lerat pathogénèse

PATHOGENPATHOGENÈÈSE DES LSE DES LÉÉSIONS SIONS HHÉÉPATIQUES DU VHC :PATIQUES DU VHC :

MODMODÉÉLISATION ANIMALELISATION ANIMALE

HervHervéé LERATLERAT

INSERM U955INSERM U955DDéépartement de Virologie Molpartement de Virologie Molééculaire et Immunologieculaire et Immunologie

Physiopathologie et ThPhysiopathologie et Théérapeutique des Hrapeutique des Héépatites Virales Chroniques (Pr. Pawlotsky)patites Virales Chroniques (Pr. Pawlotsky)

Hôpital Henri Mondor, CrHôpital Henri Mondor, Crééteil, France.teil, France.

NNéécessitcessitéé de dde dééveloppement de veloppement de modmodèèles animauxles animaux

ContexteContexte dd’’un un organeorgane entierentierdansdans un animal vivant.un animal vivant.

Pathologies viro-induites: contribution du virus?

ModMod èèles animaux pour lles animaux pour l ’é’étude des tude des pathologies induites par le VHCpathologies induites par le VHC

�� Primates nonPrimates non--humainshumains�� ChimpanzChimpanzéé

�� OuistitiOuistiti

ModModèèlesles dd’’infectioninfection

�� ProblProblèème de disponibilitme de disponibilitéé et de coet de coûût.t.

�� RongeursRongeurs ((““humanishumanisééss””))�� uPAuPA/SCID/SCID

�� TrimeraTrimera

�� ratrat

ModMod èèles animaux pour lles animaux pour l ’é’étude des tude des pathologies induites par le VHCpathologies induites par le VHC

ModModèèlesles dd’’infectioninfection

ModModèèlesles dd’’infectioninfection ((rongeursrongeurs))

Adapted from Kremsdorf et Brezillon, World J Gastroenterol 2007

�� Techniquement trTechniquement trèès complexes s complexes àà mettre en mettre en œœuvreuvre

uPA/SCID

Trimera mice

Rat

Rodent models HumanizationViremia

Copies/mLDuration of infection

(Months)

Human hepatocyte transplantation

Xenograft of humanliver tissues

Immunotolerization and transplantation of human

hepatoma cell line

104 to 8x107

7x104

1-2x104

Up to 9

Around 1

Up to 4

Peak viremia

1 month

18 days

3 months

�� TransgenTransgenèèsese murinemurine�� ClassiqueClassique

�� ConditionnelleConditionnelle ((systsystèèmeme CreCre/Lox)/Lox)

ModMod èèles animaux pour lles animaux pour l ’é’étude des tude des pathologies induites par le VHCpathologies induites par le VHCModModèèles dles d’’expression des protexpression des protééines viralesines virales

�� Avantages Avantages ::�� FacilitFacilitéé dd’é’élevage, technique rodlevage, technique rodééee

�� Expression chronique Expression chronique àà long termelong terme

�� Pas de rPas de rééponse immuneponse immune

�� Pas de rPas de rééplication virale plication virale

The full-length HCV ORF transgenic mouse model FL -N/35

Lerat et al., Gastroenterology 2002

RNA HCV +X C57BL6J

Liver

micro-injectionsC57Bl6J x C3H/HeJ

X C57BL6JDNA HCV +

FL-NE1 E2core

NS

4aNS3 NS4b NS5a NS5bNS2p7Albumin promoter SV40 PolyA

Genotype 1b

FL-N/35

The full-length HCV ORF transgenic mouse model FL -N/35

Lerat et al., Gastroenterology 2002

RNA HCV +X C57BL6J

Liver

micro-injectionsC57Bl6J x C3H/HeJ

X C57BL6JDNA HCV +

FL-NE1 E2core

NS

4aNS3 NS4b NS5a NS5bNS2p7Albumin promoter SV40 PolyA

Genotype 1b

SteatosisSteatosis

CarcinomaCarcinoma

CoCo--fibrogenicfibrogenic+CCl4+CCl4

Hepatocellular Carcinomas

A

Lerat et al., Gastroenterology 2002.

1 cm

1 cmFL-N/35-170UNC

FL-N/35-171UNC

1 cm FL-N/35-102CERFE

Visualisation en IRM des CHC chez la souris VHC

(H. Lerat, A. Luciani et T. Décaens, données personnelles.)

