel, 2003).

1.4. Rôles fonctionnels des protéines Gab : études des KO

Les souris KO gab1 -/- meurent in utero, du à des anomalies du cœur, du placenta, et à un

mauvais développement de la peau et des muscles (Yart et al., 2003). La protéine Gab1 joue donc

un rôle critique durant l’embryogénèse. Les souris KO gab2-/- et gab3-/- sont viables, fertiles et

apparemment normales. Les études conduites sur les lignées myélo-monocytaires suggèrent un rôle

important de Gab2 au cours du développement macrophagique. L’invalidation de gab3 n’entraine

55


pas d’altérations du développement, de l’hématopoïèse ou des fonctions du système immunitaire

des souris. En outre, le défaut d’expression de gab3 au cours de la différenciation macrophagique

n’est pas compensé par une augmentation des transcrits de gab1 et gab2. Les protéines Gab2 et

Gab3 ont une structure relativement conservée, et présentent une répartition tissulaire comparable,

de ce fait, elles sont vraisemblablement impliquées dans la régulation des mêmes voies de

signalisation. Bien que les deux protéines puissent avoir des rôles différents, il y a une redondance

de leurs fonctions, notamment dans l’activation des voies des MAPK et de la PI3K, qui pourrait

permettre un développement normal des souris gab2-/- et gab3-/-.

2. La protéine phosphatase SHP2

La protéine SHP2 (SH2 containing tyrosine phosphatase) est une protéine phosphatase (PTP)

cytosolique contenant des domaines SH2, aussi connue sous le nom de PTP1D, SHPTP-2, SHPTP-

3, PTP2C ou Syp. Cette protéine est exprimée dans différents tissus et types cellulaires. Elle

possède la même structure et une forte homologie avec la protéine phosphatase SHP1 qui est

majoritairement exprimée dans les cellules hématopoïétiques (Qu, 2002). Les invertébrés tels que la

drosophile et C. elegans possèdent chacun un homologue de SHP2 qui est respectivement

Corkscrew (Csw) et Ptp-2.

Chez l’homme, SHP2 est codée par le gène PTPN11. SHP2 contient deux domaines SH2 à

l’extrémité N terminale, un domaine catalytique (PTP) portant l’activité phosphotyrosine

phosphatase et une extrémité C terminale avec des sites de phosphorylation sur tyrosine et un motif

riche en proline (figure 22).

Figure 22: Représentation schématique de la protéine phosphatase SHP2. (Hanna et al., 2006)

Le domaine SH2 permet la liaison de SHP2 sur des résidus tyrosine d’autres protéines. Une

activité PTP apparaît être nécessaire pour toutes les fonctions biologiques de SHP2 (Keilhack et al.,

2005). La protéine SHP2 est un partenaire de la protéine adaptatrice Gab1 dans de nombreux types

cellulaires et est responsable de l’activation de différentes voies de signalisation (Kapoor et al.,

2004). La protéine SHP2 a été impliquée dans diverses voies de signalisation dont celles initiées par

des facteurs de croissance comme le PDGF, l’EGF et l’IGF-1, ainsi que par des cytokines comme

l’IL-3, le GM-CSF et l’EPO ou par des hormones, et joue un rôle important dans la régulation de la

prolifération cellulaire, la différenciation et la migration.

56


Les souris KO shp2 -/- meurent in utero, dû à la présence de défauts du développement (Saxton

et al., 1997). De plus, la protéine SHP2 a une fonction positive dans l’hématopoïèse et dans le

développement de la souris dépendant de l’EGFR (Qu et al., 1998). L’inactivation du gène PTPN11

provoque des défauts du développement importants comparable aux conséquences de la perte de

fonction des protéines RTK (Dance et al., 2007; Edouard et al., 2007). De plus, des mutations de

PTPN11 sont impliquées dans des désordres génétiques à savoir le syndrome de Noonan et le

syndrome de Léopard et ces mutations sont également responsables de la formation de cancer

(essentiellement les leucémies).

3. Gab1, SHP2 et la voie des MAPK

La protéine SHP2 joue un rôle important dans l’activation des MAPK en réponse à divers

facteurs de croissance, à des hormones ou à des cytokines. Après phosphorylation de certaines de

leurs tyrosines, les protéines Gab1 peuvent également interagir avec un domaine SH2 de la tyrosine

phosphatase SHP2. La fonction des complexes Gab1-SHP2 a été particulièrement bien étudiée,

notamment grâce à l’utilisation de mutants Gab1 incapables d’interagir avec SHP2 (Gab1ΔSHP2).

La présence de ce mutant dans les cellules MDCK empêche la formation de structures épithéliales

différenciées normalement induite par Met et inhibe l’activation des MAPK en réponse à l’EGF

(Cunnick et al., 2000; Cunnick et al., 2001; Kapoor et al., 2004). La formation des complexes

Gab1-SHP2 est corrélée avec l’activation de la voie MAPK et la mise en place d’un processus de

différenciation cellulaire. En fait, la liaison de Gab1 avec la phosphatase SHP2 permet le maintien

de SHP2 dans une conformation compatible avec son activité catalytique (Huang et al., 2002). Des

études ont montré que l’association entre Gab1 et SHP2 active non seulement la protéine SHP2

mais permet aussi à SHP2 d’accéder à ses substrats.

Le rôle de SHP2 dans l’activation de MAPK a été très clairement décrit en réponse à l’EGF.

Différentes études ont montré que SHP2 est nécessaire à l’activation des MAPK et à la progression

du cycle cellulaire (Bennett et al., 1996). Ces études ont également montré que l’activité catalytique

et les domaines SH2 de la phosphatase SHP2 sont nécessaires pour une activation des MAPK

induite par l’EGF plus probablement en amont de Ras (Cai et al., 2002; Cunnick et al., 2000; Yart

et al., 2001). En effet, il a été montré que SHP2 peut intervenir dans l’activation de la voie

Ras/MAPK en fonctionnant comme protéine adaptatrice, en participant au recrutement de Grb2/Sos

à la membrane plasmique (Bennett et al., 1994). Cependant, l’utilisation de mutants catalytiquement

inactifs de la phosphatase suggère que l’activité catalytique de SHP2 est nécessaire pour permettre

57


l’activation de Ras/MAPK (Cunnick et al., 2000; Deb et al., 1998; Maroun et al., 2000; Noguchi et

al., 1994; Yart et al., 2001).

De plus, des substrats de SHP2 pourraient faciliter l’activation de Ras/MAPK. Chez l’homme, un

des premiers substrats de SHP2 à avoir été identifié a été SHPS-1 (Shp Substrate-1) ou SIRPa1

(Signal Inhibitor Receptor Protein a1). La protéine SHPS-1/SIRPa1 est une glycoprotéine

transmembranaire dépourvue d’activité enzymatique. Le domaine intracellulaire de SHPS-1

comportant quatre tyrosines est phosphorylé en réponse à différents agonistes induisant alors une

interaction avec SHP2 (Fujioka et al., 1996). Cette interaction permet de lever l’inhibition

allostérique de la phosphatase qui alors déphosphoryle les résidus tyrosines de SHPS-1 et s’en

dissocie. La protéine SHPS-1 agit directement sur la kinase Src qui est impliquée dans l’activation

des MAPK. La protéine SHP2 peut également déphosphoryler les protéines Sprouty (Spry) qui

régulent négativement l’activité des MAPK. Chez les mammifères, quatre isoformes de la protéine

Sprouty ont été identifiées. Deux modèles d’intervention des protéines Spry dans la régulation de la

voie Ras/MAPK peuvent être proposés. Tout d’abord, il a été démontré qu’en réponse au FGF, la

protéine Spry devient phosphorylée et peut lier Grb2. Ainsi, la protéine Spry piége Grb2 ce qui

conduit à une séquestration du complexe Grb2/SOS inhibant alors l’activation de la voie

Ras/MAPK. Ensuite, en réponse au VEGF, Spry4 inhibe l’activation des MAPK indépendante de la

protéine Ras en liant Raf1 empêchant alors l’activation de Raf1 par la voie de la PLCγ/PKC (Sasaki

et al., 2003). Récemment, Hanafusa et al. ont démontré que la protéine SHP2 peut directement

déphosphoryler Spry en réponse au FGF, permettant ainsi la dissociation de Grb2/Sos, aboutissant à

l’activation des MAPK (Hanafusa et al., 2004). Il a été également montré que SHP2 déphosphoryle

les sites de liaison de RasGAP sur Gab1, ce qui provoque la libération de Ras-GAP aboutissant

alors à l’activation de la voie Ras/MAPK (Montagner et al., 2005). Des membres de la famille des

protéines kinases Src ont été montrés comme étant des régulateurs positifs dans l’activation de la

voie Ras/MAPK. Ren et al ont montré qu’il existe une interaction entre Gab1 et la paxilline. Quand

la paxilline est phosphorylée sur des résidus tyrosines, elle est associée à Csk et à Src. En réponse à

l’EGF, le recrutement de SHP2 auprès de Gab1 aboutit à la déphosphorylation de la paxilline

impliquée dans l’interaction avec Csk qui est l’inhibiteur de Src, induisant ainsi sa dissociation du

complexe. La kinase Src est alors phosphorylée ce qui permet l’activation de la voie des MAPK

(Ren et al., 2004).

En conclusion, la tyrosine phosphatase SHP2 joue un rôle important dans l’activation de la voie

Ras/MAPK en réponse à de nombreux agonistes. De plus, différents mécanismes ont été proposés

pour rendre compte de la fonction positive de SHP2 dans l’activation de la voie Ras/MAPK.

58


III. La voie PI3K

1. Présentation de la famille des PI3K

Les PI3K sont des enzymes à activité lipide kinase qui sont capables de phosphoryler les

phosphoinositides en position 3 du noyau inositol pour produire des D3 phosphoinositides qui sont

considérés comme des seconds messagers. Cette réaction mène à l’activation de plusieurs voies de

signalisation intracellulaire qui régulent les fonctions comme le métabolisme cellulaire, la survie

cellulaire, la croissance cellulaire, la prolifération, le trafic vésiculaire (Engelman et al., 2006). En

plus d’une activité lipide kinase, les PI3K possèdent une activité sérine/thréonine kinase (Carpenter

et al., 1993). La famille des PI3K est composée de trois classes (classe I, classe II et classe III) qui

diffèrent dans leur structure, dans leur distribution dans les tissus, dans le mécanisme d’activation et

dans leur fonction (Cantley, 2002; Deane and Fruman, 2004; Vanhaesebroeck and Waterfield,

1999; Wymann et al., 2003). Les PI3K se présentent généralement sous forme d’hétérodimères

constitués d’une sous-unité catalytique et d’une sous-unité régulatrice (figure 23).

Les PI3K de classe I sont divisées en deux sous-familles dépendantes des récepteurs auxquels

ils se couplent. Les PI3K de classe IA sont activées par les RTK tandis que les PI3K de classe IB

sont activées par les RCPG (Katso et al., 2001). Les sous-unités catalytiques des PI3K de classe I

(p110α, β, δ et γ) contiennent un domaine liant p85, un domaine liant Ras (RBD), un domaine C2,

un domaine PIK (phosphatidylinositol kinase homology) et un domaine catalytique. Trois gènes

PIK3R1, PIK3R2 et PIK3R3 codent les cinq sous-unités régulatrices de la classe IA : p85α, p55α,

p50α, p85β, p55γ. Les sous-unités régulatrices ont une structure commune consistant en un

domaine liant p110 flanqué de deux domaines SH2, les deux isoformes p85α et p85β ont en plus un

domaine SH3 en N terminal et un domaine BCR (Breakpoint cluster region) flanqué de deux

régions riches en proline (Fruman et al., 1998). Ces sous-unités régulatrices peuvent lier par leurs

domaines SH2 des tyrosines phosphorylées incluses dans les motifs YXXM des RTK activés ou

d’une protéine adaptatrice (comme Gab1) (McGlade et al., 1992). La sous-unité p110β est régulée

non seulement par la sous-unité régulatrice p85 mais aussi par la liaison aux sous-unités Gβγ des

protéines G hétérotrimériques (Engelman et al., 2006). La seule sous-unité catalytique de la classe

IB est p110γ, qui s’associe aux sous-unités régulatrices p101 ou p84 (aussi connue comme

p87PIKAP). Les PI3K de classe IB semblent être activées par les RCPG par l’interaction directe avec

la sous-unité Gβγ. Toutes les isoformes de la classe I de PI3K possèdent une activité protéine kinase

intrinsèque. Les isoformes p110 α et β sont exprimées de façon ubiquitaire tandis que les isoformes

δ et γ sont surtout exprimées dans les leucocytes. Les PI3K de la classe I régulent la croissance

59


et/ou le métabolisme (Engelman et al., 2006). Le substrat préférentiel in vivo des PI3K de classe I

est le PI4,5P2.

