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UNIVERSITE PARIS XII - VAL DE MARNE U.F.R. DE SCIENCES ET TECHNOLOGIES

THESE

pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PARIS XII

Discipline : Parasitologie

Présentée et soutenue par

Radu BLAGA

Le 12 mars 2007

Variabilité génétique et spatio-temporelle au sein du genre

Trichinella : étude dans une zone a forte endémicité

Jury

Pr Stéphane BRETAGNE : Université Paris XII, Créteil

Dr. Jacques CABARET : INRA, Tours

Pr Jean DUPOUY-CAMET : Universite Paris V, Paris

Dr. Stefan NICOLAE: ANSVSA, Bucarest, Roumanie

Pr Liu MINGYUAN : Jilin University, Changchun, China

Pr. Vasile COZMA : USMAV, Cluj-Napoca, Roumanie

Dr Pascal Boireau : UMR BIPAR, Maisons-Alfort

Président

Rapporteur

Rapporteur

Examinateur

Examinateur

Directeur de thèse

Directeur de thèse

1

lui Tio, Ana-zina si Sofia-ingerasa

1

Remerciements En tant que première thèse en cotutelle réalisée entre la France et la Roumanie au sein de

l’UMR BIPAR INRA-AFSSA-ENVA-UPVM et respectivement l’Université des Sciences

Agricoles et Médecine Vétérinaire de Cluj-Napoca, j’ai été amené à surmonter des

nombreuses et variées difficultés. Je n’aurais jamais pu les dépasser sans l’aide illimitée de

toutes les personnes que je tiens à remercier ci-après :

Monsieur Pascal Boireau pour m’avoir facilité la découverte du monde de la recherche et

favorisé ma formation scientifique, par ma thèse vétérinaire, mon DEA et enfin ma thèse

universitaire. Je tiens à le remercier très vivement pour m’avoir accueilli dans son laboratoire,

pour sa grande compétence à diriger cette thèse, ses judicieux conseils, sa gentillesse, son

enthousiasme. Merci d’avoir été un professeur de biologie moléculaire patient et très

enrichissant, toujours novateur.

Monsieur Vasile Cozma, qui a su encadrer cette thèse et qui m'a si souvent épaulé dans les

moments délicats et m'a conduit dans l'étude des parasites. Merci d’avoir été un professeur

patient et plein de bonne volonté. Qu'il trouve ici un bien faible témoignage de toute ma

reconnaissance.

Danielle Le Rhun, ma mère spirituelle, sans qui une partie de ce travail n’aurait pas été

réalisé, toujours d’excellents conseils et prête à tout. Merci pour votre présence, votre

soutien, votre si grande gentillesse et surtout pour votre dévouement sans limite…

Catherine Perret, Annie Alliot, Evelyne Le Naour, Patricia Bécret, Martine Cote, Elisabeth

Petit, qui m’ont très chaleureusement accueilli dans l’unité de Parasitologie, se sont toujours

montrées disponibles, pour leurs grandes compétences techniques, leur efficacité et leur

gentillesse.

Enfin, j'exprime ma profonde reconnaissance à tous mes collègues de l’unité qui m'ont si

chaleureusement accueilli et aidé, et m'ont permis de vivre avec enthousiasme ces cinq années

passées au laboratoire : René Chermette, Jacques Guillot, Bruno Polack, Geneviève

Marignac, Isabelle Vallée, Franck Le Guerhier, Muriel Vayssier-Taussat, Nadia Berkova,

Françoise Féménia, Dominique Huet, Céline Bahuon, Jean-François Fabien, Karine Lesage,

Audrey Glémarec, Pauline Macé, Aurélie Heckmann, Véronique Lainé-Prade, Hélène

Chevenotot, Martine Monteil, Adélaide Nieguitsila, Bernard Lemonnier.

Je tiens à exprimer ma grande reconnaissance à l’équipe de Parasitologie de la Faculté de

Médecine Vétérinaire de Cluj-Napoca qui a su m’aider à retrouver le chemin de

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l’administration et de la recherche en Roumanie. Je remercie tout particulièrement Monsieur

Calin Gherman auprès de qui j'ai acquis une grande part de mon expérience en parasitologie-

tout-terrain, pour son aide précieuse et amicale dans la collecte des échantillons et pour me

faire découvrir le plaisir de travailler en équipe.

