mÉmoire de master 1
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RÉPUBLIQUE DE CÔTE D'IVOIRE Union - Discipline - Travail
Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
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NANGUIABROGOUA
UFR des Sciences de la Nature Année Universitaire
2012 - 2013
MÉMOIRE DE MASTER 1
Option: Protection des Végétaux et de l'Environnement
Thème : DOSAGE DES
PHÉNOLIQUES ET ÉTUDE
COMPOSÉES
DE QUELQUES
ENZYMES DU MÉTABOLISME PHÉNOLIQUE
DANS LES GRAINES CHEZ LE CULTIVAR R405-
2000 DU COTONNIER Gossypium hirsutum L.
(Malvaceae)
Présenté par :
N'GORAN Kouakou Désiré
Mémoire soutenu le 02 AOÛT 2013 devant le Jury composé de :
- Professeur. TRA BI Pézan -Docteur. KONAN Kouassi Hubert - Professeur. KOUAKOU Tanoh Hilaire
Président du Jury Membre du Jury Encadreur
DÉDICACES
Je voudrais avant toute chose, rendre gloire à l'ETERNEL DES ARMÉES qui dans sa bonté
nous à fait grâce de la vie.
A mon oncle N'GORAN Kouadio Gilbert qui est un père toujours présent pour moi.
A ma mère Y AO Amoin Collette qui ma toujours soutenu.
A BESSE Sonou Landry un ami plus qu'un frère.
A KOUADIO Kouakou Honoré et à sa famille.
A feue N'GORAN Aménan Rose ma tante.
A mes frères et sœurs.
REMERCIEMENTS
Les travaux présentés dans ce mémoire ont été effectués dans le cadre de notre stage de fin de
cycle pour l'obtention du diplôme de master 1 de protection des végétaux et de
l'environnement. Ces travaux ont été réalisés au Laboratoire de Biologie et Amélioration des
Productions Végétales (LBAPV).
La réalisation de ce mémoire a été rendue possible grâce aux soutiens et conseils de plusieurs
personnes que nous tenons à remercier :
- Prof. DJE Yao, doyen de l'UFR des Sciences de la Nature et ses collaborateurs;
- Prof. Kouadio Yatty Justin, Directeur du Laboratoire de Biologie et Amélioration des
Productions Végétales;
- notre encadreur et «père» Professeur KOUAKOU Tanob Hilaire, pour nous avoir accepté
dans son équipe, pour ces précieux conseils, son soutien financier et surtout pour sa
disponibilité à l'égard des étudiants·
- tous les enseignants chercheurs de la filière Protection des Végétaux et de l'Environnement;
- tous nos ainés en année de thèse en particulier KONAN François (pour ses conseils et la
suivie de mes travaux), Dr.Y APO Edwige, KIMOU Serge Hervé, KONE Tchoa (pour les
analyses statiques), qui m'ont soutenu lors de mes travaux. A tous mes amis de la promotion
master PVE, pour leur soutien fraternel.
Nos remerciements sont également adresser à LOUKOU Kouassi Anderson, à KOFFI
Kouadio Bruno et famille, à KOUADIO Guillaume, à KOUADIO Patrice, à ma chérie
KONAN Monique ainsi qu'à mes frères et sœurs pour leur soutien moral, matériel et spirituel.
Enfin, nous remercions tous ceux qui d'une manière ou d'une autre, nous ont aidés dans la
réalisation de ce document et que nous ne pouvons citer individuellement.
jj
LISTE DES FIGURES
Figure 1: Développement du fruit du cotonnier G .hirsutum 7
Figure 2: Graines de cotonnier avec coques (AC) 16
Figure3: Graines de coton sans coques (SC) 17
Figure 4: Teneur en phénols totaux des graines avec coques et sans coques de cotonnier cv.
R405-2000 24
Figure 5: L'activité Phénylalanine Ammonia-lyasique des graines avec coques et sans
coques de cotonnier cv. R405-2000 25
Figure 6: L'activité Tyrosine Ammonia-lyasique des graines avec coques et sans coques de
cotonnier cv. R405-2000 26
Figure 7: L'activité Peroxydasique des graines avec coques et des graines sans coques de
cotonnier cv. R405-2000 27
Figure 8: L'activité Polyphénoloxydasique des graines avec coques et des graines sans
coques de cotonnier cv. R405-2000 28
Figure 9: L'activité de l 'AIA-oxydase des graines avec coques et des graines sans coques du
cotonnier cv. R405-2000 29
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1: Liste du matériel de laboratoire utilisé pour l'étude et leur
utilisation 15
Tableau 2: Récapitulatif du métabolisme phénolique dans les graines avec coques (AC) et
dans les graines sans coques (SC) 30
iii
LISTES DE SIGLES ET ABRÉVIATIONS
AC : Graine avec coque
AIA : Acide Indole 3-Acétique
AS: Graine sans coque
C: Coque
CIDT : Compagnie Ivoirienne pour le Développement des fibres Textiles
CIRAD: Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le
Développement
CV : Cultivar
EDTA: Acide Ethylène Diamine Tétraacetique
G: Gossypium
IDESSA : Institut Des Savanes
IRCT : Institut de Recherche du Coton et des Textiles exotiques
MF : Matériel Frais
MS : Murashige et Skoog
PAL : Phénylalanine Ammonia-lyase
PEG : Polyéthylène Glycol
POD: Peroxydase
PPO : Polyphénoloxydase
PVP : Polyvinylpyrrolidone
TAL : Tyrosine Ammonia-lyase
TG : Type de graine
iv
RÉSUMÉ
Le métabolisme des composés phénoliques a été étudié dans les graines à coques et
sans coques chez un cultivar de cotonnier (Gossypium hirsutum L cv. R405-2000) cultivée en
Côte d'Ivoire. Les résultats ont montré que le taux de phénol est significativement élevé dans
les graines à coques que dans les graines sans coques. Cette variation s'expliquerait par une
forte activité des enzymes de biosynthèse (PAL et TAL) dans les graines avec coques que
dans les graines sans coques et d'une activité des enzymes de dégradation des phénols (POO
et PPO) élevée dans les graines sans coques que dans les graines avec coques. Par ailleurs,
l'analyse de l'activité del' AJA-oxydase a révélé une activité très faible dans les graines avec
coques que dans les graines sans coques. Ces résultats indiqueraient donc que les graines de
cotonnier contiendraient des composés du métabolisme secondaire.