Figure 23: Les différentes classes de PI3K. Trois classes de PI3K ont été identifiées chez les mammifères. La classe I est constituée des enzymes hétérodimériques (une sous-unité régulatrice et une sous-unité catalytique), les classes II et III regroupent des enzymes monomériques. Dans la sous-unité p110, on distingue le domaine liant p85 (p85 binding domain), le domaine de liaison avec la protéine Ras (Ras binding domain), un domaine C2, un domaine PIK (phosphatidylinositol kinase homology) et un domaine catalytique. Dans la sous-unité régulatrice, on trouve un domaine SH3, deux domaines riches en proline séparés par le motif homologue au domaine catalytique de RhoGAP (BCR) et enfin deux domaines SH2, séparés par le domaine d’interaction entre sous-unité (p110 binding domain). La sous-unité catalytique p101 ne présente aucune homologie avec d’autres protéines et sa région d’interaction avec la sous-unité p110γ n’est pas encore identifiée. Les domaines PX et C2 se retrouvent chez les membres de la classe II. La classe III est homologue de la PI3K de la levure, Vps34. (Hawkins et al., 2006).

Les enzymes de classe II sont composées des sous-unités PI3K-C2α, β et γ. Ils n’ont pas de

site liant une protéine adaptatrice mais possèdent des domaines PX et C2 qui pourraient permettre la

liaison de D3 phosphoinositides et d’autres lipides membranaires. Bien que leurs sous-unités

60


régulatrices n’aient pas été identifiées, les enzymes de classe II sont régulées par des récepteurs

tyrosine kinases et des récepteurs couplés aux protéines G. Les substrats préférentiels des PI3K de

classe II in vitro sont le PI4,5P2, le PI4P et le PI. Cependant, les PI3K de classe II représentent une

voie alternative dans la formation de PI3P dans certains contextes d’activation de récepteurs et/ou

d’endocytose (Katso et al., 2006; Wheeler and Domin, 2006). Les PI3K de classe II régulent donc

le trafic membranaire et l’internalisation des récepteurs (Gaidarov et al., 2001).

Les PI3K de classe III comprennent la sous-unité hVps34p (vacuolar protein-sorting

defective 34) et une sous-unité régulatrice p150. In vitro, le PI est le seul substrat de ces enzymes,

permettant alors la production de PI3P. Les PI3K de classe III régulent le trafic vésiculaire

(Engelman et al., 2006).

Les PI3K pourraient de plus avoir une fonction de protéine adaptatrice, ainsi la PI3Kγ pourrait

lier l’AMPc phosphodiestérase indépendemment de son activité lipide kinase, probablement via p84

(Patrucco et al., 2004).

2. Fonctions biologiques des différentes isoformes des PI3K

Les différentes isoformes des PI3K jouent un rôle important dans l’immunité, dans le

métabolisme et dans la fonction cardiaque.

L’inactivation génétique de p110α et de p110β provoque la mort embryonnaire tandis que

les souris KO pour les isoformes p110δ et p110γ sont viables et fertiles mais montrent des

déficiences dans les réponses immunes et inflammatoires (Foukas and Okkenhaug, 2003).

L’isoforme p110γ est impliquée dans le développement des cellules T. L’isoforme p110 β a un rôle

dans la prolifération cellulaire et dans la croissance cellulaire invasive (Czauderna et al., 2003). Les

souris KO hétérozygotes pour les sous-unités régulatrices de la classe I A présentent une sensibilité

augmentée à l’insuline et une tolérance au glucose améliorée. Par contre, les souris KO

homozygotes meurent après la naissance. Les souris KO pour p85β sont viables et aucun phénotype

n’a été rapporté (Fruman et al., 1999). PI3Kα joue un rôle dans la croissance et la régulation du

métabolisme. PI3Kβ quant à elle intervient dans la thrombose. PI3Kδ et PI3Kγ interviennent dans

l’inflammation et l’asthme (Hawkins et al., 2006).

De plus, une réduction de l’expression de toutes les isoformes de p110 a été observée dans

les souris KO p85α (Fruman et al., 2000). L’isoforme p110δ permet l’activation de Akt et contribue

alors à la prolifération cellulaire dans les leucémies myéloides (Sujobert et al., 2005). L’isoforme

p110 γ n’a pas été impliquée dans la croissance cellulaire et dans la tumorigénèse. Des souris KO

61


pour la sous-unité p85α ont montré des fonctions essentielles de la sous-unité p85α dans les

cellules B et les mastocytes. Cependant, le développement des cellules T n’est pas affecté chez les

souris KO pour les sous-unités régulatrices p85α, p85α/p55α/p50α ou p85β (Deane A.J. et al.

2007).

PI3K subunits Knockout model

p85β, p55γ Embryonic death

p85α/p55α/p50α (panp85α) pan-p85-/-: perinatal lethality

p85α pan-p85α +/-; p85-/-; p50α/p55α -/-: viable

p55α/p50α

Complex phenotypes in insulin-dependent metabolic regulation and immune cell function. Characteristic and paradoxical increase in insulin-stimulated PI3K signalling: possible confounding effects on expression of other regulatory and catalytic Class I PI3K subunits and/or non-PI3K catalytic functions

p85β increased insulin sensitivity

p101, p84 Viable, immunological defects

p110α Embryonic lethality

p110β Embryonic lethality

p110δ Viable, phenotype in haemopoitic lineage (e.g lymphocytes, leucocytes)

p110γ Viable, phenotype in myeloid lineage (e.g leucocytes) and heart

Tableau 6 : Conséquences biologiques de l’invalidation de gènes codant pour les sous-unités des PI3K (D’après (Hawkins et al., 2006).

3. Mécanisme d’activation des PI3K de classe I

Des progrès ont été faits dans la compréhension des mécanismes moléculaires permettant

l’activation des PI3K de classe IA en aval de récepteurs à activité tyrosine kinase (Cantley, 2002;

Wymann and Pirola, 1998).

Les sous-unités régulatrices p85, p50/p55 jouent un rôle important dans l’activation des PI3K de

classe Ia par des RTK. Lors de la stimulation des récepteurs, la sous-unité régulatrice va être

recrutée par ses domaines SH2 aux tyrosines phosphorylées incluses dans les motifs YXXM qui se

trouvent soit sur le récepteur ou soit sur une protéine adaptatrice. La sous- unité régulatrice se lie

soit directement au récepteur comme c’est le cas pour le récepteur au PDGF ou à une protéine

62


adaptatrice comme Gab1 qui est liée au récepteur de l’EGF (Hawkins et al., 2006). Les PI3K

peuvent aussi être activées grâce à la liaison directe de Ras par l’intermédiaire d’un domaine RBD à

la sous-unité catalytique p110 (Rodriguez-Viciana et al., 1994; Rodriguez-Viciana et al., 1996).

L’activation de Ras est un élément clef de la signalisation en aval de différents récepteurs qui

se déroule souvent en parallèle avec l’activation des PI3K de classe I et est le plus souvent associée

à l’activation de ERK (Downward, 2003). Seules les PI3Kα et PI3Kδ sont activées par Ras

(Rodriguez-Viciana et al., 2004). Ainsi, la PI3Kβ est régulée différemment par rapport aux autres

isoformes de la classe IA, en effet, elle peut être activée par les protéines Gβγ en synergie avec p85

(Kurosu et al., 1997; Shin et al., 2005). Des délétions de combinaisons variées de gènes codant les

sous-unités p85/p50-p55 dans les souris provoquent une augmentation de sensibilité des voies

dépendantes de PI3K en aval des récepteurs de l’insuline (Foukas et al., 2006; Sleeman et al., 2005;

Taniguchi et al., 2006; Vanhaesebroeck et al., 2005).

4. Les 3- phosphoinosides

Le phosphatidylinositol (PI), le précurseur de tous les phosphoinositides, constitue moins de

10% des lipides totaux des membranes cellulaires des eucaryotes (Figure 24). Un peu près 5% de PI

cellulaires sont phosphorylés en position 4 (PI4P), et 5% sont phosphorylés en position 4 et 5

(PI4,5P2). Cependant, moins de 0,25% des lipides totaux sont phosphorylés en position 3 formant

des 3-phosphoinositides. Ces phosphoinositides exercent des fonctions régulatrices à l’intérieur de

la cellule (Rameh and Cantley, 1999).

Figure 24 : Les voies de synthèse des PI. Les classes d’enzymes PI3K qui catalysent la phosphorylation de différents substrats de PI3K. Kin: kinases; Pase : phosphatases. (Rameh and Cantley, 1999)

63


4.1 Phosphatidylinositol 3-phosphate (PI3P)

Le PI3P est présent dans toutes les cellules de mammifères et de levure. Il peut être produit in

vitro par phosphorylation des PI par la PI3K de classe I, II ou III (Rameh and Cantley, 1999).

Cependant, la majorité des PI3P dans les cellules de mammifères est probablement produit par les

PI3K de classe III (Vanhaesebroeck et al., 1997). C’est le plus abondant des 3-phosphoinositides et

son taux est relativement constant. Le PI3P est fortement enrichi dans les membranes des

endosomes et des vesicules intraluménales et dans les corps multivisiculaires (MVB). Les PI3K de

classe III sont fortement apparentées au produit du gène Vps34 de la levure, et l’enzyme de la

levure, est spécifique des PI et ne phosphorylerait pas PI4P ou PI4,5P2. Le premier domaine liant

les protéines au PI3P est le domaine FYVE, qui est conservé de la levure à l’humain. En liant le

PI3P par leurs domaines FYVE, ces protéines sont recrutées à la membrane endosomale. Le PI3P

est impliqué dans le trafic vésiculaire. Le PI3P joue également un rôle important dans l’autophagie

(Sasaki et al., 2007). Simonsen et al ont montré que le PI3P régule la formation de la membrane

d’isolement autophagique par le recrutement de Alfy (autophagy-linked FYVE protein)(Simonsen

et al., 2004).

4.2 Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate (PI3,5P2)

Les voies principales de la synthèse de PI3,5P2 sont les phosphorylations successives de PIP

par une PI3K puis de PI3P par une PI5K (Whiteford et al., 1997). Le PI3,5P2 peut aussi être produit

par la phosphorylation de PI5P par les PI3K de classe IA (Rameh et al., 1997). Les protéines

contenant un domaine PH sont des cibles pour le P3,5P2. Le PI3,5 P2 peut être impliqué dans le

trafic vésiculaire (Yamamoto et al., 1995).

4.3 Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP3)

La majorité du PIP3 synthétisé en réponse à des signaux extracellulaires est produit par la

phosphorylation de PI4,5P2 (Hawkins et al., 1992). Les PI3K de classe I sont les seules enzymes

qui synthétisent le PIP3. Les PI5K α et β utilisent le PI3P comme substrat pour produire du PIP3 en

phosphorylant en position 4 et 5 le PI3P (Tolias et al., 1998; Zhang et al., 1997). En plus de Akt,

PDK1 et PKCε et d’autres cibles de PIP3 ont été décrites. Beaucoup de ces protéines ont des

domaines PH qui permettent la liaison au PIP3 (Hemmings, 1997). Les domaines SH2 de Src et de

p85 peuvent lier PIP3 en compétition avec des protéines contenant des phosphotyrosines (Rameh et

64


al., 1995). Le PIP3 lie les domaines SH2 de PLCγ et augmente leur activité phospholipase envers le

PI4,5P2 in vitro (Rameh et al., 1998).

