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M.Nonus 1 MICRO-ORGANISMES Bactéries Levures- Moisissures Champignons Virus Cellules animales Cellules végétales Cellules souches Algues

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M.Nonus 1

MICRO-ORGANISMES Bactéries

Levures- Moisissures

Champignons

Virus

Cellules animales

Cellules végétales

Cellules souches

Algues

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Disciplines

• Biologie

• Biochimie

• Microbiologie

• Génie métabolique

• Génie chimique

• Génie génétique

• Génie mécanique

• Génie informatique

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Métabolisme • Catabolisme

– Biodégradation

– Énergie

– Croissance

– Maintenance

• Anabolisme

– Biosynthèses

– Croissance –Multiplication cellulaire

– Productions

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Composition cellulaire

• Biomasse Humide : 20% de MS

• Ex: Levure Boulangerie

– Matière organique: 90% /MS:

• C : 45%, N:8,5%,O:32,4%, H: 14,1%

– Minéraux : 10%/MS : P, K, S , Na, Mg, Ca…

– Composition cellulaire

• Protéines : 55% , RNA: 20,5%, Lipides : 9,1%

• Lipo-polysaccharides :3,4% , DNA: 3,1%

• Glycogène : 2,5% ,polysaccharides 2,5%

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Matières premières • Sources Carbonées

– Amidon, sucres, hydrocarbures…

• Sources azotées

– Minérales

– Organiques

• Phosphore

• Soufre

• Oligo-éléments

• Facteurs de croissance

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Sources carbonées

• Sucres simples

– Glucose, saccharose, lactose ….

– Mélasses , cannes

• Polymères

– Amidons : blé , maïs, cellulose?

• Hydrocarbures

– Méthanol, fractions pétrolières

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Sources azotées

• Minérales

– NH3, NH4 OH, (NH4 )2 SO4, (NH4)2 HPO4 ,

– NH4 NO3 …

• Organiques

– Protéines

– Peptones

– Acides aminés

– Urée …

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Autres matières premières

• Phosphore: phosphates

• Soufre : sulfates

• Potassium : Kcl

• Magnésium : MgO, MgSO4

• Calcium: Ca CO3 , Ca Cl2, Ca SO4

• Oligo-éléments : sels métalliques etc…

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CULTURES-MISE EN OEUVRE

Cellules viables

Source d’énergie

Apports nutritionnels

Conditions de cultures

Paramètres physico-chimiques

Paramètres physiologiques

Cinétiques

Usine cellulaire

Génie métabolique

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CONSERVATION • Souches

– Obtention :

• Collections (ATCC, NRRL, DSM…)

• Isolements ,Sélection , criblage, Mutagenèse

• Génie génétique

• Méthodes de conservation

– Repiquages

– Cryo-préservation (- 80°C, Azote liq …)

– Lyophilisation

Viabilité . Pureté Micro-biologique. Activités

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Réalisation des cultures

Micro-organismes

Conservation, pré-cultures , cultures , contrôles

Milieux

Formulation, Préparation , stérilisation

Matériels

Calibration, stérilisation

Management

suivi des paramètres et conduite

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Agitateur

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DIVISION BACTERIENNE

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Croissance microbienne

• Augmentation du nombre

• Division par scissiparité

• Allongement des cellules

• ADN répliqué

• Dédoublement du chromosome

• Division de la paroi et membrane plasmique

• Formation d’un septum

• Séparation en deux cellules

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Croissance microbienne

• Convention internationale

– N = nombre de cellules N0: nb cell initiales

– Symboles pour les masses mises en jeu

– X = biomasse nombre de cellules ou MS

– S = Substrat

– P = Produit

– 0 = di-oxygène

– C = C02

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Croissance microbienne

• Temps de génération

– Temps que met une bactérie ou la population

dont elle est issue à se diviser.

– Très variables : minutes, heures, jours.