Mots clés : Métabolisme : variété : composés phénoliques ; enzymes de dégradation ·
enzymes de biosynthèse
1 V
1 TABLE DES MATIÈRES
DÉDICACES .i
REMERCIEMENT ii
LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES iii
LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONS iv
RÉSUMÉ v
fNTRODUCTION 1
PREMIÈRE PARTIE : GÉNÉRALITÉS .4
1.1. Origine et histoire 5
l.2. Taxonomie du cotonnier 5
1 1.3. Morphologie et cycle de développement du cotonnier 5
1.4. Ecologie du cotonnier 8
1.5. Maladies et ravageurs du cotonnier 8
1.5.1. Maladies du cotonnier 8
1
1.5.2. Ravageurs du cotonnier 9
1.6. Culture du cotonnier 9
1.7. Importance du cotonnier 10
1.8. Métabolisme phénolique chez le cotonnier 11
1.8.1. Composés phénolique 11
1.8.2. Enzymes du métabolisme phénolique .12
1.8.2.1. Enzymes de biosynthèse 12
1.8.2.1.1. Phénylalanine Ammonia-lyase (P AL) 12
1.8.2.1.2. Tyrosine Ammonia-lyase (TAL) 12
1
1.8.2.2. Enzymes de dégradations 12
1.8.2.2.1. Peroxydases (POD) 12
1.8.2.2.2. Polyphénoloxydases (PPO) 13
1.8.2.3. AIA-oxydase 13
DEUXIÈME PARTIE : MATÉRIELS ET MÉTHODES 14
2.1. Matériels 15
2.1.1. Matériel biologique 15
2.1.2. Matériels techniques 15
2.1.2.1. Matériels de laboratoire 15
2.1.2.2. Produits chimiques 15
2.2. Méthodes 16
2.2.1. Obtention de graines avec coques et sans coques 16
2.2. 1. 1. Délintage des graines 16
2.2.1.2. Test de viabilité 16
2.2.1.3. Obtention des graines sans coques 17
2.2.2. Extraction des phénols totaux 17
2.2.2. 1. Extraction et dosage des phénols totaux 17
2.2.2.2. Extraction des enzymes 1 8
2.2.2.3. Purification des enzymes 18
2.2.2.4. Dosage de quelques enzymes du métabolisme phénolique 19
2.2.2.4.1. Enzymes de biosynthèse 19
2.2.2.4.1.J. Extraction et dosage des Ammonia-Lyases (PAL&TAL) .19
2.2.2.4.2. Enzymes de dégradation .20
2.2.2.4.2.1. Extraction et dosage des Peroxydases (POO) 20
2.2.2.4.2.2. Extraction et dosage des Polyphénoloxydases (PP0) 21
2.2.2.4.3. AlA-oxydase 21
2.2.2.4.4. Analyse statistique 22
TROISIÈME PARTIE: RÉSULTATS EXPERIMENTAUX 23
3.1. Teneur en phénols totaux des graines avec coques et des graines sans coques 24
3.2. Activité des enzymes du métabolisme phénolique 25
3.2.1. Enzymes de biosynthèse 25
3.2.1.1. La Phénylalanine Ammonia-lyase (PAL) 25
3.2. l .2. La Tyrosine Ammonia-lyase {TAL) 26
3.2.2. Dégradation des phénols .27
3.2.2.1. Les Peroxydases (POD) 27
3.3.2.2. Les Polyphénoloxydases (PPO) 28
3.4. Activité de I' AIA-oxydase 29
QUATRIÈME PARTIE : DISCUSSION 32
Discussion 33
CONCLUSION ET PERSPECTIVES 35
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 37
ANNEXE 44
INTRODUCTION
1
Le cotonnier est une plante de la famille des Malvacées et du genre Gossypium qui
présente 49 espèces dont quatre sont cultivées (Mergeai, 2003). Il est cultivé dans les régions
tropicales et subtropicales et sa culture occupe 2,5 % des terres arables du monde (Sèment,
1986). Sa culture en Côte d'Ivoire, constitue à côté de celle du binôme café cacao. l'un des
piliers de l'économie du pays. Il exige pour sa culture des températures élevées et constantes,
des pluies modérées et espacées (Parry, 1982). Les Etats Unis, l'Inde, la Chine,
l'Ouzbékistan et le Pakistan sont les grands producteurs, avec près de 60 % de la production
mondiale. Les pays africains, producteurs de coton, ne participent que pour 6 % de cette
production mondiale. La Côte d'Ivoire fournit près de 150.000 tonnes de coton-graines, se
plaçant ainsi au 5c rang des producteurs africains au Sud du Sahara après le Burkina-Faso, le
Bénin, le Mali et le Cameroun (Anonyme, 2004). Le coton procure à cet effet des revenus
substantiels aux masses paysannes du Centre et du Nord du pays qui sont Jes principales
régions cotonnières. Avec une production mondiale de coton-graine qui est actuellement
estimée à 27 millions de tonnes (Townstend, 2008), Je cotonnier constitue la première plante
textile au monde. L'industrie du coton fournit trois co-produits principaux : les graines,
séparées des fibres de coton par égrenage, les coques et les tourteaux, issus de la production
d'huile. Les graines fournissent entre 16 et 20 % d'huile, 25 et 30 % de coques et 45 et 50 %
de tourteaux (Sauvant et al., 2004 ; Nagalakshmi et al., 2007). La disponibilité sur le marché
des co-produits du coton est tributaire de l'offre et de la demande de coton textile qui reste le
débouché essentiel de la plante (Marquiê et Eric, 1995).
La production de graines représente entre 55 et 65 % de la récolte de coton-graine.
Cependant, sa valeur marchande atteint à peine 15 % de celle de la récolte. Tous les
constituants de la graine peuvent être séparés successivement et valorisés pour des usages
variés. Le duvet ou linter est récupéré à l'aide de machines appelées «délinteuses ». Il est
exploité dans la fabrication de coton hydrophile, de rembourrage pour matelas, ou comme
matière première pour diverses industries chimiques (Gautier, 1947 ; Lagière, 1966 ; Parry,
1982). Les coques sont ensuite séparées des amandes par une opération de décorticage et sont
généralement utilisées comme combustibles (Gautier, 1947). Les amandes restantes servent à
l'extraction d'huile comestible (Gautier, 1947); les tourteaux qui en résultent, riches en
protéine, sont utilisés pour l'alimentation des ruminants. La création de variétés de cotonnier
sans glandes à gossypol (dits glandless) a ouvert la voie pendant quelques années à une
exploitation des graines dans l'alimentation humaine (Buffet, 1979; Bourely, 1980).
2
De nouvelles possibilités de valorisation de la graine de coton sont également étudiées
notamment dans le domaine de la fabrication de matériaux biodégradables (Marquiê et Eric,
1995).
Lors de la trituration en vue d'une bonne qualité de l'huile et de la production de
tourteaux, un taux de coques optimal étant requis pour le bon fonctionnement des presses, les
usines choisissent soit de décortiquer partiellement les graines, soit de réincorporer une partie
des coques (Gilles, 1994). Mais le rôle de la coque dans les produits dérivés de la graine de
coton est mal connu.
Donc pour avoir une meilleur qualité des produits dérivés de la graine de coton pour
une sécurité alimentaire : nous nous sommes assignés comme objectif spécifique de
comprendre l'importance et surtout l'influence de la coque dans les graines de coton. Cette
étude tentera d'apprécier la variation d'un métabolisme secondaire : celui des composés
phénoliques dans les graines avec coques et sans coques de cotonnier cv. R405-2000. à
travers J'activité de quelques enzymes de biosynthèse (PAL ; TAL) et quelques enzymes de
dégradation (POD ; PPO). Cette étude sera complétée par l'analyse de l'activité de l' AIA
oxydase.
Apres cette partie introductive, la première partie de notre travail sera consacrée à la
généralité sur le cotonnier, sur les composés phénoliques et sur quelques enzymes du
métabolisme phénolique. La deuxième partie va concerner le matériel et les méthodes utilisés.
Les résultats expérimentaux seront discutés dans la troisième partie. Une conclusion de notre
travail sera tirée, suivie des perspectives qui orienteront les prochaines études.
