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Elisabeth HuguetInstitut de Recherche sur la Biologie de l’Insecte

Cours M2 Recherche Infectiologie cellulaire et moléculaire, Vaccinologie UES3-1 Santé Publique

Septembre 2008

Université F. Rabelais, ToursUMR CNRS 6035

France

La double vie d’un virus fascinant impliqué dans des interactions

hôtes-parasites chez les insectes

Cotesia congregata parasite la chenille Manduca sexta

Cotesia congregata

(Guêpe Braconidae)

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Conséquences du parasitisme

X

X

XX

Arrêt du développementImmunosuppression

XX

Manduca sexta

Cotesia congregata

(Guêpe Braconidae)

Implication d’un troisième partenaire ?

X

X

XX

Arrêt du développementImmunosuppression

Manduca sexta

Cotesia congregatabracovirus

Oeufs de guêpe + Virus

(Beckage et al,1994) (Edson et al, 1981)

Le virus est indispensable à la réussite parasitaire

Oeufs de guêpe lavés

(sans virus)

Oeufs de guêpe + Virus +

psoralène

Blocage expression virus

Le virus existe sous deux formes …

1. Une forme virale « libre » constituée de multiples cercles d’ADN double brin

Virus DNAMW

FIGE

2.5 kb

7.5 kb

5 kb

10 kb

25 kb

20 kb

15 kb

40 kb 35 kb 30 kb

45 kb

Cette forme est présente en large excès dans les ovaires des femelles guêpes


Sonde ADN viral « EP1 »Signal non attendu !

5 kb

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Sonde ADN viral « EP1 »Taille attendue 5 kb

ADN guêpe


1. Une forme virale linéaire intégrée au génome de la guêpe

PV4 PV10EP1

1 2 3 4 55 7 8 106 9

Belle et al., 2002

Expériences d’hybridations in situ sur chromosomes de guêpes


Transmission verticale à la descendance

Réplication

Peu d’expression des gènes viraux

Pas d’intégration dans le génome

PAS de réplication

Expression forte des gènes viraux

Dans la guêpe :

Dans la chenille :

Réplication virale

55

Expression des gènes virauxProduction de protéines virales

Oviposition

Injection de virus

Dérégulation de la physiologie de l’hôteSuccès parasitaire de la guêpe

Cotesia congregata bracovirus est indispensable à la réussite parasitaire de la guêpe

Cellules ovariennes de C. congregata

Production des cercles viraux

Manduca sexta

Injection des particules

virales

Succès du parasitisme

Expression des gènes viraux

Alteration du developpement Alteration de l’immunité

Protéines de capsides

Formation virales

Génome intégré(chromosome 5)

REPLICATION

& MORPHOGENESE

VIRALES EXPRESSION

DES GENES

DE VIRULENCE

Cycle du bracovirus de Cotesia congregata

http://www.uky.edu/~mjshar0/genera/Cotesia/congregata.html

Symbioses : mutualisme/parasitisme

Virus qui joue un rôle central

Association mutualiste Avec une guêpe

Association parasitaire Avec une chenille

Sans le virus la guêpe ne peut pas assurer sa descendance

Sans la guêpe le virus ne peut pas se répliquer et se transmettre : virus ayant perdu son autonomie

Associations virus-guêpes

Bracovirus

Ichnovirus



> 17000 espèces de guêpes Braconidae







> 14000 espèces de guêpes Ichneumonidae

Ichneumonoidae

Ichneumonidae

Braconidae

35 sous familles qui ne possèdent

pas de PDV

34 sous familles qui ne possèdent pas de PDV

Campopleginae

Banchinae

14000 espèces

Ichnovirus

Complexe Microgastroïde

(7 sous familles)

17000 espèces Bracovirus

Origine indépendante de l’association virus-guêpe chez les guêpes Braconidae et Ichneumonidae

Deux familles de virus associées à deux familles de guêpes



Origine des associations guêpes braconidae-virus

>17000 espèces

MeteorinaeMacrocentrinae

AphidiinaeOpiinae

Alysiinae

DoryctinaeBraconinae

BRACONIDAE

MICROGASTRINAEMiracinae

Cheloninae

CardiochilinaeMICROGASTRINAE-CotesiaMiracinae

Cheloninae

Cardiochilinae

Virus ancêtre

Guêpe ancêtre (70 millions d’années)



Les questions scientifiques

Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ?

