i. bacteriologie generale ii. relations...

IFSI, UE 2.10.S1, G. Chabanon

I. BACTERIOLOGIE GENERALEII. RELATIONS BACTERIE-HOTE

III. APPLICATIONS

« Unité d’Enseignement 2.10.S1 »« Infectiologie-Hygiène »

(année 2011-12)

----Professeur Gérard CHABANONLaboratoire de Bactériologie-Hygiène

Faculté de Médecine Toulouse-Rangueil


I . BACTERIOLOGIE GENERALEINTRODUCTION AU MONDE MICROBIEN

GENERALITES1. Microscope : - apparaît au début du XVII è siècle ; postérieur à la

lunette astronomique, postérieure aux lunettes à lire (-300 ans),

- Anthony Van Leuwenhoeck (Delf) : le plus grand et plus infatigable des observateurs au microscope ; découverte d’un monde vivant, «animaculesmicroscopiques » ; base de la microbiologie mais pas seulement,

- constat de l’étendue du monde microbien : air, eau, sol (environnement) et animaux.


2. Terminologie : un repère, le Dictionnaire de la Langue Française par E. Littré, Paris, 1875 ; mots non encore répertoriés :

. microbe , mais sont cités « les microscopiques »cad les êtres vivants qui ne peuvent être vus qu’au microscope et, bien entendu les « animacule s »,

. bactérie : terme non encore retenu ; ceux largement décrits : infection , contagion , épidémie et mesures préventives (lazaret, quarantaine) ; exemple : grande peste (XIV è siècle ) mais connue et parfaitement décrite bien avant (V-VI av J.C.) ; plus près de nous : choléra (XIXè siècle ); progrès des connaissances issus des épidémies …

. « virus », terme utilisé mais pour décrire à la fois toutes les substances capables de produire la maladie infectieuse mais également le principe de transmissiondes maladies contagieuses ; la définition du virus, telle que nous la connaissons aujourd’hui, est plus tardive.


3.Structure fonctionnelle des bactériesGénéralités

1/ Bactéries : plus petits microorganismes vivantsconnus ; unicellulaires ; font partie des procaryotes .2/ Nous appartenons aux eucaryotes ; nous sommes desêtres vivants pluricellulaires , nos cellules sont organisées en tissus.

Attention ! il existe d’autres organismes vivants, unicellulaires qui sont classés parmi les eucaryotes (champignons, algues, protozoaires…). 3/ Comparaison cellule eucaryote /cellule procaryote :


cellule eucaryote cellule procaryote

Noyau

oui

non ; appareil nucléaire

membrane nucléaire oui

non

chromosome

oui

multiple de 2N « diploïde »

oui

unique N = 1 « haploïde »

multiplication mitose

Pluricellulaire

bi-partition (scissiparité) 1 cellule mère� 2 cellules

filles identiques

mitochondries (« centrale d’énergie »)

oui lieu : intracytoplasmique

non lieu de production d’énergie :

membrane cytoplasmique

paroi

absente

(sauf cellule végétale)

présente

(sauf mycoplasmes)


4. Taille(s) et forme(s) : . généralement : taille de 1 à 10 µm ; les morphologies et les types de groupement, reflet du mode de division, sont des critères très utilisés pour identifier les bactéries,. visibles au microscope optique : sphère (cocci), bâtonnets (bacilles), incurvées (vibrions), spirochètes(dispositif optique spécial) ; microscopie optique courant : grossissements de 100 à 1000 fois ,. intérêt de certaines colorations : GRAM (positif ou négatif), ZIEHL (mycobactéries)…. microscopie électronique (ultra-structure) : apport considérable par coloration négative ou coupes sagittales; balayage.