4.4 Phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate (PI3,4P2)

Les taux de PI3,4P2 peuvent être régulés par des signaux extracellulaires comme le PDGF

(Auger et al., 1989). La production de PI3,4P2 se fait par la déphosphorylation de PI3,4,5P3 ou par

la phosphorylation de PI3P ou de PI4P. Les PI3K de classe II peuvent phosphoryler le PI4P pour

produire du PI3,4P2 indépendamment de la synthèse du PI3,4,5P3. Akt est la cible la mieux

caractérisée de PI3,4P2. Le domaine PH de Akt lie les phosphoinositides in vitro et

préférentiellement le PI3,4P2.

5. La sérine/thréonine kinase Akt

Un nombre de domaines liant les phosphoinositides ont été identifiés et caractérisés comme le

domaine FYVE, le domaine PH ou le domaine PX (Hurley and Meyer, 2001; Katso et al., 2001;

Vanhaesebroeck et al., 2001). Ces domaines sont retrouvés sur des protéines qui sont recrutées au

niveau de régions spécifiques des cellules par l’interaction avec les phosphoinositides. La liaison

des phosphoinositides à ces domaines est généralement de faible affinité et rapidement réversible.

Les protéines qui peuvent lier ces phosphoinositides sont des sérine/thréonine kinases (exemple,

Akt), des tyrosine kinases (exemple, Btk), des phospholipases (exemple, la PLCγ), des protéines

adaptatrices comme Gab1, des GEF (exemple, Tiam, cytohesin, Vav) et des GAP (exemple ARAP)

(Rameh and Cantley, 1999) (figure 25). L’effecteur le mieux caractérisé de la PI3K est la

sérine/thréonine kinase PKB/Akt, qui joue un rôle dans les voies de transduction du signal activées

par une grande diversité de stimuli extracellulaires et contribue alors à des fonctions cellulaires

incluant la croissance cellulaire, le métabolisme, la régulation transcriptionnelle (Brazil and

Hemmings, 2001).

65


Figure 25: Les différents effecteurs des PI3K de classe I. Les PI3K activées produisent du PI3,4,5P2 et du PI3,4P2 sur le feuillet interne de la membrane cellulaire (ici seul le PI3,4,5P3 est représenté). Suite à la formation de ces 3-phosphoinositides, de nombreuses protéines possédant un domaine PH vont être recrutées à la membrane plasmique et être alors activées. Cette activation va permettre de mettre en place des réponses cellulaires diverses telles que la survie cellulaire, la croissance, la transcription de gènes (Hawkins et al., 2006).

5.1. Structure et expression de Akt

Akt est une Sérine/Thréonine kinase de 57 kDa, elle est l’homologue de l’oncoprotéine v-Akt.

Akt est aussi appelée PKB (Protein kinase B) ou RAC (related to protein kinase A and C). Chez les

mammifères, la famille des kinases Akt comptent trois membres Akt1(PKBα), Akt2(PKBβ) et

Akt3(PKBγ). Akt2 et Akt3 ont 81 et 83% d’homologie en séquence d’acides aminés avec Akt1,

respectivement (Vanhaesebroeck and Alessi, 2000). Chacune des isoformes de Akt consiste en trois

domaines fonctionnels : un domaine PH liant des phosphoinositides, un domaine kinase central où

se trouve Thr308 dans Akt1 (Thr309 dans Akt3), et un domaine régulateur où se trouve Ser473 dans

Akt1 (Ser474 dans Akt2, Ser472 dans Akt3) (figure 26). Les trois isoformes de Akt ont une forte

homologie avec les PKA, PKC dans leur domaine kinase (Manning and Cantley, 2007).

66


Figure 26: Structure des trois isoformes humaines de Akt/PKB. (Osaki et al., 2004)

Les trois gènes codant les protéines Akt de mammifères sont exprimés dans divers tissus. Ainsi,

Akt1 est plus abondant dans le cerveau, le cœur et le poumon tandis que Akt2 est plus exprimée

dans le muscle squelettique et Akt3 plus exprimée dans le cerveau, les reins (Altomare et al., 1995;

Altomare et al., 1998; Brodbeck et al., 1999).

5.2. Mécanisme d’activation de Akt

Akt est activée par un double mécanisme : la translocation à la membrane plasmique et la

phosphorylation de deux résidus Thr308 et Ser473 (Andjelkovic et al., 1997; Bellacosa et al., 1998).

Après la production de PI3,4P2 et de PI3,4,5P3 par PI3K, Akt est recrutée à la membrane

plasmique et lient ces phosphoinositides par son domaine PH. L’interaction du domaine PH de Akt

avec les phosphoinositides provoquent des changements conformationnels de Akt, ce qui permet à

Akt d’être phosphorylée sur deux sites bien spécifiques: Thréonine 308 et Sérine 473 (Alessi et al.,

1996; Osaki et al., 2004). Tout d’abord, une sérine/thréonine kinase, la PDK1 (phosphoinositide-

dependent kinase 1) de 63 kDa qui a un domaine PH va phosphoryler Akt sur le résidu Thr 308

(Mora et al., 2004; Stephens et al., 1998).

PDK1 est constitutivement active et son activité est indépendante de la liaison du domaine PH

au phosphoinositide. La colocalisation de Akt avec PDK1 est nécessaire pour la phosphorylation de

la Thr308 (Anderson et al., 1998; Andjelkovic et al., 1997). Il a été montré que le domaine PH de

Akt puisse être un inhibiteur de la phosphorylation de Thr 308 en masquant ce résidu de la PDK1

(Song et al., 2005). PDK1 phosphoryle et active d’autres substrats incluant des isoformes de PKC

tel que PKCζ, SGK (serum and glucocorticoid-induced kinase), p70S6-kinase, PAK (p21 activated

67


protein kinase) ou CISK (cytokine-independent survival kinase) impliqués notamment dans la

survie cellulaire (Blume-Jensen and Hunter, 2001; Cantley, 2002). La phosphorylation sur Thr308

active partiellement Akt (Alessi et al., 1996), une pleine activation de Akt nécessite la

phosphorylation sur un deuxième site, la sérine 473 par une sérine/thréonine kinase, la PDK2.

L’identité de PDK2 a été longtemps controversée. Différentes PDK2 potentielles ont été

identifiées : PKCβII, ILK (integrin-linked kinase), DNA-PK (DNA dependent protein kinase) ou

Akt elle-même par autophosphorylation (Delcommenne et al., 1998; Kawakami et al., 2004; Laine

et al., 2000; Toker and Newton, 2000). Récemment il a été montré que mTORC2 (mTOR complex

2) constitué des protéines mTOR, mLST8, Rictor et SIN1 serait PDK2. En effet, elle phosphoryle

Akt sur la sérine 473 (Manning and Cantley, 2007; Sarbassov et al., 2005). La phosphorylation

seule de la sérine 473 a un faible effet sur l’activation de Akt (Alessi et al., 1996). Des études ont

décrit le rôle de la phosphorylation de tyrosine dans la régulation de Akt (Conus et al., 2002; Jiang

and Qiu, 2003). En effet, deux résidus localisés dans le domaine catalytique de Akt, Tyr 315 et Tyr

326, sont phosphorylés suivant l’activation du récepteur et sont nécessaires pour l’activité de Akt

(Chen et al., 2001a).

Les KO des isoformes de Akt dans les souris présentent des phénotypes distincts (Chen et al.,

2001b; Cho et al., 2001a; Cho et al., 2001b; Easton et al., 2005; Tschopp et al., 2005). Akt1

contribue à l’invasion tumorale et aux métastases en permettant la sécrétion de métalloprotéases et

en permettant la transition épithélio-mésenchymateuse (Larue and Bellacosa, 2005; Thant et al.,

2000). Akt2 est localisée avec le collagène IV pendant l’attachement cellulaire et joue un rôle dans

l’invasion tumorale, la motilité (Arboleda et al., 2003). L’invalidation des différentes isoformes

provoquent des défauts du développement et des altérations dans la sensibilité à l’insuline (Cho et

al., 2001b; Peng et al., 2003; Yang et al., 2003). De plus, la dérégulation des kinases Akt est

fréquemment associée à des maladies telles que le cancer et le diabète (Nicholson and Anderson,

2002; Song et al., 2005).

5.3. Effets biologiques de l’activation de Akt

Akt activée joue un rôle dans de nombreux processus cellulaires tels que la survie cellulaire, la

prolifération, le métabolisme cellulaire, la migration, la croissance cellulaire, le contrôle du cycle

cellulaire en phosphorylant différents substrats (Datta et al., 1999; Delcommenne et al., 1998;

Kandel and Hay, 1999; Vivanco and Sawyers, 2002).

68


Akt joue un rôle majeur dans la survie cellulaire en inactivant par phosphorylation des

protéines pro-apoptotiques (Bonni et al., 1999; Datta et al., 1997). Akt peut phosphoryler deux

protéines pro-apoptotiques, la caspase 9 et Bad (Cardone et al., 1998; Song et al., 2005). Une fois

phosphorylée par Akt, la protéine pro-apoptotique Bad se dissocie de Bcl-2 qui est localisée sur la

membrane mitochondriale et forme alors un complexe avec les protéines 14-3-3 dans le cytosol, ce

qui conduit à l’inhibition de l’apoptose (Datta et al., 1999).

De même, des facteurs de transcription de la famille forkhead (FKHR/FoxO1, FoxO2,

FKHRL1/FoxO3 et AFX/FoxO4) sont phosphorylés par Akt ce qui va créer un site de liaison pour

les protéines de la famille 14-3-3. Le complexe FKHRL1/14-3-3 est retenu dans le cytosol bloquant

ainsi la transcription de gènes pro-apoptotiques comme Fas ligand, TRAIL (TNF-related apoptosis-

inducing ligand), TRADD (TNF receptor type 1 associated death domain) (Datta et al., 1999;

Nicholson and Anderson, 2002).

Akt peut également activer IκB kinase (IKK) qui à son tour dégrade IκB, un inhibiteur de

ΝFκB, provoquant alors la translocation nucléaire et l’activation de ΝFκB. L’activation de NFκB

mène alors à la transcription de gènes de survie dépendants de NFκB, incluant Bcl-xL, les

inhibiteurs de la caspase (Barkett and Gilmore, 1999; Lauder et al., 2001).

De plus, Akt inhibe indirectement la fonction de la protéine p53 qui est un suppresseur de

tumeur. En effet, Akt lie et phosphoryle la protéine ubiquitine ligase Mdm2 (Murine double minute

2) permettant alors l’inactivation et la dégradation de p53 (Gottlieb et al., 2002; Mayo and Donner,

2001). Le facteur de transcription CREB (Cyclic AMP response element binding protein) est aussi

phosphorylé par Akt, ce qui permet l’augmentation de la transcription de gènes anti-apoptotiques

comme Bcl-2, Mcl-1 et Akt elle même (Pugazhenthi et al., 2000; Wang et al., 1999). Αkt est

également impliquée dans la régulation du cycle cellulaire par la phosphorylation et puis la

rétention cytoplasmique des inhibiteurs du cycle cellulaire, p21Cip/Waf1 et p27KIP1 (Shin et al., 2002;

Viglietto et al., 2002; Zhou et al., 2001).

Akt joue aussi un rôle dans la croissance cellulaire et dans la traduction par des voies menant à

l’activation d’une sérine/thréonine kinase, mTOR (mammalian Target of rapamycin) (Li et al.,

2004c). mTOR active alors la p70S6K (p70 ribosomal protein S6 kinase) qui agit comme régulateur

de la traduction favorisant alors la croissance cellulaire (Inoki et al., 2002; Tee et al., 2002). PDK1

participe également à l’activation de p70-S6K (Biondi et al., 2001).

