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Les protéines

Cours du Dr. NAMOUR par Elo Année : 2005-2006

Faculté de Médecine de Nancy


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I. Généralités

1) Introduction Les protéines sont des macromolécules très importantes dans les cellules car elles remplissent des fonctions essentielles à la survie de la cellule : -catalyse (enzymes de réaction) -transport (hémoglobine pour transporter l’O2 dans le sang) -support mécanique (la charpente cellulaire : le cytosquelette) -protection immunitaire (anticorps) -mobilité (contraction des muscles) -transmission de l’influx nerveux -multiplication cellulaire 2) Propriétés des protéines 1-Les protéines sont composées avec 20 acides aminés différents (ou aminoacides). L’ordre d’enchaînement de ces aa constitue la structure primaire de la protéine. Une liaison peptidique relie les acides aminés entre eux. 2-Les protéines possèdent une grandes variétés de groupement fonctionnels (OH, COOH, NH3) 3-Elles peuvent s’associer en complexes. (On peut identifier une protéine en étudiant les protéines qu’elle fréquente). 4-Les protéines sont rigides (protéines du cytosquelette) ou flexibles (pour la transmission de l’information entre les cellules)

3) les différents niveaux d’organisation


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Structure primaire : Les acides aminés sont alignés dans un ordre spécifique. La protéine n’a pas encore de fonction. Structure secondaire : Les protéines subissent des contraintes (ex : liaisons Hydrogènes) qui entraînent le changement de leurs configuration spatial. Elles prennent la forme de structures régulières et répétées : hélice α, feuillet β. Structure tertiaire : La protéine se replie encore et forme des domaines compacts et globulaires : naissance des domaines protéiques. La protéine a alors une fonction spécifique. Structure quaternaire : Plusieurs structures protéiques (ex : domaine) n’appartenant pas forcément à la même chaîne d’a.a. s’assemblent pour ne former qu’une protéine. La structure primaire détermine la structure tridim ensionnelle.

II. Les acides aminés 1) Formule générale des acides aminés Dans les a.a.3 caractères sont fondamentaux pour la structure des protéines : _Un groupement amine (NH2) _Un groupement acide (COOH) _Une portion variable d'un acide aminé à l'autre (indiquée par la lettre R sur la molécule ci-contre; R pour radical) appelée chaîne latérale Remarque : Le carbone central s’appelle le carbone α (alpha)


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2) Configuration du carbone α Tous les a.a. possèdent un carbone alpha asymétrique (=reliés à 4 groupements différents) sauf la glycine à cause des 2 atomes d’hydrogènes sur le carbone alpha. Ils existent 2 isomères L et D pour chaque acide aminé (sauf pour la glycine) mais seuls les L aminoacides sont incorporés dans les protéines. Remarque : _2 molécules sont des isomères si elles sont le reflet l’une de l’autre dans un miroir et donc si elles ne sont pas superposables. _La glycine possède 2 substituts Hydrogène donc son reflet dans un miroir donne 2 molécules identiques et superposables.


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3) La fonction aminoacide Les fonctions amine (NH2 NH3+) et acide (COOH COO-) ont la propriété de se charger (+ ou-) et ainsi modifier la charge de la protéine. L’état d’ionisation de l’acide aminé dépend du pH de la solution. Le groupement COOH est un acide plus fort que NH3+ donc quand le pH va monter il va perdre son proton en premier et devenir COO-. Les formes prédominantes sont COO- et NH3+. Le pKa d’un acide ou d’une base est la valeur du pH à laquelle il y a autant de formes protonées que de formes non protonées. Si pH › pKa, c’est la forme basique non protonée (COO- et NH2) qui prédomine. Si pH ‹ pKa, c’est la forme acide protonée (COOH et NH3+) qui prédomine. Si pH= pKa, il y a autant de forme basique que acide. 7 acides aminés sont plus complexes et contiennent une chaîne latérale ionisable : Chaîne latérale de l’Histidine : pKa=6 Le point isoélectrique (pI) d’un acide aminé est la valeur du pH pour laquelle la charge nette=0


