caractérisation de biomarqueurs d'exposition à la fumonisine b1
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N° d’ordre :
THÈSE
Présentée pour obtenir le titre de
DOCTEUR DE L'INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE
ÉCOLE DOCTORALE : SCIENCES ÉCOLOGIQUES, VÉTÉRINAIRES, AGRONOMIQUES ET
BIOINGÉNIERIES
SPÉCIALITÉ : MYCOTOXICOLOGIE
par
M. TR�N S�-Trung
CARACTÉRISATION DE BIOMARQUEURS
D'EXPOSITION À LA FUMONISINE B1 CHEZ
LES PALMIPÈDES.
Soutenue le 06 octobre 2005 devant le Jury composé de :
M. BABILÉ René
M. ÉTIENNE Michel
M. FRÉMY Jean Marc
M. GALTIER Pierre
M. GUERRE Philippe
Président
Rapporteur
Rapporteur
Membre du Jury
Directeur de Thèse
" Et le chemin est long du projet à la chose"
Molière
iiA notre Président de Thèse,
Monsieur le Professeur BABILE
Professeur de l'Ecole Nationale Sup�rieure Agronomique de Toulouse.
Qui nous fait l'honneur de pr�sider notre jury de th�se.
Qu'il trouve ici l'expression de notre reconnaissance et de notre profond respect.
A notre Jury de Thèse,
Monsieur le Docteur ETIENNE,
Directeur de recherche de l'INRA ¼ UMR SENAH.
Qui nous fait l'honneur d'�tre rapporteur de ce travail de th�se.
Qu'il trouve ici l'expression de nos plus sinc�res et chaleureux remerciements.
Monsieur le Docteur FRïMY,
Directeur de recherche du CNRS - Maison d'Alfort.
Qui nous fait l'honneur d'�tre rapporteur de ce travail de th�se.
Qu'il trouve ici l'expression de notre profonde consid�ration.
Monsieur le Docteur GALTIER,
Directeur de recherche de l'INRA ¼ Toulouse.
Qui nous a fait l'honneur de participer š notre jury de th�se.
Qu'il trouve ici l'expression de notre attachement respectueux.
Monsieur le Professeur GUERRE,
Professeur de l'Ecole Nationale V�t�rinaire de Toulouse.
Qui nous a fait l'honneur de diriger ce travail de th�se.
Qu'il trouve ici l'expression de notre profonde gratitude pour nous avoir accueilli dans son
laboratoire ainsi que pour ses conseils enrichissants non seulement sur les mycotoxines mais
aussi sur l¸informatique, pour son aide tr�s pr�cieuse et sa confiance tout au long de ces ann�es.
iiiA Monsieur BAILLY,
Pour m¸avoir accueilli dans votre laboratoire ainsi que pour votre aide tr�s pr�cieuse et surtout
pour avoir dirig� ce travail de th�se. Qu¸il trouve ici l'expression de ma profonde gratitude et mon
attachement respectueux.
A Monsieur et Madame BODIN,
Pour tous les sentiments que vous me portez et surtout pour m¸avoir chaleureusement accueilli et
vous �tre occup� de moi durant mon s�jour en France. Qu¸ils trouvent ici l'expression de mes plus
profonds sentiments.
A Monsieur et Madame BENARD,
Pour votre accueil et votre soutien continuel. Qu¸ils trouvent ici l'expression de mes plus chaleureux
remerciements.
A Didier et Lydie,
Pour votre gentillesse incroyable et pour vos corrections de ce travail de th�se.
A Claudine, Arlette, Marie-Rose et Alain,
Pour le bonheur que c¸est de travailler avec vous ! Merci pour tout § !
A C�line, Fatma, Caroline, Anne-Ga�lle, Lionel et Florence,
Pour tous les bons moments que l¸on a partag� pendant vos stages au laboratoire de Pharmacie ¼
Toxicologie et aussi pour les petits cours de fran¯ais que vous m¸avez donn�. Le monde est petit,
on se reverra un jour !
A B�atrice et Luis,
Pour votre gentillesse illimit�e et votre tr�s sinc�re amiti�.
A tous ceux qui m¸ont accompagn� par leur soutien affectif, moral et mat�riel, par leurs
encouragements tout au long de cette �tude.
ivA la m�moire de mes grands-parents paternels et mon grand-p�re maternel.
A ma grand-m�re maternelle,
Qu¸elle trouve ici l¸expression de ma reconnaissance et de mon affection.
A mes parents,
Sans vous cette th�se n¸aurait pas exist� et vous, š votre mani�re avez pass� autant examens
que moi, partageant angoisses, �checs et succ�s. Que cet humble travail repr�sente
l¸accomplissement de tous vos sacrifices et le reflet de mon immense reconnaissance et amour.
A mes sÂurs et mes fr�res,
Pour votre amour, votre patience et votre foi en moi.
A B�ch VŽn,
Pour l¸amour que tu me portes et tous ces moments de bonheurs partag�s. Qu¸ils durent
�ternellement.
A Madame et Monsieur le Docteur TRẦN Hữu-Thế,
Pour tous les sentiments tr�s pr�cieux que vous m¸avez port� pendant tout mon s�jour en France.
Qu¸ils trouvent ici l'expression de ma profonde gratitude et mon attachement respectueux.
A tous les autres amis vietnamiens, sans pouvoir les citer, quelle belle ambiance dans la plus belle
amiti�.
vCe travail a fait l’objet des publications suivantes :
1. TARDIEU D., TRAN S.T., AUVERGNE A., BABILE R., BENARD G., BAILLY J.D. and
GUERRE P.: Effects of Fumonisins on Liver and Kidney Sphinganine and The
Sphinganine to Sphingosine Ratio During Chronic Exposure in Ducks. Soumis.
2. TRAN S.T., TARDIEU D., AUVERGNE A., BAILLY J.D., BABILE R., DURAND S.,
BENARD G. and GUERRE P.: Serum Sphinganine and The Sphinganine to
Sphingosine Ratio as a Biomarker of Dietary Fumonisins During Chronic Exposure in
Ducks. Chemico – Biological Interactions, 2005, sous presse.
3. TRAN S.T., AUVERGNE A., BENARD G., BAILLY J.D., TARDIEU T., BABILE R. and
GUERRE P.: Chronic Effects of Fumonisin B1 on Ducks. Poultry Science, 2005, 84 (1),
22-28.
4. TARDIEU D., BAILLY J.D., BENARD G., TRAN T.S. and GUERRE P.: Toxicity of
Maize Containing Known Levels of Fumonisin B1 During Force-Feeding of Ducks.
Poultry Science, 2004, 83 (8), 1287-1293.
5. TRAN S.T., BAILLY J.D., TARDIEU D., DURAND S., BENARD G. and GUERRE P.:
Sphinganine to Sphingosine Ratio and Predictive Biochemical Markers of Fumonisin
B1 Exposure in Ducks. Chemico – Biological Interactions, 2003, 146, 61-72.
1
TABLE DES MATIÈRES
LISTE DES ABRÉVIATIONS ...................................................................................................... 4
TABLE DES ILLUSTRATIONS .................................................................................................. 5
RÉSUMÉ ...................................................................................................................................... 10
SUMMARY.................................................................................................................................. 11
INTRODUCTION....................................................................................................................... 12
Partie I. DONNÉES BIBLIOGRAPHIQUES ........................................................................... 14
I.1. Fumonisines ...................................................................................................................... 15
I.1.1. Historique................................................................................................................... 15
I.1.2. Structure et propriétés.............................................................................................. 15
I.1.3. Origine ........................................................................................................................ 19
I.1.4. Niveau de contamination dans les aliments ......................................................... 23
I.2. Mycotoxicoses................................................................................................................... 26
I.2.1. Espèces très sensibles ............................................................................................... 26
I.2.2. Espèces peu sensibles ............................................................................................... 32
I.2.3. Pouvoir carcinogène ................................................................................................. 37
I.3. Cinétique et mécanisme d’action de la fumonisine B1................................................ 40
I.3.1. Toxicocinétique.......................................................................................................... 40
I.3.2. Mécanisme d’action .................................................................................................. 46
1.4. Biomarqueurs d’exposition aux fumonisines.............................................................. 54
I.4.1. Description des paramètres biochimiques sériques............................................. 54
I.4.2. Biomarqueurs d’exposition aux fumonisines ....................................................... 59
I.5. Intérêt du modèle palmipède........................................................................................ 69
2
I.5.1. Production de palmipède : données économiques ............................................. 69
I.5.2. Production de palmipède : données techniques.................................................. 70
I.5.3. Intérêt des études sur palmipèdes.......................................................................... 74
Partie II. MATÉRIELS ET MÉTHODES .................................................................................. 75
II.1. Réactifs et Appareillage. ................................................................................................ 76
II.1.1. Réactifs ...................................................................................................................... 76
II.1.2. Appareils................................................................................................................... 76
II.1.3. Matériel courant de laboratoire ............................................................................. 77
II.2. Production de Fumonisine B1 ....................................................................................... 77
II.2.1. Souche utilisée pour la production de FB1........................................................... 77
II.2.2. Milieu de culture...................................................................................................... 77
II.2.3. Substrat et contamination du maïs........................................................................ 78
II.2.4. Extraction, purification et dosage......................................................................... 78
II.3. Traitement des animaux ................................................................................................ 79
II.3.1. Détermination des valeurs usuelles ...................................................................... 79
II.3.2. Toxicité subaiguë sur des canards en croissance ................................................ 80
II.3.3. Toxicité pendant le gavage..................................................................................... 81
II.3.4. Toxicité chronique ................................................................................................... 82
II.4. Paramètres biochimiques et dosage de Sphinganine (Sa) et Sphingosine (So) ..... 85
II.4.1. Biochimies sériques ................................................................................................. 85
II.4.2. Dosage de Sa et So dans le sérum et dans les tissus ........................................... 85
II.5. Analyses statistiques ...................................................................................................... 93
Partie III. RÉSULTATS............................................................................................................... 95
III.1. Toxicité subaiguë sur canards en croissance ............................................................ 96
III.1.1. Effets sur la santé.................................................................................................... 96
III.1.2. Altérations biochimiques ...................................................................................... 98
III.1.3. Altérations des Sphingolipides .......................................................................... 102
3
III.2. Toxicité pendant le gavage ........................................................................................ 107
III.2.1. Effets sur la santé.................................................................................................. 107
III.2.2. Altérations biochimiques .................................................................................... 109
III.2.3. Altération des sphingolipides ............................................................................ 111
III.3. Toxicité chronique....................................................................................................... 113
III.3.1. Comparaison des 2 protocoles............................................................................ 113
III.3.2. Effets sur la santé.................................................................................................. 116
III.3.3. Altérations biochimiques .................................................................................... 123
III.3.4. Altérations des sphingolipides........................................................................... 126
Partie IV. DISCUSSION........................................................................................................... 133
IV.1. Effets sur la santé......................................................................................................... 134
IV.2. Altérations biochimiques ........................................................................................... 137
IV.3. Altérations des sphingolipides.................................................................................. 139
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES.................................................................................... 144
RÉFÉRENCES ........................................................................................................................... 146
4
LISTE DES ABRÉVIATIONS
ACN : Acétonitrile
AFNOR : Agence Française de Normalisation
ALAT : Alanine aminotransférase
ASAT : Aspartate aminotransférase
CCM : Chromatographie sur Couches Minces
CV : Cœfficient de Variation
ELEM : Leucoencéphalomalacie équine
FB1 : Fumonisine B1
FB2 : Fumonisine B2
GGT : Gamma glutamyltransférase
HPLC : Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP)
IARC : Agence Internationale de Recherche sur le Cancer
IC : Intervalle de confiance de la moyenne
IP : Intra-péritonéale
IV : Intra-veineuse
LDH : Lactate déshydrogénase
OPA : Ortho-phthaldialdéhyde
PAL : Phosphatase alcaline
pH : Potentiel hydrogène
PPE : Œdème pulmonaire porcin
PV : Poids vif
Sa : Sphinganine
So : Sphingosine
UV: Ultra-violet 14C-FB1: Fumonisine B1 marquée au Carbone 14
5
TABLE DES ILLUSTRATIONS Figure I.1.1 : Structure de la fumonisine B1 --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 16
Figure I.1.2 : Maïs naturellement contaminé ----------------------------------------------------------------------------20
Figure I.2.1 : Coupe transversale d’encéphale ---------------------------------------------------------------------------27
Figure I.2.2 : Poumon avec œdème------------------------------------------------------------------------------------------29
Figure I.3.1 : Cinétique de la FB1 -------------------------------------------------------------------------------------------- 40
Figure I.3.2 : Structure des sphingolipides -------------------------------------------------------------------------------46
Figure I.3.3 : Voies de biosynthèse de novo du céramide et des sphingolipides complexes ------------------- 49
Figure I.3.4 : Métabolisme des sphingolipides en réponse à un agoniste, et conséquences -------------------51
Figure I.3.5 : Effets de la FB1 sur le métabolisme des sphingolipides ------------------------------------------------------------------------ 52
Figure I.5.1 : Schéma d’obtention de canards mulards ----------------------------------------------------------------71
Figure II.1 : Chromatogramme d’un mélange de standards So-Sa et Sa C20-------------------------------------- 89
Figure II.2 : Chromatogramme d’un échantillon de foie d’un canard témoin ----------------------------------- 89
Figure II.3 : Chromatogramme d’un échantillon de foie d’un canard traité -------------------------------------- 89
Figure III.1.1 : Effets de la FB1 sur les poids vifs et la croissance ---------------------------------------------------- 96
Figure III.1.2 : Effets de la FB1 sur les poids des foies ---------------------------------------------------------------- 96
Figure III.1.3 : Analyse histologique de foie des canards en croissance ------------------------------------------- 97
Figure III.1.4 : Effets de la FB1 administrée quotidiennement par VO pendant 12 jours sur les
concentrations sériques en Prot, Chol et les activités de l’ALAT, LDH (cinétique) -------------------99
Figure III.1.5 : Effets de la FB1 administrée quotidiennement par VO pendant 12 jours sur les
concentrations sériques en Prot, le Chol et les activités de l’ALAT, LDH (effets cumulés) ------- 101
Figure III.1.6 : Effets de la FB1 administrée quotidiennement par VO pendant 12 jours sur la
concentration sérique en Sa et le rapport Sa/So (cinétique) ---------------------------------------------- 104
Figure III.1.7 : Effets de la FB1 administrée quotidiennement par VO pendant 12 jours sur les
concentrations sériques en Sa et le rapport Sa/So (effets cumulés) ------------------------------------- 106
Figure III.2.1 : Effets des fumonisines sur le foie après gavage ---------------------------------------------------- 108
Figure III.2.2 : Analyse histologique de foies après gavage -------------------------------------------------------- 109
Figure III.2.3 : Effet de l’ingestion du maïs naturellement contaminé par des fumonisines sur le
rapport Sa/So et les concentrations sériques en Sa après 12 jours de gavage ----------------------- 111
Figure III.2.4: Effet de l’ingestion du maïs naturellement contaminé par des fumonisines sur le
rapport Sa/So et les concentrations hépatiques en Sa après 12 jours de gavage -------------------- 112
Figure III.3.1 : Effets sur la croissance de l’administration quotidienne de FB1 chez des canards
témoins et traités --------------------------------------------------------------------------------------------------- 116
Figure III.3.2 : Effet de l’administration quotidienne de FB1 sur le poids vif----------------------------------- 116
Figure III.3.3 : Effet de l’administration quotidienne de FB1 sur le gain de poids ---------------------------------------------117
6
Figure III.3.4 : Effet de l’administration quotidienne de FB1 sur la consommation moyenne d’aliment - 118
Figure III.3.5 : Effet de l’administration quotidienne de FB1 sur le poids du foie ----------------------------- 119
Figure III.3.6 : Analyse histologique : Evolution de l’organisation hépatique chez des canetons entre
J0 à J28 de traitement (7 et 35 jours d’âge)--------------------------------------------------------------------- 121
Figure III.3.7 : Analyse histologique: Evolution de l’organisation hépatique chez des canetons
recevant 128 mg FB1/kg d’aliment pendant 28 jours de traitement ------------------------------------ 122
Figure III.3.8 : Effets de la FB1 administrée quotidiennement par VO pendant 77 jours sur la
concentration sérique en Protéines totales et Cholestérol ------------------------------------------------ 124
Figure III.3.9 : Effets de la FB1 administrée quotidiennement par VO pendant 77 jours sur les activités
sériques de la PAL, la LDH, l’ALAT et l’ASAT ------------------------------------------------------------- 125
Figure III.3.10 : Effets de la FB1 administrée quotidiennement par VO pendant 77 jours sur les
concentrations sériques en So, Sa et le rapport Sa/So ---------------------------------------------------- 128
Figure III.3.11: Effets de la FB1 administrée quotidiennement par VO pendant 77 jours sur les
concentrations hépatiques en So, Sa et le rapport Sa/So-------------------------------------------------- 129
Figure III.3.12: Effets de la FB1 administrée quotidiennement par VO pendant 77 jours sur les
concentrations rénales en So, Sa et le rapport Sa/So ------------------------------------------------------- 130
Figure III.3.13. Corrélation entre le rapport Sa/So obtenu dans le sérum, le foie et le rein chez les
canards recevant quotidiennement de la FB1 pendant 77 jours ----------------------------------------- 131
Figure III.3.14 : Relation entre les doses cumulées de FB1 administrées et la concentration en Sa (A) et
le rapport Sa/So (B) dans le sérum ---------------------------------------------------------------------------- 132
7
Tableau I.1.1: Structures des fumonisines ------------------------------------------------------------------------------- 16
Tableau I.1.2 : Espèces fongiques productrices de fumonisines ----------------------------------------------------- 20
Tableau I.1.3 : Niveau de contamination de FB1 dans le maïs et ses sous-produits ---------------------------- 24
Tableau I.2.1: Effets de la FB1 chez les volailles -------------------------------------------------------------------------- 33
Tableau I.2.2 : Action embryolétale de la FB1 chez les volailles ----------------------------------------------------- 36
Tableau I.3.1 : Absorption de la FB1 ---------------------------------------------------------------------------------------- 41
Tableau I.3.2 : Distribution et excrétion de la FB1 ---------------------------------------------------------------------- 43
Tableau I.3.3 : Classification des sphingolipides ------------------------------------------------------------------------ 46
Tableau I.4.1: Biomarqueurs d’exposition aux fumonisines chez les équidés ----------------------------------- 60
Tableau I.4.2 : Biomarqueurs d’exposition aux fumonisines chez les porcines ---------------------------------- 61
Tableau I.4.3 : Biomarqueurs d’exposition aux fumonisines chez les rongeurs --------------------------------- 63
Tableau I.4.4 : Biomarqueurs d’exposition aux fumonisines chez les primates non humains --------------- 65
Tableau I.4.5 : Biomarqueurs d’exposition aux fumonisines chez les volailles----------------------------------- 67
Tableau 1.5.1 : Production de filière canard entre 1998 et 2002 en Europe ---------------------------------------- 69
Tableau 1.5.2 : Production de filière avicole entre 1995 et 2002 en France ----------------------------------------- 70
Tableau 1.5.3 : Production de foie gras entre 1999 et 2002 en France ----------------------------------------------- 70
Tableau II.1 : Validation de la méthode de dosage -------------------------------------------------------------------- 91
Tableau II.2 : Stabilité du dérivé fluorescent dans le temps ---------------------------------------------------------- 92
Tableau III.1.1 : Paramètres de distribution des concentrations sériques en protéines totales,
cholestérol, ALAT et LDH chez les canards non exposés aux mycotoxines ------------------------- 98
Tableau III.1.2 : Estimation de la dose de FB1 nécessaire pour dépasser le percentile 90 de différents
paramètres biochimiques établis chez les canards non exposés aux mycotoxines et
indemnes de toute affection connue ------------------------------------------------------------------------ 100
Tableau III.1.3 : Modélisation non paramétrique (logiciel Sigmaplot) de la relation dose/effet
obtenue après 12 jours de traitement chez les canards ------------------------------------------------- 102
Tableau III.1.4 : Paramètres de distribution statistique des concentrations sériques en sphinganine
libre et du rapport sphinganine/ sphingosine chez les canards non exposés aux
mycotoxines ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 103
Tableau III.1.5 : Estimation de la dose de FB1 nécessaire pour dépasser le percentile 90 de la
concentration en Sa et du rapport Sa/So établis chez les canards non exposés aux
mycotoxines et indemnes de toute affection connue ---------------------------------------------------- 105
Tableau III.1.6 : Modélisation non paramétrique de la relation dose/effet obtenue après 12 jours de
traitement chez les canards ------------------------------------------------------------------------------------ 106
Tableau III.2.1 : Effets de l’ingestion du maïs naturellement contaminé par les fumonisines sur les
performances et le type d’engraissement hépatique chez le canard après 12 jours de gavage 107
8
Tableau III.2.2 : Effets de l’ingestion du maïs naturellement contaminé par des fumonisines sur les
paramètres biochimiques sériques chez le canard après 12 jours de gavage --------------------- 110
Tableau III.3.1 : Comparaison des effets de la FB1 sur la croissance au cours des deux études ------------ 114
Tableau III.3.2 : Effets de la FB1 sur les paramètres biochimiques et le rapport Sa/So au jour 21 de
traitement des deux études ------------------------------------------------------------------------------------ 115
Tableau III.3.3: Effets de la FB1 sur le poids relatif du coeur, muscle pectoral, gésier, de la rate et du
foie chez les canards après 77 jours de traitement ------------------------------------------------------- 118
9
Schéma II.1 : Protocole expérimental d’intoxication subaiguë sur des canards en croissance--------------- 80
Schéma II.2 : Protocole expérimental d’intoxication au cours du gavage ---------------------------------------- 81
Schéma II.3 : Protocole expérimental d’intoxication chronique (Protocole A) ---------------------------------- 83
Schéma II.4 : Protocole expérimental d’intoxication chronique (Protocole B) ---------------------------------- 84
Schéma II.5 : Préparation d’homogénat de tissus -----------------------------------------------------------------------86
10
RÉSUMÉ
La fumonisine B1 (FB1) est une toxine produite par Fusarium verticillioides. Elle
est responsable de différentes affections chez l’animal, la leucoencéphalomalacie équine
et l’œdème pulmonaire porcin étant les plus connues. En France, bien que la prévalence
de la FB1 se confirme d’année en année, peu d’études existent chez les palmipèdes, qui
constituent pourtant la production la plus exposée. L’objectif principal de nos travaux
est la caractérisation de biomarqueurs d’exposition et d’effets des fumonisines chez les
palmipèdes au cours de différents scénario d’exposition : chez les canards en croissance
(distribution de 0, 5, 15 et 45 mg FB1/kg poids vif/jour pendant 12 jours), dans les
conditions de gavage (distribution de 0, 10 et 20 mg FB1/kg d’aliment pendant 12 jours)
et dans des conditions d’expositions chroniques (distribution de 0, 2, 8, 32 et 128 mg
FB1/kg d’aliment pendant 84 jours). Différents paramètres biochimiques sériques
(protéines totales, cholestérol, activités lactate déshydrogénase, phosphatases alcalines,
alanine aminotransférase …) ainsi que les concentrations en sphingosine (So),
sphinganine (Sa) et le rapport Sa/So ont été explorés au niveau sérique, hépatique et
rénal. Le rapport Sa/So est le biomarqueur le plus sensible lors d’exposition à la FB1. La
plus faible dose étudiée capable de déterminer un effet détectable est de 2 mg FB1/kg
d’aliment. La cinétique des différents paramètres explorés est toutefois étroitement liée
à la durée de traitement. Bien que nos études rapportent une altération de la croissance
et des pertes économiques lors d’exposition aux plus fortes doses, ces effets ne
surviennent qu’à des niveaux d’exposition nettement supérieurs à ceux entraînant une
altération du métabolisme des sphingolipides.
11
SUMMARY
Fumonisine B1 (FB1) is a toxin produced by Fusarium verticillioides. It is
responsible for various affections in animal, the equine leucoencephalomalacia and the
porcine pulmonary oedema being the most known. In France, although the prevalence
of the FB1 is confirmed year after year, few studies are available in ducks which
constitute the most exposed production. The main objective of our work is the
characterization of biomarkers of fumonisins effects and exposure in ducks during
different exposure scenario: in ducks during growth (distribution of 0, 5, 15 and 45 mg
FB1/kg body weight/day during 12 days), under conditions of force-feeding
(distribution of 0, 10 and 20 mg FB1/kg feed during 12 days) and under chronic
exposure conditions (distribution of 0, 2, 8, 32 and 128 mg FB1/kg feed during 84 days).
Various plasmatic biochemical parameters (total proteins, cholesterol, activities of
lactate dehydrogenase, alkaline phosphatases, alanine aminotransferase…) as well as
sphingosine (So) and sphinganine (Sa) concentrations and Sa/So ratio were explored at
the plasmatic, hepatic and renal level. Sa/So ratio is the most sensitive biomarker of FB1
exposure. The lowest investigated dose able to determine a detectable effect is 2 mg/kg
feed. The kinetics of these parameters is closely linked to the duration of exposure.
Although our studies report an alteration of the growth and economic losses during
mycotoxin exposure to the highest tested dose, theses effects only occur at exposure
levels significantly higher than those leading to an alteration of the sphingolipids
metabolism.
12
INTRODUCTION
Les mycotoxines sont des composés toxiques issus du métabolisme secondaire
des moisissures susceptibles de contaminer l’alimentation animale et humaine à tous les
stades de la chaîne alimentaire. Parmi les mycotoxines, les fumonisines constituent la
famille de mycotoxine la plus fréquemment rencontrée de par le monde [1], la
Fumonisine B1 (FB1) étant la plus abondante et la plus toxique de la famille [2]. Elle est
principalement produite par Fusarium verticillioides, champignon qui contamine plus
particulièrement le maïs [3, 4]. Cette toxine a été caractérisée chimiquement en 1988 [5,
6]. Depuis, sa toxicité a été largement étudiée in vitro et in vivo. Chez les mammifères, les
fumonisines sont responsables de la leucoencéphalomalacie des équidés [7] ainsi que de
l’œdème pulmonaire porcin [8, 9]. Elles sont considérées comme carcinogènes chez le
rat et suspectées intervenir dans les cancers de l’œsophage chez l’homme [10]. Dans
plusieurs espèces, comme les équidés, les suidés, les ovins, les rongeurs et les primates
non humain, une toxicité hépatique et rénale a également été observée [11]. Chez les
oiseaux, de nombreuses études rapportent une réduction du poids vif et une altération
de l’indice de consommation alimentaire. Ces modifications sont souvent observées lors
d’ingestion de fortes doses (100-300mg FB1/kg d’aliment), les effets des faibles doses
étant moins bien caractérisés.
La fumonisine B1 a une structure proche de celle de la sphingosine et la
sphinganine (sphingolipides membranaires). Cette similarité de structure est à l’origine
de l’inhibition de la biosynthèse des sphingolipides. Cette perturbation entraîne une
accumulation des bases sphingoïdes (la sphinganine et dans une moindre mesure la
sphingosine ainsi que leur métabolites) et une déplétion en céramide et en
sphingolipides complexes à l’origine de nombreux bouleversements biochimiques.
Différentes études montrent ainsi que la FB1 induit in vitro et in vivo une augmentation
du rapport Sphinganine/Sphingosine (Sa/So) [12, 13]. Ce rapport peut donc être
considéré comme biomarqueur de l’exposition à la FB1 chez plusieurs espèces [14-21].
En France, des travaux réalisés sur le maïs ont montré que 67% des échantillons
étaient contaminés par Fusarium verticillioides. Parmi ces souches, 80% ont la capacité de
produire des niveaux élevés de FB1 dans des conditions de laboratoire [22]. Par ailleurs,
13
divers cas de leucoencéphalomalacie équine ont été rapportés, confirmant l’importance
de la contamination du maïs, notamment dans le sud-ouest [23]. Bien que la prévalence
des fumonisines sur le territoire français se confirme d’année en année, peu d’études
existent chez les palmipèdes, qui constituent pourtant la production la plus exposée.
L’objectif principal des nos travaux est la caractérisation de biomarqueurs
d’exposition et d’effet des fumonisines chez les palmipèdes au cours de différents
scénario d’exposition. Cet objectif est poursuivi par la réalisation de différents
protocoles permettant de :
- caractériser des biomarqueurs d’exposition chez les palmipèdes en croissance,
- préciser la signification de ces biomarqueurs chez les palmipèdes dans les
conditions de gavage,
- déterminer leur validité dans des conditions d’exposition chronique à
différents niveaux de contamination comparables à la réalité.
14
Partie I. DONNÉES BIBLIOGRAPHIQUES
15
I.1. Fumonisines
I.1.1. Historique
C’est en 1988 que Gelderblom et coll. ont identifié les fumonisines, une nouvelle
classe de mycotoxines, a partir de cultures de Fusarium moniliforme Sheldon [5]. Cette
moisissure, décrite pour la première fois en 1904 par Sheldon et répertoriée sous le nom
de Fusarium verticillioides Nirenberg depuis 1998 [2], était connue pour être impliquée
dans l’apparition de pathologies chez les animaux. Toutefois, jusqu’en 1988, aucune
étude n’avait réussi à isoler les molécules responsables.
Depuis leur découverte, les fumonisines se sont révélées être des contaminants
fréquents du maïs et de ses sous-produits mais aussi du sorgho et du riz [3, 24]. Elles
sont retrouvées dans la plupart des pays du monde, comme, par exemple les Etats-Unis,
le Canada, l’Afrique du Sud, l’Australie, la Chine, la Thaïlande, les Philippines,
l’Indonésie, le Mexique, la France, l’Italie, les Pays Bas, la Pologne et l’Espagne [5, 22, 25-
35]. Depuis leur découverte, leur implication directe dans de nombreuses pathologies
animales a pu être confirmée. Ainsi, elles sont responsables de leucoencéphalomalacie
chez les équidés [23, 36-40], d’œdème pulmonaire chez le porc [9, 41-43], de l’apparition
d’hépato-carcinomes chez le rat et la souris [44-49], de diminution des performances
zootechniques chez les volailles [50-52], et, enfin, elles sont suspectées d’être impliquées
dans la forte prévalence de cancers de l’œsophage chez l’homme dans certaines région
du globe : en Afrique du Sud, en Chine, en Italie, … [33, 53, 54]. C’est pourquoi, la
fumonisine B1 (FB1) est classée parmi les cancérogènes potentiels pour l’homme (groupe
2B) par le Centre International de Recherche sur le Cancer [10]. Nous allons maintenant
plus particulièrement focaliser notre étude sur la FB1 qui est la plus abondante des
fumonisines présentes à l’état naturel et la plus toxique [2].
I.1.2. Structure et propriétés
I.1.2.1. Structure
Nom commun : Fumonisine B1 (FB1)
Formule chimique : C34H59NO15
Poids moléculaire : 722
16
Structure :
Tableau I.1.1: Structures des fumonisines [2, 55]
Figure I.1.1 : Structure de la fumonisine B1 [2].
La FB1 est un diester de l’acide 1,2,3 propane tricarboxylique et du 2-amino-
12,16-diméthyl 3,5,10,14,15- pentahydroxyeicosane (Figure I.1.1). C’est la plus
abondante des fumonisines, qui constituent une famille de toxines dont on a identifié au
moins 15 membres, répartis en 4 catégories : FA1, FA2, FA3, FAK1 ; FB1, FB2, FB3, FB4 ; FC1,
FC2, FC3, FC4 ; FP1, FP2 et FP3 [2].
La structure plane des fumonisines A1, A2, B1, B2 a été élucidée en 1988 par
Bezuidenhout et ses collaborateurs, en employant la résonance magnétique nucléaire et
la spectrométrie de masse [6]. La FA1 se différencie par une acétylation de la fonction
aminée, alors que les fumonisines B2, B3 et A2 sont des analogues déshydroxylés de FB1
et FA1 (Tableau I.1.1).
La FAK1 se distingue de la FA1 par le remplacement du groupe N-acétylé de la
FA1 par un groupe renfermant une fonction cétone [2]. De même, l’iso- FB1 se distingue
de la FB1 par la présence d’une fonction hydroxyle en C4 au lieu de C5 [56]. Les
Fumonisines C sont semblables aux Fumonisines B, excepté en C1 où le groupe méthyle
adjacent au groupe amine, est absent ; les Fumonisines P ont, elles, un groupe 3-
hydroxypyridium à la place du groupe amine présent dans la structure des Fumonisines
B.
I.1.2.2. Propriétés physiques
A l’état pur, la FB1 se présente sous la forme d’une poudre hygroscopique de
couleur blanche [2]. Son point d’ébullition est de 103 à 105°C [55, 57].
FUMONISINE R1 R2 R3
FB1 OH OH H
FB2 H OH H
FB3 OH H H
FB4 H H H
FA1 OH OH CH3CO
FA2 H OH CH3CO
2019
1817
1615
1413
1211
109
87
65
43
OHOH
CH3
O
O CH3 OH2
1CH3
NH2
CCH2CHCH2COOHO
CCH2CHCH2COOHO
COOH
COOH
R1 R3
R2
17- Solubilité : Les fumonisines sont des composés très polaires, solubles dans
l’eau pour des concentrations inférieures à 20 mg/mL [58]. Leur solubilité est plus
importante dans le méthanol et dans le mélange acétonitrile – eau (1v :1v). Elles sont
insolubles dans les solvants non polaires.
- Ces molécules ne possèdent pas de groupements chromophores, elles
n’absorbent ni dans l’ultraviolet (UV), ni en lumière visible et ne sont pas fluorescentes
[59]. Lors du dosage, une dérivatisation est donc nécessaire pour mettre en évidence ces
composés après séparation par chromatographie.
I.1.2.3. Propriétés chimiques
Présentant une structure d’ester, les fumonisines sont hydrolysables par
chauffage en milieu acide (6M d’HCl) ou basique (0,05 à 2 M de KOH). Elles libèrent
alors les acides propane tricarboxylique et l’aminopolyol (AP) correspondants [3].