Akt joue un rôle dans le métabolisme cellulaire en inactivant la glycogen synthase kinase 3

(GSK 3) et en activant la glycolyse et le transport du glucose (Cross et al., 1995; Deprez et al.,

1997; Kohn et al., 1996). Akt empêche la dégradation de la cycline D1 en inhibant la GSK 3 et

stimule ainsi l’activité des facteurs de transcription E2F, régulateurs de la progression dans le cycle

cellulaire (Diehl et al., 1998; Woodgett, 2005).

69


Y

Y p85

p110Y

Y

PTENPH

Akt

S473

T308

PDK1

PDK2

Bad

CaspaseFKHR

GSK3p27

CREBMdm2

p53

Bcl-2Bcl-xL Cascade de

caspases

IKK

glycolyseNFΚBJNK

Bcl-2Mcl-2

mTOR

p70S6K

Survie cellulaire Croissance cellulaireet prolifération

P

PP

P

P

P

PIP2 PIP3 PIP3 PIP2

TK

TK

Y

Y p85

p110

p85

p110Y

Y

PTENPH

Akt

S473

T308

PDK1

PDK2

Bad

CaspaseFKHR

GSK3p27

CREBMdm2

p53

Bcl-2Bcl-xL Cascade de

caspases

IKK

glycolyseNFΚBJNK

Bcl-2Mcl-2

mTOR

p70S6K

Survie cellulaire Croissance cellulaireet prolifération

P

PP

P

P

P

PIP2 PIP3 PIP3 PIP2

TK

TK

Figure 27 : Représentation schématique du mode d'activation de Akt et de certaines voies de signalisation activées par Akt. Une fois activée, Akt peut phosphoryler différentes cibles, pour permettre la survie cellulaire, la progression dans le cycle, la croissance ou la prolifération.

6. Régulation des PI3K

- par régulation de Akt

Un nombre de protéines liant Akt ont été identifiées comme pouvant réguler positivement ou

négativement l’activité de Akt suggérant alors qu’il peut y avoir une régulation transitoire de cette

kinase (Brazil et al., 2002) (tableau 6).

70


Tableau 7: Liste des protéines régulant l’activité de la sérine/thréonine kinase Akt/PKB (Song

et al., 2005).

Des protéines inhibant l’activation de Akt en réduisant leur phosphorylation sur les résidus

Thr308 et Ser 473 ont été identifiées (tableau 6). Par exemple, CMTP (carboxyl-terminal modulator

protein) régule négativement Akt, en réduisant la phosphorylation sur Ser473 (Maira et al., 2001).

De même, Trb3 qui est un régulateur négatif de l’activation de Akt lie la région centrale du domaine

kinase de Akt (Du et al., 2003). Keratin K10 lie Akt et la séquestre au cytosquelette et inhibe alors

sa translocation intracellulaire qui provoque l’inactivation de l’activité kinase de Akt et inhibe la

prolifération cellulaire (Paramio et al., 2001). Des régulateurs positifs de Akt comme Hsp90 (heat

shock protein), Hsp27, Tc11, Grb10, Ft1 interagissent avec différents domaines de Akt.

- Régulation par des phosphatases

Il existe deux enzymes majeures qui régulent la PI3K: PTEN (phosphatase and tensin homolog

deleted on chromosom 10) et l’inositol 5 phosphatase, SHIP (SH2-containing inositol phosphatase).

PTEN qui est une inositol 3 phosphatase a été identifiée comme étant un suppresseur de tumeur qui

est fréquemment muté ou délété dans un très grand nombre de tumeurs, menant alors à une

activation constitutive des PI3K (Cantley and Neel, 1999). Le principal substrat de PTEN est le

PI3,4,5P3. PTEN convertit alors le PI3,4,5P3 en PI4,5P2. La perte de PTEN est corrélée avec

71


l’activation de Akt dans les cellules cancéreuses. Une perte de l’activité de PTEN provoque une

activation permanente de la voie de signalisation PI3K/Akt.

L’invalidation de PTEN a des conséquences dramatiques dans le développement

lymphocytaire (Vivanco and Sawyers, 2002). Les SHIP1 et SHIP2 sont des inositol 5 phosphatases

qui déphosphorylent le PI3,4,5P2 pour donner du PI3,4P2. SHIP1 est exprimée dans la lignée

hématopoïétique et SHIP2 est exprimée de façon ubiquitaire. La perte de SHIP2 provoque une

diminution dramatique dans la sensibilité à l’insuline suggérant que cette phosphatase régule la

PI3K en aval de l’insuline (Clement et al., 2001). Les SHIP peuvent être régulées par le recrutement

auprès de récepteurs inhibiteurs dans le système immunitaire (Rohrschneider et al., 2000) et PTEN

peut être régulée par l’oxydation de cystéine du site catalytique (Leslie et al., 2003). Ces deux

phosphatases ont un rôle antagoniste avec celui des PI3K, mais agissent avec les PI3K afin de

réguler finement l’activité de Akt.

Targeted phosphatase Comments

SHIP1 SHIP-/- phenotype in haemopoietic ; increased PI3K signalling

SHIP2 SHP2-/-: perinatal lethality dependent on targeting strategy; metabolic phenotype

PTEN PTEN -/-: perinatal (cre-conditional -/- models available) cancer-related phenotypes

PTEN+/-: cancer-related phenotypes, increased PI3K-signalling Tableau 8: Conséquences biologiques de l’invalidation des gènes codant pour les protéines PTEN et SHP1 et 2. (Hawkins et al., 2006)

7. Gab1, SHP2 dans l’activation de la voie des PI3K

Nous avons vu que la protéine multi-adaptatrice Gab1 et la protéine phosphatase SHP2 jouent

un rôle dans l’activation de la voie Ras/MAPK. En plus de ce rôle, ces deux protéines interviennent

dans l’activation de la voie PI3K.

La PI3K présente la particularité d’agir en amont et en aval des protéines Gab. Puisque le

domaine cytoplasmique de l’EGFR ne contient pas de motifs liant p85, la stimulation par l’EGF

provoque l’activation de PI3K par un mécanisme indirect. La sous-unité régulatrice p85 qui

contient deux domaines SH2 lie spécifiquement des motifs YXXM qui se trouve sur la protéine

multi-adaptatrice Gab1 (Holgado-Madruga et al., 1996; Mattoon et al., 2004). Cette interaction

permet le plus souvent de potentialiser l’activation de la voie PI3K. En effet, la surexpression dans

les cellules PC12 d’une protéine Gab1 mutée sur ses sites d’interaction avec la protéine p85

(Gab1Δp85) empêche la propagation d’un signal anti-apoptotique en réponse au NGF (Holgado-

Madruga et al., 1997). Le recrutement de p85 par Gab1 mène donc à l’activation de PI3K et à la

72


production de PIP3 à la membrane plamique. L’interaction entre Gab1 et la PI3K va permettre la

mise en place d’une boucle d’amplication dans l’activation de PI3K. Ainsi, le domaine PH de Gab1

va lier les produits lipidiques de la PI3K, ce qui va permettre le recrutement de molécules Gab1

additionnelles, entrainant de ce fait l’activation de PI3K (Rodrigues et al., 2000).

Figure 28: Modèle de la régulation de l’activation de PI3K par la protéine phosphatase SHP2. (Zhang et al., 2002).

De plus, il a été montré que la protéine phosphatase SHP2 régule l’intensité et la durée de

l’activation de la PI3K en réponse à l’EGF (Zhang et al., 2002). En plus de son rôle positif dans

l’activation de la voie Ras/MAPK, la protéine phosphatase SHP2 régule négativement la PI3K en

déphosphorylant les sites de liaison de la sous-unité p85 sur Gab1 (Zhang et al., 2002). SHP2 aide

alors à réguler la boucle d’amplification contrôlant ainsi la cinétique, la localisation de l’activation

de PI3K en réponse à l’EGF. Cette régulation apparaît être spécifique du récepteur activé. En effet,

l’activation de la PI3K en réponse au PDGF et à l’IGF-1 n’est pas augmentée.

IV. Interconnection entre les voies Ras/MAPK et PI3K

De récentes études ont montré qu’il existe une interconnection entre les voies Ras/MAPK et

PI3K, mais le rôle de PI3K dans l’activation des MAPK reste assez controversé.

73


1. Régulation de la voie MAPK par la voie PI3K

La PI3K participe à l’activation de la voie des MAPK puisque différentes études ont montré

que l’inhibition de PI3K empêche la stimulation de ERK1/2 notamment en réponse à certains

facteurs de croissance et dans certains types cellulaires (Duckworth and Cantley, 1997; Rubio and

Wetzker, 2000; Wandzioch et al., 2004; Wennstrom and Downward, 1999; Yart et al., 2001). Ainsi,

certaines études ont montré que des inhibiteurs de la PI3K ou des dominants négatifs de PI3K

inhibent l’activation de la voie Ras/MAPK, tandis que d’autres études ont montré que l’inhibition

de PI3K n’a pas d’effet sur l’activation des ERK1/2 (Cross et al., 1994; Ferby et al., 1996; Frevert

and Kahn, 1997; Hu et al., 1996; Lopez-Ilasaca et al., 1997; Nakamura et al., 1996). Par

conséquent, la PI3K n’a pas les mêmes effets sur la voie Ras/MAPK selon le ligand et le type

cellulaire utilisé.

L’expression de sous-unités p110α de la PI3K stimule l’activation des MAPK dans les oocytes

de Xénope (Hu et al., 1995a), tandis que la surexpression de p110γ et non de p110α provoque

l’activation des MAPK dans les cellules COS-7 (Frevert and Kahn, 1997; Lopez-Ilasaca et al.,

1997). La PI3K intervient dans l’activation des MAPK dans les cellules musculaires squelettiques

de rat, dans les cellules d’ovaires d’hamster chinois, et dans les adipocytes de rat (Cross et al., 1994;

Liu et al., 2006; Welsh et al., 1994), par contre la PI3K n’intervient pas dans l’activation des

MAPK dans d’autres types cellulaires comme les cellules pariétales de lapin (Nakamura et al.,

1996; Scheid and Duronio, 1996). Dans les COS-7 et dans les cellules Swiss 3T3, l’inhibition de

l’activité de la PI3K diminue l’activation des MAPK sous stimulation par de faibles doses de EGF

ou de PDGF (ou ou quand les cellules expriment peu de molécules de RTK) (Duckworth and

Cantley, 1997; Wennstrom and Downward, 1999).

Au contraire, dans le cas de cellules exprimant abondamment des RTK et stimulées avec une

forte dose de ligand, PI3K ne devient plus nécessaire dans l’activation de ERK1/2 (Duckworth and

Cantley, 1997; Wennstrom and Downward, 1999). Toutes ces études suggérent que la force et

l’intensité du signal de stimulation peuvent être des facteurs importants dans la détermination de la

dépendance de la PI3K dans l’activation de la voie Ras/MAPK. Dans les cellules de carcinomes

hepatocellulaires, il a été montré que PI3K est nécessaire à l’activation de ERK1/2 lorsqu’ il y a

stimulation par l’insuline et non par l’EGF (Liu et al., 2006). Donc, le rôle de PI3K dans

l’activation de ERK1/2 dans ce cas là dépend du ligand utilisé plutôt que de la force du signal de

stimulation. Dans la lignée cellulaire Vero, PI3K intervient dans l’activation de la voie Ras/MAPK

en réponse à l’EGF indépedamment de la force du signal (Yart et al., 2001). La voie dépendante de

la PI3K impliquant les protéines Gab1 et SHP2 est nécessaire, en plus de la voie Grb2/SOS, pour

l’activation de Ras par l’EGF (Yart et al., 2001).

74


Plusieurs membres de la famille PKC agissent comme intermédiaires entre la voie PI3K et la

voie des MAPK. Il semblerait que PI3K puisse intervenir dans l’activation de certaines PKC

conduisant ainsi à la phosphorylation et l’activation de Raf (Duckworth and Cantley, 1997;

Naranatt et al., 2003; Schonwasser et al., 1998). Récemment, il a été montré que la protéine β GBD

(galactosidase binding protein) qui induit l’arrêt du cycle cellulaire en phase S/G2, inhibe

l’activation des MAPK en réponse au PDGF en ciblant la PI3K. Le recrutement de Grb2 au niveau

du récepteur et l’association de Grb2/SOS ne sont pas affectés (Wells et al., 2007).

