pathogénèse microbienne chapitre 1 les déterminants du pouvoir pathogène (et donc de la maladie...

Pathognse microbienne Chapitre 1 Les dterminants du pouvoir pathogne (et donc de la maladie infectieuse) 1

1 Le pouvoir invasif de lagent pathogne

1-1- Transmissibilit de lagent pathogne

Premire tape pour quune maladie infectieuse due une bactrie exogne se dveloppe : transport de lagent pathogne vers lhte - soit par contact direct dun hte un autre (toux, ternuement, contact direct dun corps lautre) - soit par transmission indirecte : * dispersion des agents par un hte infect * dpt des agents sur diverses surfaces * transmission ensuite lhte via eau, nourriture, objets, vecteurs anims 4

Pntration dans lorganisme 5 3 grandes voies de pntration : - voie arienne - voie digestive - voie cutano-muqueuse (dont la voie sexuelle)

1-2- Fixation de lagent pathogne

7 Ladhsion

Intervention dans ladhsion : Constituants superficiels de la bactrie (adhsines) Rcepteurs cellulaires de lhte 8

1-2-1 Rle de ladhsion

10 Attachement du microorganisme aux muqueuses digestive, respiratoire et urognitale afin dempcher son expulsion mcanique (assure notamment par toux, battement des cils, pristaltisme intestinal). Etape dpendant de la capacit du pathogne concurrencer avec succs la microflore normale de lhte pour les lments nutritifs

1-2-2- Mcanisme de ladhsion

15 - Phase 1 : interaction lectrostatique ou type forces de Van des Waals (quand la distance est de lordre de 10 nm) entre certains constituants superficiels (du microorganisme et des constituants de la membrane plasmique de la cellule hte (= phase non spcifique) - Phase 2 : interaction ( moins de 1 nm) entre fimbriae, pili, polyosides capsulaires et rcepteurs prsents sur certaines cellules de lhte (= phase spcifique)

Possession par Escherichia coli dadhsines pour les cellules urinaires : pili PapG (associs la pylonphrite, pili dont il existe plusieurs allles). Diffrenciation des rcepteurs que d'un ou deux rsidus osidiques : PapG reconnat au minimum un digalactoside li un lipide de la membrane cellulaire. Chaque pilus PapG possde un rcepteur spcifique : le type III li la vessie, le II aux circuits d'excrtion rnale. 16

1-2-2-1 Structures de la cellule hte mises en jeu Phospholipides, cholestrol, glycoprotine, rcepteurs spcifiques, protines transmembranaires, molcules de la matrice extracellulaire 17 Si spcificit dans la reconnaissance, existence dun tropisme cellulaire Exemple : E coli possde le pili PAP reconnaissant spcifiquement un glycolipide prsent la surface des cellules pithliales du tractus urinaire Si spcificit dans la reconnaissance, existence dun tropisme cellulaire Exemple : E coli possde le pili PAP reconnaissant spcifiquement un glycolipide prsent la surface des cellules pithliales du tractus urinaire

18 1-2-2-2- Structures bactriennes responsables 2 groupes - Pili ou fimbriae Fins filaments protiques (polymrisation dune sous- unit protique : la piline) disposs tout autour de la bactrie et termins par une adhsine capable de se fixer de faon spcifique un rcepteur cellulaire - Adhsines non fimbriales Protines ou lipopolyosides de la paroi de la bactrie, de la capsule permettant un contact serr entre la bactrie et la cellule

19 Adhsines fimbriales Adhsines afimbriales Protines ou LPS de la membrane externe chez les bactries Gram ngatif Protines de paroi chez les bactries Gram positif Acides teichoques, lipoteichoques Protines ancres dans la paroi Protines liant la fibronectine (FnbA, FnbB) Protines liant le fibrinogne (clumping factor ClfA, ClfB)

Lien des adhsines non fimbriales avec cellule hte - soit par fixation directe au rcepteur cellulaire - soit par fixation des molcules de la matrice extracellulaire compose de molcules interagissant entre elles et avec les cellules avoisinantes (collagne, lastine, fibrinonectine 20

Collagne, lastine, fibinonectine = pont entre bactries et cellules 21

22 Bilan : structures bactriennes responsables de ladhsion - Fimbriae (appendices protiques fibrillaires de la surface de certaines bactries Gram -) - Pili (protines) - Capsule ou glycocalyx (polyosides) - Couche muqueuse (glycoprotine ou mucopolyoside) - Couche S - Acides teichoques et lipoteichoques de la paroi (constituant de la paroi des Gram +) et LPS de la paroi des Gram - - Hmagglutinine filamenteuse (facilite ladhrence aux rythrocytes) - Lectine (protine)

Les structures en jeu dans ladhsion Structure mise en jeu Nature de la molcule Exemple de bactrieSurface de lhte Paroi Acide lipotechoque LPS Enzymes Gly3PDH Staphylococcus aureus Salmonella Typhimurium Streptococcus pyogenes Cellule pithliale Macrophage MEC/cellules du pharynx Capsule/ Glycocalyx polysaccharide Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Cellules pithliales respiratoires Matriel biologique Fimbriae protineStreptococcus parasanguis Escherichia coli enteropathogne Protines salivaires Flagelle protinesPseudomonas aeruginosa Cellules pithliales Couche membranaire protineVibrio choleraeCellules pithliales 23

24 Exemple de Staphylococcus aureus Plus dune dizaine dadhsines identifies, dont : Protine A (protine paritale se liant au facteur de Willebrand et au fragment Fc des Ig entranant une activation polyclonale des lymphocytes B) Protine de liaison au collagne de type I, II et IV Protine de liaison la fibrinonectine (adhrence des S aureus aux caillots plasmatiques et aux biomatriaux ayant un contact prolong avec le sang) Protine de liaison au fibrinogne : clumping factor (ClfA, ClfB) provoquant lagrgation des bactries en prsence de plasma

1-2-3- Consquences de ladhsion

26 High power scanning electron micrograph of EPEC displaying localized adherence to HEp-2 cells. Note the elongated microvilli to which the bacteria appear to attach Scanning electron micrograph showing microcolonies of EPEC displaying the characteristic localized adherence pattern of adherence to HEp-2 cells.

27 Transmission electron micrograph showing the attaching and effacing effect. EPEC have effaced microvilli and are intimately attached to the surface of the HEp-2 cell which responds to the bacteria by forming the typical cup shaped pedestals.