Les fumonisines ayant une fonction amine primaire (ou secondaire) et une ou
plusieurs fonctions alcool, elles peuvent être N et/ou O acétylées et méthylées. Les
dérivés mono- ou diméthylés obtenus lors d’une extraction par le méthanol, peuvent
interférer avec l’analyse chromatographique de ces mycotoxines [3, 60].
I.1.2.4. Stabilité
La FB1 est relativement stable dans la plupart des conditions utilisées pour le
traitement des denrées alimentaires. Les résultats d’études récentes concernant les
effets de la chaleur, du traitement chimique, du tamisage, de la fermentation par les
levures et du vieillissement vont être maintenant résumés.
I.1.2.4.1. Traitement thermique
La concentration en FB1 d’un maïs contaminé soumis à un traitement thermique
décroît avec le temps. Néanmoins, ces mycotoxines sont considérées comme
thermostables.
Une température inférieure à 125°C maintenue pendant 60mn n’apporte
qu’une diminution de 27% des teneurs en FB1. Cependant, une température de 150°C ou
supérieure à 175°C, pendant 10mn, réduit respectivement de 50% et de plus de 80% les
teneurs en FB1 [61, 62].
18Une température de 150°C permet une réduction de 80 à 90% de la FB1 à
pH=4, 18 à 30% à pH=7 et 40 à 52% à pH=10 [61]. A 78°C, ce composé est stable pendant
16h dans des solutions tampons à pH= 3.5 et pH=9 [3].
Lorsque le maïs contaminé est cuit dans de l’eau bouillante (100°C), la FB1,
au départ également répartie entre l’eau de cuisson et les grains, se trouve d’autant plus
dans le surnageant que le temps de cuisson est long. Après 10 minutes de traitement, la
quantité totale de FB1 commence à diminuer au cours du temps (décroissance de 50%
après de 51 minutes) [59].
I.1.2.4.2. Traitement chimique
L’action de l’ammoniaque (2% à température ambiante et pression
atmosphérique) permet une réduction non négligeable du niveau de contamination
détectable, mais ne diminue toutefois pas la toxicité du maïs si il est administré à des
rats [63-65]. Si ce traitement est effectué à température élevée, 79% de la FB1 est détruite
[66].
Le traitement par de l’eau chaudée (Ca(OH)2), à 25°C, pendant 24 heures,
provoque une réduction de 95% des teneurs en FB1 des grains de maïs contaminés. Cette
diminution est liée à la perte du péricarpe où se localise principalement la toxine [64].
Toutefois, le maïs contaminé-traité reste toxique pour des rats même si cette toxicité est
plus faible que celle du maïs contaminé-non traité [67].
Le traitement par une solution de Chlorure de Sodium (NaCl) permet une
réduction de 74% à 86% des teneurs en FB1 [68]. Par ailleurs, un traitement combiné par
de l’H2O2 et du NaHCO3 permet de supprimer la toxine présente dans des grains de
maïs contaminés [66].
I.1.2.4.3. Traitement mécanique (ou tamisage)
Le broyage à sec du maïs aboutit à la distribution de la toxine dans le son, le
germe et la farine [69]. Les particules fines du maïs (<3mm) constituent 5 à 20% de la
masse des cargaisons de maïs et concentrent 26,2 à 69,4% de la FB1. Leur élimination par
tamisage, avant tout autre procédé, pourrait donc constituer une première étape de
décontamination [70]. Par ailleurs, la teneur en FB1 est aussi réduite par le broyage
humide effectué pendant la fabrication des amidons de maïs car cette toxine est
hydrosoluble [71, 72].
19I.1.2.4.4. Traitement biologique
La production d’éthanol au cours de la fermentation par des levures
s’accompagne d’une destruction partielle de la FB1 [73]. La partie non dégradée est
retrouvée dans la « pâte » de fermentation mais rien n’est détecté dans la fraction
alcoolique. Ces donnés sont contradictoires avec celles de Scott et coll. qui précisent que
le maïs concassé parfois utilisé comme complément dans la brasserie, doit être indemne
de fumonisines. En effet, celles-ci ne sont pas suffisamment détruites lors du processus
de fermentation : en 8 jours, la concentration en FB1 ne diminue que de 3 à 28%, suivant
la souche de Saccharomyces cerevisiae employée [74]. Par ailleurs, la fumonisine B1 a déjà
été isolée dans des échantillons de bière à des concentrations comprises entre 2 et 59
ng/ml [56].
I.1.2.4.5. Vieillissement des solutions standard
La FB1 extraite de matériel de culture en vue d’analyse ou destinée à la
réalisation d’intoxications expérimentales est conservée le plus souvent à 4°C, dans le
noir, jusqu’à son utilisation. La stabilité de cette mycotoxine est fonction des solvants
utilisés pour l’extraction et la conservation : mélange acétonitrile - eau (1v :1v) ou
méthanol-eau (3v :1v). Une expérimentation réalisée par Visconti et coll. [75] indique
que la FB1 reste stable dans le mélange acétonitrile - eau durant près de 6 mois quelle
que soit la température : -18, 4, 25°C. En revanche, la FB1 est plutôt instable dans le
méthanol ou il est produit des esters monométhyliques ou diméthyliques [60]. En effet,
5, 35 et 60% de FB1 se décomposent après 6 semaines de stockage aux températures de 4,
25 et 40°C, respectivement. Par contre, cette molécule se conserve bien dans le méthanol
si la température de stockage est maintenue à une valeur de -18°C [75].
I.1.3. Origine
I.1.3.1. Espèces productrices
Le genre Fusarium comporte des espèces capables de produire de nombreuses
mycotoxines dont les plus connues sont les fumonisines, les trichothécènes et la
zéaralénone.
20Les fumonisines peuvent être produites par plusieurs espèces de Fusarium :
F. verticillioides Nirenberg et F. proliferatum Matsushima étant les 2 principales (Tableau
I.1.2). Ces deux espèces sont des contaminants fréquents du maïs et se développent au
champ, avant la récolte (Figure I.1.2) [76, 77].
Figure I.1.2 : Maïs naturellement contaminé [77].
Tableau I.1.2 : Espèces fongiques productrices de fumonisines [43, 78-87].
Fusarium verticillioides Fusarium dlamini
Fusarium proliferatum Fusarium anthophilum
Fusarium polyphialidicum Fusarium napiforme
Fusarium oxysporum Fusarium nygamai
Fusarium beomiforme Fusarium thapsinum
Fusarium subglutinans Fusarium globosum
I.1.3.2. Ecologie et conditions de développement
Le genre Fusarium comprend des espèces pouvant se développer sur différents
substrats et dans différentes conditions. Ces espèces peuvent se rencontrer à l’état
saprophytique dans le sol.
La majorité des espèces de Fusarium se développent sur les grains au champs
car leur croissance requiert des teneurs en eau (TE) supérieures à 22% [59, 88] soit une
activité en eau (aw) comprise entre 0,956 et 0,998 [88-91]. Pour des valeurs d’aw
inférieures à 0,92, la croissance et le métabolisme de ces espèces est considérablement
21ralenti [88] pour être complètement inhibé lorsque l’aw est inférieure à 0,85 [1]. Ce
sont donc des espèces hygrophiles qui ne pourront coloniser secondairement une
denrée correctement séchée.
La température et le pH jouent aussi un rôle important sur la croissance, le
développement et la physiologie des moisissures. Les températures habituellement
rencontrées dans des denrées alimentaires sont comprises entre 0-35°C [92]. Les valeurs
optimales de ces paramètres étant de 25°C à pH=5,5 et à 25°C, pH=7,0 pour la
croissance de F. proliferatum et F. verticillioides respectivement [59, 88, 93].
Si les Fusarium peuvent se développer dans des conditions environnementales
assez larges, la toxinogénèse, elle, nécessite des conditions plus étroites, assez proches
des conditions optimales de croissance de la moisissure.
I.1.3.3. Voie de biosynthèse de la fumonisine B1
La synthèse de la FB1 a été plus particulièrement étudiée par le groupe
d’ApSimon [94]. Toutefois, à l’heure actuelle, les voies de biosynthèse des fumonisines
ne sont pas encore complètement élucidées.
Les fumonisines présentent des similitudes structurales avec le squelette
carboné des sphingolipides, ce qui suggère que les voies de synthèse pourraient être
voisines [95, 96]. Toutefois, une étude a montré que l’incorporation de groupements
acétyles marquées au C14 dans le squelette de la fumonisine s’apparentait plus à la
synthèse d’une polycétone qu’à celle des lipides [97].
I.1.3.4. Facteurs influant sur la toxinogénèse
La production des mycotoxines dépend de facteurs intrinsèques liés au
microorganisme, et de facteurs extrinsèques, correspondant à l’ensemble des facteurs de
l’environnement.
I. 1. 3.4.1. Facteurs intrinsèques
Toutes les espèces fongiques toxinogènes n’ont pas le même potentiel de
production de toxine. La distribution du potentiel toxinogène dépend de l’espèce
fongique considérée et, pour une même espèce, de la région et du substrat d’origine
[59]. Par ailleurs, les capacités de croissance, de développement et de compétition de
l’espèce sur le substrat influeront directement sur la synthèse de mycotoxine
22I.1.3.4.2. Facteurs extrinsèques
a/ Disponibilité en eau
Dans des denrées peu hydratées (comme les céréales, …), la disponibilité en eau
a une influence déterminante. De manière générale, la toxinogénèse n’a lieu que pour
des activités en eau (aw) nettement supérieures à l’aw minimale permettant la croissance;
pour les Fusarium, cette valeur est de 0,85 [1, 59, 92].
b/ Température
La température optimale de toxinogénèse est en général voisine de la
température optimale de croissance, entre 20 – 25°C [93, 98]. Les conditions de
développement du F. verticillioides permettent de comprendre qu’un climat tempéré sera
particulièrement favorable à la production des fumonisines.
c/ Composition gazeuse
La réduction de la pression partielle en oxygène et surtout l’accroissement de la
teneur en CO2 ont un effet dépresseur bien plus important sur la toxinogénèse que sur
la croissance. En ce qui concerne l’influence de ce facteur sur la toxinogénèse, il existe
peu de données bibliographiques fiables concernant les Fusarium.
d/ Nature du substrat
La toxinogénèse dépend beaucoup plus étroitement de la composition chimique
de la denrée que de la croissance. On peut faire systématiquement le classement
suivant, par ordre décroissant en fonction des composants majeurs du substrats :
glucides, lipides et protides. Quoi qu’il en soit, il n’est pas possible d’extrapoler ce
classement, car il peut y avoir des interférences plus ou moins spécifiques entre certains
composés d’origine végétale ou fongique [92].
Une étude comparant les productions de toxines sur milieux liquides et solides
a montré que ce sont les substrats solides qui permettent la plus grande production de
fumonisine B1: 2,9 – 12,5g/Kg de matière sèche (milieux solides) contre 0,04 – 0,59g/L
(milieux liquides) [99].
Outre ces aspects, certains éléments biologiques peuvent interférer de façon
indirecte avec la toxinogénèse. Les prédateurs tels que les insectes et les acariens sont
des vecteurs de spores de moisissures qu’ils introduisent à l’intérieur même du grain
23par les lésions qu’ils créent. Les moisissures trouvent alors des conditions très
favorables à leur développement et à la toxinogénèse. La coexistence d’autres espèces
fongiques (moisissures, levures) ou de bactéries a généralement un effet dépresseur sur
la concentration en toxine du fait de la compétition pour le substrat.
Quant aux agents fongistatiques, dans la mesure où ils sont rationnellement
utilisés comme conservateurs, ils bloquent le développement des moisissures et donc la
production de toxines sans toutefois détruire celles préalablement présentes dans la
denrée [59, 92]. Au champ, les effets des antifongiques sur les Fusarium sont en revanche
parfois très difficle à prédire, nottamment en ce qui concerne la synthèse des
trchothécènes [100].
I.1.4. Niveau de contamination dans les aliments
Le maïs et les produits qui en sont dérivés sont les seuls aliments dans lesquels
des teneurs importantes de fumonisines ont pu être observées. Le tableau I.1.3
récapitule les résultats d'un certain nombre d’études visant à déterminer le niveau de
contamination du maïs et ses sous produits par la FB1. Il en ressort que presque 60% des
5211 échantillons analysés sont contaminés par la FB1. La fréquence de contamination
semble être la plus importante en Amérique du Sud (85% de 266 échantillons) et en
Océanie (82% de 82 échantillons). La fréquence de contamination observée en Europe
reste toutefois élevée avec 53% des 1918 échantillons testés.
Bien entendu, la fréquence et les niveaux de contamination observés dépendent
étroitement de la nature des produits testés. L'incidence la plus élevée a été observée
pour le maïs destiné à l’alimentation animale (82% de 1112 échantillons), mais aussi
pour des produits issus du broyage du maïs grain, tels que la farine, la polenta et la
semoule (73% de 517 échantillons). Les niveaux de contamination rapportés sont
extrêmement variables en fonction de l’origine géographique des échantillons. A titre
d’exemple, les valeurs observées sur des échantillons destinés à l’alimentation animale
varient de 330 à 2 mg/kg. La majorité des échantillons fortement contaminée a été
impliquée dans l’apparition d’intoxication animales aiguës (leucoencéphalomalacie
équine, oedème pulmonaire porcin, …)
24Tableau I.1.3 : Niveau de contamination de FB1 dans le maïs et ses sous-produits [2].
° Comprend des barres céréales, maïs en boîte, maïs congelé, maïs extrudé, pain, biscuit, flocons de céréales, pâtes,
amidon, maïs doux, aliment pour des enfants , gruau, purée, popcorn, tortillas, soupe...
Produits Pays Positif/ total
Niveau de FB1
(mg/kg)
AMERIQUE DU NORD
Maïs Canada, USA 324/729 0,08 - 37,9 Farine de maïs Canada, USA 73/87 0,05 - 6,32 Sous produits de maïs° USA 66/162 0,004 - 1,21 Maïs (pour animaux) USA 586/684 0,1 - 330 AMERIQUE DU SUD
Maïs Argentine, Uruguay, Brésil 126/138 0,17 - 27,05 Farine de maïs, polenta Pérou, Vénézuéla, Uruguay 5/17 0,07 - 0,66 Sous produits de maïs° Uruguay, Méxique 63/77 0,15 - 0,31 Maïs (pour animaux) Brésil, Uruguay 33/34 0,2 - 38,5
EUROPE
Maïs Autriche, Croatie, Hongrie, Italie,
Pologne, Portugal, Roumanie, Espagne, R.U.
248/714 0,01 - 250
Farine de maïs, polenta, semoule Autriche, Bulgarie, Tchèque,
France, Allemagne, Italie, R.U., Pays Bas, Espagne, Suisse,
181/258 0,008 - 16
Sous produits de maïs° Tchèque, France, Allemagne,
Italie, Pays Bas, Espagne, Suède, Suisse, R.U.
167/437 0,008 - 6,10
Maïs importé, farine Pays Bas, Suisse 143/165 0,01 - 3,35
Maïs (pour animaux) France, Italie, Espagne, Suisse, R.U. 271/344 0,02 - 70
AFRIQUE
Maïs Bénin, Kenya, Malawi, Zambie, Mozambique, Afrique du Sud,
Tanzanie, Ouganda, Zimbabwe 199/260 0,02 - 117,5
Farine de maïs Botswana, Egypte, Kenya, Afrique du Sud, Zambie,
Zimbabwe 73/90 0,05 - 3,63
Sous produits de maïs° Botswana, Afrique du Sud 8/17 0,03 - 0,35 Maïs (pour animaux) Afrique du Sud 16/16 0,47 – 8,85
ASIE
Maïs Australie, Chine, Indonésie, Népal, Philippines, Thaïlande, Vietnam 361/614 0,01 - 155
Farine de maïs China, Inde, Japon, Nouvelle-Zélande, Thaïlande, Vietnam 44/53 0,06 - 2,60
Sous produits de maïs° Japon, Taiwan 52/199 0,07 - 2,39 Maïs (pour animaux) Corée, Thaïlande 10/34 0,05 - 1,59 OCEAN
Maïs Australie 67/70 0,3 - 40,6 Farine de maïs Nouvelle Zélande 0/12 -
25Plus rarement, quelques enquêtes ont aussi pu rapporter la présence de
fumonisines dans d’autres denrées alimentaires comme le riz [101], les asperges [102] et
le sorgho [103]. Par contre, aucune contamination par ces mycotoxines n’a à ce jour été
observée sur les autres céréales comme le blé, le seigle, l'orge et l'avoine [104].
De l’ensemble de ces données, il ressort que la contamination par les fumonisines
du maïs et des produits qui en sont dérivés est fréquente, quel que soit le pays concerné.
Les niveaux de contamination observés sont parfois très élevés et responsables
d’intoxications animales aiguës.
26I.2. Mycotoxicoses
Les fumonisines sont responsables de différentes pathologies animales et
suspectées être responsables de la prévalence anormalement élevée de cancer de
l’oesophage humain observée dans certaines régions. Une des caractéristiques de ces
toxines est qu’il existe une très grande variabilité de sensibilité en fonction des espèces
animales. De plus, pour les espèces sensibles, la nature des troubles observés est
souvent très différente en fonction de l’espèce mais aussi de la dose de toxine ingérée et
du mode d’exposition. Nous allons maintenant décrire l’impact des fumonisines sur la
santé animale et humaine en distinguant les espèces en fonction de leur sensibilité à ces
molécules.
I.2.1. Espèces très sensibles
I.2.1.1. Les équidés
Les équidés (chevaux, mulets, ânes, poneys) sont apparemment les animaux les
plus sensibles aux fumonisines puisque des troubles peuvent apparaître après
l’ingestion d’aliment contaminé par des concentrations de l’ordre de 5 mg de FB1/kg
d’aliment [105]. On connaît à l’heure actuelle trois types d’affections pouvant être
associés à la consommation de maïs ou de ses sous-produits contaminés des
fumonisines. En fonction de la dose ingérée, l’animal pourra présenter des troubles
nerveux (leucoencéphalomalacie équine), hépatiques (hépatotoxicose) ou un syndrome
duodénite - jéjunite proximale.
I.2.1.1.1. La leucoencéphalomalacie équine (LEM)
La LEM a été décrite pour la première fois aux Etats-Unis en 1850 [106] puis en
Afrique du Sud [107]. Depuis, des cas ont été observés partout dans le monde y compris
dans le Sud-Ouest de la France [23].
Il s’agit d’une maladie d’évolution toujours mortelle se traduisant, au plan
lésionnel, par une liquéfaction de la substance blanche de l’encéphale [108]. La LEM
semble être une pathologie spécifique des équidés même si des troubles nerveux ont
aussi pu être rapporté chez le lapin [109], les porcs [110] et les carpes [111] exposés aux
fumonisines.
27
Figure I.2.1 : Hémisphère célébral gauche,
coupe transversale. Une zone de
dégénérescence et d'œdème (>) entoure
une cavitation(�) de la substance blanche
[23].
Il semble que la voie d’administration et le débit de dose soient des facteurs
importants dans l’apparition de la LEM. En effet, une étude réalisée en 1988 par
Marasas et coll. a montré que la distribution orale de 20 doses comprises entre 1 et 4
mg de FB1/kg de poids vif (PV), réparties sur 29 jours permet de reproduire la LEM.
De même, l’administration par voie veineuse de 6 doses de 0,125 mg de FB1/kg PV,
réparties sur 7 jours est suffisante pour déclencher l’apparition de cette maladie [7].
Une expérimentation menée par Wilson et coll. chez les poneys recevant du
maïs concassé naturellement contaminé par la FB1, a permis de montrer qu’une dose
de 22 mg de FB1/kg d’aliment pendant 55 jours entraîne l’apparition des troubles
[112]. Dans une autre étude, l’administration à des chevaux de 15 mg de FB1/kg
d’aliment pendant 150 jours (soit de 0,3 mg de FB1/kg PV/jour) n’a pas eu de
conséquence clinique [2]. Ce résultat a été confirmé chez des poneys ayant reçu du
maïs concassé naturellement contaminé par 15 mg de FB1/kg d’aliment [15].
La dose minimale de fumonisine capable d’entraîner des troubles après
ingestion par voie orale est donc encore inconnue à l’heure actuelle. Par contre, des
intoxications expérimentales réalisées avec de la FB1 pure ont montré que
l’administration par voie veineuse de 0,01 à 0,05 mg de FB1/kg PV/jour entraîne
l’apparition de lésions cérébrales [201].
Compte tenu de ces données, et des cas de LEM décrits après ingestion de
maïs naturellement contaminé, Shephard et coll. conseillent une teneur maximale
tolérable de 5 mg de FB1/kg d’aliment destiné aux équidés afin d’éviter les risques de
LEM [35].
Concernant la FB2 et la FB3, Ross et coll. ont montré qu’une ration contenant
du matériel de culture de F. proliferatum (M6290 et M6104) contaminé essentiellement
28
par la FB2 à 75 mg/kg a entraîné, après 150 jours d’administration, l’apparition d’une
LEM associée à des lésions d’hépatite chez des poneys. Par contre, un aliment
contenant essentiellement de la FB3 à 75 mg/kg n’a eu aucun effet [113].
La nature et l’intensité des symptômes observés sont très variables et il ne
semble pas y avoir de relation directe entre l’importance des signes cliniques et celle
des lésions cérébrales. Le tableau clinique est dominé par des troubles nerveux :
hyperesthésie, hyperexcitabilité, ataxie, amaurose, marche en cercle, pousser au mur
[11]. Une dépression, des paralysies, de l’ictère sont aussi rapportés [114, 115].
Parfois, l’animal refuse de se déplacer et tombe en décubitus latéral. La mort peut
être soudaine ou précédée de convulsions, de mouvements de pédalage ou d’un état
comateux. Dans tous les cas, la mort semble inévitable et survient quelques heures à
quelques jours après le début des troubles [23, 112-119].
A l’autopsie, on note principalement des foyers de liquéfaction de la
substance blanche, un encéphale globalement œdémacié et présentant des zones
jaunâtres et fluctuantes, des hémorragies périvasculaires et une démyélinisation
diffuse [118].
Une forme plus difficile à détecter, car plus discrète sur le plan
symptomatique, a également été décrite : l’hépatotoxicose.
I.2.1.1.2. L’hépatotoxicose
Il s’agit aussi d’une maladie d’évolution fatale, liée à la consommation de
fortes doses de FB1, tandis que des doses inférieures seraient à l’origine de la LEM. La
limite entre l’hépatotoxicose et la LEM n’est pas nette. En effet, l’hépatotoxicose
s’accompagne de lésions du système nerveux et nous venons de voir que la LEM
s’accompagne de modifications hépatiques [118].
Expérimentalement, l’hépatotoxicose a été décrite après administration de
doses élevées de FB1 (6 doses de 2,5 mg de FB1/kg PV/jour, pendant 7 jours par voie
orale). Dès le huitième jour, la jument intoxiquée présentait une apathie, une
faiblesse, de l’anorexie, une constipation et un ictère [7]. A l’autopsie, on constate
principalement un ictère généralisé, un foie remanié et un encéphale œdémacié [7].
Dans une autre étude, une nécrose hépatique et une encélopathie légère sont
observée chez les poneys recevant 44 mg de FB1/kg d’aliment pendant 9- 45 jours
29
tandis qu’une nécrose hépatique accompagnée de LEM est retrouvée chez les
animaux traités à la dose plus forte, 88 mg de FB1/kg d’aliment pendant 75-78 jours
par voie orale [39].
Une dernière manifestation clinique de l’intoxication des équidés par les
fumonisines a été décrite : le syndrome duodénite/jéjunite proximale.
I.2.1.1.3. Syndrome duodénite/jéjunite proximale
Le syndrome duodénite/jéjunite proximale (DJP) est un syndrome
caractérisé par une dépression, associé à un reflux gastrique important, parfois
hémorragique [120]. A l’autopsie, les lésions sont limitées au duodénum et au
jéjunum proximal. Les séreuses et les muqueuses sont rouges, avec des pétéchies et
des ecchymoses [121]. La maladie ne présente aucun caractère infectieux et les
analyses n’ont jamais révélé d’agent pathogène. Cependant, Schumacher et coll. ont
tenté de reproduire la maladie expérimentalement mais les résultats ne permettent
pas de conclure à la responsabilité unique de la FB1 [120].
I.2.1.2. Les suidés
Le porc est particulièrement sensible aux fumonisines [8, 122, 123]. Les
organes cibles sont le poumon, le foie, le pancréas, le rein et le cœur [9, 41, 122, 124-
127]. Dans cette espèce, la FB1 est impliquée dans deux syndromes : l’œdème
pulmonaire porcin et l’hépatotoxicose.
I.2.1.2.1. L’œdème pulmonaire porcin
L’œdème pulmonaire porcin est un syndrome fréquemment rencontré aux
Etats-Unis [9, 41, 42]. Il fut reproduit expérimentalement pour la première fois en
1981, par Kriek et coll. [128]. Par la suite, les observations sur le terrain et d’autres
expérimentations ont confirmé l’implication de la FB1.
Figure I.2.2 : Poumon d’un porc ayant reçu
une ration contenant 32 mg de FB1/kg d’aliment
pendant 4 jours et présentant des signes
d’oedème pulmonaire [125].
30Les symptômes de l’œdème pulmonaire porcin ont été reproduits
expérimentalement chez des porcs après administration intra-veineuse de 0,4 mg/kg
PV de FB1 et de FB2 pendant 4 jours [41, 122], et chez les porcelets sevrés, après
ingestion de matériel de culture contenant 10 mg de FB1 /kg (équivalents à 0.4
mg/kg PV/jour) pendant 4 semaines [129]. La dose minimale de FB1 permettant de
reproduire l’œdème pulmonaire porcin se situe donc aux alentours de 4,2 - 5 mg de
FB1/kg d’aliment/jour pendant 14 jours [130, 131]. L’administration de plus fortes
doses de toxines semble raccourcir le temps nécessaire à l’apparition des symptômes
[9]. Toutefois, il existe aussi quelques études contradictoires puisque Guzman et coll.,
n’ont observés aucune anomalie chez des porcs ayant reçu 70-140 mg de matériel de
culture de FB1/kg d’aliment pendant 9 mois [132].
Après un temps de latence de 2 à 10 jours, caractérisé seulement par une
baisse de la consommation, l’animal présente des troubles respiratoires d’intensité
croissante. On peut observer une tachypnée, avec dyspnée et respiration abdominale,
ainsi qu’une importante léthargie. La peau, la sclère et les muqueuses sont cyanosées.
Des râles humides sont parfois audibles. La mort survient en quelques jours, après
une phase de décubitus [9, 125, 130].
A l’ouverture de la cage thoracique, un liquide clair, jaune pâle est observé
(200 à 520ml). Il coagule rapidement lorsqu’il reste exposé à l’air [133]. Les poumons
sont lourds, non collabés, et du liquide s’écoule à la coupe. L’œdème pulmonaire est
surtout interstitiel et interlobulaire. Il y a peu d’exsudat et de mousse dans les
bronchioles, les bronches et la trachée. Un œdème pleural peut être présent. Le foie et
les reins peuvent présenter des foyers de nécrose [125, 130].
A l’examen microscopique, le tissu pulmonaire interlobulaire et
périvasculaire est oedémacié. Le liquide thoracique ne contient ni érythrocytes, ni
cellules inflammatoires [9, 134]. Par ailleurs, la structure du lobule hépatique est
désorganisée. Certains hépatocytes sont nécrosés, présentant une caryolyse et une
hyperéosinophilie du cytoplasme. Quelques figures de mitose sont visibles [130].
L’œdème pulmonaire pourrait insulter d’une atteinte cardiaque. En effet, il a
été montré que la fumonisine réduit l'efficacité mécanique du ventricule gauche
[135]. Les parois des chambres cardiaques serait plus flaccides [133] ce qui suggère
que l’œdème pulmonaire porcin est secondaire à la défaillance aiguë du coeur
gauche [124, 135, 136]. Pour éviter l’œdème pulmonaire porcin, Shephard et coll.
31préconisent des taux de fumonisines inférieurs à 10 mg/kg d’aliment destiné aux
porcs [35].
A côté de cette forme clinique d’intoxication des suidés par les fumonisines,
une hépatotoxicose plus ou moins intense peut également être observée.
I.2.1.2.2. L’hépatotoxicose
L’atteinte hépatique des porcins est observée lors d’exposition à de plus
faibles doses de FB1 que l’œdème pulmonaire [122, 125, 130]. En effet, en dessous de
4 mg de FB1/kg PV/jour et par voie orale, seules des lésions hépatiques sans
répercussion clinique sont observées [125, 130]. Entre 4,5 et 6,3 mg de FB1/kg
PV/jour, des cas d’oedème pulmonaire et d’hépatotoxicose clinique sont mentionnés
[122, 130]. Au-delà, seul l’œdème pulmonaire est observé [125].
Les signes cliniques de l’hépatotoxicose peuvent être frustes, dominés par
une perte de poids, de l’inappétence pouvant conduire à de la cachexie, de la
dépression. Un ictère d’intensité variable a aussi été rapporté [125].
A l'examen nécrosique, le foie est souvent brun, lisse et présente des
nodules ; sa structure interne est également modifiée. Les reins présentent une
nécrose tubulaire corticale. On note des troubles de la kératinisation sur le tube
digestif (parakératose et hyperkératose de la muqueuse œsophagienne) [122, 125,
137].
Une étude a également montré que, outre les poumons et le foie, la
vascularisation cardiaque et pulmonaire est modifiée par la FB1 [138].
I.2.1.2.3. Les autres effets de la FB1 chez le porc
L’administration d’un aliment contenant 300 mg de FB1/kg d’aliment a des
truies gestantes a entraîné l’apparition de malformations foetales [139].
Une ingestion de faibles doses de cette toxine augmenterait la sensibilité des
porcelets à l’infection par des souches pathogènes d’E. coli [140] et diminuerait le
taux d’anticorps anti-Mycoplasma agalactiae des animaux [141]. Le blocage in vivo de
la prolifération lymphocytaire pourrait empêcher la mise en place d’une immunité
spécifique et expliquer la plus grande sensibilité des animaux aux infections
concomitantes. Il pourrait aussi entraîner des échecs de vaccination dus à l’absence
de mis en place d’une immunité protectrice.
32I.2.1.3. Les autres espèces sensibles
Chez le lapin, Bucci et coll. [109] ont montré que la FB1 provoque des lésions
qui rapellent la leucoencéphalomalacie. Certains animaux sont morts après avoir été
traités plusieurs jours avec une dose de 1,75 mg/kg PV. De plus, des lésions
hépatiques et rénales ont été observées. Gumprecht et coll. [142] ont montré que par
voie intraveineuse, la FB1 est néphrotoxique dans cette espèce animale.
Des études ont été effectuées sur les poissons-chats, mettant en évidence une
toxicité sur les poissons de 1 à 2 ans dès la dose de 20 mg de FB1/ kg d’aliment [143,
144].
I.2.2. Espèces peu sensibles
I.2.2.1. Les volailles
L’étude des effets de la FB1 chez les volailles est d’autant plus importante que
leur alimentation contient en général une proportion importante de maïs. Diverses
affections des volailles ont été associées à la consommation de maïs contaminé par F.
verticillioides ou F. proliferatum : baisse des performances, refus de s’alimenter,
faiblesse, diarrhée, mortalité. Des cas de mortalité dus à la consommation de grains
contaminés par F. verticillioides ont aussi été rapportés chez des oiseaux sauvages
[16]. Toutes ces pathologies ne sont sans doute pas imputables aux seules
fumonisines. En effet, les études expérimentales montrent que leur impact sur la
production aviaire apparaît le plus souvent limité à une altération de la croissance.
I.2.2.1.1. Ralentissement de la croissance
La distribution à des poussins d'une ration contenant 10 à 300 ppm de FBl
entraîne une baisse de l'indice de consommation alimentaire, et une diminution du
poids moyen [17, 51, 52, 145-148]. Certains animaux apparaissent rachitiques et
présentent une diarrhée noirâtre et collante qui serait due à une diminution de la
digestibilité de la matière sèche de la ration [51, 145, 147]. La FB1 a aussi un impact
sur le poids relatif des organes comme le foie, le rein, la rate, le proventricule, le cœur
et le gésier [17, 51, 52, 146, 148] (Tableau I.2.2). Cependant, ces résultats ne sont pas
observés dans les études menées par Li et coll. [149] ainsi que Henry et coll. [150].
33Tableau I.2.2 : Effets de la FB1 chez les volailles.
Espèce, âge Dose Durée de
l’exposition Symptômes et lésions Références
Coquelets de
1 jour 8,5 ppm 15 jours
Diarrhée collante noire ; réduction de
poids vif [147]
Poussins de
1 jours
100, 300,
375, 450 et
525 ppm
14, 19, 21 et
28 jours
Réduction de poids vif et de gain
moyen quotidien; augmentation du
poids relatif du foie, du rein de la rate,
des proventricules ; prolifération des
hépatocytes et hyperplasie ; réduction
de la vitamine A sérique ; aucune
atteinte du squelette
[17, 51, 52,
146, 148, 151]
Poussins de
2 ou 1 jours
10, 40 et 80
mg FB1
pure/kg
6 ou 21 jours
Augmentation du poids relatif du foie
et de la rate ; réduction de la matière
grasse du foie
[145, 150]
Poussins de
7 jours
25 et 50
ppm 7 semaines
Réduction du poids relatif des
proventricules [152]
Poulets de
21 jours
100 et 200
ppm
60, 120 et 180
min
Diminution de la capacité d’élimination
d’E.coli du système circulaire [149]
Poules
pondeuses
de 21 et 72
semaines
8, 16, 100 et
200ppm
30, 112 et 420
jours
Diarrhée ; foies agrandis, friables et
pâles ; réduction de la production des
œufs pendant le premier cycle de 28
jours ; réduction du poids du rein
[147, 153]
Dindons de
7 jours
25 et 50
ppm 14 semaines
Réduction de la consommation
quotidienne [152]
Dindes de 1
jour
25, 50, 100,
175, 200,
300, 325,
400 et 475
ppm
21 – 28 jours
Réduction du gain moyen quotidien et
du poids relatif de la rate ;
augmentation du poids relatif du foie,
du pancréas, du gésier et des
proventricules ; augmentation de
l’hémoglobine et des hématocrites ;
hyperplasie biliaire ; hyperplasie et
hypertrophie des hépatocytes ;
diminution du taux en anticorps
[16, 154-158]
Caille
pondeuse de
5 semaines
0 et 10 ppm 84 – 140 jours
Réduction de la consommation, de la
production et du poids des œufs, et du
poids vif
[159]
34
Caneton
Pékin de 1
jour
100, 200,
400 ppm 21 jours
Réduction de la consommation et du
gain moyen quotidien ; augmentation
du poids absolu du foie, du cœur, du
rein, du pancréas et des proventricules ;
hyperplasie hépatocystique et biliaire ;
foie brun foncé
[160]
L'examen nécrosique des animaux exposés à de fortes teneurs en toxine
révèle, en général, une atteinte hépatique, digestive et thymique. Les poids du foie,
du gésier et du proventricule sont anormalement élevés. Le foie est parsemé de
foyers de nécrose de taille constante mais dont le nombre augmente avec la dose.
