Plan
• Les pectines: définition et structure– Le squelette pectique– Les chaînes latérales– Conformation des homogalacturonanes
• Méthodes d'étude des pectines• Les pectines en tant qu'additifs: sources, méthodes
d'extraction, propriétés et réactivité• Les enzymes pectolytiques• Les pectines in situ: biosynthèse, rôles dans les
parois et dans la transformation des fruits et légumes• Quelques exemples de nos travaux
Les pectines
Polymères de la paroi végétale primaire (matrice amorphe)Maturation et transformations des fruits et légumesE440: Gélifiants: confitures, fourrages, fruits sur sucres
Stabilisants boissons lactées acides...
Polysaccharides complexes, riches en acide galacturonique
OH
H O
O
OH
OH
C OOH
a c id e α D g a la c t u r o n iq u e
Les sous-unités
• homogalacturonanes: DGalpA α (1→4) DGalpA α ….; – substitutions: du COOH (méthanol, amide, ions)– des OH secondaires (acetyls)
• homogalacturonanes substitués par des oses: – rhamnogalacturonane II: chaînes latérales complexes– xylogalacturonanes: résidus xylose– apiogalacturonanes: résidus apiose
• - rhamnogalacturonane I: – rhamnose DGalpA α (1 → 2) LRhap α (1 → 4) DGalpA α …. ,
chaînes latérales longues.
Organisation des sous-unités
Zones lissesZones hérissées
DGalpA α (1->4) DGalpA α….DGalpA α (1->2) LRhap α (1->4) DGalpA α ….
OO
O
OH
OH
COOH
O
OH
O
O
HO H3C
OO
O
OH
OH
COOH
OU?
Homogalacturonanes
O
HOO
O
OH
COOH
O
HOO
OH
COOCH3
O
HOO
OH
CONH2
O
HOO
OH
COO -Na +
Ac
Degré de méthylation DM
Degré d'amidation DA
Conditions de gélification
Degré d'acétylation DAc
Inhibe la gélification
Tableau 1: Classification des pectines selon des critères technologiquesDM > 50 Pectines HM (High methoxy)DM < 50 Pectines LM (Low methoxy)DA < 25*, DM < 50 Pectines LMA (Low methoxy, Amidated)DM < 5 Acides pectiques* limite réglementaire.
Homogalacturonanes 1: taille – répartition Rha
• Hypothèse de Rees: 4% de rhamnose: 1 / 25?– Pectinases: Le rhamnose est regroupé en zones
rhamnogalacturoniques macromoléculaires
• Hydrolyse acide– Résistance des liaisons à l’hydrolyse acide– GalA-GalA > GalA-ON > ON-GalA > ON-ON
?
Les modèles (faux) à répartition homogène GalA-Rha
Talmadge et al., 1973)
(GalA)25 – Rha – (GalA)25 - Rha
Rees & Wight
Hydrolyse acide
Pectines ou pulpe de betteravepH 13,4°C, 1h
Pectines/pulpe déestérifiéesHCl 0,1N,80°C
SolubleInsoluble
Centrifugation
Hydrolyse acide
Hydrolyse acide
0 20 40 60 80 100
5h
72h24h
Insoluble
Autres oses neutresRhamnose
0 5 10 15 20 25 30 35
Soluble
5h
72h24h
5h
72h24h
Pomme
Citrus
Betterave
% (poids) des pectines initiales
Acide galacturonique
Hydrolyse acide
Homogalacturonanes
2040
0
1
0
20
0
1
0
20
40
0
2
4
72h
24h
5h
0
GalA (mg/L) ON (mg/L)
0 0,5 1Kav
18 22 26 30Volume d'élution (mL)
I90°
RI
CitrusVolts
DP: 70-100Rha < 0.5 %
Hydrolyse acide
Homogalacturonanes 2distribution des méthyles
• Pourquoi?– Degré de méthylation pour prédire les utilisations possibles– N’explique pas toutes les différences de réactivité (calcium)
• Génération de ces différences:– Biosynthèse et surtout réarrangements in muro– Méthylesterases
• Distribution inter moléculaire et intra moléculaire• Comment mesurer cette distribution?
