enseignement tutoréenligne(ed1)) · les syndromes myélodysplasiques (smd) sont des hémopathies...

DFGSM2, UE Tissu sanguin : Hématologie, ED2 : enseignement tutoré en ligne (partie 1)

Enseignement)tutoré)en)ligne)(ED2))

(1) Concep'on(de(l’enseignement(:(Caroline(Bret(

Par$e&1&

Méthodes)d’explora:on))en)Hématologie)cellulaire)

Informa'on(importante(!(Cet$ enseignement$ en$ ligne$ (par/e$ 1)$ a$ pour$ objec/f$ de$ préparer$ la$ séance$ présen/elle$ (par/e$ 2)$ de$ l'ED2$ "Ou/ls$ d'explora/on$ en$ Hématologie$cellulaire".$

Il$est$donc$indispensable$de$suivre$cet$enseignement$(par/e$1)$avant$ la$séance$présen/elle$de$l'ED2$(par/e$2).$

DFGSM2, UE Tissu sanguin : Hématologie, ED2 : enseignement tutoré en ligne (partie 1) Les objectifs pédagogiques

Les)objec:fs)pédagogiques)

Préambule)

A l’issue de cette séance, vous devriez être en mesure de :

(1)

*) Citer) les) ou:ls) d’explora:on) biologiques des) cellules) hématopoïé:ques) de) 2ème) inten:on) (ou) examens)biologiques spécialisés)en)Hématologie)cellulaire)) )*)Décrire)leur)principe)))*) Citer) leurs) principales) indica:ons) en) hématologie))*)Citer)leurs)avantages)et)leurs)limites))

Sommaire)de)la)séance)

Préambule)

(2)

Introduc:on)

&

) Pourquoi& u$liser& des& examens& biologiques spécialisés& & (ou& ou$ls& d’explora$on& de& 2ème& &inten$on)&en&Hématologie&&?&

& Quels& sites& anatomiques& impliqués& dans& & l’hématopoïèse& pathologique& peutAon& &explorer&avec&ces&examens biologiques&?&

)Quels) sont) les) examens) spécialisés) pouvant)être) u:lisés) en) Hématologie) cellulaire)(défini:on,) modalités) de) réalisa:on,)avantages,)limites))?))

)A&les&examens&de&Cytologie&spécialisée&

&

&A&les&examens&de&Cytométrie&en&flux&

&

&A&les&examens&de&Cytogéné$que&

&

&A&les&examens&de&Biologie&moléculaire&&

))

DFGSM2, UE Tissu sanguin : Hématologie, ED2 : enseignement tutoré en ligne (partie 1) Sommaire de la séance

Déroulement)de)la)séance)

Préambule)

(3)

IMPORTANT !

Il vous est demandé de lire attentivement ce document pdf.

Les exercice qui suivent cette partie théorique sont très simples ! Leur objectif est de vous permettre de vérifier les connaissances acquises.

Pour passer d’un exercice à l’autre, la validationde votre(vos réponse(s) est obligatoire.

REMARQUES :

Certaines notions sont abordées sous forme de « focus » (mini-résumés vous apportant des informations complémentaires).

DFGSM2, UE Tissu sanguin : Hématologie, ED2 : enseignement tutoré en ligne (partie 1) Déroulement de la séance

Pourquoi)u:liser)des)examens))spécialisés)en)Hématologie))cellulaire)?)

Introduc:on)

(4)

Pour$ rappel,$ l’hématopoïèse$ peut$ être$ explorée$ en$première$ inten/on$ par$ un$ examen$ très$ couramment$

employé,$ l’hémogramme) (ou$ numéra/on$ et$ formule$sanguine).$

$Cet$examen$peu$invasif$est$informa/f$dans$de$nombreuses$

situa/ons$pouvant$affecter$l’hématopoïèse$:$

$O  des$ situa:ons) dites) «) réac:onnelles) ») ou$ acquises)

transitoires$ (exemple$ des$ carences$ en$ vitamine$ B12$

ou$ folates,$ des$ états$ infec/eux,$ du$ blocage$ de$matura/on$granuleuse$iatrogène…),$

$O  des$ anomalies) géné:ques) cons:tu:onnelles)

(exemple$ des$ maladies$ héréditaires$ des$ globules$

rouges,…),$$

O  des$ anomalies) acquises) tumorales) que$ l’on$ désigne$par$le$terme$d’hémopathies)malignes.$

$

$

DFGSM2, UE Tissu sanguin : Hématologie, ED2 : enseignement tutoré en ligne (partie 1) Pourquoi utiliser des examens spécialisés en Hématologie cellulaire ?

Pas de panique ! Ces différents états pathologiques de l’hématopoïèse seront abordés au fur et à mesure des cours dispensés dans le cadre de cette UE !

Focus(1.1())))Les)hémopathies)malignes)

Les hémopathies malignes sont définies comme étant des pathologies tumorales de l’hématopoïèse.

Introduc:on)


(5)

Elles peuvent affecter différentes branches de l’hématopoïèse et sont très hétérogènes sur le plan biologique et clinique.

Il existe différentes catégories d’hémopathies malignes dont la description officielle est donnée par un ouvrage de référence, la classification OMS des tumeurs hématopoïétiques et des tissus lymphoïdes :

Les principales catégories d’hémopathies malignes (en simplifiant) sont : * les syndromes myéloprolifératifs,* les syndromes myélodysplasiques,* les leucémies aiguës,* les lymphomes ou néoplasies matures affectant la lignée lymphoïde.

Focus(1.2())))Les)syndromes)myéloproliféra:fs)

Les syndromes myéloprolifératifs (SMP) sont des hémopathies au cours desquelles une ou plusieurs lignées hématopoïétiques prolifèrent de façon incontrôlée et chronique. Les principales sous-catégories (liste non exhaustive) sont :

* la leucémie myéloïde chronique (LMC) : prolifération de la lignée granuleuse,* la thrombocytémie essentielle (TE) : prolifération affectant la lignée plaquettaire,* la polyglobulie de Vaquez (PV) : prolifération affectant la lignée érythroïde,* la myélofibrose primitive : prolifération des lignées plaquettaire et granuleusequi évolue vers un appauvrissement progressif de l’hématopoïèse par unphénomène de fibrose.