L'épithélium biliaire est hyperplasié. Le cartilage de croissance des épiphyses tibiales
est plus épais chez les individus exposés aux plus fortes doses de FB1 (300-400 ppm).
Le cortex thymique est plus fin, et des modifications morphologiques et
fonctionnelles des macrophages sont observées in vitro [161]. In vivo, une baisse de
la teneur en l'immunoglobulines G plasmatiques est également décrite [162] et la
capacité d’élimination de bactéries comme Escherichia coli est diminué chez des
poulets ingérant une ration contenant 200 mg FB1/kg d’aliment pendant 21 jours
[149].
Lors d’expositions chroniques, le poids moyen et l’indice de consommation
alimentaire des poulets et des poules pondeuses ne sont pas affectés par la
consommation d’une ration contenant 50 mg de FB1/kg d’aliment pendant 49 jours
de traitement et 200 mg de FB1/kg d’aliment pendant 15 cycles de 28 jours (soit 420
jours) [152, 153]. A l’autopsie, aucun effet de la FB1 sur le poids relatif des organes
comme le foie, les reins, le cœur, le pancréas, la rate, le gésier et la bourse de
Fabricius et aucune lésion ne sont observés [152].
Par contre, une diminution de la ponte et du poids des œufs a été rapportée
[147, 153]. De plus, la mortalité des poules pondeuses augmente de façon
significative lors d’ingestion de 200 mg de FB1/kg d’aliment pendant 420 jours [153].
Comme chez les poulets, l’administration à des dindes de 25 à 475 mg de
FB1/kg d’aliment pendant 21 à 28 jours entraîne une réduction du gain moyen
quotidien et une augmentation du poids relatif du foie, du pancréas, du gésier et des
proventricules [16, 154-157]. Une diminution du taux d’anticorps spécifiques a
également été observée chez des dindes vaccinées contre le virus de Newcastle et
35nourries pendant 4 semaines avec un aliment contaminé par 200 mg FB1/kg
d’aliment [158].
Chez la caille, un effet de la FB1 sur la consommation alimentaire, le poids
vif, la production et le poids des œufs a été mis en évidence par Ogido et coll. après
administration aux animaux d’une dose de 10 mg/kg d’aliment pendant 84-140 jours
[159]. Cependant, ces résultats n’ont pas été retrouvés chez des cailles recevant 17,7
mg/kg d’aliment pendant 8 à 12 semaines [163].
Chez des canetons, une consommation de 0,575 – 1,145 mg FB1/kg d’aliment
pendant 2 jours n’a entraîné aucune mortalité [164]. Dans une autre étude réalisée
chez les canetons âgés d’1 jour recevant de 100 - 400 mg de FB1/kg d’aliment, une
réduction de la consommation et du gain moyen quotidien a été observée après 21
jours de traitement. A l’autopsie, une augmentation du poids du foie, du cœur, du
rein, du pancréas et des proventricules a été notée ainsi qu’une hyperplasie
hépatocystique et biliaire [160].
Par conséquent, quelle que soit l’espèce concernée, les volailles semblent
beaucoup plus résistantes aux fumonisines que les équidés et les porcs. L’impact des
toxines ne se traduit dans ces espèces que par une diminution des performances
zootechniques sans apparition de signe clinique nettement marqué.
Différentes études in ovo ont été réalisées afin de déterminer
d’embryotoxicité de la FB1.
I.2.2.1.2. Embryolétalité et embryotoxicité
La mortalité des embryons dépend de la dose de FB1 inoculée dans l'oeuf et,
de l'âge de l'embryon (Tableau I.2.1) [165]. Ainsi, la FB1 apparaît comme
potentiellement embryotoxique et tératogène chez les volailles. Toutefois, son
administration par voie intraveineuse n'entraînant pas l'apparition de résidus dans
les oeufs [166, 167], ces effets ne s’expriment sans doute pas dans les conditions
naturelles. Ils posent en revanche un problème en toxicologie pour l'évaluation du
risque chez l’homme. Ces aspects seront précisés ultérieurement lors de l'étude des
effets des fumonisines sur les rongeurs de laboratoire.
36Tableau I.2.1: Action embryolétale de la FB1 chez les volailles [165]
Jour d’incubation Mortalité cumulative au jour 18
d’incubation FB1 injectée
(10µl/œuf)
(soit en µg)
Nombre
des œufs
injectés 7 10 14 18 Nombre des morts /total %
Nombre des embryons morts
Témoin : 0
Percé : 0
Solvant : 0
2
4
8
16
32
64
40
40
40
40
40
40
40
40
40
0
0
0
4
5
5
10
11
15
0
0
1
0
0
3
7
14
19
2
0
1
1
2
0
3
2
6
0
0
0
0
0
0
1
4
…
2/40
0/40
2/40
5/40
7/40
8/40
21/40
31/40
40/40
5,0
0,0
5,0
12,5
17,5
20,0
52,5
77,5
100
I.2.2.2. Les ruminants
Il semblerait que les bovins soient moins sensibles aux fumonisines que les
autres animaux. En effet, des expérimentations réalisées par Osweiler et coll. ont
montré que des teneurs en fumonisines allant jusqu’à 148mg/kg d’aliment, ne
modifiaient pas le gain moyen quotidien [168]. Seuls quelques paramètres
biochimiques comme l’ASAT, la GGT, la LDH, la bilirubine et le cholestérol sont
augmenté chez deux veaux ayant absorbé 148 mg/kg d’aliment. De légères lésions
au niveau du foie ont pu être observées à l’autopsie [168]. Les vaches laitières
pourraient être plus sensibles aux fumonisines que les bovins de boucherie, peut-être
en raison du stress associé aux méthodes de production. En effet, des bovins laitiers
(Holstein et Jersey) recevant des rations contenant 100 ppm de fumonisine pendant 7
jours environ avant la mise bas et pendant les 70 jours suivants ont montré une
diminution de leur production lactée (6 kg/vache/jour), ce qui s’explique
principalement par une diminution associée de leur consommation alimentaire. Une
élévation de la concentration sérique de certaines enzymes pouvait évoquer une
affection hépatique [169].
37Comme c’est le cas pour les bovins, les études menées chez les ovins
confirment la grande résistance aux fumonisine des ruminants par rapport aux
mammifères monogastriques [170].
I.2.3. Pouvoir carcinogène
Les propriétés carcinogènes de la FB1 ont été mises en évidence chez le rat
mais n’ont pas encore été démontrées chez d’autres espèces même si des exposition
chroniques de porcs à de fortes doses de FB1 ont entraîné l’apparition de nodules
d’hyperplasie hépatique [137]. La caractérisation du pouvoir cancérigène des
fumonisines est très importante dans le cadre de l’élaboration de normes visant à
déterminer les limites maximales tolérables en toxine dans l’alimentation humaine.
I.2.3.1. Rongeurs
Le rat a permis de mettre en évidence les propriétés cytotoxiques et
cancérigènes de la FB1.
Une intoxication de courte durée (4 jours à 4 semaines) entraîne
principalement une hépatotoxicité avec cirrhose (hyperplasie hépatocellulaire) et
prolifération des canaux biliaires et une néphrotoxicité avec des images
d’autophagocytose et de dégénérescence cellulaire dans le cortex dès 15 mg FB1/kg
d’aliment [171]. Cependant, on note aussi une fœtotoxicité et une atteinte du thymus
pour une intoxication par 60 mg FB1/kg poids vif par voie orale [172].
Après une exposition de longue durée (50 mg FB1/kg d’aliment, 150 jours à 2
ans) diverses équipes ont noté la formation de carcinomes hépatocellulaires, de
cirrhose, d’adénofibrose, de nodules néoplasiques et de cholangiocarcinome [45, 49,
173]. Apres une exposition de 2 ans, des lésions de carcinome stomacal et une
hyperplasie des cellules basales de l’œsophage sont rapportées [174]. C’est
Gelderblom qui établit la responsabilité de la FB1 dans ces phénomènes cancéreux
en 1991 [175].
Lors d’exposition intermédiaire (44 à 78 jours à 50 mg FB1/kg d’aliment), on
note l’apparition d’une thrombose intraventriculaire [108], et une
hypercholestérolémie [176, 177].
38I.2.3.2. Homme
Dans l’espèce humaine, les fumonisines pourraient être impliquées dans
certains cancers de l’œsophage [4, 178].
I.2.3.2.1. En Afrique du Sud, dans le Transkei
Plusieurs études ont indiqué une prévalence très élevée de cancer de
l’œsophage dans la population noire du Transkei, en Afrique du Sud. Le taux de
cancer atteint des proportions de 50 à 200 pour 100 000 personnes [36, 53, 179, 180].
Le maïs, bien que fréquemment moisi, y constitue un aliment de base (jusqu’à 100%
des calories). Les épis les plus altérés sont même utilisés pour la fabrication de
boissons fermentées, comme la bière. Des analyses mycologiques portant sur
différents échantillons révèlent une contamination par F. verticillioides
significativement plus élevée dans les régions à fort taux de cancer de l’oesophage
que dans les régions à faible taux (P<0,01) [54]. Les concentrations mesurées en FB1 et
FB2 sont significativement plus fortes dans les échantillons issus de zones à forte
proportion de cancer (jusqu’à 118 mg de FB1 [53] et 30 mg de FB1/litre de bière [2]).
I.2.3.2.2. En Chine
Des observations du même type ont également été rapportées en Chine, où la
prévalence de F. verticillioides est 2 fois plus forte dans les régions « à cancer » (Lixian
et Cixian, dans la province du Henan) que dans les autres [181-183]. Des enquêtes ont
ensuite montré que les échantillons de maïs en provenance de Lixian et Cixian
contiennent un niveau souvent élevé de FB1 (18 – 155 mg/kg) [182]. Ces résultats ont
permis de montrer l’existence d’une relation entre la prévalence du cancer de
l’œsophage et l’exposition de la population à la FB1.
Une autre investigation, menée de 1997 à 2000, sur le cancer primaire du foie
en Chine, a montré l’existence d’une différence significative (P<0,01) entre le niveau
de FB1 présent dans le maïs contaminé en provenance des régions à fort taux (0,14 à
34,9 mg/kg à Henan) par rapport au niveau observé dans les échantillons provenant
de zones à faible taux (0,08 à 15,1 mg/kg à Penlai) [183].
I.2.3.2.4. En Italie du nord
En 1990, la province de Pordenone dans le nord de l’Italie a présenté le taux
de mortalité par cancer le plus élevée d’Italie, et même d’Europe en ce qui concerne
39le cancer de l’œsophage (68 cas), le cancer de la cavité buccale (179 cas) et le cancer
du pharynx (170 cas) [184].
Dans cette région, la plupart du maïs est produit et consommé localement.
Les souches de Fusarium produisant les fumonisines ont pu être isolées sur ce maïs et
de la FB1 a pu être retrouvées dans les produits alimentaires qui en était issus (0,15 à
3,76 mg de FB1 /kg) [85, 185].
En conclusion, chez les mammifères monogastriques, les fumonisines sont
toxiques et responsables d’affections variées en fonction des espèces. Elles sont
responsables de la leucoencéphalomalacie des équidés et de l’œdème pulmonaire
porcin, elles sont considérées comme carcinogènes chez le rat et suspectées de jouer
un rôle dans l’apparition de certains cancers chez l’homme. Dans plusieurs espèces,
une toxicité hépatique et rénale a également été observée.
Les oiseaux sont plus résistants et les nombreuses études qui y ont été
consacrés ne rapportent, le plus souvent qu’une réduction du poids vif et une
altération de l’indice de consommation alimentaire.
Les ruminants sont, quant à eux considérés comme résistants aux
fumonisines.
40I.3. Cinétique et mécanisme d’action de la fumonisine B1
I.3.1. Toxicocinétique
I.3.1.1. Absorption
Lors d’administration par voie orale chez le rat, la fumonisine B1 est très
rapidement absorbée avec cependant une absorption plus importante des formes
hydrolysées de FB1. L’absorption maximale est atteinte 1,02h après l’administration
par voie orale et 20 minutes après l’administration intra-péritonéale (Figure
I.3.1A&B) [186].
Figure I.3.1 : Variation de la concentration sérique de la FB1 en fonction du temps A : après
administration par voie IP. Chaque point représente la moyenne de la détermination chez les deux
rats. B : Concentration sérique de la FB1 après une administration par voie IV de 2 mg/kg (■) ou par
vo de 10 mg/kg (□). Les données représentent la moyenne ± SE chez les 8 rats [186].
La quantité de FB1 mesurée dans le plasma après une administration par voie
orale chez le porc [187], la poule pondeuse [166], le singe [188], la vache [189], le rat
[190] et le canard [191] est très faible.
Chez le canard, la biodisponibilité est de 2,27 – 3,75% [191]. De même, le
passage dans la circulation générale ne représenterait que 2 à 4% de la dose de 14C-
FB1 administrée chez rat [186] le singe [188], et le porc [187]. Chez la poule pondeuse,
l’absorption mesurée est inférieure à 1% de la dose totale administrée [166] (Tableau
I.3.1).
Con
cent
ratio
nde
laFB
1(µ
g/m
l)
Con
cent
ratio
nde
laFB
1(µ
g/m
l)
Durée (min) Durée (heures)
A B
41Tableau I.3.1 : Absorption de la FB1.
Espèce Voie Méthode Tmax Cmax Biodisponibilité Ref.
VO 160 mg/kg PV 2h 0,5 µg/ml 2,7 – 3,75 %
CANARD IP 10 mg/kg PV 30 min
31,2 µg/ml
-
[191]
POULE VO
1,28 µCi/kg
(14C- FB1)
(2mg FB1/kg)
1,5-2,5 h
40-145dpm/ml
soit 28-
103ng/ml
0,71% [166]
VO
14C-FB1
14C-HFB1
14C- FB1-fructose
0,69µmol/kgPV
Non défini Non définie
Absorption
supérieure des
formes
hydrolysées
[192]
VO 10mg FB1/kg PV 1,02 h 0,18µg/ml 3,5% [186]
VO 7,5mgFB2/kg PV Non défini Non détectée
Négligeable
(0,2% de la dose
retrouvée dans
les urines
IP 7,5mg FB2/kg PV 20 min 3,5µg/ml
[193]
RAT
IP 7,5mg FB1/kg PV 20 min 8,6µg/ml [190]
PORC VO 0,5mg FB1/kg
(0,35µCi) 1,10h 33ng/ml 4% [187]
VACHE VO 1 et 5 mg FB1/kg
PV Non défini Non détectée négligeable [189]
VO
321kBq (14C- FB1)
6,42mg FB1/kg
PV
1-2 h 210ng/ml 2% [188]
SINGE
VO 7,5mgFB2/kg PV 3-5 h 25-
40ng/ml < 2% [194]
La faible biodisponibilité observées chez les ruminant pourrait être due à un
métabolisme ruminal puisque 60 à 90% de la FB1 retrouvée dans les fécès est
hydrolysée contrairement aux monogastriques chez lesquels la forme majoritaire est
la molécule mère [189, 195].
42Il n’existe aucune donnée disponible sur l’absorption de FB1 par voie
pulmonaire ou cutanée. Cependant, puisque la FB1 est présente dans les cellules de F.
verticillioides (mycélium, spores et conidiospore), il pourrait exister un risque
d’absorption par inhalation. Le risque d’une absorption cutanée semble, quant à lui,
très faible, puisque la FB1 est hydrosoluble et que les composés polaires ne traversent
pas la barrière tégumentaire [2].
I.3.1.2. Distribution
Lors d’une administration par voie orale chez le rat et le porc, la FB1 est
retrouvée dans la plupart des tissus notamment le foie et les reins [187, 196, 197]. En
règle générale, le foie contient plus de FB1 que les reins, cependant une étude menée
par Norred et coll. montre le contraire [196].
Chez le canard, on trouve que la FB1 est présente dans les foie en quantité 20
à 40% fois plus important que dans les muscles [191].
Chez la rate gestante [198], 1 heure après l’administration d’une dose de 14C-
FB1 par voie IV, 14,5% et 4% de la dose administrée sont retrouvés respectivement
dans le foie et les reins. On en retrouve cependant seulement de 0,24% à 0,44% dans
l’utérus, de 0 à 0,04% dans le placenta et moins de 0,015% dans le fœtus lui-même.
D’autres études ont corroboré l’idée qu’il n’existe qu’un faible transfert de la FB1 par
la barrière placentaire chez le rat [199, 200] et le lapin [201].
Chez le porc (Tableau I.3.2), on retrouve aussi de faibles concentrations dans
les poumons, la rate et les muscles squelettiques. L’accumulation tissulaire de la FB1
est notée tant qu’elle n’est pas retirée du régime alimentaire de l’animal et on estime
à 2 semaines le temps nécessaire à la disparition de la FB1 du foie et des reins [202,
203].
Ce schéma de distribution est aussi applicable à la poule pondeuse [166] aux
primates [188] et aux vaches [189]. Cependant la faible biodisponibilité chez ces
dernières implique une très faible distribution tissulaire. Elle se limite à quelques
traces détectées dans les tissus précités. Aucun résidu n’est retrouvé dans les œufs et
de faibles traces sont détectées dans le lait de vaches [195].
43Tableau I.3.2 : Distribution et excrétion de la FB1.
Espèce Voie Dose administrée Distribution Ref.
CANARD IP 10 mg/kg PV
Foie : 41,4 ng/g
Muscle : 1,2 ng/n
Muscle/Plasma : 0,07
[191]
IV 0,64µCi/kg dans
2mg/kg PV
Traces après 24 h dans foie, reins et caecum
POULE
VO 1,28µCi/kg dans
2mgFB1/kg PV
Traces 24h après gavage dans jabot, foie,
reins, intestin grêle et caecum. Nulles dans
œufs
[166]
IP 0,29 µCi/kg PV
106 000 dpm/rat
Après 24h : - Fécès : 66%
- Urine : 32 %
Foie : 1%
Rein : <1%
VO 7,5mg/kg PV
93 000 dpm/rat
101% de la dose retrouvée dans les fécès
après 24h
[197]
RAT
IV 2mg/kg PV Foie : 0,22µg/ml
Rein : 2,35µg/ml
foie/serum: 2
rein/serum: 30 [186]
IV 0,4mg/kg PV
(0,25µCi)
Foie 1076 ng/g
Rein : 486 ng/g
VO 0,5mg/kg PV (0,35µCi) 10 à 2 fois moins que lors de l’IV
[187]
VO
3mg14C-FB1/kg
d’aliment 12j (soit 3µCi)
puis 2mg14C-FB1/kg
d’aliment 12j (soit 2µCi)
Foie : 347 dpm/g
160 ng/g
rein : 146 dpm/g
65ng/g
[203] PORC
VO 100mgFB1/Animal/j
5-11j
Résultats difficilement interprétables :
SD>MOY des valeurs détectées [202]
VACHE VO 1 et 5 mg FB1/kg PV Non dosée Pas d’absorption [189]
IV
2,33 µCi (14C- FB1)/kg
PV
soit 1,72mgFB1/kg PV
Foie : 1,92% de la dose initiale
Muscle : 0,62%
Rein : 0,37%
VO 8,7 µCi (14C- FB1)
soit 6,42mg FB1/kg PV
Foie : 0,64% de la dose initiale
Muscle : 0,14%
Rein : 0,03%
[188]
SINGE
VO 3 000 000dpm
8mg FB1/kg PV
Muscle : 1% de la dose initiale
Foie : 0,4%
Cerveau : 0,2%
[204]
44I.3.1.3. Métabolisme
Peu de données sont disponibles sur le métabolisme de FB1. Cependant la
principale forme d’excrétion biliaire et urinaire est la molécule mère. Chez le singe,
une fraction de FB1 retrouvée dans les fécès est sous une forme partiellement
hydrolysée (mono-esters par perte d’un acide propane-tricarboxylique), alors que la
fraction retrouvée dans l’urine est composée de 96% de FB1 non hydrolysée. Il
apparaît donc clairement que le métabolisme de la FB1 se déroule dans le tube
digestif sous l’action d’enzymes ou de micro-organismes et non dans le foie puisque
aucun métabolite n’est retrouvé dans les voies biliaires [188].
De plus, des études menées sur des hépatocytes de rats et par incubation
directe de FB1 en présence d’enzymes de biotransformation (sous forme de
microsomes) ne révèlent aucune production de métabolite. Ceci confirme qu’il
n’existe pas ou peu de métabolisme hépatique de la FB1 [205]. On note cependant une
induction de l’activité des cytochromes P450 1A1 et P450 4A1 lors d’injections
répétées de FB1 par voie intra-péritonéale sans qu’elle permette de conclure à une
métabolisation de la FB1 par ces enzymes [206].
Lors d’expérimentation sur la vache laitière nous avons vu que la FB1 n’était
pas ou peu retrouvée dans le lait. Aucun de ses métabolites ou conjugués ne l’est non
plus [207].
I.3.1.4. Elimination
Chez le canard, le temps de demi-élimination est de 64 min dans deux
expérimentations réalisées à la dose de 10 mg/kg PV par voie intra-péritonéale [191].
Chez le rat, après une administration IV, la FB1 est rapidement éliminée du
compartiment central, il ne reste que 20ng/ml de plasma 8 heures après
l’administration de 2mg/kg PV [208].
On note une première phase d’élimination rapide et simultanée à la phase de
distribution, son temps de demi-vie est très court : de l’ordre de 10-20min [190]. Le
temps de demi-vie d’élimination est alors de l’ordre de 1 heure [208].
Différentes voies d’élimination de la FB1 ont été mises en évidence. La FB1 est
majoritairement éliminée par voie biliaire : 67% de la dose administrée par voie IV
est retrouvée dans la bile dans les 24 heures [209]. Elle est également éliminée par les
voies urinaire et fécale [190, 196].
45Par voie orale, la majorité de la FB1 administrée est éliminée dans les fèces. Le
temps de demi-vie plasmatique est de 3,15 heures, de 4heures dans le foie et 7 heures
dans les reins [186].
Chez le singe, la poule pondeuse et la vache laitière l’élimination
plasmatique de la FB1 est rapide, les temps de demi élimination sont respectivement
de l’ordre de 40 min [204], 49min [166] et 17min [189].
Chez le porc, la cinétique est toujours rapide mais pas autant que chez les
espèces précitées. Le temps de demi-vie d’élimination est de l’ordre de 3 heures.
Cependant, lors d’une cathétérisation des canaux biliaires, le temps de demi-vie est
diminué à 96 minutes.
En conclusion, la FB1 est faiblement absorbée après administration par voie
orale (2 à <6% de la dose); elle est rapidement éliminée du plasma ou de la
circulation et retrouvée dans les fèces (molécule mère intacte, partiellement ou
entièrement hydrolysée) et dans l’urine (molécule mère entièrement hydrolysée). Par
ailleurs, l'excrétion biliaire est aussi importante. La FB1 ne s’accumule pas dans les
tissus mais une faible proportion de la toxine absorbée est retrouvée dans le foie et
les reins des animaux exposés. L’ensemble de ces données est difficilement
conciliable avec un mécanisme de toxicité cumulative de ces composés.
46I.3.2. Mécanisme d’action
La FB1 est structurellement proche de la sphingosine, constituant cellulaire
des sphingolipides. Cette similarité est à l’origine de l’inhibition de la biosynthèse
des sphingolipides au sein de la cellule. Pour mieux comprendre l’impact cellulaire
de la FB1, nous allons présenter les sphingolipides plus en détail.
I.3.2.1. Les sphingolipides
I.3.2.1.1. Définition et structures
Les sphingolipides sont des lipides complexes, constitués obligatoirement
d’un diol aminé à longue chaîne carbonée (18 carbones) de type sphingoïde, dont :
- la fonction amine est reliée à un acide gras de poids moléculaire élevé par
une fonction amide.
- la fonction alcool primaire est reliée à un groupement polaire qui peut être
de type phosphocholine dans le cas des sphingomyélines ou de type osidique dans le
cas des cérébrosides et gangliosides.
La classification des sphingolipides est basée sur la nature du groupement R2
liée à l’hydroxyle (cf. tableau structure).
Tableau I.3.3 : Classification des sphingolipides
Groupement R2 Noms
H
phosphate
céramides
céramides-1-phosphate
phosphocholine sphingomyélines
glucide
ose
oside neutre
oside acide
- sulfate
- acide sialique
glycosphingolipides
cérébrosides
glycosphingolipides neutres
glycosphingolipides acides
sulfoglycosphingolipides
sialoglycosphingolipides
ou gangliosides
Dans cette partie, nous ne présenterons que les particularités des
sphingoïdes, les céramides, les sphingomyélines et les cérébrosides.
Base sphingoïde
OH O - R2
NH – R1
Figure I.3.2 : Structure des
sphingolipides
47a/ Sphingoïdes
Sphingosine : largement majoritaire chez les animaux, elle entre dans la
composition de 90% des sphingolipides. Elle possède à la fois une partie aliphatique
insaturée et une partie hydrophile polaire. La stéréochimie des carbones -2 et -3 de la
sphingosine est indiquée ci-dessous (D-amino, érythro-) ; la double liaison est trans
[210].
Sphiganine : elle résulte de la condensation sur l'acide palmitique (16C)
de l'amino-acide sérine (3C). Elle a la structure suivante :
- chaîne carbonée linéaire à 18 carbones
- deux fonctions alcool : primaire sur le C1 et secondaire sur le C3
- une fonction amine primaire sur le C2
b/ Céramide:
Les céramides sont précurseurs des lipides et de ce groupe. Ils sont dérivés
des sphingosines par fixation d'un acide gras sur le groupe amine (acylation).
Les acides gras entrant dans la composition des ces molécules sont :
- à nombre pair de carbones, de 16 à 24C
- saturés ou monoinsaturés
- souvent α-hydroxylés (OH en C2)
Sphingosine183
21
OH
NH2
OH
Sphinganine 18 43
21
OH
NH2
OH
24,
32
NH1,
1
OHOH
18
O liaison amide
Sphingosine
Exemple de céramide
48c/ Sphingomyélines
Les sphingomyélines sont des phospholipides membranaires, présentes dans
toutes les membranes et plus particulièrement au niveau des gaines de myéline des
neurones. Elles sont constituées d'une base longue chaîne (sphingosine ou
dihydrosphingosine), d'un acide gras amidifiant la fonction amine et d'un phosphate
estérifiant la fonction alcool primaire et lui même estérifié par un alcool aminé
(choline). Les sphingomyélines contiennent le groupement d’alcool primaire de la
sphingosine estérifié par la partie phosphate de la phosphocholine.
d/ Cérébrosides (monoglycosphingolipides)
Les cérébrosides sont des glycolipides constitué par l’association du
céramide à un résidu glucidique comme le galactose (galactosylcéramide - GalCer)
ou le glucose (glucosylcéramide - GlcCer).
Le GalCer est un lipide important du tissu nerveux alors que le GlcCer est le
principal glycosphingolipide des tissus extraneuronaux et un précurseur de la
plupart des glycosphingolipides plus complexes.
Les glycosphingolipides sont les constituants du feuillet externe des
membranes plasmiques, et, comme tel, seraient importants dans la communication et
le contact entre les cellules [211].
49I.3.2.2. Métabolisme
I.3.2.2.1. Synthèse
La principale enzyme responsable de la synthèse des sphingolipides est la
sérine-palmityl transférase et celle responsable de leur dégradation est la
sphingomyélinase. Celle-ci est absente dans l’estomac, son activité augmente dans le
duodénum et le grêle pour diminuer dans le côlon et le rectum.
Figure I.3.3 : Voies de biosynthèse de novo du céramide et des sphingolipides complexes. La
sphingosine n'est pas une intermédiaire directe de la voie de biosynthèse mais elle est seulement
formée après le renouvellement du céramide.
CoASH: Coenzyme A; DAG: DiAcylGlycérol; Ptd Choline: PhosphatetidylCholine.
Biosynthèse de novo
Sérine + Palmitoyl-CoA
3-Cétosphinganine
Dihydrocéramide
Sphingomyélines
Sérine palmitoyl transférase (Pyridoxal Phosphate) CO2
NADPH + H+
NADP
Acide gras - CoA N-acyltransférase
Désaturase
Sphingomyélinase
SM synthase
PtdCholine
DAG
Sphingosine-1-phosphate
Choline-P
Glucosylcéramide
Lactosylcéramide
Glycolipides Gangliosides
Voie des Glycosphingolipides
Voie de la Sphingosine-1-phosphate
N-acyltransférase
CER synthase
So kinaseSo-1-phosphatase
GcCER synthase
Cérébrosidase
Stimuli de stress (drogues, radiations, …) Acide gras libre +
Stimuli physiologiques (TNFα, …)
+
CoASH
Voie des Sphingomyélines
ADP
ATP
Acide gras - CoA
CoASH
Pi
50La sphingosine est synthétisée dans le réticulum endoplasmique (Figure
I.3.3). Après combinaison avec le pyridoxal phosphate, la sérine est décarboxylée et
réagit avec le palmitoyl-CoA pour former la 3-cétosphinganine. La sphinganine (ou
dihydrosphingosine) est obtenue après une étape de réduction de la 3-céto
sphinganine où le NADPH est utilisé comme donneur d’hydrogène ; le groupe α-
amine de la sphinganine est ensuite acylé pour former un dihydrocéramide (ou N-
acyl sphinganine) par la N-acyltransférase (ou céramidase). La dernière étape qui a
lieu dans le réticulum endoplasmique consiste en une oxydation du squelette
carboné en ∆4 de la sphinganine et permet l’obtention d’un céramide (ou N-
acylsphingosine). [211-214]. La sphingosine peut être libérée au cours de cette étape,
ce qui explique pourquoi la concentration en sphingosine libre dans la cellule reste
faible à l’état physiologique [214-216]. Les céramides sont élaborés dans l’appareil de
Golgi et servent de précurseurs pour la biosynthèse de sphingolipides complexes,
comme les sphingomyélines et les glycosphingolipides (cérébrosides et gangliosides)
[215, 217, 218].
I.3.2.2.2. Catabolisme
Le catabolisme des sphingolipides complexes a lieu dans les lysosomes à
l’issue du renouvellemnt régulier des membranes cellulaires. La sphingosine libérée
subit une réaction de N-acylation rapide (recyclage) ou phosphorylée dans le cytosol.
La phosphosphingosine est ensuite dégradée en éthanolamine phosphate et en
aldéhyde dans le réticulum endoplasmique [214, 215, 217, 218].
I.3.2.3. Rôles des sphingolipides
Les sphingolipides jouent des rôles importants dans l’agencement strutural,
la croissance, la différenciation et la mort des cellules. Ils interviennent en tant que
messagers intracellulaires lors de la transduction des signaux membranaires (facteurs
de croissance, facteurs de différenciation et cytokines [219, 220]). La fonction de
signalisation des sphingolipides est illustrée dans la Figure I.3.4. Quelques agonistes,
tel que le PDGF (platelet-derived growth factor), activent un panel d'enzymes qui
hydrolysent la sphingomyéline en céramide (sphingomyélinases), le céramide en
sphingosine (céramidases), et la sphingosine en sphingosine-1-phosphate
(sphingosine kinases) [221]. Chacun de ces produits intermédiaires est un composé
51bioactif qui peut moduler l’activité des protéines kinases, des phosphatases, et
d’autres voies de signalisation. La sphingosine-1-phosphate est en outre un composé
original qui présente une fonction intracellulaire [220].
Par conséquent, toute variation de la quantité des bases sphingoïdes
entraînera des altérations dans le métabolisme des lipoprotéines et dans la
signalisation intracellulaire, se traduisant par l’apparition d’un phénomène de mort
cellulaire de type apoptotique [222-226] ou, au contraire, une résistance des cellules
aux phénomènes de mort cellulaire et une induction de signaux prolifératifs [220,
221].
Figure I.3.4 : Métabolisme des sphingolipides en réponse à un agoniste et conséquences
cellulaires [219].
I.3.2.4. Action de la Fumonisine B1 sur la biosynthèse des sphingolipides
Les produits intermédiaires de la biosynthèse de novo des sphingolipides (la
sphingosine, les dihydrocéramides, et les céramides) (Figure I.3.3) sont hautement
bioactifs. A l’état normal, les quantités de ces composés restent faibles [227].
Cependant, plusieurs formes de stress cellulaire peuvent induire la biosynthèse de
novo des sphingolipides et perturber le comportement cellulaire lors de
l’accumulation de certain de ces composés [228, 229].