28 Adhsion aux cellules htes Pas deffet apparent Signal, rgulation de molcules dadhsion intercellulaire Helicobacter pilori E. coli Chez la bactrie : Libration de toxines et augmentation de l'expression des gnes de virulence Invasion Salmonella spp Shigella spp Listeria Legionella Altrations morphologiques EPEC Helicobacter pilori Mort cellulaire, apoptose Mycoplasma spp, Yersinia enterolitica, Helicobacter pil ori Pertes d'eau et d'electrolytes Vibrio cholerae EPEC Induction de cytokines Helicobacter pilori En rouge : chez la bactrie En violet : chez la cellule hte En rouge : chez la bactrie En violet : chez la cellule hte

CONSQUENCES CHEZ LA BACTRIE 29

a/ Activation de gnes de virulence ncessaires la suite des effets pathognes Exemple : cas de Yersinia pseudotuberculosis Existence dun locus chromosomique inv codant pour une protine invasine se liant un rcepteur des cellules pithliales, des macrophages et des lymphocytes T 30

Prsence de diffrents gnes Yop plasmidiques chez la bactrie codant pour des protines membranaires altrant le cytosquelette des cellules htes - gne Yop A codant pour une protine Yop A (Yad A) ayant une activit dadhsine, permettant la fixation aux intgrines prsentes sur les cellules htes (notamment les macrophages) 31

- gne Yop H codant pour une protine Yop H ayant une activit phosphatase, pouvant provoquer la dphosphorylation des protines de lhte, do blocage de la phagocytose 32

- gne YoT codant pour une protine Yop T induisant un effet cytotoxique sur les cellules de lhte (dont les macrophages) en inhibant ses GTP ases, do activit antiphagocytaire 33

- gne Yop E codant pour une protine Yop E provoquant linactivation de lactivit des GTP ases de la cellule hte, do dpolymrisation des filaments dactine, dsorganisation du cytosquelette et inhibition de la phagocytose 34

Consquence de ladhsion : 1 er temps : induction de la production du systme de scrtion de type III (Yop B et D) 2 me temps : libration intracellulaire (injection) des protines Yop E, Yop H, Yop T 3 me temps : effets nfastes sur la cellule. 35

Suite ce contact de la bactrie avec une cellule hte, activation des systmes de scrtion de type III 36

37 www.biozentrum.unibas.ch/.../html/cornelis.html

b/ Adaptation au nouvel environnement Adhsion peut entraner selon les bactries : - soit une limitation de la croissance, - soit une augmentation de la croissance. 38

CONSQUENCES CHEZ LA CELLULE HTE 39

a/ altration de la morphologie : formation du pidestal et destruction des microvillosits par EPEC 40 http://www.bms.ed.ac.uk/research/others/smaciver/Bacter4.gif

a/ altration de la morphologie : formation du pidestal et destruction des microvillosits par EPEC 41 1- Gnes responsables : -Gnes esp codant les protines Esp (EPEC secreting protein) permettant la translocation de la protine Tir (Translocating intim receptor) -Gne Tir codant pour la protine Tir -Gne eae codant pour lintimine. 1- Gnes responsables : -Gnes esp codant les protines Esp (EPEC secreting protein) permettant la translocation de la protine Tir (Translocating intim receptor) -Gne Tir codant pour la protine Tir -Gne eae codant pour lintimine.

42 2 - Mcanisme

1 er temps : adhsion locale des EPEC la surface des cellules pithliales par leurs pili (reconnaissance par des lectines du pilus de rsidus osidiques ports par les glycolipides ou glycoprotines membranaires. 43

2 me temps : scrtion des protines Esp (A et B) induisant la translocation de la protine Tir qui sintgre dans la membrane plasmique et permet lattachement de la bactrie la cellule pithliale par lintimine. 3 me temps : phosphorylation des protines ducytosquelette, flux dinositol triphosphate et de Ca2+ 44

Consquence : rorganisation des protines du cytosquelette avec agglomration des molcules dactine, plus de maintien des villosits effacement des villosits et obtention dune sorte de pidestal form dactine agglomr, d actinine et de myosine la surface de lentrocyte. 45

46 Parfois le pidestal peut se transformer en vritable pseudopode Parfois il peut arriver que la bactrie soit internalise, mais elle reste enferme dans la vacuole

Consquence : - effacement des villosits = une diminution de la surface de la bordure en brosse et donc diminution des enzymes - diminution de labsorption, do perte deau et diarrhes 47

48 http://www.bms.ed.ac.uk/research/others/smaciver/Bacter4.gif Adhsion de lintimine aux entrocytes via la protine Tir : activation de la cellule hte - agglomration des molcules dactine, - plus de maintien des villosits - effacement des villosits et obtention dune sorte de pidestal form dactine agglomr, d actinine et de myosine la surface de lentrocyte. Adhsion de lintimine aux entrocytes via la protine Tir : activation de la cellule hte - agglomration des molcules dactine, - plus de maintien des villosits - effacement des villosits et obtention dune sorte de pidestal form dactine agglomr, d actinine et de myosine la surface de lentrocyte.

b/ modification de lexpression des molcules dadhrence intercellulaire Exemple de Bordetella pertussis Coqueluche : maladie des voies respiratoires strictement humaine et trs contagieuse Transmission de la bactrie expulse par les arosols expulss par lindividu contagieux qui tousse 49

b/ modification de lexpression des molcules dadhrence intercellulaire Exemple de Bordetella pertussis - Interaction grce ses nombreuses adhsines aux cellules cilies du tractus respiratoire et aux cellules phagocytaires. - - Interaction de lhmagglutinine filamenteuse (FHA) lintgrine CR3 des cellules phagocytaires conduisant un dtournement son profit dune voie de signalisation intracellulaire. 50

Beaucoup dagents pathognes peuvent adhrer la surface cellulaire, mais seulement quelques uns pourront pntrer. Pour quelques pathognes, survie et multiplication ncessitent entre dans les cellules auxquelles ils ont adhr. Infection peut : - sarrter la pntration dans la cellule (Shigella) - stendre plus ou moins loin dans lorganisme (Salmonella, Listeria) 51

1-3- Invasion

1-3-1- Mise en vidence exprimentale

Mise en contact de cellules en culture avec suspension de la bactrie tudier. Croissance bactrienne Aprs croissance, lavage puis addition dun antibiotique (gentamycine) ne diffusant pas dans les cellules Lavage puis lyse des cellules et talement du lysat sur un milieu slectif pour les bactries tudies 54 Protection des bactries intracellulaires Dnombrement des bactries invasives

3 Types de pathognes : - croissance intracellulaire obligatoire : Chlamydiae, Brucella, Legionella, Rickettsia, Mycobacterium... - croissance intracellulaire facultative : S. aureus, S. typhi, Listeria, - croissance extracellulaire (avec parfois une pntration trs transitoire) : E. coli, P. aeruginosa, Klebsiella, S. pneumoniae 55

Invasion obligatoire pour les bactries intracellulaires (Mycobacterium, Rickettsia, Chlamydia, Legionella, Brucella) Invasion facultative pour certaines bactries (Listeria, Salmonella, Shigella, Yersinia) Invasion trs transitoire pour E coli, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae) afin datteindre le tissu sous pithlial 56

Soit la bactrie provoque sa propre internalisation (mcanisme souvent mal connu). Dans les cas connus : - Implication de protines de la paroi bactrienne (invasines) et de rcepteurs cellulaires transmembranaires (intgrines) - Remaniement du cytosquelette cellulaire (actine) - Apparition de pseudopodes - chappement au phagolysosome ou survie lintrieur Ex. Shigella, Listeria monocytogenes Passage de cellules en cellules (Listeria), soit la bactrie arrive se mouvoir travers les tissus 57

1-3-2- Mcanismes dinvasion des cellules non phagocytaires

Mcanismes dinvasion pas toujours bien connus Description de 2 mcanismes principaux : Mcanisme Zipper : endocytose suite une interaction entre des protines bactriennes de surface et des rcepteurs de surface de la cellule hte ( Yersinia et Listeria) Mcanisme Trigger : activation de lendocytose par des effecteurs bactriens injects dans la cellule hte (scrtion de type III) (Salmonell, Shigella) 59

1-3-2-1 Mcanisme Trigger

- Interaction fimbriae de type I et protine (invasome) - Action sur le cytosquelette par des protines bactriennes qui sont directement injectes dans la cellule hte via un systme de scrtion de type III(gnes codant pour le systme de scrtion = gnes chromosomiques ou plasmidiques) selon : -Formation dextrusions de la membrane cellulaire de lhte, Augmentation du Ca2+ Rarrangement actif des filaments dactine, do mission de pseudopodes gants Internalisation de la bactrie dans une vacuole 61 Cercles en vert = actine

