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UNIVERSITE PARIS 12-VAL DE MARNE

UFR DE SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE

Thèse de Doctorat

Physiologie et Physiopathologie des Appareils Respiratoires

AUTEUR : Pierre-Régis BURGEL

TITRE :

Hypersécrétion de mucus dans l’épithélium respiratoire humain :

rôles du récepteur de l’epidermal growth factor (EGF) et des polynucléaires éosinophiles

dans la synthèse de mucine par l’épithélium des polypes naso-sinusiens.

Thèse dirigée par : Professeur Daniel DUSSER/ co-direction Professeur Jay A. NADEL

Soutenue le 18 décembre 2006

Jury : Monsieur le Professeur Thierry Chinet

Monsieur le Professeur Bruno Crestani

Monsieur le Professeur André Coste

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REMERCIEMENTS

Au Professeur Daniel Dusser pour son soutien et sa confiance sans cesse renouvelée. Merci de

m’avoir ouvert tant d’opportunités.

Au Professeur Jay Nadel. Thank you for all your help and support! You will always be a

model for me.

Aux Professeurs Thierry Chinet, Bruno Crestani et André Coste pour avoir accepté de juger

ce travail

Au Dr Estelle Escudier et au Pr André Coste pour m’avoir appris que l’épithélium respiratoire

ne s’arrêtait pas à la partie supérieure de la trachée.

A tous les membres du Laboratoire du Pr Nadel à San Francisco: Iris Ueki, Jae Jeong Shim,

Kioshi Takeyama, Suil Kim, Matt Shao, Dominic Tam, Trang Dao-Pick. Let there be light !

A tous les membres de L’UPRES EA2511: Clémence Martin, Sophie Danel, Isabelle Fajac,

Guity Thévenot, David Montani, Anh-Tuan Dinh-Xuan pour leur aide et leur bonne humeur.

A mes parents qui m’ont donné très tôt le goût du travail et m’ont toujours encouragé.

A Jean-Stéphane, Lydie, Alexia et Elias.

A Nadia, Edmond, Jean et Nadi.

A Reem sans qui la vie ne serait pas la même.

Aux organismes qui m’ont permis de poursuivre la recherche au sein l’UPRES EA2511 à

l’Hôpital Cochin : La Chancellerie des Universités de Paris (Legs Poix), l’association Vaincre

la Mucoviscidose, le Collège des PU-PH de Pneumologie, l’association Cardif.

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TABLE DES MATIERES :

1ère Partie : Revue de littérature

1. Mucus et hypersécrétion de mucus en pathologie respiratoire.

1.1. Mucus et mucines dans les voies aériennes normales.

1.2. Hypersécrétion de mucus en pathologie respiratoire.

1.2.1. Manifestations cliniques de l’hypersécrétion de mucus.

1.2.2. Conséquences de l’hypersécrétion de mucus dans l’asthme.

1.2.3. Conséquences de l’hypersécrétion de mucus dans la BPCO.

1.2.4. Conséquences de l’hypersécrétion de mucus dans la mucoviscidose.

1.3. Traitement de l’hypersécrétion de mucus : de nouvelles molécules sont nécessaires.

2. Mécanismes de la synthèse et de la sécrétion des mucines.

2.1. Mécanismes de la sécrétion des mucines.

2.2. Régulation de la synthèse des mucines.

3. Rôles du récepteur de l’epidermal growth factor (EGF) en pathologie pulmonaire.

3.1. Récepteurs et ligands de la famille des récepteurs de l’EGF.

3.2. Rôles du récepteur de l’EGF dans la synthèse de mucine et la réparation épithéliale.

3.3. Autres rôles du récepteur de l’EGF en pathologie pulmonaire humaine.

3.3.1. Rôles du récepteur de l’EGF dans les cancers broncho-pulmonaires.

3.3.2. Rôles du récepteur de l’EGF dans la prolifération des fibroblastes et la fibrose

pulmonaire.

3.4. Cibler l’hypersécrétion de mucus avec des antagonistes du récepteur de l’EGF en

étude clinique humaine.

4

4. Rôles des cellules inflammatoires dans la synthèse de mucines.

4.1. Rôles des polynucléaires neutrophiles.

4.2. Rôles des polynucléaires éosinophiles.

5. Intérêt de la polypose naso-sinusienne pour l’étude de l’hypersécrétion de mucus des

voies aériennes.

2ème Partie : Travaux originaux

1. Stratégie générale de la thèse.

2. Rôle du récepteur de l’EGF dans la synthèse de mucine par l’épithélium des polypes

naso-sinusiens.

2.1. Expression de la mucine MUC5AC et du récepteur de l’EGF dans l’épithélium nasal

normal et l’épithélium des polypes naso-sinusiens (publication originale [1]).

2.2. Effets d’activateurs et d’antagonistes du récepteur de l’EGF sur la synthèse de

mucines sur des cellules épithéliales de polypes naso-sinusiens en culture primaire.

3. Rôle des éosinophiles dans la synthèse de mucine par l’épithélium respiratoire.

3.1. Les éosinophiles humains activés induisent la synthèse de la mucine MUC5AC dans

l’épithélium respiratoire par activation du récepteur de l’EGF (publication originale

[2]).

3.2. Etude de l’effet des corticoïdes intranasaux sur l’infiltration par les polynucléaires

éosinophiles et la synthèse de mucine MUC5AC dans la polypose naso-sinusienne in

vivo chez l’homme (publication originale [3]).

3ème partie : Conclusion générale et perspectives.

Bibliographie.

Curriculum vitae.

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1ère Partie : Revue de littérature

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1. Mucus et hypersécrétion de mucus en pathologie respiratoire

1.1 Mucus et mucines dans les voies aériennes normales.

Physiologiquement, l’épithélium des voies aériennes de conduction est recouvert d’une fine

couche de mucus qui permet l’hydratation des cellules épithéliales et joue un rôle de barrière

contre les agressions. Le mucus est un mélange complexe de protéines, de lipides et d’une

phase liquidienne composée d’eau et d’électrolytes. Le gel formé par le mélange de ces

composants tapisse la surface de l’épithélium des voies aériennes de conduction. Les

particules et les micro-organismes inhalés s’adsorbent dans le gel de mucus, et les

mécanismes de clairance des sécrétions bronchiques (clairance muco-ciliaire, toux)

permettent leur évacuation vers les voies aériennes supérieures où elles sont expectorées ou

dégluties. Ce mécanisme de défense primitif contre les agents pathogènes participe de façon

importante à la défense de l’organisme et fait partie de l’immunité innée.

Les mucines sont des glycoprotéines de poids moléculaire élevé; elles doivent leur nom au

fait qu’elles ont été historiquement identifiées comme le constituant principal du mucus chez

l’homme [4]. Les études montrent en effet que les glycoprotéines constituent environ 40 à

50% du poids total du mucus (dialysé puis lyophilisé) prélevé chez des sujets normaux [5].

Les mucines sont constituées d’un noyau protéique et de chaînes d’hydrates de carbone. La

structure protéique des mucines (appelée MUC Protein Backbone ou apomucine) est riche en

résidus sérine et thréonine qui sont des sites de O-glycosylation (assurant la liaison avec les

oligosaccharides) [6]. Les sucres constituent jusqu’à 80% de la masse totale des mucines et

leurs confèrent une forme allongée et une structure rigide qui participent aux propriétés

rhéologiques et viscoélastiques du mucus [4]. Une représentation schématique d’une

glycoprotéine de mucine est montrée sur la Figure 1.

7

Figure 1 : Représentation schématique d’une glycoprotéine de mucine [4].

A ce jour, 19 mucines différentes ont été identifiées chez l’homme. Ces mucines sont

exprimées dans les muqueuses en rapport avec le milieu extérieur, en particulier les voies

respiratoires, digestives et les organes reproductifs (voir Figure 2).

Figure 2 : Expression des mucines chez l’homme (reproduit de la référence [7])

8

La classification des mucines repose sur leurs caractéristiques structurelles et sur leurs rôles

biologiques. Cette classification permet de différencier les mucines sécrétées et les mucines

ancrées dans la membrane. Les mucines sécrétées sont subdivisées en fonction de leurs

propriétés de former un gel au contact des sécrétions liquidiennes (voir Tableau 1).

Tableau 1

Classification des mucines chez l’homme (d’après [7])*:

Mucines Membranaires

Mucines sécrétées formant un gel

Mucines sécrétées ne formant pas de gel

MUC1 MUC2 MUC7

MUC3 MUC5AC MUC8

MUC4 MUC5B MUC9

MUC12 MUC6 MUC19

MUC13

MUC14

MUC15

MUC16

MUC17

MUC20

*MUC11 est non classable.

Les mucines membranaires possèdent un domaine transmembranaire permettant l’ancrage

dans la membrane cellulaire où ces molécules participent aux mécanismes d’adhésion

cellulaire, à la reconnaissance des pathogènes et à la transmission de signaux vers le domaine

intracellulaire [8]. Les mucines membranaires peuvent être clivées par protéolyse et être

sécrétées dans la lumière bronchique ou synthétisées sous forme sécrétée du fait d’un épissage

9

différentiel [9]; Cependant la contribution de ces mucines à la formation du gel de mucus et à

sa viscosité semble peu importante.

Les mucines sécrétées sont de structure proche de celle des mucines membranaires mais ne

possèdent pas de domaine d’ancrage transmembranaire. Les mucines sécrétées sont d’abord

synthétisées et stockées sous la forme de granules intracytoplasmiques où les molécules de

mucines existent sous une forme condensée et déshydratée. La sécrétion des granules de

mucines préformés vers l’extérieur de la cellule est un mécanisme actif (exocytose) en

réponse à une stimulation extra-cellulaire [10]. Lors de leur sécrétion, les mucines vont être

hydratées et augmenter de taille d’environ 1000 fois au contact des sécrétions liquidiennes

[11]. Certaines de ces mucines sécrétées ont la propriété de former un gel au contact des

sécrétions liquidiennes. Ces mucines sécrétées formant un gel contiennent des domaines

riches en cystéines qui peuvent s’associer au sein d’une même molécule de mucine ou entre

des molécules différentes, ce qui explique la polymérisation des molécules des mucines et la

formation d’un réseau moléculaire. Les mucines sécrétées formant un gel contribuent de façon

majeure aux caractéristiques viscoélastiques et rhéologiques du mucus [8]. Afin de simplifier

la nomenclature utilisée dans cette thèse, nous utilisons le terme « mucine » pour qualifier les

mucines sécrétées ayant la capacité de former un gel.

Chez l’homme, les mucines sécrétées dans les voies aériennes inférieures sont synthétisées

par les cellules productrices de mucines (ou cellules caliciformes) de l’épithélium des voies

aériennes de conduction et par les cellules à mucus des glandes bronchiques qui sont situées

dans la sous-muqueuse (Figure 3).

10

Figure 3

Identification des mucines sécrétées dans l’épithélium et les glandes bronchiques des

voies aériennes humaines.

Une coloration par le bleu d’Alcian/PAS a mis en évidence les glycoprotéines de mucines sur

les tissus bronchiques obtenus chirurgicalement chez un sujet non-fumeur. A gauche, l’étude

de l’épithélium à fort grossissement montre la présence de quelques cellules caliciformes,

(identifiées par des flèches). A droite, à plus faible grossissement, les glandes sous-

muqueuses bronchiques (têtes de flèches) contiennent des cellules productrices de mucines

(colorées en bleu) et des cellules séreuses (non colorées). Les barres horizontales représentent

50 µm.

11

Douze gènes de mucines sont exprimés dans les voies aériennes : MUC1-4, MUC5AC,

MUC5B, MUC7-8, MUC11, MUC13, MUC20 et plus récemment MUC19 [4]. Parmi ces

mucines, les mucines sécrétées pouvant contribuer à la formation d’un gel sont MUC2,

MUC5AC et MUC5B [4], mais les principales mucines formant le gel de mucus semblent être

MUC5AC et MUC5B [8]. En effet, l’ARNm de MUC2 est mis en évidence dans les voies

respiratoires hautes [12] et basses [13][14] ; cependant la protéine MUC2 n’a jamais pu être

isolée de façon convaincante dans les sécrétions respiratoires humaines [15][16]. La mucine

MUC5AC est, au moins quantitativement, la principale mucine sécrétée dans les voies

respiratoires humaines [15][17]. MUC5B est également retrouvée en grande quantité dans les

sécrétions respiratoires humaines [18]. Plusieurs études ont suggéré une ségrégation de ces

deux mucines dans des types cellulaires différents avec une expression exclusive de

MUC5AC par l’épithélium respiratoire [19][20] et une expression de MUC5B par les glandes

sous-muqueuses [20][21].

1.2 Hypersécrétion de mucus et mucines en pathologie respiratoire.

1.2.1 Manifestations cliniques de l’hypersécrétion de mucus

Au cours de nombreuses maladies respiratoires (asthme, bronchopneumopathie chronique

obstructive, mucoviscidose), une quantité excessive de mucus est produite et sécrétée [22].

Les manifestations cliniques de l’hypersécrétion sont variables en fonction de la localisation

anatomique du mucus. Dans les voies aériennes proximales (bronches cartilagineuses), les

mucines sont sécrétées par l’épithélium et les glandes bronchiques. Les canaux excréteurs des

glandes bronchiques sont situés à proximité des récepteurs de la toux [23]. De ce fait, l’

hypersécrétion de mucines à ce niveau, à partir d’une hyperplasie des cellules caliciformes

et/ou des glandes bronchiques, est probablement responsable d’une symptomatologie

associant une toux et une expectoration. Dans les petites voies aériennes, qui ne contiennent

12

pas de glandes bronchiques ni de récepteurs de toux, les mucines sont sécrétées par

l’épithélium ; la sécrétion de mucines à ce niveau ne provoquerait pas de toux. Par contre, du

fait de la petite taille de ces voies aériennes, la sécrétion de mucines peut entraîner

l’obstruction complète des bronchioles par des bouchons de mucus. Chez le sujet normal, les

bronchioles contribuent peu à la résistance totale des voies aériennes [24], et les modèles

expérimentaux prédisent qu’il faut une obstruction de plus de 75% des bronchioles avant que

des modifications de la fonction respiratoire ne soient détectables par les épreuves

fonctionnelles respiratoires de routine [25]. L’obstruction des petites voies aériennes par des

bouchons de mucus pourrait donc survenir sans provoquer de symptômes cliniques jusqu'à un

stade avancé.

1.2.2 Conséquences de l’hypersécrétion de mucus dans l’asthme.

L’obstruction bronchiolaire par des bouchons de mucus et l’hyperplasie des cellules

caliciformes de l’épithélium bronchiolaire sont décrites depuis longtemps chez les patients

décédés d’asthme aigu grave [26][27][28]. Kuyper et coll. ont récemment analysé les

bronchioles sur une cohorte historique de 93 patients décédés d’asthme aigu grave et conclu

que l’occlusion des petites voies aériennes par des bouchons de mucus était retrouvée chez

quasiment tous les patients décédés d’asthme [29]. Il est probable que l’occlusion extensive

des petites voies aériennes par les bouchons de mucus a provoqué une insuffisance

ventilatoire aiguë conduisant à l’asphyxie et au décès.

Chez les patients ayant un asthme chronique modéré, l’hyperplasie des cellules à mucus dans

l’épithélium des bronches proximales est retrouvée par l’étude des biopsies bronchiques

[17][28][30]. La sécrétion de mucus dans les bronches proximales pourrait contribuer à la

toux fréquemment retrouvée chez les patients asthmatiques. Il est également possible que

l’occlusion bronchiolaire par des bouchons de mucus joue un rôle dans l’apparition d’un

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trouble ventilatoire obstructif chronique chez certains patients asthmatiques. Cette question

reste en suspens car les prélèvements pulmonaires contenant des bronchioles sont difficiles à

obtenir chez les patients ayant un asthme chronique.

Figure 4 : Hypersécrétion de mucus chez un patient décédé d’asthme aigu grave

Légende : Coupe histologique de poumons prélevés lors d’une nécropsie chez un patient

décédé d’asthme aigu grave. A faible grossissement (A), la coloration par le bleu

d’Alcian/PAS (violet) identifie des glycoprotéines de mucines dans les glandes sous-

muqueuses (Gland) et leur canal excréteur (Duct) ainsi que dans l’épithélium de surface

(Epith.). Un bouchon de mucus (plug) obstrue la lumière de cette bronche proximale. A plus

fort grossissement (B), on visualise l’hyperplasie des cellules caliciformes (« goblet cells »,

G.C.) dans l’épithélium. Le mucus contenu par ces cellules caliciformes est en continuité avec

le mucus sécrété dans la lumière bronchique. Les barres représentent 50µm. Photographie

reproduite de la référence [31].

14

1.2.3 Conséquences de l’hypersécrétion de mucus dans la bronchopneumopathie

chronique obstructive (BPCO).

L’effet de la présence d’une toux et d’une expectoration chronique, des manifestations

probablement liées à l’hypersécrétion de mucus dans les voies aériennes proximales, sur

l’évolution de la BPCO a fait l’objet de nombreuses études. Les études initiales débutées dans

les années 1960 au Royaume Uni avaient conclu à l’absence de relation entre la présence

d’une toux et d’une expectoration chronique et la mortalité chez les patients atteints de BPCO

[32]. Les auteurs avaient suggéré que l’hypersécrétion de mucus soit un élément mineur dans

la physiopathologie de la BPCO [32]. Cette conclusion a été reconsidérée sur deux arguments.

Premièrement, Vestbo et coll. ont montré que la présence d’une toux et d’une expectoration

chronique était associée à une décroissance plus rapide du VEMS, à une augmentation du

risque de pneumopathies et de décès par infection pulmonaire chez les patients atteints de

BPCO [33]. Deuxièmement, Hogg et coll. ont récemment montré que la présence de

bouchons de mucus dans les bronchioles des patients atteints de BPCO était associée à la

baisse du VEMS [25]. Saetta et coll. ont montré une hyperplasie des cellules caliciformes

dans les bronchioles des sujets atteints de BPCO [34]. Ces données suggèrent que

l’hypersécrétion de mucus contribue à la progression de la maladie (dégradation de la fonction

respiratoire) et à la survenue de complications infectieuses.

1.2.4 Conséquences de l’hypersécrétion de mucus dans la mucoviscidose et les dilatations

des bronches.