Les fumonisines inhibent la N-acyltransférase, enzyme qui acyle des bases
sphingoïdes (la sphinganine en provenance de la synthèse de novo et la sphingosine
Récepteur
Agoniste
Sphingomyéline
Céramide
Sphingosine
Sphingosine-1-P
OH OH
OH OH
OH OPO3H2
O
N
NH2
NH2
R
R
R
RStimulateur de croissance, (anti-apototique)
Inhibiteur de croissance, (cytotoxique/ pro-apoptotique)
Inhibiteur de croissance, (cytotoxique/ pro-apoptotique)
Sphingomyélinase(s)
N-acyltransférase(s)
Sphingosine kinase(s)
52
Sphinganine
Sphingolipides complexes (réduites)
Sphingosine(parfois élevée)
Sphinganineélevée
Céramide
Sphinganine
Sérine + palmitoyl-CoA
R 32
1
OH
NH3+
OH R 32
1
OH
NH3+
OH
dihydrocéramide
Diffusion au sang et/ou sorti dans l’urine
Membrane plasmatique
Réticulum endoplasmique
N-acyltransférase
issu du renouvellement des sphingolipides). Cette action est illustrée dans la Figure
I.3.5. Cette inhibition de la synthèse des céramides s’accompagne de l’accumulation
de la sphinganine, et, plus tardivement lorsque le nombre de cellules altérées est
important, d’une augmentation de la sphingosine. L’origine de cette inhibition serait
à mettre en relation avec l’analogie structurale existant entre la FB1 et la sphinganine
[12, 13, 171, 222, 230].
Figure I.3.5 : Effets de la FB1 sur le métabolisme des sphingolipides.
I.3.2.5. Action de la Fumonisine B1 sur le métabolisme des acides gras
La toxicité de la FB1 pourrait également être due à une altération du
métabolisme des acides gras poly-insaturés et des phospholipides. Les phénomènes
de stress oxydatif semblent également être augmentés lors d’intoxication par la FB1.
D’autres actions sont rapportées telles une inhibition des phosphatases, de la GTP-BP
(Guanosine tri-phosphate-binding protein), une activation de la PKC (phosphokinase
C) et une perturbation des courants calciques[198].
53I.3.2.6. Conséquences
L’action des fumonisines conduit donc à une accumulation de sphinganine
libre et à l’augmentation du rapport sphinganine/sphingosine [14]. Ce rapport est
d’ailleurs utilisé en tant que marqueur d’exposition à ces mycotoxines [231].
Une partie de la sphinganine libre est métabolisée à l’intérieur des cellules,
mais le reste est libéré dans le milieu extracellulaire. In vivo, elle s’accumule dans les
tissus et se retrouve rapidement dans le sang et les urines [230, 232]. Or, tous les
métabolites dérivés des sphingolipides, peuvent se révéler cytotoxiques en fonction
du type de composé formé, de leur localisation intracellulaire et du type cellulaire
considéré [233].
L’accumulation des bases sphingoïdes va donc conduire, dans certaines
cellules, à une inhibition de la croissance et à l’apparition d’un phénomène
d’apoptose. Ainsi, sur des hépatocytes de rat, une concentration en FB1 comprise
entre 10 et 35 µM conduira, après une période de latence de 24 heures, à une
inhibition de la prolifération cellulaire ; une concentration supérieure aboutira
toujours à une mort cellulaire [234, 235].
Quoi qu’il en soit, l’exposition cellulaire aux fumonisines se traduit par une
perturbation profonde de la machinerie cellulaire et s’accompagne d’une
perturbation des signaux normaux de mort et de prolifération cellulaire. Cet effet
pourrait expliquer l’effet cancérigène de ces molécules chez les rongeurs de
laboratoire [236-238]. En effet, leur pouvoir tumorigène ne peut être expliqué par une
interaction directe de ces molécules avec l’ADN mais pourrait résulter de la sélection
de cellules pré-néoplasiques plus résistantes à l’action des toxines ou à des
phénomènes de prolifération anarchique après une phase de mort cellulaire
importante [239].
En conclusion, le mécanisme d’action de la FB1 repose sur l’analogie
structurale entre la toxine et la sphingosine. Cette analogie est à l’origine de
l’inhibition de la N-acyltransférase et de la perturbation de la biosynthèse des
sphingolipides. Cela se traduit, au plan cellulaire par l’accumulation de Shinganine,
parfois de Sphingosine, qui sont deux composés hautement réactionnels pouvant
perturber le bon fonctionnement de la machinerie cellulaire.
541.4. Biomarqueurs d’exposition aux fumonisines
La fumonisine B1 est à l’origine de l’inhibition de la biosynthèse des
sphingolipides. Cette rupture de métabolisme s’accompagne de nombreux
bouleversements biochimiques.
Nous aborderons dans ce chapitre les paramètres biochimiques qui sont
modifiés par l’exposition des animaux aux fumonisines et qui pourraient être mis à
profit comme biomarqueur de l’exposition animale à ces toxines. Nous limiterons
notre étude aux marqueurs les plus fréquemment analysés et pour lesquels il a été
démontré un effet des fumonisines dans plusieurs espèces animales : protéines
totales, cholestérol total, créatinine, transaminases (alanine aminotransférase et
aspartate aminotransférase), gamma (γ)–glutamyltransférase, lactate déshydrogénase
et phosphatase alcaline. Nous comparerons ensuite ces paramètres à la mesure du
rapport Sa/So.
I.4.1. Description des paramètres biochimiques sériques
Les paramètres biochimiques seront décrits en se basant tout d’abord sur les
connaissances obtenues chez l’homme puis chez les animaux. Les données relatives
aux volailles seront précisées lorsqu’elles sont disponibles.
I.4.1.1. Protéines totales (PROT)
Les protéines plasmatiques sont principalement synthétisées par le foie, les
cellules sanguines, les ganglions lymphatiques, la rate et la moelle osseuse. Le dosage
des protéines totales est utilisé pour évaluer l'état d'hydratation, l'état nutritionnel, le
fonctionnement du foie, du rein ou différents états pathologiques tels qu'une
inflammation ou une altération des défenses immunitaires.
Par conséquent, chez l’homme et les animaux, les concentrations en protéines
totales plasmatiques et le ratio des différentes fractions peuvent être fortement
modifiés dans diverses situations pathologiques par rapport aux limites normales
(chez poulet : 56 g/L) [240].
Une hypoprotéinémie peut être due à un défaut d’apports exogènes en
protéines ou en acides i-aminés (état de dénutrition ou sous nutrition, parasitisme
intestinal, syndrome de malabsorption - malassimilation (intolérance au gluten ou
55sprue chez l’homme - insuffisances hépatiques et/ou pancréatiques) ainsi qu’à une
insuffisance des biosynthèse endogènes (insuffisances hépatiques, syndrome
d’immunodéficience). D’autre part, des pertes excessives rénales (syndrome
néphrotique, insuffisance rénales) ou par exsudation (lésions vasculaires et
inflammatoires, brûlure graves et étendues, …) conduisent également à une
hypoprotéinémie.
En revanche, les situations d’hyperprotéinémies sont liées soit à un état de
déshydratation importante (réduction du secteur hydrique vasculaire) soit à des
apports exogènes excessifs (syndrome immunoproliératifs, maladies auto-immunes
ou réponse inflammatoire exacerbée) [241].
I.4.1.2. Cholestérol total (CHOL)
Le cholestérol, constituant de toutes les membranes lipidiques des
eucaryotes. Il est synthétisé essentiellement par le foie, mais aussi dans une moindre
mesure par des gonades, les surrénales et enfin la paroi intestinale. On considère
qu’environ 75% du cholestérol sont synthétisés dans l’organisme et 25% apporté par
l’alimentation chez les omnivores et les carnivores.
Le cholestérol est véhiculé dans le sang par des systèmes de transport
(lipoprotéines) très différents : les LDL (lipoprotéines de faible densité) et les HDL
(lipoprotéines de haute densité). C'est pour cela qu'on distingue le cholestérol-LDL
et le cholestérol-HDL, l'ensemble formant le cholestérol total.
Pour un organisme donné, il est plus important de considérer le rapport
LDL/HDL que de considérer séparément les concentrations en LDL et en HDL. En
partie génétiquement déterminé, ce rapport est supérieur à 1 dans l’espèce humaine
ce qui correspond à un risque élevé d’athérosclérose alors que chez les autres
mammifères et chez les oiseaux, ce rapport est inférieur à 1, ce qui signifie que dans
les espèces animales, le risque d’athérosclérose demeure faible [211, 242].
La concentration sérique usuelle en cholestérol total chez le poulet est de 4,75
mmol/L [240].
I.4.1.3. Créatinine (CREA)
La créatinine sérique est un produit de déchet formé par la dégradation
spontanée de la créatine dans le muscle. La majeure partie de la créatine se trouve
56dans les tissus musculaires sous forme de créatine phosphate et joue le rôle de
réservoir de stockage de haute énergie pour la conversion en adénosine triphosphate.
Le taux de formation de créatinine est pratiquement constant : 1 ou 2 % de la créatine
est converti en créatinine toutes les 24 heures.
Si la fonction rénale est normale, la créatinine est éliminée par filtration
glomérulaire. Les dosages de créatinine sont indiqués pour le diagnostic et le suivi
d’affections rénales aiguës et chroniques ainsi que pour la surveillance de dialyses
rénales. Dans les premières phases des atteintes rénales, l’élévation de l’urémie
précède généralement celle de la créatininémie. Cependant, l’urémie est aussi
affectée par des facteurs tels que le régime alimentaire, le degré d’hydratation et le
métabolisme protéique. En revanche, la créatininémie demeure plus constante car
elle n’est pas affectée par les facteurs précédemment cités. Ainsi, la créatininémie est
un test plus fiable pour l’exploration des fonctions rénales que l’urémie [243-245].
I.4.1.4. Les Transaminases : Alanine aminotransférase (ALAT) et
Aspartate aminotransférase (ASAT)
L’ALAT (E.C. 2.6.1.2.) (ou transaminase glutamate-pyruvate, TGP ou GPT) et
l’ASAT (E.C. 2.6.1.1.) (ou transaminase glutamate-oxaloacétate, TGO ou GOT)
appartiennent au groupe des transaminases, qui permettent de catalyser la
conversion des amino-acides en α-céto-acides et vice versa. Ces 2 enzymes sont
présentes dans de nombreux tissus, et notamment dans le foie. Si la quantité d’ALAT
reste faible dans les reins, le coeur, les muscles squelettiques, le pancréas, la rate et les
poumons, on trouve en revanche des quantités importantes d’ASAT dans ces tissus,
si bien que l’ALAT est considérée comme un marqueur relativement spécifique
d’une atteinte hépatique.
Néanmoins, des augmentations des activités sériques d’ALAT sont
également observées lors d’atteintes myocardiques, d’hépatopathies et de dystrophie
musculaire. De plus, les augmentations d’activité de l’ALAT persistent davantage
que celles de l’ASAT. Cependant, une augmentation concomitante de l’ALAT et
l’ASAT est une bonne indication du degré de ralentissement hépatique après
infarctus myocardique [246-249].
L’HSA existe sous deux isoenzymes qui sont présentes dans le cytoplasme et
dans les mitochondries. Lorsque les cellules sont faiblement endommagées, le
57cytoplasme libère la majeure partie de l’ASAT, et les mitochondries n’en libèrent
qu’une faible partie. En revanche, en cas de dommages importants, les enzymes
libérées proviennent majoritairement des mitochondries. Le sérum normal ne
contient que des isoenzymes cytoplasmiques. En revanche, lors des maladies
coronariennes ou hépatobiliaires, le sérum contient les deux isoenzymes.
Les maladies hépatobiliaires comme la cirrhose, les carcinomes métastatiques
et les hépatites virales augmentent également les activités sériques d’ASAT. Suite à
un infarctus du myocarde, l’activité sérique d’ASAT augmente et atteint son
maximum deux jours après l’attaque [248-250].
L’activité sérique usuelle de l’ASAT chez le poulet est de 174,8 u/L [240].
I.4.1.5. Gamma (γ) – glutamyltransférase (GGT)
La GGT (E.C. 2.3.2.2) est une peptidase qui hydrolyse l’acide glutamique fixé
à l’azote-terminal des protéines ou des peptides et le econjugue à un accepteur
approprié (peptides, eau, acides i-aminés).
La plus forte concentration de GGT s’observe dans la membrane
intracavitaire des tubules proximaux du rein. Le dosage de l’activité GGT dans les
urines permet de déceler des lésions rénales. On en trouve également dans la rate, la
prostate, l’intestin et le foie (canaux biliaires) [246]. Cliniquement, des élévations
prononcées de la GGT sérique sont presque toujours associées à des maladies
hépatobiliaires, notamment lors d’obstructions biliaires intrahépatiques ou
posthépatiques, où les valeurs dépassent de 5 à 30 fois la normale. On observe des
augmentations modérées de l’activité sérique de la GGT dans les cas d’hépatite, de
cirrhose, de stéatose hépatique, de néoplasme hépatique métastatique et de
pancréatique aiguë ou chronique [246, 248].
Le dosage de la GGT sert au diagnostic et au suivi des dysfonctions
hépatiques et des voies biliaires. Il est en outre un test sensible utilisé dans le
dépistage de l’alcoolisme occulte chez l’homme. L’activité de cette enzyme est bien
plus sensible que celles d’autres enzymes hépatiques car l’élévation de la GGT se
produit plus précocement et dure plus longtemps [248, 249, 251].
58I.4.1.6. Lactate déshydrogénase (LDH)
La LDH (E.C. 1.1.1.27) se trouve dans de nombreux tissus et plus
particulièrement dans le coeur, le foie, les muscles et les reins. La LDH sérique peut
être séparée en cinq isoenzymes différentes suivant leur mobilité électrophorétique
[246].
De nature tétramérique, la LDH peut être constituée de 4 sous-unités
identiques ou par styles de sous-unités différentes en proportions variables. Ces deux
sous-unités ont été dénommées H (Heart) et M (Muscle) selon leur chaîne
polypeptidique. On compte deux homotétramères, la LDH-1 (cœur) et la LDH-5 (foie
et muscles squelettiques), et trois isoenzymes hybrides retrouvées dans le sérum
[246, 249].
Les dosages de LDH sont également utilisés pour le diagnostic et le suivi
d’affections hépatiques (libération dans le sérum de l’isoemzyme LDH-1 : hépatite
virale aiguë, cirrhose, métastases hépatiques), d’atteintes du myocarde (libération de
la LDH-5 : infarctus du myocarde) et de cancers du poumon et des reins. On peut
aussi observer des activités sériques LDH très élevés dans de leucémie, d’anémie
hémolytique ou bien dans les intoxications aiguës graves [246, 248, 249, 252-254].
L’activité sérique usuelle de la LDH chez le poulet est de 636 u/L [240].
I.4.1.7. Phosphatase alcaline (PAL)
La PAL (E.C. 3.1.3.1.) correspond à un groupe de phosphatases (pH optimum
environ égal à 10) présentes dans presque tous les tissus de l’organisme : dans les
cellules hépatiques (canaux biliaires), les ostéoblastes, les reins, la rate, le placenta, la
prostate, les leucocytes et l’intestin grêle. On distingue quatre types de PAL dans le
sérum: le type foie-os-rein, le type intestin, le type placenta et le type cellules
germinales. Le type foie-os-rein est particulièrement important et la majorité de la
PAL sérique normale est d’origine hépato-biliaire.
Par conséquence, l’activité sérique de la PAL augmente lors de choléstases
intra ou extra-hépatique (hépatites, cirrhoses, cancers, toxicités chimiques) mais aussi
lors d’atteintes osseuses (carcinomes métastatiques, rachitisme et ostéomalacie). Elle
est parfois élevée chez l’enfant et l’adolescent pendant la croissance en raison d’une
activité accrue des ostéoblastes. Les valeurs de référence pour l’interprétation
clinique dépendent donc de l’âge des sujets.
59En outre, de légères augmentations des activités sériques de PAL
accompagnent les insuffisances cardiaques globales, les rectocolites hémorragiques,
les entérites régionales et les infections bactériennes abdominales [246, 248, 249, 255].
L’activité sérique usuelle de la PAL chez le poulet est de 482,5 u/L [240].
I.4.2. Biomarqueurs d’exposition aux fumonisines
I.4.2.1. Chez les mammifères
I.4.2.1.1. Chez les équidés
Lors de LEM, aucune anomalie n’est détectée sur le plan hématologique,
seules des modifications biochimiques sont décrites (Tableau I.4.1). On peut constater
une élévation des marqueurs hépatiques de cytolyse et de cholestase suivants :
ASAT, GGT, PAL, SDH, acides biliaires et bilirubine totale [7, 37, 112, 120, 256, 257].
Bien que tous ces paramètres biochimiques soient affectés par les fumonisines, les
enzymes ASAT et GGT sont plus spécifiques dans ce cas. Enfin, une élévation du
taux de protéine dans le liquide céphalorachidien est aussi rapportée (supérieure à 14
ng/ml) [116].
Des études réalisées chez des équidés ont montré l’altération du métabolisme
des sphingolipides (Tableau I.4.1). On a observé une augmentation de la
concentration en Sa libre dans le sang et dans l’hypothalamus [15, 18, 120]. La mesure
du rapport Sa/So est ainsi proposée comme moyen de dépistage et de diagnostic de
l’intoxication [15].
I.4.2.1.2. Chez les porcins
L’examen biochimique révèle une atteinte hépatique dès 4,5 mg de FB1/kg
de poids vifs/jour, par voie orale : augmentation des activités plasmatiques de
l’ASAT, de la GGT, de la CREA, de l’ALAT, de la PAL, de la LDH et des
concentrations en cholestérol [130, 137, 258-260]. Parmi ces enzymes, comme chez des
équidés, l’ASAT, la PAL et la GGT sont encore les plus sensibles à l’exposition à la
FB1. Le cholestérol est le seul paramètre biochimique du sérum qui est resté élevé de
façon dose-dépendante pendant l'expérience [132] (Tableau I.4.2).
60
Tableau I.4.1: Biomarqueurs d’exposition aux fumonisines chez les équidés.
Espèce, âge DoseDurée de
traitement
Rapport
Sa/SoASAT GGT LDH PAL Références
<1 ppm, 44 et 88 ppm
FB1293 jours AS AS AS AS [15, 39]
Poney (mâle et
femelle) de
plusieurs âges75 ppm FB2
75 ppm FB3
136-223
jours
57-65
jours
AS
AS
AS
AS
[261]
Chevaux de 15
ans (425 kg)2,5 ppm FB1 x 6 11 jours AS AS AS [7]
Chevaux de 349
– 612 kg PV
65, 130, 200 ou
1455 – 4360 ppm FB1
11 – 27
joursAS AS [18, 120]
Chevaux de 150
- 190 kg PV30 -42 mg FB1/ kg PV
270-425
joursAS AS [37]
AS: Augmentation significative;
Sa/So : sphinganine/sphingosine ; ASAT : aspartate aminotransférase ; GGT : γ - glutamyltransférase ; LDH : lactate déhydrogénase ; PAL : phosphatase
alcaline.
61
Tableau I.4.2 : Biomarqueurs d’exposition aux fumonisines chez les porcins.
Espèce, âge DoseDurée de
traitement
Rapport
Sa/SoCHOL CREA ALAT ASAT GGT LDH PAL Références
cellules
endothéliales de
l’artère
pulmonaire
50 µM FB1 3 heures AS [262]
Macrophage
alvéolaire
Porcs
recevant
15 ppm
4 – 5 jours AS [263]
23, 101 et
175 ppm14 jours AS AS AS AS AS AS [14, 130]
Porcelets
(en sevrage) 70 et 140
ppm9 mois AS AS AS AS [132]
Porcelets sevrés
de 5 semaines
5, 10, 30,
100 et 190
ppm
7, 28 et 83
joursAS AS AS AS AS AS AS
[129, 131, 133,
137]
Truies 200 ppm 14 jours AS [259]
AS: Augmentation significative;
Sa/So : sphinganine/sphingosine ; CHOL : cholestérol ; CREA : créatinine ; ALAT ; alanine aminotransférase ; ASAT : aspartate aminotransférase ; LDH :
lactate déhydrogénase ; GGT : γ - glutamyltransférase ; PAL : phosphatase alcaline.
62L’élévation des sphingolipides dans le sang chez les porcs ayant reçus 5 mg
de FB1/kg d’aliment a été obtenue avant l’apparition des modifications des
paramètres biochimiques sériques. Cela montre la sensibilité du rapport Sa/So
comme marqueur d’exposition des suidés à la FB1 [14, 131]. L’élévation de ce rapport
est observée dans le foie, les poumons et les reins dès que la ration contient plus de
23 mg de FB1/kg d’aliment [14] (Tableau I.4.2). Il ne semble pas y avoir de relation
directe entre l’élévation du rapport Sa/So et l’apparition de lésions puisque
l’élévation de ce rapport dans les reins n’est pas associée aux lésions rénales alors
qu’elle l’est aux lésions hépatiques et pulmonaires [14, 258]. On constate aussi que le
rapport Sa/So augmente proportionnellement à la dose de FB1 administrée aux
animaux [129, 131].
I.4.2.1.3. Chez les rongeurs
L’impact de la FB1 sur les paramètres biochimiques est observé chez les rats
soumis à des expositions de courte durée (Tableau I.4.3). Par exemple, il est rapporté
une augmentation significative des activités ALAT, ASAT, GGT et PAL associée à
une altération du métabolisme du cholestérol et de la créatinine chez les rats recevant
de 100 à 437 mg de FB1/ kg d’aliment pendant 21 à 28 jours, ou chez ceux nourris par
des rations contenant 1,25 et 7,5 mg/kg poids vifs/jour pendant 6 jours. Dans ces
conditions expérimentales, l’effet de la FB1 sur le rapport Sa/So est aussi observé
dans le sérum, le rein et le foie des animaux exposés [20, 177, 264-267]. Par contre, il
faut souligner qu’aucune modification notable des paramètres biochimiques ni du
rapport Sa/So n’est trouvée après 2 ans de traitement par des doses de 1, 10 et 25 mg
de FB1/kg d’aliment. Seule la créatinine sérique est alors augmentée [264].
63
Tableau I.4.3 : Biomarqueurs d’exposition aux fumonisines chez les rongeurs
Espèce, âge DoseDurée de
traitement
Rapport
Sa/SoPROT CHOL CREA ALAT ASAT GGT PAL Références
100 et 250 ppm 21 jours AS AS
1, 10 et 25 ppm 2 ans ns ns AS
[264]Rat
8 - 437 ppm 28 jours AS AS AS AS AS AS [20, 265]
Rat de 45 jours
(150 - 175 g PV)
1,25 et 7,5
mg/kg PV/j
1, 2, 4 et 6
joursAS AS AS AS AS AS [177, 266, 267]
25 mg FB1 /kg
PV
4, 8, 12 et
24 heuresAS [19]
5, 15 et 35
mg/kg PV/j14 jours AS AS AS [176]
Souris
42 – 49 jours
ou 56 – 84 jours10 ppm 90 jours RS ns ns [268]
AS: Augmentation significative; RS : Réduction significative ; ns: augmentation non significative ;
Sa/So : sphinganine/sphingosine ; PROT : Protéines totales ; CHOL : cholestérol ; CREA : créatinine ; ALAT ; alanine aminotransférase ; ASAT :
aspartate aminotransférase ; GGT : γ - glutamyltransférase; LDH : lactate déhydrogénase ; PAL : phosphatase alcaline.
64Chez les souris, les protéines totales, le cholestérol et l’ALAT augmentent
significativement après 14 jours de gavage à des doses de 5, 15 et 35 mg de FB1/kg
poids vif/jour [176]. La modification du rapport Sa/So est aussi obtenue dans les
cellules épithéliales intestinales et dans le foie de souris recevant 25 mg de FB1/kg
poids vif, pendant de 4 à 8 heures. Toutefois, ce rapport dépend de la durée de
traitement et revient au niveau des témoins 24 heures après l’injection sous cutanée
de la toxine. L’augmentation du rapport Sa/So est plus persistante dans le rein [19].
Comme chez les rats, après un traitement prolongé (10 mg de FB1/kg d’aliment
pendant 90 jours) aucune modification importante n’est plus observée si ce n’est une
réduction de la concentration en cholestérol chez les souris âgés de 8 à 12 semaines
[268] (Tableau I.4.3).
I.4.2.1.4. Chez les primates non humains
Une altération du métabolisme du cholestérol et de la créatinine a été
observée chez des singes gavés avec 1 mg de FB1/kg poids vifs, 3 fois/semaine,
pendant 51 jours. Dans ces conditions, une augmentation significative des activités
de l’ALAT, des GGT et des LDH a aussi été décrite [21]. Des modifications similaires
des enzymes hépatiques et rénales ont suivi l’administration d’une ration contenant
10 mg de FB1/kg poids vifs à raison d’1 gavage/semaine pendant 7 – 50 jours [232].
Là encore, ces altérations sont associées à une élévation significative du rapport
Sa/So dans les deux études (Tableau I.4.4). En revanche, lors d’exposition prolongée,
une réduction de la concentration en cholestérol ainsi que les activités de l’ASAT, de
l’ALAT et de la PAL a été rapportée chez des singes ayant reçu 0,18 mg de FB1/kg
poids vifs/ jours pendant 4 ans [269]. Dans ce cas, le rapport Sa/So a
significativement augmenté après 60 semaines de traitement pour les doses de toxine
comprises entre 0,3 et 0,18 mg de FB1/kg poids vifs/ jours [269, 270].
Le traitement par la FB2 conduit aussi à des modifications de l’ASAT et de la
GGT chez les singes nourris avec une ration contenant 10 mg/kg poids vifs mais
cette toxine n’a aucun effet sur la concentration en cholestérol, en créatinine ni sur les
activités de l’ALAT ou de la LDH. En revanche, une élévation importante du rapport
Sa/So sérique est observée [271] (Tableau I.4.4).
65
Tableau I.4.4 : Biomarqueurs d’exposition aux fumonisines chez les primates non humains.
Espèce,
âgeDose
Durée de
traitement
Rapport
Sa/SoCHOL CREA ALAT ASAT GGT LDH PAL Références
1mg FB1/kg PV
(3 gavage/semaine)51 jours AS AS AS AS [21]
Singes10 mg FB1/kg PV
(1 seul gavage)7 – 50 jours AS AS AS AS AS AS AS [232]
Singes10 mg FB2/kg PV
(1 seul gavage)51 jours AS ns ns ns AS AS ns [271]
Singes0,8 – 0,18 mg
FB1/kg PV/jour
60 semaines,
4 ansAS RS RS RS RS [269, 270]
AS: Augmentation significative; ns: non significative ; RS : Réduction significative ; ns: augmentation non significative ;
Sa/So : sphinganine/sphingosine ; CHOL : cholestérol ; CREA : créatinine ; ALAT ; alanine aminotransférase ; ASAT : aspartate aminotransférase ;
LDH : lactate déhydrogénase ; GGT : γ - glutamyltransférase; PAL : phosphatase alcaline.
66
I.4.2.2. Chez les volailles
I.4.2.2.1. Chez les poulets et poules pondeuse
Parmi des paramètres biochimiques analysés chez les poulets, l’activité de
l’ASAT semble être la plus sensible avec une augmentation perceptible à partir d’une
consommation de 30 mg de FB1/kg d’aliment pendant 16 jours [145]. Toutefois, une
élévation des autres paramètres biochimiques comme l’ALAT, la GGT, la LDH, ou
les protéines totales et le cholestérol a aussi été rapporté chez les volailles exposées
aux fumonisines (Tableau I.4.5) [17, 52, 145, 146, 150, 272, 273]. Au contraire, l’activité
de la PAL diminue après une ingestion de 300 mg de FB1/kg d’aliment pendant 10
jours [145].
Comme dans les autres espèces, le rapport Sa/So se révèle être un marqueur
précoce et sensible d’exposition aux fumonisines puisque son élévation est détectée
après une exposition à 20 mg de FB1/kg d’aliment pendant 21 jours [17, 150].
Lors d’exposition prolongée, aucune modification des paramètres
biochimiques n’a pu être observée chez des poulets nourris avec 25-50 mg de FB1/kg
d’aliment pendant 49 jours [152]. Dans ce cas, seul l’élévation du rapport Sa/So était
perceptible [152].
I.4.2.2.2. Chez les dindes
Par rapport au poulet, il est intéressant de constater que, chez les dindes, la
concentration sérique en cholestérol est réduite de façon significative dans toutes les
études (Tableau I.4.5). Ainsi, après administration d’une ration contenant 200 mg de
FB1/kg d’aliment pendant 21 jours, une réduction significative de la concentration du
cholestérol accompagnée d’augmentations de l'activité de la LDH, de l’ASAT et de la
GGT a pu être rapportée [154-157]. Là encore, il convient de souligner que la
réalisation d’expositions prolongées (jusqu’à 50 mg FB1/kg d’aliment pendant 14
semaines) n’a plus entraîné de modifications des paramètres biochimiques précités
[152].
En revanche, le rapport Sa/So se révèle toujours être un biomarqueur
sensible de l’exposition à la FB1 avec une dose minimale de toxine ayant un effet de
25 mg de FB1/kg d’aliment et ce, quelle que soit la durée de traitement [152, 155].
67
Tableau I.4.5 : Biomarqueurs d’exposition aux fumonisines chez les volailles.
Espèce, âge DoseDurée de
traitement
Rapport
Sa/SoPROT CHOL ASAT GGT LDH PAL Références
30, 75, 100, 200,
300 et 400 ppm
16, 19 et 21
joursAS ns1 AS AS ns1 ns RS1
[17, 52, 145, 146,
272, 273]Poussins de 1 jours
20, 40, 80 mg
FB1 (pure)/kg21 jours AS ns ns ns ns [150]
Poules pondeuses 200 ppm 112 jours AS AS [153]
Poussins de 7 jours 25 et 50 ppm 49 jours AS ns ns ns ns ns [152]
Dindes de 1 jour
25, 75, 100, 200,
300, 400 et 475
ppm
21 jours AS ns RS AS AS AS ns [16, 154-157]
Dindons de 7 jours 25 et 50 ppm 98 jours AS ns ns ns ns ns [152]
Canetons de 1 jour100, 200, 400
ppm21 jours AS ns ns ns AS [160]
AS: Augmentation significative; RS : Réduction significative ; ns: augmentation non significative ;
Sa/So : sphinganine/sphingosine ; PROT : Protéines totales ; CHOL : cholestérol ; CREA : créatinine ; ALAT ; alanine aminotransférase ; ASAT : aspartate
aminotransférase ; GGT : γ - glutamyltransférase; LDH : lactate déhydrogénase ; PAL : phosphatase alcaline.
1 AS dans l’étude menée par Kubena et al. (1997) chez les poulets recevant 300 ppm FB1 pendant 19 ou 21 jours.
68
I.4.2.2.3. Chez les canards
De très rares études avaient été réalisées sur l’effet de la FB1 chez les canards.
Une seule expérimentation chez les canetons Pékin menée par Bermudez et coll. [160]
a cherché à explorer d’éventuelles modifications des paramètres biochimiques des
animaux exposées. Dans cette étude, les analyses biochimiques n’ont pas montré
beaucoup d’altérations puisque seule la GGT était augmentée de façon significative
chez les canetons ayant reçu plus de 100 mg de FB1/kg d’aliment pendant 21 jours.
La encore, une augmentation significative du rapport Sa/So est observée aux mêmes
doses (Tableau I.4.5).
En conclusion, il ressort de ces données que l’exposition des animaux aux
fumonisines entraîne une modification de certains paramètres biochimiques. La
nature et l’importance de ces modifications dépendent de l’espèce animale
concernée. L’augmentation de la concentration plasmatique en cholestérol ainsi que
celles des activités de l’ASAT et de l’ALAT sont retrouvées après l'exposition à la FB1
chez les mammifères. Les altérations ne sont toutefois pas spécifiques d’une
exposition aux fumonisines Ces modifications biochimiques sont moins constantes
chez les volailles. Par conséquent, il semble difficile d’utiliser ces paramètres comme
biomarqueurs d’une exposition aux fumonisines. En revanche, l’élévation du rapport
Sa/So plasmatique (ou hépatique ou rénal) semble être un marqueur sensible et
spécifique de l’exposition aux fumonisines dans toutes les espèces où il a été étudié.
69
I.5. Intérêt du modèle palmipède
L’élevage des palmipèdes est très ancien puisqu’il est déjà décrit dans
l’Egypte ancienne, soit environ 1500 ans avant J.-C., puis par les Grecs et les Romains.
En Europe, cette production est beaucoup plus tardive et remonte environ au
Moyen-Age [274]. Ces dernières années, la production de palmipèdes, et plus
particulièrement de palmipèdes gras s’est beaucoup développé grâce à la mise en
place de nouvelles formes commerciales très variées (viande à rôtir, foie gras, magret,
etc.).
I.5.1. Production de palmipède : données économiques
I.5.1.1. Production de canard
Depuis 1998, la France est, de très loin , le plus important producteur de
produits de canard de l’Union Européenne (hors pays de l’Est) (Tableau 1.5.1) [275].
Elle représente désormais la troisième production avicole du pays (Tableau 1.5.2)
[276]. Ce développement très important de cette filière traduit l'engouement du
consommateur pour cette viande rouge à caractère festif. La consommation moyenne
est aussi en croissance puisqu’elle est passée de 0,9 kg/habitant en 1980 et 3,1 kg en
1998 [277]. Ceci peut s’expliquer en partie par les qualités diététiques de cette viande.
En effet, le filet de canard cumule les avantages d'une viande de volaille (faible
teneur en lipides) et ceux d'une viande rouge (teneur élevée en phospholipides,
riches en acides gras polyinsaturés) [277].
Tableau 1.5.1 : Production de filière canard entre 1998 et 2002 en Europe [275].
(1000 tonnes) Dan. All. Fra Irl. Ita. P.B. Por. R.U. 1998 4 37 193 4 14 13 7 39 1999 5 38 201 4 14 13 7 41 2000 4 40 213 5 13 13 7 40 2001 5 41 231 6 15 13 8 46 2002 5 43 241 6 15 14 8 46
Dan. : Danemark ; All. : Allemagne ; Fra. : France ; Irl. : Irlande ; Ita. : Italie ; P.B. : Pays Bas ;
Por. : Portugal et R.U. : Royaume Uni.
70
Tableau 1.5.2 : Production de filière avicole entre 1995 et 2002 en France [276].