Tumeur

CHC induits par le VHC:

Mécanismes Moléculaires?

Rôle direct des protéines virales?

CHC CHC viroviro --induitsinduits : : mméécanismescanismes molmol ééculairesculaires ??

Incorporation de BrdU

HCV TGNon TG

ARNmCyclin B1 MYC

1

3

5

7

9

mR

NA

(F

old

incr

ease

)

HCV TGNon TG HCV TGNon TG

Détection PCNA

HCV TGNon TG

Modulation du cycle Modulation du cycle cellulairecellulaire dans le foie des souris transgdans le foie des souris transgééniquesniques

-> Les mécanismes restent à définir.Lerat et al., Gastroenterology 2002.Keasler, Virology 2006.M. Higgs (données personnelles)

% a

popt

otic

hepa

tocy

tes

0

10

20

30

40

50

non TG

HCV TG

P<0.05

in vivo

P<0.01

ex vivo

HCV TGNon TG

Hoe

chst

+

-

Flu

ores

cenc

e in

tens

ity

Inhibition de Inhibition de ll’’apoptoseapoptose dans le foie des souris transgdans le foie des souris transgééniquesniques

(Disson et al., Gastroenterology, 2004)

BidBid

GAPDHGAPDH

LIVERLIVER KIDNEYKIDNEY

HCV HCV tgtg -- ++ -- ++

BidBid24 24 kDkD

ActivatedActivatedcaspasecaspase 88

BidBid --NN10 10 kDkD

BidBid --tt14 14 kDkD

CytochromeCytochrome CC

++

Apoptosis

WTWT HCV HCV tgtg00

0.40.4

0.20.2

0.60.6

0.80.8

11

1.21.2

Bi

Bi d

d p

rot e

inp

rot e

inle

vel

leve

l (A

U)

(AU

)

BidBid

N=13N=13N=10N=10

p<0.01p<0.01

(Disson et al., Gastroenterology, 2004)

Inhibition de Inhibition de ll’’apoptoseapoptose dans le foie des souris transgdans le foie des souris transgééniquesniques

APOPTOSEAPOPTOSE

caspase 3 caspase 9

cytochrome C

caspase 8

Fas

FasL

Bid

Membrane cellulaire

mitochondrie

VHC (NS2)

CIDE-B

fragmentation ADN

CIDE-B

Annexin V

HCV TG +-

Erdtmann et al., J Biol Chem 2003.

VHC (NS5A)

calpaïne

Etape vers le cancer

RRéésumsuméé : inhibition de la voie FAS dans le foie des souris VHC: inhibition de la voie FAS dans le foie des souris VHC

Bid (21 kD)

GAPDH

NT CHC NT CHC NT CHC

Patients #1 #2 #3

Tissus

NT= tissu adjacent au CHC

(Simonin et al., Hepatology 2009)

Diminution de lDiminution de l’’expression de expression de bidbid chez les patients infectchez les patients infectéés par le VHCs par le VHC

0

1

2

3

VHC

Cirrhose++-

--+ +

+--

-+

Tissus NT CHC

n 15 9 8 15 9 8

Bid

/GA

PD

H

*

Simonin et al., Hepatology, 2009

Diminution de lDiminution de l’’expression de expression de bidbid chez les patients infectchez les patients infectéés par le VHCs par le VHC

Persistence of adenovirus infection in HCV+ hepatocytes(Disson et al., Gastroenterology, 2004)

Day 3

Day 21

non TG HCV TG

Ad βGal108 pfu/g

D +3 Liver biopsy

D +21(sacrifice)

Liver and spleen removal

β-gal histology

+ enzymatic assay

10+ 4

10+ 5

10+ 6

10+ 7

+3 +21 +3 +2110+ 3

10+ 4

10+ 5

10+ 6

ßG

AL

activ

ityin

the

liver

(RLU

)

ßG

AL

activ

ityin

the

sple

en (

RLU

)

LIVER SPLEEN

p<0.05

N.S.