62 SopE/E2 et SopB vont induire lactivation du facteur RhoGTPase (Rac, Cdc42) pour conduire le remodelage de lactine-F en utilisant la machinerie Cre(Arp2/3). -SipA va induire la polymerisation et le regroupement de lActine-F, SipA provoque la dissociation de lactine-F en inhibant le facteur ADF/cofilin et gelsolin. -SipC a la mme fonction que SipA -en internalisant SopB gnre phosphatidyl inositol 3 phosphate (PI3P) pour se mettre sur la macropinocytose crant plus despace pour la Salmonelle (SCVs). SopE/E2 et SopB vont induire lactivation du facteur RhoGTPase (Rac, Cdc42) pour conduire le remodelage de lactine-F en utilisant la machinerie Cre(Arp2/3). -SipA va induire la polymerisation et le regroupement de lActine-F, SipA provoque la dissociation de lactine-F en inhibant le facteur ADF/cofilin et gelsolin. -SipC a la mme fonction que SipA -en internalisant SopB gnre phosphatidyl inositol 3 phosphate (PI3P) pour se mettre sur la macropinocytose crant plus despace pour la Salmonelle (SCVs).

1-3-2-2- Mcanisme Zipper

Mcanisme de type Zipper Interaction directe entre une protine de la surface bactrienne et un rcepteur de la cellule hte. Ex : Listeria : interaction entre linternaline A bactrienne avec E- cadhrine des cellules pithliales ou entre linternaline B bactrienne et le rcepteur Met des hpatocytes Formation dun nombre important de points de contact avant invagination(fermeture clair) responsables dune cascade de signaux activant les composants du cytosquelette 64

Mcanisme de type Zipper (suite) Fermeture de la vacuole dendocytose par dpolymrisation de lactine 66

Quelque soit le mcanisme dinvasion, Interactions entre la bactrie et la cellule hte Rarrangement du cytosquelette dactine de la cellule par induction des cascades de signal cellulaire responsable de la formation de la vsicule dendocytose. 67

1-3-3- Devenir des bactries dans les cellules envahies

69 Les bactries pathognes peuvent envahir les cellules non phagocytaires comme les cellules pithliales par deux types de mcanismes: zipper et trigger . Aprs son internalisation, la bactrie peut survivre lintrieur de la vacuole dendocytose (Salmonella, Legionella) ou chapper dans le cytoplasme cellulaire (Shigella, Listeria)

1-3-3-1- chappement dans le cytoplasme cellulaire

71 Aprs entre dans la cellule, lyse de la membrane de la vacuole par la listriolysine Bactries libres dans le cytoplasme cellulaire Interaction de la bactrie avec le cytosquelette et polymrisation de lactine cellulaire Dplacement de la bactrie qui va pouvoir aller envahir dautres cellules et essaimer dans tout lorganisme Cas des Listeria

1-3-3-2- Survie et multiplication dans la vacuole (ex : Legionella)

Facteur cl du pouvoir pathogne de Legionella pneumophila provient de sa capacit survivre et se multiplier dans les macrophages et les monocytes humains. 75

Deux loci distincts participent ce processus : - le locus dot (defective organelle trafficking), intervenant dans trois processus cruciaux pour le pouvoir invasif de la bactrie - le locus icm (intracellular multiplication), ncessaire pour la multiplication bactrienne lintrieur du phagosome et intervenant galement dans la lyse du macrophage. Lensemble de ces gnes va permettre la survie et la multiplication de L. pneumophila dans le phagosome en suivant la squence suivante 76

Rle des produits du locus dot (defective organelle trafficking) pour le pouvoir invasif de la bactrie : * inhibition de la fusion phagosome- lysosome, * recrutement et fusion des organites cellulaires avec le phagosome, * multiplication intracellulaire de L. pneumophila 77

78 Phagocytose par enroulement Phagosome sentourant de vsicules Phagosome sentourant de ribosomes Pas de fusion des phagosomes avec les lysosomes Multiplication des bactries dans le phagosome, augmentation de volume jusqu sa rupture librant de nombreuse bactries

Internalisation : moyen de dissmination pour les bactries pathognes mais aussi un moyen pour chapper aux contraintes environnementales comme les dfenses de la cellule hte et le milieu qui lhberge souvent (acidit...) 80

1-3-4- Mcanismes dinvasion extracellulaire

Production de facteurs de virulence favorisant linvasion des tissus sans passer par une tape intracellulaire : les collagnases : ex Clostridium spp qui dgrade le collagne du tissu conjonctif llastase qui hydrolyse la laminine associe aux membranes basales ex : Pseudomonas aeruginosa. la hyalurodinase des Streptocoques et Staphylocoques dtruisant lacide hyaluronique la streptokinase : Streptocoques se fixant au plasminogne, il active la production de plasmine digrant ainsi la fibrine des caillots. 82

1-4- Colonisation et maintien dans lorganisme

1-4-1- Facteurs dacquisition de la nourriture

Ncessit de trouver chez lhte un environnement appropri : lments nutritifs, pH, temprature, potentiel rdox Dveloppement par beaucoup dagents de mcanismes labors de collecte des lments nutritifs (exemple bien connu : mcanisme dacquisition du fer car carence en fer (

Mcanisme dacquisition du fer Si prsence directe dions Fe2+ dans le milieu : * diffusion du Fe2+ travers les porines de ME * Prise en charge par des transporteurs pour traverser la MI Exemple dadaptation bactrienne aux organes coloniss : systme dvelopp par Salmonella enterica et Helicobacter pylori, pathognes respectivement de lintestin et de lestomac, organes dans lesquels le fer est sous forme Fe2+ 86

Si le fer est squestr -Fixation directe du Fe III de la lactoferrine, de la transferrine ou de lhmoglobine grce des rcepteurs spcifiques Ex. TbpA/tbpB, LbpA/LbpB et HpuA/HpuB chez Neisseria spp. -Scrtion de sidrophores (chlateurs des ions Fe3+) ou dhmophores inductibles en milieu et de rcepteur de surface permettant lentre dans la cellule Ex. arobactine chez E. coli, Shigella et Salmonella pyoverdine et pyochline chez P. aeruginosa aurochline chez S. aureus 87

88 Fixation directe du Fe III squestr Rcepteurs diffrents

89 Fixation indirecte via sidrophore et rcepteur

90 Fixation indirecte via hmophore et rcepteur

1-4-2- Mcanismes dchappement au systme immunitaire

92 Echappement aux dfenses immunes de lhte Inhibition de la phagocytose Survie dans les phagocytes Lyse des phagocytes Tolrance Variation antignique Inhibition de la prsentation Ag Inhibition de lopsonisaation Inhibition ou stimulation cytokines Inhibition de lactivation du complment Activation inapproprie des C T Induction apoptose SINS Immunit inne SIS ( Immunit adaptative )

1-4-2-1- Rsistance linternalisation par les phagocytes

Exemples : Capsule de Streptococcus pneumoniae Protines effectrices Yop scrtes par Yersinia aprs ladhsion Coagulase produite par Staphylococcus aureus (caillot sanguin autour de la bactrie lui permettant dchapper la phagocytose) Protine A de Staphylococcus aureus fixant les Ig par leur fragment Fc et empchant ainsi la phagocytose 94