• L’augmentation du nombre de bactéries d’une

population qui double à chaque génération peut

s’exprimer sous forme de puissance de 2

2 m N0 cellules

m : nombre de doublements de la bactérie mère

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Croissance microbienne

X

t

I

II

III

IV

I

N

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Croissance microbienne • 4 phases principales

– Latence I

– Croissance exponentielle II

– Stationnaire III

– Décroissance (exponentielle ou non ) IV

• 3 phases transitoires

– Démarrage : début phase exponentielle

– Ralentissement: fin phase exponentielle

– Déclin : fin de phase stationnaire

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Croissance microbienne • Phase de latence ou démarrage

– Ensemencement , adaptation au milieu et conditions de l’environnement , premières divisions , activité métabolique intense ( ADN, ARN , enzymes….)

• Phase de croissance exponentielle ou log.

– Multiplication cellulaire maximale

– Temps de génération le plus court

– Taux de croissance maximal

– Activité métabolique maximale

– Limitation par le transfert d’O2 ( cult. aérobies)

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Croissance microbienne

• Phase exponentielle (suite )

– Fin :

• Limitation d’un substrat C, N , P, 02…

• Accumulation de produit (toxicité)

• pH , T ,

• Flore compétitive

• Inhibiteurs Conservateurs, antibiotiques

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Croissance microbienne

• Phase stationnaire

– Nb. de cell. Appa. = Nb de cell. Disp.

– Cellules fragiles meurent

– Arrêt de la reproduction

– Utilisation des réserves cellulaires

– Changements morphologiques

– exp Sporulation , modif. du cytoplasme

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Croissance microbienne

• Phase de décroissance ou déclin

– Nombre bactéries qui meurent > nouvelles

bactéries qui apparaissent

– Mortalité des cellules restantes peut suivre une

progression géométrique ou non : déclin

exponentiel ou non

– Bactéries adaptées à l’environnement peuvent

se multiplier sur les déchets métaboliques ou

produits des réactions de conversion, voire les

produits de lyse des cellules mortes

(cannibalisme)

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Cinétique de Croissance

• Phase de latence : x = cte dx/dt = 0

• Phase de démarrage : x dx/dt µ

• Phase logarithmique: x dx/dt µ = cte

• Phase ralentissement : x dx/dt µ

• Phase stationnaire: x= cte dx/dt µ=0

• Phase de déclin :x

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Terminologie

• Batch

– Opération unitaire, traitement par lot , fournée

• Fed-batch : batch alimenté

– Ajout en cours de culture d’éléments nutritifs ,

source de C , N , précurseur etc ….

• Culture continue

– Renouvellement du milieu de culture par

apport et retrait

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Cinétique de Croissance

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BATCH

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Cinétique de Croissance

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Cinétique de Croissance

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Cinétique de Croissance

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Cinétique de Croissance

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Croissance microbienne

x : concentration en biomasse kg/m3

s : concentration en substrat

p: concentration en produit

rx: vitesse de production de la biomasse par

unité de volume en kg / m3 /h

rs:vitesse de consommation du substrat par

unité de volume en kg/ m3 /h

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Cinétique de Croissance

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Cinétique de Croissance

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RENDEMENT

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Croissance microbienne

I

II

III VII

Log X

t

t

t

dx/dt

µ=1/x

dx/dt

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Cultures

• Métabolite primaire

– Associé à la croissance microbienne

• Métabolites secondaire

– Dissocié de la croissance microbienne

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Cultures • Batch

– Modification permanente des paramètres de

culture (X, S, P …) jusqu’à épuisement de

nutriments : limitations

– sauf ceux régulés , (pH, temp…)