Ad βGal108 pfu/g

D +3 Liver biopsy

D +21(sacrifice)

Liver and spleen removal

β-gal histology

+ enzymatic assay

Persistence of adenovirus infection in HCV+ hepatocytes(Disson et al., Gastroenterology, 2004)

Non tg HCV tg

Rela

tive

RO

S leve

ls (%)

0

100

200

300

400

500

600

700

n=4n=4n=4n=4 n=4n=4n=4n=4

DNA damage

inflammation

fibrosis

NS3-NS5A

Nox4

(M. Higgs, H. Lerat, données personnelles)

Surcharge en FER

CHC

ROS

Electron transport Complex (1) CORE

Glutathion

HCV-tgNon tg

DHEDHEDHEDHE

Age= 17 mo

Production de ROS dans les souris VHC, implication sur la Production de ROS dans les souris VHC, implication sur la carcinogencarcinogenèèse hse héépatique.patique.

GADD45GADD45GADD45GADD45γγγγGADD45GADD45GADD45GADD45ββββGADD45GADD45GADD45GADD45ααααGADD153GADD34

Senseurs de stress

Q

M

G1G2

S

G0

CyclinB1

Cdc2

Arrêt du cycle Arrêt du cycle Arrêt du cycle Arrêt du cycle cellulaire (G2/M)cellulaire (G2/M)cellulaire (G2/M)cellulaire (G2/M)

GADD45GADD45GADD45GADD45LLLLéééésions de sions de sions de sions de llll’’’’ADNADNADNADN

Nucleotide excision repair

LLéésionssions de de ll’’ADNADN –– La La famillefamille GADDGADD

Gadd45Gadd45Gadd45Gadd45ββββ

P

P

P

Histone H3

Histone H1

Lamine

La surexpression de GADD45 entraine un arrêt de la transition G2/M.

Indexe mitotique des hIndexe mitotique des h éépatocytes VHC+patocytes VHC+

PhosPhosPhosPhos----histone H3 (histone H3 (histone H3 (histone H3 (SerSerSerSer 10)10)10)10)

+/+/+/+/---- Gadd45Gadd45Gadd45Gadd45ββββsiRNAsiRNAsiRNAsiRNA

wt FL-N/35

+/- UV-C

UVUVUVUV----CCCC

Gadd45Gadd45Gadd45Gadd45ββββ siRNAsiRNAsiRNAsiRNA

wt FL-N/35 wt FL-N/35 wt

++++ ++++ ++++

++++

p = 0.0001

NS

NS

% m

itosi

s% m

itosi

s% m

itosi

s% m

itosi

s

0

10

20

30

40

(Higgs, Lerat et al. Soumis)

RRéégulationgulation éépigpig ééniquenique du du promoteurpromoteur de GADD45b de GADD45b dansdans les les hhéépatocytespatocytes VHC+VHC+

PhosPhosPhosPhos----histone H3 (histone H3 (histone H3 (histone H3 (SerSerSerSer 10)10)10)10)

+/+/+/+/---- 5555----azaazaazaaza

wt FL-N/35

+ UV-C

UVUVUVUV----CCCC

Gadd45β siRNA

wt FL-N/35 FL-N/35 FL-N/35

++++ ++++ ++++ ++++

++++

5555----azaazaazaaza ++++++++

p = 0.0014

p = 0.0001

p = 0.0003

0

5

10

15

20

25

30

% m

itosi

s% m

itosi

s% m

itosi

s% m

itosi

s


LL’’expression de GADD45b est diminuexpression de GADD45b est diminuéée dans le foie des patients e dans le foie des patients infectinfectéés par le VHCs par le VHC

HCV+

HBV+

HBV- HCV-

NT

T

NT

T

NT

T

Groupes de patients étudiés

Rela

tive

Gad

d45β

pro

tein

exp

ress

ion (%)

0

20

40

60

80

100

120

Non tumoral tissue

Tumoral tissue

HBV + HCV +HCV +HCV +HCV +HBV -HCV -

HBV +HBV -HCV -

HCV +HCV +HCV +HCV +

Gadd45β >

Actin >

HC

V +

HB

V +

HB

V -

HC

V -

NT T NT T NT T


Chronicité infectionChronicité infection

Vers un mVers un méécanisme de la carcinogencanisme de la carcinogenèèse hse héépatique patique viroviro--induite?induite?

