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Réunion MycoMed, Paris, 15/10/2015

C H R I S T I N E S E G O N D S

ACCRÉDITATION COFRAC RETOUR D’EXPÉRIENCE DU CHU DE

TOULOUSE

PREMIER AUDIT COFRAC BACTÉRIOLOGIE FÉVRIER 2015

Recherche de mycobactéries

Echantillon d'origine humaine hors sang, moelle osseuse,

liquides hémorragiques

Culture milieu liquide Automate MGIT


Détection mycobactéries du complexe tuberculeux

+ R rifampicine

Echantillon d'origine humaine (sauf sang et

prélèvements hémorragiques)

PCR en temps réel XPERT MTB/Rif

Deux analyses Mycobactéries soumises à accréditation, portée A

Points non validés par le fournisseur: •  Détection dans les urines •  Ajout de vancomycine au mélange antibiotique

Point non validé par le fournisseur: •  Détection dans les prélèvements extra-pulmonaires

MGIT/MÉTHODE DÉTECTION DANS LES URINES

•  Bibliographie (limitée!) •  Chan DS et al. An evaluation of the recovery of mycobacteria

from urine specimen using the automated BACTEC MGIT 960. J. Med. Microbiol, 2008.

•  Hillemann D et al. Use of the BACTEC MGIT 960 for recovery of Mycobacteria from 9558 extra-pulmonary specimens, including urine samples. J. Clin. Microbiol. 2006.

Sensibilité 83-93%; délai de positivité <<milieu solide

•  Culture en milieu solide en parallèle

•  Recensement en cours des urines positives en culture (comparaison MGIT/Löwenstein Jensen) pour répondre à une éventuelle question auditeur


MGIT/MÉTHODE PANTA+ VANCOMYCINE

•  Rationnel •  Recommandé par formateur •  Mélanges antibiotiques autres automates: PANTAV/

Bactalert®, PVNA/Versatrek ® •  Recrutement mucoviscidose important (≈400 échantillons/an)

•  Bibliographie (limitée!) Chang CL et al, Reduction of contamination of Mycobacterial Growth Indicator Tubes with a Modified Antimicrobial combination. J. Clin. Microbiol. 2002



Essais : comparaison de méthode

•  Echantillons hors mucoviscidose (N=34,15 positifs) MGIT-PANTA+V versus Bactalert-PANTAV

Résultats concordants, délai de positivité légèrement inférieur en MGIT, taux de contamination similaire

•  Expectorations mucoviscidose natives (N=20, 2 positifs) et surchargées par M. avium, M. intracellulare, M. abscessus

MGIT-Mycoprep ± ac. oxalique – PANTA+V versus Bactalert-dithiotréitol/chlorhexidine-PANTAV MGIT plus sensible (2 positifs supplémentaires), taux de contamination similaire



• Gestion des lots de vancomycine •  Conservation des aliquots : cf recommandations

pour supplément paraTB •  Contrôle de stérilité •  Traçabi l i té des lots : lot de poudre de

vancomycine, dates de première et dernière utilisation des aliquots

• Surveillance du taux de contamination en milieu liquide/milieu solide

1,5%/4,7%


MGIT/MÉTHODE

•  Démarche d’ensemencement des échantillons •  Pas de question sur le point urine •  Vancomycine: pourquoi et comment? •  Ecart non critique •  Utilisation en complément du kit Mycoprep® qui présente une

inadéquation entre les quantités de tampon phosphate et des autres réactifs, d’un tampon externe commercialisé, non inclus dans la validation de méthode •  Comparaison des taux de positivité et de la détection des patients

connus positifs pendant les périodes respectives d’utilisation des tampons

•  Comparaison de la détection pour échantillons neutralisés en parallèle par les 2 tampons

•  EEQ: CTCB, CAP-Survey


PCR XPERT MTB RIF/MÉTHODE PRELEVEMENTS EXTRA-PULMONAIRES

Bibliographie •  Méta-analyse OMS 2013

•  prélèvements ganglionnaires, liquide pleural, LCR, tissus hors ganglions sensibilité 40-80%

•  urines et selles : données insuffisantes Automated Real-Time Nucleic Acid Amplification Technology for Rapid and Simultaneous Detection of Tuberculosis and Rifampicin Resistance: Xpert MTB/RIF Assay for the Diagnosis of Pulmonary and Extrapulmonary TB in Adults and Children: Policy Update. Geneva: World Health Organization; 2013. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK258608/

Xpert MTB/RIF implementation manual Technical and operational ‘how-to’: practical considerationshttp://apps.who.int/iris/bitstream/10665/112469/1/9789241506700_eng.pdf?ua=1