3
' PREMIERE PARTIE :
GÉNÉRALITÉS
4
1
1.1. Origine et histoire
L'utilisation de la fibre de coton par l'homme pour son habillement ou tout autre usage
remonterait à la préhistoire. La littérature en la matière dégage essentiellement deux origines
géographiques distinctes que sont l'Asie et l'Amérique précolombienne. Le premier tissu en
coton produit dans le monde daterait d'environ 3200 ans avant Jésus Christ. Celui-ci a été
découvert dans les excavations de Mohenjo-Daro dans la vallée de l'Indus au Pakistan
occidental (Anonyme, 2005). La seconde origine du coton serait issue des civilisations
précolombiennes. Car, de vieux spécimens de coton ont été découverts dans les fouilles au
Nord de la Côte péruvienne et daterait de 2500 ans avant Jésus Christ (Parry, 1982). De ces
civilisations le coton parvint jusqu'au Mexique, puis aux Etats Unis où la principale variété
cultivée à l'heure actuelle provient de la variété précolombienne Gossypium hirsutum L.
(Anonyme, 2005). Par la suite, la culture de la plante fut répandue dans Je bassin
méditerranéen par les Arabes. En Côte d'Ivoire, la culture cotonnière à commencé en 1923
dans Je Nord du pays (Parry, 1982).
1.2. Taxonomie du cotonnier
Le cotonnier est une dicotylédone dialypétale de l'ordre des Malvales. Il appartient à
la famille des Malvaceae, tribu des Hibisceae et au genre Gossypium (Fryxell, 1979). Dans ce
genre quatre espèces ont été domestiquées 2 espèces diploïdes, Gossypium arboretum L. et
Gossypium herbaceum L. ; et deux autres espèces tétraploïdes que sont Gossypium
barbadense L. et Gossypium hirsutum L. Cette dernière espèce est économiquement la plus
importante et fournit plus de 95 % de la production mondiale du coton (Munro, 1994).
1.3. Morphologie et cycle de développement du cotonnier
Le cotonnier est un arbuste pérenne de 1,5 mètre de haut. 11 est cultivé comme une
plante annuelle dans le but de limiter les dégâts causés par les maladies et ravageurs.
11 est constitué d'une racine pivotante avec des ramifications latérales et une tige
verticale sur laquelle se développent, articulées en spirales, des branches latérales appelées
soit:
-des branches végétatives (monopodes); celles qui sont situées à la base du plant;
5
-des branches fructifères (sympodes); celles qui sont situées plus haut sur la tige (ou sur les
branches végétatives) et qui portent directement les fleurs, puis les capsules (Parry, 1982).
Les feuilles se développent sur les nœuds de la tige et des branches. A l'aisselle des
feuilles, des bourgeons donnent naissance soit à une branche. soit à des branches fructifères à
une fleur. Les fleurs fécondées deviennent des fruits (capsules), qui comprennent 3 à 5
compartiments (loges) renfermant des graines et les fibres (Sement, 1986). Le cotonnier
évolue suivant 4 phases:
La première phase correspond à la levée qui commence de la germination après semis
à l'étalement des cotylédons. Cette phase se situe entre 6 à 10 jours en conditions favorables
(Demol et al., 1992). La seconde phase correspond au stade plantule. Elle débute par la
croissance de la plante depuis l'apparition des feuilles jusqu'à l'ouverture de la première fleur
du cinquantième au soixantième jour après le semis. Cette phase se caractérise par un
développement racinaire intense. L'hypocotyle s'allonge, le bourgeon terminal forme des
feuilles et des bourgeons latéraux à chaque nœud. La première vraie feuille (non lobée)
apparait environ 6 à 8 jours après la levée avec la formation simultanée de 6 ou 7 initiales
feuilles supplémentaires (Parry, 1982). Le stade plantule est suivi d'une troisième phase
appelée phase de reproduction qui comprend la floraison, la formation et la maturation des
capsules (figure 1 ). La floraison commence au premier nœud de la branche fructifère et se
poursuit en progressant à la fois sur la branche supérieur et d'un nœud à l'autre le long des
branches ; la fleur est de couleur blanche crème le matin de l'ouverture puis se teint pour
devenir rose le lendemain. La floraison est lente au début, s'intensifie ensuite pour atteindre
un maximum au début de 25 à 30 jours (Sement, 1986).
La quatrième et dernière phase correspond à la maturation des capsules. Cette phase
nécessite 3 à 4 semaines pour que les capsules atteignent leur taille définitive et 2 à 3
semaines pour qu'elles se dessèchent et s'ouvrent en laissant apparaître le coton graine
(figure l). Du semis à la récolte le cycle de développement du cotonnier est de 145 à 185 jours
(Parry, 1982).
6
Figure 1: Phases de développement du fruit du cotonnier G. hirsutum (Archives CIRAD)
A : Fleur de cotonnier
B : Capsule verte
C : Capsule ouverte
7
1.4. Ecologie du cotonnier
Le cotonnier demande des sols profonds, perméables, et assez homogènes. Il préfère
les limons argile-sableux ou sable-argileux (Parry, 1982). Le développement du cotonnier est
optimal pour des pH compris entre 6 et 7 tandis que les sols trop humides sont défavorables
(Kouamé, 2000). Les températures favorables à une bonne germination se situent entre 25 et
30 °C alors que celles nécessaire pour le développement végétatif maximal varient entre 27 et
32 °C (Parry, 1982). Le cotonnier exige beaucoup de lumière et de chaleur en fonction des
différentes phases de son cycle (Munro, 1994). Il a aussi besoin durant son cycle végétatif
d'une pluviométrie allant de 600 à 800 mm et d'une sécheresse absolue au moment de
l'ouverture des capsules. Des périodes trop longues d'humidité relative supérieure à 90 %
peuvent affecter la fécondation et provoquer d'importantes chutes de rendement. Le mauvais
drainage ou l'inondation des parcelles sont à éviter (Anonyme, 2004). En Côte d'Ivoire,
seules les zones du Nord, du Centre et de l'Est possèdent des contions pédoclirnatiques
favorables à cette culture.
1.5. Maladies et ravageurs du cotonnier
1.5.1. Maladies du cotonnier
Les maladies du cotonnier représentent une cause importante dans la perte de
production de coton.
- les agents pathogènes responsables des maladies du cotonnier sont les champignons,
les bactéries, les virus ou les mycoplasmes (Delattre, 1973 ; Parry, 1982 ; Delhove et al.,
1992). Les maladies les plus courantes sont:
- les fontes de semis dues à Rhizoctonia solani se manifestent peu de temps après la
levée. Les plantes atteintes de cette maladie flétrissent et présentent des nécroses au niveau du
collet·
- la Tracheomycose due à Fusarium oxysporium f sp. vasinfectum. Les champignons
envahissent l'intérieur de la plante et bloquent les vaisseaux conducteurs où circule la sève ce
qui provoque un dépérissement de la plante ;
8
- les pourritures des capsules causées par les champignons (Nematospora sp Diplodia
gossypina, Colletotrichum spp.), elles attaquent des fibres, ce qui entraine une baisse de la
qualité des fibres. L'attaque des champignons survient après les piqûres d'insectes.
1.5.2. Ravageurs du cotonnier
Il existe plus de 13000 espèces d'insectes pouvant attaquer le cotonnier (Pearson,
1958; Semeot, 1986).Parmi les plus courants et endogènes à la culture de cette plante, on peut
citer quelques uns:
- le Ver rose du cotonnier (Pectinophora gossypiella). IL se nourrit de graines de la
plante depuis l'intérieur et peut avoir des conséquences importantes sur le rendement au
niveau de la récolte en particulier en Afrique et en Inde·
- les mouches blanches (Bremisia gossypiella). Elles sucent la sève des feuilles et sont
particulièrement dévastatrices en Inde et en Afrique ;
- le puceron du cotonnier (Aphis gossypii). JI colonise les jeunes plants du cotonnier. li
suce la sève des feuilles et dépose dessus un miellat ( excrément liquide. riche en sucres et en
acides aminés) qui brûle les feuilles et diminue leur capacité pbotosynthétique.