La mucoviscidose et les dilatations des bronches sont caractérisées par la présence d’une toux

et d’une expectoration chronique. L’hyperplasie des cellules productrices de mucines est

présente dans les voies aériennes proximales [35] et dans les bronchioles [36]. Les mucines

sécrétées participent à l’obstruction bronchiolaire par les bouchons de mucus et

15

contribueraient ainsi à la dégradation de la fonction respiratoire chez les patients atteints de

mucoviscidose [36]. Les bouchons de mucus présent dans les voies aériennes pourraient

également avoir un rôle majeur dans la persistance de l’infection bactérienne. Worlitzsch et

coll. ont montré par immunohistochimie que Pseudomonas aeruginosa, la principale bactérie

responsable d’infection bronchique chronique dans la mucoviscidose, était localisée dans les

bouchons de mucus à distance de l’épithélium [37]. Ces auteurs ont montré que le

microenvironnement hypoxique des bouchons de mucus favorisait la croissance de la bactérie

et le développement d’un phénotype bactérien muqueux contribuant à la résistance aux

antibiotiques [37].

1.3. Traitement de l’hypersécrétion de mucus : de nouvelles molécules sont nécessaires.

Nous avons montré précédemment que l’hypersécrétion de mucus pourrait contribuer de

façon majeure à l’aggravation des maladies respiratoires chroniques des voies aériennes de

conduction (asthme chronique, BPCO, mucoviscidose) et à la mortalité dans certaines

situations aiguës (asthme aigu grave) [31]. L’idée d’utiliser des thérapeutiques visant à

diminuer la synthèse et/ou la sécrétion des mucines pour prévenir l’obstruction des voies

aériennes par les bouchons de mucus est donc séduisante. Cette stratégie n’est pas

consensuelle car le mucus est un élément important de l’immunité innée [38]. La suppression

complète du mucus des voies respiratoires pourrait donc avoir pour conséquence une

réduction de la défense muqueuse vis à vis des agents irritants et des pathogènes inhalés [38].

Cette situation est jusqu’à présent théorique car aucun traitement disponible ne permet de

diminuer sensiblement l’hypersécrétion de mucus en pathologie humaine. La réponse à cette

interrogation légitime ne pourra être apportée que par la réalisation d’essais thérapeutiques

avec des molécules réduisant efficacement la synthèse et/ou la sécrétion de mucus.

16

Certaines thérapeutiques utilisées dans le traitement des pathologies respiratoires associées à

une hypersécrétion de mucus sont réputées avoir des effets sur la synthèse et/ou la sécrétion

de mucus. Parmi ces thérapeutiques, les corticoïdes sont utilisés pour le traitement de

l’asthme et de la BPCO pour leurs effets anti-inflammatoires variés, mais leurs effets sur la

synthèse de mucines sont controversés [39]. Les données disponibles in vitro montrent que la

dexaméthasone, un glucocorticoïde, diminue l’expression de l’ARNm de la mucine MUC5AC

sur des cultures de cellules épithéliales tumorales [40] et non tumorales des voies aériennes

[41]. Cet effet de la dexaméthasone serait lié à une action du récepteur des glucocorticoïdes

(activé par la liaison à la dexaméthasone) sur deux sites GRE situés en cis du promoteur du

gène MUC5AC [41]. Cependant, l’effet de la dexaméthasone sur la transcription des gènes de

mucines ne s’accompagne pas d’une diminution de la synthèse de protéines de mucines dans

un modèle de culture de cellules épithéliales de rat [42]. Les résultats des études animales sur

des modèles murins sont difficiles à interpréter car les corticoïdes peuvent réduire

l’hypersécrétion de mucus ou rester sans effet en fonction des protocoles de traitement

utilisés, des stimuli utilisés et du fonds génétique des souris [43][44][45]. L’effet des

glucocorticoïdes sur la synthèse de mucine est donc très incertain. En particulier, l’effet des

traitements corticoïdes inhalés, qui sont couramment utilisés dans le traitement de l’asthme et

de la BPCO, sur la synthèse de mucines n’a jamais été testé de façon satisfaisante en étude

clinique humaine. Cette constatation est à l’origine de notre étude présentée plus loin sur

l’effet des corticoïdes intranasaux sur l’expression des mucines dans l’épithélium des polypes

naso-sinusiens [3].

Les autres thérapeutiques couramment utilisées pour le traitement des pathologies

bronchiques chroniques (anticholinergiques, β2-agonistes, méthylxanthines) n’ont pas d’effets

cliniques prouvés sur l’hypersécrétion de mucus [46]. Les traitements dit mucolytiques (N-

acétylcystéine et dérivés), utilisés pour leurs propriétés à fluidifier les sécrétions bronchiques

17

et éventuellement antioxydantes n’ont pas d’effet majeur démontré sur la synthèse et la

sécrétion de mucines dans les voies aériennes humaines. Certaines thérapeutiques comme la

rhDNAse recombinante et les aérosols de sérum salé (NaCl hypertonique) ont été proposés

dans la mucoviscidose pour améliorer la clairance muco-ciliaire [47]. Leurs effets sur la

synthèse et la sécrétion de mucines chez les patients atteints de mucoviscidose n’ont jamais

été étudiés.

L’absence de molécule disponible ciblant spécifiquement l’hypersécrétion de mucus en

thérapeutique humaine justifie les recherches menées depuis une quinzaine d’années pour

identifier les mécanismes moléculaires conduisant à la synthèse et à la sécrétion des mucines.

L’objectif de ces recherches est d’identifier les étapes conduisant à la production et à la

sécrétion des mucines afin de développer des thérapeutiques innovantes ciblant sélectivement

ces étapes. Les mécanismes identifiés par ces recherches sont décrits à la section suivante.

2. Mécanismes de la synthèse et de la sécrétion des mucines.

L’hypersécrétion de mucines comporte deux mécanismes distincts : la synthèse et la sécrétion

de mucines. La régulation de ces deux événements n’est pas forcément coordonnée :

l’augmentation de la synthèse de mucines sous l’effet d’un stimulus n’est pas toujours

associée à une augmentation de la sécrétion des mucines [8]. La synthèse de mucines

nécessite une succession d’étapes comportant la transcription d’un gène MUC en ARNm sous

l’effet de facteurs de transcription activés, puis la synthèse d’une protéine MUC à partir de cet

ARNm et sa modification post-traductionnelle sous l’effet de glycosyltransférases (GT) dans

l’appareil de Golgi. Une fois synthétisées, les mucines matures (glycosylées) sont stockées

dans les granules intracytoplasmiques des cellules productrices de mucines. La sécrétion des

mucines stockées fait intervenir des mécanismes d’exocytose en réponse à une stimulation

18

extracellulaire par un secrétagogue. Ces mécanismes sont illustrés par le schéma ci-dessous

(reproduit de la référence [4]).

Figure 5 : Synthèse et sécrétion de mucine par une cellule caliciforme.

2.1 Mécanismes de la sécrétion des mucines.

La sécrétion de mucines est un mécanisme actif d’exocytose des vésicules cytoplasmiques qui

contiennent des mucines préformées et condensées sous une forme déshydratée. La sécrétion

des mucines préformées implique la liaison d’un stimulus à son récepteur membranaire,

déclenchant la fusion des vésicules intracellulaires avec la membrane cellulaire et la sécrétion

des mucines dans la lumière bronchique. Les mécanismes moléculaires conduisant à la fusion

19

des vésicules intracellulaires avec la membrane cellulaire et à la sécrétion des mucines ont été

décrits dans une revue récente [8]. Parmi les stimuli pouvant déclencher la sécrétion des

mucines (appelés « secrétagogues ») on retiendra les neurotransmetteurs et les neuropeptides

(substance P, vaso-intestinal peptide (VIP), les stimulations adrénergiques et cholinergiques,

le calcitonin gene-related peptide (CGRP)), les protéases des mastocytes (chymase) et des

neutrophiles (sérines protéases : élastase, protéinase 3, cathepsine G), les produits bactériens

(élastase de Pseudomonas aeruginosa, alginate, rhamnolipides), les médiateurs

inflammatoires (leucotriènes cystéinés, prostaglandines, histamine, platelet activating factor,

ATP, UTP, les radicaux libres oxygénés) [22]. Les plus puissants stimuli de la sécrétion de

mucines sont les protéases, en particulier les sérines protéases des polynucléaires neutrophiles

[48]. Plusieurs études ont montré que le contact direct entre les polynucléaires neutrophiles

recrutés dans les voies aériennes lors des processus inflammatoires et les cellules caliciformes

de l’épithélium pouvait déclencher la sécrétion des mucines par l’intermédiaire de l’élastase

ancrée dans la membrane du polynucléaire neutrophile [49][50].

2.2 Régulation de la synthèse des mucines.

L’étude de la régulation de la synthèse de mucines a débuté dans les années 1990, après le

clonage des gènes de mucines exprimées dans les voies respiratoires [51][52]. Les études

successives ont montré que de nombreux stimuli retrouvés dans les voies aériennes dans les

maladies bronchiques chroniques associées à une hypersécrétion de mucus (asthme, BPCO,

mucoviscidose) augmentaient la synthèse des mucines par les cellules épithéliales des voies

aériennes in vitro et chez l’animal. Ainsi, la stimulation allergénique [53], les cytokines Th2

[54][55][56][57][58], les virus [59], les facteurs de virulences des bactéries à gram+ et à

gram- [13][14], l’ozone [60], la fumée de cigarette [61], l’acroléine (un composant de la

fumée de cigarette) [62], le platelet activating factor (PAF) [63], le tumor necrosis factor-

20

alpha (TNF-α) [64] et l’élastase du polynucléaire neutrophile [65] ont la propriété de stimuler

la transcription des gènes de mucines et/ou la production des protéines de mucines. Cependant

les mécanismes moléculaires conduisant à une augmentation de la synthèse de mucines en

réponse à ces stimuli sont restés longtemps inconnus. En 1998, Li et coll. ont pour la première

fois décrit le mécanisme intracellulaire responsable de la synthèse des mucines en réponse à la

stimulation de cellules épithéliales des voies aériennes par les facteurs de virulence de

Pseudomonas aeruginosa, une bactérie à gram- infectant fréquemment les patients

mucoviscidosiques [12]. Ces auteurs ont montré que le surnageant de culture de Pseudomonas

aeruginosa entraînait l’activation d’une voie de signalisation Src-Ras-MAPK-pp90rsk

conduisant à l’activation du facteur de transcription NF-kappaB et à la synthèse de mucine

[66]. Dans cette étude, les récepteurs extracellulaires responsable de la reconnaissance des

facteurs de virulence bactériens et de la transduction du signal intracellulaire n’étaient pas

identifiés. En 1999, Takeyama et coll. ont montré que l’activation du récepteur de l’epidermal

growth factor (EGF), un récepteur membranaire, par ses ligands induisait la synthèse de

mucine dans une lignée de cellules épithéliales tumorales des voies aériennes en culture [67].

Ces auteurs ont également montré que des inhibiteurs sélectifs de la tyrosine kinase du

récepteur de l’EGF abolissaient l’induction de l’hyperplasie des cellules caliciformes

provoquée par une stimulation allergénique dans l’épithélium de trachéal de rat in vivo [67].

Par la suite de nombreuses études ont démontré le rôle central de l’activation du récepteur de

l’EGF dans la synthèse de mucines en réponse à des stimuli divers dans les modèles

expérimentaux (cultures de cellules épithéliales tumorales in vitro et modèles animaux) (pour

une revue récente, voir [68]). De ce fait la section suivante est consacrée à la biologie du

récepteur de l’EGF et aux effets de l’activation de ce récepteur sur l’épithélium des voies

aériennes.

21

3. Rôles du récepteur de l’EGF en pathologie pulmonaire.

3.1 Récepteurs et ligands de la famille des récepteurs de l’EGF.

La famille des récepteurs à activité tyrosine kinase HER (human epidermal growth factor

receptor) est constituée de quatre récepteurs : REGF/HER1, HER2, HER3 et HER4. Le

récepteur de l’EGF (REGF ou HER1) est le chef de file de cette famille. C’est une protéine de

membrane de 170 kDa comportant trois domaines : Le domaine extracellulaire contient le site

de fixation des ligands ; le domaine transmembranaire permet l’ancrage du récepteur dans la

membrane cellulaire ; le domaine intracellulaire possède une activité enzymatique tyrosine

kinase. Six ligands du récepteur de l’EGF sont décrits : l’EGF, le transforming growth factor

alpha (TGF-α), l’heparin-binding (HB)-EGF, l’amphiréguline, la bétacelluline et l’épiréguline

[69]. Ces ligands sont synthétisés sous la forme de proligands, ancrés dans la membrane

cellulaire et de faible affinité pour le récepteur. Le clivage protéolytique des proligands par

des enzymes (métalloprotéases) libère le ligand fonctionnel de haute affinité avec le récepteur

[70].

Dans leur forme inactive, les récepteurs de la famille HER sont sous la forme de monomères.

La fixation d’un ligand soluble sur le domaine extracellulaire de son récepteur provoque le

rapprochement de deux récepteurs, conduisant à la formation de dimères. Ces dimères sont

des homodimères quand les deux récepteurs sont identiques (par exemple, EGFR-EGFR) ou

des hétérodimères quand les deux récepteurs sont différents (par exemple, EGFR-HER2). La

dimérisation des récepteurs conduit à l’activation de l’enzyme (tyrosine kinase) située dans le

domaine intracellulaire des récepteurs et à la phosphorylation de résidus tyrosines

intracellulaires. Ce processus déclenche l’activation de nombreux mécanismes intracellulaires

conduisant à des synthèses protéiques et aux effets biologiques. La diversité des ligands et les

différentes possibilités de dimérisation des récepteurs seraient responsables de la diversité des

réponses biologiques liées à l’activation de ces récepteurs.

22

3.2 Rôles du récepteur de l’EGF dans la synthèse de mucines et la réparation épithéliale

dans les voies aériennes.

En 1999, la co-expression des gènes de mucines et du récepteur de l’EGF dans les

tumeurs bronchiques primitives a suggéré la possibilité de l’implication du récepteur de

l’EGF dans la synthèse des mucines. Takeyama et coll. ont démontré in vitro que le traitement

des cellules épithéliales bronchiques tumorales NCI-H292 par des ligands du récepteur de

l’EGF induisait la synthèse des glycoprotéines de mucines, en particulier de la mucine

MUC5AC [67]. L’administration préalable d’un antagoniste sélectif de la tyrosine kinase du

récepteur de l’EGF empêchait la synthèse de mucines dans ce modèle. Ces données

montraient que l’activation du récepteur de l’EGF suffisait à provoquer la synthèse de

mucines et suggéraient qu’elle puisse jouer un rôle dans l’hypersécrétion de mucus en

pathologie humaine. Les études successives ont montré que l’activation du récepteur de

l’EGF contrôle l’hypersécrétion de mucus provoquée par tous les stimuli classiques de

l’hypersécrétion bronchique (fumée de cigarette, bactéries et leurs composants, protéases,

stimulation antigénique à l’ovalbumine…). La voie du récepteur de l’EGF apparaît donc

comme le mécanisme final commun conduisant à la synthèse de mucines en réponse aux

agressions épithéliales [68]. Les mécanismes par lesquels ces stimuli variés convergent vers

l’activation du récepteur de l’EGF ont été identifiés in vitro [68]. L’activation du récepteur de

l’EGF nécessite la fixation de l’un de ses ligands dans le domaine extra-cellulaire. Les

sources potentielles de ligands nécessaires à l’activation du récepteur de l’EGF dans les voies

aériennes sont :

• Les cellules inflammatoires recrutées dans les voies aériennes : les mastocytes ,

les monocytes, les polynucléaires éosinophiles [71] et neutrophiles [72]

sécrètent des ligands solubles (actifs) du récepteur de l’EGF.

23

• Les cellules épithéliales des voies aériennes de patients asthmatiques

expriment les proligands du récepteur de l’EGF [73] qui sont peu actifs Les

stimuli qui induisent la synthèse de mucines provoquent le clivage de ces

proligands par l’activation de métalloprotéases membranaires

(métalloprotéases du groupe ADAM et/ou gélatinase B/MMP-9) ou par le

recrutement de cellules inflammatoires qui libèrent des enzymes protéolytiques

(élastase du polynucléaire neutrophile, par exemple). Le clivage enzymatique

des proligands libère le ligand soluble (actif) qui se fixe dans le domaine

extracellulaire du récepteur de l’EGF à la surface des cellules épithéliales.

L’activation du récepteur par son ligand provoque l’autophosphorylation des

résidus tyrosines dans le domaine intracellulaire et active des voies de

signalisation intracellulaire. Ainsi, la phosphorylation du domaine

intracellulaire de l’EGF provoque l’activation de la voie des p44/42 MAP

kinases et du facteur de transcription Sp1 puis la transcription des gènes de

mucines et la synthèse de protéines de mucines (Figure 6)[74].

24

Figure 6 : Mécanismes d’activation du récepteur de l’EGF conduisant à la synthèse de

mucines dans l’épithélium respiratoire en culture.

Légende : L’agression de l’épithélium respiratoire par des stimuli toxiques (produits

bactériens, fumée de cigarette…) provoque l’activation de métalloprotéases membranaires

(par exemple, la tumor necrosis alpha-converting enzyme, TACE). Ces enzymes clivent les

proligands (inactifs) du récepteur de l’EGF à la surface de l’épithélium respiratoire et libèrent

ainsi les ligands solubles (actifs). La fixation d’un ligand soluble dans le domaine

extracellulaire du récepteur de l’EGF provoque la phosphorylation (P) de résidus tyrosine

dans le domaine intracellulaire de ce récepteur par sa tyrosine kinase. La phosphorylation du

récepteur de l’EGF conduit à la mise en action de voies de signalisation intracellulaire et à la

transcription des gènes de mucines. Les protéines de mucines sont alors synthétisées et

stockées dans des granules cytoplasmiques jusqu’à ce qu’une stimulation extracellulaire

déclenche leur sécrétion.