Introduc:on)


(6)

Au bout de plusieurs mois ou années d’évolution, ces pathologies ont la possibilité d’évoluer vers une fibrose de la moelle osseuse ou vers un phénomène de transformation en leucémie aiguë, que l’on appelle l’acutisation. Ce sont essentiellement des pathologies de l’adulte.

Du fait de ces phénomènes de prolifération et en dehors des stades de fibrose, la moelle osseuse des patients atteints de SMP est généralement une moelle de densité augmentée, riche, voire très riche en cellules.

Focus(1.3())))Les)syndromes)myélodysplasiques)

Les syndromes myélodysplasiques (SMD) sont des hémopathies au cours desquelles des anomalies de la cellule souche hématopoïétique engendrent une augmentation de l’hématopoïèse dans le compartiment médullaire avec production de cellules anormales et paradoxalement des cytopénies au niveau du sang circulant. Ce sont essentiellement des pathologies de l’adulte âgé.

Au bout de plusieurs années d’évolution, ces pathologies ont la possibilité d’évoluer vers un appauvrissement de la moelle osseuse (ou insuffisance médullaire) ou vers un phénomène de transformation en leucémie aiguë, que l’on appelle l’acutisation.

Focus(1.4())))Les)leucémies)aiguës)

Les leucémies aiguës (LA) résultent de la prolifération médullaire d’un clone de cellule hématopoïétique maligne bloquée à un stade de différenciation précoce de l’hématopoïèse également appelé « blaste ».

Introduc:on)


(7)

Bien que bloqués à un stade très immature, les blastes peuvent être partiellement engagés vers la différenciation lymphoïde (B ou T, NK plus rarement) ou myéloïde. Il existe ainsi une multitude de sous-catégories de LA en fonction de la nature des blastes.

Les blastes peuvent être retrouvés à de faibles pourcentages au cours d’autres hémopathies malignes (cas des SMP et des SMD) : par définition, le taux de blastes dans la moelle osseuse doit être de 20% au minimum pour retenir un diagnostic de LA.

Focus(1.5())))Les)lymphomes)ou(néoplasies(lymphoïdes(matures(

Les lymphomes sont des tumeurs caractérisées par la prolifération maligne de cellules lymphoïdes matures, les cellules lymphomateuses. Elles se distinguent ainsi des LA lymphoblastiques au cours desquelles des cellules blastiques lymphoïdes immatures prolifèrent (cf. supra). Certaines de ces pathologies affectent la lignée plasmocytaire (exemple du myélome multiple).

Contrairement aux autres hémopathies malignes précédemment décrites, ces pathologies émergent non pas au sein de la moelle osseuse (sauf exception) mais au sein des organes lymphoïdes périphériques (ganglions, rate,…). Elles peuvent toutefois envahir secondairement la moelle osseuse.

Une LA peut survenir à tous les âges de la vie. Au fur et à mesure de la prolifération des blastes dans la moelle osseuse, une insuffisance médullaire survient avec comme conséquence un appauvrissement progressif de l’hématopoïèse. Un traitement adapté est indispensable. A défaut, une LA est rapidement fatale.

Il existe de très nombreuses catégories de lymphomes. Certaines sont agressives, d’autres indolentes. Il s’agit principalement d’une pathologie de l‘adulte. Toutefois, certaines formes peuvent être retrouvées chez l’enfant.

Introduc:on)

(8)

En$cas$d’anomalie$de$l’hématopoïèse,$l’hémogramme$permet$de$déceler$des$anomalies$quan/ta/ves$et$ou$

qualita/ves$(cf.$cours$«$Hémogramme$»).$$

A$la$numéra:on)sanguine):$O  une$cytopénie,$une$bicytopénie)ou$encore$une$

pancytopénie,$O  ou$au$contraire$une$polyglobulie,$une$thrombocytose)

ou$une$leucocytose,)sont$des$arguments$permeVant$de$suspecter$une$éventuelle$

hémopathie.$$

A$la$formule)sanguine):$O  un$défaut$ou$un$excès$d’une$ou$plusieurs$catégories$de$

leucocytes,$

O  $la$présence)dans)le)sang)de)cellules)hématopoïé:ques)normales)mais)habituellement))localisées)dans)la)moelle)osseuse,)

O  la$présence)dans)le)sang)de)cellules)hématopoïé:ques)anormales)(tumorales)$

sont$des$arguments$permeVant$de$suspecter$une$éventuelle$hémopathie.$

$$


Introduc:on)

(9)

Si$ l’hémogramme$ permet$ de$ dépister$ certaines$ anomalies$de$ l’hématopoïèse$ et$ parfois$même$de$ s’orienter$ vers$ une$pathologie$ en$ par/culier,$ il$ n’est$ la$ plupart$ du$ temps$ pas$suffisant$ pour$ poser$ un$ diagnos/c$ précis$ de$ pathologie$

hématologique.$$

Ainsi,$ il$ est$ nécessaire$ de$ recourir$ aux$ examens)complémentaires)de)2ème) inten:on)ou$examens$spécialisés$qui$ auront$ pour$ objec/f$ de$ caractériser) finement) (nature$des$ cellules)$ et$ de$quan:fier$ les$ cellules$ pathologiques$ au$niveau$ de$ leur$ site) de) produc:on) (moelle$ osseuse,$ganglions,…)$dans$le$but$$:$

$O  d’établir) un) diagnos:c) rigoureux) parmi$ la$ mul/tude$

d’é/ologies$possibles,$

O  et$ donc$ de$ choisir) le) traitement) le) plus) adapté) à) la)pathologie$en$ques/on.$


Quels)sites)anatomiques)impliqués)dans)l’hématopoïèse)pathologique)peutUon)explorer)avec)ces)examens)?)