- les nématodes. Il existe 128 espèces de nématodes qui peuvent s'attaquer au
cotonnier et causer d'énormes dégâts aux plantes (Sement, 1986)
1.6. Culture du cotonnier
La culture cotonnière est pratiquée dans de nombreux pays du monde. Elle s'étend à
l'intérieur d'une bande alJant de 47 ° de latitude nord à 32 ° de latitude sud. Toutefois, elle est essentiellement pratiquée dans les zones semi-arides et arides des régions tropicales et
subtropicales.
En Afrique de l'ouest comme en Côte d'Ivoire, la cuJture du cotonnier connaît une
longue histoire. Ce n'est qu'après une phase de recherche réalisée par l'Institut de Recherche
du Coton et des textiles exotiques (I.R.C.T), créé en 1946, que le gouvernement a décidé la
vuJgarisation du cotonnier Gossypium hirsutum en 1960 (Anonyme, 1985).
9
Cette décision était fondée sur des mesures pour la diversification des spéculations
présentes en Côte d'Ivoire (café, cacao, bois au sud et coton au nord). Actuellement, c'est le
coton appartenant à l'espèce Gossypium hirsutum qui est cultivé en Côte d'Ivoire, une espèce
plus rentable et donnant des fibres de qualité ; mais qui présente deux inconvénients majeurs :
vulnérabilité face au parasite et exclusivisme culturale (Delattre, 1973).
Deux types de variétés sont cultivés en Côte d'Ivoire:
Le type dit classique à fibres de longueur moyenne ou longue dont les tissus contiennent
de petits sacs remplis de substances toxiques appelées gossypol; fibres de longueur moyenne
(NTA 88-6, R 405, ISA 205-K), fibres longues (ISA 319-A, BULK SR), et le type dit
glandless (où le gossypol a été génétiquement éliminé) introduit et vulgarisé dans le pays
depuis 1974 (ISA GL6, ISA GL7, ISA GL8, ISA LP5, ISA MG 11, etc.).
En Afrique de l'ouest, pour assurer une meilleure production, les semis de cotonnier sont
généralement réalisés en début de saison de pluies, afin de permettre une floraison et une
fructification dès le relèvement de l'ensoleillement (Couilloud, 1989). Ainsi, en Côte
d'Ivoire, depuis 1985, le service de vulgarisation de la CIDT a conseillé aux producteurs de
semer à la période allant de mai à juillet.
. Les surfaces cultivées en Côte d'Ivoire ont considérablement augmenté depuis 1960 et la
production cotonnière a connu un essor considérable. Aujourd'hui, la culture cotonnière
occupe plus de la moitié du territoire ivoirien. Elle a débuté dans le nord pour s'étendre
progressivement vers le centre du pays, depuis la zone savanicole de Tengrélajusqu'à la zone
pré-forestière de Yamoussoukro.
1.7. Importance du cotonnier
Le cotonnier est cultivé à la fois pour ses fibres et ses graines qui constituent les
matières premières intéressantes pour les industries textiles et agroalimentaires (Sement,
1986). En pharmacie, les fibres de coton à la confection de coton hydrophile, de la ouate. de
coton iode etc. Le service des poudres fabrique des explosifs comme le fulmicoton, la
nitrocellulose, etc. Les graines sont oléagineuses et fournissent une huile alimentaire après
élimination du gossypol qui est toxique. Les tourteaux sont utilisés dans l'alimentation du
bétail et dans la fabrication de farines comestibles par l'homme riche en protéines, lorsqu'ils
proviennent des graines sans glandes à gossypol dites glandless.
10
Les coques servent de combustible et peuvent également servir à la fabrication de
charbon, de carburant, de pate à papier, etc. Le duvet ou linter, qui est un ensemble de petits
poils très courts se trouvant à la surface des graines des cotonnier sert à différents usages
comme la fabrication de vernies, de fibres de disques, d'explosifs, de feutre, de rembourrages
de papiers fins, de similicuir, etc. (Anonyme, 1993). Le cotonnier est donc à la fois une
plante industrielle et une culture vivrière.
En Afrique de l'ouest et du centre, environ 10 millions d'individus dépendent de la
production et de la transformation cotonnières pour leur revenu. En outre, même si les pays de
l'Afrique de l'ouest ne sont pas les premiers états producteurs du continent, leur dépendance
économique envers ce produit est forte, à l'instar du Mali dont le coton représente 60 % des
entrées en devises.
1.8. Métabolisme phénolique chez le cotonnier
1.8.1. Composés phénolique Les substances appartenant au groupe des composés phénoliques sont très hétérogènes
tant par leur composition que par leur structure. Considérées comme des substances
secondaires, métaboliquement inactives, elles ne suscitaient que peu d'intérêt. Mais les
recherches de ces dernières années ont démontré que les composés phénoliques ne sont
nullement des produits inertes du métabolisme. Ils sont soumis, dans les tissus végétaux, à
d'importantes variations quantitatives et qualitatives, témoignant ainsi d'un dynamisme
biochimique incontestable (Davies et al., 1964). Les composés phénoliques interviennent
dans les processus vitaux les plus divers. Les expériences avec les précurseurs marqués au
carbone 14 ont permis de préciser les principales étapes de la biosynthèse des polyphénols.
Deux voies différentes de leur formation sont actuellement connues (Neish, 1964 ; Conn,
1964). L'une lié au métabolisme des acides gras et l'autre lié au métabolisme des glucides et
des acides aminés. Les composés phénoliques ont une activité antioxydante et permettent de
conserver convenablement l'huile après la trituration des graines (Hammadi, 2006). Ils sont
responsables de la qualité gustative de l'huile et de sa stabilité (Visioli et al., 1998; Arrigo et
al., 1995) et représentent un intérêt en terme de santé humaine, notamment au niveau des
maladies cardiovasculaires et des cancers grâce à leur effet antioxydants (Owen et al.,2000).
Les composés phénoliques sont également utilisés comme additifs dans l'industrie
agroalimentaire, pharmaceutique et cosmétique (Laughton et al., 1991 ; Cben et al., 2004).
11
1.8.2. Enzymes du métabolisme phénolique
1.8.2.1. Enzymes de biosynthèse
1.8.2.1.1. Phénylalanine ammonia-lyase (PAL)
La phénylalanine ammonia-lyase (PAL) est la première enzyme impliquée dans la voie
de biosynthèse des phénylpropanoïdes (Mazeyrat et al., 1999). Son substrat est la
phénylalanine. Cette enzyme joue un rôle dans la résistance des plantes par production des
précurseurs des lignines et de l'acide salicylique et d'autres composés phénoliques. Son
activité permet de générer l'acide cinnamique qui est une molécule-clé du métabolisme des
phénols (Richter, 1993).
1.8.2.1.2. Tyrosine ammonia-lyase (TAL)
C'est une enzyme de biosynthèse des phénols par la voie de la tyrosine. La TAL joue
un rôle important dans le mécanisme de défense de la plante face aux pathogènes. En effet,
comme la PAL, c'est un précurseur des lignines et de nombreux composés phénoliques qui
d'après Morrelo et al., (2005), posséderaient une activité antifongique.