1-4-2-2- Survie et multiplication dans les phagocytes

Exemples clatement du phagosome (ex : production de listriolysine O lysant la membrane du phagosome) Rsistance aux enzymes lysosomiales et aux peroxydes par production de catalase et de superoxyde dismutase (Staphylococcus aureus Listeria, Rickettsie, ) Blocage de la fusion du phagosome avec les lysosomes (Mycobacterium, Legionella, Chlamydiae ) 96

1-4-2-3- Induction de lapoptose

Apoptose: en 1 er lieu : perte de contact de la cellule en apoptose avec les cellules environnantes En 2 me lieu : diminution du volume cellulaire par condensation du cytoplasme et du noyau. Au niveau des organites, cest la mitochondrie qui subit le plus de modifications : relargage du cytochrome c dans le cytoplasme, diminution du potentiel membranaire et adressage de protines pro- ou anti-apoptotiques la membrane mitochondriale. La condensation du noyau et de la chromatine aboutit la fragmentation de lADN en fragments de 150-200 paires de bases. De plus modification de la membrane 98

Aptitude dun grand nombre de bactries causer l'apoptose de leurs cellules cibles et ainsi : - de supprimer des cellules du systme immunitaire inn comme les macrophages, afin de maintenir leur survie dans le tissu infect - de dmarrer un processus inflammatoire. 99

Exemple : cas de Shigella, bactrie ayant la capacit de programmer la mort du macrophage qu'elle infecte : - mort apoptotique de la cellule par activation de caspase-1, une cystine protase capable d'activer l'IL-1 et de causer lapoptose 100

1-4-2-4- chappement la rponse immunitaire

Exemples - Production de protases des Ig A par Neisseria et Streptococcus - Masquage des Ag bactriens par liaison des protines de lhte (fibrinonectine, collagne, hparine, transferrine) : Staphylococcus, Neisseria - Fixation des Ig G par leur fragment Fc empchant leur rle dopsonisation - Variation antignique des structures de surface de la bactrie (certaines espces de Salmonella et gonocoques) - Mimtisme molculaire - Inhibition d e la production dAc (ex : Pseudomonas aeruginosa stimulant les LT suppresseurs inhibant les LB 102

Mcanisme de variation molculaire de la piline des gonocoques 103 Recombinaison homologue entre un gne silencieux pilS et un gne actif pilE

2 Le pouvoir toxinogne de lagent pathogne

Toxine (toxicon poison ; premire toxine dcouverte : toxine diphtrique par Roux et Yersin en 1888 ) Bibliographie : chap 34 de Prescott, Roitt et Bacterial Disease mechanism 105

2-1- Quelques gnralits

2-1-1- Dfinition

Toute substance protique ou peptidique simple ou complexe (glycoprotines, glycopeptides, lipoprotines, lipopeptides), ainsi que macromolcules lipopolyosidiques dorigine bactrienne, capables des doses trs faibles (gnralement comprises entre 10 -2 et 10 -6 mg) de provoquer la mort dun organisme vivant (mammifres le plus souvent), ou dinduire in vivo ou in vitro des dsordres pathologiques irrversibles ou rversibles au niveau dorganes, de tissus, de cellules ou de liquides biologiques dun tel organisme. 108

Si troubles dus uniquement la toxine (en labsence mme de la bactrie) : intoxination Si troubles dus la bactrie + toxine : toxi- infection 109

2-1-2- Implication des toxines dans les maladies infectieuses

2-1-2-1- Critres du rle effectif de la toxine

Production effective de toxines par la bactrie infectante Reproduction dun ou de plusieurs des effets biologiques ou symptmes majeurs observs au cours de la maladie lors de linjection de la toxine ou des toxines Reproduction par la ou les toxine(s) in vitro, au contact dorganes, de tissus ou de cellules isoles, de certaines manifestations physiopathologiques, biochimiques ou mtaboliques observes chez lhte infect (par exemple : hmolyse, lsions histologiques, production deffecteurs impliqus dans le syndrome clinique....) 112

Capacit de la bactrie toxinogne infectante pouvoir, pour certains syndromes, provoquer les manifestations de la maladie partir dun foyer localis, sans multiplication excessive ou extensive, les organes, tissus ou cellules cibles se trouvant distance du foyer infectieux. La bactrimie doit, au site daction de la toxine, tre nulle ou non significative Compatibilit de la concentration effective en toxines dans lorganisme de lhte infect et le (ou les) site(s) daction de la avec les donnes de la maladie naturelle. 113

2-1-2-2- Quelques pathologies avec rle essentiel (sinon unique) des toxines

115 Exemples de pathologies dans lesquelles la (ou les) toxine(s) produite(s) joue(nt) un rle essentiel

2-1-3- Classification des toxines

2-1-3-1- Classification topologique de Raynaud et Alouf (classification plutt obsolte)

Toxines associes en permanence la bactrie : - groupe comprenant les toxines intracytoplasmiques, les toxines membranaires et les toxines paritale - groupe regroupant environ 30 % des toxines bactriennes caractrises ce jour ; Toxines extracellulaires : - groupe comprenant les exotoxines vraies et celui des toxines localisation mixte intra et extracellulaire, - groupe regroupant environ 70 % des toxines bactriennes caractrises ce jour. 118

2-1-3-2- Classification biochimique

120 Toxines protiques Toxines lipopolyosidiques (LPS) de la membrane externe de la paroi des bactries Gram -

2-1-3-3- Classification pharmacologique (classification en fonction du tropisme ou de la symptomatologie anatomo-clinique observe)

Entrotoxines, Leucocidines, Hmolysines, Dermotoxines, Neurotoxines, Nphrotoxines, Hpatotoxines, Toxines immunocytotropes, Cardiotoxines... Remarque : toxine pantrope = toxine agissant sur plusieurs cellules cibles. 122

2-1-3-4- Classification selon le mode daction cellulaire sur la cellule cible

Toxines agissant depuis la surface cellulaire - Toxines activant des rcepteurs membranaires de la cellule cible ; - Toxines formant des pores travers la membrane de la cellule cible ; Toxines mode d'action intracellulaire - Toxines qui devront traverser la membrane cellulaire (A-B toxine) - Toxines injectes 124

2-2- Les toxines lipopolyosidiques (glucolipidoprotiques)

Constituants de la cellule bactrienne : lipopolyosides de lenveloppe externe Toxines restant attaches la bactrie et libres uniquement lors de sa lyse : endotoxines 127

2-2-1- Structure

131 Lipide A comportant le plus souvent deux oses (glucosamine) portant 2 groupes phosphates lis un nombre variables dAG intgrs dans la paroi

132 Core polyosidique (avec 2 glucides nexistant que chez les bactries endotoxines, certaines plantes et algues (1 heptose et le KDO acide 3-dsoxy-D-manno-2octulosonique))attach au lipide A dans la MI

133 Ag O Longue chane polyosidique, synthtise indpendamment, sattachant au lipide A core quand la synthse est termine, avant insertion dans la ME. UN noyau interne + un noyau externe + chaine O-spcifique compose dune zone rpte 3 8 glucides. Chaine variable selon les espces

2-2-2- Principales caractristiques

135 Action non spcifique : toutes les toxines LPS donnent quasiment les mmes troubles Toxicit une dose souvent importante Thermostable le plus souvent Immunognicit : assez faible (difficile dobtenir des antitoxines) Impossibilit de les transformer en anatoxine (substance ayant perdu son pouvoir toxique, mais ayant conserv son pouvoir immunogne)

