Les pectines: définition et structure

C. RenardUMR SQPOV, Avignon

Fév 2010

Plan

• Les pectines: définition et structure– Le squelette pectique– Les chaînes latérales– Conformation des homogalacturonanes

• Méthodes d'étude des pectines• Les pectines en tant qu'additifs: sources, méthodes

d'extraction, propriétés et réactivité• Les enzymes pectolytiques• Les pectines in situ: biosynthèse, rôles dans les

parois et dans la transformation des fruits et légumes• Quelques exemples de nos travaux

Les pectines

Polymères de la paroi végétale primaire (matrice amorphe)Maturation et transformations des fruits et légumesE440: Gélifiants: confitures, fourrages, fruits sur sucres

Stabilisants boissons lactées acides...

Polysaccharides complexes, riches en acide galacturonique

OH

H O

O

OH

OH

C OOH

a c id e α D g a la c t u r o n iq u e

Les sous-unités

• homogalacturonanes: DGalpA α (1→4) DGalpA α ….; – substitutions: du COOH (méthanol, amide, ions)– des OH secondaires (acetyls)

• homogalacturonanes substitués par des oses: – rhamnogalacturonane II: chaînes latérales complexes– xylogalacturonanes: résidus xylose– apiogalacturonanes: résidus apiose

• - rhamnogalacturonane I: – rhamnose DGalpA α (1 → 2) LRhap α (1 → 4) DGalpA α …. ,

chaînes latérales longues.

Organisation des sous-unités

Zones lissesZones hérissées

DGalpA α (1->4) DGalpA α….DGalpA α (1->2) LRhap α (1->4) DGalpA α ….

OO

O

OH

OH

COOH

O

OH

O

O

HO H3C

OO

O

OH

OH

COOH

OU?

Homogalacturonanes

O

HOO

O

OH

COOH

O

HOO

OH

COOCH3

O

HOO

OH

CONH2

O

HOO

OH

COO -Na +

Ac

Degré de méthylation DM

Degré d'amidation DA

Conditions de gélification

Degré d'acétylation DAc

Inhibe la gélification

Tableau 1: Classification des pectines selon des critères technologiquesDM > 50 Pectines HM (High methoxy)DM < 50 Pectines LM (Low methoxy)DA < 25*, DM < 50 Pectines LMA (Low methoxy, Amidated)DM < 5 Acides pectiques* limite réglementaire.

Homogalacturonanes 1: taille – répartition Rha

• Hypothèse de Rees: 4% de rhamnose: 1 / 25?– Pectinases: Le rhamnose est regroupé en zones

rhamnogalacturoniques macromoléculaires

• Hydrolyse acide– Résistance des liaisons à l’hydrolyse acide– GalA-GalA > GalA-ON > ON-GalA > ON-ON

?

Les modèles (faux) à répartition homogène GalA-Rha

Talmadge et al., 1973)

(GalA)25 – Rha – (GalA)25 - Rha

Rees & Wight

Hydrolyse acide

Pectines ou pulpe de betteravepH 13,4°C, 1h

Pectines/pulpe déestérifiéesHCl 0,1N,80°C

SolubleInsoluble

Centrifugation

Hydrolyse acide

Hydrolyse acide

0 20 40 60 80 100

5h

72h24h

Insoluble

Autres oses neutresRhamnose

0 5 10 15 20 25 30 35

Soluble

5h

72h24h

5h

72h24h

Pomme

Citrus

Betterave

% (poids) des pectines initiales

Acide galacturonique

Hydrolyse acide

Homogalacturonanes

2040

0

1

0

20

0

1

0

20

40

0

2

4

72h

24h

5h

0

GalA (mg/L) ON (mg/L)

0 0,5 1Kav

18 22 26 30Volume d'élution (mL)

I90°

RI

CitrusVolts

DP: 70-100Rha < 0.5 %

Hydrolyse acide

Homogalacturonanes 2distribution des méthyles

• Pourquoi?– Degré de méthylation pour prédire les utilisations possibles– N’explique pas toutes les différences de réactivité (calcium)

• Génération de ces différences:– Biosynthèse et surtout réarrangements in muro– Méthylesterases

• Distribution inter moléculaire et intra moléculaire• Comment mesurer cette distribution?