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Acide aminé simple : 2 groupements ionisables Ex : Alanine pK1=2.4 pK2=9.9 pI = (pK1 + pK2) / 2 = 6.1 Acide aminé complexe : 3 groupements ionisables Pour déterminer le pI d’un acide aminé complexe on prend comme 1er pKa celui qui est avant la charge 0 et comme 2ème pKa celui qui est juste après la charge 0. Ex : cas d’acide aminé dibasique : la lysine PI = (pK2 + pK3)/2 Pour une protéine possédant plusieurs a.a. le pI est la valeur du pH à laquelle le nombre de groupes chargés+ est égal au nombre de groupes chargés -. Si pH › pI, la protéine est chargée -. Si pH ‹ pI, la protéine est chargée +. La charge d’une protéine dépend du pH du milieu dans lequel elle se trouve. Ex : l’électrophorèse des protéines sériques Pour un pH=8.6 › pI, les protéines du sérum ont une charge négative et migrent donc vers le pôle positif et s’immobilisent en fonction de leur pI.


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4) La liaison peptidique Une protéine est un enchaînement d’a.a. liés par une liaison peptidique. Le groupement amine NH3+ est à gauche et la carboxyl à droite lors de la représentation d’une protéine. La liaison peptidique est plane, rigide et polaire (=hydrophile)

� La liaison peptidique est plane : Les électrons sont partagés entre les atomes O- C- N mais ils sont plus attirés vers le O qui est le plus électronégatif. Conséquence : il n’y a pas de rotation autour de la liaison C-N

� La liaison peptidique est rigide : Il n’y a pas de rotation entre C-N mais il peut y avoir un angle de torsion qui entraîne 2 configurations : Trans et Cis. .


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Il n’est pas possible de passer de la configuration trans à cis car cela demande une énergie trop importante : la liaison peptidique est donc rigide. Tous les acides aminés ont la configuration Trans sauf la Proline qui peut être Trans ou cis. Encombrement stérique : il existe une répulsion entre les chaînes latérales dans la configuration Cis qui fait qu’elles s’éloignent l’une de l’autre et occupent plus d’espace que dans la configuration Trans.

� La liaison peptidique est polaire : La liaison peptidique possède des groupes qui peuvent former des liaisons hydrogènes. Les liaisons hydrogènes permettent aux feuillets Bêta et aux hélices alpha d’être stables.


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5) La chaîne latérale Les a.a. polaires chargés : Acide aspartique : charge négative Acide glutamique : charge négative Arginine : charge positive Lysine : charge positive Histidine : charge positive Les a.a. polaires neutres : Asparagine Glutamine Sérine Thréonine Tyrosine Les a.a. non polaires : Alanine Glycine Valine Leucine Isoleucine Proline Phénylalanine Méthionine Tryptophane Cystéine En rouge : acide aminé essentiels (Moyen mnémotechnique : Le très lyrique Tristan fait vachement méditer Iseult Leu thr lys trp phe val met ile) Surlignage jaune : acides aminés possédant des chaînes latérales ionisables. Chaque acide aminé possède un groupement fonctionnel qui va déterminer sa fonction.


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� Les a.a. non polaires : -chaîne latérale aliphatique hydrophobe (chaîne hydrocarbonée CH). -chaîne latérale cyclique

- chaîne latérale cyclique et aromatique


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� Les a.a. polaires neutres -a.a. phosphorylables (contient un groupement hydroxyle OH très réactif) (chaîne latérale aromatique aussi) -Cystéine (cas particulier) : groupement sulfhydryle La cystéine possède un groupement thiol et même si c’est un acide aminé non polaire, il se rapproche des caractéristiques des polaires neutres car SH réactif peut échanger son H pour former des ponts S-S. Par une réaction d’oxydation, une cystéine forme fréquemment un pont disulfure avec une autre cystéine pour donner un dimère qu'on appelle cystine. Les cystéines contribuent à maintenir la structure tridimensionnelle de très nombreuses protéines grâce à cette faculté. Si les ponts S-S sont rompus, la protéine va perdre sa fonction. Le 2-β-mercaptoethanol casse les ponts S-S (réduction de la liaison covalente)


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- groupement amide

Ce sont des groupements peu réactifs mais polaire (=hydrophile) et peuvent donc être donneur ou accepteur d’H.