D. Clavé - M. Archambaud 2010

Morphologie des bactéries


Structure bactérienne


Eléments constitutifs de la structure bactérienne ( 1)1/ cytoplasme , apparaît optiquement « vide » ; contient : - chromosome ou génome de la bactérie (« appareil nuclappareil nuclééaireaire »):

. composé d’ADN, double brin , généralement unique, circulaire ,

. sa réplication (multiplication à l’identique) est la cible d’action de certains antibiotiques ( quinolones; rifamycines ; nitro-imidazolés …)

. siège de mutations (modification de composition de la chaînepolydésoxyribonucléotidique (ADN) dont certaines peuvent être àl’origine de la résistance de la bactérie aux antibiotiques (résistance aux antibiotiques; mutation de la cible). le séquençage partiel et mieux encore le séquençage de l’entier chromosome permettent une identification parfaite de la bactérie (méthode d’identification peu utilisée en routine),

- plasmides, ADN, support gènes résistance antibiotiques (résistance plasmidique; R enzymatique) / gènes de virulence (facteurs pathogénicité).

- ribosomes , regroupés sous forme de polyribosomes , lieu de la synthèse des protéines : polyribosomes + ARNm + ARNt � peptides ; cibles d’action de certains antibiotiques (aminoglycosides, tétracyclines, chloramphénicol, Macrolides,Lincosamines,Synegistine…)


Eléments constitutifs de la structure bactérienne (2)2/ membrane cytoplasmique , bi-couche phospholipidique :

- participe aux échanges nutritionnels entre la cellule bactérienne et son environnement ;

- « centrale » de production d’énergie ; - cible d’action de certains antiseptiques et antibi otiques (polymyxines, nitrofuranes).

3/ paroi- présente chez toutes les cellules procaryotes et chez certaines cellules eucaryotes (végétales), ORIGINALITE

- constituée d’une macromolécule très originale : le peptidoglycane , macromolécule rigide (confère à la bactérie sa forme), agencée en maille de filet, rôle protecteur (résistante aux chocs osmotiques),

- support du caractère gram positif ou gram négatif (coloration de GRAM), lié à sa composition chimique et à son organisation physique (épaisseur GRAM + > GRAM-) ; très important en pratique : diagnostic bactériologique, action antibiotiques, physiopathol ogie…

Gram positif

Staphylococcus Sreptococcus

Listeria Clostridium Nocardia

Gram négatif

entérobactériePseudomonas Acinetobacter

Helicobacter pylori


Eléments inconstants de la structure bactérienne (4)

1. capsule : double extérieurement la bactérie ; plus souvent de nature polysaccharidique (pneumocoque ; méningocoque) mais non exclusivement ; facteur inhibiteur de la phagocytose.

Remarque : il peut exister chez certaines bactéries d’autres composésprésents à la surface de la bactérie et désignés sous le terme d’exopolysaccharides ou « slime » (chez Pseudomonas aeruginosaou bacille pyocyanique). 2. fimbriae ou pili ; structures filamenteuses plus ou moins organisées, de nature protéique ; certaines d’entre elles constituent un facteur de pathogéncité (par ex : sont le support de molécules dites « adhésines » car permettent la fixation des bactéries à la surface des cellules des muqueuses).3. spore ++: lorsque la bactérie se trouve dans des conditions de vie défavorables, elle se transforme en spore (sporulation) :

. il s’agit pour la bactérie d’une forme de survie mais aussi de résistance à la dessiccation et à la chaleur ; ce qui explique les températures qu’il faut atteindre au cours des procédures de stérilisation (120°en chaleur humide) pour les tuer ; cette modifi cation de forme est rencontrée chez les bactéries habituellement présentes dans l’environnement : bacillus, clostridium (Clostridium tetani, responsable du tétanos)…


« forme végétative »

conditions défavorables « germination »

� « sporulation » conditions favorables

« spores »

Mode d ’actionLes cibles bactériennes des

antibiotiques

La paroi

Le ribosomeL ’ADN

ββββ-lactaminesGlycopeptidesFosfomycine

AminosidesMacrolides, kétolidesLincosamidesSynergistinesTétracyclinesAcide fusidiquePhénicolésLinezolide

QuinolonesRifamycinesNitroimidazolésSulfamides

PolymyxinesDaptomycine

La membrane externe


II. RELATIONS BACTERIE – HOTEFACTEURS DE PATHOGENICITE DES BACTERIES,

leur rôle dans la genèse du processus infectieux

Généralités (1)

1. Bactérie « pathogène » : capable de provoquer une maladie infectieuse chez un individu (animaux… plantes) dont les mécanismes de défense sont normaux.