– Intra: • Dégradation enzymatique• RMN 1H, 13C
– Inter• Méthodes de fractionnement : échange d’ions, électrophorèse
Homogalacturonanes 2distribution des méthyles
Exemple: dégradation par une PG
Non estérifiéEstérifié
Etudes sur des pectines obtenues par différentes méthodes de déestérification
PME de plante
PME fungique
NaOH
Lindberg et al., 2000
RMR du 1H ou du 13C
• Mesure des surfaces des différents signaux
• Calcul des proportions– Vérification interne par les
sommes
Distribution intermoléculaire: échange d’ions
• Les pectines hautement méthylées éluent précocément
multichaînemonochaîne
0 20 40Volume d'élution (ml)
Rép
onse
col
orim
étriq
ue0
0.5
Tam
pon
acét
ate
(M)
75
72
69
64
43
DM
PME A.niger à pH 4,5
0 20 40Volume d'élution (ml)
Rép
onse
col
orim
étriq
ue
0
0.5
Tam
pon
acét
ate
(M)
75
72
69
63
42
DM
PME pomme à pH 7,0
DEAE
Guillotin et al., 2007
2 pectines commerciales de même composition
Dionex PropacTM WAX-10 column (WAX; 250×4 mm)
Pectines « expérimentales »
Electrophorèse capillaire
B: HM pectin (la même que dia précédente)D et G: pectines LMAE: pectine LM
Mobilité électrophorétique en fonction DS
Guillotin et al., 2007
Homogalacturonane: acétylation
• Acétylation du O-2 ou O-3– Varie selon les espèces– Betterave:
• 2-O et 3-O en proportions similaires• Rarement sur GalA méthylés
• Acétylation inhibe la gélification
• Degré d’estérification / degré de méthylation– Les acétyles comptent comme un GalAMe
Distribution Ac et Me dans pectine bettterave
Ralet et al., 2005• Quantitative representation of the HG-
derived oligogalacturonates recovered. • Reconstructed HG domain with proposed
acetylation pattern. • Reconstructed HG domain with proposed
acetylation and methylation patterns (○) unsubstituted GalA residue; (● ) methylated GalA residue; (● ) 2-O-acetylated GalA residue; (● ) 3-O-acetylated GalA residue; (●) methylated and acetylated GalA residue.
Rhamnogalacturonane Ichaîne rhamnogalacturonique
...2)- α-L-Rha-(1 4)-α-D-GalpA-(1 2)- α-L-Rha-(1 4)- α-D-GalpA-(1 2)- α-L-Rha-(1 4)-α-D-GalpA-(1 ...
Rhamnose = 6-déoxy-L-mannose
Rhamnogalacturonane Ichaîne rhamnogalacturonique
• Longueur de la chaîne rhamnogalacturonique– Essais d’hydrolyse acide: quelques dizaines– Probablement quelques centaines– Non méthylé?– GalA acétylé (O-2 ou O-3)
• Irrégularités: – Zones non dégradables par enzymes spécifiques RG– GalA:Rha = 2: 1, env 5 KDa (pomme, poire, carotte, poireau…)
• Ramifications: – Chaînes longues, sur le O-4 du rhamnose: 1/5 à 4/5 – Gal en connection (oligomères Rha (Gal)-GalA- Rha (Gal)- GalA)– Puis galactanes (arabinogalactane type I) et arabinanes– β-D-GlcpA-(1 → 3) sur GalA
Rhammnogalacturonane Ichaînes latérales
4a : Arabinane
4b : Arabinogalactane de type I
4c : Arabinogalactane de type II? (AGP)
...→5)-α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→ ...O-2
O-3
α-L-Araf
O-3
α-L-Araf
α-L-Araf
...→5)-α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1→ ...O-2
O-3
α-L-Araf
O-3
α-L-Araf
O-3
α-L-Araf
O-3
α-L-Araf
α-L-Arafα-L-Araf
...→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→ ...O-3
α-L-Araf
O-3
α-L-ArafO-5
α-L-Araf
...→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→ ...O-3
α-L-Araf
O-3
α-L-ArafO-5
α-L-Araf
O-3
α-L-Araf
O-3
α-L-ArafO-5
α-L-Araf
O-5
α-L-Araf
R = L-Araf-(1 ou α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1
β-D-Galp
...→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→ ...O-6
β-D-Galp
O-6
β-D-Galp
O-6R
O-6
β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-
O-6
β-D-Galp
O-6
...