– Intra: • Dégradation enzymatique• RMN 1H, 13C

– Inter• Méthodes de fractionnement : échange d’ions, électrophorèse

Homogalacturonanes 2distribution des méthyles

Exemple: dégradation par une PG

Non estérifiéEstérifié

Etudes sur des pectines obtenues par différentes méthodes de déestérification

PME de plante

PME fungique

NaOH

Lindberg et al., 2000

RMR du 1H ou du 13C

• Mesure des surfaces des différents signaux

• Calcul des proportions– Vérification interne par les

sommes

Distribution intermoléculaire: échange d’ions

• Les pectines hautement méthylées éluent précocément

multichaînemonochaîne

0 20 40Volume d'élution (ml)

Rép

onse

col

orim

étriq

ue0

0.5

Tam

pon

acét

ate

(M)

75

72

69

64

43

DM

PME A.niger à pH 4,5

0 20 40Volume d'élution (ml)

Rép

onse

col

orim

étriq

ue

0

0.5

Tam

pon

acét

ate

(M)

75

72

69

63

42

DM

PME pomme à pH 7,0

DEAE

Guillotin et al., 2007

2 pectines commerciales de même composition

Dionex PropacTM WAX-10 column (WAX; 250×4 mm)

Pectines « expérimentales »

Electrophorèse capillaire

B: HM pectin (la même que dia précédente)D et G: pectines LMAE: pectine LM

Mobilité électrophorétique en fonction DS

Guillotin et al., 2007

Homogalacturonane: acétylation

• Acétylation du O-2 ou O-3– Varie selon les espèces– Betterave:

• 2-O et 3-O en proportions similaires• Rarement sur GalA méthylés

• Acétylation inhibe la gélification

• Degré d’estérification / degré de méthylation– Les acétyles comptent comme un GalAMe

Distribution Ac et Me dans pectine bettterave

Ralet et al., 2005• Quantitative representation of the HG-

derived oligogalacturonates recovered. • Reconstructed HG domain with proposed

acetylation pattern. • Reconstructed HG domain with proposed

acetylation and methylation patterns (○) unsubstituted GalA residue; (● ) methylated GalA residue; (● ) 2-O-acetylated GalA residue; (● ) 3-O-acetylated GalA residue; (●) methylated and acetylated GalA residue.

Rhamnogalacturonane Ichaîne rhamnogalacturonique

...2)- α-L-Rha-(1 4)-α-D-GalpA-(1 2)- α-L-Rha-(1 4)- α-D-GalpA-(1 2)- α-L-Rha-(1 4)-α-D-GalpA-(1 ...

Rhamnose = 6-déoxy-L-mannose

Rhamnogalacturonane Ichaîne rhamnogalacturonique

• Longueur de la chaîne rhamnogalacturonique– Essais d’hydrolyse acide: quelques dizaines– Probablement quelques centaines– Non méthylé?– GalA acétylé (O-2 ou O-3)

• Irrégularités: – Zones non dégradables par enzymes spécifiques RG– GalA:Rha = 2: 1, env 5 KDa (pomme, poire, carotte, poireau…)

• Ramifications: – Chaînes longues, sur le O-4 du rhamnose: 1/5 à 4/5 – Gal en connection (oligomères Rha (Gal)-GalA- Rha (Gal)- GalA)– Puis galactanes (arabinogalactane type I) et arabinanes– β-D-GlcpA-(1 → 3) sur GalA

Rhammnogalacturonane Ichaînes latérales

4a : Arabinane

4b : Arabinogalactane de type I

4c : Arabinogalactane de type II? (AGP)

...→5)-α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→ ...O-2

O-3

α-L-Araf

O-3

α-L-Araf

α-L-Araf

...→5)-α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→ ...O-2

O-3

α-L-Araf

O-3

α-L-Araf

O-3

α-L-Araf

O-3

α-L-Araf

α-L-Arafα-L-Araf

...→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→ ...O-3

α-L-Araf

O-3

α-L-ArafO-5

α-L-Araf

...→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→ ...O-3

α-L-Araf

O-3

α-L-ArafO-5

α-L-Araf

O-3

α-L-Araf

O-3

α-L-ArafO-5

α-L-Araf

O-5

α-L-Araf

R = L-Araf-(1 ou α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1

β-D-Galp

...→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→ ...O-6

β-D-Galp

O-6

β-D-Galp

O-6R

O-6

β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-

O-6

β-D-Galp

O-6

...