2. Maladie infectieuse : conséquence d’un conflit entre :. capacité d’agression de la bactérie (ou du pathogène : virus,

parasites, champignons…) vis-à-vis de l’hôte. mécanismes de défense de l’hôte : « défenses non

spécifiques », dites naturelles et « défenses spécifiques », la réponse immunitaire: humorale, cellulaire ; DUALITE.


Généralités (2)

3. Maladie infectieuse : description très ancienne dans l’histoire de l’humanité: écrits, momies, représentations peintures/sculptures…) ; particularité, contagiosité, épidémie, mesures préventives (isolement) mais existence de maladies infectieuses non contagieuses (ex: infection urinaire).

4. Lien de causalité �� maladie/agent pathogène ++ :. historique , compréhension expérimentale de la

maladie naturelle- par inoculation de « produits » issus d’un individu malade à un

animal sain ou de la bactérie isolée en culture pure ; fin du XIXèsiècle, travaux de Pasteur, Koch, … : ex Mycobacterium tuberculosis et le cobaye (tuberculose),

- par injection de l’un des « produits » bactériens : toxine tétanique et cobaye (tétanos) ; premier quart du XXè siècle ; « théorie toxiniquede la maladie infectieuse »,

- par vaccination , contre preuve.. aujourd’hui : nous savons que, bien souvent, la genèse de la

maladie infectieuse est le résultat de l’action de plusieurs facteurs de pathogénicité que la bactérie en cause peut exprimer.


GENERALITES (3)

5. Territorialité : monde septique/monde stérile ++- nous vivons dans un environnement septique ; microorganismes

dans sol, air et eau.- surface de notre corps , revêtement peau et muqueuses ; limite

physique, naturelle entre territoires septiques et stéri les :-> extérieur , flores microbiennes présentes : muqueuses (oro-pharynx, digestif, vaginale, surtout) >> peau . . - - --> intérieur , stérile : viscères (cœur, foie, cerveau, muscles, os,..) et liquides organiques (sang, lymphe, LCR, urines…).

- composition flores bactériennes humaines:. bactéries « endogènes », « flore commensale » résidente,

présente chez tous les individus ; majoritaire(ex : tube digestif : anaérobies ; Escherichia coli et entérocoques…)

. bactéries en « transit », issues de l’environnement, quantitévariable selon périodes et individus.Association peau/muqueuse + flores microbiennes réside ntes :

barrière naturelle très efficace contre l’infection.


Les flores bactériennes

Flore cutanée

Flore oro-pharyngée

Flore digestive

Flore vaginale

=Flores commensales

Quantités


GENERALITES (4)

6. BACTERIES « PATHOGENES »Deux situations à considérer :

- - Bactéries pathogènes opportunistes (BPO) :- . nombreuses espèces concernées ; origine soit bactérie des

« flores commensales » soit de « flore de transit , saprophyte». conditions normales : BPO ne créent pas de maladie

infectieuse mais, si conditions « favorables » (occasion fait le larron) – rupture spontanée /provoquée revêtement cutanéo-muqueux - -> infection.Remarque : « portage sain » . L’organisme héberge, en l’absence de signe(s) d’infection, une bactérie bien connue pour son pouvoir pathogène; ex : streptocoque A (Streptococcus pyogenes) (angine,…) ou méningocoque (Neisseria meningitidis) (méningite cérébrospinale); le mécanisme du passage d’un simple portage ->maladie déclarée, demeure mal expliqué,


GENERALITES (5)