2-2-3- Troubles induits

137 Faibles doses : maux de tte, malaises, fivre dans la heure avec max 3 heures, Leucopnie (chute de 40 % des leucocytes) Forts doses : choc septique caractris par : Perturbations vasculaires : vasodilatations, fuite de plasma vers les tissus, hypotension et hypovolmie, retour veineux fortement diminu pouvant tre mortelles Troubles de la coagulation

- Fixation du LPS sur une protine fixatrice : la LBP (LPS binding protein) - Fixation du complexe LPS-LBP sur des rcepteurs spcifiques - rcepteur CD14 (prsent en surface des Macrophages ou sous forme soluble en circulation permettant aux cellules endothliales sans CD14 de rpondre au LPS - rcepteur TLR-4 (Toll-like- receptor) - Scrtion par les macrophages de cytokines proinflammatoires (IL1, IL6, IL8, TNF, PAF) 138

- Activation par les cytokines proinflammatoires de de leurs cellules cibles respectives aprs fixation sur leurs rcepteurs spcifiques - Induction de la production de mdiateurs de linflammation (prostaglandines, leukotrines) et activation des cascades du complment et de la coagulation - Effets physiopathologiques (fivre, hypotension gnralise, CIVD, diarrhe, ventuellement coma et mort) 139

2-3- Les toxines protiques

Groupe trs htrogne par : - leur structure, - leur mode daction, - le type de microorganisme scrteur, - leur site daction, - les troubles induits. 141

2-3-1- Microorganismes producteurs

143 Essentiellement des Gram + Clostridium tetani Clostridium botulinum Corynebacterium diphteriae Staphylococcus aureus Bordetella pertussis Streptococcus Quelques bactries Gram - Vibrio cholerae Shigella dysenteriae Pseudomonas aeruginosa

2-3-2- Principales proprits

Synthtises par des bactries spcifiques (contenant souvent un plasmide ou un prophage porteur du gne de la toxine) Souvent thermolabiles (inactives entre 60C et 80C) avec une exception notable : lentrotoxine staphylococcique Fort pouvoir toxique pour certaines (toxine botulinique par exemple) Induction de troubles spcifiques Fortement immunognes Transformables pour certaines en anatoxines 145

DL50 (rat par voie orale) : strychnine : 10 mg/kg cyanure : de 0,5 3 mg/kg toxine botulique : 1 ng/kg DL50 (intrapritonale) : cobra noir: 0.324 mg/kg endotoxine: 0.1 mg/kg toxine botulique : 1,4 ng/kg 146

147 Dfinition dune anatoxine : toxine ayant perdu son pouvoir toxique mais ayant conserv son pouvoir antignique Obtention danatoxines : action du mthanal (formol) pendant 30 40 jours 40C Intrt des anatoxines : utilisation pour vacciner (anatoxine diphtrique, anatoxine ttanique).

Consquence du pouvoir immunogne Possibilit dinjecter lanatoxine des animaux (lapin, cheval.) Synthse dAc spcifiques par lanimal Recueil du sang et purification des Ac contenus dans le plasma Injection possible des Ac des personnes contamines ou susceptibles dtre contamines afin de leur permettre de ne pas avoir de troubles. 148 Applications : - srum antittanique - srum antibotulinique

2-3-3- Mode daction

Toxines agissant depuis la surface cellulaire - Toxines activant des rcepteurs membranaires de la cellule cible ; - Toxines formant des pores travers la membrane de la cellule cible ; Toxines mode d'action intracellulaire - Toxines qui devront traverser la membrane cellulaire - Toxines injectes 152

2-3-3-1- TOXINES ACTIVANT DES RCEPTEURS MEMBRANAIRES DE LA CELLULE CIBLE 153

Toxine agissant de lextrieur Deux groupes de toxines : Toxines considres comme superantignes, Toxines agissant au niveau de la transduction de messages via le GMPc en activant la guanylyl cyclase. 154

A/ Toxine activit superantignique (exemple des entrotoxines staphylococciques) Prsence sur les entrotoxines staphylococciques de deux sites distincts dinteraction : un premier site dinteraction avec certaines molcules du complexe majeur dhistocompatibilit de type II un deuxime site de liaison avec certains domaines variables du TCR. 155

156 Consquence : activation non spcifique d'un grand nombre de lymphocytes T auxiliaires, do scrtion massive d'interleukines sont responsables des signes cliniques. Alors que, pour un antigne conventionnel, la population lymphocytaire T auxiliaires active reprsente en moyenne 0,5 % de la population lymphocytaire T auxiliaires totale, les superantignes peuvent activer jusqu' 25 % de la population lymphocytaire T auxiliaire.

B/ Toxine B/ Toxine activant un rcepteur membranaire prsentant une activit guanylate cyclase : exemple de l'entrotoxine thermostable ST du pathovar ETEC 157 Entrotoxine thermostable ST : entrotoxine -peptidique produite par les souches d'Escherichia coli classes dans le pathovar ETEC (principaux srovars : O6, O8, O15, O20, O25, O27, O63, O78, O80, O85, O115, O139, O148, O153, O159, O167). agents causals de la classique diarrhe du voyageur (turista), diarrhe en gnral peu svre, faite de selles hydriques, associe des douleurs abdominales, des nauses, parfois des vomissements et peu ou pas de fivre, - thermostable code par des gnes plasmidiques

158 Rcepteur de la ST : - protine transmembranaire activit guanylate cyclase prsente au ple apical des cellules pithliales intestinales, - protine dont les ligands endognes sont : * la guanyline * et luroguanyline PKG : Protine Kinase G PKA : Protine Kinase A PDE : Phosphodiestrase CFTR : Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator

159 Liason toxine et rcepteur : - augmentation incontrle de lactivit enzymatique du rcepteur - augmetation de la concentration cytosolique en GMPc - phosphorylation des transporteurs membranaores, tout particulirement le CFTR.

160 Consquences : - excrtion continue dions Cl - - inhibition des labsorption des ions Na + et Cl - - fuite osmotique deau vers la lumire intestinale

2-3-3-2- TOXINES FORMANT DES PORES TRAVERS LA MEMBRANE CELLULAIRE 161

- Scrtion de la grande majorit de ces toxines sous une forme monomrique hydrosoluble. - Reconnaissance par la toxine d'un rcepteur membranaire spcifique la surface de la cellule cible conduisant sa fixation et l'oligomrisation d'un nombre variable de sous-units monomriques. - Dmasquage de rgions de la protine permettant linsertion dans la membrane et la formation du pore. - Effets sur la cellule cible sont fonction de la taille des pores et de leur permabilit slective. 162

Deux grands groupes : a) les toxines liant le cholestrol ; b) les toxines motif RTX (Repeat in ToXin). 163

A/ Toxine A/ Toxine liant le cholestrol Toxines, produites principalement par des bactries Gram positif (listeriolysine de Listeria monocytogenes, pneumolysine O de Streptococcus pneumoniae, Streptolysine O de Streptococcus pyogenes, perfringolysine O de Clostridium perfringens, cereolysine O de Bacillus cereus) Toxines prsentant plusieurs caractristiques communes 165 Pourquoi le O ? Oxygne labile

Caractristiques communes rcepteur membranaire : cholestrol ; protines de masse molculaire gnralement comprise entre 50 60 kDa et scrtes sous forme monomrique soluble ; Toxines "thiol activables : inactives ltat oxyde, loxydation de la fonction thiol abolissant la possiblit de liaison de la toxine au cholestrol. On retrouve ainsi rgulirement la lettre O dans le nom de ces toxines, O pour "Oxygen labile". 166