25

Le récepteur de l’EGF est un acteur central du développement des épithéliums chez

l’embryon et les souris invalidées pour le récepteur de l’EGF ne sont pas viables. Le rôle du

récepteur de l’EGF dans la réparation épithéliale a également été montré. Chez l’animal,

l’agression de l’épithélium respiratoire (instillation de microbilles d’agarose dans la trachée

ou l'inhalation de naphtalène) provoque l’expression du récepteur de l’EGF et de ses

principaux ligands dans l’épithélium respiratoire, suggérant un rôle dans la réparation

épithéliale [75][76][77]. Les cultures de cellules épithéliales bronchiques ont permis de tester

le rôle de l’activation du récepteur de l’EGF dans la fermeture de blessures mécaniques de

l’épithélium des voies aériennes. La réalisation d’une blessure mécanique de l’épithélium

provoque l’expression du récepteur de l’EGF sur les berges de la blessure [78]. L’activation

de ce récepteur conduit à la migration de cellules des berges de la blessure vers la zone

blessée, permettant un comblement rapide de la perte de substance sans prolifération cellulaire

dans le cas d’une blessure de petite taille. L’activation du récepteur de l’EGF peut se faire en

l’absence d’apport exogène de ligands, suggérant un mécanisme autocrine (activation du

récepteur par des ligands produits par les cellules épithéliales) et l’apport exogène d’EGF

accélère le processus de réparation épithéliale [78]. In vivo, chez le mouton, la reconstitution

de l’épithélium bronchique après sa destruction dans un modèle d’inhalation de fumée

(vapeurs toxiques de combustion du coton) est accélérée par l’inhalation d’un mélange de

facteurs de croissance contenant de l’EGF [79]. Ces données suggèrent que l’administration

d’EGF recombinant puisse favoriser la réparation épithéliale chez l’homme; l’administration

d’un traitement bloquant l’activation du récepteur de l’EGF pourrait théoriquement diminuer

l’efficacité de la réparation de l’épithélium respiratoire en réponse à des agressions.

Nous avons récemment effectué une revue extensive de la littérature sur les rôles de

l’expression et de l’activation du récepteur de l’EGF dans la synthèse de mucines en réponse

26

à des stimuli variés et dans la réparation de l’épithélium respiratoire endommagé [68]. Cet

article de revue est inséré à la page suivante.

27

3.3 Autres rôles du récepteur de l’EGF en pathologie pulmonaire humaine.

3.3.1 Rôles du récepteur de l’EGF dans les cancers broncho-pulmonaires.

L’activation du HER1/REGF par ses ligands provoque des cascades de mécanismes

intracellulaires impliquées dans des phénomènes biologiques multiples et d’une importance

fondamentale dans la cancérogenèse. Ainsi l’activation du HER1/REGF favorise la

différenciation et la prolifération cellulaire, la résistance à l’apoptose, stimule l’angiogénèse et

provoque l’augmentation du pouvoir métastatique des tumeurs [80]. La surexpression du

récepteur de l’EGF dans différentes tumeurs solides a été corrélé à la progression tumorale, à

un pronostic défavorable et à l’apparition d’une résistance à la chimiothérapie. Les principaux

cancers surexprimant le récepteur de l’EGF sont le cancer bronchique non à petites cellules,

les cancers mammaires, ovariens, colorectaux, prostatiques, gastriques et ORL. Les

inhibiteurs de la tyrosine kinase du récepteur de l’EGF administrés par voie orale sont utilisés

dans le traitement du cancer bronchique non à petites cellules avec une efficacité antitumorale

dans certains sous-groupes de patients [81].

3.3.2 Rôle du récepteur de l’EGF dans la prolifération des fibroblastes et la fibrose

pulmonaire

L’activation du récepteur de l’EGF par ses ligands jouerait également un rôle important dans

la survenue d’une fibrose pulmonaire. Ainsi le stress oxydatif provoqué par le traitement de

cellules épithéliales bronchiques humaines par des sels de métaux (Vanadium) provoque la

synthèse d’heparin binding (HB)-EGF [82]. Ce ligand du récepteur de l’EGF induit la

prolifération des myofibroblastes et le dépôt de collagène in vitro, suggérant une voie de

signalisation paracrine entre cellules épithéliales et myofibroblastes impliquant le récepteur de

l’EGF. Cette hypothèse a été récemment confirmée puisque l’expression transgénique

inductible de TGF-α, un autre ligand du récepteur de l’EGF, dans l’épithélium bronchique de

28

souris adultes conduit à l’apparition de dépôts de collagène et au développement d’une fibrose

pulmonaire [83]. Les implications thérapeutiques de ces études récentes pour le traitement des

fibroses pulmonaires restent encore incertaines.

3.4 Cibler l’hypersécrétion de mucus avec des antagonistes du récepteur de l’EGF en

étude clinique humaine.

L’hypersécrétion de mucus contribue à la morbidité et à la mortalité de nombreuses maladies

respiratoires chroniques (voir plus haut), suggérant l’intérêt de disposer de thérapeutiques

pour cibler l’hypersécrétion de mucus dans ces pathologies [38]. Le rôle central joué par

l’activation du récepteur de l’EGF dans la synthèse de mucines en réponse à des stimuli variés

[68] dans les modèles in vitro et chez l’animal suggère l’intérêt d’utiliser des antagonistes du

récepteur de l’EGF pour diminuer l’hypersécrétion bronchique de mucus dans ces

pathologies.

L’inhibition des voies d’activation et de signalisation de la famille des récepteurs HER fait

l’objet d’intenses recherches [81][84][85]. Les molécules visant à prévenir l’activation du

récepteur de l’EGF appartiennent principalement à deux catégories:

• Les inhibiteurs de tyrosine kinase : ce sont de petites molécules qui bloquent l’action

des tyrosines kinases intracellulaires. Leur effet se traduit par un blocage des voies de

signalisations intracellulaires contrôlées par les récepteurs HER. Parmi ces molécules

on trouve, le gefitinib (IRESSA) et l’erlotinib (TARCEVA), utilisées en particulier

dans le cancer bronchique non à petites cellules.

• Les anticorps monoclonaux : ces anticorps reconnaissent spécifiquement des sites

antigéniques situés dans le domaine extracellulaire des récepteurs HER et empêchent

la liaison du ligand et/ou l’activation du récepteur. Parmi les molécules dont le

développement est le plus avancé on trouve le cetuximab (C225, ERBITUX).

29

Compte tenu des rôles joués par le récepteur de l’EGF dans la croissance et la réparation

épithéliale dans différents organes, l’utilisation de molécules inhibant l’activation de ce

récepteur pourrait paraître risquée. En fait, les inhibiteurs de la tyrosine kinase du récepteur de

l’EGF et les anticorps monoclonaux ciblant ce récepteur sont utilisés dans le traitement du

cancer bronchique non à petites cellules avec des effets secondaires modérés [84][85]. Les

effets secondaires de ces traitements sont principalement la survenue d’une éruption cutanée

acnéiforme et de troubles digestifs (diarrhées). Un faible pourcentage de patients (0,88%)

traité avec le gefitinib ont développé une pneumopathie interstitielle. Cette complication a été

décrite avec une fréquence plus élevée chez les patients japonais (1,9%) que chez les patients

traités aux Etats Unis (0,34%), suggérant une prédisposition génétique, et chez les patients

ayant une fibrose pulmonaire préexistante [86]. Le profil de toxicité des antagonistes du

récepteur de l’EGF rend théoriquement possible l’utilisation de ces traitements ou de leurs

dérivés administrés directement dans les voies aériennes pour le traitement de

l’hypersécrétion bronchique. Cependant ces molécules n’ont pour l’instant pas reçu

d’autorisation d’utilisation dans les pathologies non néoplasiques. De ce fait, il est impossible

de tester en essai clinique humain l’hypothèse que l’hyperplasie des cellules à mucus présente

dans l’épithélium respiratoire des pathologies bronchiques chroniques (asthme, BPCO,

mucoviscidose, dilatation des bronches) est liée à l’activation du récepteur de l’EGF.

4. Rôle des cellules inflammatoires dans la synthèse de mucines

L’association d’une hypersécrétion de mucus et du recrutement de cellules inflammatoires

(polynucléaires éosinophiles et/ou neutrophiles, macrophages) dans les pathologies

bronchiques chroniques a depuis longtemps suggéré un rôle pour les cellules inflammatoires

dans l’hypersécrétion de mucus.

30

4.1 Rôle des polynucléaires neutrophiles.

Si le rôle des protéases du polynucléaire neutrophile dans la sécrétion des granules de

mucines préformées a été montré depuis longtemps [48], leur rôle dans la production des

mucines est de reconnaissance plus récente. Breuer et coll. ont montré que l’administration

d’élastase neutrophile dans les voies aériennes de hamsters provoque la sécrétion rapide de

mucines suivie par une hyperplasie des cellules caliciformes [87][88]. Voynow et coll. ont

montré que l’élastase neutrophile stimule la synthèse du gène et de la protéine MUC5AC par

l’épithélium respiratoire in vitro [65] et chez la souris [89]. Kohri [90] et Shao [91] ont

montré que l’activité protéolytique de l’élastase était responsable de l’activation du récepteur

de l’EGF conduisant à la synthèse de mucine. Takeyama et coll. ont montré que le stress

oxydatif produit par les polynucléaires neutrophiles pouvait entraîner les mêmes effets [92].

De ce fait, le recrutement des polynucléaires neutrophiles au contact des cellules productrices

de mucines peut entraîner la sécrétion rapide de mucines suivie par la synthèse de nouvelles

glycoprotéines de mucines liée à l’activation du récepteur de l’EGF.

5.2 Rôle des polynucléaires éosinophiles.

Les polynucléaires éosinophiles recrutés dans les voies aériennes ont été suspectés de

contribuer à l’hypersécrétion de mucus dans l’asthme. En effet, l’hypersécrétion de mucus

retrouvée chez les patients décédés d’asthme aigu grave et chez les patients ayant un asthme

modéré s’accompagne du recrutement et de l’activation des polynucléaires éosinophiles au

contact de l’épithélium des voies aériennes. Cohn et coll. ont testé l’implication des

éosinophiles dans l’hypersécrétion de mucus en utilisant des souris déficientes pour l’IL-5

[93]. Ces auteurs ont trouvé que l’hyperplasie des cellules à mucus provoquée par le transfert

de lymphocytes Th2 activés dans les voies aériennes était identiques chez les souris sauvages

et chez les souris déficientes pour l’IL5 (dépourvues d’éosinophiles). Cohn et coll. ont conclu

31

que l’hypersécrétion de mucus et le recrutement des éosinophiles dans les voies aériennes

étaient deux phénomènes associés à la stimulation allergénique mais n’avaient aucune

relation.

5. Intérêt de la polypose naso-sinusienne pour l’étude de l’hypersécrétion de mucus des

voies aériennes.

Les voies respiratoires supérieures et inférieures forment un continuum partageant de

nombreuses propriétés anatomiques et histologiques et une importante fonction : le passage de

l’air vers et en dehors des poumons [94]. Les voies respiratoires supérieures et inférieures

partagent également la fonction de défense de l’organisme contre les particules et les agents

infectieux inhalés. Le nez est la porte d’entrée de l’air dans le système respiratoire et donc la

première ligne de défense contre les agents inhalés. La structure de la muqueuse nasale reflète

directement son rôle à l’interface avec le milieu extérieur. L’épithélium nasal est un

épithélium de type respiratoire cilié contenant des cellules productrices de mucines et dont les

caractéristiques morphologiques sont comparables à celles de l’épithélium des voies aériennes

inférieures. Les principaux types cellulaires représentés dans l’épithélium nasal sont les

cellules ciliées, les cellules productrices de mucines, les cellules basales et les cellules

épithéliales non-ciliées [94]. Les mucines sécrétées par l’épithélium nasal contribuent à la

formation du gel de mucus qui participe à la défense de l’épithélium contre les agents

pathogènes inhalés.

La polypose naso-sinusienne est une maladie inflammatoire chronique de la muqueuse

respiratoire nasale qui touche environ 4% de la population occidentale [95]. La polypose

naso-sinusienne peut être isolée (dite « idiopathique » ou primitive) ou entrer dans le cadre de

pathologies de l’épithélium respiratoire (mucoviscidose, dyskinésie ciliaire) ou d’une

intolérance à l’aspirine (souvent associée à un asthme et formant alors la triade de Widal). La

32

polypose naso-sinusienne primitive est caractérisée par le développement bilatéral et

multifocal de tumeurs oedémato-fibro-épithéliales, les polypes. Histologiquement, les polypes

sont décrits comme des pseudo-tumeurs œdémateuses formées de tissu conjonctif lâche et

recouverts d’épithélium. L’épithélium des polypes naso-sinusiens est un épithélium pseudo-

stratifié de type respiratoire, mais des modifications épithéliales à type de métaplasie

squameuse ou d’hyperplasie des cellules productrices de mucines ont été décrites

[96][97][98][99]. La polypose naso-sinusienne primitive est également caractérisée par la

présence de nombreuses cellules inflammatoires dans le stroma des polypes. Les

polynucléaires éosinophiles sont les cellules majoritairement retrouvées dans les polypes

naso-sinusiens [100][101].

Les mécanismes à l’origine de la croissance des polypes naso-sinusiens sont inconnus.

Bernstein et coll. ont émis l’hypothèse que la croissance des polypes soit favorisée par les

modifications structurelles et fonctionnelles de l’épithélium de l’épithélium respiratoire nasal

en réponse à l’agression épithéliale par des agents irritants ou infectieux [101]. Selon cette

théorie, les modifications épithéliales provoquées par la sécrétion de médiateurs de

l’inflammation par les cellules inflammatoires (en particulier par les polynucléaires

éosinophiles) pourraient résulter en une augmentation de l’absorption transépithéliale de

sodium et d’eau, favorisant à la formation de polypes [101]. L’étude des mécanismes de

prolifération et de différenciation de l’épithélium des polypes, qui sont largement inconnus,

semble donc importante à la compréhension des mécanismes de croissance des polypes. Coste

et coll. ont trouvé, par des techniques d’immunohistochimie et de cytométrie de flux, un index

de prolifération élevé dans l’épithélium des polypes naso-sinusiens [98][99]. Les études

anatomo-pathologiques ont montré l’existence fréquente d’une hyperplasie des cellules à

mucus dans l’épithélium des polypes [102][103], bien que cette caractéristique ne soit

unanimement acceptée [104].

33

Nous nous sommes intéressés à la polypose naso-sinusienne pour étudier les mécanismes de

la synthèse de mucine dans l’épithélium des voies aériennes pour les raisons suivantes :

- L’hyperplasie des cellules caliciformes décrite dans l’épithélium des polypes naso-

sinusiens suggérait une augmentation de la synthèse des mucines.

- La présence d’une prolifération et d’une différenciation anormale de l’épithélium des

polypes laissait envisager l’implication de facteurs de croissance dans des

modifications épithéliales.

- Les relations entre les modifications morphologiques et fonctionnelles de l’épithélium

et la sécrétion de facteurs de croissance par les polynucléaires éosinophiles ont été

suggérées [105][106] mais n’ont jamais été directement étudiées. L’association de

modifications épithéliales et d’un infiltrat inflammatoire constitué en majeure partie de

polynucléaires éosinophiles permettait d’envisager l’étude des relations éventuelles

entre l’infiltration épithéliale par les éosinophiles et la synthèse de mucine.

34

2ème partie : Travaux originaux

35

1. Stratégie générale du projet de recherche et de la thèse

Les travaux présentés dans cette thèse se sont étalés sur plusieurs années et la stratégie adoptée

est à replacer dans le contexte des connaissances en constante évolution dans le domaine étudié.

Suite à la première publication montrant le rôle de l’activation du récepteur de l’EGF dans la

synthèse de mucine sur des cellules tumorales en culture et dans un modèle de stimulation

allergénique chez le rat [67], nous avons souhaité évaluer la pertinence de ces mécanismes pour

l’hypersécrétion de mucus dans les voies aériennes humaines. Nous nous sommes alors intéressés

à la polypose naso-sinusienne en raison de la description histologique préalable d’une hyperplasie

des cellules caliciformes dans l’épithélium des polypes et de la (relative) facilité d’accès à des

prélèvements de polypes. Dans une première étude, nous avons évalué, à l’aide de techniques

d’immunohistochimie et d’hybridation in situ, l’expression du récepteur de l’EGF dans

l’épithélium des polypes naso-sinusiens et les relations entre la présence du récepteur de l’EGF et

l’expression des mucines. Cette étude a fourni les premières données humaines sur l’implication

éventuelle du récepteur de l’EGF dans la synthèse de mucines en pathologie respiratoire non

tumorale ; elle a fait l’objet d’une première publication originale [1]. A partir des résultats de

cette première étude descriptive, nous avons construit deux études in vitro pour évaluer les

hypothèses générées par notre étude sur les polypes :

- La première étude, qui utilise un modèle de culture primaire de cellules épithéliales de

polypes naso-sinusiens a eu pour buts de tester l’effet d’activateurs et d’antagonistes du récepteur

de l’EGF sur la synthèse de la mucine MUC5AC.

- La seconde étude dérivée de ces données s’est intéressée à l’effet de la stimulation de

cellules épithéliales des voies aériennes par des polynucléaires éosinophiles, isolés chez des

patients atopiques et activés in vitro, sur la synthèse de la mucine MUC5AC. Cette étude a fait

l’objet d’une seconde publication originale [2].

36

Par ces études nous avons montré que l’activation du récepteur de l’EGF par ses ligands

provoque la synthèse de mucine dans l’épithélium des polypes naso-sinusiens. Nous avons

également montré que les éosinophiles humains, qui sont présents en grand nombre dans les

polypes naso-sinusiens, pouvaient sécréter des molécules conduisant à l’activation du récepteur

de l’EGF et à la synthèse de mucine par l’épithélium respiratoire. Nous avons alors souhaité

tester la pertinence de ces résultats en étude clinique humaine. Nous avions pour ambition de

tester l’effet d’inhibiteurs de la tyrosine kinase du récepteur de l’EGF sur la synthèse de mucine

dans l’épithélium des polypes naso-sinusiens humains in vivo. Cependant ces molécules n’ont

pour le moment pas reçu d’autorisation d’utilisation dans les pathologies humaines non tumorales

et n’ont donc pas pu être utilisées. Il nous est alors apparu logique de tester l’effet des corticoïdes

intranasaux sur la synthèse de mucines par les polypes naso-sinusiens in vivo. Les rationnels pour

réaliser cette étude étaient multiples : (1) Les corticoïdes, dont l’administration par voie

intranasale est le traitement de référence de la polypose naso-sinusienne [104], sont réputés avoir

un effet sur l’hypersécrétion de mucus. Cependant aucune étude clinique humaine n’a été réalisée

dans ce domaine (voir discussion sur les thérapeutiques ciblant l’hypersécrétion). (2) L’un des

effets les mieux établis des corticoïdes est la diminution de l’inflammation à polynucléaires

éosinophiles. (3) L’effet des corticoïdes sur l’expression et l’activation du récepteur de l’EGF est

peu connu [78]. Pour ces raisons nous avons construit une étude clinique humaine testant l’effet

d’un corticoïde intranasal, la fluticasone, sur l’expression des mucines, du récepteur de l’EGF et

le recrutement des polynucléaires éosinophiles et neutrophiles chez des patients atteints de

polypose naso-sinusienne. Cette étude a fait l’objet d’une troisième publication originale [3].

