Hyperhomocysteinémie Homocystinurie

maladie métabolique

maladie conjonctive

Erreur innée

Macromoléculeconjonctive

Erreur innée

Métabolisme

Remodelage tissulaire

synthèse dégradation

80

µmol/L

300 15 20 40 60

Hyperhomocystéinémies

modérée sévère

homocystinurie

AsymptomatiqueFacteur de risque vasculaire

Symptomatologie sévèreComplications

intermédiaire

hyperhomocystéinémie

100

Etiologies

Hyperhomocystéinémies

Déficits enzymatiques

5,10-methyleneTHF

MTHFRHcy

Met

SAM

SAH

cystathionine

Cys

CBSSer

Hser

THF

5-MeTHF

X

Me-XMS

Ser

Gly B6

B12

B6

proteines

Etiologies

Déficit en CBSHomozygote: très sévère

B6-sensibleB6-résistant

Hétérozygote: modérée, discrète

Déficit en MTHFRHomozygote: sévère Hétérozygote: modérée

Déficit méthylation B12intermédiaire

Hyperhomocystéinémies

Déficits enzymatiques

5,10-methyleneTHF

MTHFR

Hcy

Met

SAM

SAH

cystathionine

Cys

CBSSer

Hser

THF

5-MeTHF

X

Me-XMS

Ser

Gly B6

B12

B6

proteines

X

X

X

Etiologies

Hyperhomocystéinémies

Déficits vitaminiquesFolates, B6, B12,

Insuffisance Rénale Chronique

Facteurs iatrogènes- Antifoliques Méthotrexate, anticonvulsivants, Sulfasalazine- Anti B6 Isoniazide, Procarbazine, Cyclosérine, Azauridine- Inhibiteur MS protoxyde d’azote- Oestroprogestatifs

Excès d’apport en méthionine ?

Modèles animaux

Hyperhomocystéinémies

• CBS

-/- survie limitée

+/- avec régime riche en Met

• MTHFR +/-

Modèles génétiques

Modèles diététiques

Régimes riches en Met

poulet pendant la croissance

rat adulte

porc adulte

Symptomatologie

Homocystinurie

Lésions oculairesEctopie du cristallin : inférieureMyopieLuxation du cristallin

Diagnostic différentielMaladie de Marfan : ectopie supérieure ou externe

Lésions squelettiques et musculairesAspect marfanoïde

Taille élevée

Extrémités longues et fines

Arachnodactylie

Genu valgum

Déformation du sternum

Ostéoporose

Scoliose

Hypotonie musculaire

Symptomatologie

Homocystinurie

Lésions vasculairesArtériosclérose

Athérothrombose

Atteintes neurologiques

Retard mental

Autres

Lésions cutanées, peau fine, pores élargies

Dépigmentation

Pneumothorax

Symptomatologie

Homocystinurie

maladie métabolique

maladie conjonctive

Remodelages de la paroi artérielle

Clinique

Histologique ?

Biochimique ?

Homocystinurie – Remodelage matriciel

Histological examination showed spectacular alteration of elastic structure

in arteries from homocystinuric human

« …extracellular matrix deposition, elastica degeneration, smooth muscle cell hyperplasia, and fibrosis. » (Gibson. 1964).

« The arteriosclerotic plaques occuring in homocystinuria, whether caused by CBS deficiency, methyl transferase deficiency, or MTHFR deficiency, are typical fibrous plaques, characterized by

smooth muscle cell hyperplasia, deposition of extracellular matrix and collagen, and degeneration and destruction of elastic fibers. »

(McCully, 1983)

Porcs adultes

Hyperhomocysteinemie

Coronaire

Orcein stained 6 µm transverse section

Controle

hyperhomocysteinemie (x 2)

Atherosclerose

Evènement précoce (4 mois)majeur (~50 %)

Régime riche en Met

Hyperhomocystéinémie modérée – Dégradation des structures élastiques artérielles

Défaut des structures élastiques artérielles - conséquences tissulaires

Souris KO elastine (-/-)

proliferation et migration SMCs

formation neointimastenose

(DY. Li, 2002)

IEL renal arteryIEL renal arteryVue ‘‘en face’’, confocal MicroscopyVue ‘‘en face’’, confocal Microscopy

YoungYounganimalanimal

OldOldanimalanimal

Fenestration

SMCs migration

Hyperhomocysteinemie

proliferation SMCs

Épaississement intimal

Défaut d’assemblage

Dégradation des structures élastiques

?