CANCER du FOIECANCER du FOIE

Expression VHCExpression VHC

Inhibitionréponse immune

Inhibitionréponse immune

Multiplication cellulaire

Multiplication Multiplication cellulairecellulaire

Surexpression des cyclines et oncogènes

Surexpression des cyclines et oncogènes

Inhibition apoptoseInhibition Inhibition apoptoseapoptose

Diminution de protéines pro apoptotiques

Diminution de protéines pro apoptotiques

Lésions ADNLLéésions ADNsions ADN

production ROS production ROS

Réparation ADNRRééparation ADNparation ADN

Stéatose induite par le VHC:



Stéatose micro-vésiculaire

Non TGNon TG VHC TGVHC TG

VHC TGVHC TG VHC TGVHC TG

Lerat et al., Gastroenterology 2002.

Stéatose micro-vésiculaire

coloration Oil Red O

analyse in silico

HCV TGNON TGM

F

M

0

5

10

15

20

25

12.5 ± 0.4

13 ± 0.8 14.4 ± 0.8

14.1 ± 0.3

n=12

n=12 n=10

n=7

p<0.001

% d

e l’a

ire to

tal

HEPATOCELLULAR STEATOSISHEPATOCELLULAR STEATOSIS

de novo TG synthesis

TG secretion default

Increased TG serum uptake

TG degradation default (oxydation)

ER Stress?

VIRALPROTEINS

? ?

?

?

StStééatoseatose viroviro --induitinduit ee: : mméécanismescanismes molmol ééculairesculaires ??

Défaut d’exportation des triglycérides.La sécrétion des VLDL hépatiques chez la souris à jeun a été mesurée par l’augmentation des triglycérides plasmatiques (A et B) et de l’apolipoprotéineB (C) après inhibition de la lipoprotéine lipase par le triton WR1339 (B et C).

Pla

smat

ic T

G (

g/L)

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

A

WT HCV-tg

14 14n

4

6

8

10

12

14

Pla

smat

ic T

G (

g/L)

B

WT HCV-tg

13 13n

1

2

3

4

5

6

Pla

smat

ic A

poB

(g/L

)

C

WT HCV-tg

13 13n

Inhibition de la « Microsomal Transfer Protein »

WT HCV-tg150

200

250

300

350

400

450

500

pmol

es/1

00µ

g/4h

Activité MTP

Stimulation de la lipogenèse

Citrate

Acetyl-CoA

ATP-CL

Malonyl-CoA

Acyl-CoAs

TG

Lipo

genè

se ACC

FAS

SCD1

* p=0.01

** p=0.02WT

HCV-tg

AR

Nm

(aug

men

tatio

n re

lativ

e)

n 11

FAS SCD1

0

2

4

9

EMACCACL

11 14 11 118 8 16 8 8

*

**

**

** p=0.02

RT-qPCR

* p=0.01

FA

S/G

AP

DH

WT HCV-tg

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

*

4 9n

Western Blot

Stimulation de la lipogenèse

Citrate

Acetyl-CoA

ATP-CL

Malonyl-CoA

Acyl-CoAs

TG

Lipo

genè

se ACC

FAS

SCD1

Régulation de la lipogenèse

SREBP1cDomaine de transactivation

(Noyau)

SREBP1c Précurseur

(RE puis Golgi)

Citrate

Acetyl-CoA

ATP-CL

Malonyl-CoA

Acyl-CoAs

TG

Lipo

genè

se ACC

FAS

SCD1


(Noyau)

SREBP1c Précurseur

(RE puis Golgi)

Citrate

Acetyl-CoA

ATP-CL

Malonyl-CoA

Acyl-CoAs

TG

Lipo

genè

se ACC

FAS

SCD1


SREBP1c (clivé)

SREBP1c (précurseur)

Lamine A/C

Actine

noyau

microsomes

WT HCV-tg

Western Blot

AR

Nm

(aug

men

tatio

n re

lativ

e)

n 14 16

0

1

2

3

4

WT HCV-tg

RT-qPCR


(Noyau)

SREBP1c Précurseur

(RE puis Golgi)

Citrate

Acetyl-CoA

ATP-CL

Malonyl-CoA

Acyl-CoAs

TG

Lipo

genè

se ACC

FAS

SCD1


Lipogenèse induite par le stress du RE?