– Pas d’ajouts sauf air, anti-mousse, OH-

régulation pH

– Métabolite primaire

– Métabolite secondaire

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Cultures

• Batch ou opération unitaire

• Fed Batch ou Batch alimenté

• Culture continue

• Production T, kg, U

• Productivité volumique: kg/m3/h, g/l/h,U/l/H

• Productivité spécifique: kg/kg , g/g , U/g

• Productivité vol. spécifique: kg/m3/kg/h, g/g/l/h

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Cultures

• Limitations : équation de MONOD

– Nutriments : substrat limitant

• O2, OUR=OTR

• S : C, N, P etc…

• µ= µmax S

Ks + S

Ks :coefficient de demi saturation

Relie le taux de croissance µ à la nutrition

Empirique ,proche de la réalité

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Cultures

• Quand une source de Carbone est utilisée comme source d’énergie et élément de croissance , sa concentration en phase liquide a une grande influence sur la vitesse de croissance.

• Ks est numériquement égal à la valeur de la concentration qui correspond à une vitesse de croissance égale à la moitié de µ max.

• Plus Ks est petit plus la vitesse de croissance est grande

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Cultures

µ µ

µmax

µ

µmax/2

S Ks

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Cultures

• Constantes de saturation

µ-organisme substrat Ks mg/l

E.coli glucose 6,8 10-2

E.coli mannitol 2

E.coli lactose 20

E.coli tryptophane 4,9 10-4

Candida oxygène 4,5 10-2

Pseudomonas méthanol 0,7

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• Fed batch : batch alimenté

– Ajout milieu, S, f. croissance …

– Facile à mettre en œuvre

– Aug. la productivité et production

– Peut permettre de dissocier les phases de

croissance et production

– Maintenir certaines constantes

– Production Penicilline

• (C ) Glucose trop élevée favorise X

• (C) glucose trop basse pénalise P

CULTURES FED BATCH

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CULTURES FED BATCH

Pas de sortie de milieu

CO2, N2 , O2 res, Volatils …

Air, air enrichi, gaz

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M.Nonus 68

CULTURES FED BATCH

• V: volume du milieu de culture

• F : débit d’alimentation

• S0: concentration du substrat à l’entrée t = 0

• S: concentration du substrat dans le réacteur

à t

• X0: concentration de biomasse entrée

• X : concentration de biomasse à t

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CULTURES FED BATCH Biomasse

V d X /dt = µVX

XdV/dt + VdX/dt = µXV

VdX/dt = µXV – XdV/dt

Ajout de liquide = débit d’alimentation

= dV/dt = F

dX/dt = X (µ- F/V )

F/V = D taux de dilution

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CULTURES FED BATCH

Substrat

SdV/dt = S0 F – µXV 1/Y x/s max

VdS/dt + SdV/dt = S0 F – µXV 1/Y x/s max

dS/dt = (S0 – S) F/V - µXV 1/Y x/s max

À l’équilibre

dS/dt = 0 F = µXV/ Yx/s max ( S0 – S)

XV = X0 V0 e µt

F = µ X0 V0 e µt / Yx/s( S0 – S)

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CULTURES CONTINUES

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CULTURES CONTINUES

• Notion de CSTR : CHEMOSTAT

– Continuous Stired Tank Reactor

– Réacteur continu agité

– Homogénéité : stabilité

• Distribution

• (X,S,P = constante) distribution homogène dans l’ensemble du volume du réacteur

• Volume constant alimentation et soutirage en continu

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CULTURES CONTINUES • Batch puis alimentation continue

• A l’équilibre les variables du batch deviennent

constantes : état stable

• étude de l’influence de paramètres sur la culture :

recherche des conditions limites de conduite

• Améliore la productivité pour X et métabolites

primaires

• Exp utilisation :

– Traitement d’eau

– Bioconversion ( resting cells)

– Produits instables ou à faible productivité

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CULTURES CONTINUES • Peu utilisées en milieu industriel

– Risques de contamination

– Stabilité génétique des souches

– Beaucoup de métabolites secondaires ( pas

associés à la croissance)

– Logistique et fiabilité

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M.Nonus 75

CULTURES CONTINUES CHEMOSTAT

- croissance cellulaire est limitée par un nutriment essentiel les autres sont en excès

- à l’état d’équilibre les concentrations en S, X P sont constantes

- le CSTR est alimenté en milieu neuf à la même vitesse que le milieu du réacteur est soutiré.