Les études présentées ouvrent la voie à la réalisation d’essais cliniques avec des molécules

innovantes ciblant l’hypersécrétion de mucus dans la polypose naso-sinusienne et, à terme, dans

les autres maladies chroniques des voies aériennes associées à une hypersécrétion de mucus

37

(BPCO, mucoviscidose, asthme). Ces différentes étapes de notre thèse vont être présentées

successivement.

38

2. Rôle du récepteur de l’EGF dans la synthèse de mucine par l’épithélium des polypes

naso-sinusiens.

2.1. Expression de la mucine MUC5AC et du récepteur de l’EGF dans l’épithélium nasal

normal et dans l’épithélium des polypes naso-sinusiens.

Introduction

Nous avons réalisé cette étude juste après la publication originale décrivant l’implication du

récepteur de l’EGF dans la synthèse de mucine par l’épithélium des voies aériennes [67].

Dans cet article, Takeyama et coll. avaient montré que l’activation du récepteur de l’EGF par

ses ligands était responsable de la synthèse de mucine par l’épithélium des voies aériennes

chez le rat, suggérant l’importance de ce mécanisme dans l’hypersécrétion de mucus chez

l’homme [67]. A cette époque, les données sur l’expression du récepteur de l’EGF en

pathologie non tumorale des voies aériennes de l’adulte étaient très peu nombreuses.

Amishima et coll. avaient comparé les prélèvements pulmonaires de 7 patients asthmatiques

(3 prélèvements autopsiques de patients décédés d’asthme aigu grave et 4 patients ayant une

chirurgie thoracique pour exploration d’un nodule pulmonaire) à ceux de 8 patients décédés

sans pathologie pulmonaire connue [73]. En utilisant des techniques d’immunohistochimie,

ces auteurs avaient conclu que le récepteur de l’EGF et son ligand l’EGF étaient faiblement

présents dans l’épithélium respiratoire des sujets sans pathologie pulmonaire. Par contre, il

existait une surexpression du récepteur de l’EGF et de son ligand l’EGF dans l’épithélium des

voies aériennes de conduction des patients asthmatiques. Ces données suggéraient un rôle

pour la voie de signalisation du récepteur de l’EGF dans le remodelage de l’épithélium

bronchique [73]. Aucune donnée sur les relations entre l’expression du récepteur de l’EGF ou

de ses ligands n’était disponible.

39

De façon à tester l’hypothèse que la synthèse de mucines dans les voies aériennes humaines

était liée à une surexpression et à l’activation du récepteur de l’EGF, nous avons réalisé une

étude morphologique sur des polypes humains prélevés lors d’interventions chirurgicales afin

d’identifier les cellules et les molécules potentiellement impliquées dans la synthèse de

mucines dans l’épithélium des polypes naso-sinusiens. L’objectif de cette étude était de

générer des hypothèses sur les relations potentielles entre l’expression et d’activation du

récepteur de l’EGF et la présence de mucines dans l’épithélium. Cette étude qui à fait l’objet

d’une publication originale est présentée à la page suivante [1].

40

Principales conclusions et discussion

Dans cette étude, nous avons émis l’hypothèse que l’hyperplasie des cellules caliciformes de

l’épithélium des polypes naso-sinusiens [102][103] était liée à l’activation du récepteur de l’EGF.

Pour évaluer la pertinence de cette hypothèse nous avons recherché la présence des molécules et

des cellules potentiellement impliquées dans l’activation du récepteur de l’EGF et la synthèse de

mucines sur des prélèvements anatomo-pathologiques de patients opérés de polypose naso-

sinusienne par des techniques d’immunohistochimie et d’hybridation in situ [1]. Nous avons

d’abord confirmé que l’épithélium des polypes naso-sinusiens était le siège d’une hyperplasie des

cellules caliciformes et que la mucine MUC5AC, une mucine majeure des voies aériennes chez

l’homme, était présente dans l’épithélium nasal normal et dans l’épithélium des polypes (voir

Figures 1 et 2 [1]). Ces résultats sont en accord avec les données publiées au préalable qui

montrait l’expression de l’ARNm de MUC5AC dans les polypes naso-sinusiens [107] et dans la

muqueuse nasale normale [108]. Nous avons alors évalué l’expression du récepteur de l’EGF et

nous avons montré, pour la première fois, l’expression du gène et de la protéine du récepteur de

l’EGF dans l’épithélium des polypes et dans l’épithélium nasal normal (voir Figure 3 [1]).

Ensuite, nous avons étudié la relation entre l’expression du récepteur de l’EGF et la présence de

mucine dans l’épithélium nasal. Pour les tissus exprimant le récepteur de l’EGF,

l’immunomarquage pour ce récepteur était plus important dans l’épithélium des polypes naso-

sinusiens (qui contenait une grande quantité de mucines) que dans l’épithélium nasal normal (qui

contenait moins de mucines). Dans le groupe de polypes exprimant le récepteur de l’EGF

(REGF+), les zones d’épithélium hyperplasique contenaient plus de mucine MUC5AC et de

récepteur de l’EGF que les zones d’épithélium pseudostratifié (voir Figure 5 [1]). Ces résultats

sont compatibles avec notre hypothèse que l’activation du récepteur de l’EGF conduit à la

synthèse de la mucine MUC5AC dans l’épithélium des polypes naso-sinusiens.

Dans cette étude, 4 des 8 polypes analysés avaient des caractéristiques immunohistochimiques

compatibles avec l’implication du récepteur de l’EGF dans le développement des cellules à

41

mucus : ces polypes avaient une expression importante du récepteur de l’EGF dans les cellules

basales de l’épithélium et une hyperplasie des cellules à mucus. Les 4 autres polypes

n’exprimaient pas le récepteur de l’EGF malgré la présence importante de cellules à mucus dans

l’épithélium. Il y plusieurs explications possibles pour expliquer l’absence d’expression du

récepteur de l’EGF dans ces polypes :

(1) La production de mucines dans ces polypes pourrait être indépendante de l’activation du

récepteur de l’EGF.

(2) La disparition du récepteur de l’EGF pourrait survenir lorsque l’épithélium s’est

différencié en cellules à mucus et que les mucines n’ont pas été sécrétées (rétrocontrôle négatif).

Les expériences menées sur l’épithélium nasal de rat sont ici importantes à décrire. Lee et coll.

ont montré que l’épithélium nasal du rat maintenu en atmosphère stérile avait environ 20% de sa

surface occupée par des glycoprotéines de mucines identifiées par la coloration par le bleu

d’Alcian/PAS et pour la mucine MUC5AC en immunohistochimie [109]. Dans cet épithélium, à

l’état basal, les cellules caliciformes sont intactes, il n’y a pas de mucines secrétées à la surface

de l’épithélium, et le récepteur de l’EGF n’est pas exprimé [109]. Lorsque l’on induit l’afflux de

polynucléaires neutrophiles par administration de chimiokines, on provoque la sécrétion rapide

des mucines, suivie par l’expression du récepteur de l’EGF et la réapparition de mucines dans les

cellules épithéliales. L’administration d’un inhibiteur de la tyrosine kinase du récepteur de l’EGF

dans ce modèle ne prévient pas la sécrétion des mucines mais empêche la production de

nouvelles mucines dans l’épithélium. De ce fait, une hypothèse est que lorsque l’épithélium

contient des cellules à mucus « inactive », le récepteur de l’EGF n’est pas exprimé ; par contre

après la sécrétion de mucines en réponse au recrutement de polynucléaires neutrophiles, la

synthèse de nouvelles mucines nécessite l’expression et l’activation du récepteur de l’EGF [109].

Dans les polypes naso-sinusiens, les polynucléaires éosinophiles sont une source majeure

de ligands du récepteur de l’EGF : Elovic et coll. ont trouvé que le principal site d’expression du

42

gène et de la protéine TGF-α dans les polypes naso-sinusiens est constitué par les éosinophiles

[105]. Ces données suggèrent que les polynucléaires éosinophiles recrutés au contact de

l’épithélium des voies aériennes puissent contribuer à l’activation du récepteur de l’EGF et à la

synthèse de mucines.

En conclusion, ces données descriptives suggèrent la possibilité d’un lien causal entre

l’hyperplasie des cellules à mucus dans l’épithélium des polypes naso-sinusiens (et la synthèse de

la mucine MUC5AC) d’une part, et l’expression et l’activation du récepteur de l’EGF d’autre

part. Cette étude a ouvert la voie à d’autres études montrant un lien entre l’expression des

mucines et celle du récepteur de l’EGF dans l’épithélium des voies aériennes de patients atteints

d’asthme modéré [30], de panbronchiolite diffuse [110] ou de mucoviscidose évoluée [36].

Collectivement ces études suggèrent que les antagonistes du récepteur de l’EGF puissent être

utilisés pour cibler l’hypersécrétion de mucus dans ces différentes pathologies. Nos données

suggèrent par ailleurs que les polynucléaires éosinophiles pourraient jouer un rôle dans

l’hyperplasie épithéliale des cellules caliciformes et la synthèse de la mucine MUC5AC.

Sur la base de ces hypothèses nous avons construit deux études in vitro :

- La première étude, qui utilise un modèle de culture primaire de cellules épithéliales de

polypes naso-sinusiens a eu pour buts de tester directement l’effet d’activateurs et d’antagonistes

du récepteur de l’EGF sur la synthèse de la mucine MUC5AC.

- La seconde étude dérivée de ces données s’est intéressée à l’effet de la stimulation de

cellules épithéliales des voies aériennes par des polynucléaires éosinophiles, isolés chez des

patients atopiques et activés in vitro, sur la synthèse de la mucine MUC5AC.

43

2.2 Effets d’activateurs et d’inhibiteurs du récepteur de l’EGF sur la synthèse de mucines

dans un modèle de culture primaire de cellules épithéliales de polypes naso-sinusiens.

Objectif de l’étude

L’objectif de cette étude était d’étudier directement l’effet d’activateurs et d’antagonistes du

récepteur de l’EGF sur la synthèse de mucines dans l’épithélium des polypes naso-sinusiens.

Nous avons émis l’hypothèse que l’activation du récepteur de l’EGF provoque la synthèse de

la mucine MUC5AC par l’épithélium des polypes. Cette hypothèse repose sur les éléments

suivants:

- L’activation du récepteur de l’EGF la lignée tumorale épithéliale NCI-H292 provoque

la synthèse de la mucine MUC5AC [67].

- Nos données morphologiques montrent une hyperplasie des cellules à mucus et une

surexpression de la mucine MUC5AC dans l’épithélium des polypes naso-sinusiens

humains. Ces modifications épithéliales s’accompagnent d’une surexpression du

récepteur de l’EGF pour la moitié des polypes étudiés [1].

En l’absence de modèle animal reproduisant de façon fiable la polypose naso-sinusienne,

nous avons choisi de tester cette hypothèse sur un modèle de culture primaire de cellules

épithéliales de polypes naso-sinusiens [111].

Méthodes

Culture primaire de cellules épithéliales de polypes naso-sinusiens

Nous avons utilisé une méthode de culture primaire de cellules épithéliales de polypes naso-

sinusiens développée depuis plusieurs années dans le laboratoire de l’Unité INSERM 651

(Hôpital H. Mondor, Créteil) [112][113][114].

44

Les polypes ont été prélevés chez des patients atteints de polypose naso-sinusienne primitive,

pour lesquels une indication chirurgicale (ethmoïdectomie endonasale) a été posée dans le

service d’ORL et de chirurgie cervico-faciale du Pr A.Coste à l’Hôpital Intercommunal de

Créteil. Les polypes, étant à l’époque de la réalisation de l’étude, considérés comme des

déchets opératoires, l’autorisation du CCPPRB n’a pas été nécessaire pour la réalisation de

cette étude. Cependant, les patients ont été informés de l’utilisation de ces polypes et leur

accord a été obtenu lors de la consultation préopératoire. Les polypes des patients atteints de

mucoviscidose, de dyskinésie ciliaire primitive, de patients ayant eu des symptômes

d’infection virale ou bactérienne récente n’ont pas été retenus pour cette étude.

Après résection chirurgicale, les polypes ont été immédiatement placés à 4° C dans un milieu

composé de DMEM-Ham’s F12 (Invitrogen : Life Technologies 95613 Cergy-Pontoise,

France) supplémenté en antibiotiques : Pénicilline, Streptomycine, Fungizone (Invitrogen :

Life Technologies) et Gentamycine (Sigma, St Quentin Fallavier, France). Les polypes ont

alors été rapidement transportés au laboratoire. Le milieu a été aspiré et les polypes ont été

débarrassés du mucus et des caillots sanguins par un rinçage avec du PBS contenant du DTT

(5nM ; 1,4-Dithio-DL-Threitol, Sigma). Une digestion enzymatique a ensuite été réalisée en

incubant le polype pendant 18 heures à 4°c dans un milieu composé de DMEM-Ham’s F12,

d’antibiotiques et de pronase (0,1% ; Sigma). En fin d’incubation la pronase a été neutralisée

volume à volume avec un milieu composé de DMEM-Ham’s F12, d’antibiotiques, de sérum

de veau fœtal (5 % ; Invitrogen : GIBCO) et d’acides aminés non essentiels (Invitrogen : Life

technologies). Les cellules dissociées ont été récupérées par filtration puis centrifugation à

1500 rpm pendant 7 minutes. Le surnageant a été aspiré et le culot cellulaire a été incubé à

37°c pendant 3 minutes dans une solution de trypsine (0,25% ; Invitrogen : GIBCO) afin de

compléter la dissociation enzymatique des cellules. La trypsine a été neutralisée volume à

volume par un milieu composé de DMEM-Ham’s F12, d’antibiotiques, de sérum de veau

45

fœtal 5% et d’acides aminés non essentiels. Les cellules ont alors été centrifugées à 1500 rpm

pendant 7 minutes puis le surnageant aspiré et les cellules ont été re-suspendues dans 10 mL

de milieu composé de DMEM-Ham’s F12, d’antibiotiques, de sérum de veau fœtal 5% et

d’acides aminés non essentiels, puis comptées sur une lame de Mallassez. Pour la culture nous

avons utilisé des filtres de 1 cm2 (pores de 0,4 µm) montés dans des inserts (Transwell®

Clear, Costar®, USA), placés chacun dans un puits aménagé sur une plaque 12 puits. Chaque

filtre a été recouvert d’une couche de collagène IV (10 à 20 µg/cm2) déposée par

sédimentation au moins 24 heures avant l’ensemencement.

J0:

Ensemencement

J1:

Mise en interface air-liquide par aspiration du surnageant et lavage des

cellules avec du PBS.

Milieu de culture

changé

quotidiennement.

DMEM-Ham F12-SVF 5%

1 millions de cellules/mLCellules adhérentes au filtre

Filtre en polyester avec pores de

0,4 µm de diamètre recouvert

d’une couche de collagène IV

SVF 5% : sérum de veau fœtal à 5%

Basal

Apical

J0:

Ensemencement

J1:

Mise en interface air-liquide par aspiration du surnageant et lavage des

cellules avec du PBS.

Milieu de culture

changé

quotidiennement.

DMEM-Ham F12-SVF 5%

1 millions de cellules/mLCellules adhérentes au filtre

Filtre en polyester avec pores de

0,4 µm de diamètre recouvert

d’une couche de collagène IV

SVF 5% : sérum de veau fœtal à 5%

J0:

Ensemencement

J1:

Mise en interface air-liquide par aspiration du surnageant et lavage des

cellules avec du PBS.

Milieu de culture

changé

quotidiennement.

DMEM-Ham F12-SVF 5%

1 millions de cellules/mLCellules adhérentes au filtre

Filtre en polyester avec pores de

0,4 µm de diamètre recouvert

d’une couche de collagène IV

SVF 5% : sérum de veau fœtal à 5%

Basal

Apical

L’ensemencement a été réalisé dans chaque insert, en pipetant 1 mL de milieu contenant 106

cellules/mL par voie apicale (voir schéma ci-dessus). Le milieu de culture (DMEM-Ham’s

F12 et antibiotiques) contenant du sérum de veau fœtal standardisé (2 % ; Ultroser G,

Invitrogen : Biosepra) a été déposé au fond de chaque puits, au contact du pôle basal du filtre.

Après 24 heures de culture, la mise en interface air-liquide a été effectuée en aspirant le

milieu d’ensemencement puis en lavant les cellules par voie apicale à 3 reprises avec du PBS,

46

afin d’éliminer les cellules non adhérentes au filtre. Le milieu de culture (sous-nageant) a été

remplacé toutes les 24 heures et les cultures ont été maintenues à 37°c dans un incubateur

humidifié avec un air enrichi en CO2 (5%). Les cellules ont été observées quotidiennement au

microscope optique inversé pour juger de la confluence de la culture.

Les caractéristiques de ce modèle ont été précisées préalablement par des techniques

morphologiques (microscopie optique et électronique), immunologiques (immunohistochimie

et cytométrie de flux) et par la réalisation de mesures électrophysiologiques [112][113][114].

Les cellules expriment la cytokératine (un marqueur de leur origine épithéliale) et se

différencient en cellules caliciformes et en cellules ciliées. Les mesures électrophysiologiques

montrent que la résistance électrique des cultures se stabilise dès la fin de la première semaine

de culture à des valeurs élevées (1100 Ω.cm²), suggérant l’établissement de jonctions

épithéliales serrées. La différence de potentiel trans-épithéliale s’établit à -40 mV dès le 4ème

jour de culture confirmant l’existence de transport ioniques efficaces. Ces données suggèrent

que les cultures ainsi obtenues soient constituées exclusivement de cellules épithéliales

(absence de fibroblastes ou de cellules inflammatoires). Des expériences préliminaires ont

montré que les cellules non stimulées expriment le récepteur de l’EGF et la mucine MUC5AC

en immunohistochimie dès les premiers jours de culture (données non présentées).