2. Régulation de la voie PI3K par la voie Ras/MAPK

Des travaux ont révélé que la PI3K co-immunoprécipite avec Ras suggérant qu’elle peut agir

en tant que répresseur ou activateur de Ras (Sjolander et al., 1991). Puis Ras a été décrit comme

interagissant directement avec la sous unité p110 de la PI3K et potentialisant l’activité lipide kinase

de la PI3K activée par des facteurs de croissance (Kodaki et al., 1994; Rodriguez-Viciana et al.,

1994). De plus le niveau d’activation de la PI3K obtenu sous stimulation par Ras varie en fonction

de l’isoforme de la PI3K qui est ciblée et des protéines Ras considérées (Rodriguez-Viciana et al.,

2004). Ainsi, p110α est significativement activée alors que p110γ ne l’est que très peu, et cela dans

le même modèle cellulaire (Rubio et al., 1997). Suire et al ont montré une activation forte et directe

de PI3Kγ par H-Ras in vitro et in vivo (Suire et al., 2002). L’interaction de la sous-unité catalytique

de PI3K avec Ras induit un changement dans la structure de la poche catalytique de PI3K (Suire et

al., 2002). L’utilisation d’un dominant négatif de Ras inhibe la capacité de NGF et de l’EGF à

élever les taux de 3-phosphoinositides dans les cellules PC12 ce qui suggère que Ras agit en amont

de la PI3K (Rodriguez-Viciana et al., 1994). La fonction des interactions entre la PI3K et les petites

GTPases est compliquée par le fait que la PI3K peut également stimuler l’activation de Ras ce qui

veut dire que la PI3K peut intervenir en amont et en aval de l’activation de Ras (Hu et al., 1995b).

Le potentiel oncogénique des isoformes Ras est corrélé avec l’activation de la PI3K et non avec

celle des ERK (Li et al., 2004a). La capacité de mutants de Ras à permettre la transformation

cellulaire in vitro et la formation de tumeur in vivo nécessite la PI3K (Gupta et al., 2007). De plus,

la transcription du gène Fos qui est induite par l’expression de p110 dans les cellules NIH3T3, est

bloquée par l’expression de dominants négatifs de Ras (Hu et al., 1995a).

Il a été montré que les ERK1/2 interagissent avec la protéine Gab1. Les ERK1/2 vont alors

pouvoir phosphoryler Gab1 sur les résidus sérine et thréonine de séquences qui contiennent aussi le

site de liaison de la PI3K (Yu et al., 2001). Ainsi, en réponse à l’HGF, il va y avoir une

augmentation des complexes Ga1/PI3K ce qui va permettre l’activation de la voie PI3K (Yu et al.,

2001). Au contraire, dans le cas du récepteur de l’EGF, la phosphorylation des résidus sérine et

75


thréonine entraîne la déphosphorylation des tyrosines de Gab1. La formation des complexes Gab1-

PI3K va alors être inhibée ce qui va induire l’inhibition de la voie PI3K (Yu et al., 2002). La

phosphorylation de Gab1 par ERK1/2 conduit donc à un rétrocontrôle positif ou négatif, selon le

type de stimulation.

Nous venons donc de voir qu’il existe une interconnection entre les voies Ras/MAPK et PI3K

en réponse à l’EGF, qui fait intervenir les deux protéines Gab1 et SHP2. Les protéines Gab1 et

SHP2 jouent en effet un rôle important autant dans le maintien de l’activation de la voie Ras/MAPK

que dans l’activation de la voie PI3K. Il existe des rétrocontrôles positifs et négatifs qui permettent

de réguler ces deux voies de signalisation.

Figure 29: Schéma de l’activation des voies Ras/MAPK et PI3K en réponse à l’EGF et de l’interconnection entre ces deux voies. (Kiyatkin et al., 2006)

76

Introduction bibliographique Chapitre III : Implications des récepteurs ErbB dans les cancers

Chapitre III : Implications des récepteurs ErbB dans les cancers

I. Dérégulation des ErbB dans les cancers

Les récepteurs ErbB sont impliqués dans beaucoup de cancers humains en particulier dans des

tumeurs solides tels que les cancers du poumon, de la tête et du cou, du sein, les glioblastomes etc...

Le récepteur de l’EGF a été le premier récepteur membranaire clairement impliqué dans la

cancérogenèse avec la découverte de son homologie avec l’oncogène v-ErbB qui code pour une

version tronquée et constitutivement active de ce récepteur (Herbst, 2004). Les altérations des

récepteurs ErbB observées sont des mutations, des surexpressions (avec ou sans amplification) ou

une stimulation anormale par leurs ligands (Gschwind et al., 2004; Holbro et al., 2003). Les

mutations peuvent toucher les différentes parties du récepteur. La surexpression des ErbB est

associée à une augmentation de l’agressivité de la tumeur (degré d’invasion, fréquence des rechutes

et survie des patients) (Slamon et al., 1989). De plus, l’agressivité de la tumeur va varier en fonction

de l’hétérodimère formé.

Tableau 9 : Dérégulations des récepteurs de la famille ErbB retrouvées dans les cancers. (Yarden and Sliwkowski, 2001).

Dans le cas de ErbB2, la mutation d’une valine en acide glutamique dans le domaine

extracellulaire provoque l’activation du récepteur et l’acquisition d’un pouvoir oncogénique en

favorisant probablement son oligomérisation (Weiner et al., 1989). Des mutations dans le domaine

tyrosine kinase de ErbB2 ont été identifiées dans un petit nombre de cancer des bronches non à

77


petites cellules. L’amplification génique de ErbB2 conduit à sa surexpression à la surface cellulaire.

ErbB2 est fréquemment surexprimé dans les cancers du sein (15 à 25%), du poumon (15 à 30%).

De plus, la surexpression des ErbB est détectée dans les cancers ovarien, gastrique, de la vessie, de

l’oesophage, du pancréas (Holbro and Hynes, 2004; Hynes and Stern, 1994; Normanno et al., 2005;

Slamon et al., 1987).

Quant à ErbB3, il est surexprimé dans 20% des cancers du sein, 28 à 47% des cancers

pancréatiques et 81% des cancers gastriques. Il est également surexprimé dans les cancers ovariens,

de la prostate et colorectaux (Gullick, 1996). La surexpression de ErbB3 augmente le pouvoir

transformant de ErbB2 (Alimandi et al., 1995).

ErbB4 est exprimé dans environ 12% des carcinomes mammaires (Witton et al., 2003), où il

apparaît comme un marqueur de bon prognostic. ErbB4 est faiblement exprimé dans les tumeurs du

sein, de la prostate (Kew et al., 2000). Il est rarement exprimé avec les autres membres de la famille

ErbB.

En terme de réponse mitogène et de pouvoir transformant, les homodimères sont moins

mitogènes et ont un pouvoir transformant moins fort que les hétérodimères. En effet, les

hétérodimères contenant ErbB2 sont les complexes les plus puissants (Kokai et al., 1989; Riese et

al., 1995). Il a été montré que l’hétérodimère ErbB2 /ErbB3 a un rôle crucial dans la transmission

du signal mitogène. La co-expression de ErbB2 avec ErbB3 est retrouvée dans de nombreux

cancers, tels que les carcinomes épidermoïdes de la cavité buccale où l’expression de l’

hétérodimère ErbB2/ ErbB3 est associée à un mauvais pronostic vital (Xia et al., 1999). La

coexpression de plusieurs membres de la famille ErbB est retrouvée dans différents cancers incluant

le cancer du cerveau, du sein, ovarien (Gilbertson et al., 1997; Osaki et al., 1992; Skirnisdottir et al.,

2001; Xia et al., 1999). L’hétérodimère EGFR/ErbB2 apparaît être le plus puissant inducteur de la

transformation cellulaire et de la signalisation mitogène comparé aux autres hétérodimères (Garrett

et al., 2003; Lenferink et al., 1998; Yarden and Sliwkowski, 2001).

L’EGFR joue un rôle dans la migration des cellules tumorales, l’adhésion cellulaire, et le

développement de métastases. D’autre part, l’EGFR stimule la synthèse de protéines comme le

VEGF, le bFGF qui sont des éléments essentiels du processus de néoangiogénèse. La dérégulation

de l’EGFR contribue donc au développement tumoral via ses effets sur la progression dans le cycle

cellulaire, l’inhibition de l’apoptose, l’induction de l’angiogénèse (Herbst and Bunn, 2003). Il est

fréquemment dérégulé dans des tumeurs épithéliales.

78


Plusieurs mécanismes aboutissant à la dérégulation de l’EGFR ont été proposés: (Figure 30)

- la surexpression de l’EGFR

- des mutations activatrices de l’EGFR

- la surexpression des ligands (EGF, TGFα)

- l’hétérodimérisation de l’EGFR avec d’autres membres de la famille des récepteurs

ErbB en particulier ErbB2

- la régulation défectueuse de l’EGFR

-

Figure 30: Mécanismes selon lesquels l’EGFR devient oncogénique (Zandi et al., 2007).

- La surexpression des ligands (EGF, TGFα)

La surexpression des ligands TGF α et EGF permet une activation de l’EGFR par une stimulation

autocrine. Plusieurs tumeurs solides (pancréas, estomac, ovaire, sein) expriment de forts taux

d’EGFR et des ligands de l’EGFR (Bridges, 1999; Cohen et al., 1994; Umekita et al., 2000).

L’expression de TGFα dans différentes tumeurs co-exprimée avec l’EGFR provoque une plus forte

prolifération cellulaire et un plus mauvais pronostic comparé aux tumeurs exprimant l’EGFR sans

co-expression de ses ligands (Umekita et al., 2000; Yamanaka et al., 1993).

- La surexpression de l’EGFR

La surexpression de l’EGFR a été corrélée à une augmentation de l’agressivité tumorale dans

plusieurs types de cancers tels que les cancers pulmonaires à non petites cellules, les cancers de la

tête et du cou, du sein, de la vessie, de l’ovaire (Strawn and Shawver, 1998; Velu, 1990). Cette

surexpression pourrait être due à un mécanisme de régulation transcriptionnelle, post-

79


transcriptionnelle ou à une amplification du gène. La surexpression de l’EGFR aboutit à une

prolifération et une migration cellulaire anarchiques, qui conduisent alors au développement de

métastases. La surexpression de l’EGFR est souvent associée à un mauvais pronostic. La

surexpression de l’EGFR due à l’amplification du gène est de même très fréquente dans les

glioblastomes (40%) (Wikstrand et al., 1998). Il a été montré que dans des cancers tels que les

cancers du poumon, des ovaires, du sein, du cerveau, l’amplification du gène est souvent

accompagnée par des réarrangements ou l’altération du gène qui provoque des délétions du

domaine extracellulaire du récepteur.

- Des mutations de l’EGFR

Des mutations du gène de l’EGFR sont fréquentes dans des cancers humains. Ces mutations

peuvent être divisées en trois principaux groupes: des mutations dans le domaine extracellulaire,

des mutations dans le domaine intracellulaire et des mutations dans le domaine tyrosine kinase.

Tableau 10: Mutations de l’EGFR. Abréviations : ECD = extracellular domain; ICD= domaine intracellular ; TKD= tyrosine kinase domain; GBM= glioblastomes multiformes ; PC= prostate cancer; BC= breast cancer ; NSCLC= non small cellular lung cancer ; OC= ovarian cancer ; HNC= head and neck cancer

Les mutations dans le domaine extracellulaire de l’EGFR sont fréquentes dans les glioblastomes

multiformes. La mutation la plus fréquente et la mieux caractérisée est l’EGFRvIII aussi connue

comme del2-7EGFR ou Δ2-7EGFR (Ekstrand et al., 1992; Wong et al., 1992; Yamazaki et al.,

1988; Zandi et al., 2007). L’EGFRvIII est délété d’une partie de son domaine extracellulaire de

liaison au ligand (Tang et al., 2000). Ce mutant est retrouvé dans 50% des glioblastomes

multiformes et dans plusieurs types de cancers incluant les tumeurs du sein, ovarien, du poumon et

dans les médulloblastomes (Moscatello et al., 1995). Cette forme oncogénique de l'EGFR induit une

activation faible mais constitutive du récepteur indépendante du ligand qui jouerait un rôle majeur

80


dans le pronostic défavorable des tumeurs (Lorimer, 2002; Pedersen et al., 2001; Wong et al.,

1992).