1.8.2.2. Enzymes de dégradations
1.8.2.2.1. Peroxydases (POD)
Les peroxydases (POD) sont des oxydoréductases largement répandues chez les
végétaux. Elles interviennent dans la détoxification des cellules par élimination des peroxydes
d'hydrogène (Kanazawa et al., 2000). Les peroxydases catalysent l'oxydation d'une variété
de composés phénoliques, notamment les monophénols de façon préférentielle comme l'ont
mentionné plusieurs auteurs (Santimone, 1973; Castillo et al., 2002). Les peroxydases
catalysent aussi l'oxydation des monophénols en monoquinones qui sont des fongitoxines
(Nicholson et Hammers-chidt, 1982). Elles sont connues pour êtres multifonctionnelles en
participant à une vaste gamme de processus physiologique tels que la défense contre les
pathogènes, la croissance et la différenciation cellulaire (Rudra et al., 2008)
12
1 1 1 1 1 1
1.8.2.2.2. Polyphéooloxydases (PPO)
Ce sont des oxydoréducteurs capables de catalyser l'oxydation des polyphénols en
diquinones (Mayer, 1987). Leurs principaux substrats sont la catéchine, la quercétine et les
dérivés hydroxycinnamiques (Cheynier et al., 1989 ; Machaeix et al., 1990 ; Kouakou,
2003). Leurs activités augmentent au cours des attaques fongiques dans les plantes
(Constabel et al., 1995), et les diquinones produits serait doués d'activité antifongique
(Cvicova et al., 1996 ; El Bellaj et El Hadrami, 1998). De ce fait, ces enzymes peuvent
constituer un paramètre de mesure de la défense des plantes.
1.8.2.3 AIA-oxydase
L' AIA-oxydase est une enzyme impliquée dans la dégradation de l' AIA. Elle joue un
rôle important dans le métabolisme des plantes et peut affecter la dédifférenciation cellulaire
en modulant les concentrations en AlA endogène et en catalysant l'incorporation des
composés phénoliques dans les parois cellulaires (Pedreno et al., 1997). L'oxydation de
l' AlA génère du H202 qui est utilisé dans les réactions d'oxydation des composés phénoliques
par les peroxydases (El Bellaj et El Hadrami, 1998).
13
' DEUXIEME PARTIE:
MATÉRIELS ET MÉTHODES
14
2.1. Matériels
2.1.J. Matériel biologique
Le matériel végétal est constitué de graines de coton cultivar R 405-2000 fourni par la
Compagnie Ivoirienne du Développement du Textile (CIDT). R 405-2000 est un cultivar
originaire de Côte d'Ivoire (cultivar local) généralement produit dans les régions de Niellé
M'bingué, Korhogo.
2.1.2. Matériels techniques
2.1.2.1. Matériels de laboratoire
Au cours de cette étude. les expérimentations réalisées ont nécessité l'utilisation de
différents instruments et appareils de laboratoire. La liste nominative et l'utilisation de ces
instruments ont été consignées dans le tableau I.
Tableau 1: Liste du matériel de laboratoire utilisé pour l'étude et leur utilisation.
Matériels de laboratoire Utilisation
Tubes à essai (de diamètre 25 mm) et de Culture, Dosage
longueur (25 x 150)
Boite de pétri en pyrex Manipulation des graines
Pinces Manipulation des graines
Balance de précision Pesée des produits Mortier Broyage PH-mètre Ajustement du P11 du milieu
Thermomètre Sert à mesurer les températures du milieu
Centrifugeuse Centrifugation des solutions
Spectrophotomètre Lecture des Densités Optiques (DO)
2.1.2.2. Produits chimiques
Les produits chimiques qui ont été utilisés pour les extractions et dosages sont entre autres:
l'éthanol 80 %. Je réactif de Folin -Ciocalteu, la tyrosine, Dowex 2, , le gaïacol, borate de
sodium, phénylalanine, citrate de odium pyrocatéchol, acide sulfurique
15
polyvinylpyrrolidone (PVP), acide p-coumarique, MnCl, AIA, polyéthylèneglycol 6000 (PEG
6000), EDT A, mercaptoétbanol.
2.2. Méthodes
2.2.1. Obtention des graines sans coques et avec coques
L'obtention des graines sans coques et avec coques pour nos manipulations s'est fait en
plusieurs étapes :
2.2.1.1. Délintage des graines
Les graines ont été débarrassées de leurs fibres (linter) avec de L'acide sulfurique concentré.
Elles ont été ensuite rincées à l'eau. Nous avons obtenu des graines dites délintées (figure 2)
Figure 2: Graines de cotonnier graines avec coques (AC) débarrassées des fibres
(déliotées)
2.2.1.2. Test de viabilité
Les graines délintées ont été plongées dans un récipient d'eau. Celles qui ont immergé
sont dites viables. Elles sont séchées et utilisées pour nos manipulations. Les graines qui
émergent sont dites non viables.
16
2.2.1.3. Obtention des graines sans coques
Les graines viables séchées ont été imbibées dans de l'eau distillée stérile. 48 heures
après les graines dont l'amande a sailli ont été débarrassées de leurs coques à l'aide d'une
pince. Nous avons obtenu les graines sans coques (amandes) (figure3).
Figure 3: Graines de coton sans coques(SC)
2.2.2. Extraction des phénols totaux
Le dosage des phénols totaux a été effectué sur le matériel végétal frais et a concerné
les graines avec coques et sans coques.
2.2.2.1. Extraction et dosage des phénols totaux
Extraction
Environ 0,5 g du matériel végétal frais est broyé dans 5 ml d'éthanol 80 %. Le broyat
a été centrifugé à 5000 trs/min pendant 5 min à 4°C. Le surnageant obtenu constitue l'extrait
brut sur lequel a été effectué le dosage des phénols totaux.
Dosage
Le dosage des composés phénoliques s'est fait par la méthode de Singleton et al,
(1999), modifié et adapté à notre matériel végétal. Le mélange réactionnel est composé
principalement d'acide phosphotungstique et d'acide phosphomolybdique qui est réduit en
milieu alcalin, parallèlement à l'oxydation des phénols. La présence de phénol est révélée par
l'addition de 0,5 mJ de réactif de Folin- Ciocalteu IN et de 1,5 carbonate de sodium 17 % à
17
0,5 ml d'extrait brut, suivie d'une incubation de 30 à 45 mn. L'intensité de la coloration bleue
produite par cette réaction, proportionneUe à la concentration des composés phénoliques de
l'extrait est suivie au spectrophotomètre à la longueur d'onde de 765 nm.
. Lors du dosage, un témoin est réalisé où l'extrait phénolique est remplacé par l'eau
distillée. Le taux de phénols totaux est déterminé à l'aide d'une droite d'étalonnage réalisé
avec différentes concentrations d'acide gallique (1 OOµg/ml) et est exprimé en mg/g de matière
fraiche (MF).
2.2.2.2. Extraction des enzymes
Le tampon requis pour l'extraction des substances enzymatiques sera fonction des
enzymes étudiés et donc précisé ultérieurement pour chacune d'entre elles. L'extraction des
enzymes est réalisée à froid: 4 °C (pour prévenir les actions inhibitrices des composées
phénoliques et des enzymes protéolytiques) par broyage de 0,5g du matériel végétal frais
(graine) dans du tampon d'extraction. Lors du broyage 1,2 ml d'une solution dite milieu
d'extraction composée de 0,5 ml de polyéthylèneglycol 6000 (PEG 6000) est utilisée pour
fixer les composés phénoliques, de 0,25 % de thiosulfate de sodium afin de protéger les sites
enzymatiques, 15 % de glycérol pour la stabilité des systèmes enzymatiques. de l'EDTA 1
mM comme complexant et de mercaptoéthanol 15 mM est ajoutée comme composés
réducteurs pour prévenir les oxydations enzymatiques. Après centrifugation. à 5000
tours/min. pendant 20 min, le surnageant obtenu représente l'extrait brut d'enzymes.