(1000 tonnes) 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 Poulets 974 1053 1045 1049 985 943 1006 941 Dindes 627 636 675 702 675 729 715 669 Canards 100 157 176 193 201 213 231 241 Poules 62 55 55 59 55 54 55 56 Pintades 42 45 46 43 41 43 46 39
I.5.1.2. Production de foie gras
Les formes commerciales de consommation du canard et de l'oie sont très
variées (viande à rôtir, foie gras, magret, etc.). Elles dépendent du contexte
économique et culturel des lieux de production. En France, surtout dans la région
Midi-Pyrénées, l’essentiel de la production est destiné au gavage.
Tableau 1.5.3 : Production de foie gras entre 1999 et 2002 en France [278].
(1000 tonnes) 1999 2000 2001 2002 Foie gras de canard 15,0 15,1 15,8 16,6 Foie gras d’oie 0,5 0,6 0,6 0,6 TOTAL 15,5 15,7 16,4 17,2
La production de foie gras en France s’est rapidement développée au cours
des dernières années. Plus de 17 milles tonnes de foie gras ont été produites en 2002,
soit presque 82% de la production mondiale de foie gras (Tableau I.5.3). De même, la
consommation française a été beaucoup augmentée, plus de 400% en 15 ans. Elle
avoisine désormais les 250g/pers/an [279].
Le foie gras est un produit typique de la France et plus particulièrement de
certaines régions françaises dont le Sud Ouest (Landes, Gers…)
I.5.2. Production de palmipède : données techniques
I.5.2.1. Races
De nos jours en France, l’exploitation des palmipèdes utilise essentiellement
trois types d’animaux qui sont destinés soit au gavage, soit à la production de viande
à rôtir. Ces animaux sont le canard mulard, le canard de Barbarie et l’oie. Cependant,
71
le canard commun est aussi utilisé dans le cadre de la reproduction pour la
production de canetons mulards qui sont des hybrides. Voici les principales
caractéristiques des différents types d’animaux utilisés en élevage.
I.5.2.1.1. Le canard commun
L’espèce Anas est surtout connu dans les régions d’Asie du Sud Est et en
Chine. Sous l’influence de l’homme et du milieu, cette espèce a donnée naissance à
des races aussi différentes que le longiligne et vertical Coureur Indien (race
pondeuse) et le Pékin à rôtir, charnu et horizontal. Le dimorphisme sexuel est faible
chez le canard Pékin, la femelle pesant, à l’âge adulte, le même poids que le mâle.
Ceci permet d’abattre les deux sexes au même âge, généralement entre 7 et 8
semaines [274].
I.5.2.1.2. Le canard mulard
Le canard mulard est un hydride issu du croisement entre un mâle barbarie
(Cairina moschata) et une cane dite « commune » (Anas platyrynchos), généralement de
type Pékin (Figure I.5.2). Le mulard est stérile. Il est donc pratiquement
exclusivement destiné au gavage. A la différence du barbarie, il présente peu de
dimorphisme sexuel. Mais les sujets femelles sont moins appréciés, parce que l’aspect
de leur foie ne correspond pas aux critères recherchés actuellement [280].
Figure 1.5.2 : Schéma d’obtention de canards mulards par croisement d’un mâle de Barbarie et d’une cane commune [281].
72
I.5.2.1.3. Le canard de Barbarie
Originaire d'Amérique du Sud, le canard de Barbarie est issu d'une espèce
sauvage, différente de celle dont descendent les canards communs. Il s'en distingue
par de nombreux caractères anatomiques, dont le principal est un important
dimorphisme sexuel (les femelles sont deux fois moins lourdes que les mâles). En
outre, la croissance des muscles pectoraux étant encore importante chez les mâles
après 10 semaines (en relation avec le développement du vol) ceux-ci ne sont abattus
qu’à 11 ou 12 semaines contre 9 ou 10 pour les femelles [274].
Son intérêt tient à la taille du mâle (plus de 4 kg de poids vif à l'âge de 12
semaines), ce qui facilite une présentation sous forme de morceaux de découpe. En
outre, sa viande est maigre, comme celle du poulet (2% de lipides dans le filet) et
riche en acides gras polyinsaturés. [282]. Ces caractéristiques, ajoutées aux qualités
gustatives de sa chair, ont beaucoup contribué au développement de la
consommation de la viande de canard.
Le canard de Barbarie est également apte à la production de foie gras. De
nombreux ateliers de gavage du Sud-Ouest utilisent des mâles de cette espèce.
Cependant, la plus grande part de la production se fait avec des mâles mulards.
I.5.2.1.4. Les oies
L’oie grise du Sud-Ouest (ou grise des Landes) est le type d’oie à retenir
préférentiellement pour le gavage. Elle est sans fanon sous le bec et sans bavette sous
la poitrine. Elle est d’un format moyen (6 à 7 kg pour les sujets de deux sexes, 10 à 12
kg après engraissement), possède un plumage gris clair à gris foncé. Les autres races
d’oie (oie du Rhin, oie de Guinée) ne doivent être exploitées qu’en production de
viande à rôtir, car elles ne possèdent aucune aptitude au gavage [280].
I.5.2.2. Conduite d’élevage
I.5.2.2.1. Phases et durée d’élevage
En France, 75% des animaux produits sont destinés au gavage. Dans ce
cadre, l’élevage des palmipèdes se divise en 2 phases : une phase de croissance et une
phase de gavage.
73
Phase de croissance :
Dès leur naissance, les canetons et oisons sont élevés dans les conditions
suivantes [274, 280, 283]:
- la densité : 35 kg de poids vif/m2 en maximum jusqu’au 42ème jour puis 7,5
canards/m2 à partir du 43ème jour ;
- la température : environ 32 - 35°C pendant la première semaine puis
réduction progressive pour arriver à la température ambiante au bout d’un mois
environ ;
- la ventilation : 3 – 4 m3/h/kg de poids vif, avec une vitesse < 0,3 m/s ;
- l’éclairement : en permanence pendant la première semaine (40 – 50 lux
puis réduite à 20 – 30 lux); puis 10 ou 12h par jour dès la 2e semaine et jusqu’à
abattage.
La durée courante de cette phase est de 12 à 14 semaines.
Phase de gavage :
A la fin de la phase de croissance, l'oiseau doit avoir un poids vif de 3,8 à 4,0
kg, en ce qui concerne les canards mulards [280].
La durée classique de la phase de gavage est de 12 à 16 jours pour le canard
et de 21 jours pour l’oie [280, 284, 285].
Le gavage est une période critique dont la réussite dépend de nombreux
facteurs: état sanitaire et physiologique de l’animal à la fin de la période de
croissance, conditions environnementales dans l’atelier de gavage, technicité du
gaveur et, bien entendu, qualité du maïs utilisé pendant cette période.
I.5.2.2.2. Alimentation
Le maïs est l’aliment de base des animaux pendant la phase de gavage.
L’intérêt de cette céréale est multiple :
- il permet un apport énergétique élevé, grâce à sa richesse en amidon (75%),
- sa composition déficitaire en certaines enzymes permet une accumulation
importante des lipides dans le foie.
C’est pour ces raisons que le maïs est un élément important de l’alimentation
des palmipèdes, pendant la phase de croissance, où il représente 15 à 30% de la
74
ration, mais surtout pendant la phase de gavage puisque les animaux ingèrent en
moyenne 800g à 1kg de maïs par jour pendant cette période [286, 287]. Il est donc
nécessaire de disposer d’un maïs d’excellente qualité sanitaire et nutritionnelle pour
assurer la production de palmipèdes gras dans de bonnes conditions [286].
I.5.3. Intérêt des études sur palmipèdes
En France, le maïs est la deuxième production végétale derrière le blé tendre et
les surfaces cultivées représentent un peu plus de 10 % de la surface agricole utile totale.
Cette production est surtout concentrée dans le Sud-Ouest de la France et notamment
en Aquitaine et en Midi-Pyrénées [288].
Des enquêtes ont mis en évidence qu’une proportion importante de la
production pouvait être contaminée par des souches de Fusarium verticillioides. Parmi
ces souches, 80% ont la capacité de produire, in vitro, des niveaux élevés de fumonisine
B1 [22]. De plus, les cas de leucoencéphalomalacie équine rapportés, confirment la
fréquence et l’importance de la contamination du maïs dans le sud-ouest de la France
[23].
Bien que les palmipèdes, de par leur régime alimentaire et les conditions de
production, soient naturellement fortement exposés aux fumonisines, peu d’études se
sont attachées à caractériser l’impact de ces mycotoxines chez ces espèces. Par ailleurs,
les études sur canard Pékin sont difficilement extrapolables aux animaux gras.
La caractérisation des effets des fumonisines pendant les différentes phases de
production et la recherche de biomarqueurs d’exposition et d’effet de ces toxines dans
ce modèle animal est donc particulièrement important, tant sur le plan scientifique que
sur le plan économique pour cette filière.
75
Partie II. MATÉRIELS ET MÉTHODES
76
II.1. Réactifs et Appareillage.
II.1.1. Réactifs
Le standard de fumonisine B1 a été acheté chez Sigma2 , les autres standards de
sphinganine C18 (D-erythro dihydrosphingosine), de sphingosine C18 (D-erythro sphingosine)
et de C20 sphinganine ont été fournis par Matreya3.
L’OPA (ortho-phthaldiadéhyde)4 et autres produits chimiques sont de la plus
haute qualité disponible et ont été achetés chez Sigma. Les solvants de qualité HPLC ont
été fournis par Scharlau5.
Dans toutes les études, de l’eau distillée et désionisée a été utilisée.
II.1.2. Appareils
L’analyseur automatique de biochimie clinique pour la détermination
quantitative des paramètres biochimiques dans le sérum a été fourni par Vitros6.
Le matériel nécessaire à la préparation des homogénats des tissus est le suivant :
tubes à hémolyse en verre, une balance (MettlerXJ100), un Potter (5 mL) N° AA72, un
appareil type Potter-Elvejhem avec piston , une centrifugeuse (Jouan, type GR2000 SX).
L’extraction de sphinganine et sphingosine a nécessité un bain-marie Memmert,
un appareil à ultra sons Branson 2510 R-MT7, un agitateur type Vortex8, une
centrifugeuse (Jouan, type GR2000 SX), une chaîne d’évaporation (module de chauffage
Techne (Dri-Block, DB-3D)9 relié à une bouteille d’azote type R), et des filtres seringue à
membrane Sun-Sri (porosité de 0,45 µm)10.
L’extraction de fumonisine a nécessité les matériels suivants : papier filtre plissé
Prolabo11, plaque de silice Si60 60 (20 x 20 cm)12.
Le matériel nécessaire aux dosages de Sphinganine et sphingosine est constitué
d’une chaîne CLHP (Chromatographie en phase Liquide Haute Pression) composée de
2 M.O., U.S.A 3 Pleasant Gap, U.S.A. 4 Sigma Inc., 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA 5 Barcelone, Espagne. 6 Diagnostics Ortho – Clinique, Issy-Les-Moulineaux, France 7 Branson precision processing group, U.S.A. 8 Janke & Kunke (IKA-Labortechnik, Allemagne). 9 Royal Unis. 10 Titan syringe filter, NY, UM, 4MM (SUN-SRI, Wilmington, U.S.A.). 11 Prolabo, France. 12 Merck, 64271 Damstadt, Germany
77
la manière suivante : le passeur d’échantillons et la pompe M220013 provenaient de chez
ICS, ils étaient connectés à un détecteur de fluorescence programmable FD-500
Shimazu14, lui-même relié à un système d’acquisition de données (PIC 3, ICS). La
colonne analytique retenue est de nature phase inverse C18 de référence Prontosil 120-5-
C18 H15 d’une longueur de 250 mm, de diamètre intérieur de 4,0 mm contenant des
particules de phase stationnaire de granulométrie 5 µm. Une pré colonne de même
nature est placée en tête de colonne.
II.1.3. Matériel courant de laboratoire
Le matériel courant de laboratoire utilisé quotidiennement est le suivant :
micropipettes et cônes Standard Eppendorf16, inserts Sun-Sri17 renfermant l’échantillon
à injecter, seringues 1 mL Codan18 et aiguilles Neolus 0,6 mm19.
II.2. Production de Fumonisine B1
II.2.1. Souche utilisée pour la production de FB1
La souche de Fusarium verticillioides (NRRL-3428) utilisée pour la production de
FB1 a été isolée dans le laboratoire, à partir de brisures de maïs responsables de
leucoencéphalomalacie chez des chevaux dans la région toulousaine.
II.2.2. Milieu de culture
Le milieu de culture employé pour l’isolement et l’identification du genre
Fusarium est de type PDA (Potato Dextrose Agar). La souche de Fusarium verticillioides
est ensuite conservée sur gélose au malt et repiquée régulièrement.
La culture est réalisée par étalement dans des boîtes de Pétri de diamètre 9 cm,
contenant 17 mL de gélose au malt. Cette espèce donne un thalle blanc qui prend une
coloration lie-de-vin après 5 jours de culture à 25°C [22, 59].
13 Toulouse, France. 14 Kyoto, Japon. 15 Bichoff, Allemagne. 16 Eppendorf AG, Allemagne 17 Sun-Sri Vial 0,25ml C/TPP 12x32 (U.S.A.) 18 Codan AG, Allemagne. 19 Terumo, Belgique.
78
II.2.3. Substrat et contamination du maïs
Le riz ou le maïs utilisé comme milieu de culture des toxines provient d’un
même lot. Il est trié manuellement pour éliminer les grains visiblement moisis. 50 g de
riz ou de maïs concassés sont placés dans des boîtes de Pétri de 15 cm de diamètre à
laquelle est ajoutés 50 mL d’eau distillée. L’ensemble est stérilisé à 121°C pendant 30
min avant l’inoculation.
Les boîtes de Pétri contenant le riz ou le maïs stériles sont ensemencées par
dépôt de 3 carrés de gélose (0,5 cm x 0,5 cm) issus d’une culture de 5 - 7 jours de
Fusarium verticillioides. Les boîtes sont ensuite placées dans une étuve à 23°C et incubées
pendant 4 - 5 semaines.
Pour les études de toxicité subaiguë, le milieu de culture a été extrait, concentré
et dosé avant usage comme il est décrit ci-après (cf page 80).
Pour les études de toxicité chronique, afin de limiter le volume administré aux
animaux, le matériel de culture a été séché à l’étuve à 80 - 90°C pendant 90 min puis
broyé en farine très fine dont le calibre a été contrôlé par tamisage. Un prélèvement de
25 g a été utilisé pour quantifier les toxines comme il est décrit ci-après. Le reste est
conservé au congélateur à -20°C jusqu’à utilisation. Un contrôle de la teneur en
fumonisines est effectué juste avant usage (cf page 82).
II.2.4. Extraction, purification et dosage
L’extraction et le dosage de FB1 dans le riz ou le maïs sont basés sur les procédures
décrites par Le Bars et coll. [22].
II.2.4.1. Extraction
25 g de l’échantillon à doser sont déposés dans un erlenmeyer en verre de 250
mL et extraits avec 100 mL de mélange acétonitrile–eau (50v/50v) en utilisant le
mélangeur à approximativement 300 agitations/min pendant une nuit.
L’extrait est filtré sur filtre plissé et concentré par évaporation d'acétronitrile.
Les teneurs en toxine sont ensuite ajustées selons les besoins par dilution dans l’eau
désionisée. Enfin, la FB1 est dosée par chromatographie en couche mince.
79
II.2.4.2. Dosage
2 µL d’extrait sont déposés sur une plaque de Silice. La migration s’effectue
dans un bain composé de butanol - acide acétique – eau (20/10/10).
Après séchage, la plaque est vaporisée avec un mélange paranisaldéhyde
/méthanol/acide acétique/acide sulfurique (0,5/85/10/5). Elle est chauffée à 110°C
pendant 10 min pour permettre la visualisation la FB1 sous forme d’une tâche de
couleur violette. Les tâches sont ensuite quantifiées par densitométrie grâce à un
appareil de référence Shimadzu20 CS 930, à 600 nm.
La quantification de la teneur de l’extrait en FB1 est réalisée par comparaison
avec une gamme standard de référence déposée sur la même plaque. La gamme
standard est préparée avec le même solvant que celui de l’extrait analysé et stockée dans
l’obscurité, à basse température (4° - 8°C).
La pureté de l’extrait brut ainsi obtenu était de 54% FB1, de 8% FB2 et de 9% FB3.
29% des extraits sont constitués par des pigments de riz ou de maïs qui sont aussi
présents dans les extraits administrés aux animaux témoins.
II.3. Traitement des animaux
Les oiseaux étaient des canards mulards (hybrides de canards de Barbarie et de
canes de Pékin). Toutes les procédures expérimentales sont conformes aux Directives
Nationales Françaises pour le soin et l’usage des oiseaux dans le but de recherches.
II.3.1. Détermination des valeurs usuelles
II.3.1.1. But de l’étude
Etablir des valeurs usuelles concernant des paramètres biochimiques sériques
chez le canard mulard.
II.3.1.2. Méthode expérimentale
500 canards âgés de 84 jours non exposés aux mycotoxines et indemnes de toute
affection connue ont été sélectionnés pour cette étude. L’analyse des paramètres
biochimiques et des sphingolipides a été réalisée respectivement sur 500 et 50
échantillons sériques. 20 Kyoto, Japan.
80
Age : 21 jours
J0 J12
Durée du traitement
Jour
Autopsie
J2
Prélèvement de sang de 5 canards par lot, tous les 2 jours
J4
Début du traitement
J6 J8 J10
Age : 28 jours Age : 40 jours
II.3.2. Toxicité subaiguë sur des canards en croissance
II.3.2.1. But de l’étude
Observer l’effet de l’ingestion répétée de fortes doses de FB1 pendant une courte
période de 12 jours chez des canards mulard en croissance.
II.3.2.2. Méthode expérimentale
II.3.2.2.1. Animaux et alimentation
Les vingt canards mâles âgés de 3 semaines ont été acclimatés avec accès libre à
la nourriture (UFAC, Languedoc, France) et à l’eau pendant une semaine avant le début
de l'étude.
A l’âge de 4 semaines, les canards ont été aléatoirement distribués dans quatre
groupes de cinq oiseaux recevant respectivement la FB1 partiellement purifiée à raison
de 12,5 ml/kg de PV, aux doses suivantes : 0, 5, 15 et 45 mg de FB1/kg de poids vif/jour.
Les oiseaux ont été traités pendant 12 jours par gavage individuel à la seringue
(extrait de matériel de culture) après pesée. La procédure est décrite dans le schéma
suivant :
Schéma II.1 : Protocole expérimental d’intoxication subaiguë sur des canards en croissance.
II.3.2.2.2. Examens complémentaires
a/ Prise de sang
Tous les 2 jours, le sang a été prélevé à la veine jugulaire dans des tubes
héparinés et des tubes secs et analysé pour étude de la biochimie sérique et du rapport
Sa/So.
81
J0 J12Durée du traitement
Jour
Autopsie
J2
Pesée et prélèvement de sang de 25 canards par lot
J4
Début du traitement par gavage
J6 J8 J10
Age : 84 jours Age : 96 jours
b/ Abattage des oiseaux
Les canards ont été tués, 24 h après la dernière administration de la FB1.
L'autopsie a été effectuée et des organes (le foie, le rein, le gésier, le cœur et la rate) ont
été prélevés, pesés et fixés dans le formol pour analyse histologique ou conservés à -
80°C jusqu'à utilisation.
II.3.3. Toxicité pendant le gavage
II.3.3.1. But de l’étude
Observer l’effet de l’ingestion de maïs gavage contaminé pour différentes doses
de FB1 pendant toute la période de gavage (de 12 jours) chez des canards mulard.
II.3.3.2. Méthode expérimentale
II.3.3.2.1. Animaux et alimentation
Les soixante-quinze canards mâles âgés de 12 semaines ont été distribués
aléatoirement en 3 groupes de 25 oiseaux puis gavés pendant 12 jours avec de l’aliment
gavage constitué de la manière suivante :
L’absence d’autres mycotoxines (aflatoxine B1, ochratoxine A, zéaralénone,
trichothécènes, fusarine c, acide fusarique, moniliformine) a été confirmée. Le traitement
par gavage est présenté dans le schéma ci-dessous :
Schéma II.2 : Protocole expérimental d’intoxication au cours de gavage.
Lot de Canard Dose de traitement (mg de FB1/kg d’aliment)
20 mg/kg d’aliment maïs naturellement contaminé par la FB1 à une dose de 20 mg/kg
10 mg/kg d’aliment 50%de maïs sain + 50% de maïs contaminé par la FB1 à 20 mg/kg
0 mg/kg d’aliment maïs sain
82
II.3.3.2.2. Examens complémentaires
a/ Pesée
Tous les oiseaux sont pesés avant le traitement et le dernier jour avant l’autopsie
des oiseaux (J0 et J12).
b/ Prise de sang
Le sang a été prélevé à la veine jugulaire dans les tubes héparinés au jour 0 (J0),
avant le traitement et le dernier jour avant l’autopsie des oiseaux (J12). Le sang a été
centrifugé pour récupérer le sérum qui a ensuite été conservé à -20°C jusqu’à utilisation.
c/ Abattage des oiseaux
Au dernier jour de traitement, tous les canards ont été tués, 12h après le dernier
repas. L'autopsie a été effectuée, des organes (le foie, le rein, le gésier, le cœur et la rate)
ont été prélevés puis pesés et fixés dans le formol pour analyse histologique ou
conservés à -80°C jusqu'à analyse.
II.3.4. Toxicité chronique
II.3.4.1. Protocole A
II.3.4.1.1. But de l’étude
Déterminer l’effet de l’ingestion répétée de différentes doses de FB1 pendant
une période prolongée (11 semaines).
II.3.4.1.2. Méthode expérimentale
a / Animaux et alimentation
40 canards mâles âgés de 1 jour ont été acclimatés avec libre accès à la
nourriture (Aliso, Auch, France) et à l’eau pendant une semaine avant le début de
l'étude. A l’âge de 7 jours, les oiseaux ont été pesés, identifiés par des bagues aux ailes et
séparés en 5 lots de 8 oiseaux. La fumonisine B1 a quotidiennement été administrée
pendant 77 jours par voie orale sous forme de matériel de culture équivalent aux doses
suivantes: 0, 2, 8, 32 et 128 mg de FB1/kg d’aliment. L’alimentation est fournie ad
83
Jour
Début du traitement
Age : 84 jours
Age : 1 jour
J0 J77
Durée du traitement
Autopsie
J14
Pesée et prélèvement de sang de 8 canards par lot, par semaine
J7 J21 J28 J35 J42 J49 J56 J63 J70
Age : 7 jours
libitum par un aliment classique (démarrage jusqu'à 3 semaines, puis croissance)
dépourvu de mycotoxines.
Schéma II.3 : Protocole expérimental d’intoxication chronique (Protocole A).
b/ Examens complémentaires
Pesée
Tous les oiseaux sont pesés une fois par semaine le matin, avant de recevoir la
ration expérimentale, pendant toute la période de 77 jours.
Prise alimentaire
La prise alimentaire moyenne par lot d’oiseaux est déterminée chaque semaine.
Prise de sang et abattage des oiseaux
A partir du J21 de traitement jusqu’au J77, chaque semaine, les animaux sont
prélevés pour analyse biochimique du sérum et mesure du rapport Sa/So. Au jour 77,
après avoir prélevé le sang à la veine jugulaire, tous les oiseaux sont tués pour récupérer
le foie, le cœur, le muscle pectoral, la rate, le gésier et le rein. Les organes sont prélevés,
pesés et conservés à -80°C ou dans du formol avant analyse.
II.3.4.2.Protocole B
II.3.4.2.1. But de l’étude
Compléter les données obtenues grâce au Protocole A. Cette nouvelle étude va
nous permettre de réaliser des prélèvements lors des premières semaines de traitement
(entre J0 et J28) dans les mêmes conditions que le protocole précédent.
84
II.3.4.2.2. Méthode expérimentale
a/ Animaux et alimentation
105 canards mâles âgés de 1 jour ont été acclimatés avec accès libre à la
nourriture (Aliso, Auch, France) et à l’eau pendant une semaine avant le début de
l'étude. A l’âge de 7 jours, les oiseaux ont été pesés, identifiés par des bagues aux ailes et
séparés en 5 lots : 25 canetons pour lot témoin et 20 canetons par lot traité. La
fumonisine B1 a quotidiennement été administrée pendant 28 jours par voie orale sous
forme de matériel de culture équivalent aux doses suivantes: 0, 2, 8, 32 et 128 mg de
FB1/kg d’aliment. L’alimentation est fournie ad libitum par un aliment classique
(démarrage jusqu'à 3 semaines, puis croissance) dépourvu de mycotoxines.
Schéma II.4 : Protocole expérimental d’intoxication chronique (Protocole B).
b/ Examens complémentaires
Pesée
Tous les oiseaux sont pesés une fois par semaine le matin, avant de recevoir la
ration expérimentale, pendant toute la période de 28 jours.
Prise alimentaire
La prise alimentaire moyenne par lot d’oiseaux est déterminée chaque semaine.
Age : 1 jour
Durée du traitementJour
Age : 35 jours
Autopsie finale
J0
Prélèvement de sang et autopsie de 5 canards par lot, par semaine
J7 J14 J21
Début du traitement, autopsie de 5 canards
du lot témoin
Age : 7 jours
J28
85
Prise de sang et abattage des oiseaux
Au J0, après avoir prélevé le sang à la veine jugulaire, 5 oiseaux du groupe
témoin sont tués pour récupérer le foie. Cet organe est pesé et conservés à -80°C ou dans
du formol avant analyse.
Aux jours 7, 14, 21 et 28 de traitement, 5 oiseaux par groupe ont été tués. Le
sang et le foie ont été prélevés comme décrit plus haut pour analyse des paramètres
biochimiques sériques, mesure du rapport du Sa/So ou examen histologique.
II.4. Paramètres biochimiques et dosage de Sphinganine (Sa) et Sphingosine (So)
II.4.1. Biochimies sériques
Les paramètres biochimiques sériques suivants ont été analysés :
Alanine aminotransferase CE 2.6.1.2 (ALAT) :
Aspartate aminotransferase CE 2.6.1.1 (ASAT)
Phosphatase alcaline CE 3.1.3.1 (PAL)
Lactate déshydrogénase CE 1.1.1.27 (LDH)
Cholestérol total
Protéines totales
Ces analyses ont toutes été réalisées à l’hôpital de Rangueil21 (Toulouse).
II.4.2. Dosage de Sa et So dans le sérum et dans les tissus
La procédure d’extraction et dosage de Sphinganine (Sa) et de Sphingosine (So)
libre dans les sérums et tissus que nous avons retenue est basée sur celle décrite par
Mérill et coll. [289] et reprise par Riley et coll. [231] avec quelques modifications.
Dans tous les cas, la quantification des bases sphingoïdes « in vivo » nécessite
plusieurs étapes :
- une extraction - purification
21 1, avenue Jean Poulhès, 31403 Toulouse Cedex 4
86
- une dérivatisation car les molécules natives ne présentent aucune propriété
d’absorption dans l’Ultra Violet ou la lumière visible, ni aucune propriété de
fluorescence.
- un dosage par HPLC et détection de fluorescence.
Un standard interne est utilisé, pour s’affranchir des différences d’extraction et
pour gagner en précision sur la concentration en Sa dont le niveau est très bas dans des
conditions usuelles [231].
La différence entre les méthodes déjà décrites et celle que nous avons adoptée
dans ce travail touche essentiellement la partie d’extraction purification.
II.4.2.1. Procédure d’extraction
La procédure d’extraction de la Sa et la So dans le sérum et les tissus repose sur des
propriétés d’extraction en phase liquide.
Pour les tissus, une étape préalable d’homogénéisation est nécessaire.
II.4.2.1.1. Préparation d’homogénat de tissus
Un gramme de tissus est pesé et broyé grâce à un Potter en verre à une vitesse
de 500 tours/min dans 3000 µL de tampon K (pH=7,4)22.
Le broyat obtenu est centrifugé 3000g/min pendant 15 minutes et l’homogénat
de tissus est récupéré (Schéma II.5).
1g tissus (foie, rein ou muscle) + 1000 µL tampon K (pH=7,4)
Broyer au Potter-Elvejhem (N0 AA 7223) avec piston (500 tours)
Rincer le Potter par 1000 µL tampon K (x 2 fois)
Centrifuger à 3000 g/min. pendant 15 min.
Récupérer l’homogénat de tissus (approximativement 3000 µL) (Jeter le culot)
Schéma II.5 : Préparation d’homogénat de tissus.
22 200 mL KH2PO4 0,1M (13,6g/L) + 800mL K2HPO4 0,1M (17,4g/L) 23 Thomas Philadelphia, USA
87
II.4.2.1.2. Extraction de Sa et So à partir de sérum ou d’homogénat de tissus
La Sphinganine C20 (Sa C20) est utilisée comme standard interne afin de
déterminer un pourcentage d’extraction pour chaque échantillon traité. Ainsi, avant
l’extraction, 100 µL de Sa C20 10µM sont déposés dans un tube en verre et évaporés à
sec. 100 µL de sérum ou d’homogénat de tissus sont ajoutés. L’extraction débute par
l’ajout de 1500 µL de mélange Méthanol-Chloroforme (4v/1v) et 100 µL de solution
d’hydroxyde de Potassium (KOH) 1M24. L’ensemble est incubé à 37°C pendant 1 heure.
Après avoir laissé refroidir les échantillons à température ambiante, 1000 µL de
chloroforme et 2000 µL d’eau alcaline25 sont ajoutés. Les tubes sont délicatement
retournés 20 fois.
Une centrifugation de 20 minutes à une vitesse de 3000g/min est réalisée à
température ambiante afin de séparer les deux phases en présence. La phase organique
(phase inférieure) est récupérée, l’autre jetée. Un rinçage de cette phase chloroformique
par 3000 µL d’eau alcaline est effectué puis une centrifugation identique à la précédente
va nous permettre de récupérer à nouveau la phase organique. Elle est ensuite évaporée
à sec sous azote à la température de 45-50°C.
II.4.2.2. Préparation des solutions
II.4.2.2.1. Solution de standard
Une gamme de standard de So, Sa est préparée à des concentration allant de 25
à 5000 nM (mélange de standards So, Sa dans l’éthanol) pour effectuer un étalonnage de
nos appareils et réaliser les dosages ultérieurs. Ces solutions standards nous
permettrons d’avoir accès aux différents paramètres de validation de la méthode de
dosage.
II.4.2.2.2. Solution de standard dérivé
Une quantité de 20 µL de chacune des solutions de la gamme sont mis en présence
de 40 µL de la solution d’OPA (ortho-phthaldialdéhyde)26 et de 140 µL de mélange
méthanol-eau (90v/10v). L’ensemble est agité et puis mis aux ultra-sons pendant 10 min
à température ambiante avant injection de 20 µL dans la colonne de CLHP. 24 KOH 1M : 56,11g + Eau QSP 1 litre 25 Eau alcaline : 100µL de NH4OH 2N + 250mL d’eau distillée 26 OPA : 25mg OPA + 500µL éthanol + Tampon Borate QSP 50mL (+ 25µL β-mercaptoéthanol tous les 2jours)
Tampon Borate : 3g Acide Borique + 30mL Eau + 30mL KOH 1M + KOH 1M QSP pH=10,5 + Eau QSP 100mL
88
II.4.2.2.3. Solution d’essai
Après évaporation, le résidu sec est repris dans 20 µL d’Ethanol. 40 µL de
d’OPA ainsi que 140 µL de mélange de méthanol-eau (90v/10v) sont ajoutés.
L’ensemble est mis aux ultra-sons pendant 10 min puis centrifugé à 3000g/min pendant
10 min et passé à travers un filtre à membrane avant injection.
Les concentrations en So et Sa seront déterminées après une injection de 20µl de
solution dérivée dans le système chromatographique. La mesure des aires des différents
pics obtenus est traduite en concentration grâce aux calibrations obtenues à l’aide de
standard de Sa et So et en tenant compte des traitements et dilutions effectuées. La
surface obtenue pour C20 Sa nous permet d’avoir accès au pourcentage d’extraction
pour chaque échantillon. Les concentrations en So et en Sa sont exprimées en
nanomole/litre pour le sérum et en nanomole/gramme pour les tissus.
II.4.2.3. Séparation et dosage
II.4.2.3.1. Généralité
Le système CLHP comporte :
- une colonne analytique de nature phase inverse (contenant des particules de
silice greffées par des groupements C18 d’une granulométrie de 5 microns)
- un détecteur de fluorescence dont les longueurs d’onde d’excitation et
d’émission sont respectivement de 335 nm et de 440 nm. Le range est de x 256 et la
sensibilité est à niveau élevé. [231, 290].
- la phase mobile est composé de méthanol et d’eau (9v :1v)
- le débit est 1,25 ml/min.
- la sphinganine C20 est utilisée comme standard interne.
Les sphingolipides ont les temps de rétention suivants : sphingosine (So) : 12,5
min, sphinganine (Sa) : 17,5 min et sphinganine C20 : 29 min. Les chromatographes ci
après sont obtenus pour des solutions de standard (Figure II.1), un échantillon de foie
témoin (Figure II.2) et traité (Figure II.3).
89
Figure II.1 : Chromatogramme d’un mélange de standards So-Sa 0,5 µM et Sa C20 10µM.
Figure II.2 : Chromatogramme d’un échantillon de foie d’un canard témoin (0 mg FB1/kg
d’aliment) au J7 de traitement + Sa C20 10 µM
Figure II.3 : Chromatogramme d’un échantillon de foie d’un canard traité (128 mg FB1/kg
d’aliment) au J7 de traitement + Sa C20 10 µM
Temps (min)
µV
Temps (min)
µVµV
Temps (min)
90
II.4.2.3.2. Validation de la méthode de dosage
a/ Linéarité
Des solutions diluées d’un mélange de standard de Sa et So sont utilisées pour
réaliser une étude de régression. Pour cela, les solutions de standard sont injectées en
triplicate pour chaque concentration. Par la suite, on vérifiera que la relation entre
quantité injectée et réponse observée (ici l’aire) peut être considérée comme une droite.