II. Inhibiteurs des ErbB en thérapie anti-cancéreuse

A l’heure actuelle deux stratégies thérapeutiques principales se sont révélées prometteuses pour

cibler les récepteurs ErbB : des anticorps monoclonaux et des inhibiteurs de l’activité kinase.

1. Les anticorps monoclonaux

Les anticorps monoclonaux sont administrés par voie intraveineuse. Ils bloquent le site de

fixation extracellulaire du ligand. Ils empêchent la dimérisation du récepteur qui est à l’origine de

l’initiation du processus d’activation. Ils induisent l’internalisation du récepteur (Sunada et al.,

1986). Les récepteurs ErbB sont alors dégradés et les voies de signalisation induites par des

récepteurs ErbB sont inhibés.

Les premiers anticorps monoclonaux produits étaient murins, mais ces anticorps produisaient

rapidement une réponse immune. Donc ils ne peuvent pas être utilisés chez l’homme. Afin de

pallier à ce problème, on a donc successivement assisté au développement des anticorps chiméres

puis des anticorps humanisés. Les anticorps chimères sont composés d’un fragment Fv murin

d’affinité et de spécificité caractérisé qui est fusionné avec des régions constantes humaines.

L’immunogénicité de ces « anticorps chimères » est réduite, de plus, la tolérance de ces anticorps

est améliorée pour une utilisation thérapeutique chez l’homme. Dans le but de réduire la partie

murine des anticorps chimères, des anticorps "humanisés" ont été développés. Ainsi, des boucles

hypervariables (CDR) d’un anticorps murin ont été greffées sur la charpente d’un anticorps humain.

De cette façon, l’anticorps obtenu est essentiellement humain. Récemment, l’utilisation de souris

transgéniques dans lesquelles ont été introduites les séquences codant les chaînes légère et lourde de

l’immunoglobuline humaine (exemple : XenoMouse) a facilité la production d’anticorps

monoclonaux humains (figure 31).

81


Figure 31: Classification des différents anticorps monoclonaux (murin, chimérique, humanisé et humain). (Imai and Takaoka, 2006)

Plusieurs anticorps monoclonaux dirigés contre le domaine extracellulaire de l’EGFR ont été

développés. Le plus couramment utilisé est le cetuximab qui est un anticorps monoclonal humanisé

de type IgG2. Il a une activité anti-tumorale in vitro et dans des modèles de xénogreffes (Masui et

al., 1984). Une augmentation de l’expression de l’inhibiteur du cycle cellulaire, p27KIP1 est

observée, les cellules sont alors arrêtées en phase G1 (Baselga, 2001; Baselga, 2001b; Bennasroune

et al., 2004b). Le cetuximab a également des propriétés anti-angiogéniques et il influence l’apoptose

(Petit et al., 1997). Il est notamment utilisé dans le traitement du cancer colorectal. De plus, le

cetuximab est utilisé en association avec la chimiothérapie pour traiter les cancers du côlon

métastatiques et avec la radiothérapie pour le traitement des cancers de la tête et du cou (Baselga,

2001a; Baselga, 2001b; Baselga, 2001c; Bonner et al., 2006; Huang et al., 1999).

Il existe également des anticorps monoclonaux dirigé contre ErbB2. Ainsi, l’herceptine

(trastuzumab) est un anticorps monoclonal humanisé dirigé contre la région extracellulaire de

ErbB2 (Carter et al., 1992). Cet anticorps monoclonal a été le premier à être utilisé pour une

utilisation clinique en particulier dans le traitement du cancer du sein métastasique (Baselga et al.,

1996; Cobleigh et al., 1999). Le trastuzumab régule l’expression de ErbB2 en augmentant son

endocytose et sa dégradation ceci s’accompagne d’une inhibition des voies des MAPK et des PI3K

(Nahta and Esteva, 2007; Sarup et al., 1991). Il bloque également l’hétérodimérisation de ErbB2

avec les autres membres de la famille des récepteurs ErbB (Baselga and Albanell, 2001). ErbB2 est

rapidement déphosphorylé par le trastuzumab (Lane et al., 2000). A la suite de cela, il permet l’arrêt

du cycle cellulaire et l’apoptose grâce à une augmentation de l’expression de la p27KIP1 qui réduit

l’activité de cdk2 (Baselga and Albanell, 2001; Lane et al., 2000; Sliwkowski et al., 1999). De plus,

il active PTEN ce qui provoque la déphosphorylation de Akt et alors la prolifération cellulaire est

inhibée (Nahta and Esteva, 2006). Il inhibe également l’angiogénèse. La densité des microvaisseaux

82


est diminuée in vivo (Izumi et al., 2002; Klos et al., 2003) et la migration des cellules endothéliales

est réduite in vitro (Klos et al., 2003) en réponse au trastuzumab. Environ 30% des cancers du sein

métastasiques répondent au trastuzumab et l’utilisation de celui-ci en combinaison avec la

chimiothérapie (comme le paclitaxel ou le docetaxel) est plus efficace que le trastuzumab seul

(Slamon et al., 2001; Tokunaga et al., 2006). Les effets anti-tumoraux de trastuzumab peuvent

également s’expliquer par l’inhibition du clivage du domaine extracellulaire de ErbB2 (Molina et

al., 2001). Chez les patients avec un cancer du sein métastasique, des taux élevés du récepteur

ErbB2 tronqué de son domaine extracellulaire est corrélé à un mauvais pronostic (Colomer et al.,

2000; Leitzel et al., 1995; Molina et al., 2002). Le trastuzumab a surtout été utilisé dans le

traitement du cancer du sein mais actuellement son action est étudiée dans d’autres types de cancers

(Morrison et al., 2006).

Anticorps Caractéristiques Statut Cancers Trastuzumab (Herceptine) IgG1humanisé

Anti ErbB2 Approuvé en

1998 sein

Cetuximab (Erbitux)

IMC-C255 IgG2 chimère Anti-EGFR

Approuvé en 2004

Phase II-III

colorectal, de la tête et du cou Pancréas, poumon, cerveau

Panitumumab (vectibix) ABX-EGF

IgG2 humaine Anti-EGFR

Approuvé en 2006

Phase I-III

Colorectal Poumon, ovaires, cerveau

Matuzumumab EMD-72000

IgG1 humanisé Anti-EGFR

Phase II Colorectal, cervical et gastrique

Nimotuzumab (TheraCIM) h-R3

IgG1 humanisé Anti-EGFR

Phase III Poumon

Zalutumumab (HuMaxEGFr) mAb 2F8

IgG1 humaine Anti-EGFR

Phase III Poumon, tête et cou

Pertuzumab (Omnitarg) RhuMAb 2C4

Anticorps monoclonal humanisé

Anti-ErbB2

Phase III Cerveau, ovaires, prostate, sein

Ch806 IgG2 chimère Anti-EGFRvII

Phase I Tumeurs solides avancées

Tableau 11: Liste d’anticorps monoclonaux anti-ErbB utilisés en thérapie anti-cancéreuse. (D’après(Roberts and Der, 2007))

D’autres anticorps monoclonaux ont été développés (tableau 10). Ainsi, le pertuzumab qui est

un anticorps monoclonal anti-ErbB2, inhibe l’hétérodimérisation de ErbB2 et par conséquent inhibe

83


la signalisation intracellulaire (Agus et al., 2005; Garland et al., 2006; Mendoza et al., 2002). Le

panitumumab est un anticorps humain qui lie l’EGFR et empêche la fixation du ligand. Il a une plus

forte affinité pour l’EGFR que le cetuximab (Yang et al., 1999). Il provoque l’arrêt du cycle

cellulaire et supprime la production de facteurs pro-angiogéniques. La combinaison du

panitumumab avec des agents chimiothérapeutiques a démontré une activité anti-tumorale additive

dans des modèles de xénogreffes de tumeurs (Jakobovits et al., 2007).

2. Les inhibiteurs de l’activité kinase

Une seconde classe de molécules a aussi connu un développement très important: les

inhibiteurs de tyrosine kinase (TKI pour tyrosine kinase inhibitors) qui sont des molécules de petite

taille. Beaucoup de ces inhibiteurs appartiennent à la famille des analinoquinazolines ou des

analogues (Bennasroune et al., 2004a). Les TKI inhibent de façon spécifique l’activité tyrosine

kinase des récepteurs ErbB, par compétition avec le site de fixation de l’ATP au niveau

intracellulaire, empêchant ainsi la phosphorylation du récepteur et par conséquent le blocage des

voies de signalisation. Ils sont administrés par voie orale.

Deux molécules inhibitrices sélectives de l’EGFR (gefitinib et erlotinib) sont aujourd’hui

approuvées pour le traitement de cancers du poumon (gefitinib et erlotinib) et du pancréas

(erlotinib) et de nombreuses autres sont à différents stades d’essais cliniques (tableau 11). Ces

dernières ne sont pas uniquement sélectives d’un seul récepteur ErbB, en effet, elles peuvent pour

certaines inhiber deux ou plus de récepteurs ErbB (Moasser, 2007) voir tableau 11.

Le gefitinib (Iressa ou ZD1839) est donc un inhibiteur de l’activité tyrosine kinase de l’EGFR,

mais il a été montré que selon la dose de gefitinib utilisé, il devient également un inhibiteur de

l’activité tyrosine kinase de ErbB2 (Anderson et al., 2001). Il induit l’arrêt du cycle cellulaire en

phase G1 et inhibe la prolifération cellulaire tumorale. Il inhibe aussi l’angiogénèse. L’inhibition de

la croissance tumorale est l’effet thérapeutique prédominant de l’Iressa in vitro et in vivo. En

association avec les chimiothérapies anti-cancéreuses, la radiothérapie ou le trastuzumab, le

gefitinib a montré une meilleure efficacité comparée à celle observée avec l’utilisation du gefitinib

seul (Albanell et al., 2002; Ciardiello et al., 2000; Normanno et al., 2002). Chez les patients en

récidive de glioblastomes, l’Iressa n’est pas très efficace, donc il est actuellement évalué en

combinaison avec la radiothérapie ou avec le témozomolide (chimiothérapie). En utilisation

clinique chez les patients ayant le cancer du poumon non à petites cellules, le gefitinib est efficace

chez les individus portant des mutations somatiques à savoir une mutation de délétion (del 747-750)

84


ou une mutation ponctuelle L858R (Lynch et al., 2004; Paez et al., 2004; Pao et al., 2004). Ces

mutations augmentent l’activité tyrosine kinase de l’EGFR.

L’autre inhibiteur de l’activité kinase de l’EGFR est l’erlotinib. Il induit l’arrêt du cycle

cellulaire en phase G0/G1, l’accumulation de p27kip1. Il induit aussi l’apoptose mais des

concentrations plus élevées d’erlotinib sont généralement nécessaires dans le traitement des cancers.

Donné en combinaison avec des inhibiteurs de PI3K, l’erlotinib est plus efficace (Slamon et al.,

2001).

Il existe des inhibiteurs de l’activité kinase des ErbB qui sont en cours de développement et qui

lient le récepteur d’une manière irréversible (EKB-569, canertinib, HKI-272).