Protocole expérimental

Vingt-quatre heures après la confluence, les cellules ont été placées pendant 8 heures dans un

milieu de culture sans sérum (sans Ultroser G) afin de limiter l’apport exogène de facteurs de

croissance. Juste avant les expériences, les cellules ont été lavées deux fois de suite par voie

apicale, avec du PBS à 4°c afin d’éliminer les mucines déjà sécrétées.

Pour déterminer l’effet de l’activation du récepteur de l’EGF sur la synthèse de la mucine

MUC5AC, nous avons traité les cellules avec un ligand du récepteur de l’EGF, le

47

Transforming Growth Factor alpha (TGF-α humain recombinant, 10 ng/mL, Calbiochem,

distributeur VWR, Fontenay sous Bois, France) seul ou associé au Tumor Necrosis Factor

alpha (TNF-α humain recombinant, 10 ng/mL, Calbiochem). En effet, le TNF-α, une

cytokine proinflammatoire présente dans les voies aériennes des patients atteints de

pathologies pulmonaires chroniques [115], augmente l’expression du récepteur de l’EGF et

potentialise l’effet du TGF-α sur la synthèse de MUC5AC dans une lignée tumorale de

cellules épithéliales respiratoires [67]. Les concentrations de TGF-α et de TNF-α utilisées ont

été choisies par référence à des études publiées [67][116]. Compte tenu du nombre limité de

cellules épithéliales disponibles pour chacune des expériences, nous n’avons pas testé l’effet

de différentes concentrations de TNF-α et de TGF-α.

Dans certaines expériences, les cellules ont été prétraitées 30 minutes avant la stimulation par

un inhibiteur sélectif de la tyrosine kinase du récepteur de l’EGF, la tyrphostine AG1478 (10-5

M ; IC50 = 3 nM pour la tyrosine kinase du récepteur de l’EGF, Calbiochem) [117].

L’inhibiteur était laissé dans le milieu de culture pendant toute la durée de l’expérience. Un

composé inactif de la classe des tyrphostines, l’AG9 (10-5

M ; IC50 = 1250 µM pour la

tyrosine kinase du récepteur de l’EGF, Calbiochem) a été utilisé comme contrôle négatif de

l’AG1478.

Pour juger de l’expression de la protéine MUC5AC nous avons réalisé un marquage

immunohistochimique pour la mucine MUC5AC et mesuré par méthode ELISA les

concentrations de la protéine MUC5AC dans les lysats cellulaires. Pour l’évaluation de

l’expression de la protéine MUC5AC les expériences ont été arrêtées après 24 heures de

traitement. Les temps d’expériences ont été déterminés d’après les données de la littérature

[61].

48

Détection de la protéine MUC5AC par immunohistochimie

Après 24 heures de stimulation par le TNF-α et/ou le TGF-α, les cultures cellulaires ont été

lavées avec du PBS, fixées dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 30 minutes puis

conservées dans du PBS à 4°c. Pour l’immunomarquage, nous avons utilisé un anticorps

monoclonal de souris dirigé contre la mucine MUC5AC (clone 45M1; dilution 1:500,

Neomarkers). L’immunomarquage a été réalisé selon la technique décrite précédemment. Les

lames ont été contre-colorées avec de l’hématoxyline afin d’identifier les noyaux cellulaires.

Enfin, les inserts ont été découpés et les filtres montés entre lame et lamelle permettant leur

analyse au microscope optique.

Quantification de la coloration immunohistochimique pour la protéine MUC5AC

L’analyse a été effectuée à l’aide d’une caméra numérique (Leica microsystems, Wetzlar,

Allemagne) reliant le microscope optique à un ordinateur. Pour chaque insert, nous avons

photographié 20 champs microscopiques choisis de façon aléatoire à un grossissement de

200X. Les cellules ont été comptées sur l’écran de l’ordinateur par un investigateur ignorant

les conditions de culture à l’aide d’une grille de lecture. Cette grille comprend 6 carreaux de

taille identique et permet une évaluation non biaisée de la densité cellulaire [118][119].

Chaque carreau est tracé avec deux côtés en pointillés et deux côtés en trait continu (voir

exemple, page suivante). Nous avons compté les cellules dont les noyaux (contre colorés avec

l’hématoxyline) étaient situés à l’intérieur des carreaux ou touchaient les côtés tracés en

pointillés. Les cellules dont les noyaux étaient situés hors des carreaux ou faisaient

intersection avec les côtés tracés en trait continu n’ont pas été comptées. Pour chaque

condition de traitement (dupliquées), nous avons compté le nombre de cellules positives pour

la mucine MUC5AC et le nombre total de cellules. La méthode a été décrite sur l’exemple de

champ de comptage ci-dessous.

49

Exemple de comptage sur une photographie d’une culture cellulaire de cellules épithéliales de polype colorées par un immunomarquage pour la protéine MUC5AC (granules bruns) et contre colorées à l’hématoxyline (noyaux bleus) :

La grille comportant 6 carreaux est appliquée sur l’écran et les cellules sont comptées comme

décrit précédemment (voir ci-dessus). Ainsi, on compte 5 cellules positives pour la mucine

MUC5AC (flèches non barrées). Les cellules situées au contact des traits continus (flèches

barrées) ou les cellules situées hors des carreaux n’ont pas été comptées. Grossissement initial

200X, barre = 50 µm.

Compte tenu de variations du nombre de cellules positives pour MUC5AC (MUC5AC+) entre

les cultures obtenues à partir de polypes issus de patients différents, les résultats du comptage

des cellules MUC5AC+ ont été exprimés en pourcentage de variation par rapport au nombre

de cellules positives dans la condition Contrôle (cellules de la même expérience, cultivées en

milieu sans sérum seul).

50

Mesure de la protéine MUC5AC par méthode ELISA

Après 24 heures de traitement, les cellules ont été lysées dans chaque insert par 500µL d’une

solution de PBS contenant du Triton X (1% ; Sigma) et de l’acide déoxycholique (1% ;

Sigma). Les filtres ont été grattés à l’aide d’une pointe de pipette et les lysats cellulaires ont

été collectés dans des microtubes et conservés à -80°C. Après décongélation, les lysats

cellulaires ont été centrifugés à 1500 rpm pendant 10 minutes. Cinquante microlitres de

chaque surnageant additionnés de 50 µL de tampon carbonate-bicarbonate (Sigma) ont été

déposés dans un puits de la plaque d’ELISA (Maxisorp Nunc; Fisher Scientific, Santa Clara,

CA). La plaque a ensuite été placée dans un four à 37°c jusqu’à séchage complet. Après triple

lavage avec du PBS, 100 µL/puits d’une solution d’albumine bovine à 2% dans du PBS ont

été appliqués pendant une heure à température ambiante, de façon à saturer les sites de

fixation protéique non spécifique. Après un triple lavage des puits avec du PBS, 100 µL/puits

d’une solution d’anticorps monoclonal dirigé contre la MUC5AC (clone 45M1; dilution

1:500) dilué dans du PBS contenant 0.05% de Tween-20 et 1 % d’albumine bovine ont été

déposés. Après une heure d’incubation à température ambiante, les puits ont été lavés trois

fois avec du PBS et 100 µL d’une solution d’anticorps de chèvre anti-IgG de souris conjugué

à la peroxydase (1:10 000 ; Sigma) ont été ajoutés dans chaque puits pendant 1 heure à

température ambiante. Après un triple lavage avec du PBS, la réaction colorée a été

développée en déposant 50 µL d’une solution de 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)

peroxydase (Sigma). La réaction a été surveillée par une lecture de la densité optique à 650

nm jusqu’à stabilisation de la densité optique (environ 40 minutes) puis bloquée avec 50 µL

d’une solution molaire d’acide sulfurique (H2SO4, Sigma) et lue à 450 nm. Pour chaque

mesure, les concentrations de MUC5AC (mg/mL) ont été déterminées par rapport à une

courbe standard obtenue à l’aide de concentrations connues de mucine bovine purifiée (Type

I, Sigma). Du fait de variations des concentrations de mucines mesurées entre les cultures

51

issues de polypes de patients différents, les résultats ont été exprimés en pourcentage de

variation par rapport à la concentration mesurée dans la condition contrôle (cellules de la

même expérience cultivées en milieu sans sérum seul).

Statistiques

Les données obtenues par comptage des colorations immunohistochimiques pour la protéine

MUC5AC (nombre de cellules positives pour MUC5AC et nombre total de cellules) ainsi que

les concentrations de protéine MUC5AC mesurées par ELISA ont été analysées à l’aide d’un

test ANOVA pour les mesures répétées afin d’identifier des différences entre les conditions

de cultures. Lorsqu’une différence a été identifiée dans le test ANOVA, une analyse post-hoc

(test de Student-Newman-Keuls) a permis de préciser cette différence. Une différence

observée a été considérée comme significative lorsque le P était inférieur à 0,05.

En raison de la variabilité de l’expression de MUC5AC dans des cultures issues de patients

différents, les résultats (nombre de cellules positives pour MUC5AC, concentrations de la

protéine MUC5AC dans les lysats cellulaires) ont été standardisés en pourcentage de variation

par rapport à la condition Contrôle (cellules de la même culture cultivées en milieu sans

sérum seul). Les données sont représentées sous la forme de Moyenne ± Ecart type.

52

Résultats

Effet de l’activation du récepteur de l’EGF sur la synthèse de la protéine MUC5AC

L’immunohistochimie pour la protéine MUC5AC sur des cellules épithéliales de polypes

naso-sinusiens cultivées pendant 24 heures après la confluence en milieu sans sérum seul

(Contrôle), identifie des cellules MUC5AC+ dans toutes les cultures (10,2 ± 5,2 % du nombre

total de cellules ; n = 5 expériences en conditions dupliquées) (Fig. 1a et 1b). De même,

l’ELISA pour la protéine MUC5AC dans les lysats cellulaires de cellules cultivées en

condition Contrôle, retrouve des concentrations mesurables dans toutes les cultures (0,30 ±

0,14 mg/mL ; n = 3 expériences en conditions dupliquées).

Le traitement des cellules en culture pendant 24 heures par le TGF-α, un ligand du récepteur

de l’EGF, induit une augmentation du nombre des cellules MUC5AC+ et un allongement des

cellules épithéliales en immunohistochimie (Fig. 1a). L’analyse morphométrique quantitative

de l’immunohistochimie révèle un doublement du nombre de cellules exprimant la protéine

MUC5AC dans les inserts traités par le TGF-α (Fig. 1b) (P < 0,05 par rapport au Contrôle ; n

= 5 expériences). De même, le TGF-α entraîne une augmentation de la concentration de la

protéine MUC5AC mesurée par ELISA dans les lysats cellulaires (P < 0,05 par rapport au

Contrôle ; n=3 expériences) (Fig. 1c). L’augmentation du nombre de cellules MUC5AC+ par

le TGF-α se fait sans modification du nombre total de cellules par rapport au Contrôle :

12,4.103 ± 4,7.10

3 cellules/mm², vs 12,0.10

3 ± 5,1.10

3 cellules/mm² respectivement (P > 0,05 ;

n = 5 expériences).

Le traitement des cellules par le TNF-α n’augmente pas le nombre de cellules MUC5AC+ en

immunohistochimie (Fig. 1b) et ne change pas la concentration de la protéine MUC5AC dans

les lysats cellulaires (Fig. 1c). Le TNF-α ne potentialise pas l’effet du TGF-α sur l’expression

de la protéine MUC5AC en immunohistochimie et sur les mesures en ELISA (Fig. 1b et 1c).

53

Contrôle TNF-αααα TGF-αααα TGF-αααα + TNF-ααααContrôle TNF-αααα TGF-αααα TGF-αααα + TNF-αααα

Fig. 1a : Photographies représentatives de l’effet du traitement par le TGF-αααα et/ou le TNF-αααα sur l’immunomarquage pour la protéine MUC5AC :

Les cellules ont été cultivées pendant 24 heures en milieu sans sérum seul (Contrôle) ou additionné de TNF-α (10 ng/mL) et/ou de TGF-α (10 ng/mL). Après

fixation, un immunomarquage avec un anticorps anti-MUC5AC a été réalisé (marquage sous la forme de granules bruns, flèches) et les lames ont été contre

colorées à l’hématoxyline afin d’identifier les noyaux cellulaires (colorés en bleu). Les photographies sont représentatives de 5 expériences indépendantes (n=5

patients), réalisées en conditions dupliquées. Notez le changement de forme des cellules (allongement) après traitement par le TGF-α associé à l’augmentation du

nombre de cellules marquées positivement pour la protéine MUC5AC par rapport au Contrôle. Le TNF-α n’augmente pas l’expression de MUC5AC et ne

potentialise pas l’effet du TGF-α. Grossissement initial 400X, barre = 50 µm.

54

Nombre de cellules MUC5AC+

(% de variation par rapport au Contrôle)

*, P < 0,05 par rapport au Contrôle; †, P > 0,05 par rapport au TGF-αn = 5 expériences réalisées en conditions dupliquées

Contrôle TNF-αααα TGF-αααα TGF-αααα+

TNF-αααα

0

40

80

120

160

* *, †

Nombre de cellules MUC5AC+

(% de variation par rapport au Contrôle)

*, P < 0,05 par rapport au Contrôle; †, P > 0,05 par rapport au TGF-αn = 5 expériences réalisées en conditions dupliquées

Contrôle TNF-αααα TGF-αααα TGF-αααα+

TNF-αααα

0

40

80

120

160

* *, †

Contrôle TNF-αααα TGF-αααα TGF-αααα+

TNF-αααα

0

40

80

120

160

* *, †

Fig. 1b : Effet du traitement par le TGF-αααα (10 ng/mL) et/ou le TNF-αααα (10 ng/mL) sur l’expression de la protéine MUC5AC : Les cellules confluentes ont été cultivées pendant 24 heures en milieu sans sérum seul

(Contrôle) ou additionné de TNF-α (10 ng/mL) et/ou de TGF-α (10 ng/mL). Après fixation et

immunomarquage pour la protéine MUC5AC, les cellules ont été comptées par un

investigateur ignorant les conditions de culture (voir Méthodes). Les résultats sont exprimés

en pourcentage de variation du nombre total de cellules marquées positivement pour la

protéine MUC5AC par rapport au Contrôle ± Ecart type.

55

Contrôle TNF-αααα TGF-αααα TGF-αααα+

TNF-αααα

0

40

80

120

Concentration de la protéine MUC5AC

dans les lysats cellulaires

(% de variation par rapport au Contrôle)

*, P < 0,05 par rapport au Contrôle; †, P > 0,05 par rapport au TGF-αn = 3 expériences réalisées en conditions dupliquées

*

*, †

Contrôle TNF-αααα TGF-αααα TGF-αααα+

TNF-αααα

0

40

80

120

Concentration de la protéine MUC5AC

dans les lysats cellulaires

(% de variation par rapport au Contrôle)

*, P < 0,05 par rapport au Contrôle; †, P > 0,05 par rapport au TGF-αn = 3 expériences réalisées en conditions dupliquées

*

*, †

Fig. 1c : Effet du traitement par le TGF-αααα et/ou le TNF-αααα sur la concentration de la protéine MUC5AC : La concentration de la protéine MUC5AC a été mesurée par ELISA dans les lysats cellulaires

de cellules confluentes cultivées pendant 24 heures en milieu sans sérum seul (Contrôle) ou

additionné de TNF-α (10 ng/mL) et/ou de TGF-α (10 ng/mL). Les résultats sont exprimés en

pourcentage de variation par rapport au Contrôle ± Ecart type.

Page 56

Effet d’un antagoniste du récepteur de l’EGF sur la synthèse de la protéine MUC5AC

Le prétraitement des cellules par un inhibiteur sélectif de la tyrosine kinase du récepteur de

l’EGF (AG1478, 10-5

M) prévient l’effet du TGF-α sur le changement de forme des cellules

(Fig. 2a) et sur l’augmentation du nombre de cellules MUC5AC+ par rapport au Contrôle

(Fig. 2a et 2b). De même, le prétraitement par l’AG1478 inhibe l’augmentation de la

concentration de la protéine MUC5AC induite par le TGF-α mesurée par ELISA (Fig. 2c).

La tyrphostine AG9, un composé inactif de structure chimique proche de l’AG1478 (10-5

M)

ne prévient pas les effets du TGF-α sur le nombre et l’aspect des cellules MUC5AC+ (Fig. 2a

et 2b), ni sur la concentration de la protéine MUC5AC (donnée non représentée). Le nombre

total de cellules n’est modifié ni par l’AG1478 ni par l’AG9 (n=4 expériences, données non

représentées).

Page 57

Contrôle TGF-ααααContrôle + AG1478 TGF-αααα + AG1478 TGF-αααα + AG9Contrôle TGF-ααααContrôle + AG1478 TGF-αααα + AG1478 TGF-αααα + AG9

Fig. 2a : Photographies représentatives de l’effet d’un antagoniste du récepteur de l’EGF sur l’immunomarquage pour la protéine MUC5AC :

Les cellules ont été cultivées pendant 24 heures en milieu sans sérum seul (Contrôle) ou en présence de TGF-α (10 ng/mL). Dans certaines

expériences, les cellules ont été prétraitées par la tyrphostine AG1478, un antagoniste sélectif du récepteur de l’EGF (10-5

M), ou par la

tyrphostine AG9, un composé inactif (10-5

M). Après fixation, un immunomarquage avec un anticorps anti-MUC5AC a été réalisé (marquage

sous la forme de granules bruns, flèches) et les lames ont été contre colorées à l’hématoxyline afin d’identifier les noyaux cellulaires (colorés en

bleu). Les photographies sont représentatives de 4 expériences indépendantes (n=4 patients), réalisées en conditions dupliquées. Le traitement par

le TGF-α provoque un allongement des cellules et une augmentation du nombre de cellules MUC5AC+. Ces effets sont prévenus par l’AG1478

mais pas par l’AG9. Grossissement initial 400X, barre = 50 µm.