L’hyperhomocysteinemie induit une dégradation majeure des structures élastiques

qui peut accélérer le développement de l’athérosclérose

Composantamorphe:élastine

microfibrillesfibrilline-1, -2

MAGPfibuline-1, -2

Fibre élastique

Structures elastiques

FibrillinesIn vivo :

embryon de poulet

Fib ↓ sans défaut des structures élastiques (Boot. 2004)

poulet en croissance :Fib ↓ défaut structures élastiques (Hill. 2002)

In vitro : Fib-1 : défaut de repliement domaines EGF (2005)

Fib-1 : dysfonction (↓ calcium binding, Hubmacher. 2005)

Proteoglycansaggregation perturbation interactions (McCully. 1993)

Synthèse et réticulation élastine : observations contradictoires

Fibres élastiques anormales

Hyperhomocysteinemie et élastogenèseHyperhomocysteinemie et élastogenèse

• Porcs + régime riche en Met :

fenestration des lames élastiques

↓ contenu en élastine aorte abdominale et coronaire (Charpiot. 1998)

• Souris ApoE -/- mice + régime riche en Met (Hoffman. 2001)

↑ elastolyse dans aorte

Degradation structures élastiques artérielles

In vivo, animal adulte

• Rats + régime riche en Met (Zulli. 1995)

disparition des lames élastiques aorte

Hyperhomocysteinemie Hyperhomocysteinemie – – dégradation des structures élastiquesdégradation des structures élastiques

Porc + régime riche en Met

Ela

stin

con

tent

(V

v, %

)

12

Control Hyperhcy0

4

8*

C H

10 µM 100 µMHcy

50 µm0

4

8

10 100 µM Hcy

*

72 h

Hyperhomocysteinemiemodérée4 mois

In vivo

Ex vivo

Culture d’explants artériels + Hcy

Aorte abdominale

Processus Elastolytique

Aorte abdominale

*

0

40

Spe

cific

ela

stol

ytic

act

ivity

(A

U /

mg

pro

tein

)

10 100 µM Hcy

+Phe

10 100

100

200

0

*

C H C H

+Phe

+Phe (phenanthroline)Inhibiteur de

metalloproteinases

Processus Elastolytique

Porc + régime riche en Met

72 h

Hyperhomocysteinemiemodérée4 mois

In vivo

Ex vivo

Culture d’explants artériels + Hcy

Aorte abdominale

Aorte abdominale

Ela

stin

con

tent

(V

v, %

) 12

10 µM 100 µMHcy0

4

8

10 100 µM Hcy

*

100 µM+ GM6001

100 +

GM6001

GM6001, inhibiteur large spectre des MMPs previent la degradation structurale induite par Hcy

Processus Elastolytique MMP-dépendant

MMP-9

MMP-2

Gelatin-zymographieGelatin-zymographie

72 kDa -68 kDa -

92 kDa -

TIMPs26 kDa -

22 kDa -

TIMP-1

TIMP-2

Reverse zymographieReverse zymographie

- 92 kDa

- 72 kDa- 68 kDa

Western BlotWestern Blot

Spe

cific

act

ivity

(A

U /

mg

prot

ein)

10 50 100 µM Hcy

Balance MMP/TIMPBalance MMP/TIMP

10 50 100 µM Hcy

10 50 100 µM Hcy

10 50 100 µM Hcy

↑ MMP-2 et MMP-9 élastolytiques

Inhibiteurs tissulaires inchangés

In vivo, the degradation of the arterial elastic structures induced by hyperhomocysteinemia is more marked in the

inner part of the media.