Introduc:on)

(10)

Dans$ le$ cas$ des$ pathologies$ acquises,$ il$ est$ d’usage,$ au)moment)du)diagnos:c,$d’explorer$le$site)de)produc:on)des)cellules)pathologiques)afin$de$les$caractériser$:$$

O  dans$ le$ cas$ des$ situa:ons) dites) «) réac:onnelles) »)ou$acquises) transitoires$ (exemple$ des$ carences$ en$

vitamine$B12$ou$folates,$des$états$infec/eux,$du$blocage$

de$ matura/on$ granuleuse$ iatrogène…)$ pour$ lesquelles$l’examen$du$sang$ne$suffit$pas$:$

La&moelle(osseuse(pourra&être&explorée&$

O  dans$ le$ cas$des$anomalies)acquises) tumorales)de$ type$hémopathies)malignes$:$

$La&moelle(osseuse(pourra& être& explorée& (SMP,& SMD,&

&LA),&sauf&dans&le&cas&des&lymphomes&pour&lesquels&ce&

&sont&les&organes(lymphoïdes(périphériques(qui&seront&&explorés.&

$

$

DFGSM2, UE Tissu sanguin : Hématologie, ED2 : enseignement tutoré en ligne (partie 1) Quels sites anatomiques impliqués dans l’hématopoïèse pathologique peut-on explorer ?

Introduc:on)

(11)

Les$ hémopathies$ malignes$ de$ type$ LA$ et$ lymphomes$peuvent$ également$ se$ disséminer$ vers$ d’autres$ sites$

anatomiques$:$O système$nerveux$central,$

O séreuses,$O peau,$

O os…$

Ainsi,$ il$ sera$ possible$ d’effectuer$ des$ prélèvements$ en$ lien$

avec$ ces$ localisa:ons) secondaires) pour$ étudier$ et$caractériser$ les$ cellules$ pathologiques$ qui$ y$ seraient$présentes$:$

O liquide)céphaloUrachidien)(LCR),$O liquide)pleural,$O liquide)d’ascite,$O liquide)péricardique,$O échan:llons):ssulaires)divers.$$Les$ examens$ spécialisés$ effectués$ dans$ le$ cadre$ du$

diagnos/c$ pourront$ également$ être$ réalisés$ sur$ ces$

échan/llons$ dans$ le$ cadre$ d’un$ bilan) d’extension) de) la)maladie.$$

DFGSM2, UE Tissu sanguin : Hématologie, ED2 : enseignement tutoré en ligne (partie 1) Quels sites anatomiques impliqués dans l’hématopoïèse pathologique peut-on explorer ?

Dans le cas des lymphomes, ces derniers peuvent atteindre secondairement la moelle osseuse. Il est ainsi possible d’explorer la moelle osseuse des patients concernés : on parlera alors de bilan médullaire d’extension (il permet de voir la « dissémination » de la maladie).

Quels)sont)les)examens)spécialisés))pouvant)être)u:lisés)en)Hématologie))cellulaire)?)

Les)examens)spécialisés)

(12)

DFGSM2, UE Tissu sanguin : Hématologie, ED2 : enseignement tutoré en ligne (partie 1) Quels sont les examens spécialisés pouvant être utilisés ?

Les$ grandes$ catégories$ d’examens$ spécialisés$ pouvant$ être$u/lisées$en$Hématologie$cellulaire$sont$les$suivantes$:$

$$

$$

$

$$

$

$$

$$

$

$En$ pra/que,$ les$ examens$ réalisés$ sur$ des$ échan/llons$

liquides$ (moelle$ osseuse,…)$ sont$ pris$ en$ charge$ par$ les$laboratoires) de) Biologie) Médicale) alors$ que$ les$ examens$

réalisés$ sur$des$échan/llons$/ssulaires$ (ganglions,$pièce$de$

splénectomie,…)$ sont$ pris$ en$ charge$ par$ les$ laboratoires)d’AnatomoUpathologie.$

les(examens(de(Cytologie(spécialisée(:$analyse$morphoO$logique$des$cellules$au$microscope,$

les(examens(de(Cytométrie(en(flux(et(d’ImmunohistoG(chimie(:$étude$des$protéines$exprimées$par$les$cellules,$

les(examens(de(Cytogéné'que&:$étude$des$anomalies$$de$chromosome,$

les(examens(de(Biologie(moléculaire(:$étude$des$anomalies$moléculaires.$

Pourquoi)réalise)tUon)ces)examens)?)


(13)

DFGSM2, UE Tissu sanguin : Hématologie, ED2 : enseignement tutoré en ligne (partie 1) Pourquoi réalise t-on ces examens ?

En$ cas$ de$ suspicion$ d’hémopathie,$ ces$ différents$ examens$sont$réalisés$pour$les$raisons$suivantes$:$

$Cytologie$spécialisée)

$Les$cellules$pathologiques$ont$une$

morphologie$généralement$

anormale)

$Cytométrie$en$flux$$

et$ImmunoOhistochimie)

$Les$cellules$pathologiques$peuvent$être$caractérisées$par$certaines$

protéines$qu’elles$expriment$$

$Cytogéné/que)

$Les$cellules$pathologiques$peuvent$

présenter$une$ou$plusieurs$

anomalies$chromosomiques$$

$Biologie$moléculaire)

$Les$cellules$pathologiques$peuvent$présenter$des$anomalies$géné/ques$

$

En$ pra/que,$ dans$ les$ cas$ de$ suspicion$ d’hémopathie$maligne,$ ces$ différents$ examens$ sont$ réalisés$en) parallèle)car$il$est$per/nent$de$caractériser$les$cellules$pathologiques$sous) tous) ces) aspects)pour$ en$ déterminer$ précisément$ la$

nature.$$Les$ résultats$ de$ ces$ différents$ examens$ sont$ ainsi$

confrontés$entre$eux,$ le$ tout$permeVant$de$conclure$à$un$

diagnos/c$précis.$

Cytologie)spécialisée)