Dans notre cas, 8 points de gamme ont été testés : 0, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 et 5000
nM.
La réponse du détecteur (aire en µv*s) en fonction de molarité en nM est linéaire
sur la gamme de concentration comprise entre 0, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 et 5000 nM.
Les équations des droites obtenues sont les suivantes : y=0,0051x pour la Sphinganine et
y=0,0045x pour la Sphingosine (y : concentration (nM) et x : l’aire du pic après
chromatographie (µv*s)) et les coefficients de corrélation obtenus, récapitulés sur le
Tableau II.1, sont toujours de l’ordre de 0,999.
b/ Limite de détection (LD) et limite de quantification (LQ)
LD : c’est la plus petite quantité de substance dans un échantillon pouvant être
détectée, mais non quantifiée.
LQ : c’est la plus petite quantité de substance dans un échantillon pouvant être
dosée dans les conditions expérimentales décrites avec une fidélité définie [291].
En théorie, LD et LQ sont déterminées à partir d’échantillons supplémentés à
des concentrations croissantes en comparaison avec les mêmes échantillons témoins.
Leur détermination pratique est basée sur le rapport signal/bruit. La LD est la
concentration qui engendre un signal 2 fois supérieur à celui du même échantillon
témoin, et l’on s’accorde à déterminer la LQ comme la concentration qui engendre un
signal 4 fois supérieur à celui à celui du même échantillon témoin.
En ce qui nous concerne, il n’existe pas de sérum (ou plasma) témoin (sans Sa
et/ou So) ; nous avons donc réalisé une estimation de ces LD et LQ, en comparant la
hauteur de bruit de fond d’échantillon au voisinage des temps de rétention des bases
sphingoïdes et des hauteurs de pics obtenues sur nos gammes en appliquant des
facteurs respectifs de 3 et 5.
Les limites de détection et de quantification sont présentées dans le Tableau II.1.
91
c/ Répétabilité
C’est la mesure de la précision sur des mesures effectuées sur un même
échantillon par le même opérateur, sur le même appareillage [292].
On procède de la manière suivante : une solution standard de chaque base
sphingoïde à 5µM est injectée 10 fois successivement.
Les résultats obtenus présentés sur le Tableau II.1 attestent d’une répétabilité
satisfaisante puisque pour les aires mesurées de Sa et So, les CV% enregistrés sont
toujours inférieurs à 5%[293].
d/ Reproductibilité
C’est la mesure de la précision mais évaluée par des mesures effectuées sur
plusieurs jours [292]. On l’estime par le calcul du CV%. On procède de la manière
suivante : des standards de Sa et So sont injectés 10 fois sur quarante jours différents.
Les résultats obtenus présentés sur le Tableau II.1 attestent d’une
reproductibilité satisfaisante puisque les CV% enregistrés pour les aires mesurées de Sa
et So sont toujours inférieurs à 5%[293].
Tableau II.1 : Validation de la méthode de dosage.
Paramètres de validation Sphinganine Sphingosine
Linéarité r =0,999 r =0,999
Limite de détection et de quantification 25 nM (pour LD) et 50 nM (pour LQ)
Répétabilité CV= 3% CV= 4%
Reproductibilité CV= 4% CV= 5%
e/ Stabilité du dérivé fluorescent dans le temps
La stabilité du dérivé fluorescent a été étudiée pour s’assurer qu’il était possible
de réaliser d’importantes séries d’analyses à l’aide d’un passeur d’échantillon.
Elle a été conduite de la manière suivante : un mélange de standard de Sa et So
à 0,5µM a été dérivatisé puis injecté 5 fois en 6 jours aux échéances 0 ; 0,5 ; 1 ,5 ; 3,5 et 6
jours. Jusqu’à 1,5 jours nous n’enregistrons aucune variation significative du paramètre
observé (Aire des pics). A 3,5 jour une diminution de 7% est notée tandis qu’à 6 jours
elle est de 15%.
92
Cette étude nous permet d’être certain de pouvoir traiter l’extraction -
purification des échantillons dans une journée et de pouvoir les dérivatiser afin de
réaliser les dosages de manière automatique durant la nuit. Les résultats sont présentés
dans le Tableau II.2.
Tableau II.2 : Stabilité du dérivé fluorescent dans le temps : résultat présenté en % des aires
obtenues à jour 0 considérées comme 100%.
Jour Sphinganine Sphingosine
0 100% 100% 0,5 100% 99% 1,5 97% 97% 3,5 93% 93% 6 85% 87%
II.4.2.3.3. Expression des résultats
a/ Pourcentage d’extraction
Comme décrit par Riley et coll. [231], le dosage de Sa est relativement
compliqué car les pourcentages d’extraction peuvent être variables et faibles (environ
40% dans les tissus). C’est un réel problème dans le cas d’échantillons provenant
d’oiseaux témoins dans lesquels les niveaux réels de Sa sont déjà particulièrement
faibles. C’est pour cela que l’utilisation de Sa C20 comme un standard interne a été
préconisée pour s’affranchir de ce problème.
Lors de chaque série d’analyse, 100µl du standard interne Sa C20 à 10 µM sont
évaporés à sec dans un tube (en verre) avant d’ajouter 20µl de standard de Sa, So à
0,5µM. Ce mélange est dérivatisé comme décrit plus haut puis injecté sur colonne de
CLHP en début, en milieu et en dernier de la série d’échantillons.
L’aire obtenue pour le pic de standard interne Sa C20 est considérée comme le
100% théorique pour le calcul du pourcentage d’extraction.
b/ Calcul des concentrations
Le calcul des concentrations en sphingolipides après chromatographie est basé sur
l’équation obtenue des droites de calibration présentées plus haut : y=0,0051x
(R2=0,9987) pour la Sphinganine et y=0,0045x (R2=0,9998) pour la Sphingosine avec y :
concentration de la solution dérivatisée (nM) et x : l’aire du pic chromatographique
93
(µv*s). Il faut toutefois tenir compte du pourcentage d’extraction (P%) pour chaque
échantillon.
Dès lors, les concentrations en sphingolipides après chromatographie seront
calculées de la manière suivante :
Pour le sérum : (nmol/litre de sérum)
Avec
y : nanomol par litre de
P% = Aire mesurée C20 é
Pour les tissus,
Avec
y : nanomol par litre de
P% = Aire mesurée C20 é
c/ Rapport Sa/So
Le rapport Sa/So es
calculé de la manière suivant
Avec
[Sa] : concentrations e
[So] : concentrations e
II.5. Analyses statistiques
Les résultats sont exprim
types (Protocole II.1, II.2 et II
Le traitement statistique des
de variance à un facteur (AN
[Sérum] = y/P%*5
solution dérivatisée
chantillon/Aire mesurée C20 standard
(nmol/gramme de tissu)
[Tissu] = 3y/P% *5000solution dérivatisée
chantillon/Aire mesurée C20 standard
t le biomarqueur d’exposition à la FB1. Ce rapport est
:
n S
n S
és
.3) e
rés
OV
[Sa] / [So]
phinganine
phingosine
de manière générale sous la forme : moyenne ± écart-
t moyenne ± erreurs standard (Protocole II.4A et II.4B).
ultats est exploité en réalisant tout d’abord une analyse
A) après vérification de l’homogénésité des variantes.
94
Quand des différences significatives entre les moyennes sont signalées (P <0.05),
elle seront soulignées par des étoiles (*) sur les graphiques. Dans ce dernier cas, la
différence entre moyennes de différents lots est déterminée par le test de Tukey.
95
Partie III. RÉSULTATS
96
0
35
70
105
0 mg/kg FB1 5 mg/kg FB1 15 mg/kg FB1 45 mg/kg FB1
Poid
sdu
Foie
(g)
III.1. Toxicité subaiguë sur canards en croissance
III.1.1. Effets sur la santé
III.1.1.1. Mortalité et Performance
Les performances de canards mulards recevant de la FB1 quotidiennement par
voie orale pendant 12 jours sont présentées dans la Figure III.1.1. Aucune mortalité ou
manifestation clinique n’a été observée au cours de l’étude. Le poids vif a graduellement
augmenté chez tous les animaux, aucune différence significative entre témoins et traités
n’étant observée. Cependant, une diminution significative du gain de poids a pu être
mise en évidence chez les animaux recevant de la FB1.
Figure III.1.1 : Effets de la FB1 sur les poids vif et la croissance1 (administration quotidienne par
intubation pendant 12 jours de 0, 5, 15 et 45 mg/kg PV). 1 Valeurs obtenus pour 5 animaux par groupe et exprimées en moyenne ± écart-type.
A l’autopsie, aucune lésion n’a pu être mise en évidence, en dehors d’une
hépatomégalie sur les animaux exposés aux fumonisines. L’augmentation du poids du
foie est significative et liée à la dose de toxine administrée (augmentation respective de
29, 36 et 48% pour les canards recevant 5, 15 et 45 mg/kg de FB1) (Figure III.1.2).
Figure III.1.2 : Effets de la FB1 sur les poids des foies1 (administration quotidienne par
incubation pendant 12 jours de 0, 5, 15 et 45 mg/kg PV). 1 Valeurs obtenus pour 5 animaux par groupe et exprimées en moyenne ± écart-type.
0
1
2
3
0 1 2 3 4 5
kg
J0 (Po ids vifs)J12 (Poids vifs)Cro issance
5 mg/kg FB1 15 mg/kg 45 mg/kg 0 mg/kg FB1
97
III.1.1.2. Histologie
Les analyses histologiques du cerveau, du rein et du foie ont été conduites après
la coloration Giemsa. Aucune anomalie n’a pu être mise en évidence dans le cerveau ou
le rein quel que soit le groupe d’animaux envisagé. Une altération de l’organisation
hépatique a en revanche pu être constatée chez les animaux exposés aux fumonisines
(Figure III.1.3). Elle se caractérise par une désorganisation des travées avec
implémentation d’une structure micro glandulaire aussi bien en région périportale
qu’en région centrolobulaire. L’infiltration inflammatoire et les fibroses périportales
étaient nulles ou minimes pour l’ensemble des animaux.
Figure III.1.3 : Coloration Giemsa. A1 (X100) et A2 (X600) : Foie de canard témoin. Remarquer
la présence des travées hépatiques (les lignes pointillées). B1 (X100) et B2 (X600) : Foie de canard recevant
45 mg de FB1/kg PV/jour pendant 12 jours. Remarquer la mise en place d’une structure micro
glandulaire (flèches) dans les régions périportales et centrolobulaire.
A1 A2
B1 B2
98
III.1.2. Altérations biochimiques
L’absence de valeurs usuelles concernant les paramètres biochimiques sériques
chez le canard mulard a justifié la réalisation d’une étude préalable d’un certain nombre
de marqueurs sur des animaux non exposés aux mycotoxines et indemnes de toute
affection connue. Les paramètres de distribution statistique des concentrations sériques
en protéines totales et en cholestérol ainsi que les activités de l’alanine aminotransférase
(ALAT) et de la lactate déshydrogénase (LDH) sont présentés dans le tableau III.1.1. Le
calcul du percentile 90 pour chacun de ces paramètres a pu être effectué.
Tableau III.1.1 : Paramètres de distribution des concentrations sériques en protéines totales,
cholestérol, ALAT et LDH chez les canards non exposés aux mycotoxines.
PROT : protéines totales ; CHOL : cholestérol; ALAT : alanine aminotransférase; LDH : lactate
déshydrogénase; IC: intervalle de confiance de la moyenne.
Les effets de la FB1 administrée quotidiennement par VO pendant 12 jours sur
les concentrations sériques en protéines totales et en cholestérol ainsi que sur les
activités de l’alanine aminotransférase et de la lactate déshydrogénase sont présentés
dans la Figure III.1.4.
Une augmentation significative de tous ces paramètres est obtenue en fin
d’expérimentation pour toutes les doses utilisées (t-test, P<0,05).
Des différences significatives par rapport aux témoins pour les concentrations
en protéines totales et en cholestérol ainsi que sur les activités de l’alanine
PROT (g/l)CHOL
(mmol/l)
ALAT
(U/l) LDH (U/l)
Nombre d’échantillons 500 500 500 500
Minimum 34 3,1 4 342
Maximum 58 5,7 56 6456
Médiane 41 4,3 23 1705
Moyenne 42,1 4,4 24 2046
Ecart-type 4,4 0,5 9 1202
Erreur Standard 0,20 0,02 0,40 53.77
IC 99% (supérieure) 42,6 4,4 25 1908
IC 99% (inférieure) 41,6 4,3 22,9 1907
Percentile 90 48 5 34 3800
99
aminotransférase et de la lactate déshydrogénase sont respectivement obtenues après 8,
6, 4 et 4 jours (ANOVA à 1 facteur, P<0,05).
Figure III.1.4 : Effets de la FB1 administrée quotidiennement par VO pendant 12 jours sur les
concentrations sériques en protéines totales, cholestérol et les activités de l’alanine aminotransférase,
lactate déshydrogénase chez le canard. Les données sont présentées sous la forme moyenne ± écart-type
obtenues pour un groupe de 5 animaux recevant 0, 5, 15 et 45 mg de FB1/kg PV pendant 12 jours. (----) :
90ème percentile obtenu sur 500 canards témoins non exposés aux mycotoxines. * : Différence significative
entre les groupes (ANOVA, P<0,05).
La juxtaposition de ces résultats aux données précédemment établies sur des
canards non exposés aux toxines révèle qu’un dépassement du percentile 90 est observé
encore plus précocement. Ainsi seulement 1 à 4 administrations de FB1 suffisent à
dépasser ce paramètre (Tableau III.1.2).
Bien que le délai nécessaire au dépassement de ce percentile soit lié à la dose de
fumonisine administrée, la relation n’est pas linéaire.
La multiplication du délai par la dose permet d’obtenir la dose cumulée en FB1
nécessaire pour avoir un effet détectable sur les paramètres étudiés au cours d’une
intoxication aigue. Cette opération confirme que la dose cumulée nécessaire pour
obtenir un même effet est fort différente selon les lots, ce qui suggère une saturation de
l’effet aux plus fortes doses.
30
40
50
60
70
0 2 4 6 8 10 12
0 mg FB1/ kg P V/ j 5 mg FB1/ kg P V/ j
15 mg FB1/ kg P V/ j 45 mg FB1/ kg P V/ j
0
4
8
12
16
0 2 4 6 8 10 12
Prot
éine
sto
tale
s(g
/L)
Cho
lest
érol
(mm
ol/L
)
Durée de traitement (jour) Durée de traitement (jour)
*
**
** *
*
0
20
40
60
80
0 2 4 6 8 10 12
0
5000
10000
15000
20000
0 2 4 6 8 10 12
ALA
T(u
/L)
LDH
(u/L
)
Durée de traitement (jour) Durée de traitement (jour)
*
**
* *
**
**
*
100
Tableau III.1.2 : Estimation de la dose de FB1 nécessaire pour dépasser le percentile 90 de
différents paramètres biochimiques établis chez les canards non exposés aux mycotoxines.
PROT CHOL ALAT LDH
En utilisant la relation temps/effet (Figure III.1.4)
Durée de traitement (jours) nécessaire au dépassement
du percentile 90 (jours)*
45 mg de FB1 /kg/jour voie orale 4,23 0,85 2,28 1,96
15 mg de FB1 /kg/jour voie orale 4,91 1,17 2,58 2,57
5 mg de FB1 /kg/jour voie orale 7,13 1,52 4,08 4,71
Dose cumulative correspondante (mg/kg)**
45 mg de FB1 /kg/jour voie orale 190 38 103 88
15 mg de FB1 /kg/jour voie orale 74 18 39 39
5 mg de FB1 /kg/jour voie orale 36 8 20 24
En utilisant la relation dose/effet (Figure III.1.5)
Dose cumulative (mg/kg) nécessaire au dépassement
du percentile 90 20 12 10 15
PROT : protéines totales ; CHOL : cholestérol; ALAT : alanine aminotransférase; LDH : lactate
déshydrogénase;
* : Estimée par régression;
** : obtenue par la multiplication de la durée par la dose administrée.
Une autre approche de la plus faible dose de FB1 susceptible d’entraîner un effet
détectable consiste à établir la relation existant entre la dose cumulée administrée au
cours de l’étude et le paramètre étudié (Figure III.1.5).
Cette approche révèle là encore que, bien que l’effet des fumonisines sur les
concentrations sériques en protéines totales et en cholestérol ainsi que sur les activités
de l’alanine aminotransférase et de la lactate déshydrogénase soit fonction de la dose,
cet effet est saturable.
Une modélisation non paramétrique de la relation dose/effet précédemment
établie a été réalisée à l’aide du logiciel SigmatPlot en utilisant l’équation suivante :
y = moyenne + a/(1 + b/x)
avec y la concentration du paramètre mesuré, moyenne, la moyenne du
paramètre étudié obtenue sur les 500 animaux non exposés aux mycotoxines et x, la
101
dose cumulée de FB1 administrée. Les paramètres du modèle sont présentés dans le
Tableau III.1.3. Le fort coefficient de corrélation obtenu, suggère que le modèle utilisé
pour la détermination est correct.
Cette modélisation permet de déterminer la dose cumulée de FB1 susceptible
d’entraîner un dépassement du percentile 90 précédemment établi sur des canards
mulards non exposés aux fumonisines. Cette dose a été rapportée dans le tableau III.1.2.
Figure III.1.5 : Effets de la FB1 (doses cumulées en mg/kg PV) administrée quotidiennement
par VO pendant 12 jours sur les concentrations sériques en protéines totales, cholestérol et les activités de
l’alanine aminotransférase, lactate déshydrogénase chez le canard. Valeurs individuelles (-♦-) et moyenne
± écart-type obtenus pour chaque groupe. (----) : percentile 90 obtenu chez 500 animaux témoins non
exposés aux mycotoxines. (____) : Modélisation non paramétrique (logiciel Sigmaplot) de la relation
dose/effet en utilisant l’équation : y = moyenne + a/(1 + b/x) avec : y, la concentration du paramètre
mesuré, moyenne, la moyenne du paramètre obtenue sur 500 animaux non exposés aux mycotoxines et x,
la dose cumulative de la FB1 administrée.
Prot
éine
sto
tale
s(m
g/L)
FB1 (mg/kg PV, dose cumulée) FB1 (mg/kg PV, dose cumulée)
Cho
lest
érol
(mm
ol/L
)
FB1 (mg/kg PV, dose cumulée) FB1 (mg/kg PV, dose cumulée)
ALA
T(u
/L)
LDH
(u/L
)
102
Tableau III.1.3 : Modélisation non paramétrique (logiciel Sigmaplot) de la relation dose/effet
obtenue après 12 jours de traitement chez les canards.
PROT (mg/l) CHOL (mg/l) ALAT (U/l) LDH (U/l)
Moyenne 42 4,4 24 2046
a +/- SE 20 +/- 2,2 10,3 +/- 0,8 50,5 +/- 5,8 16762 +/- 2932
P of a <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001
b+/- SE 52,8 +/- 23,6 90,7 +/- 24,7 27,6 +/- 18,6 97 +/- 55
P of b 0,0380 0,0017 0,1544 0,093
R2 0,90 0,95 0,88 0,84
ED10 6 10 3 11
PROT : protéines totales ; CHOL : cholestérol; ALAT : alanine aminotransférase; LDH : lactate
déshydrogénase; SE : Erreurs standard ; ED10 : dose qui détermine 10% de l’effet.
Cette modélisation permet également de déterminer la dose cumulée de FB1
susceptible d’entraîner 10% de l’effet maximal (ED10).
La comparaison de ces approches très différente révèle que :
- l’ALAT est dans tous les cas le paramètre biochimique non spécifique le plus
sensible,
- des doses cumulées de l’ordre de 5 à 10 mg/kg de FB1 administrées sur
quelques jours sont suffisantes pour entraîner un effet biochimique détectable.
Ces analyses posant un problème de spécificité, les paramètres biochimiques
étudiés signent une altération hépatique et non une exposition spécifique aux
fumonisines. Par conséquent, les effets de ces toxines sur les sphingolipides ont été
étudiés.
III.1.3. Altérations des Sphingolipides
Comme pour les paramètres biochimiques non spécifique, l’absence de valeurs
usuelles concernant les concentrations sériques en sphinganine et en sphingosine chez le
canard mulard (et les autres espèces) a justifié la réalisation d’une étude préalable sur
des animaux non exposés aux mycotoxines et indemnes de toute affection connue. Les
paramètres de distribution statistique des concentrations en Sa et So sériques sont
présentés dans le tableau III.4. Le calcul du percentile 90 a pu être effectué.
103
Tableau III.1.4 : Paramètres de distribution statistique des concentrations sériques en
sphinganine libre et du rapport sphinganine/ sphingosine chez les canards mulards non exposés aux
mycotoxines.
Sa: sphinganine; So: sphingosine; Sa/So: rapport sphinganine/sphingosine; IC: Intervalle de
confiance de la moyenne.
Les effets de la FB1 administrée quotidiennement par VO pendant 12 jours sur
les concentrations sériques en Sa et sur le rapport Sa/So sont présentés dans la Figure
III.1.6.
Une augmentation significative de ces paramètres est obtenue en fin
d’expérimentation pour toutes les doses utilisées (t-test, P<0,05).
Des différences significatives par rapport aux témoins pour les concentrations
en Sa et le rapport Sa/So sont respectivement obtenues après 2 et 6 jours (ANOVA à 1
facteur, P<0,05).
Sa
(nmol/l)
So
(nmol/l) Sa/So
Nombre d’échantillons 50 50 50
Minimum 16 16 0,29
Maximum 56 83 1,37
Médian 27 38 0,82
Moyenne 30 42 0,77
Ecart-type 9 17 0,25
Erreur standard 1,92 3,64 0,05
IC 99% au-dessus 35 53 0,93
IC 99% au-dessous 24 32 0,62
Percentile 90 40 70 0,95
104
Figure III.1.6 : Effets de la FB1 administrée quotidiennement par VO pendant 12 jours sur la
concentration sérique en Sa (A) et le rapport Sa/So (B). Les données sont présentées sous la forme
moyenne ± écart-type obtenues pour un groupe de 5 animaux recevant 0, 5, 15 et 45 mg de FB1/kg PV
pendant 12 jours. (----) : 90ème percentile obtenu chez 50 canards témoins non exposés aux mycotoxines. * :
Différence significative entre les groupes (ANOVA, P<0,05).
La juxtaposition de ces résultats aux données précédemment établies sur des
canards non exposés aux toxines révèle qu’un dépassement du percentile 90 est observé
encore plus précocement. Ainsi, pour la Sa, seulement 1 à 2 administrations de FB1
suffisent à entraîner un dépassement. 2 à 4 administrations sont nécessaires dans le cas
du rapport Sa/So.
Comme cela a été fait pour les paramètres biochimiques non spécifiques, le délai
nécessaire au dépassement de ce percentile permet de calculer la dose cumulée en FB1
entraînant un effet détectable sur les sphingolipides au cours d’une intoxication aigue
(Tableau III.1.5). Le délais nécessaire pour obtenir un dépassement du percentile 90 de
la Sa étant inférieur à 1, il a été arrondi à 1 pour estimer la dose cumulative
correspondante.
0
500
1000
1500
2000
0 2 4 6 8 10 12
Durée de traitement (jour)
Con
cent
rati
onen
Sa(n
mol
/L)
5 mg FB1/kg PV/j 45 mg FB1/kg PV/j
15 mg FB1/kg PV/j 0 mg FB1/kg PV/j
0
1,5
3
4,5
6
0 2 4 6 8 10 12
Durée de traitement (jour)R
appo
rtSa
/So
** *
*
*
*
*
*
*
*
105
Tableau III.1.5 : Estimation de la dose de FB1 nécessaire pour dépasser le percentile 90 de la
concentration en Sa et du rapport Sa/So établis chez les canards non exposés aux mycotoxines.
Sa Sa/So
En utilisant la relation temps/effet (Figure III.1.6)
Durée de traitement (jours) nécessaire au dépassement du
percentile 90 (jours)*
45 mg de FB1 /kg/jour voie orale <1 1,6
15 mg de FB1 /kg/jour voie orale <1 2,7
5 mg de FB1 /kg/jour voie orale <1 4,0
Dose cumulative correspondante (mg/kg)**
45 mg de FB1 /kg/jour voie orale 45 72,0
15 mg de FB1 /kg/jour voie orale 15 40,5
5 mg de FB1 /kg/jour voie orale 5 20
En utilisant la relation dose/effet (Figure III.1.7)
Dose cumulative (mg/kg) nécessaire au dépassement du
percentile 90 0,25 1,5
De la même manière que précédemment, nous avons établi la relation existant
entre la dose cumulée administrée au cours de l’étude et le paramètre étudié (Figure
III.1.7).
Comme pour les paramètres biochimiques, bien que l’effet des fumonisines sur
les concentrations en Sa et le rapport Sa/So soit fonction de la dose, cet effet est
saturable. Cette relation a également été modélisée à l’aide du logiciel SigmatPlot en
utilisant l’équation suivante :
y = moyenne + a/(1 + b/x)
avec y la concentration du paramètre mesuré, moyenne, la moyenne du
paramètre étudié obtenue sur les 50 animaux non exposés aux mycotoxines et x, la dose
cumulée de FB1 administrée. Les paramètres du modèle sont présentés dans le Tableau
III.1.6. Le fort coefficient de corrélation obtenu, suggère que le modèle utilisé pour la
détermination est correct.
Cette modélisation permet de déterminer la dose cumulée de FB1 susceptible
d’entraîner un dépassement du percentile 90 précédemment établi sur des canards
mulards non exposés aux fumonisines. Cette dose a été rapportée dans le tableau III.1.5.
106
Figure III.1.7 : Effets de la FB1 (doses cumulées en mg/kg PV) administrée quotidiennement
par VO pendant 12 jours sur les concentrations sériques en Sa et le rapport Sa/So.. Valeurs individuelles (-
♦-) et moyenne ± écart-type obtenus pour chaque groupe. (----) : percentile 90 obtenu chez 50 animaux
témoins non exposés aux mycotoxines. (____) : Modélisation non paramétrique (logiciel Sigmaplot) de la
relation dose/effet en utilisant l’équation : y = moyenne + a/(1 + b/x) avec : y, la concentration du
paramètre mesuré, moyenne, la moyenne du paramètre obtenue sur 50 animaux non exposés aux
mycotoxines et x, la dose cumulative de la FB1 administrée.
Tableau III.1.6 : Modélisation non paramétrique (logiciel Sigmaplot) de la relation dose/effet
obtenue après 12 jours de traitement chez les canards.
Sa (nmol/l) Sa/So
Moyenne 30 0,77 a +/- SE 1781 +/- 202 4,28 +/- 0,08 P of a 0,0126 0,0004 b+/- SE 90 +/- 64 7,03 +/- 2,19 P of b 0,1174 0,0853 R2 0,989 0,999 ED10 10 0,8
PROT : protéines totales ; CHOL : cholestérol; ALAT : alanine aminotransférase; LDH : lactate
déshydrogénase; SE : Erreurs standard ; ED10 : dose qui détermine 10% de l’effet.
Cette modélisation permet également de déterminer la dose cumulée de FB1
susceptible d’entraîner 10% de l’effet maximal (ED10) (Tableau III.1.6).
Par ces approches, les doses cumulées de FB1 nécessaires pour entraîner un effet
détectable sur le métabolisme des sphingolipides sont inférieures à 1 mg/kg PV. Elles
sont inférieures à celles entraînant un effet sur les marqueurs biochimiques non
spécifiques.
0
500
1000
1500
2000
0 60 120 180 240 300 360 420 480 5400
1
2
3
4
5
6
0 60 120 180 240 300 360 420 480 540FB1 (mg/kg PV, dose cumulée)
Sa (nmol/L) Sa/So
FB1 (mg/kg PV, dose cumulée)
107
III.2. Toxicité pendant le gavage
III.2.1. Effets sur la santé
III.2.1.1. Mortalité et Performance
Les effets sur les paramètres zootechniques des fumonisines naturellement
présentes dans du maïs administré au cours du gavage de canards mulards sont
présentés dans le Tableau III.2.1. Aucune manifestation clinique n’a été observée au
cours de l’étude. Bien que 2 canards soient morts dans le groupe recevant le maïs
contaminé à hauteur de 20 mg FB1/kg, cette mortalité ne semble pas reliée à l’ingestion
de la toxine.
Tableau III.2.1 : Effet de l’ingestion du maïs naturellement contaminé par les fumonisines sur
les performances et le type d’engraissement hépatique chez le canard mulard après 12 jours de gavage1.
FB1 (mg/kg d’aliment)
Paramètres 0 10 20
Maïs ingéré (dose cumulative par canard, g) 9 976 9 959 9 972
Poids vifs en total (g) 5 639 ± 535 5 575 ± 490 5 540 ± 640
Ratio de conversation alimentaire 6,32 7,04 7,54
Poids du muscle pectoral (g) 480 ± 36 456 ± 33 470 ± 23
Poids de la graisse pectorale (g) 273 ± 21 280 ± 26 286 ± 22
Poids de la cuisse (g) 732 ± 69 740 ± 58 734 ± 72
Poids du manchon (g) 296 ± 32 280 ± 25 285 ± 31
Poids des viscères (g) 522 ± 84 526 ± 99 548 ± 97
Poids du foie (g) 532 ± 110 526 ± 102 472 ± 115
Score d’engraissement3 2,3 1,9 1,5
1 Valeurs obtenus pour 25 animaux par groupe et exprimées en moyenne ± écart-type. 2 Le score d’engraissement est déterminé après examen histologique du foie et attribution de la
note suivante selon le type d’engraissement majoritairement observé : Score de 1 = stéatose de type micro-
vacuolaire ; Score de 2 = stéatose de type micro et macro-vacuolaire ; Score de 3 = stéatose de type macro-
vacuolaire ; Score de 4 = stéatose de type macro-vacuolaire et vésicules lipidiques ; Score de 5 = stéatose
avec vésicules lipidiques.
108
Le poids vif a graduellement augmenté chez tous les animaux, aucune
différence entre témoins et traités n’étant observée. De même, aucun effet significatif sur
le taux de consommation alimentaire n’a été observé.
Aucune différence de rendement carcasse n’est constatée entre animaux
recevant du maïs indemne et animaux recevant du maïs contaminé par les fumonisines.
De même, bien que le poids des foies apparaisse moins important chez les animaux
recevant du maïs contaminé, cette différence n’est pas significative.
Ainsi, aucune différence significative sur les paramètres zootechniques entre
animaux témoins et animaux exposés ne semble observée au cours de cette étude.
Signalons cependant que l’ensemble des pertes occasionnées par les fumonisines à la
dose de 20 mg/kg d’aliment (foie moins lourd, indice de consommation alimentaire
supérieur) occasionne une perte voisine de 1€ par animal.
A l’autopsie, aucune lésion macroscopique n’a été observée. On observe
toutefois une décoloration quasi systématique des foies des animaux recevant le maïs
contaminé par 20 mg/kg de FB1 (Figure III.2.1).
Figure III.2.1 : Effets des fumonisines sur le foie après gavage à l’aide de maïs naturellement
contaminé par 0 (Témoin), 10 et 20 mg/kg FB1. Noter la décoloration jaune obtenue à 20 mg/kg.
Témoin 20 mg FB1/kg 10 mg FB1/kg
109
III.2.1.2. Histologie
Une analyse microscopique des foies a été conduite après coloration de Giemsa.
L’analyse comparée du type de surcharge graisseuse a révélé une modification du type
d’engraissement (Figure III.9).
Figure III.2.2 : Analyse histologique de foies après gavage avec du maïs indemne de
fumonisines (Témoin) et du maïs naturellement contaminé à hauteur de 20 mg de FB1/kg d’aliment.
Coloration Giemsa (x600), noter la diminution de taille et l’augmentation de nombre des vacuoles chez les
animaux exposés à la FB1.
Ces altérations nous ont conduit à réaliser une analyse systématique des lames
et à établir un score d’engraissement en fonction du type de stéatose prépondérant. Le
type d’engraissement prépondérant chez les animaux témoins était une stéatose micro
et macro vacuolaire. A l’inverse, la stéatose était majoritairement de type micro
vacuolaire chez les animaux recevant le maïs contaminé par 20 mg/kg de FB1. Le type
de stéatose observé chez les animaux recevant le maïs contaminé à 10 mg/kg était
intermédiaire (Tableau III.6).
III.2.2. Altérations biochimiques
Les effets de l’ingestion de maïs naturellement contaminé par des fumonisines
au cours du gavage ont été explorés sur différents paramètres biochimiques sériques
(Tableau III.2.2). Ces effets sont difficiles à interpréter en raison d’un effet du gavage
lui-même sur ces paramètres.
Témoin 20 mg FB1/kg
110
Tableau III.2.2 : Effet de l’ingestion du maïs naturellement contaminé par des fumonisines sur
les paramètres biochimiques sériques après 12 jours de gavage 1.