- In vivo in human (Mc Cully. 1983)« ...disruption of the elastic laminae,

usually more marked toward the innermost elastic membrane,… »

- In vivo in animal (Charpiot. 1998)

Haemodynamic strains ?

Endothelium ?

Hyperhomocysteinemie Hyperhomocysteinemie – – dégradation des structures élastiquesdégradation des structures élastiques

10 µM 100 µMHcy

50 µm

6 µm transverse section. (+) catechine- stained elastic structure

Ex vivo, explants arteriels en culture + homocysteine

½media

Hyperhomocysteinemie Hyperhomocysteinemie – – dégradation des structures élastiquesdégradation des structures élastiques

MMP -2 MMP-9

10 µM 100 µM 10 µM 100 µMHcy

6 µm transverse sections

↑ expression MMP-2 et MMP-9 dans la partie interne de la média…

MMPs – Expression tissulaire

½media

Hyperhomocysteinemie Hyperhomocysteinemie – – dégradation des structures élastiquesdégradation des structures élastiques

Immunohistochimie

10 µM 100 µM 10 µM 100 µMHcy

TIMPs – Expression tissulaire

Hyperhomocysteinemie Hyperhomocysteinemie – – dégradation des structures élastiquesdégradation des structures élastiques

TIMP -1 TIMP-2

expression et distributionTIMP-1 et TIMP-2 inchangées

6 µm transverse sections Immunohistochimie

Gelatin Zymography

72 kDa -

MMP-2*

*

*

100

200

0

** *

100

200

0

92 kDa -

Act

ivity

(%

)A

ctiv

ity (

%)

(µM)10 50 100 250

MMP-9

(Lamy. 2004)(Lamy. 2004)

Potentiel protéolytique des cellules endothéliales

(µM)10 50 100 250

(µM)10 50 100 250

(µM)10 50 100 250

-Casein Zymography

10 50 100

µM Homocysteine

250

27 kDa -

(1) Absence d’inhibiteur(2) Inhibiteur des métalloprotéases (1,10 phenanthroline)(3) Inhibiteur des serine protéases (PMSF)(4) Inhibiteur des cystéine protéases (Iodoacetamide)(5) Inhibiteur des aspartate protéases (Pepstatine A).

1 2 3 4 5

27 kDa -

- 75 kDa

- 27 kDa

Western Blot

10

50

100

µM Homocysteine

250

Caseinolytic serine protease

Human tissue Kallikrein (hK1)

Potentiel protéolytique des cellules endothéliales

Hyperhomocysteinemie

Problème métabolique

Activation de systèmes protéolytiques

- déséquilibre MMPs/TIMPs : MMP-2, MMP-9- serine protease(s?) activatrice de MMPs

Dégradation des structures élastiques artérielles

Artériosclérose, athérosclérose

métabolisme

remodelage

clinique

Atteinte structures élastiques artère, cristallin (?), peau (?)

Elastolyse vs défaut d’élastogenèse dans:

- hyperhomocysteinemies acquises

- hyperhomocysteinemies innées

défaut d’assemblage des fibres élastiques

↑ sensibilité à la dégradation protéolytique ?

↑ expression/activité des MMPs ?

Et les collagènes ?os, artère, peau (?)

Hyperhomocystéinémie Remodelage matriciel

Laboratoire de Physiopathologie des Tissus non Minéralisés Faculté de Chirurgie Dentaire– Université René Descartes – Montrouge

Laboratoire de Biochimie UMRs-608. Faculté de Pharmacie – Université de la Méditerranée. Marseille.

Thierry AugierAndré BarlatierAlexandrine BertaudRaymond Calaf

Claire CeriniCorinne ChareyreEdouard LamyCécile Genovesio

Philippe Charpiot

Gaston GodeauSylvie Igondjo-TchenKarim Senni