(14)

DFGSM2, UE Tissu sanguin : Hématologie, ED2 : enseignement tutoré en ligne (partie 1) Les examens de Cytologie spécialisée

Les$examens$de$Cytologie$spécialisée$permeVent,$comme$vu$précédemment,$ de$ caractériser$ des$ cellules$ pathologiques$

au$ sein$d’un$échan/llon$ selon$des$ critères$ de$morphologie$(étude$au$microscope$op/que$ou$ sur$ support$numérisé)$et$

de$ les$ quan/fier$ au$ sein$ de$ l’ensemble$ des$ cellules$examinées.$

$

1.)L’étude)de)la)moelle)osseuse)$

Deux$examens$peuvent$être$réalisés$pour$étudier$ la$moelle$osseuse$:$

$O  le$ myélogramme$ (réalisé$ au$ laboratoire$ de$ Biologie$

Médicale),$

O  la$ Biopsie) OstéoUMédullaire) (ou$ BOM,$ réalisée$ au$laboratoire$d’AnatomoOPathologie).$$

$$Ils$apportent$des$informa/ons$complémentaires,$le$choix$de$

réaliser$ l’un$ ou$ l’autre$ dépend) du) contexte) pathologique)(cf.$indica/ons).$$$

a.)Le)myélogramme)a1.)Le)geste)de)prélèvement)$

Le$prélèvement$de$moelle$osseuse$se$fait$par$ponc:on$avec$un$ trocart$ auquel$ on$ adapte$ une$ seringue$ pour$ aspirer$

brièvement$ le$ suc$ médullaire$ au$ niveau$ sternal$ ou$ iliaque$avec$ au$ préalable$ une$ anesthésie$ locale$ ou$ sous$ analgésie$

inhalatoire.$Le$geste$doit$être$réalisé$après$an/sepsie$locale.$

Le$suc$médullaire$est$posi/onné$sur$une$lame$inclinée$pour$le$débarrasser$du$sang$qui$dilue$la$moelle$proprement$dite,$

puis$ les$ grumeaux$ de$ moelle$ sont$ récupérés$ et$ étalés$ sur$lame$par$écrasement$et$séchage$rapide.$$

$


(15)


$a2.)Le)traitement)de)l’échan:llon)au)laboratoire)$Une$ fois$ sèches$et$correctement$ iden/fiées,$ les$ lames$sont$

envoyées$ au$ laboratoire$ de$ Biologie$ Médicale$ où$ elles$seront$ colorées$ au$ MayOGrünwald$ Giemsa$ et$ évaluées$ au$

microscope$op/que.$$

En$pra/que,$le$cytologiste$va$compter$plusieurs$centaines$de$

cellules$ et$ les$ classer$ dans$ les$ différentes$ catégories$ de$cellules$médullaires$normales$et$anormales$possibles.$

$


(16)


a3.)Les)informa:ons)apportées)par)le)myélogramme)$$

Lors$ de$ la$ lecture$ du$ myélogramme$ au$ microscope,$ le$cytologiste$procède$aux$opéra/ons$suivantes$:$

$

O apprécia/on$de$la$richesse)globale$de$l’échan/llon$(cf.$

page$suivante),$

O apprécia/on$de$la$densité)en)mégacaryocytes$et$

recherche$de$leurs$anomalies$morphologiques$

éventuelles,$

O détermina/on$des$pourcentages)de)cellules)

médullaires)normales)avec$apprécia/on$de$leur$

matura:on$$O recherche$de$cellules)anormales$$

exemples&:&blastes,&cellules&lymphomateuses,&&

cellules&de&surcharge,&macrophages&

avec&leishmanies,&&métastases&de&tumeur&solide…&

$$$

Un des avantages majeurs du myélogramme est qu’il est réalisable en urgence (résultat pouvant être rendu en quelques heures seulement)

moelle)riche)ex):)SMP)au)diagnos:c)

moelle)pauvre)

densité)normale)



Au$ faible$ grossissement,$ le$ cytologiste$ peut$ évaluer$ la$densité$ de$ l’échan/llon$ médullaire,$ ce$ qui$ peut$ être$ un$

premier$ élément$ d’orienta/on$ vers$ une$ éventuelle$pathologie$:$

$

(17)

Images&:&collec$on&C.&Bret&



(18)

Exemple)d’envahissement)médullaire)par)des)cellules)hématopoïé:ques)anormales)de)type)blastes)

Cas(de(leucémie(aiguë(promyélocytaire(ou(LAM3((

Image&:&collec$on&C.&Bret&

Au$ grossissement$ plus$ fort,$ le$ cytologiste$ va$ rechercher$d’éventuelles$cellules$anormales$d’origine$hématopoïé/que$

ou$non$(cf.$images$suivantes).$$



(19)

Exemple)d’envahissement)médullaire)par)des)cellules)non)hématopoïé:ques)(plus)rare))=)métastases)

Cas(de(neuroblastome(




(20)

Observa:on)de)leishmanies))(cas)de)leishmaniose)viscérale)chez)un)immunodéprimé))



(21)


a4.)La)présenta:on)des)résultats)du)myélogramme)$

Les$résultats$sont$présentés$sous$forme$d’un$compteOrendu$men/onnant$:$

O les$renseignements$cliniques,$O la$densité$globale$de$l’échan/lllon,$

O une$ évalua/on$ semiOquan/ta/ve$ des$ mégacaryocytes$avec$ descrip/on$ de$ leurs$ éventuelles$ anomalies$

morphologiques,$

O le$%$des$cellules$normales,$O le$ %$ des$ éventuelles$ cellules$ anormales$ et$ leur$

descrip/on,$

O une$ conclusion$ (échan/llon$ sans$ anormalie$ localement$décelable,$infiltrat$pathologique…).$$