V = Constante

- les autres paramètres de la culture restent constant (T, pH, 02 dissous , ….)

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CULTURES CONTINUES

• Bilan matière

F X0 – FX + V µX – V kdX = V dX/dt (0)

F = Débit d’alimentation en l/h

V = milieu de culture l

X = concentration cellulaire g/l

µ = taux de croissance h-1

kd = taux de mortalité h-1

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M.Nonus 78

CULTURES CONTINUES dX/dt = D X0 + ( µ- kd - D)X (1)

taux de dilution

D = F/V

Inverse du temps de séjour

milieu d’alimentation est stérile X0 = 0

taux de mortalité négligeable / taux de

croissance kd <<µ

A l’équilibre dX/dt = 0

µ = D (2)

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M.Nonus 79

CULTURES CONTINUES Si D0 X S0 Yx/s S0 D µmax X0 S S0

C en

X, S

D h-1

DX

X

S

td

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CULTURES CONTINUES Limitations physiologiques

-synthèse des enzymes

-excrétion des enzymes

-transport des substrats

-transport des métabolites

-inhibition par excès de substrat

-inhibition par le métabolite excrété

-inhibition par accumulation de composés toxiques dans le cellule

concerne l’analyse d’un type de micro-organisme.

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CULTURES CONTINUES Limitations technologiques

- pH

- température

- Aw

- force ionique

- Oxygénation

- Présence de CO2

- Concentrations en précurseurs

- Élimination des calories

concerne une population de micro-organismes

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CULTURES CONTINUES µmax sur glucose

Organisme T°C µmax h-1

td h

A.niger 30 0,2 3,46

P.chrysogenum 25 0,123 5,65

A.nidulans 20 0,090 7,72

A.nidulans 30 0,215 3,23

a.nidulans 37 0,360 1,96

E.coli( glc) 30 0,28 2,48

E.coli( malt.) 30 0,22 3,15

E.coli( maltotriose) 30 0,18 3,85

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M.Nonus 83

CULTURES CONTINUES

• Influence aw sur µmax de Saccharomyces

µ

aw 1 0,98 0,96 0,94 0,92

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M.Nonus 84

CULTURES CONTINUES

• S’il y a au moins une limitation par un élément

nutritif : équation MONOD substitue dans (2)

µ = D = µmax S / Ks + S (3)

S = substrat limitant g/l

Si D > µmax la culture ne peut se reproduire

assez vite pour se maintenir c’est le lavage (

wash out)

Graphe 1/µ par rapport 1/S on peut estimer Ks et

µmax

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M.Nonus 85

Cultures

µ µ

µmax

µ

µmax/2

S Ks

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M.Nonus 86

CULTURES CONTINUES Si D0 X S0 Yx/s S0 D µmax X0 S S0

C en

X, S

D h-1

DX

X

S

td

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M.Nonus 88

CULTURES CONTINUES

• Pour D < µmax la concentration en substrat de

l’effluent

• S = Ks D/ µmax - D (4)

Le bilan matière en l’absence de métabolisme

endogène

F S0 - FS -V µ X 1/Yx/smax – VqpX 1 /Yp/s max = V dS/dt (5)

S0 et S concentration en S de l’alimentation et l’effluent

qp est le taux spécifique de formation du produit extra

cellulaire

Yx/s Yp/s sont les rendements en cellules et produits g X/g S

g P/ g S

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CULTURES CONTINUES Si D0 X S0 Yx/s S0 D µmax X0 S S0