- - Bactéries pathogènes spécifiques (BPS) :. nombre limité d’espèces concernées - essai de définition :. dès leur pénétration dans l’organisme (voies naturelles),

expression de leur pouvoir pathogène et apparition de l’infection,. leur isolement en culture , à partir d’un prélèvement, est synonyme

d’infection ++.ex : Mycobacterium tuberculosis, Brucella, Neisseria gonorrhoeae…Remarque : PATHOVARS ++ : certaines souches, appartenant à une espèce bactérienne donnée, considérée habituellement telle que BPO, peuvent posséder des gènes de virulence -> comportement de BPS ; ex actualité très récente : - souches d’ Escherichia coli , hyper virulentes (graines germées); situation déjà décrite, E.coli -> « maladie des hamburgers » ou Syndrome Hémolytique et Urémique…; - souche de Klebsiella pneumoniae , hyper virulente et multi résistante aux antibiotiques (Inde, Asie -> importation récente en EU).


Modélisation du processus infectieux :de la porte d’entrée -> l’infection (1)

1) Colonisation, pénétration/invasion :- peau plus résistante que muqueuses ; certaines bactéries capables pénétrerspontanément peau saine (Leptospires) ; rôle favorisants traumatismes (micro

traumatismes, plaies, …),- surface muqueuses, point de départ majorité infection s spontanées ++ ,

(spontanées ; provoquées chirurgie, endoscopie) ;. adhésines chez certaines bactéries (fimbriae, cf partie I du cours) facilitent

fixation surface muqueuses ;. exopolysaccharides ou « slime » protection bactéries/défenses non spécifiques

.Remarques +++:- notre organisme est, en permanence le siège de tent atives de

colonisation/invasion par les bactéries et assure leur élimination : arbre respiratoire : escalator mucociliaire ; voies urinaires : jet des urines ; tube digestif : acidité, effet de barrière flore « endogène » ….

- dans des conditions normales, les défenses « nature lles » assurent le maintien de la stérilité des tissus s/cut. et s/muqueux ,des viscères et des liquides organiques…

- infections dites « épicellulaires » ++ : bactérie infectante n’atteint pas espaces s/cutanés/muqueux. (Bordetella pertussis/coqueluche, Neisseria gonorrhoeae /blénorragie (MST)…


Modélisation du processus infectieux : de la porte d’entrée -> l’infection(2)

2) Multiplication/diffusion (tissus, septicémies) ; facteurs bactériens facilitant cette étape :

- résistance phagocytose ; capsule ( cf partie I du cours) ; survie…- captation du Fe : sidérophores.- résistance pouvoir bactéricide sang (sérum)…- échappement au système immunitaire…3) Destruction tissus (nécrose…) : action toxines et enzymes

bactériens ++


Toxines bactériennes (1)1) Toxines protéiques :

- nombreuses bactéries assurent la synthèse de telles toxines- >300 décrites- par définition , effet biologique constaté à très faibles doses ; armes NBC- conséquences cliniques variées :

. soit la toxine est responsable à elle seule de maladie cl inique (tox tétanique/tétanos ; tox botulinique/botulisme ; entérotoxine : intoxication alimentaire, choléra…

. soit, maladie clinique résultat actions conjuguées toxine( s) + enzymes (s)- classification :

. AB toxines , composées de 2 polypeptides :B fixation à la membrane cellulaire (cellule cible) ; A partie active fixation sur la cible, dans la cellule (Tox tétanique, botulinique, entérotoxines….)

. toxines cytolytiques, cible = membrane cellulaire ex phospholipase/globules rouges/hémolysine redoutable (Clostridium perfringens)

. toxines agissant tels des « super antigènes » c.a.d. -> réponse inflammatoire massive -> « syndrome de choc toxique », pronostic redoutable (staphylococcique, streptococcique)

- antigéniques et immunogènes : induisent la synthèse d ’anticorps, capables de « neutraliser » le pouvoir tox de la toxine

toxine -> anatoxine c.a.d. sous action conjuguée de la chaleur et du formol la protéine perd sa toxicité (détoxification) mais reste antigénique et immunogène-> vaccins anti tétaniques et anti diphtériques.