$Exemple&de&compteArendu&lors&d’un&diagnos$c&de&leucémie&aiguë&lymphoblas$que&:&


(22)


b.)La)Biopsie)OstéoUMédullaire)(BOM))b1.)Le)geste)de)prélèvement)et)la)prépara:on)de)l’échan:llon)$Le$ prélèvement$ de$ moelle$ osseuse$ se$ fait$ avec$ un$ trocart$

permeVant$ de$ prélever$ une$ caroVe$ osseuse.$ Il$ s’agit$ d’un$geste$plus$invasif$que$celui$réalisé$en$vue$du$myélogramme$

(biopsie&versus&ponc/on).$

La$ caroVe$ osseuse$ est$ immédiatement$ u/lisée$ pour$ faire$des$apposi/ons$sur$lame$et$est$en$suite$fixée$pendant$24$h$

dans$ un$ liquide$ de$ fixa/on$ (formol,…)$ avant$ d’être$

décalcifiée$ puis$ traitée$ selon$ les$ techniques$ habituelles$d’histologie$ :$ déshydrata/on,$ inclusion$ en$ paraffine,$

colora/on,$prépara/on$de$lames$d’immunoOhistochimie.$

Image&:&V.&Szablewski&

Du fait de ces différents traitements, les résultats de

la BOM ne peuvent pas être rendus en urgence.


(23)


b2.)Les)informa:ons)apportées)par)la)BOM)$

Lors$ de$ la$ lecture$ de$ la$ BOM$ au$ microscope,$ l’anatomoOpathologiste$procède$aux$opéra/ons$suivantes$:$

$

O apprécia/on$de$la$richesse)globale$de$l’échan/llon,$

O étude$des$cellules)médullaires)hématopoïé:ques)

normales)(répar//on,$distribu/on$topographique,$anomalies$morphologiques$éventuelles),$

O étude$des$cellules)non)myéloïdes):)lymphocytes,)

plasmocytes,)mastocytes,)macrophages)(répar//on,$

distribu/on$topographique,$anomalies$morphologiques$

éventuelles),$

O étude$du$réseau)de)ré:culine,$

O étude$de$la$composante)vasculaire,$

O étude$de$la$composante)osseuse,$O recherche$de$cellules)anormales$diffuses$ou$en$foyer.$

La BOM apporte des informations structurales (os, vaisseaux,…) qui ne sont pas explorées par le

myélogramme.


(24)


b3.)Les)principales)indica:ons)du)myélogramme)et)de)la)BOM)))))))))))))))))))b4.)Avantages)et)inconvénients)du)myélogramme)et)de)la)BOM))$

Myélogramme)$Explora/on$des$cytopénies/excès$de$$cellules$à$la$NFS$$

Recherche$d’infiltrat$médullaire$:$$O$blastes$$O$cellules$lymphomateuses$$O$plasmocytes$tumoraux$$O$cellules$métasta/ques$

$

Suspicion$de$syndrome$myéloproliféra/fs,$de$syndromes$myélodysplasiques$$Recherche$de$cellules$de$surcharge$$

Recherche$de$leishmanies$$$

$$$

BOM)$Explora/on$des$moelles$pauvres$$(aplasie)$et/ou$des$échecs$de$ponc/on$médullaire$$

Recherche$de$localisa/on$lymphomateuse$médullaire$$(«$bilan$d’extension$»)$$Recherche$de$métastases$de$tumeur$solide$$Recherche$de$certaines$é/ologies$infec/euses$

$

+(autres(indica'ons(qui(seront(vues(dans(les(années(d’étude(ultérieures&

Avantages)$Myélogramme$réalisable$en$urgence$$Coût$réduit$

$U/le$pour$poser$le$diagnos/c$de$nombreuses$hémopathies$$U/le$pour$explorer$des$pathologies$autres$que$les$hémopathies$

&ex&:&recherche&de&leishmanies&&

Inconvénients)$BOM$:$non$réalisable$en$urgence$)Expérience$du$cytologiste/anatomopathologiste$$

condi/onnant$la$qualité$du$résultat$$Problème$des$échan/llons$de$mauvaise$qualité$$(hémodilu/on$notamment)$rendant$l’examen$non$$contribu/f$$

Sensibilité$faible$:$problème$des$cellules$rares$pouvant$ne$$pas$être$détectées$$Problème$$de$caractérisa/on$de$certaines$cellules$$anormales$dont$la$morphologie$ne$permet$pas$à$elle$seule$$

de$les$iden/fier$


(25)


2.)L’étude)du)LCR)$Prélevé$par$ponc/on$lombaire,$le$LCR$peut$être$étudié$d’un$

point$ de$ vue$ cytologique$ au$ laboratoire$ de$ Biologie$

Médicale$ou$au$laboratoire$d’AnatomoOPathologie$afin$d’en$déterminer$la$composi/on$cellulaire.$

$A$ l’état$ physiologique,$ le$ LCR$ est$ pauciOcellulaire$ (il$ ne$

renferme$que$de$très$rares$cellules$autochtones$ou$d’origine$

hématopoïé/que).$$

A$ l’occasion$ de$ certaines$ hémopathies$ malignes$ avec$localisa/ons$ secondaires$ neurologiques,$ le$ LCR$ peut$ être$

envahi$de$cellules$hématopoïé/ques$malignes$qui$pourront$

être$caractérisées$au$microscope$après$cytocentrifuga/on$et$colora/on$ de$ l’échan/llon$ (au$ May$ Grünwald$ Giemsa$ au$

laboratoire$de$Biologie$médicale).$$

$

ATTENTION ! Le LCR est un liquide

biologique très très fragile : il faut l’adresser en urgence

au laboratoire. Les cellules se lysent dès 30 minutes après

le geste de prélèvement.