Je remercie vivement Monsieur Ioan Dida, Mme Carmen Cretu, Mme Silvia Antoniu,

Monsieur Anton Stoichici et Monsieur Benoit Durand pour la collecte et l’interprétation des

données épidémiologiques. Sans leur aide une grande partie de cette thèse n’aurait pas existé.

Je voudrais également faire part de toute ma reconnaissance à l’équipe de Parasitologie de la

Faculté de Médecine Vétérinaire de Changchung : Lu Qiang, Li Lianrui, Wu Xiuping, Xia

Huiqing, Cui Guozhen, Deng Hongkuan, Sun Lei, Yang Zhidong. Je tiens à exprimer ma

grande reconnaissance toute particulièrement à Baoquan, mon demi-frère et sa femme Chen

Li, pour leur soutien permanent et leur patience.

Un merci particulier à Mme Guadalupe Ortega-Pierres et comandantos Romel pour leur

soutien et leur confiance en moi.

J'exprime ma profonde gratitude à la direction générale de l’AFSSA, et tout particulièrement

à la Direction de Programmation des Laboratoires pour m’avoir accordé toute leur confiance

en me finançant ma bourse de thèse. Je voudrais également faire part de toute ma

reconnaissance envers l’administration et tout particulièrement le rectorat de l’Université des

Sciences Agricoles et Médecine Vétérinaire de Cluj-Napoca pour toute leur compréhension

concernant les nombreux voyages et missions réalisés sur le terrain.

Que soient très vivement remerciés Monsieur S.Bretagne qui a très aimablement accepté la

présidence de notre jury, Monsieur J. Dupouy-Camet pour avoir pris en charge la difficile

tâche d'être rapporteur et Monsieur J.Cabaret qui nous a fait le grand honneur de se déplacer

pour assister à la présentation de notre travail et le juger. Mes remerciements les plus sincères

vont à Monsieur S.Nicolae, et Monsieur Liu Mingyuan qui ont également accepté de se

déplacer pour faire partie de notre jury. Et enfin, un grand merci à toute ma famille réunie, qui a été d’un soutien sans faille et d’une

grande compréhension.

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Table des matières REMERCIEMENTS ............................................................................................................................... 1

TABLE DES MATIÈRES....................................................................................................................... 3

INDEX DES TABLEAUX ET DES FIGURES ..................................................................................... 7

ABREVIATIONS ................................................................................................................................... 9

1. INTRODUCTION TRICHINELLA ET TRICHINELLOSE ............................................................. 11

A. TRICHINELLA ET TRICHINELLOSE : ETAT DES CONNAISSANCES ................................................... 13 1.1. Information historique.................................................................................................................... 17 1.2. Le genre Trichinella ....................................................................................................................... 17 1.3. Cycle parasitaire ............................................................................................................................. 21 1.4. Pathogénie ...................................................................................................................................... 23

1.4.1. Phase entérique............................................................................................................... 23 1.4.2. Phase circulante.............................................................................................................. 24 1.4.3. Phase musculaire ............................................................................................................ 24

1.5. Clinique .......................................................................................................................................... 27 1.6. Diagnostic....................................................................................................................................... 28

1.6.1. Diagnostic chez l’Homme .............................................................................................. 29 1.6.2. Problèmes posés par le diagnostic des trichinelloses animales ...................................... 30

1.6.2.1. Méthodes directes ................................................................................................... 30 1.6.2.2. La sérologie............................................................................................................. 31

1.7. Traitement ...................................................................................................................................... 32 1.8 Prévention et contrôle...................................................................................................................... 32

1.8.1. Réglementation des contrôles des viandes lors de l’abattage dans un pays membre de l’UE.......................................................................................................................................... 33 1.8.2. Réglementation concernant l’importation de viande de pays tiers................................. 34

B- TRICHINELLA ET TRICHINELLOSE : ÉPIDEMIOLOGIE ACTUELLE ................................................... 36 1.1. Cycles épidémiologiques................................................................................................................ 37

1.1.1. Le cycle domestique....................................................................................................... 38 1.1.2. Le cycle sauvage ............................................................................................................ 39