2.2.2.3. Purification des extraits bruts
Un extrait brut renferme un grand nombre d'inhibiteurs. La plupart des inhibiteurs
sont de nature ionique. Pour les fixer nous avons utilisé une résine échangeuse d'anions
basiques: le DOWEX 2. Il est dissout dans notre extrait brut puis incubé pendant 30 min. sous
agitation. On réalise une centrifugation afin d'éliminer le DOWEX 2 (qui a fixé les ions
inhibiteurs). Le surnageant obtenu constitue la fraction enzymatique purifiée prête à être
analysée.
18
2.2.2.4. Dosage de quelques enzymes du métabolisme phénolique
2.2.2.4.1. Enzymes de biosynthèse
2.2.2.4.1.1. Extraction et dosage des Ammonia-Lyases (PAL et TAL)
Tl s'agit de la PAL et de la TAL. La réaction catalysée par ces deux enzymes est
irréversible et l'évolution spectrophotométrique de la vitesse de production respectivement
des acides cinnamiques et acides p-coumarique traduit l'activité enzymatique.
Extraction
L'extraction de l'extrait enzymatique se fait dans les conditions que celle des peroxydases.
Dosage
Le dosage de l'activité de la PAL a été réalisé grâce à la méthode décrite par Zucker
(1965) modifiée et adaptée à notre matériel végétal. Le tampon de base utilisé est le borat
de sodium. Le mélange réactionnel contient :
OJ ml d'extrait enzymatique·
1 ml de phénylalanine 0, 1 M ;
1.9 ml de tampon borate de sodium 0,2 M pH 8,8.
Après 10 mn d'incubation à la température ambiante, l'activité de la PAL et de la TAL
qui est directement proportionnelle à la quantité d'acide cinnamique et d'acide p-coumarique
formée. est suivie au spectrophotornètre à 290 nm. Lors du dosage. un essai témoin est réalisé
pour chaque extrait dans lequel la solution de phénylalanine ou la tyrosine est remplacée par
le tampon borate de sodium 0,2 M à pH 8,8. L'activité enzymatique de la PAL et de la TAL
est respectivement exprimée en rnillimole d'acide cinnamique et d'acide p-cournarique formé
par minute par gramme de matière fraiche, en considérant que le coefficient d'extinction
molaire de J 'acide cinnamique est égal à 19600 cm-1 mol" et celui de 1 'acide p-coumarique est
égal à 17600 cm" mol" .
19
2.2.2.4.2. Enzymes de dégradation
2.2.2.4.2.1. Extraction et dosage des peroxydases (POO)
Extraction
Environ 0.5 g de matériel végétal est broyé en présence de 5 ml de tampon phosphate et
1.2 ml de produits X (mélange de plusieurs produits). Le broyat est centrifugé à 5000 trs/mn
pendant 20 min. Le DOWEX est ajouté au surnageant obtenu puis, centrifugé comme
précédemment. Le surnageant recueilli après cette deuxième centrifugation constitue l'extrait
enzymatique.
Dosage
L'activité des peroxydases a été dosée d'après la technique décrite par Santimone (1973).
Le mélange réactionnel est composé :
0.2 ml d'extrait enzymatique ;
1,4 ml de substrat constitué d'une solution de gaïacol 10-2 M;
1 .4 ml de solution d'acide sulfurique.
Après agitation, le mélange réactionnel est incubé pendant 10 mn à l'obscurité pour empêcher
la destruction partielle (à la lumière) du produit d'oxydation brun rouge formé à partir du
gaïacol en présence d'eau oxygénée. Un délai d'une minute est laissé entre les tubes lors de
l'addition de l'extrait enzymatique au substrat. L'oxydation du gaïacol est suivie au
spectrophotomètre à 470 nm, en respectant toujours le délai d'une minute entre les tubes. On
réalise un témoin où le substrat est remplacé par le tampon phosphate de sodium 0, 1 M, pH
7,5.
L'activité des peroxydases est exprimée en millimole de produit formé par minute par
gramme de matière fraiche. Le coefficient d'extinction molaire du produit formé à 4 70 nm est
égal à 26,6 cm" mor1 (Santimone, 1973).
20
2.2.2.4.2.2. Extraction et dosage des polyphénoloxydases (PPO)
Extraction
L'extraction de l'extrait enzymatique s'est fait dans les mêmes conditions que celle des
peroxydases et de la PAL, sauf qu'ici le tampon phosphate est remplacé par le tampon citrate.
Dosage
Le dosage de l'activité des PPO s'est fait selon la méthode de Joslyn et Ponting (1951)
modifiée et adaptée à notre matériel végétal. Le mélange réactionnel, incubé pendant 10 min à
la température ambiante (25 °C) est composé de :
OJ ml d'extrait enzymatique ·
1 ml de pyrocatéchol 130 mM ·
1,9 ml de tampon phosphate citrate 0,1 pH 6.5·
la lecture de la densité optique est faite au spectrophotomètre à 500 nm
contre un essai témoin dans lequel Je pyrocatéchol set remplacé par le
tampon phosphate citrate 0,1 M, pH 6,5. L'activité enzymatique des PPO
sera exprimée en variation de l'absorbance (600) par minute par gramme de
matière fraiche (Ngalaoi et Crouzet, 1986).
2.2.2.4.3. AIA-oxydase
L'activité de I' AIA-oxydase a été dosée selon la méthode El Bellaj et El Hadrami
(l 998) modifiée et adaptée à notre matériel végétal.
L'extraction des enzymes est faite avec le tampon phosphate pH 7,5 et 1 % de PVP.
0.5 g de graine a été broyé dans 10 ml de tampon phosphate pH 7,5 et 1 % de PVP. Le broyat
est centrifugé à 12000 trs/min pendant 20 min afin d'obtenir L'extrait enzymatique.
Le dosage est fait dans un volume réactionnel, constitué de 0,2 ml d'extrait
enzymatique, 0,3 ml de MnCl, 0,5 ml d'acide p-coumarique I rnM et 0,5 ml d' AIA 1 mM.
Après une première incubation faite à 30 °C pendant 20 min, 1,5 ml du réactif de Salkowsk:y
est ajouté au volume réactionnel. Une deuxième incubation de 30 min est faite à l'obscurité.
L'essai témoin est réalisé dans lequel le réactif de Salkowsky est remplacé par le tampon
phosphate pH 7,5 et 1 % de PVP. L'activité de J'AIA-oxydase est suivie au
21
spectrophotomètre à 530 nm. L'activité del' AIA-oxydase est déterminé à l'aide d'une courbe
étalon (annexe) réalisé avec différentes concentrations d'une solution mère d'AIA (125
µg/ml) et est exprimée en µg/min / g de matière fraîche
2.2.2.4.4-Analyse statistique
Les valeurs des différents paramètres étudiés représentent la moyenne de trois
expériences distinctes (chaque expérience comporte 3 essais). L'analyse statistique des
résultats a été réalisée grâce au logiciel STA TISTICA 7 .1. L'analyse de la variance
(ANOV A) à un critère de classification suivie de la comparaison des moyennes par la
méthode de NEWMAN-KEULS à un risque de 5%, a été réalisée afin de comparer les
différents paramètres.