Caractristiques communes (suite) Activit cytotoxique vis--vis de toutes les cellules eucaryotes. Rgulirement qualifies d'hmolysines, l'activit cytotoxique tant souvent tudie sur les hmaties (la streptolysine O est ainsi responsable de la -hmolyse observe in vitro sur glose au sang lors de la culture de souches de Streptococcus pyogenes). 167

Hmolyse : Zone dhmolyse autour de colonies de Streptococcus pyogenes sur glose au sang Action de la lcithinase, une phospholipase atour des colonies de Clostridium perfringens dans un milieu glos bse de jaune duf, riche en lcithine. La lcithinase dgrade la membrane des hmaties 168

Exemple de la Streptolysine O Protine de masse molaire gale 61,5 kg.mol -1, Protine scrte sous forme monomrique par Streptococcus pyogenes ainsi que par certaines souches de Streptococcus des groupes C et G. 169

Formation des pores par la streptolysine O Fixation d'un monomre sur une molcule de cholestrol Insertion de la rgion C-terminale dans la membrane. Dplacement des molcules phospholipidiques, processus ATP indpendant et dont l'nergie requise provient des changements conformationnels de la toxine. Formation de dimres interagissant ensuite pour s'insrer dans la membrane et former un pore constitu de 35 50 monomres. 170

B/ Toxine B/ Toxine RTX (Repeat in Toxin) Toxines, produites principalement par des bactries Gram ngatif ( hmolysine dEscherichia coli pathovar UPEC, pathovar EHEC, pathovar EAggEc, adnylate cyclase hmolysine de Bordetella pertussis, hmolysine de Proteus vulgaris .. ) 171 Rptition des AA dans la queue C terminale

Cas de l hmolysine d Escherichia coli - Protine dont la partie C-terminale prsente douze rptitions de la squence nonapeptidique. - Toxine fonctionnelle aprs acylation post traductionnelle Activit de ces toxines est Ca 2+ dpendante, la squence RTX tant implique dans la liaison aux ions calcium ; Pore form dans la cellule cible prsente un diamtre intrieur moyen de 2 nm environ Mort de la cellule par lyse osmotique 172

2-3-3-3- TOXINES MODE DACTION INTRACELLULAIRE (TRANSFERT INTRACYTOPLASMIQUE DUNE ACTIVIT CATALYTIQUE 175

Toxines composes de 2 sous-units (arrangements AB) : A (activity) qui porte l'activit enzymatique B (binding) qui permet la liaison un rcepteur membranaire spcifique et la translocation de l'enzyme Diffrentes activits : ADP-ribosyltransfrase Glycosyltransfrase (toxines de C. difficile) N-glycosidase (toxine de S. dysenteriae et toxines SLT dE. coli EHEC) Endopeptidase Zn-dp. : Neurotoxines botuliniques, Toxine ttanique Adnylate cyclase Dsaminase 176

A/ Caractristiques structurales de ces toxines Diffrentes structures A+B : 2 protines qui interagissent la surface de l'hte A-(5)B : 2 sous-units synthtises indpendamment, et associes de faon non-covalente lors de la scrtion et liaison hte 5B domaine de liaison compos de 5 sous-units identiques A/B 1 seul polypeptide, compos de 2 domaines pouvant tre spars par protolyse 178

B/ Attachement et entre de la toxine Entre directe Endocytose 180

Entre directe Liaison de la sous unit B un rcepteur membranaire spcifique, induisant formation d'un pore dans la membrane, Transfert de la sous unit A dans le cytoplasme Exemple : entre de la toxine activit adnylate cyclase de B. pertussis prfrentiellement du ct baso-latral 181

Entre par endocytose Liaison de la toxine au rcepteur via la sous unit B Internalisation de la toxine dans un endosome Entre de H+, do diminution du pH --> sparation toxine : la sous unit B restedanslendosome puis recyclage de la sous unit A la surface Transport de la sous unit A transporte vers organites spcifiques avant d'tre libre dans le cytosol et la ralisation de son activit 182 Exemple : toxine charbonneuse (anthrax)

183 Entre de la toxine diphtrique

C/ Mode daction des toxines activit intracellulaire 184

C1/ Mode daction des toxines activit ADP ribosyl phosphate Exemple de la toxine cholrique Protine de masse molculaire de 85,5 kDa Protine constitue d'une sous-unit A (masse molculaire 27 kDa, 240 acides amins) et de cinq sous-units B (masse molculaire 11,7 kDa, 103 acides amins) Toxine excrte aprs la fixation de Vibrio cholerae sur les entrocytes de l'intestin grle : lors de l'excrtion, la sous-unit A subit une protolyse limite et est clive en deux fragments nots A1 (acides amins 1 194) et A2 (acides amins 195 240), fragments qui restent relis par l'intermdiaire d'un pont disulfure. La sous-unit A1 porte l'activit catalytique ADP-ribosyl transfrase de la toxine. 185

186 Rcepteur GM1 : monosialoganglioside

188 L'exotoxine est excrte aprs la fixation de Vibrio cholerae sur les entrocytes de l'intestin grle. Lors de l'excrtion, la sous-unit A subit une protolyse limite et est clive en deux fragments nots A1 (acides amins 1 194) et A2 (acides amins 195 240), fragments qui restent relis par l'intermdiaire d'un pont disulfure. La sous-unit A1 porte l'activit catalytique ADP- ribosyl transfrase de la toxine.

189 Suite la liaison des sous- units B au rcepteur spcifique, la toxine cholrique est internalise dans la cellule intestinale. Celle-ci suit ensuite un long trajet rtrograde jusqu'au rticulum endoplasmique. Aprs son transfert dans les endosomes de tri, la toxine cholrique est adresse au rseau trans-golgien, puis l'appareil de Golgi, pour atteindre le rticulum endoplasmique. Pour induire ce transport rtrograde, la toxine cholrique dtourne son profit l'appareil de rtention des protines rsidentes du rticulum endoplasmique.

190 La sous-unit A1 ralise alors l'ADP ribosylation de la protine Gs lie l'adnylate cyclase membranaire. Cette modification post-traductionnelle rduit l'activit GTPasique intrinsque de la protine Gs, la rend constitutivement active et provoque l'activation de l'adnylate cyclase, ce qui se traduit par une augmentation de la concentration en AMPc intracellulaire. Ce second messager active son tour une protine kinase A qui viendra phosphoryler plusieurs canaux ioniques, modifiant leur activit. C'est en particulier le cas de la protine CFTR. Il s'ensuit une scrtion importante d'ions chlorure et, par osmose, d'eau en direction de la lumire intestinale. Une personne peut perdre dans les cas extrmes jusqu' 20 litres d'eau par jour.