1.2. Répartition géographique actuelle de la trichinellose..................................................................... 41 1.2.1. Faune sauvage et domestique ......................................................................................... 41

1.2.1.1. Amérique du Nord .................................................................................................. 41 1.2.1.2. Amérique Latine ..................................................................................................... 42 1.2.1.3. Afrique .................................................................................................................... 44 1.2.1.4. Asie ......................................................................................................................... 45

1.2.1.4.1. Moyen Orient................................................................................................... 45 1.2.1.4.2. Sud-Est Asiatique ............................................................................................ 45 1.2.1.4.3. Extrême-Orient ................................................................................................ 46

1.2.1.5. Australie et Nouvelle Zélande................................................................................. 47 1.2.1.6. Europe..................................................................................................................... 47

1.2.2. La trichinellose humaine ................................................................................................ 52 1.2.3. La trichinellose en France et en Roumanie .................................................................... 54

1.2.3.1. En France ................................................................................................................ 54 1.2.3.2. En Roumanie........................................................................................................... 56

1.2.3.2.1. Animaux domestiques ..................................................................................... 57 1.2.3.2.2. Faune sauvage dans les départements de Transylvanie ................................... 57 1.2.3.2.3. Trichinellose humaine ..................................................................................... 59 1.2.3.2.4. Méthode de contrôle de la trichinellose porcine.............................................. 59 1.2.3.2.5. Espèces de Trichinella en Roumanie............................................................... 59

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C- TRICHINELLA ET TRICHINELLOSE: LE CAS DE TRICHINELLA PSEUDOSPIRALIS ............................ 60 1.1. Différences et similitudes dans la myopathie induit par T.pseudospiralis et T.spiralis ................. 62 1.2. Réponses cellulaires comparées de T.pseudospiralis et T.spiralis ................................................. 65 1.3. Protéines d’excrétion/sécrétion de T.pseudospiralis et de T.spiralis ............................................ 67 1.4. Expression différentielle de gènes chez T.pseudospiralis et T.spiralis .......................................... 70

2. OBJECTIFS ET STRATEGIE DE RECHERCHE........................................................................... 72

3. RESULTATS .................................................................................................................................... 78

I. VARIABILITE TEMPORELLE ET SPATIALE DE TRICHINELLA ........................................................ 80 1. DISPERSION DE TRICHINELLA DANS UNE REGION A FORTE ENDEMICITE .................................. 80

1.1. La découverte de la trichinellose, un aperçu sur l’histoire de la trichinellose en Roumanie (article 1) ............................................................................................................................................... 81 1.2. L’émergence de la trichinellose humaine en Roumanie (article 2) ................................................ 82 1.3. Le contexte actuelle de la trichinellose .......................................................................................... 84

1.3.1. Emergence de l’infestation à Trichinella et la trichinellose en Roumanie (article 3) .... 84 1.3.2. Analyse de la contamination des espèces animales sauvages et domestiques par Trichinella en Roumanie.......................................................................................................... 84

1.3.2.1. Faune sauvage (articles 4 et 5)................................................................................ 84 1.3.2.2. Animaux d’élevage ................................................................................................. 87

1.3.2.2.1. Le cheval.......................................................................................................... 87 1.3.2.2.1.1. La trichinellose d’origine chevaline (article 6) ........................................ 87

1.3.2.2.1.1.1. Enquête épidémiologique chez le cheval .......................................... 88 1.3.2.2.2. Le porc............................................................................................................. 88

ARTICLES « EPIDEMIOLOGIE DE LA TRICHINELLOSE EN ROUMANIE » (1-6) ................... 90

II. VARIABILITE GENETIQUE AU SEIN DU GENRE TRICHINELLA .................................................... 155 1. GENES CODANT POUR DES PROTEINES CONSERVEES DANS LE GENRE TRICHINELLA ............. 151