� Les acides aminés polaires chargés -Basiques : la protéine a une charge positive Dans une zone de pH neutre, l’acide aminé histidine peut soit perdre un proton ou soit en prendre : il peut donc être protoné ou déprotoné selon l’environnement.


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-Acides : la protéine a une charge négative

III. les différentes structures

1) la structure primaire : c’est l’ordre d’enchaînement des a.a.

On a une succession d’acides aminés inscrit dans un plan : Cα-CO-NH-Cα Les parties variables sont les chaînes latérales qui donnent une propriété à la protéine. Les groupes de la liaison peptidique peuvent établir des liaisons hydrogènes qui stabilisent la structure secondaire.


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2) la structure secondaire C’est l’arrangement spatial des a.a. organisés en hélices alpha et feuillets bêta (= 2 structures régulières).

Les unités peptidiques peuvent effectuer une rotation autour des liaisons : Cα – N = angle PHI Cα – C = angle PSI Les 2 plans tournent alors l’un par rapport à l’autre et cela permet à la chaîne linéaire d’adopter une structure 3D. Mais toutes les valeurs phi et psi ne sont pas autorisés et seules 2 structures régulières les hélices alpha et les feuillets bêta sont stables. 4 types de liaisons non covalentes maintiennent la conformation des protéines :

• Attraction ionique La liaison ionique résulte de l'attraction électrostatique entre ions de signes contraires mais elle est affaiblie par l’eau.

• Forces de Van der Waals Ce sont des liaisons, de nature électrostatique, s'exerçant entre des atomes ou molécules polarisés. Les deux atomes vont donc porter en alternance et de façon transitoire, une charge positive et une charge négative. Une autre molécule (ou une autre partie de la molécule) va donc être très faiblement attirée par cette charge transitoire. Cette liaison est très faible, mais dans le cas des macromolécules, leur nombre élevé (dû au nombre élevé d'atomes impliqués) va produire au total une force importante.


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• Liaisons hydrogènes

L’hydrogène est considéré comme un proton partagé entre les atomes N et O. L’attraction est d’autant plus forte que les 3 atomes sont alignés.

La liaison hydrogène est affaiblie par l’eau.

• Forces hydrophobes Les molécules d’eau (hydrophiles) repoussent les surfaces hydrophobes autour et cette liaison joue un rôle primordial dans le repliement de la protéine.

� Hélice alpha Dans l’hélice alpha, les a.a. subissent un enroulement oblique : c’est la configuration la plus favorable énergétiquement. Cα est tourné à l’intérieur Les chaînes latérales sont tournées à l’extérieur. Le pas est à droite.


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Un pas (ou tour) = 3,6 acides aminés = 5,41 Angstrom (1,5 Angstrom entre 2 acides aminés) Les liaisons hydrogènes entre NH d’un acide aminé et CO d’un autre acide aminé sont enfuis à l’intérieur et maintiennent la stabilité. Les liaisons hydrogènes rapprochent les acides aminés distants de 3 ou 4 résidus.


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� Le brin bêta : Dans le brin bêta, la chaîne peptidique ne subit aucun enroulement : les a.a. sont allongés, c’est une structure étirée. On parle de brin bêta plissé. Les Cα sont tantôt en dessous tantôt en dessus du brin β. Les chaînes latérales de 2 a.a. adjacents sont orientées dans des directions opposées.

� Le feuillet bêta = association de 2 ou plusieurs brins bêta.

Les 2 brins β ont la même direction. Les liaisons hydrogènes connectent l’a.a. d’un brin à 2 a.a. qui lui fait face.