Observa:on)cytologique)d’un)échan:llon)de)LCR)chez)un)pa:ent)a`eint)de)leucémie)aiguë)lymphoblas:que)T)avec)localisa:on)méningée)(x50)$


(26)


3.)L’étude)des)liquides)d’épanchement)$Prélevé$ par$ ponc/on,$ les$ liquides$ d’épanchement$ peuvent$

être$étudiés$d’un$point$de$vue$cytologique$au$laboratoire$de$

Biologie$Médicale$ ou$ au$ laboratoire$ d’AnatomoOPathologie$afin$d’en$déterminer$la$composi/on$cellulaire.$

$A$ l’occasion$ de$ certaines$ hémopathies$ malignes$ avec$

localisa/ons$ secondaires$ dans$ les$ séreuses$ (des$ formes$

primi/ves$ sont$possibles$mais$bien$plus$ rares),$ ces$ liquides$peuvent$être$envahis$de$cellules$hématopoïé/ques$malignes$

qui$ pourront$ être$ caractérisées$ au$ microscope$ après$cytocentrifuga/on$ et$ colora/on$ de$ l’échan/llon$ (au$ May$

Grünwald$Giemsa$au$laboratoire$de$Biologie$médicale).$

$$


Observa:on)cytologique)d’un)échan:llon)d’ascite)chez)un)pa:ent)a`eint)de)lymphome)de)Burki`)(x50)$


(27)


4.) L’étude) des) échan:llons) :ssulaires,) cas) des):ssus)lymphoïdes))$

Lors$ de$ la$ prise$ en$ charge$ d’un$ /ssu$ lymphoïde$ venant$d’être$ prélevé$ par$ biopsie,$ l’anatomoOpathologiste$ procède$

aux$opéra/ons$suivantes$:$$

O examen)macroscopique)de$l’échan/llon,$

O fixa:on)au)formol)de$6$à$24h$selon$la$taille$de$l’échan/llon,$

O déshydrata:on,)

O inclusion)en)paraffine,$

O coupe)de)blocs,$O montage)de)lames)pour$étude$morphologique$au$

microscope$après$colora/on,$étude$de$type$immunoO

histochimie$ou$encore$de$type$cytogéné/que,$

O étude$au$microscope$de$l’architecture)du):ssu)

(recherche$de$lésions$en$foyers$ou$diffuses),$étude$des$

cellules$pour$recherche)de)cellules)pathologiques.$$$

$

L’étude de la biopsie ganglionnaire est l’examen

de référence pour le diagnostic des lymphomes.

Cytométrie)en)flux)et)ImmunoUhistochimie)


(28)

DFGSM2, UE Tissu sanguin : Hématologie, ED2 : enseignement tutoré en ligne (partie 1) Les examens de Cytométrie en flux et d’Immuno-histochimie

1.  La)Cytométrie)en)flux)a1.)Principe)$Les$ examens$de$Cytométrie$en$ Flux$ (désignés$par$ le$ terme$

de$ «$ phénotypage) »$ ou$ encore$ d’$ $ «$ immunoUphénotypage$ »)$ permeVent$ de$ caractériser$ des$ cellules$

pathologiques$ au$ sein$ d’un$ échan:llon) de) cellules) en)suspension) selon$ des$ critères$ d’expression) d’an:gènes) et$de$ les$ quan/fier$ au$ sein$ de$ l’ensemble$ des$ cellules$

examinées.$$

$Ils$ sont$ basés$ sur$ l’u/lisa/on$ d’an:corps) couplés) à) des)fluorochromes,$ ces$ an/corps$ reconnaissant$ des$ an/gènes$d’intérêt$ dans$ le$ cadre$ des$ pathologies$ évaluées.$ Une$ fois$

marquées$par$ces$an/corps,$les$cellules$sont$analysées$une$à$

une$ par$ un$ cytomètre) en) flux,$ automate$ capable$ de$recueillir$les$signaux$fluorescents$émis$par$plusieurs$milliers$

à$plusieurs$millions$de$cellules$à$évaluer.$Il$s’agit$ainsi$d’une$technique$pouvant$être$de$haute)sensibilité.$$$

Par$ailleurs,$les$cytomètres$actuels$permeVent$d’étudier$une$dizaine$ de$ fluorochromes$ en$ simultané$ pour$ une$ même$

cellule,$ il$s’agit$ainsi$d’une$technique)dite)«)mul:couleur)»)apportant$de$nombreuses$informa/ons$sur$l’expression$des$

an/gènes$par$les$cellules.$C’est$ainsi$que$la$carte)d’iden:té)an:génique)(ensemble$des$«$clusters$of$differen/a/on$»$$ou$«$ CD$ »)$ de$ la$ cellule$ peut$ être$ recons/tuée$ avec$ ceVe$

technique.$$

La$ technique$ s’applique$ à$ tout$ échan/llon$ de$ cellules$ en$

suspension.$ En$ hématologie,$ elle$ peut$ donc$ être$ u/lisée$pour$ l’étude$ du$ sang,$ de$ la$moelle) osseuse) obtenue$ par$ponc/on,$du$LCR,$des$liquides)d’épanchement)ou$même$de$:ssus)broyés)et)mis)en)suspension$(exemple$:$ganglions,…).$

Les antigènes exprimés par les

cellules sont souvent désignés par le terme de « marqueurs »

ou encore de « CD » pour « Cluster of Differntiation »

exemple : Lymphocytes T CD4


(29)


a2.)Intérêt)pour)l’étude)des)pathologies)hématologiques)

$Au$ cours$ de$ l’hématopoïèse$ normale,$ il$ existe$ des$

“marqueurs”$ caractéris:ques) de) l’appartenance) à) une)lignée) et$ du$ degré) de) matura:on) des$ cellules$ bien$documentés.$$

En$ cas$ de$ pathologie$ de$ l’hématopoïèse,$ des$ “marqueurs”$

caractéris/ques$de$certaines$cellules$anormales$(ex$:$blastes,$cellules$lymphomateuses)$sont$également$bien$documentés.$