Inhibiteur Caractéristiques et cible Statut Cancers Gefitinib (Iressa)

ZD1839 quinazoline réversible

EGFR Approuvé en 2003

Phase II-III poumon sein, carcinome hépatique,œsophage, tête et cou, cerveau

Erlotinib (Tarceva) OSI-774

quinazoline réversible EGFR

Approuvé en 2004 Phase II-III

Poumon, pancréas Cerveau, colorectal, vessie, rein,tête et cou, prostate et autres cancers solides

Lepatinib (Tykerb) GW572016/GW2016

quinazoline réversible EGFR, ErbB2

Phase III Sein, rein, tête et cou

Pelitinib (EKB-569) cyanoquinoline irréversible EGFR, ErbB2

Phase III Sein, poumon

PKI-166/PKI116 Pyrrolopyrimidine réversible EGFR, ErbB2

Phase I Prostate, rein

ARRY-334543 Pyridopyrimidine réversible EGFR, ErbB2

Phase I Tumeurs avancées

BMS-599626 Pyrrolotriazine réversible Pan-ErbB

Phase I Tumeurs solides avancées

Canertinib ou CI-1033 Quinazoline réversible Pan-ErbB

Phase I-II Poumon, sein

HKI-272 Cyanoquinoline irréversible Pan-ErbB

Phase II Sein, poumon

Tableau 12: Liste d’inhibiteurs de l’activité kinase des récepteurs ErbB utilisés en thérapie anti-cancéreuse. (D’après (Roberts and Der, 2007)). Le traitement des cellules tumorales avec des anticorps monoclonaux et des TKI affecte des voies

de signalisation qui sont essentielles dans le développement et la progression du cancer.

3. Autres inhibiteurs

Il existe d’autres approches thérapeutiques permettant d’inhiber les récepteurs ErbB. En

effet, il existe des agents thérapeutiques qui bloquent la transcription, la traduction ou la maturation

85


des transcrits des récepteurs ErbB. Ainsi, l’adénovirus 5 E1A (adenovirus type 5 early region 1 A)

peut fonctionner comme un suppresseur de tumeur qui inhibe la transcription de ErbB2 et supprime

le potentiel tumorigène des cellules cancéreuses qui surexpriment ErbB2 comme le cancer des

ovaires (Chang et al., 1997; Meric et al., 2000). De plus, il existe des inhibiteurs naturels et

synthétiques des protéines hsp comme le 17-AAG (17-allylamino-17-demathoxydeldanamycin), le

geldanamycine, le radicol qui induisent la dégradation du récepteur et de Akt dans les xénogreffes

de cancer inhibant ainsi la croissance tumorale (Neckers, 2002; Solit et al., 2002). Enfin, des

anticorps simple chaîne ou scFv (single chain fragment variable) anti-EGFR et anti-ErbB2 ont été

produits (Suzuki et al., 2001). Ils peuvent inhiber le transfert du récepteur à la membrane plasmique

et réduire ainsi la transduction du signal (Beerli et al., 1994). Les ScFv sont des molécules de petite

taille, mieux tolérés et pénétrant plus rapidement les tumeurs que les anticorps entiers (Joosten et

al., 2003).

D’autres stratégies sont en cours de développement afin d’inhiber les récepteurs ErbB telles

que des ribozymes pour bloquer l’expression du récepteur dans les cellules, des oligonucléotides

antisens pour bloquer la transcription des ErbB ou de leurs ligands (Hsieh et al., 2000; Vaughn et

al., 1995).

III. Phénomène de résistance

Des résistances au trastuzumab ont été observées. Ces résistances pourraient probablement être

dues à la formation d’hétérodimères ou à la surexpression d’un autre membre de la famille des

ErbB. Ainsi, des anticorps qui ciblent plusieurs ErbB peuvent être efficaces dans les cellules

cancéreuses résistantes au trastuzumab.

Des mutations somatiques de PTEN détectées dans de nombreuses tumeurs (sein, ovaires,

prostate, glioblastomes) provoquent une activation constitutive de la PI3K et par conséquent celle

de la protéine Akt. Cette activation pourrait être à l’origine de la résistance au trastuzumab dans les

cellules cancéreuses surexprimant ErbB2. Donc des inhibiteurs de PI3K combinés au trastuzumab

pourraient devenir des thérapies potentielles dans des tumeurs résistantes à trastuzumab.

De plus, une étude a montré qu’un anticorps monoclonal dirigé contre l’EGFR (appelé B467)

provoque la prolifération de lignées cellulaires cancéreuses de poumon non à petites cellules. Ces

cellules développent donc une résistance à cet anticorps. Cette résistance s’explique par le fait que

l’anticorps B467 va empêcher l’EGFR de s’hétérodimériser avec ErbB2 ou ErbB3 et alors la

dimérisation entre ErbB3 et ErbB2 va être favorisée. La formation de ces dimères va alors permettre

86


l’activation des voies de signalisation mitogènes MAPK et PI3K ce qui va conduire à la

prolifération des cellules cancéreuses. La formation des dimères ErbB2/ErbB3 peut donc expliquer

la résistance aux anticorps anti-EGFR dans ces cellules (Maegawa et al., 2007). Une solution pour

pallier à ce problème serait de bloquer les voies de signalisation en utilisant des anticorps

monoclonaux anti-EGFR et anti-ErbB2.

En dehors de ces résistances au trastuzumab, il a été observé des résistances aux inhibiteurs de

l’activité kinase comme le gefitinib ou l’ertolinib chez de nombreux patients. Dans 50% des

patients atteints de cancer du poumon, cette résistance est le plus souvent associée à une deuxième

mutation du domaine kinase de l’EGFR comme la mutation T790M (Carter et al., 2005; Kobayashi

et al., 2005; Pao et al., 2005). Des inhibiteurs irréversibles semblent inhiber le mutant T790M

(Carter et al., 2005). Des mutations somatiques dans K-Ras ont aussi été associées à la résistance au

gefitinib et au erlotinib (Pao et al., 2005).

Comme pour le trastuzumab, l’influence des mutations du gène PTEN a été mise en évidence

expérimentalement dans la résistance au gefitinib (Bianco et al., 2003; Luo et al., 2003; She et al.,

2003) par l’activation constitutive de Akt liée à la perte de la fonction de PTEN (She et al., 2003).

Les inhibiteurs de PI3K semblent être particulièrement efficaces lorsqu’ils sont donnés en

combinaison avec des inhibiteurs de l’EGFR (Haas-Kogan et al., 2005).

De plus, les inhibiteurs de PI3K lorsqu’ils sont combinés aux inhibiteurs de l’EGFR pourraient

devenir des agents prometteurs dans la résistance à l’Iressa (Ihle et al., 2005). Nous avons d’ailleurs

montré lors de notre étude dans une lignée de glioblastomes, que des inhibiteurs de PI3K combinés

à un inhibiteur de l’EGFR permet de lever la résistance aux inhibiteurs de l’EGFR. Dans la partie

résultats expérimentaux, le mécanisme qui intervient dans cette résistance sera décrit. De plus, les

substrats de AKT comme mTOR sont aussi des cibles thérapeutiques attractives pour vaincre la

résistance aux TKI liée à PTEN. Il a été observé des effets synergiques des inhibiteurs de l’EGFR et

des inhibiteurs de mTOR dans les cellules de glioblastomes (Doherty et al., 2006; Reardon et al.,

2005a; Reardon et al., 2005b). De même, il a été démontré que les inhibiteurs de l’EGFR donnés en

combinaison avec des inhibiteurs de PI3K sont plus efficaces qu’utilisés seuls (Fan et al., 2007).

Les récepteurs ErbB ne sont pas les seules protéines à être ciblées, les recherches concernant

les protéines qui appartiennent aux voies de signalisation des MAPK (les protéines Ras, Raf et

MEK) et des PI3K (les protéines PI3K, AKT, PTEN) sont également très actives.

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Résultats expérimentaux

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Résultats Expérimentaux

Rôle conditionnel de PI3K dans l’activation de la voie Ras/MAPK

en fonction du mode de recrutement du module Gab1/SHP2

I- Introduction

D’après certaines données bibliographiques, basées sur de récentes études, il existe des

connections entre les voies Ras/MAPK et la voie PI3K, cependant le rôle de la PI3K dans

l’activation des MAPK reste actuellement assez controversé. En effet, de nombreuses études

utilisant des inhibiteurs spécifiques de la PI3K, comme par exemple le LY294002 et la wortmanine,

ont démontré, dans certains types cellulaires stimulés par un grand nombre d’agonistes,

l’implication de la PI3K dans l’activation des ERK1/2 (Wandzioch et al 2004 ; Duckworth BC et al

1997 ; Wennstrom et al 1999).

Il apparaît cependant que selon le type cellulaire ou les différentes conditions d’activation dues

à la nature du ligand de l’EGFR, la PI3K intervient ou non dans l’activation de la voie Ras/MAPK

(Croos et al 1994 ; Welsh et al 1994 ; Nakamura et al 1996 ; Scheid et al 1996). En effet, certaines

études ont montré que la PI3K est nécessaire pour l’activation de ERK1/2 dans le cas d’une faible

expression de RTK à la surface cellulaire ou lorsque les cellules sont stimulées par de faibles doses

de facteur de croissance. Au contraire, il a été montré dans des cellules exprimant abondamment

d’une part le récepteur à la surface cellulaire et d’autre part stimulées par de fortes doses de ligand,

que la PI3K ne devient plus nécessaire dans l’activation de ERK1/2 (Duckworth BC et al 1997 ;

Wennstrom et al 1999). Ceci suggère donc qu’un mécanisme compensatoire dépendant de la PI3K

est capable d’engendrer une pleine activation de ERK1/2 lors de stimulation de faible intensité.

Des travaux antérieurs effectués au laboratoire ont permis de démontrer qu’une voie

dépendante de la PI3K impliquant la protéine adaptatrice Gab1 et la protéine phosphatase SHP2 est

nécessaire pour l’activation de la voie Ras/MAPK dans une lignée cellulaire d’origine épithéliale,

les cellules Vero stimulées par de faible ou de forte dose d’EGF (Yart et al 2001). Au vu de ces

résultats, nous nous sommes demandés si d’autres types cellulaires utilisent la PI3K pour activer

pleinement la voie Ras/MAPK. Le but de ce travail a donc consisté à identifier dans quelles

conditions la PI3K participe à l’activation de ERK1/2 et de déterminer le rôle de la protéine

adaptatrice Gab1, et de son partenaire la protéine phosphatase SHP2 dans cette activation. Ainsi,

afin de répondre à ces questions, nous avons dans un premier temps utilisé comme modèles

cellulaires deux lignées d’origine épithéliale assez proche (des cellules de rein de singe, les Vero et

des cellules embryonnaires de reins humains, les HEK293). Ensuite, nous avons voulu savoir si les

mêmes conditions d’activation de la voie Ras/MAPK étaient retrouvées dans deux lignées de

glioblastomes (les U87MG et les U251MG) contenant des quantités variables d’EGFR.

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II- Résultats obtenus

Signal strength dictates phosphoinisitide-3-kinase contribution to Ras/ Extracellular Signal-

Regulated Kinase 1 and 2 activation via differential Gab1/Shp2 recruitment: consequences for

resistance to epidermal growth factor receptor inhibition.

Sampaio C., Dance M., Montagner A., Edouard T., Malet N., Perret B., Salles J.P., and Raynal P.

Mol Cell Biol, 2008, 587-600

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5 50 _ 5 50_ WT Y627F ΔPH WT ΔGrb2

5_ 5 50_ 5 50 _EGF (ng/ml) Gab1-

pERK1-Myc-His

Gab1-Myc

Gab1-Flag

ERK1-Myc-His

LEGEND OF SUPPLEMENTAL FIGURE S1 HEK293 cells were cotransfected with plasmids encoding His-Myc-tagged ERK1 and the following Myc-tagged Gab1 constructs: wild-type (WT) or mutated on its Shp2 binding site (Y627F) or deleted of its PH domain (∆PH), Flag-tagged Gab1 constructs: wild-type (WT) or mutated on its Grb2-binding sites (∆Grb2), as indicated. After stimulation with EGF (5 or 50 ng/ml) when indicated, cells were lysed and processed for His-tag affinity precipitation followed by anti-pERK1-2 immunoblotting. The corresponding lysates were then subjected to anti-Myc or anti-Flag immunoblotting to control the expression level of each construct.