Page 58

Contrôle Contrôle

+

AG1478

TGF-αααα TGF-αααα+

AG1478

TGF-αααα+

AG9

-40

0

40

80

120

Nombre de cellules MUC5AC+

(% de variation par rapport au Contrôle)

*, P < 0,05 par rapport au Contrôle

†, P < 0,05 par rapport au TGF-αn = 4 expériences réalisées en conditions dupliquées

*

*

†

Contrôle Contrôle

+

AG1478

TGF-αααα TGF-αααα+

AG1478

TGF-αααα+

AG9

-40

0

40

80

120

Nombre de cellules MUC5AC+

(% de variation par rapport au Contrôle)

*, P < 0,05 par rapport au Contrôle

†, P < 0,05 par rapport au TGF-αn = 4 expériences réalisées en conditions dupliquées

*

*

†

Fig. 2b: Effet d’un antagoniste du récepteur de l’EGF sur l’expression de la protéine MUC5AC : Les cellules ont été cultivées pendant 24 heures en milieu sans sérum seul (Contrôle) ou en

présence de TGF-α (10 ng/mL). Dans certaines expériences, les cellules ont été prétraitées par

la tyrphostine AG1478, un antagoniste sélectif du récepteur de l’EGF (10-5

M), ou par la

tyrphostine AG9, un composé inactif (10-5

M). Après fixation et immunomarquage, les

cellules MUC5AC+ ont été comptées par un investigateur ignorant les conditions de culture

(voir Méthodes). Les résultats sont exprimés en pourcentage de variation par rapport au

Contrôle ± Ecart type.

Page 59

Contrôle Contrôle

+

AG1478

TGF-αααα TGF-αααα+

AG1478

-40

0

40

80

120

Concentration de la protéine MUC5AC

dans les lysats cellulaires

(% de variation par rapport au Contrôle)

*, P < 0,05 par rapport au Contrôle

†, P < 0,05 par rapport au TGF-αn = 3 expériences réalisées en conditions dupliquées

†

†

*

Contrôle Contrôle

+

AG1478

TGF-αααα TGF-αααα+

AG1478

-40

0

40

80

120

Concentration de la protéine MUC5AC

dans les lysats cellulaires

(% de variation par rapport au Contrôle)

*, P < 0,05 par rapport au Contrôle

†, P < 0,05 par rapport au TGF-αn = 3 expériences réalisées en conditions dupliquées

†

†

*

Fig. 2c : Effet d’un antagoniste du récepteur de l’EGF sur la concentration de la protéine MUC5AC : La concentration de protéine MUC5AC a été mesurée par ELISA dans les lysats cellulaires de

cellules confluentes cultivées pendant 24 heures en milieu sans sérum seul (Contrôle) ou en

présence de TGF-α (10 ng/mL). Dans certaines expériences, le milieu a été additionné

d’AG1478, un antagoniste sélectif du récepteur de l’EGF (10-5

M). Les résultats sont exprimés

en pourcentage de variation par rapport au Contrôle ± SEM.

60

Principales conclusions et discussion

L’association d’une surexpression de la mucine MUC5AC et de l’expression du récepteur de

l’EGF dans l’épithélium des polypes naso-sinusiens a fait suggérer une relation de causalité

[1]. Dans cette étude, nous avons étudié directement l’effet de l’activation du récepteur de

l’EGF par l’un de ses ligands, le TGF-α, sur la synthèse de la mucine MUC5AC par des

cellules épithéliales de polypes naso-sinusiens humain. Nos résultats indiquent que le

traitement par des cellules épithéliales de polypes par le TGF-α provoque l’augmentation de

la synthèse de la protéine MUC5AC. L’utilisation d’un inhibiteur sélectif de la tyrosine kinase

du récepteur de l’EGF bloque cet effet, indiquant que l’action du TGF-α est liée à l’activation

du récepteur de l’EGF. Ces résultats démontrent pour la première fois l’implication du

système du récepteur de l’EGF dans la synthèse de mucines par l’épithélium des polypes

naso-sinusiens. Une étude préalablement publiée montre que l’inhibition sélective de la MAP-

Kinase ERK bloque la synthèse du gène MUC5AC dans des cellules épithéliales de polypes

[120]. De façon intéressante Takeyama et coll. ont montré que la synthèse de MUC5AC

dépendante de l’activation du récepteur de l’EGF est liée à une activation de la voie ERK

[92].

La source d’activation potentielle du récepteur de l’EGF dans l’épithélium des polypes naso-

sinusiens en pathologie humaine nécessite une discussion. Premièrement, les cellules

épithéliales nasales humaines expriment le récepteur de l’EGF et ses principaux ligands [121].

La synthèse de mucines dans l’épithélium des voies aériennes en réponse à des stimuli variés,

fait intervenir le clivage des pro-ligands (par exemple le pro-TGF-α) ancrés dans la

membrane des cellules épithéliales, par des métalloprotéases membranaires [122]. De façon

intéressante Lam et coll. ont montré une surexpression du TGF-α dans l’épithélium des

polypes naso-sinusiens [123]. Nous avons confirmé par immunohistochimie la présence de

TGF-α dans les cellules épithéliales de polypes naso-sinusiens en culture (donnée non

61

représentée). Ainsi, les ligands du récepteur de l’EGF produits par les cellules épithéliales des

polypes pourraient contribuer à l’activation du récepteur de l’EGF et à la synthèse de

mucines. Deuxièmement, la polypose naso-sinusienne primitive est caractérisée par une

infiltration massive du stroma et de l’épithélium par des cellules inflammatoires. La

population majoritaire des cellules inflammatoires des polypes est représentée par les

polynucléaires éosinophiles qui expriment le TGF-α [105]. Ces données suggèrent que les

polynucléaires éosinophiles puissent provoquer la synthèse de mucine MUC5AC dans

l’épithélium des voies aériennes par activation du récepteur de l’EGF.

Les mécanismes conduisant à l’expression du récepteur de l’EGF dans la polypose naso-

sinusienne sont inconnus. Plusieurs études ont montré que la cytokine pro-inflammatoire

TNF-α augmente l’expression du récepteur de l’EGF dans l’épithélium respiratoire [67][124].

Takeyama et coll. ont montré que le traitement d’une lignée de cellules épithéliales humaines

(NCI-H292) par l’association de TNF-α + TGF-α augmente l’effet du TGF-α sur la synthèse

de mucine [67]. Dans notre étude le traitement par l’association TNF-α + TGF-α n’a pas

montré d’effet supérieur au TGF-α seul sur la synthèse de la mucine MUC5AC. Il est possible

que le TNF-α ait peu d’effet sur l’expression du récepteur de l’EGF dans l’épithélium des

polypes naso-sinusiens. Il est également possible que l’expression du TNF-α était déjà

maximale sur ces polypes ou que l’effet du TNF-α recombinant nécessite un temps

d’expérience plus long que celui choisi dans nos expériences (24 heures). Dans cette étude

construite pour montrer l’effet de l’activation du récepteur de l’EGF sur la synthèse de

mucine, nous n’avons pas évalué l’effet du TNF-α sur l’expression du récepteur de l’EGF.

L’augmentation de la synthèse de la protéine MUC5AC en réponse à l’activation du récepteur

de l’EGF se fait sans variation du nombre total de cellules. Cette observation suggère que la

synthèse de mucine soit liée à un mécanisme de différenciation des cellules épithéliales en

l’absence de prolifération cellulaire. Les données actuelles suggèrent en effet que l’apparition

62

de nouvelles cellules productrices de mucines se fait par conversion de cellules progénitrices

de l’épithélium en cellules produisant des mucines et non par prolifération des cellules

caliciformes. Ainsi, le prétraitement par la colchicine (qui bloque la métaphase) ne prévient

pas l’hyperplasie des cellules à mucus provoquée sur les cavités nasales du rat par de

l’endotoxine bactérienne [125]. Nous avons prévu de réaliser des expériences d’incorporation

de BrdU afin d’établir si les cellules contenant la mucine MUC5AC sont issues d’une

différenciation cellulaire (BrdU négatives) ou d’une prolifération cellulaire (BrdU positives).

En conclusion, nos résultats indiquent que l’activation du récepteur de l’EGF par son ligand,

provoque la synthèse de la mucine MUC5AC par l’épithélium des polypes. Les résultats de

cette étude suggèrent que les antagonistes du récepteur de l’EGF puissent être utilisés pour

prévenir l’hypersécrétion de mucus dans la polypose naso-sinusienne. Ainsi, nos résultats

permettent d’envisager la réalisation d’essais cliniques ciblant l’hypersécrétion de mucus avec

des inhibiteurs de la tyrosine kinase du récepteur de l’EGF administrés par voie locale chez

des patients atteints de polypose naso-sinusienne. De plus, le modèle de culture primaire de

cellules épithéliales de polypes naso-sinusiens peut-être utilisé pour tester l’effet

pharmacologique de nouvelles molécules sur la synthèse de mucines.

63

3. Rôle des éosinophiles dans la synthèse de mucine par l’épithélium respiratoire.

3.1. Les éosinophiles humains activés induisent la synthèse de la mucine MUC5AC dans

l’épithélium respiratoire par activation du récepteur de l’EGF.

Introduction

L’infiltration de l’épithélium respiratoire par les polynucléaires éosinophiles est

caractéristique de l’inflammation des voies aériennes dans l’asthme [126] et la polypose naso-

sinusienne [100]. Elle est également observée aux des exacerbations respiratoires chez les

patients atteints de BPCO [127]. L’augmentation de la production de mucines, liée à une

hyperplasie des cellules épithéliales à mucus (cellules caliciformes), est également décrite

dans l’asthme aigu grave [128], dans l’asthme chronique [17][30] et dans la polypose naso-

sinusienne [1]. L’analyse histologique des voies respiratoires de patients décédés d’asthme

aigu grave objective la présence d’éosinophiles dégranulés, particulièrement dans l’épithélium

respiratoire et dans les bouchons de mucus [129]; de plus, une corrélation positive entre

l’éosinophilie dans le lavage broncho-alvéolaire et la quantité d’expectoration quotidienne a

été décrite chez des patients asthmatiques [130]. Expérimentalement, la stimulation

allergénique dans des modèles murins d’asthme allergique se traduit par une intense

inflammation à éosinophiles dans les voies aériennes et une hyperplasie des cellules

épithéliales à mucus [131]. Ces données suggèrent l’implication des éosinophiles dans la

production de mucines au cours des pathologies respiratoires d’origine allergique. Cependant,

des études animales récentes remettent cette hypothèse en question : le transfert de

lymphocytes Th2 dans les voies aériennes de souris déficientes pour l’interleukine-5 (IL-5)

provoque une hyperplasie des cellules à mucus en l’absence de recrutement des éosinophiles

dans les voies aériennes [93], conduisant les auteurs à considérer que les éosinophiles ne

participent pas à l’hyperplasie des cellules à mucus. Plusieurs études récentes suggérant

64

l’existence de différences fonctionnelles majeures entre les éosinophiles murins et humains

[132][133], la relation entre les éosinophiles et la production de mucus en pathologie humaine

demeure inconnue.

Dans l’épithélium respiratoire, l’activation du récepteur de l’EGF par ses ligands (par

exemple EGF, TGF-α) provoque la synthèse du gène et de la protéine MUC5AC dans les

cellules épithéliales NCI-H292 [67]. De plus, des antagonistes sélectifs du récepteur de l’EGF

inhibent la synthèse de mucine induite par l’EGF et le TGF-α dans les cellules NCI-H292 in

vitro, ainsi que l’hyperplasie des cellules à mucus induite par une stimulation allergénique

chez le rat sensibilisé [67].

Le recrutement des éosinophiles au site de l’inflammation s’accompagne de leur activation

[134]. Les éosinophiles recrutés dans les tissus expriment le TGF-α dans certaines tumeurs

humaines [71] et dans les polypes naso-sinusiens [105]. Les éosinophiles humains, isolés dans

le sang périphérique et activés par des cytokines in vitro, produisent et sécrètent du TGF-

α [135][136][137].

Hypothèses et Objectifs de l’étude.

Nous avons émis l’hypothèse que les éosinophiles activés induisent la synthèse de mucine

dans l’épithélium respiratoire par activation du récepteur de l’EGF. Pour tester cette

hypothèse, nous avons étudié l’effet de l’activation d’éosinophiles humains, isolés à partir du

sang périphérique de sujets allergiques, sur la production de la mucine MUC5AC dans la

lignée cellulaire épithéliale respiratoire NCI-H292, ainsi que l’effet d’antagonistes du

récepteur de l’EGF dans ce modèle. Le choix d’une lignée cellulaire (NCI-H292) plutôt que

d’une culture primaire de cellules épithéliales a été dicté par des contingences pratiques : il est

en effet très difficile d’obtenir des cellules épithéliales en culture primaire au même moment

que des éosinophiles purifiés. Ce choix a par ailleurs permis de limiter la variabilité inhérente

65

à l’étude de cellules (éosinophiles et cellules épithéliales) isolées à partir de patients

différents. Cette étude a fait l’objet d’une publication originale qui insérée à la page

suivante[2].

66

Principales conclusions et Discussion

Dans cette étude, nous avons émis l’hypothèse que les éosinophiles provoquent la synthèse de la

mucine MUC5AC par l’épithélium respiratoire. Pour tester cette hypothèse nous avons isolé des

éosinophiles humains du sang périphérique et nous avons testé l’effet de l’activation de ces

éosinophiles sur la synthèse de mucines par la lignée épithéliale des voies aériennes NCI-H292.

Nos résultats indiquent que les éosinophiles humains activés induisent la synthèse de la mucine

MUC5AC dans les cellules NCI-H292 in vitro. De même, le surnageant d’éosinophiles activés

provoque la synthèse du gène et de la protéine MUC5AC dans les cellules NCI-H292 (voir

Figure 1 et 2 [2]), démontrant que l’effet des éosinophiles activés est lié à un produit sécrété.

L’effet du surnageant de culture des polynucléaires éosinophiles activés sur la synthèse de

mucines implique la phosphorylation du récepteur de l’EGF (voir Figure 3 et 4 [2]).

Les ligands du récepteur de l’EGF (par exemple, le TGF-α) se lient au récepteur de l’EGF et

activent la phosphorylation de ce récepteur dans son domaine intracellulaire, conduisant à la

synthèse de mucine [67]. Les éosinophiles [71] et les cellules de l’épithélium respiratoire (dont

les cellules NCI-H292) [138] exprimant le TGF-α, nous avons examiné le rôle du TGF-α dans la

synthèse de mucine provoquée par les éosinophiles activés. Tout d’abord, confirmant des

données publiées, nous avons montré que les éosinophiles activés sécrètent du TGF-α (voir

Figure 5). Ensuite, nous avons examiné l’effet des éosinophiles activés sur l’expression et la

sécrétion de TGF-α par les cellules épithéliales respiratoires. Le surnageant d’éosinophiles

activés provoque une importante augmentation de l’immunomarquage pour TGF-α sur les

cellules épithéliales ainsi qu’une augmentation de la concentration de TGF-α soluble dans le

surnageant de culture des cellules NCI-H292. De façon importante, un anticorps bloquant dirigé

contre le TGF-α diminue la synthèse de mucine induite par les éosinophiles activés. Ainsi, cette

étude démontre pour la première fois que les éosinophiles humains activés induisent la

production de mucine par des cellules épithéliales respiratoires humaines par activation du

67

récepteur de l’EGF, en partie liée au TGF-α. Cependant, nous n’avons pas déterminé quelle part

de l’effet de TGF-α était liée à sa sécrétion par les éosinophiles ou par les cellules épithéliales.

L’inhibition de la tyrosine kinase du récepteur de l’EGF a bloqué complètement la synthèse de

mucine induite par les éosinophiles activés, mais un anticorps bloquant anti-TGF-α diminue

seulement cette production de mucine, suggérant que l’activation du récepteur de l’EGF dans ce

contexte fait intervenir, outre l’activation par le TGF-α, d’autres mécanismes. D’autres ligands

du récepteur de l’EGF (par exemple l’ Heparin-Binding (HB)-EGF, qui est exprimé par les

éosinophiles activés [139] ou des molécules pouvant provoquer la transactivation du récepteur de

l’EGF (par exemple les radicaux libres de l’oxygène [92]) pourraient également être impliqués.

Le TGF-α est une protéine de 50 acides aminés dérivant d’un précurseur membranaire de 160

acides aminés [140] ou pro-TGF-α [141]. Le pro-TGF-α est clivé par des enzymes

protéolytiques, provoquant la libération du TGF-α soluble [142][143]. La forme soluble du TGF-

α a une activité plus puissante que son précurseur membranaire [144]. Dans cette étude, nous

avons trouvé que le surnageant d’éosinophiles activés provoque l’apparition d’un intense

immunomarquage pour TGF-α sur les cellules épithéliales respiratoires (voir Figure 6 [2]),

suggérant qu’un produit sécrété par les éosinophiles induise la synthèse de TGF-α dans

l’épithélium respiratoire. Ensuite, nous avons mesuré le TGF-α soluble dans le surnageant de

culture des cellules NCI-H292, et nous avons trouvé des concentrations de TGF-α soluble qui,

bien que faibles, étaient plus élevées après incubation avec le surnageant des éosinophiles

activés. Les cellules NCI-H292 expriment le récepteur de l’EGF [138]; après liaison du TGF-α

au récepteur de l’EGF, l’ensemble ligand-récepteur est internalisé et le TGF-α est dégradé [145].

Ainsi, les concentrations de TGF-α soluble mesurées dans le surnageant de culture des cellules

NCI-H292 dépendent de la quantité de TGF-α soluble libérée (par protéolyse du pro-TGF-α) et

du captage du TGF-α soluble par le récepteur de l’EGF. C’est pourquoi les concentrations de

68

TGF-α mesurées dans le surnageant de culture des cellules NCI-H292 ne correspondent pas à la

quantité réelle de TGF-α soluble libérée par les cellules épithéliales. Néanmoins, ces données

suggèrent qu’un produit libéré dans le surnageant d’éosinophiles activés clive le pro-TGF-α sur

la membrane des cellules épithéliales, provoquant la libération de TGF-α soluble. Les

éosinophiles sécrètent de l’élastase [146] et des métalloprotéases [147] qui pourraient jouer un

rôle dans le clivage du pro-TGF-α. Cependant l’étude des mécanismes de sécrétion du TGF-α

soluble en réponse à la stimulation des cellules épithéliales par le surnageant d’éosinophiles

activés nécessite des investigations complémentaires.