PERK ATF6IRE-1

Stress RERE

Epissage ARNm XBP1P-eiF2α

Arrêt traduction Dégradation protéique


(Noyau)

SREBP1c Précurseur

(RE puis Golgi)

Citrate

Acetyl-CoA

ATP-CL

Malonyl-CoA

Acyl-CoAs

TG

Lipo

genè

se ACC

FAS

SCD1


PERK ATF6IRE-1

Stress RERE




(Noyau)

SREBP1c Précurseur

(RE puis Golgi)

Citrate

Acetyl-CoA

ATP-CL

Malonyl-CoA

Acyl-CoAs

TG

Lipo

genè

se ACC

FAS

SCD1

eIF

2-P

/eIF

2

0

1

2

3

4

WT HCV-tg

Western blot

Non-épisséEpissé

Non-Tg HCV Tg +

ARNm XBP1

RT-PCR


PERK ATF6IRE-1

Stress RERE




(Noyau)

SREBP1c Précurseur

(RE puis Golgi)

Citrate

Acetyl-CoA

ATP-CL

Malonyl-CoA

Acyl-CoAs

TG

Lipo

genè

se ACC

FAS

SCD1

1

2

3

0

4 9

Phospho-Perk

Pho

spho

-Per

k / P

ER

K

Western Blot


PERK ATF6IRE-1

Stress RERE




(Noyau)

SREBP1c Précurseur

(RE puis Golgi)

Citrate

Acetyl-CoA

ATP-CL

Malonyl-CoA

Acyl-CoAs

TG

Lipo

genè

se ACC

FAS

SCD1

EDEM7 4

PDI11 8

WTHCV-tg

CHOP TRB315 187 4n

GRP7816 15

AR

Nm

(aug

men

atio

nre

lativ

e)

0

2

4

6

12

RT-QPCR

PERK ATF6IRE-1

Stress RERE



RRéésumsum éé


(Noyau)

SREBP1c Précurseur

(RE puis Golgi)

Citrate

Acetyl-CoA

ATP-CL

Malonyl-CoA

Acyl-CoAs

TG

Lipo

genè

se ACC

FAS

SCD1

VLDLMTPExportation TG

ApoB

Accumulation TG intracellulairesSTEATOSE HEPATIQUE

=

=

NO

YESYES

de novo TG synthesis

TG secretion default

Increased TG serum uptake

HEPATOCELLULAR STEATOSISHEPATOCELLULAR STEATOSIS

TG degradation default (oxydation)

ER StressVIRAL

PROTEINS

?

?

Towards mechanismTowards mechanismss for HCVfor HCV--inducedinduced steatosissteatosis??

Fibrose induite par le VHC?



Non-Tg HCV-Tg

anti-αSMA antibody

Stellate cell activationand absence of fibre deposition in HCV mice

Non Non TgTg

HCVHCV--TgTg

Picrosirius red staining

Enhanced fibre deposition in CCl4-treated HCV mice

Non Non TgTg + CCl4+ CCl4 HCVHCV--TgTg + CCl4+ CCl4Non Non TgTg

in in silicosilico AnalysisAnalysis

NonNon --Tg + CCl4Tg + CCl4 Tg + CCl4Tg + CCl4

PicrosiriusPicrosirius RedRed StainingStaining

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

TgNon-Tg

+ CCl4+ CCl4-- CCl4CCl4

TgNon-Tg

P=0.0036*

Are

a of

A

rea

of f

iber

sfib

ers

(%)

(%)

nn 55 55 1313 1717

* = Mann Whitney test

Quantification of fibre deposition

� Modèle reproduisant les principales pathologies induites par le VHC� Niveau d’expression similaire à l’infection chronique chez l’homme� Absence de réponse immunitaire (pas d’inflammation ni de cirrhose)

� La cirrhose n’est pas un pré requis au développement de CHC : en accord avec données cliniques (méta-analyse, Maisonneuve 2009)

� Démonstration d’effets cytopathiques directs des protéines virales en absence de cirrhose.

� Inhibition de l’apoptose (voie FAS)� Inhibition de l’expression du suppresseur de tumeur GADD45b� Inhibition de la sécretion des VLDL (MTP)� Stimulation de la lipogenèse� Action co-fibrogène

Conclusions

lerat pathogénèse

Health & Medicine