Les liaisons hydrogènes entre CO et NH connectent un a.a. d’un brin à un seul a.a. qui lui fait face sur l’autre brin.


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� Structures secondaires autre que hélice alpha et feuillet bêta : les tours et les boucles. Les tours : la glycine est le plus petit a.a. et permet aux protéines d’effectuer des tours serrés et d’avoir des contacts étroits.

Les boucles sont localisées à la surface et participent à créer les sites actifs des protéines. C’est une zone où le ligand va se fixer.

3) La structure tertiaire La structure tertiaire est le repliement (ou Folding) de la protéine et met en contact des acides aminés éloignés. Ex : la myoglobine est une molécule compact et globulaire avec un groupement prosthétique (= hème+atome de fer central)

L’hème : 4 cycles pyrroles reliés par des ponts alpha méthylène. Le fer est sous forme Fe2+ et il ne doit pas s’oxyder sinon la myoglobine perd sa fonction. Dans la myoglobine : -Les a.a. hydrophobes sont enfuis à l’intérieur de la protéine. - les a.a. polaires sont en surface. - le squelette polypeptidique est enfui pour que les liaisons H se fassent bien entre CO et NH et non pas avec les molécules d’eau de la surface. Il n’y a aucun vide à l’intérieur de la protéine !


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Cependant dans la myoglobine l’intérieur contient 2 a.a. polaires chargés : des histidines !! Rôle de ces 2 histidines dans le site actif de la myoglobine : La myoglobine fixe l’O2 dans le sang mais a une affinité plus grande avec CO (monoxyde de carbone). Alors pourquoi la myoglobine ne fixe pas le CO ???

L’histidine F8 va relever le fer et l’Histidine E7 va se pencher sur le fer et le gêner pour sa liaison avec CO : encombrement stérique. Le CO ne peut donc pas adopter son angle de prédilection et de plus l’O2 est en large excès dans l’organisme donc la myoglobine va préférentiellement transporter l’O2. La conformation a un retentissement sur la fonction !


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4) La structure quaternaire La structure quaternaire est l’arrangement spatial de la protéine composée de plusieurs sous unités. Un homodimère est un dimère formé de 2 sous unités identiques. Un hétérodimère est formé de 2 sous unités différentes. Ex : l’hémoglobine est un tétramère α2β2 (2 sous unités α et 2 sous unités β)


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IV. Des modifications confèrent aux protéines de nouvelles fonctions.

1) Addition de groupements particuliers aux a.a. Acétylation : Le groupement amine de la lysine peut être acétylé par les HAT=histones acétyl transférase. Les histones contiennent des a.a. lysines et une histone acétylé= activation de la transcription des gènes. Hydrogénation = addition d’hydrogènes Phosphorylation : concerne les a.a. phosphorylables (ser, thr, tyr) Une kinase ajoute un groupement phosphate sur un OH de l’a.a. Rôle primordial dans la signalisation cellulaire. Glycosylation : la glycosylation de l’asparagine augmente le caractère hydrophile des protéines. (pour les protéines présentes à la surfaces des cellules.) Addition d’acide gras sur le groupe α amine augmente le caractère hydrophobe et permet l’ancrage des protéines aux membranes.

2) clivage des protéines après synthèse : l’insuline L’insuline est synthétisé sous la forme d’un précurseur inactif : la préproinsuline. La préproinsuline = peptide signal+ peptide C+ 2 chaînes A et B Le peptide signal dirige la protéine vers le réticulum endoplasmique. Une fois dans le réticulum endoplasmique, le peptide signal est clivé puis le peptide C est séparé dans l’appareil de Golgi. L’insuline est alors formé par les 2 chaînes A et B reliées par des ponts S-S.