22
' TROISIEME PARTIE : , ,
RESULTATS EXPERIMENTAUX
23
3.1- Teneur en phénols totaux des graines avec coques et des graines sans coques
La teneur en phénols totaux des graines de cotonnier avec coques (AC) et ceux des
graines sans coques (SC) est représentée par la figure 4. U analyse de cette figure montre que
la teneur en phénol totaux des graines avec coques AC (1,03 ± 0,01 mg/g MF) est
significativement pJus élevée que celle des graines sans coques SC (0,63 ± 0,06 mg/g MF). La
teneur en phénols totaux augmente donc considérablement avec la présence de la coque.
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;ë 1 0,6
0,4
0,2
0
AC
b
SC Type de graine
les histogrammes portant les leures différentes sont significativement différents au seuil de 5 % (test de
Newman-keuls)
Figure 4 : Teneur en phénols totaux des graines avec coques et sans coques de cotonnier cv. R405-2000. AC : graines avec coques ; SC : graines sans coques
24
3.2- Activité des enzymes du métabolisme phénolique
3.2.1- Enzyme de biosynthèse
3.2.1.1- La Phénylalanine Ammonia-lyase (PAL)
L'activité Phénylalanine Ammonia-lyasique des graines avec coques (AC) et celle des
graines sans coques (SC) est représentée par la figure 5. Cette activité est significativement
plus élevée chez les graines avec coques AC (58. 10·3 ± 0,01 µmol/g MF) que celle des graines
sans coques SC (12 10·3 ± 0,01 µmol/g MF).
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0 ,00003
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0,00001
0
AC
b
SC Type de graine
les histogrammes portant des lettres différentes sont significativement différents au seuil de 5 % (test de
Newman-keuls)
Figure 5 : L'activité phénylalanine ammonia-lyasique des graines avec coques et
sans coques de cotonnier cv. R405-2000. AC : graines avec coques ; SC : graines sans
coques
25
3.2.1.2. La Tyrosine Ammonia-lyase (TAL)
L'activité Tyrosine Ammonia-lyasique des graines avec coques (AC) et celle des
graines sans coques (SC) est représentée par la figure 6. Cette activité est significativement
plus élevée chez les graines avec coques AC (67. 10-3 ± 0,01 µmol/g MF) que celle des graines
sans coques SC (19 10-3± 0,01 µmoJ/g MF).
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0,00003
0,00002
0,00001
0
AC
b
SC Type de graine
Les histogrammes portant des lettres différences sont significativement différents au seuil de 5 % (test de
Newman-keuls)
Figure 6 : L'activité Tyrosine Ammonia-lyasique des graines avec coques et sans
coques de cotonnier cv. R405-2000. AC: graines avec coques; SC: graines sans coques
26
3.2.2. Dégradation des phénols
3.2.2.1 Les Peroxydasique (POO)
L'activité Peroxydasique des graines avec coques (AC) et celle des graines sans
coques(SC) est représentée par la figure 7. Cette activité est significativement plus élevée
chez les graines sans coques SC (42, 19 ± 0,01 µmol/g MF) que celle des graines avec coques
AC (14, 77 ± 0,01 umol/g MF).
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0,02 1 b 0,015
0,01
0,005
0 AC
a
se Type de graine
Les histogrammes portant des lettres différentes sont significativement différents au seuil de 5 % ([est de
Newman-keuls)
Figure 7 : L'activité Peroxydasique des graines avec coques et des graines sans
coques de cotonnier cv. R405-2000. AC: graines avec coques; SC: graines sans coques
27
3.2.2.2. Les Polyphénoloxydases (PPO)
L'activité Polyphénoloxydasique des graines avec coques (AC) et celle des graines
sans coques (SC) est représentée par La figure 8. Cette activité est significativement plus
élevée chez les graines sans coques SC (15,50 10·3 ± 0,01 ADO/g MF) que celle des graines
avec coques AC (14,85 10·3± 0,01 ADO /g MF).
0,016
0,0158
0,0156
0,0154 J b
0,0152
0,015
0,0148
0,0146
0,0144 AC
a
SC Type de graine
Les histogrammes portant des lettres differentes sont significativement différents au seuil de 5 % (l'est
de Newman-keuls)
Figure 8 : L'activité polypbénoloxydasique des graines avec coques et des graines
sans coques de cotonnier cv. R405-2000. AC : graines avec coques ; SC : graines sans
coques
28
3.3. Activité de I' AJA-oxydase
L'activité de I' AJA-oxydase des graines avec coques (AC) et celle des graines sans
coques (SC) est représentée par la figure 9. Cette activité est significativement plus élevée
chez les graines sans coques SC (16,27 ± 0,19 µg/g MF) que celle des graines avec coques
AC (5,13 ± 0,23 µg/g MF).
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8
6 J b
4
2
0
AC
a
SC Type de graine
Les histogrammes portant des lettres différentes sont significativement différents au seuil de 5 % (Test de Newman-keuls)
Figure 9: L'activité de I' AIA-oxydasique des graines avec coques et des graines
sans coques du cotonnier cv. R405-2000. AC : graines avec coques ; SC : graines sans coques
29
L'ensemble de ces résultats montre que les activités des enzymes de biosynthèse (PAL
et TAL) sont significativement plus élevées dans les graines à coques que dans les graines
sans coques, tandis que celle des enzymes de dégradation (PPO et POD) sont
significativement plus élevée dans les graines sans coques que dans les graines avec coques.
Pour mieux percevoir les variations des différentes variables étudiées au cours du
métabolisme phénolique des graines de cotonnier avec coques (AC) et sans coques (SC), il
nous a paru utile de réaliser un tableau récapitulatif du métabolisme phénolique des graines de
cotonnier avec coques et sans coques(Tableau 2).
Tableau 2 : Récapitulatif du métabolisme phénolique dans les graines avec coques (AC)
et dans les graines sans coques (SC)
VARIABLES
T Phénols PALx 10·3 TALx 10-J POO PPOx 10-J
G (mg/g MF) µmol/g MF µmol/g MF µmol/g MF ADO/g MF
AC 1,03 ± O,Ola 58 ± O,Ola 67 ± O,Ola 14,77±0,0lb 14,85 ± 0,01 b
SC 0,63 ± 0,06b 12 ±0,0lb 19 ± O,Olb 42,19±0,0la 15,50 ± 0,0 la
C (+) 0,4 (+) (+) (-) (-)
AJA Oxydase
µg/gMF
5, 13 ± 0,23b
16,27 ±0,19a
(-)
Dans la même colonne, les chiffres suivis de différentes lettres son/ statistiquement différentes au seuil de 5 %
(Tes/ de Newman-keuls)
TG : type de graine ; AC : graine avec coque ; SC : graine sans coque ; C : coque ;
(+)Augmentation;(-) Diminution
Ce tableau nous a permis de constater qu'au stade des graines où nous avons effectué notre
analyse·
La teneur en phénols totaux qui est de 1,03 ± 0,01 mg/g MF en moyenne dans les graines avec
coques (AC) est passée à 0,63 ± 0,06 mg/g MF dans Jes graines sans coques (SC) soit une
différence de 0,4 mg/g MF de phénols totaux contenus dans les coques. Cette teneur
représente environ 30 % des composés phénoliques totaux des graines.
L'activité Phénylalanine Arnmonia-Iyase (PAL) qui est de 58.10-3 ± 0,01 µmol/g MF en
moyenne dans les graines avec coques (AC) est passée à 12 10-3 ± 0,01 µmol/g MF dans les
30
graines sans coques (SC) soit une diminution de 46 10·3 µmol/g MF. Cette activité participe à
environ 38,82 % de ]'activité totale de la PAL à la biosynthèse des phénols dans les graines.