Lit pour personnes souffrant de cholra 192

Lit pour personnes souffrant de cholra 193

C2/ Mode daction des toxines activit ARN glycosidase Exemple shigatoxine de Shigella dysenteriae Protine d'une masse molculaire de 70,7 kDa constitue d'une sous-unit A et de cinq sous- units B Lors de l'excrtion, protolyse limite de la sous- unit A clive en deux fragments nots A1 et A2, fragments qui restent lis par l'intermdiaire d'un pont disulfure. Activit catalytique ARN glycosidase de la toxine porte par la sous-unit A1. 194

Reconnaissance spcifique par les sous-units B des glycolipides et tout particulirement le globotriaosylcramide. Endocytose de la shigatoxine, principalement ralise par la voie clathrine dpendante, mais il est vraisemblable que la shigatoxine puisse emprunter plusieurs voies distinctes d'endocytose. Aprs son adressage au rseau trans-golgien puis l'appareil de Golgi, la shigatoxine est adresse au rticulum endoplasmique. Modalits du passage de la shigatoxine de l'appareil de Golgi au rticulum endoplasmique sont encore peu comprises. 195

Cible molculaire de la Stx : rsidu adnosine 4324 de l'ARN ribosomal de la sous-unit 28S. Consquences : arrt de la synthse protique Puis la mort cellulaire par apoptose. 196

Cas des Shigalike toxin Production parmi l'espce Escherichia coli dune toxine note Shigalike Toxin, prsentant des homologies de squence avec la shigatoxine et catalysant la mme raction (mme cible molculaire). Les EHEC sont appels aussi STEC : Shigalike Toxin Escherichia Coli. Cette toxine est par ailleurs trs tudie pour ses proprits de lyse in vitro des cellules Vero, d'o le nom de VTEC (Vero Toxin Escherichia coli) parfois utilis pour dnommer les EHEC. 197

C3/ Mode daction des toxines activit mtalloprotasique Zn 2+ Cas de la toxine botulinique Neurotoxines produites par les souches toxinognes de Clostridium botulinum et dans une moindre mesure par certaines souches de Clostridium butyricum et Clostridium barati. Neurotoxines restant dans le priplasme et libres lors de la lyse de la bactrie. Caractrisation de sept neurotoxines botuliniques distinctes notes de A, B, C1, D, E, F, G produites par diffrentes souches de Clostridium botulinum scrteurs de toxines. 198

C3/ Mode daction des toxines activit mtalloprotasique Zn 2+ Cas de la toxine botulinique Neurotoxines ayant un tropisme absolu pour la jonction neuromusculaire, o elles se fixent. Fixation suivie de linternalisation de la neurotoxine et de son activation. Toutes les neurotoxines botuliniques, ainsi que la toxine ttanique, sont des mtalloprotases Zn 2+. La protolyse mnage de la ou des protine(s) cible(s) conduit larrt des processus dexocytose et au blocage de la libration de lactylcholine. 199

201 Toxine botulinique responsable du clivage des protines permettant la liaison des vsicules dactylcholine la membrane lors de larrive dun potentiel daction Consquences : - Absence de liaison des vsicules la membrane de laxone - Pas de libration de lactylcholine dans lespace intersynaptique - Absence de transmission du potentiel daction du neurone au muscle - Absence de contraction des muscles Paralysie flasque de tous le corps et mort de la personne par asphyxie (paralysie des muscles respiratoires)

novembre 2006Cellule procaryote202

204 Action de la toxine ttanique

Les modes de scrtion des toxines 205

Facteur de virulence dans la pathognse des Salmonella 206

Comparaison exo- et endotoxines 207

2-4- Utilisation des connaissances sur les toxines

2-4-1- Utilisation prophylactique et thrapeutique

2-4-1-1- VACCINATION 210

Vaccination : procd consistant introduire un agent extrieur (le vaccin) dans un organisme vivant afin de crer une raction immunitaire positive contre une maladie infectieuse. maladie infectieuse Substance active du vaccin : antigne destin stimuler les dfenses naturelles de l'organisme (le systme immunitaire). Substance activeantignesystme immunitaire 211

Raction immunitaire primaire : outre la synthse dAc spcifiques de lagent vaccinant mise en mmoire de l'antigne prsent pour quensuite, lors d'une contamination vraie, l'immunit adaptative puisse s'activer de faon plus rapide. Diffrents types de vaccins selon leur prparation : agents infectieux inactivs, agents vivants attnus, sous-units dagents infectieux, anatoxines. 212

A/ VACCINATION PAR ANATOXINES 214

Anatoxine : toxine protique inactive (chaleur et mthanal) dont le pouvoir antignique a t conserv Besoin dadjuvants Vaccin antittanique et antidiphtrique 215

B/ VACCINATION PAR TOXINES DTOXIFIES PAR MUTAGNSE (EX : COQUELUCHE) 217

Initialement vaccination par des vaccins cellulaires, composs d'extraits bactriens de Bordetella pertussis, a fortement diminu l'incidence de la coqueluche, mais existence deffets secondaires. Recherche de nouveaux vaccins acellulaires, composs d'adhsines, telles que l'hmagglutinine filamenteuse et la pertactine, et de la toxine de pertussis dtoxifie. 218 Toxine activit intracellulaire (ADP ribosyl transfrase)

Dtoxification de la toxine par gnie gntique Changement spcifique de rsidus impliqus dans l'activit enzymatique (perte de lactivit enzymatique)et dans l'activit de liaison aux cellules cibles sans modifier les pitopes (conservation de la protection immunitaire contre la protine native) Ex : modification dune glutamate dans le site catalytique de lADP ribosyl transfrase de Bordetella pertussis 219 Ncessit dune bonne connaissance structurale et de mise en uvre de techniques de cristallisation et de biologie molculaire

C/ VACCINATION PAR TOXINES ACTIVES AU NIVEAU DES MALT (MUCOSAL ASSOCIATED LYMPHOID TISSUE) 220

Rsultats dtudes pidmiologiques : chaque anne, 800 000 enfants meurent d'infections Rotavirus, entre 500 000 et un million meurent d'infections Shigella, au minimum 120 000 personnes meurent du cholra et 350 000 d'infections par ETEC. Maladies diarrhiques reprsentent donc un problme majeur de sant publique, leur radication sera-t-elle assure par une approche thrapeutique ou prventive ? 221

Approche curative : succs incontestables (ex : diminution de 50 % de la mortalit suite la mise en place des mthodes de rhydratation par voie orale en rgion d'endmie) mais traitement antibiotique des diarrhes bactriennes souvent discut (augmentation du nombre de souches multi-rsistantes, comme c'est le cas pour Shigella). Approche prventive : existence de limites ( faibles ressources des pays pauvres et donc difficults pour une amlioration rapide des conditions sanitaires des zones endmiques). Dans de telles conditions, l'approche vaccinale prend toute sa valeur, y compris en rapport cot-bnfice 222

223 Poids des ETEC trs important en sant publique dans les pays en voie de dveloppement, - la maladie survenant essentiellement chez le jeune enfant entre 6 mois et 5 ans, - une des causes prpondrantes de la diarrhe des voyageurs. Les ETEC peuvent produire la toxine thermolabile (LT), homologue de la toxine cholrique, partageant son mode d'action par activation de l'adnyl-cyclase, avec elle des ractions immunologiques Travail actuel pour un vaccin anti-ETEC produit en Sude : srie de souches exprimant une varit de facteurs de colonisation (CFAII, CS1, CS2 + CS3, CS4, CS5), inactives par le formol et associes la sous-unit B recombinante de la toxine LT (rB-WC- ETEC)

Vaccin anti-cholra Faible efficacit et mauvaise tolrance du vaccin inactiv a peu peu conduit son abandon. Vaccin prototype : bactries tues appartenant au srotype O1, biotype classique, auxquelles avait t ajout de la sous-unit B de la toxine cholrique (vaccin B-O1 WC). Administr en trois doses orales, il avait montr une efficacit protectrice leve 6 mois (85 %) et raisonnable trois ans (60 %). Remarque : avec le temps, diminution de l'efficacit protectrice de la prsence de la sous-unit B 224