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V. Repliement ou Folding 1) Etude sur la ribonucléase Comment prouver que la structure Iaire détermine la structure IIIaire ?? On détruit et recompose la protéine pour voir exactement comment les acides aminés agissent sur la fonction de la protéine. On va étudier la ribonucléase : enzyme qui coupe les ARN. La ribonucléase possède des cystéines où s’établissent des ponts S-S. Les agents dénaturants : -L’urée et le chlorure de guanidium détruisent les liaisons non covalentes. -Le 2-β-mercaptoethanol détruit les ponts S-S. La ribonucléase active possède des ponts S-S entres des acides aminés spécifiques. 1ère expérience : on ajoute urée + 2-β-mercaptoethanol Rupture des liaisons non covalentes et rupture des ponts S-S. La ribonucléase a perdu son activité enzymatique. On retire les agents dénaturants urée + 2-β-mercaptoethanol La protéine a retrouvé son activité enzymatique. La séquence primaire (présence de cystéines) détermine la conformation (ponts S-S) et la conformation spatiale est responsable de la fonction de la protéine. Séquence conformation fonction 2ème expérience : on ajoute de l’urée. On autorise donc la formation de ponts S-S mais pas les liaisons non covalentes. 1% seulement de l’activité enzymatique. La protéine s’est repliée mais sans les liaisons non covalentes elle ne s’est pas bien repliée et les ponts S-S se sont fait entre les mauvais a.a.


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3ème expérience : on retire l’urée + traces de 2-β-mercaptoethanol (juste pour permettre la rupture des mauvais ponts S-S mais pas pour empêcher la formation d’autres) Ribonucléase active 2) Quelques points à retenir

� Certains acides aminés ont une préférence pour certaines structures secondaires mais la prédiction de la structure secondaire à partir de la séquence primaire reste difficile et l’expérience est nécessaire.

� Les interactions non covalentes sont indispensables pour la conformation de la protéine.

� L’environnement de la protéine (urée…) est importante et peut agir sur la protéine. Le repliement est un processus coopératif C’est la loi du tout ou rien : soit la protéine est repliée soit pas : passage abrupt. Le paradoxe de Levinthal : Pour se replier la protéine n’essaye pas toutes les conformations possibles ce serait trop long ! La protéine procède par étapes et si c’est stable elle continue. Le temps de repliement réel est donc beaucoup plus court que le temps de repliement calculé !

VI. Structure tertiaire : niveaux supplémentaires d’organisations Les structures supersecondaires (ou motif de repliement) sont des combinaisons de structures secondaires. 1) Le motif hélice-boucle-hélice : La Calmoduline (CaM) : famille des protéines qui fixe le calcium La CaM est un messager cellulaire activé par le calcium. Elle a 2 domaines : 1er domaine : 2 motifs hélice boucle hélice 2ème domaine : 2 motifs hélice boucle hélice Dans chaque motif hélice boucle hélice : 1 site de fixation du calcium Donc 4 sites de fixation du Ca2+ en tout.


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Si la concentration de Ca2+ dans le cytoplasme est élevée (›500nmol.) Changement de conformation de la CaM : exposition des a.a. hydrophobes à la surface de la protéine et les hélices se soulèvent. La protéine va pouvoir agir avec des protéines cibles. Le substrat Kinase CaM dépendante va alors venir s’encastrer dans la CaM. Conséquences : démasquage d’un peptide C-ter sur kinase CaM dépendante qui fixe l’ATP : La kinase CaM dépendante va prendre un groupe phosphate à l’ATP pour s’auto-phosphoryler. Puis cascade de phosphorylation qui est le signal cellulaire pour la cellule Une pompe Ca2+ - ATPases éjecte alors le Ca2+ à l’extérieur de la cellule et termine le signal. La cellule peut revenir à son état antérieur (rétro-contrôle). 2) Motifs des protéines qui se fixe à l’ADN et régule l’expression des gènes : Les protéines régulatrices possèdent des motifs structuraux typiques au niveau de la zone d’interaction avec l’ADN.

� Motif hélice-tour-hélice : dans les homéoprotéines. L'homéoprotéine est un facteur de transcription codé par un gène homéotique.