2) Endotoxines :- nature chimique : Lipide A, en fait un complexe lipopolysaccharidique, désigné par le terme de LPS- enchassé dans la membrane externe de la paroi des bactéries à Gram négatif ; de composition identique p our toutes les BG-- antigénique et immunogène (pas intérêt en pratique…)- nombreux effets biologiques (cascade…), quelle que soit l’espèce bactérienne BG- : hyperthermie, leucopénie, libération de médiateurs pro-inflammatoires -> choc hémodynamique endotoxinique ou dit encore « choc septique à Gram négatif » ; redoutable (réanimation).

Remarque : une toxine bactérienne (toxine protéique), : ex toxine tétanique (Clostridium tetani/tétanos) ; toxine botulinique(Clostridium botulinum/botulisme) ; entérotoxines(Staphylococcus aureus/intoxication alimentaire ; Vibrion cholerae/choléra


En conclusion ,Modèle animal : historiquement -> étude du processus

infectieux/protection expérimentale : démarche globale dans la connaissance des relations agent pathogène/hôte ; demeure encore aujourd’hui mais, surtout, études de protection (vaccins…) ; autre animal « zebra fish »++

« Théorie toxinique » de la maladie infectieuse : étapehistorique fondamentale d’investigation (vaccins très efficaces) mais nombre très limité de bactéries concernées ;

Concepts actuels : origine du pouvoir pathogène d’une bactérie est « pluri factorielle » « boîte à outils » y compris les facteurs d’échappement aux systèmes de défense de l’hôte (mosaïque antigénique) ; approche génétique « gènes de pathogénicité » -> vaccins du futur ... ; tout individu n’a certainement pas le même statut devant le risque infectieux…

Zebrafish


III. APPLICATIONS : DIAGNOSTICBACTERIOLOGIQUE D’UNE INFECTION

AU LABORATOIRE

Généralités (1)

Le diagnostic au laboratoire d’une infection bactérienne repose sur les étapes suivantes :

1. Mise en évidence de la bactérie infectante dans l es prélèvements du patient ; diagnostic direct :

- réaliser un examen direct, microscopique, des prélèvements ; approche cyto-bactériologique

- isoler la bactérie après mise en culture des prélèvements et l’identifier ; tester sa sensibilité aux antibiotiques (antibiogramme)


- détection rapide d’Ag bactériens ++ dans les prélèvements : S.pneumoniae (Ag capsulaire, urines,LCR) ; S.pyogenes (gorge) ; Legionella (urines) ; C.difficile (toxine,selles)

- détection rapide de gènes (ADN) bactériensd’« intérêt » ; identification bactérie: ex Mycoplasma pneumoniae ; gènes de virulence : ex E.coli; gènes résistance aux antibiotiques : ex Staphylococcus aureus…

2. Recherche de la réponse immunitaire du patient à l’infection : diagnostic indirect :

- humorale -> AC dans le sérum - cellulaire -> Intra Dermo Réaction ;

ex test tuberculinique


Généralités (2)

Le diagnostic au laboratoire d’une infection bactérienne demande une parfaite concertation entre le médecin , le personnel soignant qui, bien souvent, réalise les prélèvements et le laboratoire d’analyses .

Il est essentiel de fournir des renseignements cliniquesprécis et de les joindre aux prélèvements lors de la demande d’analyse.

Il est impératif de respecter les protocoles pour le recueil des prélèvement (asepsie par ex…) ainsi que les conditions optimales d’acheminement des prélèvements au laboratoire (délai, température…)


Généralités (3)

Les prélèvements doivent être réalisés avant l’administration d’antibiotiques ou au décours d’un arrêt volontaire de l’antibiothérapie (« fenêtre »).

La nature du prélèvement est fonction du siège (type ) de l’infection (suspicion) : oropharynx / angine ; urine / IU ; sang / septicémie ; expectoration / infection respiratoire ; LCR / méningite…

La performance de l’analyse bactériologique dépend en grande partie de la qualité du prélèvement ; la pertinence de l’interprétation du résultat est augmentée par la qualité des renseignements cliniques et thérapeutiques fournis au biologiste.