R = L-Araf-(1 ou α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1

β-D-Galp

...→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→ ...O-6

β-D-Galp

O-6

β-D-Galp

O-6

β-D-Galp

O-6R

O-6

β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-

O-6

β-D-Galp

O-6

β-D-Galp

O-6

...

immunolocalisationarabinane et galactane

Figure 4. Immunogold electron micrograph of leek root cap cells. The occurrence of (1?4)--galactan in the inner region of the primary cell wall and itsabsence from central regions of the cell wall at a cell junction can be seen (cw). Scale bar = 200 nm. Willats et al., 2000

Figure 3. Immunofluorescent micrographs of sequential sections of resin-embedded peacotyledons labelled with anti-(1→4)--galactan (A) and anti-(1→5)--arabinan (B). (1→5)--Arabinan occurs throughout the primary cell walls and (1→4)--galactan is restricted to a region of the cell wall close to the plasma membrane. The arrows indicate the outer surface of the cell wall at intercellular spaces. The dashed line indicates the outer surface of the cotyledon. The extent of one intercellular space is indicated by a line. Scale bar = 10 m.

Rhamnogalacturonane II

• « Mégaoligosaccharide »• Toutes les parois depuis les

mousses• Sucres rares : d-apiose (Api), l-

aceric acid (3-C-carboxy-5-deoxy-l-xylose, AceA), 2-O-methyl l-fucose(2Me-Fuc), 2-O-methyl d-xylose (2Me-Xyl), l-galactose (l-Gal), 2-keto-3-deoxy-d- lyxo-heptulosaricacid (Dha), and 2-keto-3-deoxy-d-manno-octulosonic acid (Kdo).

• Après hydrolyse enzymatique poussée des parois; Vin rouge (0.05g/L).

• Présence de borate (apiose): dimérisation, fixation cations (Ca, Pb)

Dimérisation du RG II

Rôle dans la structure des parois

Matsunaga, 2004http://konarc.naro.affrc.go.jp/kankyo/d_shigen/member/matunaga/interest_e.htm

Galacturonanes substitués

β D Xylp

Xylogalacturonane

(Lemna minor, Zostera)

Apiogalacturonane

Degré de xylosylation: 75% (pomme), 25% (pastèque)Méthylation indépendante xylosylation

Immunolocalisation

LM8: xyloglacturonanefortement substituéLocalisé dans les zones de déhiscence des parois

Proportions des différentes unités structurales

Polysacch (/ ms)Pectines (% polysacch)

Sous unités (%)HGXGRGINSRGII

Cassis (Hilz)

1961

6805243

Pomme(Voragen)

2042

36414710

Betterave(Voragen)

6740

29<14484

Raisin(Nunanet)

1156

65Na10232

SojaVoragen)

1659

02115604

Quel modèle aujourd’hui?

• RG II: – Sur la chaîne HG (Zhang et al.)

• Difficulté d’identifier le point de connection RG I – HG– Quantité– Sélectivité des méthodes de dégradation

• Thèse Coenen– Identification d’oligomères GalA(3)Rha(1), GalA(4)Rha(2) et

GalA(5)Rha(3) , GalA(6)Rha(3)Xyl(1) – Une chaine principale rhamnogalacturonique

Conformation des pectines

• Les pectines ne forment pas (ou très difficilement) de cristaux– A longtemps empéché l’obtention de données de

conformation (RX)

• Modèle le plus ancien (Rees, 1982): – Dichroisme circulaire + analogie avec polyguluronate– Hélice 21 pour pectate de sodium « boîte-à-œufs »

"boîte-à-œufs"

Les conformations obtenues par RX

Walkinshaw & Arnott, 1981Pectate de sodium: hélice 31maille orthogonale avec a = 0.83, b = 1.43, c = 1.34 nm

Rigby et al., 2000: Diagrammes de poudres sur cristaux d'oligogalacturonates Na, K et Ca:confirmation structure sel Na; problème de qualité des données pour les autres sels.

Modélisation moléculaire

Liaison glycosidique:

Acide carboxylique

Braccini et al., 2000

Modélisation homogalacturonane

Minima d'énergie (intégrant une constante diélectrique de 80) :

A

781021311510.0

Hélices

ΦΨγg'

DE (kcal/mol)

B

99161130-1440.3

ΦΨγn

pas (nm)

DE

A

74.694.8154

31.329

0.0

B

94.5147.9136

21.275

0.8

W&A

79.790.5

Et en présence de calcium?

• Pas de fortes différences d’énergie– Ca non localisé du hélice 31, localisé sur hélice 21