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� Motif en doigts de zinc : cys-cys-his-his C’est un domaine d'attache à l'ADN caractérisé par une boucle à la base de laquelle se trouve des histidines ou des cystéines qui coordonnent un atome de zinc. Le zinc est relié à 2 cystéines et à 2 histidines. La présence de zinc stabilise la structure. Les doigts de zinc sont des domaines d'interaction avec l'ADN ou entre protéines.

� Motif en doigts de zinc : cys-cys-cys-cys Ce motif est présent dans les récepteurs nucléaires.

VII. Les domaines protéiques

- Il s’agit d’une partie de la protéine qui se replie et c’est une unité structurelle et fonctionnelle c'est-à-dire qu’un domaine peut fonctionner seul.

- Il est constitué d’une combinaison de structures secondaires et de structures supersecondaires.

- Les domaines sont en nombres limités. - Il est composé de 40 à 350 a.a. - Chaque domaine possède une fonction propre. - Un domaine protéique retrouvé dans des protéines différentes est appelé un

module. Famille de protéines : La duplication d’un gène au cours de l’évolution aboutit à des familles de protéines : les protéines appartenant à la même famille vont remplir des fonctions en commun mais aussi des fonctions spécifiques. On peut établir les liens de parenté entre des protéines en alignant les séquences des a.a. et en comparant la structure tridimensionnelle.


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1- on recherche les domaines protéiques homologues en recherchant d’abord les fingerprints (ce sont des séquences courtes qui ont une fonction précise). Cela permet ensuite de rechercher des homologies plus distantes.

2- On compare les structures tridimensionnelles. Les protéines multidomaines sont constituées d’un mélange de domaines appartenant à des familles différentes. Exemple de protéines multidomaines :


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VIII. Les récepteurs nucléaires : protéines régulatrices de la transcription

Le ligand est une hormone. Pour pouvoir agir sur le gène il lui faut un récepteur nucléaire. Soit le récepteur est déjà fixé sur le gène dans le noyau. Soit le récepteur est à l’intérieur du cytoplasme, il y a alors formation du complexe ligand-récepteur puis transfert dans le noyau. Le complexe ligand-récepteur se fixe au niveau de la région 5’ : le promoteur. Pour que le complexe soit efficace une protéine activatrice doit être aussi là. Tous les récepteurs nucléaires sont constitués de 5 domaines : Les domaines des récepteurs nucléaires sont des modules c'est-à-dire que si on sépare le domaine de fixation à l’ADN il va garder sa fonction et on pourra le fusionner avec une autre protéine.


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Récepteur aux oestrogènes : structure du domaine C (fixation à l’ADN) -homodimère (=2 monomères identiques) de motifs en doigts de zinc (ou motif en doigts de gants) -fixation à l’ADN sur une séquence symétrique. -Chaque monomère est de type cys-cys-cys-cys et contient 2 zincs et une hélice alpha. -les 2 hélices alpha sont fixées sur 2 grands sillons successifs de l’ADN. Récepteur inactif : tant que le ligand n’est pas là, le récepteur ne peut pas activer la transcription. Récepteur actif : la fixation du ligand modifie la conformation du récepteur : l’extrémité COOH se replie et vient recouvrir le ligand ce qui forme une nouvelle surface pour accueillir le complexe activateur. Transcription des gènes ! Le protéasome :


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IX. Le protéasome Les protéines mal repliées ou les protéines dont la cellule n’a plus besoin sont amenées au protéasome. Le protéasome est une sorte de « poubelle » qui coupe les protéines en petits morceaux. Le protéasome est une enzyme (protéase) dépendante de l’ATP, présente dans le noyau et le cytoplasme et qui constitue 1% de la totalité des protéines cellulaires. Protéasome 26S= complexe 20S + complexe 19S 1) Complexe 20S:

-activité catalytique (au niveau des points rouges) -cylindre creux central -4 anneaux heptamériques (7 sous unités) homologues 2 à 2 (2 alpha et 2 bêta). Les sites actifs sont tournés vers l’intérieur et sont localisées à l’extrémité N-Ter des chaînes Bêta quand elles finissent par sérine ou thréonine.