Sampaio et al. Supplemental Figure S1

105


III- Conclusion

Dans cette étude, nous avons essayé de comprendre par l’utilisation de différentes méthodes

comment deux lignées cellulaires d’origine épithéliale assez proche (les cellules Vero et les cellules

HEK293) pouvaient présenter des différences de réponse cellulaire concernant la dépendance de la

voie Ras/MAPK vis-à-vis de la PI3K. Nous avons montré que les différences observées sont liées

au mode de recrutement du module Gab1/SHP2 auprès du récepteur, selon l’intensité du signal.

Lorsque beaucoup de molécules d’EGFR sont mobilisées ou lors de stimulation de forte intensité, le

module Gab1/SHP2 est recruté par l’intermédiaire de la protéine adaptatrice Grb2. Cependant,

lorsque peu de molécules d’EGFR sont mobilisées ou lors de stimulation de faible intensité, le

module Gab1/SHP2 est recruté grâce au domaine PH de Gab1, ayant une affinité pour les produits

de PI3K, permettant ainsi l’activation efficace des MAPK, rendant alors l’activation de la voie

Ras/MAPK dépendante de la PI3K.

PIP3

Forte stimulationFaible stimulation

ou activité résiduelle

PIP3

Forte stimulationFaible stimulation

ou activité résiduelle

Figure 32: Schéma illustrant le rôle conditionnel de PI3K dans l’activation de la voie

Ras/MAPK en fonction du mode de recrutement du module Gab1/SHP2 (Sampaio et al., 2008).

De plus, dans ces deux lignées cellulaires, par différentes approches, nous avons réussi à

créer une dépendance ou non de l’activation de la voie Ras/MAPK vis-à-vis de la PI3K. Ainsi, en

diminuant l’expression de Grb2 ou en inhibant l’activité de l’EGFR dans les cellules HEK293,

l’activation de la voie Ras/MAPK devient dépendante de la PI3K, par conséquent le recrutement du

module Gab1/SHP2 se fait par son domaine PH. Au contraire, lorsque le récepteur de l’EGF est

surexprimé dans les cellules Vero, l’activation de la voie Ras/MAPK ne dépend plus de la PI3K lors

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de stimulation de forte intensité, par conséquent le recrutement du module Gab1/SHP2 se fait par

l’intermédiaire de la protéine Grb2.

Nous avons démontré par conséquent que le module Gab1/SHP2 intervient dans l’activation

de la voie Ras/MAPK lors de stimulation de faible et de forte intensité, mais la seule différence

observée provient du mode de recrutement du module Gab1/SHP2. Nous avons également montré

que le module Gab1/SHP2 n’est pas redondant avec la voie canonique faisant intervenir le module

Grb2/Sos.

Dans la dernière partie de ce travail, les résultats obtenus avec les lignées de glioblastomes

suggèrent que le mécanisme de recrutement de Gab1 par son domaine PH est également utilisé dans

des cellules tumorales présentant des résistances aux inhibiteurs de l’EGFR afin d’activer

efficacement la voie des MAPK.

Nous avons montré que l’activation de la voie MAPK est indépendante de la PI3K dans une

lignée de glioblastome surexprimant l’EGFR (U251-MG). Lorsque cette lignée est traitée par un

inhibiteur de l’EGFR, la phosphorylation de l’EGFR est bien diminuée mais la voie des MAPK est

activée. Ces cellules acquièrent donc une résistance aux inhibiteurs de l’EGFR. Lorsque ces cellules

ont été traitées à la fois par des inhibiteurs de la PI3K et des inhibiteurs de l’EGFR, la voie des

MAPK ainsi que le recrutement du module Gab1/SHP2 ont été inhibés. De tels effets ne sont pas

observés lorsque les inhibiteurs sont utilisés séparément.

Par conséquent, nous pouvons donc dire que l’activation résiduelle de l’EGFR semble être

suffisante pour favoriser l’activation de la voie des MAPK. Ce qui suggère donc que lors de

l’inhibition de l’EGFR, les cellules tumorales résistantes aux inhibiteurs de l’EGFR mettent en

place un mécanisme de recrutement du module Gab1/SHP2 dépendant de la PI3K. En effet, la

diminution de la phosphorylation de l’EGFR due aux inhibiteurs de l’EGFR va restreindre le

recrutement de Gab1 auprès du récepteur par l’intermédiaire de Grb2. Par conséquent, le

recrutement de Gab1 va se faire par son domaine PH, domaine d’interaction avec le PIP3. Le

recrutement de Gab1/SHP2 et l’activation de la voie des MAPK deviennent alors tout les deux

dépendants de la PI3K. On se retrouve alors dans des conditions de faible stimulation. Dans ce cas

précis, les inhibiteurs de la PI3K combinés aux inhibiteurs de l’EGFR vont permettre d’inhiber

efficacement l’activation de la voie des MAPK.

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Perspectives

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Perspectives

PERSPECTIVES

Lors de notre étude, nous avons donc réussi à déterminer le mécanisme expliquant la

dépendance de la voie Ras/MAPK vis-à-vis de la PI3K, impliquant le module Gab1/SHP-2. En

effet, la dépendance de la voie Ras/MAPK vis-à-vis de la PI3K est conditionnée par le mode de

recrutement du module Gab1/SHP2.

Des données cliniques de la littérature ont montré qu’une grande proportion de tumeurs sont

résistantes aux inhibiteurs de l’EGFR (exemple : gefitinib) (Rubin BP et al Lab Invest 2006).

D’après les résultats que nous avons obtenus avec une lignée cellulaire de glioblastomes

(U251MG), nous pouvons penser que les cellules cancéreuses résistantes aux inhibiteurs de l’EGFR

mettent en place une dépendance de la voie MAPK vis-à-vis de la PI3K par le mode de recrutement

de Gab1/SHP2, ce qui pourrait expliquer que l’effet synergique observé lors de l’utilisation

combinée d’inhibiteurs de PI3K avec ceux de l’EGFR inhibent efficacement l’activation de la voie

des MAPK.

Afin de définir le rôle du module Gab1/SHP2 dans les cellules cancéreuses résistantes aux

inhibiteurs de l’EGFR comme par exemple l’Iressa (ou Gefitinib), nous pourrions bloquer l’activité

des différentes protéines composant ce module par l’utilisation d’ARN à interférence ciblant Gab1

ou SHP2, ou soit par des transfections transitoires de mutants dominants négatifs de Gab1 et de

SHP2 ou soit par des infections adénovirales de ces mêmes mutants. Ensuite, nous pourrons

mesurer les conséquences du blocage de l’activité de Gab1 et de SHP2 sur le phénotype tumoral de

ces cellules. Pour cela, nous utiliserons les techniques d’analyse de la prolifération cellulaire par

cytométrie de flux comme par exemple l’incorporation de BrdU ou l’analyse des différentes phases

du cycle cellulaire par l’incorporation d’IP (iodure de propidium). De plus, nous pourrons évaluer le

potentiel tumoral in silico par la technique de croissance en agar mou, et in vivo par l’utilisation de

modèles de xénogreffes de tumeurs sur souris Nude. Nous déterminerons ainsi si le blocage de ces

protéines parvient à lever la résistance des cellules de glioblastomes aux inhibiteurs de l'EGFR.

Dans un deuxième temps, nous pourrons tester l’effet de la double inhibition de l’EGFR et de la

PI3K par l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques de chacune des deux molécules pour tenter de lever

la résistance aux inhibiteurs de l’EGFR. Nous regarderons en particulier l’impact de cette double

inhibition sur l’activation des MAPK qui participe au développement tumoral. Par contre, une étude

a permis d’identifier des mutations activatrices situées dans le domaine tyrosine kinase de l’EGFR

(telles que L858R et delL747-P753insS) dans des cellules du cancer du poumon non à petites

cellules. Ces mutations provoquent une sensibilité au gefitinib.(Lynch et al., 2004). Ainsi, en

réponse à l’EGF, l’activation des mutants de l’EGFR est augmentée comparée à celle de l’EGFR

109

Perspectives

non muté. L’activation de l’EGFR a été quantifiée en mesurant la phosphorylation de la tyrosine

1068, qui est un site de liaison de Grb2. Dans cette étude, ces mutations vont permettre une

augmentation des sites de liaison de Grb2, par conséquent le module Gab1/SHP2 va être recruté par

l’intermédiaire de Grb2. Par conséquent, l’activation des MAPK ne va pas dépendre de la PI3K, ce

qui peut alors expliquer la sensibilité observée au gefitinib. Nous pourrons alors transfecter ces

mutants de l’EGFR dans des lignées cellulaires ou utiliser des cellules résistantes aux inhibiteurs de

l’EGFR afin d’étudier le mode de recrutement du module Gab1/SHP2 et par conséquent regarder

s’il y a dépendance ou non de la PI3K dans l’activation Ras/MAPK. L’étude du mode de

recrutement du module Gab1/SHP2 permettrait alors d’expliquer la résistance et l’efficacité des

inhibiteurs de l’EGFR.

Dans le cas où notre modèle mécanistique serait retrouvé sur le plan physiopathologique, nos

résultats présenteraient alors un intérêt clinique probable afin de mieux cibler l’efficacité des

traitements. Il serait alors intéressant de procéder au criblage de cellules cancéreuses, présentant

différentes mutations de l’EGFR, et de vérifier si le mécanisme de recrutement du module

Gab1/SHP2 est extrapolable à ces différents types cellulaires cancéreux (comme par exemple des

cellules des cancers colorectaux, des cellules de cancers du poumon non à petites cellules, des

cellules de glioblastomes, des cellules de cancer du sein, les cellules des cancers ovariens, …).

Ainsi, dans les cellules cancéreuses où l’activation résiduelle des MAPK va dépendre de la PI3K,

une double inhibition par des inhibiteurs de PI3K et de l’EGFR sera nécessaire pour permettre la

levée de la résistance aux inhibiteurs de l’EGFR. D’après une étude récente, un nouvel inhibiteur de

la PI3K, le PI103, a été découvert (Raynaud FI et al., 2007).Cette étude montre que cet inhibiteur

spécifique de la PI3K ne provoque aucune toxicité dans le modèle de xénogreffes de cancers

ovariens et du sein, contrairement au LY294002 et à la wortmaninn. Le PI103 possède également

un fort potentiel anti-angiogénique permettant ainsi de diminuer la progression tumorale (Raynaud

FI et al., 2007). Il serait donc intéressant d’utiliser le PI103 en combinaison avec le gefitinib en

traitement thérapeutique dans les cancers résistants aux inhibiteurs de l’EGFR.

Par conséquent, la mise en jeu du module Gab1/SHP2 par son mode de recrutement dans

l’activation de la voie Ras/MAPK permettrait alors d’envisager l’élaboration d’une stratégie anti-

cancéreuse. Il serait alors possible d’affecter spécifiquement les cellules tumorales en ciblant le

recrutement de la protéine à la membrane sans produire de toxicité vis-à-vis des cellules saines qui

n’utilisent pas ce module de signalisation. Nous pourrions alors transfecter dans des cellules

cancéreuses du SiRNA Gab1 humain permettant de supprimer l’expression de Gab1 endogène, ou

d’utiliser des adénovirus exprimant des mutants dominants négatifs de Gab. Nous devrions alors

observer une inhibition de l’activation de la voie Ras/MAPK, ce qui devrait entraîner une

110

Perspectives

diminution de la prolifération tumorale. Donc, Gab1 pourrait devenir une cible thérapeutique

intéressante.

La compréhension, d'un point de vue fondamental, de ces nouveaux mécanismes d'activation

de la voie Ras/MAPK apparaît comme indispensable afin d’identifier de nouvelles cibles

potentielles aboutissant à une pharmacologie anti-tumorale. Il serait intéressant de pouvoir

caractériser le degré d'implication des protéines Gab1 et SHP2 dans différentes formes de cancers

et de développer des inhibiteurs spécifiques de ces différentes protéines.

111

Références Bibliographiques

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