FB1 (mg/kg d’aliment)
0 10 20
Paramètres J0 J12 J0 J12 J0 J12
Protéines (g/L) 43 ± 3 45 ± 3 43 ± 2 46 ± 4 41 ± 3 49 ± 4*
Cholestérol (mmol/L) 4,94 ± 0,66 5,53 ± 0,48 4,87 ± 0,85 5,98 ± 0,52* 4,55 ± 0,53 6,06 ± 0,91*
ALAT (U/L) 23,2 ± 4,4 44,6 ± 7,1* 26,4 ± 3,8 53,3 ± 19,1* 29,2 ± 6,9 60,8 ± 16,2*
LDH (U/L) 3049 ± 742 4955 ± 508* 2584 ± 471 5106 ± 1538* 2892 ±1077 5269 ± 1528*
GGT (U/L) 14,0 ± 4,6 18,6 ± 8,3 14,8 ± 4,1 14,3 ± 3,9 15,6 ± 7,1 15,6 ± 4,2
PAL (U/L) 150 ± 15 130 ± 50 245 ± 178 120 ± 67 242 ± 51 346 ± 211
Bilirubine 5,6 ± 3,9 14 ± 14,3 6,2 ± 4,5 6,8 ± 2,2 8,6 ± 7,5 9,4 ± 5,7
Triglycérides 1,06 ± 0,28 4,26 ± 0,44* 1,09 ± 0,09 4,04 ± 0,75* 1,03 ± 0,13 4,94 ± 0,66 *
Créatinine (µmol/L) 11,2 ± 6,8 25,8 ± 4,9* 8,4 ± 2,2 24 ± 1,4* 10,6 ± 5,4 20,2 ± 4,1 *
Urée (mmol/L) 0,62 ± 0,12 0,74 ± 0,04* 0,60 ± 0,03 0,68 ± 0,03* 0,59 ± 0,04 0,70 ± 0,03 *
Sodium (mmol/L) 139 ± 3 139 ± 2 137 ± 2 142 ± 2 138 ± 1 138 ± 4
Potassium (mmol/L) 6,9 ± 4,1 7,1 ± 1,1 5,9 ± 2,3 7,0 ± 1,5 7,2 ± 1,4 7,3 ± 0,9
Chlorures (mmol/L) 108 ± 1 101 ± 3* 108 ± 1 103 ± 4 110 ± 1 103 ± 3 *
Bicarbonates (mmol/L) 18,0 ± 1,2 23,2 ± 6,5* 16,4 ± 2,2 24 ± 3,8* 17,2 ± 1,5 22,2 ± 3,3 *
1 Les valeurs sont obtenues sur 25 animaux par groupe et exprimées en moyenne ± écart-type.
ALAT : alanine aminotransférase; LDH : lactate déshydrogénase; GGT : Gamma-
glutamyltransférase ; PAL : phosphatase alcaline.
* : Différence significative (P<0,05 ; ANOVA) entre les valeurs en début de gavage et en fin de
gavage pour un même groupe.
Ainsi, le gavage conduit à une augmentation significative des teneurs sériques
en protéines, triglycérides, cholestérol, créatinine, urée, chlorures et bicarbonates, ainsi
qu’une augmentation des activités alanine aminotranférase et lactate déshydrogénase.
De ce fait, bien qu’une augmentation apparente de la protéinémie, de la
cholestérolémie et des activités de l’alanine aminotransférase et de la lactate
déshydrogénase semble observée chez les animaux exposés aux fumonisines, ces
différences ne sont pas significatives (ANOVA 2 facteurs, P < 0,05).
111
III.2.3. Altération des sphingolipides
Les effets de l’ingestion du maïs naturellement contaminé par les fumonisines
sur les sphingolipides sériques sont rapportés dans la figure III.2.3. Après 12 jours de
gavage, une augmentation significative en fonction de la dose est constatée aussi bien
sur les teneurs en sphinganine libre que sur le rapport Sa/So. Le gavage en lui-même
ne semble pas affecter ces paramètres.
Figure III. 2.3 : Effet de l’ingestion du maïs naturellement contaminé par des fumonisines sur le
rapport Sa/So (A) et les concentrations sériques en Sa (B) après 12 jours de gavage. Les valeurs sont
obtenues sur 5 animaux par groupe et exprimées en moyenne ± écart-type. (----) : percentile 90 obtenu
chez 50 animaux témoins non exposés aux mycotoxines.
* : Différence significative (ANOVA, P<0,05) entre les valeurs obtenues en fin de gavage.
De même, les effets de l’ingestion du maïs naturellement contaminé par les
fumonisines sur les teneurs hépatiques en Sa et le rapport Sa/So ont été mesurés (Figure
III.2.4).
Les effets de la FB1 sur la Sa libre et le rapport Sa/So sont apparus plus
importants dans le foie que dans le sérum. Ainsi, le rapport Sa/So chez les canards
gavés avec le maïs contaminé par 20 mg FB1/kg a augmenté de 503 % dans le sérum et
de 716% dans le foie.
Comme cela avait été observé au cours des études en croissance, les effets des
fumonsines sur la sphinganine libre sont plus importants que ceux sur le rapport Sa/So,
aussi bien dans le sérum que dans le foie. Cependant, les coefficients de variation
obtenus sont inférieurs pour le rapport Sa/So par rapport à la Sa libre.
0
80
160
240
320
0 ppm 10 ppm 20 ppm
Con
cent
rati
onSa
(nm
ol/L
) J o ur 0 J o ur 12
0
1
2
3
4
0 ppm 10 ppm 20 ppm
Rap
port
Sa/S
o
J o ur 0 J o ur 12A
*
*B
*
*
112
Figure III.2.4: Effet de l’ingestion du maïs naturellement contaminé par des fumonisines sur le
rapport Sa/So (A) et les concentrations hépatiques en Sa (B) après 12 jours de gavage. Valeurs
individuelles et valeur moyenne ± écart-type obtenus sur 5 animaux par groupe.
* : Différence significative (ANOVA, P<0,05).
En conclusion, les effets des fumonisines au cours du gavage semblent assez
différents de ceux observés en croissance :
- diminution du poids du foie au cours du gavage alors qu’une augmentation
était observée sur les animaux en croissance,
- pas d’effet significatif sur les paramètres biochimiques traditionnels en raison
d’une altération de ces paramètres du fait du gavage lui-même.
Néanmoins, dans tous les cas, une altération des sphingolipides peut être mise
en évidence. La sphinganine libre est plus affectée que le rapport Sa/So, mais les
variations individuelles sont plus importantes. Un effet significatif sur ces paramètres
semble détectable dès la distribution d’un aliment contaminé à hauteur de 10 mg/kg.
Cet effet précède la survenue de pertes économiques.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 1 2 3 4
Rap
port
Sa/S
o
0 ppm 10 ppm 20 ppm0,0
0,6
1,2
1,8
2,4
3,0
0 1 2 3 4
Con
cent
ratio
nSa
(nm
ol/g
)
0 ppm 10 ppm 20 ppm
A B
*
*
**
113
III.3. Toxicité chronique
Comme cela a été précisé dans la partie Matériels et Méthodes (cf. page 81), les
études de toxicité chronique ont été réalisées en deux étapes. Avant de présenter les
résultats obtenus, nous allons effectuer une analyse statistique des paramètres
communs à ces deux expérimentations afin de démontrer qu’elles peuvent être
considérées comme similaires, et qu’il est donc possible de présenter leurs résultats de
manière juxtaposée.
III.3.1. Comparaison des 2 protocoles
Une ANOVA à deux facteurs (facteur 1 : étude, facteur 2 : dose de toxine) à été
réalisée. Le plus souvent, le facteur « étude » s’est révélé non significatif (P<0,05).
Quand un effet « étude » significatif a été obtenu, une comparaison deux à deux des
différents lots ayant reçu la même dose de toxine a été réalisé (ANOVA à 1 facteur,
P<0,05).
III.3.1.1.Effets sur la croissance
Les effets des fumonisines sur la croissance au cours des deux études sont
donnés dans le Tableau III.3.1. Aucune différence significative liée au facteur « étude »
n’a été observée à J0, J7 et J21. Dans les cas de J14, bien qu’une différence significative
liée à l’étude ait été observée, une comparaison deux à deux des différents lots ayant
reçu la même dose de toxine n’a pas révélé d’effet (ANOVA à 1 facteur, P>0,05). Nous
en avons conclu que les différences observées dans l’ANOVA à 2 facteurs pouvaient
être considérées comme mineures et ne devaient pas largement entacher la suite des
résultats. Dans le cas de J28, une différence significative liée à l’étude a été observée.
Une comparaison deux à deux des différents lots ayant reçu la même dose de toxine a
révélé une différence significative pour les seuls lots témoins. Comme précédemment,
nous pouvons en conclure que ces différences entre études sont mineures et qu’elles ne
devraient pas grandement entacher la signification des effets des fumonisines.
114
Tableau III.3.1 : Comparaison des effets de la FB1 sur la croissance au cours des deux études.
Poids vifs (gramme) (M ± SE) Temps (jour) Dose
(mg FB1/kg) Protocole 3a1 Protocole 3b2P* Significatif
(P<0,05)
0 0 144 ± 3 143 ± 2 P=0,73654 Non 0 460 ± 15 433 ± 20 2 451 ± 23 427 ± 24 8 452 ± 23 435 ± 26
32 422 ± 22 408 ± 21 7
128 331 ± 31 336 ± 24
P=0,37314 Non
0 901 ± 32 1003 ± 30 P=0,05466 Non 2 925 ± 33 907 ± 94 P=0,83339 Non 8 904 ± 41 995 ± 51 P=0,19071 Non
32 816 ± 54 885 ± 81 P=0,46995 Non
14
128 583 ± 70 774 ± 57 P=0,07288 Non 0 1437 ± 48 1641 ± 65 2 1438 ± 68 1636 ± 102 8 1482 ± 66 1581 ± 93
32 1188 ± 152 1351 ± 224 21
128 958 ± 146 1041 ± 208
P=0,05114 Non
0 1954 ± 57 2230 ± 73 P=0,01256 Oui 2 1886 ± 157 2165 ± 48 P=0,20206 Non 8 2066 ± 84 2177 ± 68 P=0,37594 Non
32 1636 ± 188 1892 ± 206 P=0,39447 Non 28
128 1337 ± 178 1575 ± 250 P=0,41410 Non
* : Quand un effet « étude » significatif a été obtenu (ANOVA à 2 facteurs, P<0,05), une
comparaison des lots ayant reçu la même dose de toxine a été réalisé (ANOVA à 1 facteur, P<0,05). 1 Les valeurs sont obtenues sur 5 animaux par groupe et exprimées en moyennes ± écart-types. 2 Les valeurs sont obtenues sur 8 animaux par groupe et exprimées en moyennes ± écart-types.
III.3.1.2.Effets sur les paramètres biochimiques et le rapport Sa/So
Les effets des fumonisines sur les paramètres biochimiques et le rapport Sa/So
au jour 21 de traitement des deux études sont présentés dans le Tableau III.3.2. La
réalisation d’une ANOVA à deux facteurs (facteur étude et facteur dose de fumonisine)
n’a révélé une différence significative (P<0,05) que dans le cas des protéines totales. Une
ANOVA à 1 facteur, a montré qu’une différence significative entre groupes recevant la
même dose de toxine n’était obtenue qu’à la dose de 2 mg de FB1/kg d’aliment/jour. Le
caractère unique de cette différence ainsi que l’absence de différence significative
observée entre le lot recevant 2 de FB1/kg d’aliment/jour et le lot témoin nous
conduisent à estimer que là encore, les deux études peuvent être considérées comme
juxtaposables.
115
Tableau III.3.2 : Effets de la FB1 sur les paramètres biochimiques et le rapport Sa/So au jour 21 de
traitement des deux études.
Paramètre Dose (mg FB1/kg) Protocole 3a1 Protocole 3b2 P* Significatif
(P<0,05) 0 34 ± 1 32 ± 1 P=0,20003 Non 2 34 ± 0 30 ± 1 P=0,00130 Oui 8 33 ± 1 32 ± 1 P=0,74063 Non
32 41 ± 1 38 ± 3 P=0,12847 Non
Protéines (mg/l)
128 48 ± 1 44 ± 1 P=0,15675 Non 0 4,2 ± 0,1 4,5 ± 0,2 2 4,5 ± 0,3 4,7 ± 0,2 8 4,4 ± 0,3 4,8 ± 0,4
32 6,0 ± 0,4 6,6 ± 0,5
Cholestérol (mmol/l)
128 10,6 ± 0,6 9,6 ± 0,6
P=0,52692 Non
0 244 ± 14 251 ± 13 2 219 ± 06 271 ± 17 8 291 ± 08 281 ± 33
32 433 ± 31 401 ± 29
Phosphatase Alcaline
(u/l) 128 677 ± 37 718 ± 3
P=0,47715 Non
0 1469 ± 070 1389 ± 97 2 1646 ± 70 1468± 129 8 2363 ± 103 1419 ± 114
32 2653 ± 143 2360 ± 438
Lactate
déshydrogénase (u/l)
128 7133 ± 159 7045± 1907
P=0,21699 Non
0 20 ± 1 18 ± 4 2 19 ± 2 17 ± 1 8 26 ± 1 19 ± 2
32 31 ± 3 33 ± 14
Aspartate aminotransférase
(u/l) 128 65 ± 3 70 ± 7
P=0,73161 Non
0 41 ± 2 39 ± 5 2 41 ± 1 37 ± 3 8 49 ± 1 41 ± 4
32 62 ± 1 53 ± 9
Alanine
aminotransférase(u/l)
128 75 ± 4 70 ± 17
P=0,08527 Non
0 0,20 ± 0,03 0,23 ± 0,02 2 0,27 ± 0,03 0,29 ± 0,03 8 0,56 ± 0,03 0,71 ± 0,02
32 1,33 ± 0,1 1,42 ± 0,17
Rapport Sa/So
128 3,80 ± 0,52 3,16 ± 0,30
P=0,96807
Non
* : Quand un effet protocole significatif a été obtenu, une comparaison deux à deux des différents
lots ayant reçu la même dose de toxine a été réalisé (ANOVA à 1 facteur, P<0,05). 1 Les valeurs sont obtenues sur 5 animaux par groupe et exprimées en moyennes ± écart-types. 2 Les valeurs sont obtenues sur 8 animaux par groupe et exprimées en moyennes ± écart-types.
III.3.1.3. Conclusion
Les deux études peuvent être considérées comme juxtaposables. Les résultats
ultérieurs vont être présentés comme s’ils avaient été obtenus à partir d’une étude
unique.
116
0
1
2
3
4
5
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77
Durée de traitement (jour)
Poid
svi
fs(k
g)
0 mg/kg d'aliment (0) 2 mg/kg d'aliment (1) 8 mg/kg d'aliment (2)
32 mg/kg d'aliment (3) 128 mg/kg d'aliment (4)
a 0,1,2,3
b 4
a 0,2
a 0,1,2,3
b 4
b 4
a 0,1,2
ab 3
b 4
a 0,1,2
b 3,4
b 3,4
a 0,1,2 bc 3
a 0,1,2
b 4
NS NSa 0,1,2
NS
ab 3
ab 1 c 4
ab 3
III.3.2. Effets sur la santé
III.3.2.1. Mortalité et Performance
Aucune mortalité et aucun signe de mycotoxicose n’a été observé tout au long
de l‘étude, en dehors d’une diminution transitoire du poids corporel observée dans le
lot recevant 128 mg/kg d’aliment de FB1 (Figure III.3.1 et II.3.2).
Figure III.3.1 : Effets sur la croissance de l’administration quotidienne de FB1 chez des canards
recevant 0 mg/kg/jour (à gauche) et 128 mg FB1/kg d’aliment (à droite) à 14 (A) et 35 (B) jours de
traitement (21 et 42 jours de croissance).
Figure III.3.2 : Effet de l’administration quotidienne de FB1 sur le poids vif 1*.1 Valeurs présentées sous la forme des moyennes ± erreurs standard obtenues sur 8 canards par
groupe.
* Quand des différences significatives ont été observées (ANOVA, P<0,05), une comparaison
individuelle des moyennes a été effectuée (Test de Tukey, P<0,05). Les groupes homogènes (P <0,05) ont
été identifiés par une lettre : a, b, c. NS : Différence non significative.
A B
117
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77
Durée de traitement (jours)
Cro
issa
nce
(kg)
0 mg/kg d'aliment (0) 2 mg/kg d'aliment (1) 8 mg/kg d'aliment (2)
32 mg/kg d'aliment (3) 128 mg/kg d'aliment (4)
a 0,1,2,3
b 4
NS
a 0,1,2,4
b 3
a 0
ab 1,2,3
b 4
NS
a 0,1,2,3
NS
NS NS
NS
b 4
a 0,1,2,3
b 4
Les effets d’une exposition chronique aux fumonisines dans l’aliment sur le
poids corporel sont présentés dans la figure III.3.2. Une diminution significative du
poids vifs est observée chez les canards recevant 128 mg de FB1/kg d’aliment du jour 7
au jour 63. Cet effet a aussi été observé de J28 à J63 chez les canards recevant 32 mg de
FB1/kg d’aliment.
Ces différences sont associées à des différences de gain de poids corporel
(Figure III.3.3). Une diminution significative (P<0,05) du gain de poids corporel est
observée à J7 et J14 pour les canards recevant 128 mg de FB1/kg d’aliment, alors qu’une
augmentation est observée à J63 et J70 pour ces même animaux.
Figure III.3.3 : Effet de l’administration quotidienne de FB1 sur le gain de poids 1*.1 Valeurs présentées sous la forme des moyennes ± erreurs standard obtenues sur 8 canards par
groupe.
* Quand des différences significatives ont été observées (ANOVA, P<0,05), une comparaison
individuelle des moyennes a été effectuée (Test de Tukey, P<0,05). Les groupes homogènes (P <0,05) ont
été identifiés par une lettre : a, b, c. NS : Différence non significative.
La consommation moyenne quotidienne d’aliment est présentée dans la figure
III.3.4. Aucune différence majeure entre lots ne semble observable. Tout au plus, il est
possible de suggérer une chute de consommation en début de croissance sur le lot
recevant 128 mg/kg d’aliment de FB1, compensée par une plus forte consommation en
fin d’étude.
118
0,00
0,08
0,16
0,24
0,32
7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77
Durée de traiement (jours)
Con
som
mat
ion
(kg)
0 mg de FB1/kg d'aliment 2 mg de FB1/kg d'aliment 8 mg de FB1/kg d'aliment
32 mg de FB1/kg d'aliment 128 mg de FB1/kg d'aliment
Figure III.3.4 : Effet de l’administration quotidienne de FB1 sur la consommation moyenne1
d’aliment. 1 Moyennes obtenues sur 8 canards par groupe.
III.3.1.2. Poids relatif des organes
Les effets d’une exposition pendant 77 jours à la fumonisine B1 sur les poids
relatifs du coeur, du muscle pectoral, du gésier et de la rate sont donnés dans le Tableau
III.3.3. Aucun effet significatif n’a pu être observé sur cœurs et muscles pectorals. En
revanche, la toxine semble augmenter le poids de la rate dès 2 mg/kg dans l’aliment et
le poids des gésiers à partir de 8 mg/kg (P>0.05).
Tableau III.3.3: Effets de la FB1 sur le poids relatif du coeur, muscle pectoral, gésier, de la rate
et du foie chez les canards après 77 jours 1 de traitement.
Coeur Muscle pectoral Gésier Rate Dose
(mg FB1 /kg) (g/kg poids vifs)
0 8,27 ± 0,38a 64,24 ±2,28a 24,05 ± 0,82a 0,43 ± 0,04a
2 8,15 ± 0,18a 62,06 ± 1,38a 23,70 ± 0,99a 0,44 ± 0,04ab
8 8,35 ± 0,18a 64,38 ± 0,75a 24,85 ± 1,12ab 0,46 ± 0,03ab
32 8,14 ± 0,11a 61,14 ± 1,41a 26,55 ± 1.36ab 0,61 ± 0,04b
128 8,26 ± 0,33a 61,40 ± 2,12a 29,16 ± 1,61b 0,59 ± 0,05b
1 Moyennes ± erreurs standard obtenues sur 8 canards par groupe.
Quand des différences significatives ont été observées (ANOVA, P<0.05), la comparaison
individuelle entre les moyennes a été effectuée (Test de Tukey, P<0.05). Les groupes statistiquement
homogènes (P <0.05) ont été identifiés par une lettre : a, b, c.
119
L’effet de la fumonisine B1 sur le poids du foie est présenté dans la Figure III.3.5.
Un effet significatif sur le poids absolu du foie n’a été trouvé que chez les animaux
recevant 128 mg/kg d’aliment au jour 14 de traitement. Par contre, le poids relatif du
foie des animaux recevant 128 mg/kg d’aliment est significativement plus élevé quel
que soit le jour de traitement.
Figure III.3.5 : Effet de l’administration quotidienne de FB1 sur le poids du foie1. A : poids
absolu, B : poids relatif. 1Valeurs moyennes ± erreurs standard sur 5 (J0 à J35) ou 8 (J77) canards par groupe.
* Différences significatives (ANOVA, P<0,05).
III.3.2.2. Histologie
Quel que soit l’aliment distribué aucune lésion macroscopique n'a été observée
à l'autopsie des animaux. Les examens histologiques des foies ont été réalisés. Une
illustration des effets observés est donnée dans les figures III.3.6 et III.3.7.
Chez les témoins, à J0, les animaux sont âgés de 7 jours, le foie est riche en
graisse et glycogène, les noyaux des hépatocytes sont repoussés à la périphérie (Figure
III. 3.6). Entre J7 et J14, les capillaires sinusoïdes sont plus larges, les noyaux des
hépatocytes sont centrés et il y a de moins en moins de lipides ou de glycogènes dans le
cytoplasme. A J28, les hépatocytes sont intimement associés à la charpente des
sinusoïdes, l’organisation en travées est nettement visible.
0
2 5
5 0
7 5
0 7 14 2 1 2 8 3 5 4 2 4 9 5 6 6 3 7 0 7 7
Durée de traitement (jour)
Poid
sdu
Foie
(g)
0 mg/ kg d' a lime nt 2 mg/ kg d'a lime nt
8 mg/ kg d'a lime nt 32 mg/ kg d'a lime nt
128 mg/ kg d' a lime nt
0
2 5
5 0
7 5
0 7 14 2 1 2 8 3 5 4 2 4 9 5 6 6 3 7 0 7 7
Durée de traitement (jour)
Poid
sre
lati
f(g/
kgPo
ids
vifs
)
0 mg/ kg d' a lime nt 2 mg/ kg d'a lime nt
8 mg/ kg d' a lime nt 32 mg/ kg d'a liment
128 mg/ kg d'a lime nt
A
B
*
***
*
*
120
Chez des canetons recevant 128 mg de FB1/kg d’aliment, la surcharge en graisse
et glycogène observable à J0 a disparu à J7, comme chez les témoins. En revanche, un
certain nombre d’hépatocytes semblent s’agencer de manière à former une structure en
tubes ou acini. A J14, le nombre et le diamètre des tubes est plus important. A J28, on
note encore quelques tubes, mais avec une quantité et un diamètre moins important
(Figure III.3.7). Après 77 jours d’exposition aucune différence entre témoins et traités ne
peut être observée.
121
Figure III.3.6 : Coloration Giemsa (X400) : Evolution de l’organisation hépatique chez des canetons entre J0 à J28 de traitement (7 et 35 jours d’âge).
Jour 0 Jour 7
Jour 14 Jour 28
122
Figure III.3.7 : Coloration Giemsa (X400) : Evolution de l’organisation hépatique chez des canetons recevant 128 mg FB1/kg d’aliment pendant 28 jours de
traitement. Noter l’agencement en tubes ou acini des hépatocytes (les flèches).
Jour 28Jour 14
Jour 7Jour 0
123
III.3.3. Altérations biochimiques
Les effets de la FB1 sur la protéinémie (PRO) et la cholestérolémie (CHO) ainsi
que sur les activités de la phosphatase alcaline (PAL), de la lactate déshydrogénase
(LDH), de l’alanine aminotransférase (ALAT), de l’aspartate aminotransférase (ASAT)
sont présentés dans la Figure III.3.8 et la Figure II.3.9.
Pour l’ensemble de ces paramètres, aucune différence significative entre les
canards recevant 0, 2 et 8 mg de FB1/kg d’aliment n’a pu être observée. Par contre, tous
ces paramètres sont significativement augmentés pour les canards recevant 128 mg de
FB1/kg d’aliment, sauf l’ASAT à J70 et J77. A la dose de 32 mg de FB1/kg d’aliment, les
effets dépendent du jour de traitement. La protéinémie a significativement été
augmentée à J21, J49 et J70, la cholestérolémie de J7 à J28, l’activité de la LDH à J7, J14 et
J42, celle de l’ALAT à de J7 à J21, et celle de l’ASAT à J21, J49 ; l’activité des PAL a
toujours été supérieure à celle des témoins.
124
Figure III.3.8 : Effets de la FB1 administrée quotidiennement par VO pendant 77 jours à des canards sur la concentration sérique en protéines (PRO) et cholestérol
(CHO). Les données sont présentées sous la forme moyenne ± erreur standard obtenues pour un groupe de 5 animaux * : Différence significative entre les groupes
(ANOVA, P<0,05). (----) : percentile 90 obtenu chez 500 animaux témoins non exposés aux mycotoxines.
20
30
40
50
60
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77
Durée de traitement (jour)
Prot
éine
s (m
g/L)
0 mg de FB1/kg d'a liment 2 mg de FB1/kg d'a liment8 mg de FB1/kg d'a liment 32 mg de FB1/kg d'a liment128 mg de FB1/kg d'a liment
2,0
6,0
10,0
14,0
18,0
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77
Durée de traitement (jour)
Cho
lest
érol
(mm
ol/L
)
0 mg de FB1/kg d'a liment 2 mg de FB1/kg d'a lime nt8 mg de FB1/kg d'a liment 32 mg de FB1/kg d'a liment128 mg de FB1/kg d'a liment
**
** *
* * **
*
*
*
**
**
*
**
* * * * * ** *
* *
*
125
Figure III.3.9 : Effets de la FB1 administrée quotidiennement par VO pendant 77 jours à des canards sur la les activités sériques de la phosphatase alcaline (PAL), du
lactate déhdrogénase (LDH), de l’alanine aminotransférase (ALAT) et de l’aspartate aminotransférase (ASAT). Les données sont présentées sous la forme moyenne
± erreur standard obtenues pour un groupe de 5 animaux * : Différence significative entre les groupes (ANOVA, P<0,05). (----) : percentile 90 obtenu chez 500
animaux témoins non exposés aux mycotoxines.
0
250
500
750
1000
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77Durée de traitement (jour)
PAL
(u/L
)0 m g de F B 1/kg d'a lim e nt 2 m g de F B 1/kg d'a lim e nt8 m g de F B 1/kg d'a lim e nt 32 m g de F B 1/kg d'a lim e nt128 m g de F B 1/kg d 'a lim e nt
0
3000
6000
9000
12000
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77Durée de traitement (jour)
LDH
(u/L
)
0 m g de F B 1/kg d'a lim e nt 2 m g de F B 1/kg d'a lim e nt8 m g de F B 1/kg d'a lim e nt 32 m g de F B 1/kg d'a lim e nt128 m g de F B 1/kg d'a lim e nt
**
*
* *
*
*
*
**
** *
*
***
**
**
*
**
**
**
***
**
*
*
*
0
40
80
120
160
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77
Durée de traitement (jour)
ASA
T (u
/L)
0 m g de F B 1/k g d 'a lim e nt 2 m g de F B 1/k g d 'a lim e nt
8 m g de F B 1/k g d 'a lim e nt 32 m g de F B 1/kg d 'a lim e nt
12 8 m g de F B 1/kg d 'a lim e nt
0
30
60
90
120
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77
Dur ée de traitem ent (jour)
ALA
T (u
/L)
0 m g de F B 1/kg d 'a lim e nt 2 m g de F B 1/kg d 'a lim e nt
8 m g de F B 1/kg d 'a lim e nt 32 m g de F B 1/k g d 'a lim e nt
128 m g de F B 1/kg d 'a lim e nt
*
*
* *
**
**
*
*
*
*
**
**
* ** *
***
**
126
III.3.4. Altérations des sphingolipides
Les effets de la FB1 sur les concentrations en sphingosine (So), sphinganine (Sa)
et le rapport Sa/So obtenus dans le sérum, le foie et le rein sont respectivement
présentés dans les figures III.3.10, III.3.11 et III.3.12. Les effets observés dépendent de la
dose à laquelle les animaux ont été exposés. Il est également intéressant de remarquer
que, pour l’ensemble des tissus explorés, l’effet maximum de la FB1 sur la concentration
en Sa et le rapport Sa/So est obtenu au 7ème jour de traitement. Ensuite, la concentration
en Sa et le rapport Sa/So vont diminuer entre J7 jusqu’à J28. Entre J35 et J77 l’évolution
des concentrations dépendra des tissus.
III.3.4.1.Sérum
Concernant le sérum, bien que la concentration en Sa et le rapport Sa/So soient
toujours plus élevés chez les canards recevant 128 mg FB1/kg d’aliment que chez les
témoins, une diminution très forte de ces paramètres a été obtenue entre J7 et J28. Entre
J35 et J77 la diminution est beaucoup plus modérée. A J77, la concentration en Sa ne
représente plus que 15% de ce qu’elle était à J7.
En utilisant 32 mg FB1/kg d’aliment, l’allure générale des courbes est la même.
Des différences significatives par rapport aux témoins sont observées de J7 à J42 puis à
J56, J70 et J77 pour la concentration en Sa et de J7 à J42 puis de J56 à J77 pour le rapport
Sa/So. À la dose de 8 mg FB1/kg d’aliment, une augmentation significative du rapport
Sa/So est observée entre J7 et J35 et à J77. À la dose de 2 mg FB1/kg d’aliment, une
augmentation significative de la concentration en Sa et du rapport Sa/So n’est observée
qu’à J7 et J14 (Figure III.3.10).
La concentration en So est généralement inférieure chez les ainimaux traités par
rapport aux témoins. Des différences significatives sont obtenues de J7 à J42 chez les
animaux recevant une dose supérieure ou égale à 8 mg FB1/kg d’aliment et de J49 à J77
chez les animaux recevant 128 mg FB1/kg d’aliment. Chez les témoins et les traités à la
dose de 2 mg FB1/kg d’aliment, la concentration en So est comprise entre 100 et 250
nmol/L de sérum.
127III.3.4.2.Foie
En ce qui concerne le foie, l’administration de la FB1 à 8, 32 et 128 mg/kg
d'aliment/jour a entraîné une augmentation de la concentration en Sa et du rapport
Sa/So quel que soit le jour de traitement. Chez les oiseaux recevant 2 mg/kg
d'aliment/jour, une augmentation significative de ces paramètres n’est observée qu’à J7,
J14 et J21.
Comme pour le sérum, une diminution forte de la concentration en Sa et du
rapport Sa/So a été observée entre J7 et J21, spécialement en utilisant 32 et 128 mg de
FB1/kg d'aliment/jour (Figure III.3.11). Toutefois, passé J21, les effets semblent se
stabiliser. A J77, la teneur en Sa représente encore 55% de ce qu’elle était à J7.
A l’inverse de ce qui était observé dans le sérum, les teneurs en So dans le foie
vont augmenter tout au long de l’étude. Cette observation confirme que la décroissance
observée dans le rapport Sa/So entre J21 et J77 n’est pas liée à une diminution des
teneurs en Sa mais une augmentation des teneurs en So. Toutefois, aucune différence
entre témoins et traités n’est observée quelque soit le jour de traitement.
III.3.4.3.Reins
Concernant les reins, l’administration de FB1 à 8, 32 et 128 mg/kg
d'aliment/jour a conduit à une augmentation de la concentration en Sa et une
augmentation du rapport Sa/So pour tous les jours de traitement (Figure III.3.12).
A l’inverse de ce qui avait été constaté pour le foie, et surtout le sérum, la
décroissance de la teneur en Sa (et donc du rapport Sa/So) n’est que très modérée. A
J77, les teneurs en Sa chez les animaux ayant reçu 128 mg FB1/kg d'aliment représentent
encore 92% de celle observée à J7.
Comme pour le foie, les teneurs en So augmentent, de façon modérée au cours
du temps. A l’invers du sérum, la concentration en So est généralement supérieure chez
les animaux traités par rapport aux témoins. Ces différences sont toujours significatives
quelle que soit la dose de FB1 administrée.
128
Figure III.3.10 : Effets de la FB1 administrée quotidiennement par VO pendant 77 jours à des canards sur les concentrations sériques en So, Sa et le rapport
Sa/So. Les données sont présentées sous la forme moyenne ± erreur standard obtenues pour un groupe de 5 animaux.
* : Différence significative entre les groupes (ANOVA, P<0,05). (----) : percentile 90 obtenu chez 50 animaux témoins non exposés aux mycotoxines.
0
100
200
300
400
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77
Duréé de traitement (jour)
Con
cent
ratio
n en
So
(nm
ol/L
séru
m)
0 mg/ kg d'a lime nt 2 mg/ kg d'a liment 8 mg/ kg d'a liment
32 mg/ kg d'a liment 128 mg/ kg d'a liment
**
*
*
*
**
**
**
**
** *
**
**
* ** *
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77
Durée de traitement (jour)
Rap
port
Sa/
So
0 mg/ kg d'a liment 2 mg/ kg d'a liment 8 mg/ kg d'a liment
32 mg/ kg d'a lime nt 128 mg/ kg d'a liment
*
***** **
*
*
**
**
**
*
*
**
** *
**
** * *
0
150
300
450
600
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77
Durée de traitement (jour)
Con
cent
ratio
n en
Sa
(nm
ol/L
séru
m)
0 mg/ kg d'a liment 2 mg/ kg d'a liment 8 mg/ kg d'a liment
32 mg/ kg d'a liment 128 mg/ kg d'a liment*
* *
*
*
*
*
*
*
*** *
*
**
***
**
***
129
Figure III.3.11: Effets de la FB1 administrée quotidiennement par VO pendant 77 jours à des canards sur les concentrations hépatiques en So, Sa et le
rapport Sa/So. Les données sont présentées sous la forme moyenne ± erreur standard obtenues pour un groupe de 5 animaux. * : Différence significative entre les
groupes (ANOVA, P<0,05).