Quel est la nature du virus ancêtre ?

BRACONIDAE

Virus ancêtre

Les stratégies utilisées



Séquençage du génome viral libre

Analyse d’une banque d’ADNc à partir de chenilles parasitées

Reverse Northern en utilisant comme sonde de l’ADNc de chenilles parasitées

Génome de C. congregata Bracovirus (CcBV)• 30 cercles d’ADN db• 567 kb• 27 % de régions codantes• 156 gènes potentiels• Organisation en familles multigéniques

Séquençage de la forme libre du virus

Espagne et al. Science 2004

Contenu du génome de CcBV

Cotesia spécifiques

17%

Motifs conservés

26%

Viraux9%

Hypothétiques48%

Contenu du génome de CcBVNature du virus ancêtre ?


17%

Motifs conservés

26%

Viraux9%

Hypothétiques48%

Très peu de gènes « viraux »• 1 gène de baculovirus• 1 gène d’ascovirus• gènes de rétroéléments DIRS et Dong• gènes de polintons

Ne renseignent pas sur la nature du virus ancêtre



17%

Motifs conservés

26%

Viraux9%

Hypothétiques48%

Familles multigéniques à motifs conservés:

• Protéines-Tyrosine-Phosphatases• Inhibiteurs NFKB : IKB• Cystatines• Protéines riches en cystéines

Potentiellement de nombreux facteurs de virulenceimpliqués dans dérégulation de la physiologie de la chenille

Analyse des gènes exprimés par reverse northern.

ADN viral

Digestion enzymatiq

ue

Sonde P32 d’ADNc chenilles parasitées

Sonde P32 d’ADNc chenilles non parasitées

•ProtéinesTyrosines Phosphatases• Inhibiteurs NFKB• Cystatines

DécoupageClonageséquençage

Gènes de la famille des IκB

• Gènes codant pour protéines IκB interviennent dans la régulation de la réponse immunitaire innée chez les mammifères et les insectes (voies Toll)

• Interaction avec le facteur de transcription NF- κB

• Motif présent dans toutes les protéines IκB : domaine de répétitions ankyrines

Gènes IκB-like chez les bracovirus et ichnovirus

9 gènes IkB chez CcBV

Voie Toll chez la Drosophile

Toll



Tube

Pelle

NFkB (Dorsal)

IkB (Cactus)

Activation de peptides antimicrobiens

BacteriesGram+

Champignons

noyau

Modèle du mode d’action des IkB virauxsur l’immunité chez Manduca

Toll-like

NFkB

IkB

Activation de la réponse antiparasitaires

Reconnaissance guêpe parasite

noyau

Modèle du mode d’action des IkB virauxsur l’immunité chez Manduca

Toll-like

NFkB

IkB

Reconnaissance guêpe parasite

noyau

Injection de CcBV IkB viraux

X

Pas d’activation de gènes de l’immunité



17%

Motifs conservés

26%

Viraux9%

Hypothétiques48%

Familles multigéniques à motifs conservés:

• Protéines-Tyrosine-Phosphatases• Inhibiteurs NFKB : IKB• Cystatines• Protéines riches en cystéines

Implication des cystatines virales dans l’interaction hôte-parasite ?

1

3

2

Cercle 19

3 Cystatines

Cystatines ?• Cystatines = inhibiteur de protéases à cystéine

• Cystatines de type 2

• Première description de cystatines virales

• Chez les nématodes parasites les cystatines sont des facteurs de virulence

G

QxVxG P

W• Cibles des cystatines :

protéases à cystéine de la famille C1

Ex : papaine et cathepsine

Protéases à cystéine (type C1) des insectes :

• Digestion

• Développement (métamorphose et mue)

• Immunité ?

Cystéine protéases ciblées chez les insectes ?

26/29 kDa C1 cysteine protease

CathepsinBCathepsin L

Cathepsin L

LibérationDe protéase

Surexpression(ARNm)

Surexpression(ARNm)

Sarcophaga Mouche tsetse Drosophile

Quel est le rôle des cystatines virales dans l’interaction hôte-parasite ?

• Evolution moléculaire des cystatines virales

• Est-ce que les cystatines virales sont exprimées ?