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Dégradation protéique par un protéasome contenant un résidu N-Ter sérine : a. Le groupement –OH de la sérine est activée : exemple de la triade catalytique : asp-

his-ser dans chymotrypsine elastase (= sérine protéases)

b. Attaque nucléophile par la sérine activée.

Le groupe –OH de la sérine est activé et lance une attaque nucléophile sur les groupes carboxyles des liaisons peptidiques. Il y a formation d’intermédiaires acyl-enzyme en même temps.


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c. exemple sur un peptide de 4 a.a. Le peptide de 4 a.a. liés se trouve proche du protéasome qui possède un groupement OH activé (charge-) qui va venir attaquer un C pour former un groupe acyl R-CO. Le peptide est découpé en petits morceaux. Pourquoi le protéasome attaque une chaîne latérale particulière ? Le protéasome contient des enzymes spécifiques pour chaque chaîne latérale donc pour chaque a.a.


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2) Complexe 19S =régulation

L’accès au complexe 20S est contrôlé par le complexe 19S (=cap, 700kdaltons, 20 sous-unités) Le complexe 19S est formé de 6ATPase (catalysant l'hydrolyse de l'ATP en ADP). Il appartient à la famille des P-loop ATPases (boucle P qui se fixe que le phosphate), des N-loop ATPases (se fixe sur les nucléotides tri phosphate) et aussi à la classe AAA (ATPases Associated with various cellular activities : activités variées dans la cellule notamment régulation du cycle cellulaire, formation des organites) Dans le protéasome le complexe 19S va hydrolyser l’ATP, déplier la protéine pour qu’elle est une forme linéaire et qu’elle puisse entrer dans le complexe 20S (=canal creux)

Il est essentiel que le protéasome sache quelle protéine dégrader. Les protéines sont donc marquées par une molécule appelée ubiquitine . Le complexe 19S possède une enzyme isopeptidase qui enlève les molécules d’ubiquitines qui sont ensuite ré utilisées.


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Marquage des protéines avec des chaînes multi ubiquitines

Dans un premier temps il y a rencontre entre l’ubiquitine et l’enzyme activant l’ubiquitine : formation d’une liaison thioester grâce à l’ATP et libération de 2 phosphates. L’ubiquitine va alors être transféré sur un complexe protéique : l’ubiquitine ligase constitué de 2 enzymes E2 et E3. Il y a alors régénération de E1 qui retrouve son groupe –SH (thiol) et recommence un cycle. L’ubiquitine est prête à être transféré sur la protéine. On trouve une protéine avec un signal de dégradation sur N-Ter. L’ubiquitine est transféré sur la protéine : sur le groupement amine de la lysine (liaison isopeptidique) Par un processus identique on obtient une chaîne de 5 à 6 ubiquitines sur la protéine qui va être reconnu par le protéasome et dégradé. Le protéasome participe ainsi au renouvellement des protéines dans la cellule.


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3) Processus régulé par la dégradation des protéines

-La transcription des gènes

L’activation du NF kappa B (facteur de transcription) est due à la dégradation de l’unité inhibitrice (IkB) par le protéasome. NF kappa B inactif = 2 sous unités p65 et p50 couplées à une 3ème sous unité IkB. Un signal d’activation va activer une kinase qui va phosphoryler IkB. La phosphorylation de IkB est le signal de dégradation et les molécules d’ubiquitines vont venir se fixer sur IkB et il va être reconnu par le protéasome et dégradé. NF kappa B actif = complexe p65 et p50 qui va aller dans le noyau et activer la transcription des gènes. Fonction du NF kappa B : réponse immune et inflammatoire, apoptose, développement des cellules sanguines…


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X. Exploration des protéines.