$

Le$ phénotypage$ $ permet$ ainsi$ de$ détecter) les) cellules)anormales$ dans$ l’échan/llon$ étudié$ (ex$ :$ sang,$ moelle$

osseuse,…),$de$les$quan:fier)et$d’en$déterminer)la)nature.$$

a3.)Principaux)examens)de)Cytométrie)en)flux)pour)l’étude)des)pathologies)hématologiques)$

Le$phénotypage)des)blastes)est$ indiqué$principalement$ au$cours$ des$ leucémies) aiguës) (LA)$ avec$ comme$ objec/f$ de$

détecter$ la$ présence$ des$ blastes$ et$ d’en$ déterminer$ la$

nature$ ( lymphoïde/myéloïde).$ C’est$ un$ examen$incontournable$ en$ cas$ de$ LA$ au$ diagnos:c$ et$ u/le$également$pour$leur$suivi.$$

Le$ phénotypage) des) lymphocytes) (en$ dehors$ de$ ses$indica/ons$ pour$ étude$ de$ l’immunité)$ est$ indiqué$principalement$au$cours$des$lymphomes)disséminés)dans))le) sang,) la) moelle) osseuse,) le) LCR) ou) les) liquides)d’épanchement,$ avec$ comme$ objec/fs$ de$ détecter$ et$ de$

prouver$ la$ présence$de$ cellules$de$nature$ lymphomateuse,$

de$déterminer$de$quel$type$de$ lymphome$il$s’agit$selon$ les$marqueurs$ exprimés$ en$ complément$ des$ examens$ réalisés$

en$AnatomoOpathologie$sur$les$échan/llons$/ssulaires.$


(30)


a4.)Avantages)et)inconvénients)de)la)Cytométrie)en)flux)$

)))))))))))))))2.)L’ImmunoUhistochimie)$Les$ examens$ d’ImmunoOhistochimie$ u/lisent$ également$ la$

réac/on$ an/gèneOan/corps$mais$ sont$ réalisés,$ non$pas$ sur$des$cellules$en$suspension,$mais$sur$des)coupes)de):ssus)sur)lames) préparées) au) laboratoire) d’AnatomoUPathologie.$Autres$différences$avec$ la$cytométrie$en$flux$:$ les$an/corps$u/lisés$ne$sont$pas$couplés$à$des$fluorochromes$mais$à$des$

enzymes$ capables$ de$ transformer$ un$ substrat$ en$ produit$

coloré$ ;$ de$ plus,$ un$ seul$ marquage$ est$ réalisé$ par$ lame$(plusieurs$ lames$ doivent$ être$ marqués$ par$ chacune$ un$

an/corps).$$

Avantages)$$Applicable$sur$tout$échan/llon$avec$cellules$en$suspension$(sang,$moelle$osseuse,$$

LCR,$épanchement…)$$U/le$pour$poser$le$diagnos/c$de$nombreuses$hémopathies$$Résultats$obtenus$en$quelques$heures$

seulement$$Sensibilité$élevée$$Technique$évolu/ve$pouvant$s’adapter$aux$

dernières$avancées$en$ma/ère$de$caractérisa/on$des$cellules$$$

Inconvénients)$$Nécessité$de$personnel$qualifié$$

Nécessité$de$travailler$sur$cellules$$vivantes$(échan/llons$frais)$$Technique$en$général$non$disponible$en$dehors$des$périodes$ouvrées$$

Coût$rela/vement$élevé$$$$$

Cytogéné:que)


(31)

DFGSM2, UE Tissu sanguin : Hématologie, ED2 : enseignement tutoré en ligne (partie 1) Les examens de Cytogénétique

1.  Principe)$

Les$examens$de$Cytogéné/que$ont$pour$objec/f$l’étude)des)chromosomes) des) cellules.$ Il$ existe$ différentes$ techniques$possibles$ :$ les$ techniques$ classiques$ de$ type$ caryotype$ ou$hybrida:on) in( situ( (FISH)$ et$ des$ techniques$ plus$ récentes$comme$ le$ CGH) array.$ Ils$ peuvent$ être$ réalisés$ sur$ toute$nature$d’échan/llon$en$suspension$comportant$des$cellules$anormales$ (sang,$ moelle$ osseuse,$ LCR,$ épanchements)$ ou$

sur$des$apposi/ons$/ssulaires$sur$lame.$

$Modalité&d’obten$on&du&caryotype&(source&du&document&:&V.&Cacheux)&:&


(32)


Modalité&d’obten$on&de&l’hybrida$on&in&situ&ou&FISH&(source&du&document&:&V.&Cacheux)&:&


(33)


$

2.)Intérêt)au)cours)des)hémopathies))$

Au$ cours$ des$ hémopathies$ malignes,$ les$ cellules$hématopoïé/ques$ devenues$ tumorales$ acquièrent$ très$

fréquemment$ des$ anomalies$ chromosomiques$ (ces$dernières$ étant$ acquises$ au$ cours$ de$ la$ génèse$ de$ la$

pathologie,$ elles$ ne$ sont$ pas$ retrouvées$ dans$ les$ autres$

cellules$ de$ l’organisme,$ par$ opposi/on$ aux$ anomalies$chromosomiques$cons/tu/onnelles).$