L'activité Tyrosine Ammonia-lyasique (TAL) qui est de 67.10·3 ± 0,01 µmol/g MF en
moyenne dans les graines avec coques (AC) est passée à 19 l 0-3 ± 0,0 l µmol/g MF) dans les
graines sans coques (SC) soit une diminution de 48 10·3 µmol/g MF. Cette activité participe à
environ 45 % de l'activité totale de la TAL à la biosynthèse des phénols dans les graines.
L'activité Polyphénoloxydasique (PPO) qui est de 14,85 10·3 ± 0,01 WO /g MF en moyenne dans les graines avec coques (AC) est passée à 15,50 10·3 ± 0,01 WO/g MF celle dans les
graines sans coques (SC) soit une augmentation de 0,65 10·3 l'.).DO/g MF d'activité de la PPO
due à l'absence de coques.
L'activité Peroxydasique (POO) qui est de 14,77 ± 0,01 µmol/g MF dans les graines avec
coques (AC) est passée à 42,19 ± 0,01 µmol/g MF dans les graines sans coques(SC) soit une
augmentation de 27,42 umol/g MF d'activité de la POD due à l'absence de coques.
Aussi nous avons observé que l'activité de l' AIA-oxydase est significativement plus élevée
dans les graines sans coques (SC) que dans les graines avec coques (AC).
31
' QUATRIEME PARTIE :
DISCUSSION
32
1-Effet des phénols totaux dans les graines
Les résuJtats de nos travaux ont montré que pour la même variété de cotonnier le taux
de phénols totaux varie dans les graines selon la présence ou non de coques. En effet, cette
teneur est passée de 1,03 ± 0,01 rng/g MF en moyenne dans les graines avec coques (AC) à
0.63 ± 0.06 mg/g MF dans les graines sans coques (SC) soit une différence de 0,4 mg/g MF
de phénols totaux contenus dans les coques. Cette teneur représente environ 30 % des
composés phénoliques totaux des graines. Ce qui laisse présager d'une importance des coques
dans l'accumulation des composés phénoliques dans les graines. Des résultats similaires ont
été rapportés par Elleuch et al (2007) qui ont montré qu'au cours de la production de tahina,
l'élimination des enveloppes riches en composés phénoliques a occasionné une diminution de
la qualité du sésame. Ainsi la forte accumulation des composés phénoliques totaux pourrait
dans certains cas participé à accroitre considérablement la qualité des graines. Dans Je même
ordre d'idée, lors de la trituration en vue d'une bonne qualité de l'huile et de la production de
tourteaux, un taux de coques optimal est requis pour le bon fonctionnement des presses
(Gilles Tran, 1994). Toutes fois la baisse de phénols totaux constatée dans les graines sans
coques trouverait son explication dans son métabolisme phénolique.
2-Effet de quelques enzymes du métabolisme phénolique
Tl est bon de noter que la teneur en composés phénoliques mesurée à un stade donné
est la résultante entre biosynthèse et dégradation oxydative (Machaeix et al., 1990). En effet
J'analyse de l'activité des enzymes de biosynthèse des composés phénoliques dans les graines
de cotonnier montre une intense activité de la PAL et de la TAL dans les graines à coques et
une baisse de leur activité dans les graines sans coques. Cette baisse de l'activité de ces
enzymes a été signalée dans le fruit d'olivier (Olea europaea L.) par Morrelo et al (2005).
Dans cette même étude il a été montré que la baisse de l'activité des enzymes de biosynthèse
(PAL et TAL) est corrélée à la baisse des phénols totaux. Ceci peut donc en parti expliquer la
baisse du taux de phénol constatée dans les graines sans coques. Par ail leurs, notre étude a
révélé que l'activité de la PAL et TAL contenue dans les coques participerait respectivement
à 38,82 % et 45 % à la biosynthèse des phénols dans les graines. En outre, l'activité des
enzymes de dégradation des phénols (POD et PPO) subit une augmentation suite à la
décortication des graines, or le taux de phénols totaux a aussi subi une chute dans les mêmes
conditions; ce qui montre que la baisse des phénols totaux serait tributaire à l'augmentation
de l'activité des POD et des PPO. Nos résultats sont en accord avec ceux de nombreux auteurs
33
comme El Bellaj et El Hadrami (1998) qui ont noté une augmentation de l'activité des
peroxydases chez le palmier dattier (Phœnix dactylifera). Ziouti et al (1996) avaient déjà
émis l'idée suivant laquelle l'augmentation des activités péroxydasique coïncidait avec la
diminution de teneur en phénol de la racine de palmier. Ce qui est en conformité avec nos
résultats. De même Constabel et al (1995) ont montré que l'activité des PPO augmentait lors
d'une importante oxydation des composés phénoliques. Ce qui montre clairement que nos
résultats sont parfaitement en accord avec ceux de Constabel et al (1995). Notre étude a aussi
mis en évidence une importante activité AIAoxydasique dans les graines sans coques que
dans les avec coques. Nos résultats sont en accord avec ceux d'El BeUaj et al (1998) qui ont
précisé que l'oxydation de l' AIA génère H202 qui est utilisé par les peroxydases dans la
fixation des composés phénoliques aux parois cellulaire. En outre, les analyses statistiques
montrent que l'A[A-oxydase évolue dans le même sens que les peroxydases. L'ensemble de
ces résultats permet donc de comprendre que l'intense activité de la PAL et de la TAL serait
responsable du fort taux de phénols dans les graines avec coques. De même les fortes activités
des POD et des PPO serait quand à eux responsable de la diminution du taux de phénol dan
les graines décortiquées; ce qui signifierait que I' AJA-oxydase participerait indirectement en partie à la dégradation des composés phénoliques de la graine.
34
CONCLUSION GÉNÉRALE
ET PERSPECTIVES
35
A-CONCLUSION
Nos travaux ont eu pour objectif de comprendre l'influence de la coque dans le métabolisme
phénolique des graines de cotonnier ( cv. R405-2000). Les résultats obtenu ont montré que :
- la teneur des phénols totaux dans les graines avec coques est plus élevée que celle dans les
graines sans coques.
- l'activité des enzymes de biosynthèse (PAL et TAL) est plus intense dans les graines avec
coques que dans les graines sans coques.
- l'activité des enzymes de dégradation (PPO et POD) est moins élevée dans les graines avec
coques que dans les graines sans coques.
- l'activité de I' AlA-oxydase est moins élevée dans les graines avec coques que dans les
grames sans coques.
En définitive nous pouvons retenir que la coque influence le métabolisme phénolique.
B-PERSPECTIVES
Cette étude pourrait susciter des travaux de recherche sur les composés phénoliques chez le
cotonnier. Pour se faire, il serait intéressant:
-de suivre l'évolution du métabolisme phénolique dans les graines de plusieurs
variétés de cotonnier à des stades et à des âges différents.
-d'effectuer une étude spécifiquement sur la coque de plusieurs variétés de cotonnier
afin de déterminer dans quelle variété le métabolisme phénolique est le plus intense.
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ANNEXE
Droites d 'étalonna2es
AIA
g ~:: t : t0on5v 0.2 t 1) 0
0
• DO -Linéaire (DO)
50 AIA (~g/ml)
100 150
PHENOLS TOTAUX
• DO - Lln4alre (DO)
0 0,5 1 1.5
Acide gallique (mg/ml)
44