R = L-Araf-(1 ou α-L-Araf-(1→5)-α-L-Araf-(1
β-D-Galp
...→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→ ...O-6
β-D-Galp
O-6
β-D-Galp
O-6
β-D-Galp
O-6R
O-6
β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-
O-6
β-D-Galp
O-6
β-D-Galp
O-6
...
immunolocalisationarabinane et galactane
Figure 4. Immunogold electron micrograph of leek root cap cells. The occurrence of (1?4)--galactan in the inner region of the primary cell wall and itsabsence from central regions of the cell wall at a cell junction can be seen (cw). Scale bar = 200 nm. Willats et al., 2000
Figure 3. Immunofluorescent micrographs of sequential sections of resin-embedded peacotyledons labelled with anti-(1→4)--galactan (A) and anti-(1→5)--arabinan (B). (1→5)--Arabinan occurs throughout the primary cell walls and (1→4)--galactan is restricted to a region of the cell wall close to the plasma membrane. The arrows indicate the outer surface of the cell wall at intercellular spaces. The dashed line indicates the outer surface of the cotyledon. The extent of one intercellular space is indicated by a line. Scale bar = 10 m.
Rhamnogalacturonane II
• « Mégaoligosaccharide »• Toutes les parois depuis les
mousses• Sucres rares : d-apiose (Api), l-
aceric acid (3-C-carboxy-5-deoxy-l-xylose, AceA), 2-O-methyl l-fucose(2Me-Fuc), 2-O-methyl d-xylose (2Me-Xyl), l-galactose (l-Gal), 2-keto-3-deoxy-d- lyxo-heptulosaricacid (Dha), and 2-keto-3-deoxy-d-manno-octulosonic acid (Kdo).
• Après hydrolyse enzymatique poussée des parois; Vin rouge (0.05g/L).
• Présence de borate (apiose): dimérisation, fixation cations (Ca, Pb)
Rôle dans la structure des parois
Matsunaga, 2004http://konarc.naro.affrc.go.jp/kankyo/d_shigen/member/matunaga/interest_e.htm
Galacturonanes substitués
β D Xylp
Xylogalacturonane
(Lemna minor, Zostera)
Apiogalacturonane
Degré de xylosylation: 75% (pomme), 25% (pastèque)Méthylation indépendante xylosylation
Immunolocalisation
LM8: xyloglacturonanefortement substituéLocalisé dans les zones de déhiscence des parois
Proportions des différentes unités structurales
Polysacch (/ ms)Pectines (% polysacch)
Sous unités (%)HGXGRGINSRGII
Cassis (Hilz)
1961
6805243
Pomme(Voragen)
2042
36414710
Betterave(Voragen)
6740
29<14484
Raisin(Nunanet)
1156
65Na10232
SojaVoragen)
1659
02115604
Quel modèle aujourd’hui?
• RG II: – Sur la chaîne HG (Zhang et al.)
• Difficulté d’identifier le point de connection RG I – HG– Quantité– Sélectivité des méthodes de dégradation
• Thèse Coenen– Identification d’oligomères GalA(3)Rha(1), GalA(4)Rha(2) et
GalA(5)Rha(3) , GalA(6)Rha(3)Xyl(1) – Une chaine principale rhamnogalacturonique
Conformation des pectines
• Les pectines ne forment pas (ou très difficilement) de cristaux– A longtemps empéché l’obtention de données de
conformation (RX)
• Modèle le plus ancien (Rees, 1982): – Dichroisme circulaire + analogie avec polyguluronate– Hélice 21 pour pectate de sodium « boîte-à-œufs »
"boîte-à-œufs"
Les conformations obtenues par RX
Walkinshaw & Arnott, 1981Pectate de sodium: hélice 31maille orthogonale avec a = 0.83, b = 1.43, c = 1.34 nm
Rigby et al., 2000: Diagrammes de poudres sur cristaux d'oligogalacturonates Na, K et Ca:confirmation structure sel Na; problème de qualité des données pour les autres sels.
Modélisation homogalacturonane
Minima d'énergie (intégrant une constante diélectrique de 80) :
A
781021311510.0
Hélices
ΦΨγg'
DE (kcal/mol)
B
99161130-1440.3
ΦΨγn
pas (nm)
DE
A
74.694.8154
31.329
0.0
B
94.5147.9136
21.275
0.8
W&A
79.790.5
Et en présence de calcium?
• Pas de fortes différences d’énergie– Ca non localisé du hélice 31, localisé sur hélice 21