Enfin, au niveau du laboratoire, il y a lieu de distinguer les prélèvements issus selon leurs sites anatomiques : s tériles ou septiques (flores commensales : selles (intestin), cavité vaginale, oropharynx et peau -> considérations techniques et interprétation des résultats.


EXAMEN DIRECT DU PRELEVEMENT

Certains prélèvements sont examinés, d’emblée, directement au microscope après coloration pour examens cytologique (bleu de méthylène, MGG,) et bactériologique (Gram) :

ex urines/infection urinaire ; liquide céphalo-rachidien/méningite purulente ; sécrétions trachéo-bronchiques/infection respiratoire ;ponction abcès…


LCR de méningiteColoration de Gram

* Polynucléaires

* Coques à Gram + (diplocoques) capsulés

Pour les liquides biologiques : LCR, L. articulaire …� numération et formule des éléments nucléés

après cytocentrifugation et coloration


MISE EN CULTURE DU PRELEVEMENTObjectif : assurer l’isolement sur milieu solide de colonies bactériennes , point de départ de :- identification -> nom de Genre et d’espèce : ex Staphylococcus aureus,- détermination de sa sensibilité aux antibiotique s ; antibiogramme


Milieux de culture : solides ou liquides

Isolement sur gélosesConditions de culture

Identification des bactéries(besoin de culture pure =

isolement de chaque type de colonies)

DénominationEx:Staphylococcus aureus

StaphylococcusepidermidisEscherichia coli


Conduite de l’examen bactériologique

Jour 1 et jours suivants

Bien observer les différentes colonies

-> Taille-> Couleur-> Hémolytique ou non…

-> Coloration de GRAM sur les différentes colonies


Protéines

membrane externe, capsule…

ADN

Métabolisme bactérienEnzymes

Identification biochimique

PCRAmorces spécifiques espèceAmorces spécifiques toxineIdentification moléculaire

Identification des bactériesNom espèce exemple : Staphylococcus aureus

Identification antigénique


Antibiogramme standard par diffusion en milieu solide


Antibiogramme en milieu liquide / automate


Temps de réponse des cultures

• Au moins 48 heures– Dans la journée pour l’examen direct

– 24 h au minimum pour isolement des colonies– 24 h de plus pour l’identification et

l’antibiogramme. Temps légèrement raccourcis avec les automates (exemple VitekR, PhoenixR)

• Parfois beaucoup plus long• Réponse définitive entre 2 et 15 jours…….


COMMENTAIRES (1)

Bactérie sensible , de sensibilité intermédiaire ou résistante à un antibiotique : sur quelles bases ?-> détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI)-> comparaison, pour une souche bactérienne donnée et un antibiotique donné, entre la valeur de la CMI et la concentration moyenne obtenue dans le sérum d’un individu lors de l’administration de cet antibiotiq ue àposologie habituelle.La surveillance efficacité/toxicité d’un antibiotique peut imposer , dans certaines situations cliniques, son dosage (aminoglycosides, vancomycine).


Antibiogramme en milieu liquide / automate


COMMENTAIRES (2)Biologie moléculaire et analyse de l’ADN bactérien : une introduction récente et en plein développement apportant une expertise irremplaçable pour :- détection rapide des bactéries « d’intérêt » dans les prélèvements - identification de certaines espèces bactériennes ++:

ex : bactéries de l’environnement/infections humaines

- caractérisation d’une souche au sein d’une espèce donnée ++ :

. gène(s) de toxine(s)

. « marqueur » épidémiologique, par exemple, de « tracer » sa diffusion ; empreintes génétiques : ex Legionella

Document CNR des légionelloses


Démarche qualité prise en charge des prélèvements

est sous la responsabilité du laboratoire qui doit s’assurer que l’ensemble des actes réalisés lors des phases :

pré-analytiques (prescription, prélèvement, collecte des renseignements, transport)analytiques (analyse proprement dite)post-analytiques (expression, interprétation et transmission des résultats)

a fait l’objet de procédures écrites et de contrôles de qualité.A chaque étape des mesures de sécurité doivent être pri ses et respectées .

i. bacteriologie generale ii. relations...

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