Plusieurs études ont retrouvé une corrélation entre l’hyperéosinophilie (dans le sang [148] et dans

les voies aériennes [130]) et la quantité d’expectoration quotidienne chez des patients

asthmatiques, suggérant l’implication des éosinophiles dans l’hypersécrétion de mucus. De

même, chez des patients atteints de bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO), Saetta

et coll. [127] ont retrouvé un hyperéosinophilie dans l’expectoration au cours des exacerbations,

et Haraguchi et coll. [149] ont rapporté une corrélation entre le nombre d’éosinophiles dans les

voies aériennes et l’existence d’une hyperplasie des cellules épithéliales à mucus (cellules

caliciformes) chez des patients décédant de bronchospasme (« asthma-like attacks »). L’absence

de corrélation entre hyperéosinophilie et hyperplasie des cellules à mucus dans certains modèles

animaux a fait conclure à l’absence d’implication des éosinophiles dans l’hypersécrétion de

mucus. Ainsi, la stimulation allergénique chez des souris sensibilisées conduit au recrutement des

éosinophiles dans les voies aériennes et à l’hyperplasie des cellules à mucus, suggérant

initialement une relation entre les deux phénomènes [131]. Cependant, la stimulation

allergénique de souris C57BL/6 déficientes pour l’interleukine-5 conduit à une hyperplasie des

cellules à mucus alors que le recrutement des éosinophiles dans les voies aériennes n’existe plus,

amenant les auteurs à conclure que les éosinophiles ne sont pas des éléments important pour la

survenue d’une hyperplasie des cellules à mucus [93]. Ces résultats sont à interpréter avec

69

précaution. En effet, les éosinophiles murins (en particulier ceux des souris C57BL/6)

n’apparaissent pas dégranulés après une stimulation allergénique in vivo [132][150], alors que les

éosinophiles retrouvés sur les prélèvements histologiques dans les voies aériennes de patients

asthmatiques sont massivement dégranulés [129]. In vitro, la stimulation (cytokines, agents

chimiques) provoque la dégranulation des éosinophiles humains mais pas des éosinophiles

murins [132][133]. Il semble donc exister des différences importantes entre les éosinophiles

murins et les éosinophiles humains et les résultats obtenus chez la souris pourraient ne pas être

transposable à l’homme. Depuis la publication de nos résultats [2], deux nouvelles études sur des

souris ont cherché à établir l’effet de l’abolition du recrutement des éosinophiles sur l’hyperplasie

des cellules caliciformes dans l’épithélium respiratoire provoquée par une stimulation

allergénique [151][152]. Lee et coll. ont étudié des souris transgéniques exprimant la toxine

diphtérique A sous le contrôle du promoteur de la péroxydase des éosinophiles (souris PHIL)

[151]; Ces souris, qui sont dépourvues d’éosinophiles, ont une protection partielle contre la

survenue d’une hyperplasie des cellules caliciformes. Humbles et coll. ont étudié des souris ayant

une délétion pour un site de liaison de haute affinité dans le promoteur du facteur de transcription

GATA-1 (souris ∆dbl GATA-1) [152]. Ces souris sont également dépourvues d’éosinophiles

mais ne sont pas protégées contre l’hyperplasie des cellules caliciformes liée à une stimulation

allergénique. La différence de conclusion entre les deux études pourrait être expliquée par des

différences de lignée génétique (les souris PHIL sont créées à partir de souris BL6, alors que les

souris ∆dbl GATA-1 sont créées à partir de souris Balb/c) ou par le fait que les manipulations

génétiques effectuées chez les souris ont d’autres effets que la simple suppression des

éosinophiles [153]. Ces données soulignent la nécessité d’interpréter avec prudence les données

obtenues sur des modèles murins. Nos résultats obtenus in vitro avec des éosinophiles humains

démontrent que les éosinophiles humains activés peuvent provoquer la synthèse de mucine.

Seules des études cliniques humaines avec des molécules inhibant complètement le recrutement

70

des éosinophiles dans les voies aériennes permettront de définir de façon définitive le rôle des

éosinophiles dans la synthèse de mucines par l’épithélium.

71

3.2. Effet des corticoïdes intranasaux sur l’infiltration épithéliale par les polynucléaires

éosinophiles et l’expression de la mucine MUC5AC dans les polypes naso-sinusiens

humains.

Introduction

L’hyperplasie des cellules productrices de mucus et la surexpression des mucines sont

présentes dans l’épithélium des polypes naso-sinusiens [1] ; cependant aucune thérapeutique

ciblant directement l’hypersécrétion de mucus n’est disponible en thérapeutique humaine.

L’infiltration par les polynucléaires éosinophiles est caractéristique de la polypose naso-

sinusienne [100]. Les polynucléaires neutrophiles sont recrutés dans les voies aériennes dans

les maladies respiratoires associées à une hypersécrétion de mucus (par exemple, la BPCO, la

mucoviscidose et les dilatations des bronches, l’asthme aigu grave) et sont également

retrouvés dans les polypes naso-sinusiens [154]. L’expression des chimiokines responsables

du recrutement des polynucléaires neutrophiles est augmentée dans ces pathologies [155] et

l’interleukine 8, une puissante chimiokine des polynucléaires neutrophiles, est présente dans

les polypes naso-sinusiens [156]. Les polynucléaires neutrophiles pourraient jouer un rôle

important dans la production des mucines : les radicaux libres oxygénés dérivés des

neutrophiles [92] et l’élastase neutrophile induisent la synthèse de mucine [65][90]. Nous

avons montré précédemment que les polynucléaires éosinophiles sécrètent également des

facteurs qui induisent la synthèse de mucines dans l’épithélium des voies aériennes [2]. De ce

fait, les polynucléaires neutrophiles et éosinophiles pourraient jouer un rôle dans la

surexpression des mucines retrouvée dans la polypose naso-sinusienne [1].

Les corticoïdes intranasaux sont les traitements de référence recommandés pour le traitement

médical de la polypose naso-sinusienne. Plusieurs études ont montré que les corticoïdes

locaux permettent une diminution de la taille des polypes naso-sinusiens [157][158] et une

72

diminution importante de l’infiltration tissulaire par les polynucléaires éosinophiles [159]; par

contre, leurs effets sur la synthèse de mucines dans l’épithélium des polypes n’ont jamais été

étudiés.

La mucine MUC5AC semble être la principale mucine capable de former un gel synthétisé

par l’épithélium des voies aériennes chez l’homme [17]. Nous avons montré dans notre

première étude sur les polypes naso-sinusiens [1] que la mucine MUC5AC est une mucine

majeure de l’épithélium des polypes naso-sinusiens. L’activation du récepteur de l’EGF et les

facteurs sécrétés par les leucocytes ont tous les deux été impliqués dans la synthèse de

MUC5AC par l’épithélium respiratoire. Dans cette étude, nous avons testé l’effet de la

fluticasone intranasale sur l’expression de la mucine MUC5AC et du récepteur de l’EGF ainsi

que sur la présence de leucocytes dans les polypes naso-sinusiens. Pour chaque sujet étudié,

nous avons prélevé chirurgicalement un polype avant tout traitement et un autre polype après

8 semaines de traitement par la fluticasone intranasale. Nous avons tout d’abord évalué

l’efficacité de la fluticasone sur la réduction de la taille des polypes (évaluée par la mesure de

la résistance nasale) et sur la diminution du nombre d’éosinophiles infiltrant les polypes, ces

deux effets ayant été précédemment décrits avec la fluticasone [159]. Nous avons ensuite

évalué l’effet de la fluticasone sur l’expression de l’ARNm et de la protéine de mucine

MUC5AC et sur l’expression du récepteur de l’EGF par des techniques d’hybridation in situ

et d’immunohistochimie sur les polypes prélevés. Sur ces polypes nous avons également

évalué par immunohistochimie la présence de polynucléaires neutrophiles ainsi que

l’expression de l’interleukine 8 et du TNF-alpha. Cette étude a fait l’objet d’une publication

originale qui est insérée à la page suivante [3].

73

Principales conclusions et discussion

Les corticoïdes sont efficaces pour le traitement de la polypose naso-sinusienne mais leurs

effets sur la synthèse des mucines est inconnu. Nous avons étudié l’effet d’un traitement de

deux mois par une dose usuelle d’un corticoïde intranasal, la fluticasone, sur l’expression

(immunohistochimie et hybridation in situ) des glycoprotéines de mucine dans l’épithélium

des polypes naso-sinusiens obtenus chirurgicalement avant et après le traitement [3]. Dans

cette étude, nous avons montré que la synthèse de la mucine MUC5AC n’a pas été modifiée

par un traitement corticoïde intranasal administré à des doses usuelles (voir Figures 3 et 4

[3]). L’absence d’effet de la fluticasone sur la production de mucine par l’épithélium des

polypes ne peut être expliquée par une non-administration du produit (due à une mauvaise

observance thérapeutique ou un dépôt inadéquat du médicament) car le traitement par la

fluticasone s’est accompagné d’une diminution de la taille des polypes (démontrée par une

diminution des résistances nasales) (voir Figure 1 [3]) et d’une diminution de l’infiltration

des polypes par les polynucléaires éosinophiles (voir Figure 2 [3]). Cette étude avait été

conçue avec pour contrôle positif de l’administration du traitement ces effets bien établis des

corticoïdes, car retrouvés par de multiples études randomisées contre placebo

[157][158][159][160][161].

A notre connaissance, l’évaluation de l’effet des corticoïdes sur la synthèse de mucine par

l’épithélium des polypes naso-sinusiens n’a jamais été décrite jusqu'à présent. Dans

l’épithélium des voies aériennes inférieures de patients asthmatiques, les données publiées

montrent des résultats contradictoires concernant l’effet des corticoïdes inhalés sur

l’hyperplasie des cellules à mucus et l’expression des mucines. Laitinen et coll. ont étudié des

biopsies bronchiques obtenues chez 7 patients ayant un asthme sévère avant et après un

traitement de 3 mois par le budésonide (600 µg matin et soir), un autre corticoïde inhalé

[162]. Ces auteurs ont montré une augmentation du rapport nombre de cellules ciliées/nombre

74

de cellules à mucus après administration du traitement par le budésonide. Dans cette étude

aucune donnée concernant l’expression des gènes ou des protéines de mucines n’était

disponible. Groneberg et coll. ont rapporté l’absence de changement de la protéine MUC5AC,

étudiée par l’analyse semi-quantitative d’un immuno-marquage sur des biopsies bronchiques

de patients asthmatiques, après 1 mois de traitement par le budésonide par voie inhalée [28].

De même, Fahy et coll. ont rapporté qu’un traitement corticoïde inhalé d’un mois par la

béclométhasone ne modifiait pas les concentrations de glycoprotéines mesurées dans

l’expectoration induite chez des patients asthmatiques [163]. Notre étude est la première à

avoir examiné l’effet des corticoïdes locaux sur l’expression du gène et de la protéine

MUC5AC par l’épithélium des voies aériennes en essai clinique humain avec une analyse

morphométrique quantitative. Nos données indiquent que la quantité de la mucine MUC5AC

dans l’épithélium des polypes naso-sinusiens n’est pas modifiée par un traitement de deux

mois par des doses usuelles de corticoïdes intranasaux. La présence de mucine dans

l’épithélium des voies aériennes est la résultante de la synthèse de mucines par les cellules

épithéliales (qui augmente le contenu épithélial en mucine) et de la sécrétion de mucines à la

surface de l’épithélium (qui diminue le contenu épithélial en mucines). De ce fait, la

persistance de la présence de mucines dans l’épithélium des polypes après un traitement par la

fluticasone peut s’expliquer par des effets sur la synthèse et/ou sur la sécrétion de mucines.

De façon notable, nous avons montré par hybridation in situ que la synthèse de l’ARN

messager de MUC5AC n’était pas bloquée par le traitement corticoïde. Les modalités

expérimentales de notre étude ne permettaient pas l’étude des mucines sécrétées dans la cavité

nasale. Cependant, dans une étude préalable, McGregor et coll. ont mesuré les mucines

sécrétées dans le lavage nasal de sujets normaux traités par corticoïdes et ces auteurs ont

conclu que les corticoïdes intranasaux augmentaient la sécrétion de mucines [164]. Ces

données suggèrent que l’administration locale de corticoïdes ne diminue ni la synthèse ni la

75

sécrétion de mucines dans l’épithélium des voies aériennes et que le développement de

nouvelles thérapeutiques ciblant l’hypersécrétion de mucines est nécessaire.

L’expression et l’activation du récepteur de l’EGF sont impliquées dans la synthèse de

mucines dans l’épithélium des voies aériennes en réponse à des stimuli variés (voir Revue de

la Littérature) [165]. Nos données morphologiques et en culture cellulaire de cellules de

polypes suggèrent que la synthèse de la mucine MUC5AC dans l’épithélium des polypes soit

liée à l’activation du récepteur de l’EGF. Dans cette étude, nos données indiquent que le

traitement par un corticoïde intranasal n’a eu d’effet significatif ni sur l’expression du

récepteur de l’EGF ni sur l’expression de la mucine MUC5AC. Ces résultats sont concordants

avec les données montrant l’absence d’effet des corticoïdes inhalés sur l’expression du

récepteur de l’EGF dans l’épithélium bronchique de patients asthmatiques [78].

Le recrutement de polynucléaires éosinophiles et neutrophiles est retrouvé dans de

nombreuses maladies inflammatoires des voies aériennes s’accompagnant d’une

hypersécrétion de mucus [31]. Cette association entre la présence de cellules inflammatoires

et l’hypersécrétion de mucus a fait suggérer un rôle potentiel des cellules inflammatoires dans

la synthèse et la sécrétion de mucines par l’épithélium des voies aériennes. Les études

animales s’intéressant au rôle des éosinophiles dans l’hypersécrétion de mucines sont non

consensuelles. Cohn et coll. ont montré que l’hypersécrétion de mucus induite par le transfert

de cellules exprimant des cytokines de type Th2 chez des souris invalidées pour l’IL-5 (et

donc dépourvues d’éosinophiles dans les voies aériennes) par comparaison à des souris

normales était indépendante de la présence d’éosinophiles [93]. Cependant, Shen et coll. ont

montré que le transfert d’éosinophiles dans les voies aériennes de souris invalidées pour l’IL-

5 majorait l’hypersécrétion de mucus induite par une stimulation allergénique à l’ovalbumine

[166]. Dans notre étude, le traitement corticoïde a permis une diminution sensible du nombre

d’éosinophiles dans l’épithélium respiratoire sans modifier considérablement l’expression du

76

gène ou de la protéine MUC5AC, suggérant que la synthèse de mucines puisse survenir

indépendamment de la présence d’éosinophiles dans l’épithélium des polypes. De façon

notable, le recrutement de polynucléaires neutrophiles n’était pas diminué par le traitement

corticoïde et ces cellules pourraient contribuer à la synthèse et à la sécrétion des mucines.

En conclusion, cette étude montre qu’un traitement intranasal par la fluticasone à des doses

usuelles sur une période de 2 mois s’est accompagné d’une réduction significative de la taille

des polypes et de l’infiltration épithéliale par les polynucléaires éosinophiles. Cependant ce

traitement n’a pas modifié la synthèse de la mucine MUC5AC, l’expression du récepteur de

l’EGF et l’infiltration de l’épithélium par les polynucléaires neutrophiles. Ces données nous

conduisent à suggérer l’intérêt de tester des thérapeutiques ciblant le récepteur de l’EGF ou

inhibant le recrutement et l’activation des polynucléaires neutrophiles pour diminuer la

synthèse de mucines dans l’épithélium des voies aériennes.

77

4ème Partie : Conclusion générale et perspectives

1. Réalisation d’études cliniques ciblant l’hypersécrétion de mucines dans la polypose

naso-sinusienne

Nos études sur les polypes naso-sinusiens ont permis d’établir les éléments suivants:

• L’existence d’une hyperplasie des cellules productrices de mucine est associée à une

surexpression de la mucine MUC5AC dans l’épithélium des polypes naso-sinusiens.

• L’expression du récepteur de l’EGF dans l’épithélium de certains polypes a suggéré

un lien de causalité entre l’activation du récepteur de l’EGF et la synthèse de la

mucine MUC5AC.

• L’activation du récepteur de l’EGF par un de ses ligands, le TGF-α, provoque la

synthèse de la protéine MUC5AC dans des cultures primaires de cellules épithéliales

isolées à partir de polypes naso-sinusiens.

• Bien que les polynucléaires éosinophiles humains activés puissent provoquer la

synthèse de mucines par activation du récepteur de l’EGF in vitro, la diminution de

l’infiltration des polypes par les éosinophiles à l’aide un traitement corticoïde

intranasal ne s’accompagne pas d’un effet important sur la synthèse de mucine.

• Le traitement corticoïde intranasal n’affecte pas l’expression de la mucine MUC5AC.

De même, ni l’expression du récepteur de l’EGF et ni le recrutement de polynucléaires

neutrophiles dans l’épithélium des polypes ne sont influencés par les corticoïdes.

Ces données suggèrent que les corticoïdes, qui sont utilisés dans le traitement de nombreuses

pathologies bronchiques associées à une hypersécrétion de mucus sont peu efficaces pour

diminuer cette hypersécrétion. Nous suggérons l’intérêt de réaliser des études cliniques

humaines avec des inhibiteurs de la tyrosine kinase du récepteur de l’EGF dans les

pathologies associées à une hypersécrétion de mucus. Les molécules inhibant le recrutement

78

et/ou l’activation des polynucléaires neutrophiles pourraient également avoir un intérêt dans

ce contexte.

La réalisation d’études cliniques avec des molécules ciblant l’hypersécrétion de mucus dans

les maladies respiratoires humaines se heurte à de nombreux obstacles.

• Premièrement, l’absence de certitude quant au rôle exact des mucines dans l’altération

de la fonction ventilatoire dans les maladies respiratoires chroniques rend risqué le

choix de critères de jugement physiologiques (amélioration du VEMS….) pour

déterminer l’efficacité des ces molécules.