• Les cystatines virales sont-elles des protéines inhibitrices

fonctionnelles ?

•Quelles sont les cibles des cystatines virales chez Manduca ?

Les cystatines sont fortement exprimées pendant l’interaction hôte-parasite

25

20

15

10

5

0

NP24 H48 H

cystatin/actin

NP 24h 48h NP 24h 48h NP 24h 48h NP 24h 48h

Nerve

Chain

MidgutMalpighian

tubules

Haemocytes

cystatin actin NP 24h 48h NP 24h 48h NP 24h 48h

0

10

2030

4050

NP 40min 2h 12h 24h 48h 3d 5d 8d

NP 40min 2h 12h 24h 48h 3d 5d 8d

cystatin/actin

cystatin actin

ARNm cystatines

ARNm actine

Analyse par Northern

Corps gras Hémocytes

Les cystatines sont fortement exprimées pendant l’interaction hôte-parasite

Analyse par Western

Hemolymphe P NP

16,5

32,5

25

KDa

Cystatines

(13 kDa)

AnticorpsAnti-Cystatine1

Expression et purification d’une protéine recombinante Cystatine 1

MW(kDa)

47,5

32,5

25

16,5

6,5

Culture

supernatant

flowthrough

wash eluate

fractionsFractionsélution

• Expression de CcBV cystatine1 dans des cellules d’insectes Hi5

• Purification sur colonne de papaïne

Cystatine 1

CcBV Cystatine 1 recombinante est un inhibiteur de protéases à cystéine actif

0 1 10 100

RelativeActivity (%)Papain

Cystatin (nM)

0

20

40

60

80

100

PapainRelativ

e Activity

(%)

Cystatine 1 (nM)

0

20

40

60

80

100 Relative

Activity (%)

0 16 83Cystatin (nM)

Cathepsin BCathepsin LS.peregrina 29 kDacysteine protease

Cystatine 1 (nM)

Relative Activity (%)

Cathepsin BCathepsin L

S. peregrina 29 kDa cysteine protease

Espagne et al. Journal of Virology 2005

Modèle de travail _ Perspectives

ParasitismeŒufs de guêpe + bracovirus

Production de protéases àCystéine

Nouvelle composante de la réponse immunitaire des insectes ?

Inhibition par les cystatines de CcBV ?



Séquençage du génome viral libre

Analyse d’une banque d’ADNc à partir de chenilles parasitées

Reverse Northern en utilisant comme sonde de l’ADNc de chenilles parasitées

Les questions scientifiques

?

Réplication virale: massive dans les ovaires de guêpes

Nature du virus ancêtre ?

Pas de réplication dans la chenille hôteLes gènes viraux n’ont pas besoin d’être codés par les cercles

Les gènes viraux sont exprimés massivement dans les ovaires

Les gènes viraux sont dans le génome de la guêpe ?

Chromosome 5guêpe

Réplication virale: massive dans les ovaires de guêpes

1. Recherches de protéines virales (capside, polymérase, enveloppes)

Par une approche transcriptomique et protéomique sur les ovaires

-banque EST d’ovaires de guêpes

-analyse des protéines à partir de virus purifiés des ovaires

Nature du virus ancêtre ?

Nouvelle stratégie

2. Analyse de la forme intégrée du virus

Analyse du transcriptome d’ovaires répliquant le virus:

6000 EST d’ovaires de Cotesia congregata

Comparaison dans les banques de données

Identification des protéines de structure des virions:

Séquençage des protéines constitutives

des particules purifiées

Comparaison dans les banques de données et les banques d’EST

44 gènes viraux potentiels (origine virus d’insecte)

Gènes impliqués dans • la transcription • La constitution des nucléocapsides • La constitution des enveloppes des particules

Gènes viraux sont intégrés au génome de la guêpe

Le génome du virus reflète les contraintes évolutives différentes :mutualisme/parasitisme

1. Intégration du virus ancêtre

3. « Acquisition de gènes de virulence» Transfert du génome de la guêpe vers le virus

2. « Perte de gènes viraux » Transfert vers le génome de la guêpe

Encore beaucoup de questions


Mécanismes ?


Comment s’effectue la réplication ?

Virus comme vecteur de

transfert de gènes ?

Capture des gènes et évolution ?

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