1) Purification des protéines : chromatographie, électrophorèse La chromatographie permet l’identification des types d’a.a. d’une séquence peptidique. La spectrométrie permet la détermination du nombre de chacun des a.a. d’une séquence. 2) Selting out = précipitation par les sels. Les protéines sont moins solubles à des concentrations élevées de sels. On peut donc faire précipiter les protéines suivant leur taux de précipitation dans du sulfate d’ammonium. Certaines protéines vont précipiter pour de faible concentration et d’autres pour de plus forte concentration de sulfate d’ammonium. 3) La dialyse La dialyse permet de séparer les protéines d’un coté et les sels et autres petites molécules de l’autre (elles ont un diamètre inférieur donc vont passer à travers le sac de dialyse) Mais la dialyse ne permet pas de faire la distinction entre les différentes protéines.


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4) La chromatographie par filtration sur gel (ou gel exclusion)

Les protéines vont être séparées en fonction de leur poids (ou de leur taille car une protéine lourde sera plus grande). Des billes d’agarose creusées à l’intérieur vont laisser entrer les petites protéines qui vont être retardé et atteindre le bas de la colonne moins rapidement. Les molécules de grande taille exclues des billes sont collectées en 1er. 5) Chromatographie par échange d’ions. Les protéines sont séparées en fonction de leur charge.

Les protéines chargées + se fixent sur les billes qui ont une charge -. Les protéines chargées – ne sont pas fixées.


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6) Chromatographie d’affinité Les protéines sont séparées en fonction de leur affinité de fixation à un ligand. Exemple : Les protéines qui fixent le glucose sont retenues par des billes sur lesquelles sont greffés des résidus glucose. 7) Séparation des protéines sur gel Electrophorèse : déplacement d’une molécule possédant une charge nette dans un champ électrique. La vitesse de migration des protéines est fonction du champ électrique, de la charge, de la masse et de la conformation des protéines. On considère le champ électrique constant. On utilise du SDS (=sodium dodécyl sulfate) qui supprime les variables charge et conformation. La vitesse ne dépend plus que du poids moléculaire (en daltons) !! Le SDS va donner à toutes les protéines une charge négative et une conformation linéaire.


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Exemple : Mais la chromatographie et l’électrophorèse ne permettent pas de déterminer la séquence primaire car on ne connaît pas l’ordre d’enchaînement des a.a.


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XI. Détermination de la séquence primaire

1) Déterminer la composition en a.a. du polypeptide Le peptide est placé dans une solution d’HCl 6N à pH très acide. L’hydrolyse s’effectue durant 24h à 110°. On effectue ensuite une chromatographie pour caractériser les différents a.a. (avec la ninhydrine une coloration bleue se fixe aux a.a. et selon la teinte plus ou moins foncée on peut déterminer la concentration de chaque a.a.)

2) identification de l’extrémité N-Ter Il faut maintenant connaître l’ordre d’enchaînement des a.a. On va d’abord identifier l’extrémité N-ter en mettant le peptide en présence de dabsyl chloride. Liaison covalente entre SO2 du dabsyl chloride et la fonction amine du dernier a.a. La réaction d’Edman permet de retirer le dernier a.a N-Ter sans hydrolyser tout le peptide : On met le peptide en présence de phenyl isothiocyanate L’isothiocyanate de phényl se fixe sur le NH2 terminal grâce à son atome de souffre. Cette liaison va fragiliser la liaison peptidique entre le 1er et le 2ème acide aminé. On effectue ensuite une hydrolyse douce pour ne détruire que la liaison fragiliser afin, que le reste du peptide reste intacte. On obtient alors par exemple un phényl-isothiolcyanate-alanine et une chaîne peptidique (n-1).


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Cette technique peut s’effectuer que sur des peptides dont la longueur ne dépasse pas 50 a.a. environ. Solution : il faut couper la protéine en petits fragments grâce à des protéases.


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Exemple : 3) Le western blot Les anticorps ont une affinité spécifique vis-à-vis des antigènes. Les protéines peuvent jouer le rôle d’antigènes. L’anticorps reconnaît sur la protéine une séquence précise d’a.a. appelée épitope ou déterminant antigénique.

les protéinesaup1perdu.nancy.free.fr/bioch/lesproteines.pdf · ... formule générale des acides...

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