0
5
10
15
20
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77
Durée de traitement (jour)
Con
cent
rati
on e
n So
(nm
ol/g
)
0 m g/ kg d'a lim e nt 2 m g/ kg d'a lim e nt 8 m g/ kg d'a lim e nt
32 m g/ kg d'a lim e nt 128 m g/ kg d'a lim e nt
0
15
30
45
60
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77
Durée de traitement (jour)
Con
cent
rati
on e
n Sa
(nm
ol/g
)
0 m g/ kg d'a lim e nt 2 m g/ kg d'a lim e nt 8 m g/ kg d'a lim e nt
32 m g/ kg d'a lim e nt 128 m g/ kg d'a lim e nt
**
**
*
*
** *
**
**
*** * *
0
2
4
6
8
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77
Durée de traitement (jour)
Rap
port
Sa/
So0 m g/ kg d'a lim e nt 2 m g/ kg d'a lim e nt 8 m g/ kg d'a lim e nt
32 m g/ kg d'a lim e nt 128 m g/ kg d'a lim e nt
****
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*** * *
130
Figure III.3.12: Effets de la FB1 administrée quotidiennement par VO pendant 77 jours à des canards sur les concentrations rénales en So, Sa et le rapport
Sa/So. Les données sont présentées sous la forme moyenne ± erreur standard obtenues pour un groupe de 5 animaux. * : Différence significative entre les groupes
(ANOVA, P<0,05).
0
3
6
9
12
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77
Durée de traitement (jour)
Con
cent
ratio
n en
So
(nm
ol/g
) 0 mg/ kg d'a liment 2 mg/ kg d'a liment 8 mg/ kg d'a liment
32 mg/ kg d'a liment 128 mg/ kg d'a lime nt
0
8
16
24
32
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77
Durée de traitement (jour)
Con
cent
ratio
n en
Sa
(nm
ol/g
)
0 mg/ kg d'a liment 2 mg/ kg d'a liment 8 mg/ kg d'a liment
32 mg/ kg d'a liment 128 mg/ kg d'a liment
0
2
4
6
8
0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77
Durée de traitement (jour)
Rap
port
Sa/
So
0 mg/ kg d'a liment 2 mg/ kg d'a lime nt 8 mg/ kg d'a liment
32 mg/ kg d'a lime nt 128 mg/ kg d'a liment
**
*
**
* **
*
*
**
*
*
*
*
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*
*
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**
*
*
*
*
*
*
*
*
**
**
**
**
* *
*
****
*
131
III.3.4.4.Correlation Sa/So Sérum/tissus
L’observation des différentes cinétiques dans rapport Sa/So dans le sérum et les
tissus nous a conduit à explorer par corrélation quel organe pouvait avoir le plus
d’importance dans la détermination des teneurs circulantes en sphingolipides (Figure
III.3.13).
Une bonne corrélation (R² = 0,786) a été obtenue entre le rapport Sa/So dans le
sérum et le foie tandis que la corrélation entre le rapport Sa/So dans le sérum et le rein
était moins importante (R² = 0,595).
Figure III.3.13. Corrélation entre le rapport Sa/So obtenu dans le sérum, le foie (A) et le rein (B)
chez les canards recevant quotidiennement de la FB1 pendant 77 jours (les doses utilisées et les temps
analysés sont présentés dans partie matériel et méthodes).
III.3.4.5. Relation entre la durée de traitement et le rapport Sa/So
La relation entre les doses cumulées de FB1 administrées et le rapport Sa/So
dans le sérum est présentée dans la Figure III.3.14.
Cette analyse révèle que l'effet de la FB1 sur le rapport Sa/So est plus important
quand la toxine est administrée sur une courte période (de 7 à 21 jours) que lorsqu’elle
est administrée sur une durée plus longue (42 à 77 jours).
Sa/So du foie Sa/So du rein
132
Par exemple, le rapport Sa/So moyen passe de 0,8 à 2,5 et à 6,7 chez les canards
recevant respectivement 3,4, 13,7 et 54,7 mg FB1/kg/jour quand la toxine est
administrée sur une période de 7 jours. Cette augmentation est forte et linéaire
(R2=0,9882). Quand la toxine est administrée sur une période de 49 jours, ce rapport
passe de 0,25 à 0,51 pour une dose cumulée de 15 à 365 mg de FB1/kg. Bien que cette
augmentation soit toujours linéaire (R2=0,9551), elle est nettement faible et ce d’autant
que la dose cumulée ingérée est dix fois plus forte.
Figure III.3.14 : Relation entre les doses cumulées de FB1 administrées et la concentration en Sa (A)
et le rapport Sa/So (B) dans le sérum.
Rap
port
Sa/S
o
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000
J7
J14
J21
J28
J35
J42
J49
J56
J63
J70
J77
0
100
200
300
400
500
600
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000
J7
J14
J21
J28
J35
J42
J49
J56
J63
J70
J77
Con
cent
ratio
nen
Sa
FB1, dose cumulée (mg/kg poids vif)
A B
133
Partie IV. DISCUSSION
134
En France, une enquête sur le maïs a montré que 67% des échantillons étaient
contaminés par Fusarium verticillioides. Parmi ces souches, 80% ont la capacité de
produire des niveaux élevés de FB1 dans des conditions de laboratoire [22]. Différentes
études conduites chez les oiseaux rapportent une réduction du poids vif et une
altération de l’indice de consommation alimentaire lors d’ingestion de fortes doses (100-
300mg FB1/kg d’aliment). Néanmoins, peu d’études existent chez les palmipèdes, qui
constituent pourtant la production la plus exposée. De même, les effets des faibles doses
sont mal caractérisés chez les volailles. L’objectif principal des travaux présentés est la
recherche de biomarqueurs d’exposition et d’effet des fumonisines chez les palmipèdes.
Cet objectif est poursuivi par la réalisation de différents protocoles établis en vue de :
- caractériser des biomarqueurs grâce à une étude de toxicité sub-aigue à forte
dose,
- préciser la signification de ces biomarqueurs dans les conditions de gavage,
- déterminer leur validité dans des conditions d’exposition chronique à
différents niveaux de contamination comparables à la réalité.
Afin d’éviter un certain nombre de répétitions les résultats de ces différents
protocoles vont être discutés de façon globale, en relation avec les effets observés.
IV.1. Effets sur la santé
Aucune mortalité et aucune manifestation clinique de mycotoxicose n’ont été
observées chez les canards au cours de nos différentes études, quelle que soit la dose
administrée ou la durée de traitement. Ces observations sont en accord avec les études
réalisées sur poulets et dindes recevant 50 - 300 mg FB1/kg d’aliment pendant 21 jours
[149, 157] et sur canetons recevant 0,575-1,145 mg FB1/kg d’aliment pendant 2 jours
[164]. La faible mortalité observée chez les palmipèdes gras au cours du gavage à la
dose de 20 mg FB1/kg d’aliment n’a pas été considérée comme significative car un taux
de 5% de mortalité est considéré comme habituel au cours de cette production.
Signalons que des cas de mortalité ont été rapporté dans certaines études réalisées chez
les poules pondeuses recevant 8,5 – 100 mg FB1/kg d’aliment pendant 15 – 504 jours,
chez les poulets, les dindes et les canetons recevant respectivement 300, 200 – 300 et 100
135
– 400 mg FB1/kg d’aliment pendant 21 jours [146, 147, 153, 154, 156, 160, 294]. Les
différences de mortalité observées selon les études chez les poulets et les dindes sont
difficiles à interpréter. Elles pourraient être dues à des différences de sensibilité de
souche ou plus vraisemblablement une contamination complexe des aliments par
plusieurs fumonisines et/ou fusariotoxines. Nos études réalisées à fortes doses ayant été
effectuées à l’aide de FB1 partiellement purifiée, les risques de polycontamination sont
écartés.
Concernant les performances des animaux, une diminution du poids vif (PV) et
du gain quotidien a été trouvé chez les canards recevant 15-45 mg FB1/kg PV/jour. De
même, le PV et le gain quotidien ont été fortement affectés par la FB1 du J7 au J63 à la
dose de 128 mg FB1/kg d’aliment. Ce résultat est en accord avec différentes études qui
ont rapporté une réduction du PV chez les poulets et les dindes recevant respectivement
plus de 50 et 75 mg FB1/kg d’aliment durant 21 jours [17, 51, 52, 152, 155, 294]. On
retrouve les mêmes effets chez des cailles pondeuses recevant 10 mg FB1/kg d’aliment
pendant 140 jours [159]. L'effet de la FB1 sur le PV ne peut pas être expliqué par un refus
d'alimentation car dans notre cas les canards ont reçu quotidiennement la FB1 par
intubation, et aucune différence majeure entre lots sur la consommation moyenne
quotidienne n’est observable.
En revanche, après 70 jours de traitement, il n'y a plus de différence significative
entre le PV des témoins et des canards traités. Cette observation est en accord avec les
résultats obtenus lors d’études précédentes à long terme chez des poules pondeuses
recevant jusqu’à 200 mg FB1/kg d’aliment durant 420 jours [153], chez les poulets
recevant 25 et 50 mg FB1/kg d’aliment pendant 49 jours [152] et chez les dindes recevant
50 – 75 mg FB1/kg d’aliment pendant 98 jours et 126 jours [152, 295]. L’absence d’effet
sur le PV observé après exposition chronique à la FB1 par rapport à une exposition
subaiguë est difficile à expliquer. Elle peut être liée à une adaptation des oiseaux à la
toxine ou bien à une moindre sensibilité des adultes par rapport aux jeunes. Cette
dernière hypothèse est renforcée par la diminution significative de PV décrites chez des
canetons recevant 200 – 400 mg FB1/kg d’aliment pendant 21 jours [160].
Concernant le poids des organes, l’augmentation du poids relatif du gésier des
canards recevant quotidiennement 32-128 mg FB1/kg d’aliment pendant 77j est en
accord avec des données obtenues chez les poulets et les dindes recevant des rations
136
contenant de la FB1 [52, 154, 157, 296]. Une hypothèse évoquant des propriétés irritantes
de l'aliment contenant des mycotoxines a été proposée [297]. Cette explication n’est pas
satisfaisante dans notre étude car la FB1 a été administrée sous forme d’extrait
partiellement purifié de matériel de culture. De plus, lors de l’abattage, la muqueuse du
gésier n'a indiqué aucun signe d'irritation.
De manière générale, l’effet de la FB1 sur le poids des foies est lié à la dose
administrée. Cependant, il dépend aussi de l’âge des animaux et/ou de la durée de
traitement. En effet, chez les canards en croissance recevant 5, 15 et 45 mg de FB1/kg
PV, des augmentations du poids relatif du foie ont été respectivement de 29, 36 et 48%.
De même, chez les canards recevant 128 mg/kg d’aliment, une augmentation
significative du poids relatif du foie par rapport aux témoins, a été observée à 7, 14, 21,
28 et 77j de traitement. Ce résultat est en accord avec d’autres études chez les poulets
recevant plus de 100 mg FB1/kg d’aliment pendant 21 jours [17, 51, 52, 146], les dindes
recevant plus de 75 mg FB1/kg d’aliment pendant 21 ou 126 jours [154-157, 295, 298] et
des canetons recevant 200 - 400 mg FB1/kg d’aliment pendant 21 jours [160]. Cette
augmentation du poids relatif du foie pourrait être liée à une altération du métabolisme
des lipides ou à une hyperplasie. Cette dernière hypothèse est renforcée par l’absence de
stéatose hépatique observée dans nos travaux.
A l’inverse de ce qui était observé chez les canards en croissance, une réduction
du poids du foie gras a été observée chez les canards au cours du gavage à la dose de 20
mg FB1/kg d’aliment. Ce résultat pourrait être expliqué par une modification du type
de stéatose hépatique. Chez les témoins, la stéatose observée dans les conditions
normales de gavage est principalement liée à la formation de grosses vacuoles dans les
hépatocytes. Chez les animaux exposés à la FB1, le nombre de vacuoles était plus
important et les hépatocytes globalement moins chargés en graisse. Cette observation
est en accord avec des données obtenues par Henry et al. [150] chez les poulets,
démontrant une diminution linéaire des teneurs en lipides du foie avec une
augmentation des concentrations de la FB1 dans l'alimentation. Ces résultats sont aussi
en accord avec des données obtenues chez les rats, démontrant une modification de la
composition des lipides hépatiques [264]. Chez le canard, cette altération, qui
s’accompagne d’une altération de l’indice de conversation alimentaire, correspond à
137
une perte d’environ 1€ par canard. On ignore par ailleurs si elle a un impact sur les
propriétés technologiques et gustatives du produit.
IV.2. Altérations biochimiques
Une augmentation des concentrations sériques en protéines totales et des
activités de l’ALAT, LDH a été observée dans l’ensemble des études réalisées chez le
canard, avec des variations selon la durée de traitement et le stade d’élevage
(croissance/gavage). Ces résultats sont en accord avec ceux généralement obtenus chez
les mammifères et les oiseaux [16, 17, 51, 52, 145, 160, 272, 295, 298-300]. Les causes des
augmentations des concentrations en protéines totales sont inconnues. Une
augmentation des protéines totales est commune dans des processus inflammatoires
aigus. Cependant, les examens histologiques hépatiques ont démontré qu'aucun signe
histologique d'inflammation n’était observé pendant l'exposition à la FB1. Les
augmentations des activités de l'ALAT et de la LDH dans le sérum sont généralement
attribuées à la nécrose des hépatocytes [301]. Toutefois, l’augmentation de l’activité de
l'ALAT et de la LDH sérique reste relativement faible, par rapport à celle obtenue avec
les composés les plus hépatotoxiques [301]. Elle est en accord avec des données
suggérant que les effets de la FB1 sur le foie ne sont pas liés à une nécrose des cellules
[302]. Par ailleurs, il est intéressant de constater que les augmentations des
concentrations sériques en protéines totales, cholestérol et des activités de l’ALAT et
LDH apparaissent très tôt lors l'exposition à la FB1 chez les canards. Ces résultats sont
en accord avec des données obtenues chez les porcelets [123]. De plus, ces
augmentations sont dépendantes de la dose mais non linéaires. Elles peuvent être
modélisées selon des équations de type Michaelis-Menten, ce qui suggère qu’elles
pourraient être en relation avec un effet enzymatique des fumonisines. Cette hypothèse
sera reprise par la suite quand nous présenterons les effets de ces toxines sur la synthèse
des sphingolipides.
L'hypercholestérolémie observée dans toutes nos études lors d’exposition aux
fumonisines est en accord avec les résultats obtenus chez les poulets [52, 145, 146, 156],
mais diffère de ce qui a été observé chez la dinde [154, 156, 157]. Ces différences entre
espèces peuvent être expliquées par différents effets de la FB1 sur le métabolisme du
cholestérol. Ils peuvent comprendre des modifications de la composition membranaire,
138
des altérations de la clairance du cholestérol et/ou une modification de sa fixation aux
récepteurs cellulaires [303].
Bien que les concentrations en protéines totales, cholestérol, et les activités de
l'ALAT et de la LDH ne puissent pas être considérés comme des marqueurs spécifiques
d’une exposition à la FB1, nous avons cherché à déterminer la plus faible dose de toxine
pouvant entraîner une élévation significative de ces composés. Trois méthodes
différentes ont été utilisées pour évaluer la dose minimum nécessaire de FB1 pour avoir
un effet :
i) détermination directe de la dose entraînant un dépassement du percentile 90
sur les courbes de durée-réponse (Figure III.1.4),
ii) détermination directe de la dose entraînant un dépassement du percentile 90
sur les courbes de dose-réponse au jour 12 (Figure III.1.5),
iii) détermination de la dose en toxine entraînant 10% de l’effet maximum
(ED10).
Le percentile 90 a été sélectionné car c'est une valeur qui est souvent utilisée en
toxicologie pour déterminer si une exposition à un toxique conduit à un effet. De même,
la dose qui détermine 10 % de l'effet a été sélectionnée car elle est souvent retenue pour
extrapoler la limite détectable d’un effet. Ainsi, le percentile 90 et l’ED10 sont
recommandés dans beaucoup de directives pour étudier la toxicité des xénobiotiques
[304, 305]. Cette approche nous a permis de démontrer que des doses cumulées de
l’ordre de 10mg/kg PV de fumonisines sont suffisantes pour entraîner un effet
hépatique lors d’exposition sub-aigue. L'extrapolation de ce résultat suggère qu'une
alimentation contaminée à hauteur de 10 mg FB1/kg distribuée pendant 10 jours peut
entraîner un effet discernable chez les canards. Cette approche nous a également permis
de suggérer que la toxicité subaiguë de la FB1 est plus élevée que sa toxicité aiguë. Par
exemple, la dose cumulée nécessaire pour déterminer un effet sur l’ALAT ou la LDH est
plus élevée quand elle est ingérée pendant plus de 2 jours que quand elle est ingérée
pendant plus de 4 jours. Ces résultats se révèlent importants dans le contexte d’une
exposition chronique à la FB1 chez beaucoup d'espèces, y compris chez les humains. Ils
ont été largement confirmés au cours de l’étude de toxicité chronique, avec une
réversion presque complète à 77j de traitement de la toxicité observée à 7-21j, alors
même que les animaux étaient toujours exposés aux fumonisines.
139
Au cours de l’étude conduite pendant le gavage, bien qu'une augmentation
dépendante de la dose des protéines totales, du cholestérol, et des activités de l'ALAT et
de la LDH ait été observée, cet effet n'est pas significatif. Cette absence de significativité
s’explique par le fait que le gavage lui-même augmente les protéines totales, le
cholestérol, et les activités de l'ALAT et de la LDH, comme cela a déjà été établi dans
différentes études [306, 307]. Ce qui confirme bien que ces paramètres ne sont pas
spécifiques d’exposition aux fumonisines.
Au cours de l’étude de toxicité chronique, il est intéressant de noter que
l’augmentation maximale de la LDH, de l'ALAT et de l'ASAT dépend de la dose utilisée
mais surtout de la durée du traitement. L’effet maximal est toujours obtenu au 7ème jour
d’exposition. Notons qu’une décroissance de la PAL, de l’ALAT, de la LDH, et de
l’ASAT est observée chez les témoins et les animaux exposés aux faibles doses de FB1 du
J7 au J14. Cet effet peut être attribué à la mise en place progressive du foie mature à
partir du foie fœtal [308-310]. Par ailleurs, il est important de noter que le percentile 90
proposé pour la LDH et l’ALAT n’est utilisable que chez des animaux de plus de 14 et
28 jours, respectivement, alors que le percentile 90 proposé pour les protéines totales et
le cholestérol est utilisable quel que soit l’âge.
IV.3. Altérations des sphingolipides
De nombreuses études suggèrent qu’une altération du métabolisme des
sphingolipides est étroitement associée à la toxicité hépatique et rénale de la FB1 [222].
Les fumonisines perturbent le métabolisme des sphingolipides par inhibition de la
sphinganine et la sphingosine N-acyltransférase. Cette interaction engendre une
accumulation de Sphinganine et une augmentation du rapport Sa/So dans les tissus, le
sérum et l’urine de beaucoup d'espèces in vivo et ex vivo (les singes, poneys, lapin, rat,
poulets, canards) [14, 15, 18, 19, 160, 300, 302, 311].
Chez les poneys et les porcs, l’augmentation du rapport Sa/So précède l’action
toxique de la fumonisine et d'autres signes d’hépatotoxicité (élévation de la LDH et de
transaminases). Ce paramètre se révèle particulièrement approprié comme biomarqueur
précoce dans le contexte d’une exposition naturelle à la toxine [14, 15, 18, 312-315]. Cette
précocité a été confirmée sur coupes histologiques de foie et de rein chez le rat ou
140
l'accumulation de la sphinganine se produit plus tôt que la cytotoxicité et la fuite de
LDH dans le milieu de culture [302]. Contrairement à d'autres paramètres biochimiques
qui augmentent lors de nombreuses affections hépatiques, le rapport Sa/So est un
marqueur qui peut être considéré comme spécifique de l'exposition à la FB1. Depuis
cette découverte, de nombreuses études ont été conduites pour déterminer si le rapport
Sa/So pouvait être un marqueur prédictif d'exposition à la FB1 dans de nombreuses
espèces, y compris l’homme [312-315]. Ce rapport a même été utilisé dans la recherche
de corrélations avec les carcinomes oesophagiens en Chine ou les néphropathies
endémiques en Croatie [312, 313, 315, 316].
Paradoxalement, malgré son large utilisation, l’influence de la durée de
traitement sur ce biomarqueur n'a pas encore été complètement renseignée. Les
résultats obtenus au cours de l’étude de toxicité sub-aigue chez les canards en
croissance indiquent que la FB1 provoque une augmentation de la concentration en Sa
libre dans le sérum et du rapport Sa/So, en accord avec des données obtenues chez de
nombreuses espèces, y compris les mammifères et les oiseaux [14-20, 52, 146, 150, 154,
155, 157, 160, 232]. À notre connaissance, il s’agit de la première étude réalisée sur la
cinétique des bases sphingoïdes libres sur des populations aviaires lors d'exposition à la
FB1. Les résultats de cette étude montrent que l’effet de la toxine apparaît en premier
lieu sur la concentration en Sa. En effet, seulement 2 administrations de FB1 sont
nécessaires pour augmenter la concentration en Sa sérique de manière significative (P<
0,05) sur tous les canards traités. Par contre 4 à 6 administrations sont nécessaires pour
augmenter le rapport Sa/So de manière significative.
L’analyse statistique descriptive de la Sa et de la So libre et du rapport Sa/So
chez 50 canards non exposés aux mycotoxines et indemnes de toute affection parasitaire
connue a été réalisée dans le but d’établir un premier ordre de grandeur de valeurs de
référence de ces composés. En ce qui concerne les espèces aviaires, seulement 2 études
conduites chez des poulets ont indiqué des moyennes obtenues en Sa et So libre dans le
sérum. Ces concentrations sont respectivement de 28 et 240 nM pour la Sa et la So dans
l'étude menée par Weibking et coll. [17] et 11 et 33 nM dans l'étude menée par Henry et
coll. [150]. Dans les deux cas, on a constaté un écart-type élevé. Les résultats présentés
dans les tableaux III.1.1 et III.1.4 sont en accord avec ces données. Le percentile 90 est
proposé comme une limite qui pourrait être utilisée pour suspecter une exposition aux
141
fumonisines. Il est important de noter qu’aucun canard témoin des différentes études
que nous avons conduite ne dépasse ces valeurs, quel que soit le jour de traitement,
exception faite des concentrations en Sa chez des canetons âgés de 7 et 14 jours (soit de
J0 et J7 de traitement dans l’étude de toxicité chronique). Ces résultats suggèrent que le
percentile 90 proposé pour la Sa n’est utilisable que chez des animaux de plus de 14
jours, alors que le percentile 90 proposé pour le rapport Sa/So est utilisable quel que
soit l’âge.
On peut également remarquer que la dose nécessaire à une augmentation du
métabolisme des sphingolipides chez le canard est toujours inférieure à celle nécessaire
à une altération des paramètres biochimiques non spécifiques. Ce résultat est en accord
avec ce qui est décrit dans la littérature pour les autres espèces [222].
Comme nous l’avons présenté chez les canards en croissance exposés à la FB1,
l'intérêt principal de la Sa libre et du rapport Sa/So est que ces marqueurs sont
spécifiques d’une exposition à la FB1. Dans l’étude sur des canards gras, nous avons
également démontré que le gavage n'a aucun effet sur les sphingolipides.
L’augmentation de la concentration en Sa libre est plus élevée que l’augmentation du
rapport Sa/So et les effets de la FB1 sur les sphingolipides sont plus élevés dans le foie
que dans le sérum. Ces résultats sont en accord avec les données précédemment
obtenues sur des canards en croissance. Il est également intéressant de constater que la
toxicité de la FB1 partiellement purifiée que nous utilisons est très proche de la toxicité
du maïs naturellement contaminé par la FB1. Un effet significatif peut être observé pour
un niveau de contamination de l’aliment de l’ordre de 10 mg FB1/kg d’aliment. Cette
valeur est très proche de 1 mg FB1/ kg PV précédemment extrapolée de l’étude sur les
animaux en croissance, également conduite sur une période de 12 jours.
Les données obtenues chez les canards au cours de l’étude de toxicité chronique
suggèrent que les effets de la FB1 sur la concentration en Sa et le rapport Sa/So dans le
sérum, le foie et le rein sont étroitement liés à la dose mais aussi à la durée de
traitement. En effet, pour l’ensemble des tissus explorés, l’effet maximum de la FB1 sur
ces deux paramètres est toujours obtenu au 7ème jour de traitement, puis il décroît plus
ou moins rapidement selon les tissus. Cette observation diffère des résultats observés
chez le singe de vervet, qui ont montré un maximum au J30 de traitement [21]. Après 77
jours de traitement une différence significative entre témoins et traités à la dose de 8, 32
142
et 128 mg FB1/kg d’aliment reste observable. Ce résultat est en accord avec les études à
long terme sur poulets et dindes recevant 25 et 50 mg FB1/kg d'aliment pendant 42 et 98
jours respectivement [152]. Concernant la So, le traitement par la FB1 conduit à une
diminution modérée des concentrations sériques, en accord avec des observations
conduite après 21 jours de traitement chez le poulet [17]. En revanche, une
augmentation de la concentration en So dans le rein est notée chez les canards traités,
en accord avec des résultats obtenus chez les rats et les porcs après plusieurs semaines
de traitement [14, 265]. Aucune donnée dans la littérature n’est disponible sur les
teneurs tissulaires hépatiques ou rénales en sphingolipides chez les oiseaux. Signalons
également que la cinétique de la concentration en Sa et du rapport Sa/So dans le rein
diffère de celle observée dans le foie. Ces différences pourraient être liées à des
différences de clairance tissulaire. En effet, il a été démontré chez le rat et la souris, que
la demi vie de la Sa libre à l'intérieur du rein est beaucoup plus longue qu'à l'intérieur
du foie [19, 317]. Ainsi, le rein apparaît chez le canard l'organe le plus sensible à
l'interruption du métabolisme des sphingolipides induits par la FB1, en accord avec des
données obtenues chez le rat, le porcs, le mouton, le poney et le lapin [14, 15, 170, 171,
201, 265, 318, 319]. Pour autant aucune altération histologique rénale n’a pu être mise en
évidence chez le canard, à l’inverse de ce qui est décrit dans les précédentes espèces.
Finalement, l’analyse globale des effets des fumonisines suggère la possibilité
d'une adaptation des canards lors d’exposition chronique, aussi bien pour les
paramètres zootechniques que les marqueurs biochimiques non spécifiques et les
altérations du métabolisme des sphingolipides. Cette hypothèse a déjà été suggérée lors
d’une étude de toxicité chronique chez le singe de vervet [21]. Une autre hypothèse est
que les effets de la FB1 dépendent de la durée de l'exposition. En effet, des études
conduites chez le rat ont démontré que la FB1 peut induire un effet hépatotoxique
précoce suivi d’une prolifération compensatoire ou régénératrice de cellules [320].
Chez les canards, on peut supposer, de la même manière, qu’après une atteinte
hépatique précoce (7 jours) les hépatocytes survivants sont plus résistants à la toxicité
des fumonisines. Cette hypothèse est suggérée par :
- le pic de libération des marqueurs de cytolyse hépatique observé à 7 jours,
- la réversibilité des lésions histologiques à 28 jours,
143
- l’absence de différences significatives entre témoins et traités à 77 jours aussi
bien en ce qui concerne les marqueurs biochimiques de souffrance hépatique que
l’analyse histologique des foies.
- la présence d’une hépatomégalie modérée à jour 77.
Quelque soit le mécanisme à l’origine des altérations hépatiques, il est
intéressant de noter que ces altérations ne surviennent que lors d’exposition à des doses
supérieures à celles entraînant une altération du métabolisme des sphingolipides.
144
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
Les résultats obtenus lors de nos études sont cohérents avec les
expérimentations précédemment menées sur les autres espèces de volailles. En effet, les
canards peuvent être considérés comme résistants à la toxicité de la FB1 en termes de
mortalité et d’effets toxiques majeurs. Toutefois, des doses voisines de 32 mg/kg
d’aliment peuvent altérer les courbes de croissance lors d’exposition dans le jeune age,
alors que des doses voisines de 20 mg/kg d’aliment entraînent des pertes économiques
au cours du gavage.
L’objectif principal des travaux présentés était la caractérisation de
biomarqueurs d’exposition à la FB1 chez les palmipèdes. Cet objectif a été réalisé par des
études sur la cinétique des paramètres biochimiques, et des concentrations en Sa et du
rapport Sa/So au cours de différents scénario d’exposition. Globalement, ces travaux
ont montré que l’utilisation de ces marqueurs pour révéler une exposition aux
fumonisines devait prendre en compte la durée de l’exposition (1-2 semaines/8-10
semaines) et la période de production (croissance/gavage).
Des augmentations des concentrations sériques en protéines totales, cholestérol
et activités de l’ALAT et LDH apparaissent très tôt lors de l'exposition à la FB1 chez les
canards en croissance. Elles sont liées à la dose d’exposition, mais la relation n’est pas
linéaire. Ces altérations n’étant pas spécifiques il est difficile de les proposer en tant que
biomarqueurs d’une exposition aux fumonisines. Elles peuvent en revanche être un
indice d’exposition qu’il faudra valider par dosage des fumonisines dans les aliments ou
utilisation de biomarqueurs plus spécifiques. Par ailleurs, toute mise en évidence d’une
augmentation de ces paramètres sur des animaux en croissance devra amener les
éleveurs et les vétérinaires à se poser la question du niveau de contamination des
aliments en fumonisines. Protéines totales, cholestérol et en activités ALAT et LDH ne
sont en revanche pas utilisables pour détecter une exposition chronique ou une
exposition survenant au cours du gavage.
La concentration en Sa et le rapport Sa/So sérique sont plus sensibles que les
marqueurs biochimiques non spécifiques pour révéler une exposition aux fumonisines.
Ils sont également beaucoup plus spécifiques et utilisables au cours du gavage. Lors
145
d’exposition chronique, l’altération des sphingolipides est moins importante mais reste
détectable aux doses de fumonisines susceptibles d’entraîner une altération des indices
de production et de santé des palmipèdes, le rein étant l'organe le plus sensible.
En conclusion, ces travaux permettent d’établir qu’une altération des
sphingolipides est caractérisable chez les palmipèdes dès une exposition à environ 2 mg
FB1/kg d’aliment. Lors d’exposition de courte durée (environ 1 semaine), des altérations
de type « zootechnique » sont observées lors d’ingestion de doses plus élevées (32 mg
FB1/kg d’aliment en croissance et 20 mg FB1/kg d’aliment au cours du gavage). Aucune
information concernant la présence de résidus dans les productions n’est disponible à ce
jour, ce qui constitue une perspective de developpement ultérieur.
En ce qui concerne les effets des fumonisines chez les palmipèdes, un certain
nombre de questions reste posé : Comment les canards résistent-ils à une forte
augmentation des teneurs en sphinganine alors que l’on observe une toxicité voire une
mortalité chez mammifères ? Pourquoi l’accumulation de sphinganine diminue telle lors
d’exposition à long terme ? Qu’en est-il dans les autres espèces ?
146
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RÉSUMÉ
La fumonisine BB1 (FB1) est une toxine produite par Fusarium verticillioides. Elle est
responsable de différentes affections chez l’animal, la leucoencéphalomalacie équine et l’œdème
pulmonaire porcin étant les plus connues. En France, bien que la prévalence de la FB1 se confirme
d’année en année, peu d’études existent chez les palmipèdes, qui constituent pourtant la production la
plus exposée. L’objectif principal de nos travaux est la caractérisation de biomarqueurs d’exposition et
d’effets des fumonisines chez les palmipèdes au cours de différents scénario d’exposition : chez les
canards en croissance (distribution de 0, 5, 15 et 45 mg FB1B /kg poids vif/jour pendant 12 jours), dans
les conditions de gavage (distribution de 0, 10 et 20 mg FB1/kg d’aliment pendant 12 jours) et dans des
conditions d’expositions chroniques (distribution de 0, 2, 8, 32 et 128 mg FB1/kg d’aliment pendant 84
jours). Différents paramètres biochimiques plasmatiques (protéines totales, cholestérol, activités
lactate déshydrogénase, phosphatases alcalines, alanine aminotransférase …) ainsi que les
concentrations en sphingosine (So), sphinganine (Sa) et le rapport Sa/So ont été explorés au niveau
plasmatique, hépatique et rénal. Le rapport Sa/So est le biomarqueur le plus sensible lors d’exposition
à la FB1. La plus faible dose étudiée capable de déterminer un effet détectable est de 2 mg FB1/kg
d’aliment. La cinétique des différents paramètres explorés est toutefois étroitement liée à la durée de
traitement. Bien que nos études rapportent une altération de la croissance et des pertes économiques
lors d’exposition aux plus fortes doses, ces effets ne surviennent qu’à des niveaux d’exposition
nettement supérieurs à ceux entraînant une altération du métabolisme des sphingolipides.
SUMMARY
Fumonisine B1 (FB1) is a toxin produced by Fusarium verticillioides. It is responsible for
various affections in animal, the equine leucoencephalomalacia and the porcine pulmonary oedema
being the most known. In France, although the prevalence of the FB1 is confirmed year after year, few
studies are available in ducks which constitute the most exposed production. The main objective of
our work is the characterization of biomarkers of fumonisins effects and exposure in ducks during
different exposure scenario: in ducks during growth (distribution of 0, 5, 15 and 45 mg FB1/kg body
weight/day during 12 days), under conditions of force-feeding (distribution of 0, 10 and 20 mg
FB1/kg feed during 12 days) and under chronic exposure conditions (distribution of 0, 2, 8, 32 and 128
mg FB1/kg feed during 84 days). Various plasmatic biochemical parameters (total proteins,
cholesterol, activities of lactate dehydrogenase, alkaline phosphatases, alanine aminotransferase…) as
well as sphingosine (So) and sphinganine (Sa) concentrations and Sa/So ratio were explored at the
plasmatic, hepatic and renal level. Sa/So ratio is the most sensitive biomarker of FB1 exposure. The
lowest investigated dose able to determine a detectable effect is 2 mg/kg feed. The kinetics of these
parameters is closely linked to the duration of exposure. Although our studies report an alteration of
the growth and economic losses during mycotoxin exposure to the highest tested dose, theses effects
only occur at exposure levels significantly higher than those leading to an alteration of the
sphingolipids metabolism.