Intrt de ce type de vaccin : - relative facilit de production, - cots peu levs, - absence de ncessit de chane du froid, font que ce type de vaccin peut tre aisment produit par les pays en voie de dveloppement o le cholra est endmique 225

2-4-1-2 IMMUNOTOXINES CHIMRIQUES ET LUTTE ANTICANCREUSE

Immuno-toxine : molcule hybride forme partir dune toxine protique et dun Ac 227 Principales toxines utilises : -l'exotoxine de Pseudomonas (PE), -la toxine diphtrique (DT) -et la ricine

Aprs fixation sur leur rcepteur respectif, internalisation de PE et DT dans les cellules de mammifres par endocytose. Clivage des toxines par une protase cellulaire, la furine. Libration par le clivage protolytique du fragment actif (PE37 ou la chane A de DT) qui catalyse une raction d'ADP-ribosylation du facteur d'longation 2 (EF 2 ). Do inhibition irrversible de la protosynthse et induction de la mort cellulaire par apoptose. 228

volution des immuno-toxines et des toxines chimres Premires immunotoxines produites par conjugaison chimique des toxines avec des immunoglobulines. Inconvnients : -ncessit de purification de quantits importantes de toxines et de ligands Htrognit des conjugus ainsi produits : variabilit du nombre de molcules de toxines couples par molcule de ligand et donc variabilit de la toxicit d'un conjugu peut donc varier d'une prparation l'autre. 229

Apport de la biologie molculaire : nouvelle conception molculaire des toxines chimres qui a progress rapidement depuis 10 ans (figure 1).figure 1 Toxines recombinantes = protines de fusion dans lesquelles un domaine de liaison un antigne ou un rcepteur a fusionn avec une toxine mutante ou tronque. Le ligand peut tre un fragment variable (Fv) d'anticorps, une cytokine, un facteur de croissance ou une hormone. 230

2-4-1-3- TRAITEMENT CURATIF ET ANTI- VIEILLISSEMENT

Applications thrapeutiques des toxines botuliniques Emploi des neurotoxines botuliniques bloquant l'innervation motrice dans toutes les maladies caractrises par une hyperactivit musculaire : - utilisation pour le traitement des blpharospasmes (contractions involontaires des muscles des paupires), des paralysies hmifaciales, des torticolis spasmodiques, des dformations dynamiques du pied en quin chez les enfants prsentant une spasticit 233

Applications thrapeutiques des toxines botuliniques En France, quatre spcialits base de toxine botulinique ont reu une AMM. Trois sont base de toxine A (Botox, Dysport, Vistabel) et une base de toxine B (Neurobloc) : Le Botox, le Dysport et le Neurobloc sont des mdicaments utiliss dans les indications mdicales. Vistabel a obtenu une AMM pour la correction des rides provoques par le froncement des sourcils (rides du lion). 234

Applications thrapeutiques des toxines botuliniques Linjection intramusculaire de toxine provoque un effet paralysant sur le muscle inject avec une diffusion faible ou nulle dans les muscles adjacents. Effet paralysant proportionnel la dose de toxine injecte Effet paralysant observ durant plusieurs semaines ou plusieurs mois. Remarque : compte-tenu de la faiblesse des doses injectes, une rponse en anticorps neutralisants n'est observe que lors d'injections rptes. 235

2-4-2- Intrt pour lidentification des souches

Srogroupage de bacilles Gram- bas sur la caractrisation antignique de lAg O du LPS (Salmonella, E. coli, Shigella) Identification dune souche par identification de la toxine produite (toxinotypie) Identification de lentrotoxine staphylococcique par immunoenzymologie ou par Ouchterlony Rechecrhe de prsence de toxine botulinique par sroneutralisation Mise en vidence de toxine par agglutination de particules de latex sensibilises par des Ac spcifiques (Vivrio cholerare, E coli, Clostridium perfringens) Recherche du gne de la toxine par PCR 237

2-4-3- Dtection de LPS : test du LAL (Lysat dambocytes de Limule) Arthropodes marins ressemblant des crabes

Lhmolymphe (quivalent du sang) de la limule est de couleur bleue du fait de la prsence dhmocyanine au lieu d'hmoglobine. Cellules de lhmolymphe = ambocytes qui ragissent en prsence de LPS bactriennes en produisant une protine transformant l'hmolymphe en gel. Remarque : La limule n'ayant pas de systme immunitaire, ce gel lui permet de bloquer les infections bactriennes. 239

Test lipopolysaccharidique sur ambocyte de Limulus : dosage activit LPS Ambocytes : cellules de lhmolymphe normales isoles de la limule Dgranulation des ambocytes aprs traitement par le lipopolyoside bactrien =glification

Particularit telle que, depuis les annes 1970, utilisation de l'hmolymphe de la limule pour produire un ractif, appel lysat d'ambocyte de limule (LAL), employ notamment dans le domaine pharmaceutique pour tester l'absence d'endotoxines dans les mdicaments, les produits de dialyse et le matriel mdico-chirurgical. 241

Utilisation uniquement de la glification dans la pharmacope. Existence de tests quantitatifs o les facteurs du LAL sont activs en une cascade protolytique entrainant le dun substrat incolore substrat librant du 4-notrophnol qui absorbe 405 nm. 242

Dans le milieu mdical, lhmodialyse permet par ultrafiltration sanguine de pallier une dficience rnale. Leau utilise doit tre exempt dendotoxines (lipopolysaccharide) dorigine bactrienne. Si dtection par le test du LAL de lipopolyosides, ncessit de les liminer par diffrentes mthodes de dpyrognation : Dpyrognation par inactivation Dpyrognation par limination Voir document joint 243

2-4-4- Connaissance des voies de signalisation des cellules eucaryotes

Dimportants systmes transduction de signal ont t identifis chez les procaryotes et servent de modles pour comprendre les systmes plus complexes des eucaryotes. Beaucoup de gnes et doprateurs sont activs ou inactivs en rponse des signaux diffrents (notamment aux conditions environnementales par des protines rgulatrices faisant partie dun systme de transduction de signal 2 composants. 245 Ainsi les effets spcifiques des toxines sur un type cellulaire donn et leur des toxines a permis une meilleure comprhension des modes de signalisation intracellulaire.

Fonctionnement du systme de signal 2 composants (2 protines) 246

Premire protine : senseur fonction de kinase traversant la membrane plasmique Une partie expose lenvironnement extracellulaire (priplasme des Gram -) Une autre partie expose au cytoplasme Senseur : dtection des changements spcifiques de lenvironnement et communication de linformation au cytoplasme 247 Rgulateur

Deuxime protine : rgulateur-rponse : protine qui se fixe lADN et dclenche quand il es activ la transcription de gnes ou doprons dont lexpression est indispensable pour ladaptation au stimulus environnemental Linhibition de la transcription de gnes ou doprons non requis dans les nouvelles conditions environnementales 248 Rgulateur

249 Systme le mieux compris : rgulation chez E coli du rapport des porines OmpF/OmpC

Le systme deux composants OMPF/OMP C 250

Existence de toxines microbiennes autres que bactriennes (cf algues) Place des toxines dans la pathognse microbienne Ingestion de la toxine prforme dans laliment : intoxination Toxine produite aprs colonisation de la surface mucosale et action locale de la toxine ou distance Toxine produite par des bactries contaminantes suite une blessure et action locale ou aprs passage dans le sang. 252

pathogénèse microbienne chapitre 1 les déterminants du pouvoir pathogène (et donc de la maladie...

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