•  Tortoli et al, Eur Resp J, 2013 : sensibilité dans les urines =87,5%


PCR XPERT MTB RIF/MÉTHODE PRELEVEMENTS EXTRA-PULMONAIRES

Essais/culture •  153 prélèvements pulmonaires

Spécificité : 98.5%; sensibilité : 88.9% VPN : 98.5% ; VPP : 88.9%

•  119 prélèvements extra-pulmonaires (urines, LCR, liquides péritonéaux, liquides pleuraux, liquides articulaires, ganglions, biopsies)

Spécificité : 100%; sensibilité : 85.7% VPN : 99.1% ; VPP : 100%


PCR XPERT MTB RIF/MÉTHODE

•  Extraction d’ADN et inoculation des cassettes(L3) •  Amplification : audit général biologie moléculaire

•  EEQ (QCMD)


MYCOBACTERIES/MATIÈRE

•  Prise en charge des échantillons au préanalytique •  secteur dédié Bactériologie •  Conservation des échantillons au préanalytique en dehors

des heures d’ouverture du laboratoire: évaluation à faire!

•  Réception et vérification des prélèvements au L3


MYCOBACTÉRIES/MILIEU

Exigences environnementales pour le matériel

•  Bactec MGIT •  19 à 30°C → sonde de température ambiante •  30 à 80 % HR •  Pas de lumière, ni de chaleur directe •  Impact de la température? Réponse à la question posée à BD :

Une température extérieure trop basse peut ralentir la croissance des mycobactéries, mais durée d’incubation longue, contrôle visuel des tubes en fin d’incubation, témoin de croissance pour l’antibiogramme impact limité sur la qualité de l’analyse Une température trop élevée dans le laboratoire peut également perturber la croissance des mycobactéries. Les conséquences sur le résultat des tests sont plus difficilement évaluables

•  GenXpert •  15-30° •  10-95% HR


MYCOBACTERIES/MILIEU

•  Hygiène et sécurité dans le L3 •  Fiche d’habillage à l’entrée du L3 •  Organisation en zones •  Protection lors des activités à risque •  Conduite à tenir en cas d’incident •  Elimination des déchets (autoclave à double entrée); suivi autoclave •  Caméras de surveillance

•  Affichage KIMO L3

•  Contrôle de la décontamination des PSM •  semestriel: attention conduite à tenir en cas de non-conformité!

•  Métrologie des étuves (incubation à 30°C) •  modalités de suivi •  attention conduite à tenir en cas de non-conformité!


MYCOBACTERIES/MATÉRIEL

•  Equipements •  Traçabilité des maintenances (logiciel Kalilab) •  Vérification de la connexion informatique •  Dossiers-tests au démarrage •  Vérification mensuelle

•  Réactifs •  Gestion des stocks (logiciel Kalilab) •  Métrologie des enceintes •  Qualification des lots de tubes MGIT à chaque livraison

Selon recommandations fabricant (M. tuberculosis, M. kansasii, M. fortuitum)

•  Pas de qualification des cassettes Xpert MTB Rif à chaque livraison

•  Métrologie des pipettes


MYCOBACTERIES/MAIN D’ŒUVRE

•  Attestations de formations par le fournisseur •  Traçabilité de l’identité des manipulateurs sur le SGL •  Habilitation des techniciens •  Attestation de lecture des documents-qualité correspondants (logiciel

Kalilab) •  MGIT : tutorat + ensemencement en parallèle avec un technicien

habilité de 5 prélèvements au hasard et de 2 prélèvements de patients connus culture+

•  Xpert-MTB-RIF : extraction (L3)-Amplification (biologie moléculaire)-Saisie et interprétation (L3); tutorat tracé

•  Questionnaire d’évaluation des connaissances

•  Habilitation des biologistes •  Attestation de lecture des documents-qualité correspondants (logiciel Kalilab) •  Questionnaire d’évaluation des connaissances •  Tutorat de validation par biologiste habilité tracé


POST-ANALYTIQUE

•  Prestations de conseil des biologistes •  Indication des méthodes sur le compte-rendu •  Vérification mensuelle de l’intégrité des résultats sur

le serveur


EN CONCLUSION

•  Points forts •  Personnel technique •  Compétences techniques et connaissance des procédures •  Motivation qualité •  Maîtrise des outils (SGL, logiciel qualité, métrologie) •  Processus d’habilitation

•  Equipe de qualiticiens •  Spécialiste métrologie •  Prestation de conseil biologistes

•  Axes d’amélioration •  Définir les conduites à tenir et analyser l’impact patient en cas de non-

conformité (CQI, métrologie)

•  Pas de remarque sur portée A/points non validés fournisseur •  Attention à tout changement par rapport au dossier de

validation de méthode!


REMERCIEMENTS

•  L’équipe technique des Mycobactéries pour sa conscience professionnelle et le travail réalisé pour la préparation de l’audit •  Notre RAQ et nos qualiticiennes pour leur aide

majeure dans la gestion qualité •  Les internes ayant participé à la validation de

méthode du MGIT (bibliographie, exploitation des résultats des essais) •  L’équipe informatique pour les tâches de

paramétrage dans le SGL


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