C en

X, S

D h-1

DX

X

S

td

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M.Nonus 90

CULTURES CONTINUES

• Quand la formation en produit est négligeable

et la culture en état stable dS/dt = 0

D (S0 - S) = µX/Yx/s max (6)

si µ=D à l’équilibre et kd = 0

X = Yx/s max (S0 -S) (7)

à partir de (4) la concentration cellulaire à l’état d’équilibre

X = Yx/s max (S0 - Ks D / µmax – D) (8)

approximation : Yx/s est considéré comme constant du fait

que la formation en produit est négligeable

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M.Nonus 91

CULTURES CONTINUES

• En (7) et( 8) Yx/s est considéré comme constant( approximation)si on ne

prend pas en compte le métabolisme endogène

• Yx/s Varie avec le taux de croissance et la limitation en substrat

• si on le prend en compte, le métabolisme endogène(2) devient

D = µ- kd = µnet (9) ou µ = D + kd (10)

On substitue (10) le bilan du substrat à l’état stable et on considère

qu’il n’y a pas de produit formé

D (S0 -S) –1/ Yx/s max ( D+ kd) X= 0 (12)

Yx/s max rendement maximum ( pas de métabolisme endogène et

d’énergie de maintenance) valeur constante indépendante du taux

de croissance

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M.Nonus 92

CULTURES CONTINUES (12 ) peut être arrangée

D (S0 -S/X) – 1 / Yx/s max (D+kd ) = 0 (13)

D(1 / Yx/s ) – D/ Yx/s max - kd / Yx/s max = 0 (14)

1/ Yx/s max + kd / Yx/s max D = 1 / Yx/s (15)

I/ Yx/s = 1/ Yx/s max + ms/D (16)

ms=kd / Yx/smax (17)

On obtient les valeurs de Yx/s max et ms à partir d’essais en

chemostat en traçant 1/ Yx/s max par rapport à 1/D

pente ms interception 1/ Yx/s max

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M.Nonus 93

CULTURES CONTINUES

1/ Yx/s

1/D h 1 3 2 4 0

3

2,5

2 1/ Yx/smax = 2 Yx/smax = 0,5g de X/ g de S

ms = pente = 0, 2 gS/gX h

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M.Nonus 94

CULTURES CONTINUES

• En présence d’un métabolisme endogène

µnet = µmax S / (Ks +S )

On montre que

S= Ks (D+ kd ) / µmax – D - kd (18)

X = Yx/s max (S0 -S) D/D+ kd (19)

Si on considère la transformation du substrat en produit

Le bilan masse du produit associé à la croissance

DP= qp X (20)

qp= taux spécifique de conversion en produit

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M.Nonus 95

CULTURES CONTINUES

• Pour les produits non associés qp est une constante β alors

que pour la produits associés à la croissance c’est une

fonction de µ

• Pour le bilan substrat (5) devient :

• D (S0 -S) = 1 /Yx/s max (D+kd )X=1/ Yp/s qp X (21)

• (21) peut être résolue pour X

X= Yx/s max (S0 –S)( D/ D+kd + qp Yx/s max / Yp/s )( 22)

productivité d’un chemostat Pr s’exprime en terme de

production de produit DP ou de biomasse DX

le taux de dilution qui permet d’atteindre la productivité

maximale et obtenu d(DP)/dD = 0 ou d(DX)/dD = 0

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M.Nonus 96

CULTURES CONTINUES • La valeur optimale de D ( Dopt)pour la biomasse :

• Dopt= µmax ( 1- )

S0 est >>>> à Ks , Dopt approche D = µmax

ou point de lavage

D doit être légèrement < à Dopt stable et productivité maximale

Dopt pour la production optimale ne l’est pas forcément pour le produit

(Ks + S0 )

Ks

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M.Nonus 97

CULTURES CONTINUES

A chaque valeur de D X = Yx/s (S0 –S)

La culture continue permet

de travailler avec des µ donnés ou choisis

Yx/s peut être testé pour différents µ

l’effet de chaque substrat peut être testé