analyse in vivo des interactions protéine-protéine · mutagénèse aléatoire parpcr: dubuisson...

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Analyse in vivo des interactions protéine-protéine

Roland Lloubès LISM, IBSMhttp://lism.cnrs-mrs.fr

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Plan

Interactions « toxine-bactérie »définitions des colicinesmode d’action

Détection de complexe protéiqueLes interactions des colicines avec les protéines de l’enveloppe bactérienne:récepteurs systèmes de translocation

Interactions « protéine-protéine »Les interactions Tol-colicine suivies par plusieurs techniques immunologiques

Mutations suppressives Les complexes entre protéines solubles et entre protéines membranaires (au niveau des segments transmembranaires)

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Les colicines

Substances qui inhibent la croissance bactérienne

Substances non transmissibles

Substances insensibles aux nucléases

Substances résistantes à l’action des rayonnements UV

Substances détruites par l’action de protéases

______________________________________________________Frederick P. (1950); Jacob F. et al., (1952); Lwoff A. Et al., (1952)

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Les différentes colicines

colicine activité plasmide BRP

E2, E7, E8, E9 DNase BPM +

E3, E6 RNase BPM +

E5, E4 RNase BPM +

Cloacine DF13

(Enterobacter cloacae)RNase BPM +

A

(Citrobacter freundii)Pore BPM +

E1 Pore BPM +

N Pore BPM +

K Pore BPM +

U

(Shigella boydii)Pore chomosome ?

Col5 Pore BPM +

Col10 Pore BPM +

Ia, Ib Pore HPM -

B Pore HPM -

D RNase BPM +

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Les plasmides colicinogéniques

A, E1, K, N...

E2, E8, E9, D...

B, Ia, Ib...

L’organisation des opérons indique que la protéine d’immunité des colicines à activité nucléasique doit interagir avec la colicine elle même….

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Biosynthèse et mode d ’action des colicines

Bactérie productrice

Bactérie réceptrice

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Résistants et tolérants

Davies and Reeves (1975)

I

II

III

IV

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Récepteur etsystème de translocation

Colicines Activité Récepteur translocation

E2, E7, E8, E9 DNase BtuB TolAQRB

E3, E6 RNase BtuB TolAQRB

E5, E4 RNase BtuB TolABQR

Cloacine DF13

(Enterobacter cloacae)RNase IutA TolAQR

A

(Citrobacter freundii)Pore BtuB TolAQRB

E1 Pore BtuB TolAQ

N Pore OmpF TolAQR

K Pore Tsx TolAQRB

U

(Shigella boydii)Pore OmpA TolAQRB

S4 Pore OmpW ?

Col5 Pore Tsx TonB, ExbBD

Col10 Pore Tsx TonB, ExbBD

Ia, Ib Pore Cir TonB, ExbBD

B Pore FepA TonB, ExbBD

D RNase FepA TonB, ExbBD

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Mode d’action des différentes colicines

TonB-dépendantes

Tol-dépendantes

E5 E3E4E6

E2,E7E8,E9

Ionophoriques

EnzymatiquesD

M

B Ia, Ib5, 10 K N U S4 E1

A

BtuB

FepA

FepA

FhuA

Cir Tsx BtuB

ADN

ribosome

ARNt

Arrêt de la synthèse peptidique DNase

OmpF OmpA OmpW

Arrêt de lasynthèse du

peptidoglycane

OmpA OmpFOmpF

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Les 3 domaines de la colicine A

Baty et al. (1988)

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Les 3 domaines fonctionnels des colicines

T Colicin Ia Colicin Ia Colicin Ia

T R P

Colicin Ia

Colicin 10

Colicin E1

Colicin A

Colicin N

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Organisation des « clusters » tol-pal….

Sturgis 2001

13

Localisation et topologie des protéines du système Tol-Pal

Lazdunski et al. 2000

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Phénotype des mutants tol-pal

Immunodétections de LamB et coloration négativede cellules tolA cultivées avec maltose (a) ouglucose (b) (Lloubès et al., 2001)

- altération de l’intégrité membranaire:

hypersensibilité aux agents toxiques

fuite des protéines périplasmiques

vésicularisation de la membrane externe

- tolérance vis à vis des colicines et

des phages filamenteux (tol)

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Co-localisation

fractionnement cellulaire

séparation membrane interneet membrane externe parultracentrifugation sur gradient de sucrose

16Guihard et al. (1994)

Les protéines Tol et la colicine A sont co-localisées

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Suivi des interactions par la technique dite « overlay »

Bénédetti et al., 1991

Principe(marquage 35S des protéines)électrophorèse SDS-PAGEélectrotransfert sur nitrocelluloseincubation avec 100nM de colicine Aimmunodétection avec un anticorps dirigécontre la colicine A

Le domaine C-terminal de TolA est requis pour permettrel’interaction avec la colicine A

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Le domaine N-terminal de colA interagit avec TolA

Cette technique d ’overlay a été utile pour le complexe TolA-colicineAmais n’a pas pu être utilisée pour d’autres interactions du système.

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Immunoprécipitations

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Le domaine N-terminal de la colicine E3 interagit avec TolB

Technique pour analyser les complexes protéiquesdans le périplasme: Bouveret et al., 2002

21

Modèle pour l’étape de translocation de la colicine A

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Pontage chimique et immunoprécipitations

Coimmunoprécipitation de Pal par les anticorps anti TolA(cellules préalablement traitées avec des agents de pontage)

23

Cascales et al., 2000

La FPM et le domaine C-terminal de TolA permettent l’interaction

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Mutations suppressives dans la membrane interne

25

Lazzaroni et al., 1995

Interaction entre les segments TM de TolQ3 et de TolR

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Mutation suppressive dans le périplasme

Dubuisson et al., 2002Mutagénèse aléatoire parPCR:

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Résultats des interactions suivies par le double hybride levure

Walburger et al., 2001

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TolA

Pal

TolQ TolR

I IIIII

ME

MI

PG

L’interaction TolA-Pal requiert les protéines TolQ-TolR et laforce proton motrice issue de la membrane interne

Journet et al., 1999; Cascales et al., 2001

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III

TolA

TolB Pal

I

TolQ TolR

I II IIII

ME

MI

PGII

II

III

Les interactions des protéines Tol-Pal dans le périplasme

OmpA

Bouveret et al., 1995; Bouveret et al., 1999; Cascales et al., 2002

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IM

OM

TolA

TolQ TolR

PalTolB

OmpA

Résumé