• Deuxièmement, comme nous l’avons discuté plus tôt, l’hypersécrétion de mucus ne

s’accompagne pas nécessairement de symptômes cliniques ; L’évaluation de

l’efficacité des traitements sur les modifications de la toux et de l’expectoration, des

critères classiquement considérés comme des marqueurs de l’hypersécrétion de

mucus, est non seulement peu précise mais également d’une pertinence discutable.

• Troisièmement, la mesure de la concentration de mucines dans l’expectoration ou le

lavage bronchoalvéolaire est de réalisation pratique difficile. Les mucines sont des

molécules de structure hétérogène et leurs propriétés viscoélastiques rendent difficile

leur purification [39]. De ce fait, la standardisation des méthodes de mesure est

complexe. De plus, la dégradation enzymatique (par des protéases ou des

glucosidases) des mucines dans les voies aériennes des patients atteints de pathologies

pulmonaires chroniques pourrait compliquer encore le problème. Par exemple, la

présence de fortes concentrations d’élastase neutrophile dans l’expectoration des

patients atteints de mucoviscidose pourrait expliquer la relative diminution des

concentrations de mucines mesurées dans les expectorations de ces patients [4][167].

La meilleure approche pour juger de l’efficacité des traitements ciblant l’hypersécrétion de

mucus pourrait être histologique. Ordonez et coll. ont montré la faisabilité de quantifier

79

l’expression des gènes (RT-PCR quantitative) et des protéines de mucines (analyse

morphométrique quantitative de colorations immunohistochimiques) sur des biopsies

bronchiques de patients ayant un asthme modéré [17]. Cette technique pourrait être utilisée en

pour juger de l’effet de molécules inhibant la synthèse de mucines. Nous suggérons que la

polypose naso-sinusienne, compte tenu de la localisation anatomique favorable des polypes

qui permet leur ablation de façon relativement non-invasive sous anesthésie locale, puisse

également permettre d’évaluer les nouvelles thérapeutiques ciblant l’hypersécrétion de mucus

lors d’essais cliniques chez l’homme. L’un des intérêts de cette approche est la possibilité

d’administrer les traitements par voie locale (intranasale) avec un minimum de passage

systémique des thérapeutiques et donc un risque d’effets secondaires plus modéré. La

diminution de l’hypersécrétion de mucines dans l’épithélium des polypes naso-sinusiens

pourrait s’accompagner d’une amélioration des symptômes de la maladie (rhinorrhée,

obstruction nasale) qui participent à l’altération de la qualité de vie dans cette pathologie. Il

faut par ailleurs noter qu’aucun traitement ne permet actuellement une efficacité complète

pour supprimer les polypes naso-sinusiens. Le récepteur de l’EGF est exprimé dans

l’épithélium des polypes mais aussi dans les cellules endothéliales des vaisseaux sous-

épithéliaux (donnée personnelle non publiée). L’un des effets des antagonistes du récepteur de

l’EGF pourrait être de diminuer la perméabilité vasculaire et l’hypervascularisation des

polypes conduisant à leur régression. Ces hypothèses pourront être testés lors des essais

cliniques programmés avec des antagonistes du récepteur de l’EGF dans la polypose naso-

sinusienne.

80

2. Apport des cultures primaires de cellules épithéliales de polypes naso-sinusiens à

l’étude de l’hypersécrétion de mucus des voies aériennes.

Lors de nos études sur les cellules épithéliales de polypes naso-sinusiens, nous avons établi

que ce modèle permet l’étude des mécanismes de la synthèse de mucine in vitro, sur un

épithélium non tumoral polarisé. Les applications de ce modèle sont multiples :

• La culture de cellules épithéliales de polypes peut être utilisée pour tester in vitro

l’efficacité de molécules ciblant la synthèse et/ou la sécrétion des mucines.

• Les mécanismes moléculaires de la synthèse de mucines ont été établis sur des

cultures de cellules tumorales et sur des cultures primaires non polarisées [122]. Ces

mécanismes font intervenir l’activation du récepteur de l’EGF par ses ligands. Les

cellules tumorales expriment à la fois les ligands et les récepteurs de l’EGF sur les

mêmes cellules, cette caractéristique étant importante dans l’acquisition du caractère

tumoral. Des données récentes indiquent une ségrégation entre les récepteurs HER et

leurs ligands entre le pôle apical et le pôle baso-latéral des cellules épithéliales [168].

Les implications de ces données sur la synthèse de mucines par l’épithélium non

tumoral polarisé des polypes naso-sinusiens sont en cours d’investigation dans notre

laboratoire.

• Certaines maladies génétiques de l’épithélium des voies aériennes (mucoviscidose et

dyskinésie ciliaire) sont associées à la fois à une hypersécrétion de mucus des voies

aériennes mais également au développement d’une polypose naso-sinusienne.

L’obtention de tissus bronchiques ou bronchiolaires et leur mise en culture est difficile

dans ces pathologies et les mécanismes de la synthèse de mucines dans des cultures

primaires polarisées dans ces pathologies ont été peu étudiés. Nous prévoyons

d’étudier les mécanismes de la synthèse de mucines dans la mucoviscidose et les

dyskinésies ciliaires à l’aide de ce modèle de culture.

81

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Nature 2003;422:322-6.

101

CURRICULUM VITAE

Docteur Pierre-Régis BURGEL 36 ans. Marié. Sans enfant.

Hôpital COCHIN, AP-HP

Service de Pneumologie (Pr D. Dusser) et UPRES EA 2511,

27, rue du Faubourg Saint-Jacques,

75679 Paris Cedex 14.

e-mail : pierre-regis.burgel@cch.aphp.fr

Téléphone : 01 58 41 23 71/23 49.

Fax : 01 46 33 82 53

ACTIVITES MEDICALES

1989 - 1994 : Premier et Deuxième Cycles des Etudes Médicales. Faculté René Descartes,

UFR Cochin - Port Royal.

1994 - 2002 : Troisième Cycle des Etudes Médicales. DES de Pneumologie.

Région Ile de France.

1997 - 1998 : Coopérant du Service National. Hôpital Principal, Dakar, Sénégal.

2002-2006 : Chef de Clinique Assistant, Service de Pneumologie, Hôpital COCHIN, Paris,

Professeur D. DUSSER.

Depuis Mai 2006 : Praticien Hospitalo-Universitaire. Service de Pneumologie, Hôpital

COCHIN, Paris, Professeur D. DUSSER. Avis en réanimation médicale et cardiologie.

Gardes de Senior en Réanimation Médicale depuis 2002 : Service de réanimation médicale, Pr

JF Dhainaut et Pr JP Mira.

ACTIVITES SCIENTIFIQUES

1994 : Maîtrise de Sciences Biologiques et Médicales : Biologie Moléculaire Certificat C1 : Biochimie Générale : Professeur LEROUX. UFR Necker.

Certificat C2 : Biologie Moléculaire : Professeur KAPLAN. UFR COCHIN - PORT ROYAL.

1999 – 2001 (Mobilité : 2an et ½) : Post-Doctorat : Laboratoire du Professeur J.A. NADEL

Cardiovascular Research Institute, University of California San Francisco, USA.

Sujet : Mécanismes de l'hypersécrétion bronchique : régulation de la différenciation de

l'épithélium bronchique en cellules à mucus par le récepteur de l'EGF.

Depuis Novembre 2002 : Laboratoire de physiologie respiratoire UPRES EA 2511 - Faculté

de Médecine Cochin - Port Royal : Etude des mécanismes de l'hypersécrétion de mucus dans

la mucoviscidose.

2003-2006 : Thèse de 3ème Cycle : Rôle des polynucléaires éosinophiles et du récepteur de

l’EGF dans la synthèse de mucines par l’épithélium respiratoire. Sous la direction des Pr J.A.

Nadel et D. Dusser. Soutenance Décembre 2006.

102

ACTIVITES D’ENSEIGNEMENT

Au sein de l’Université Paris-Descartes, Faculté de Médecine :

• Enseignement dans le Module 1 :

o Bronchopneumopathies chroniques obstructives.

o Coordinateur des enseignements : hémoptysies, dyspnée.

• Enseignement dans le module 11 : Dyspnées aiguës et chroniques.

• Enseignement à la Capacité d’Aide Médicale Urgente.

• Enseignement optionnel de médecine d’urgence (DCEM2) : les pneumopathies.

• Enseignement médical en odontologie (Pr Guillevin) : Asthme, BPCO,

pneumopathies.

Au sein de l’UPRES EA 2511 :

• Encadrement du DEA de David MONTANI (2003-2004)

• Encadrement du DEA de Clémence Martin (2004-2005). Co-direction (avec Dr I.

Fajac) de la Thèse de 3ème

cycle du Dr Clémence Martin.

• Encadrement du Master M2 de Sophie Danel (2005-2006).

BOURSES ET PRIX 2000 : Année Recherche (Assistance Publique - Hôpitaux de Paris).

2002 : Bourse d'étude et de recherche du Collège des Professeurs de Pneumologie.

2002, 2003, 2005 : Subvention du Comité Poix pour la recherche pneumologique.

PUBLICATIONS INTERNATIONALES

Burgel PR, Wagner T, Pesce F, Hubert D, Dusser D. Long term non-invasive ventilation in

adults with cystic fibrosis : a retrospective study. (Manuscrit en préparation).

Fauroux B, Burgel PR, Boelle PY, Murris-Espin

M, Nove-Josserand

R, Durieu I, Stremler I,

Derlich L, Giovanetti P, Cracowski C, Clément A for the Chronic Respiratory Insufficiency

Group of the French National Cystic Fibrosis Federation Practice of noninvasive ventilation

for cystic fibrosis: a nationwide survey in France. Am J Respir Crit Care Med 2006

(submitted)

Burgel PR, Montani D, Danel C, Dusser D, Nadel JA. A morphometric study of mucins and

small airway plugging in cystic fibrosis. Thorax 2006 (in press)

Finzi L, Barbu V, Burgel PR, Mergey M, Nordlinger B, Nadel JA, Housset C. Gallbladder

mucin hyperproduction is induced by the epidermal growth factor receptor pathway, a

potential pathogenic mechanism in gallstone disease. Am J Pathol 2006 (in press).

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Texereau J, Jamal D, Choukroun G, Burgel PR, Diehl JL, Rabbat A, Loirat P, Parrot A,

Duguet A, Coste J, Dusser D, Hubert D and Mira JP. Determinants of mortality for adults

with cystic fibrosis admitted in Intensive Care Unit: a multicenter study. Respir Research

2006; 7 : 14-24.

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outcome after severe pulmonary exacerbation in adults with cystic fibrosis. Am J Respir Crit

Care Med 2005;171:158-64.

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activating neutrophils. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2001;280:L134-40.

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PUBLICATIONS en Langue Française. Montani D, Burgel PR. Diagnostic de l’embolie pulmonaire chez les malades atteints de

cancers Réflexions en Médecine Oncologique 2006 (sous presse)

Mateus C, Burgel PR, Goldwasser F. Erlotinib et cancer pulmonaire non à petites cellules:

conditions d’observation de la réponse tumorale et traitement des signes cutanés. Réflexions

en Médecine Oncologique 2006

Burgel PR. Indications et choix de l’antibiothérapie d’une exacerbation de broncho-

pneumopathie chronique obstructive (BPCO). Médecine Maladie Inf 2006 (sous presse).

Burgel PR. La place des bronchodilatateurs dans la prise en charge de la BPCO en état stable.

Observatoire de la BPCO 2006 (sous presse).

Burgel PR. Récepteur de l’EGF et poumon : au-delà du cancer ! Réflexions en Médecine

Oncologique 2005 ; 2 (7) : 29-31.

Burgel PR. Biologie de la famille des récepteurs de l’EGF ! Réflexions en Médecine

Oncologique 2005 ; 2 (5) : 9-10.

Desmazes-Dufeu N, Hubert D, Burgel PR, Kanaan R, Dusser D. Déshydratation sévère,

conséquence de la canicule d’aout 2003 sur une cohorte d’adultes atteints de mucoviscidose.

Presse Med 2005; 34:647-648.

Burgel PR. Epidermal Growth Factor. Régulation de l’hypersécrétion bronchique de mucus ;

mécanismes et perspectives thérapeutiques. La lettre du pneumologue 2001. 6 : 249-251.

Hovette P, Camara P, Raphenon G, Soko TO, Burgel PR. Prévalence de la cryptococcose

neuroméningée au cours de l’infection VIH à Dakar. Presse med. 1999; 28 :741-742.

Hovette P, Burgel PR, Camara P, Sane M, Auregan G, Klotz F. La peste pulmonaire. Rev

Pneumol Clin. 1998;54:373-374.

Burgel PR, Camara P, Collet-Burgel C, Soko TO, Hovette P. L’intoxication au ditakh : une

intoxication tropicale méconnue. Presse Med 1998 ;27 :1528.

Hovette P, Burgel PR, Camara P, Barberet G, Dieme Y, Klotz F. Pneumopathie à borrelia :

une forme méconnue de borréliose. Presse Med 1998; 27:1219

Mbaye PS, Koffi N, Camara P, Burgel PR, Hovette P, Klotz F. Manifestations pleuro-

pulmonaires de l’amibiase. Rev Pneumol Clin. 1998;54:346-352.

Hovette P, Camara P, Burgel PR, Mbaye PS, Sane M, Klotz F. Manifestations pulmonaires

associées au paludisme. Rev Pneumol Clin. 1998;54:340-345.

105

Sociétés Savantes

Membre de la Fédération des CRCM (Société Française de la Mucoviscidose) depuis 2004.

Membre de l’European Respiratory Society depuis 2004.

Membre de la Société de Pneumologie de Langue Française depuis 2002.

Membre de la Société de Pneumologie d’Ile de France depuis 2002.

Activités Diverses

Expert bibliographe pour la “Conférence de Consensus pour la prise en charge des infections

respiratoires basses” Mars 2006

Investigateur principal du protocole MUCO-VNI: Etude multicentrique (11 centres) évaluant

l’intérêt de la ventilation non-invasive dans la prise en charge de l’insuffisance respiratoire

chronique de la mucoviscidose de l’adulte (depuis Juin 2005).

Membre élu pour 3 ans du Conseil Scientifique de la Fédération des CRCM (Société

Française de la Mucoviscidose, depuis Juin 2005).

Responsable du groupe de travail sur l’insuffisance respiratoire chronique de la Fédération

des CRCM (depuis Juin 2005).

Membre du groupe de travail sur la cancérologie thoracique du GHU ouest (depuis 2004).

Membre du comité de rédaction de la revue: Réflexion en Médecine Oncologique (depuis

2004).

Membre fondateur du Groupe Initiatives BPCO (visant à promouvoir des protocoles de

recherche multicentriques sur la BPCO) (depuis 2004).

106

RESUMES

Hypersécrétion de mucus dans l’épithélium respiratoire humain : rôles du récepteur de l’epidermal growth factor (EGF) et des polynucléaires éosinophiles

dans la synthèse de mucine par l’épithélium des polypes naso-sinusiens.

L’épithélium des voies aériennes est recouvert de mucus qui joue un rôle de protection

contre les agents pathogènes. La sécrétion excessive de mucus contribue à la pathogénie des

maladies bronchiques chroniques et de la polypose naso-sinusienne. L’activation du récepteur

de l’EGF provoque la synthèse des mucines, des constituants essentiels du mucus, sur des

modèles expérimentaux, mais l’existence de ce mécanisme en pathologie humaine n’est pas

démontrée. Le rôle des polynucléaires éosinophiles, qui sont présents en grand nombre dans

les polypes naso-sinusiens, dans la synthèse de mucines est controversé. Dans ce travail, nous

montrons que l’épithélium des polypes naso-sinusiens exprime la mucine MUC5AC et le

récepteur de l’EGF et que l’activation de ce récepteur par ses ligands provoque la synthèse de

mucine dans l’épithélium des polypes naso-sinusiens en culture primaire. Nos données

indiquent que les éosinophiles humains, isolés à partir du sang et activés in vitro, sécrètent des

molécules conduisant à l’activation du récepteur de l’EGF et à la synthèse de mucine par

l’épithélium. Les antagonistes du récepteur de l’EGF n’ayant pas d’autorisation d’utilisation

dans la polypose naso-sinusienne, nous avons testé l’effet des corticoïdes sur ces mécanismes

en étude clinique humaine. Les corticoïdes locaux diminuent la taille des polypes et

l’infiltration épithéliale par les polynucléaires éosinophiles mais n’ont pas d’effet sur

l’expression des mucines ou du récepteur de l’EGF. Les études présentées ouvrent la voie à la

réalisation d’essais cliniques avec des antagonistes du récepteur de l’EGF ciblant

l’hypersécrétion de mucus dans la polypose naso-sinusienne.

Mots clefs : épithélium respiratoire, mucine, MUC5AC, polypose naso-sinusienne,

hypersécrétion de mucus, EGF.

Mucus hypersecretion in human airway epithelium : Roles of epidermal growth factor (EGF) receptor and eosinophils

in mucin synthesis by nasal polyp epithelial cells

Airway epithelium is covered by a thin layer of mucus that plays a protective role against

inhaled pathogens. Mucous hypersecretion contributes to the pathophysiology of chronic

airway diseases including nasal polyposis. Activation of the EGF receptor induces mucin

production in experimental models but the relevance of this pathway to human diseases is

unknown. The potential role of eosinophils, which are recruited to nasal polyp epithelium, in

mucin synthesis is controversial. Here, we show that nasal polyp epithelium expresses mucin

MUC5AC and EGF receptors. Importantly, we show that activation of the EGF receptor by its

ligands induces mucin MUC5AC production in primary cultures of nasal polyp epithelial

cells. We also show that human eosinophils, isolated from peripheral blood and activated in

vitro, release products that induces activation of the EGF receptor leading to mucin synthesis.

Because EGF receptor inhibitors are not yet approved for use in subjects with nasal polyps,

we assessed the effects of corticosteroids on mucin and EGFR expression in a clinical study.

Intranasal steroids reduced polyp size and eosinophilic infiltration but had little effects on

mucin and EGF receptor expression. In conclusion, these studies suggest that EGF receptor

regulates mucin synthesis in polyp epithelium and that EGF receptors inhibitors could be

useful for targeting mucous hypersecretion in nasal polyps.

Keywords: airway epithelium, mucin, MUC5AC, nasal polyp, mucous hypersecretion, EGF.