$Ces$ anomalies$ chromosomiques$ sont$ dites$ «$ récurrentes$ »$

lorsqu’elles$surviennent$fréquemment$au$cours$de$certaines$

pathologies.$ Ainsi,$ certaines$ lésions$ chromosomiques$ sont$fréquentes$mais$ non$ spécifiques$ (exemple$ de$ la$ trisomie$ 8$

au$ cours$ des$ leucémies$ aiguës$ myéloïdes).$ D’autres$ sont$plus$spécifiques$comme$la$transloca/on$t(9;22)$au$cours$de$

la$ leucémie$ myéloïde$ chronique$ (LMC)$ ou$ encore$ la$

transloca/on$ t(15;17)$ au$ cours$ de$ la$ leucémie$ aiguë$promyélocytaire$(ou$LAM3).$

$$

3.) Principales) indica:ons) au) cours) des) hémopathies)malignes)$Les$principales$indica/ons$de$ces$examens$au$cours$des$hémopathies$malignes$sont$:$$$O  étude$des$anomalies$chromosomiques$au$diagnos:c,$O  détermina:on)du)pronos:c)de$certaines$hémopathies$

malignes$Exemple&:&hyperdiploïdie&=&facteur&de&bon&

pronos$c&des&LA&lymphoblas$que&de&l�enfant&$

O$suivi)des)hémopathies)malignes)au$cours$du$traitement$et$en$fin$de$traitement$afin$de$déterminer$si$les$cellules$malignes$ont$disparu,$persistent$ou$si$une$rechute$survient$(suivi$de$la$«$maladie$résiduelle$»).$$


(34)


$

4.) Avantages) et) inconvénients) des) examens) de)Cytogéné:que)$

Avantages))Analyse$globale$des$chromosomes$$sans$a&priori&dans$le$cas$du$caryotype$$

Mise$en$évidence$des$anomalies$récurrentes$caractéris/ques$de$$certaines$hémopathies$$Iden/fica/on$de$nouvelles$anomalies$$(technique$évolu/ve)$

)))))))

Inconvénients))Nécessité$de$personnel$qualifié,$technique$non$automa/sable$$

Nécessité$de$cellules$vivantes$$Technique$en$général$non$disponible$en$dehors$des$périodes$ouvrées$$La$FISH$ne$permet$de$cibler$que$les$anomalies$que$

l�on$recherche$$Coût$élevé$$Délai$de$rendu$des$résultats$$de$plusieurs$jours$

Biologie)moléculaire)


(35)

DFGSM2, UE Tissu sanguin : Hématologie, ED2 : enseignement tutoré en ligne (partie 1) Les examens de Biologie moléculaire

1.  Principe)$

Les$ examens$ de$ Biologie$ moléculaire$ ont$ pour$ objec/f$l’étude) des) anomalies) géné:ques) des) cellules.$ Il$ existe$différentes$techniques$possibles$basées$sur$l’u/lisa/on$de$la$

PCR$(Polymerase$Chain$Reac/on)$ou$encore$le$séquençage.)De$ nouvelles$ approches$ dites$ «$ à$ haut$ débit$ »$ comme$ le$

Next)Genera:on)Sequencing)(NGS)$permeVent$une$analyse$de$plus$en$plus$fine$des$anomalies$du$génome$des$cellules$

tumorales.$

Ils$ peuvent$ être$ réalisés$ sur$ toute$ nature$ d’échan/llon$ en$suspension$comportant$des$cellules$anormales$(sang,$moelle$

osseuse,$LCR,$épanchements).$

$

2.)Intérêt)au)cours)des)hémopathies))$

Comme$ indiqué$précédemment,$au$cours$des$hémopathies$malignes,$les$cellules$hématopoïé/ques$devenues$tumorales$

a cqu iè ren t$ t r è s$ f r équemment$ des$ anoma l i e s$chromosomiques$ pouvant$ créer$ des$ altéra/ons$ de$ la$

structure$ des$ gènes$ de$ type$ fusion$ de$ gènes,$ délé/on,$

amplifica/on…$$Exemple&:&au&cours&de&la&LMC,&la&transloca$on&t(9;22)&

&(qui&peut&être&mise&en&évidence&par&les&techniques&de&

& Cytogéné$que)& & génère& la& présence& d’un& gène& de&

&fusion&appelé&BCRAABL&(qui&peut&être&mis&en&évidence&

&par&les&techniques&de&Biologie&moléculaire)&&

$

Il$ est$ également$ possible$ de$ meVre$ en$ évidence$ des$anomalies$ de$ gènes$ (de$ type$ muta/ons)$ en$ l’absence$

d’anomalie$ chromosomique$ associée.$ Les$ techniques$ de$

Biologie$ moléculaire$ sont$ ainsi$ complémentaires$ de$ la$Cytogéné/que.$

$


(36)

DFGSM2, UE Tissu sanguin : Hématologie, ED2 : enseignement tutoré en ligne (partie 1) Les examens de Biologie moléculaire

3.) Principales) indica:ons) au) cours) des) hémopathies)malignes)$Les$principales$indica/ons$de$ces$examens$au$cours$des$hémopathies$malignes$sont$:$$$O  étude$des$anomalies$géné/ques$au$diagnos:c,$O  détermina:on)du)pronos:c)de$certaines$hémopathies$

malignes$$

O  suivi)des)hémopathies)malignes)au$cours$du$traitement$et$en$fin$de$traitement$afin$de$déterminer$si$les$cellules$malignes$ont$disparu,$persistent$ou$si$une$rechute$survient$(suivi$de$la$«$maladie$résiduelle$»).$

4.)Avantages)et)inconvénients)des)examens)de)Biologie)moléculaire)$$$Avantages)

$$U/le$pour$poser$le$diagnos/c$de$nombreuses$hémopathies$et$le$suivi$

(maladie$résiduelle)$$Technique$pouvant$être$réalisée$en$$différé$sur$échan/llons$congelés$$Sensibilité$élevée$

$Technique$évolu/ve$pouvant$s’adapter$à$de$nouveaux$marqueurs$moléculaires$$$

Inconvénients)$Nécessité$de$personnel$qualifié$$On$ne$trouve$que$ce$que$l’on$cherche$!$

Sauf$avec$les$méthodes$dites$de$«$nouO$velle$généra/on$»$)Technique$en$général$non$disponible$en$dehors$des$périodes$ouvrées$$

$Coût$élevé$$Rendu$des$résultats$en$plusieurs$jours$$

$$$

enseignement tutoréenligne(ed1)) · les syndromes myélodysplasiques (smd) sont des hémopathies...

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