1.1. Clonage et analyse de l’expression de la Glutathion S Transferase de Trichinella (article 7) ..... 152 1.1.1. Détermination de la séquence nucléotidique d’une GST de T.spiralis ........................ 152 1.1.2. Analyse de la séquence nucléotidique de TsGST1....................................................... 153 1.1.3. Etude de la présence de la GST de T.spiralis au cours des différents stades de développement du parasite et chez les autres espèces............................................................ 156 1.1.4. Etude de la variabilité de la séquence de la GST chez T.nativa, T.britovi, et T.pseudospiralis ..................................................................................................................... 156 1.1.5. Peut-on utiliser TsGST24 comme antigène de diagnostic sérologique pour différencier les infestations par T spiralis de celle par T pseudospiralis ? ................................................ 158

1.1.5.1. La protéine exprimée en système procaryote est soluble...................................... 158 1.1.5.2. Analyse de l’antigénicité de TsGST24 ................................................................. 159 1.1.5.3.ELISA indirect ....................................................................................................... 159

1.2. Clonage et caractérisation d’une protéase à sérine ayant un double domaine catalytique (article 8)............................................................................................................................................................. 161

1.2.1. Le gène codant pour la SerP de T spiralis (Ts SerP) est en copie unique dans le génome de Trichinella.......................................................................................................................... 162 1.2.2. SerP est constitué par un double motif catalytique separé par un pont hydrophyle ..... 163 1.2.3. Cartographie des épitopes de SerP ............................................................................... 163

2. GENES VARIABLES DANS LE GENRE TRICHINELLA................................................................... 165 2.1. Analyse des gènes codant pour l’ARN ribosomal mitochondrial (article 9)................................ 166 2.1.1. Clonage et séquence des gènes codant pour les ARNr mitochondriaux de T nativa, T britovi, T

pseudospiralis...................................................................................................................................... 166 2.1.2. Développement d’un test de typage des espèces de Trichinella par une PCR multiplex................................................................................................................................................ 166

ARTICLES VARIABILITE GENETIQUE AU SEIN DU GENRE TRICHINELLA (7-9)................ 169

3. ETUDE DIFFERENTIELLE DU TRANSCRIPTOME DE DEUX ESPECES DE TRICHINELLA .............. 226 3.1. L’analyse de banques d’ADNc soustractive pour deux espèces du genre Trichinella ................ 226

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3.2. Analyse partielle d’une banque d’ESTs de T.pseudospiralis, comparaison avec la banque d’EST publiée de T.spiralis ............................................................................................................................ 228

4. DISCUSSION ................................................................................................................................. 235

1. EPIDEMIOLOGIE DE LA TRICHINELLOSE DANS UN PAYS DE L’EUROPE : LA ROUMANIE......... 237 1.1. La trichinellose humaine en Roumanie ........................................................................................ 237 1.2. L’infection à Trichinella chez les animaux domestique et la faune sauvage en Roumanie ......... 240

1.2.1. L’infection à Trichinella chez le porc, le sanglier et l’ours en Roumanie ................... 241 1.2.2. L’infection à Trichinella chez le cheval en Roumanie................................................. 243 1.2.3. L’infection à Trichinella dans la faune sauvage et l’identification des espèces de Trichinella sévissant en Roumanie......................................................................................... 245

1.3. Comparaison de l’incidence de la trichinellose humaine et la prévalence de l’infection à Trichinella chez les animaux en Roumanie......................................................................................... 247

2. EPIDEMIOLOGIE MOLECULAIRE DE LA TRICHINELLOSE ........................................................... 249 2.1. Les tests PCR utilisés pour le typage des espèces de Trichinella ................................................ 249 2 .2 Analyse comparative des différentes méthodes de typage moléculaire ....................................... 251 2.3. Limites actuelles du typage par PCR............................................................................................ 253

3. COMPARAISON TRICHINELLA SPIRALIS ET TRICHINELLA PSEUDOSPIRALIS .................................... 254 3.1 Analyse comparative des protéines hautement conservées ........................................................... 254

3.1.1. GST .............................................................................................................................. 254 3.1.2. TsSerP .......................................................................................................................... 257

3.2. Comparaison globale du transcriptome de T.spiralis et T.pseudospiralis.................................... 260 3.2.1. Méthode d’hybridation soustractive............................................................................. 260 3.2.2. ADNc-AFLP ................................................................................................................ 262 3.2.3. Le séquençage des banques d’ADNc ........................................................................... 262

5. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES.......................................................................................... 267

VALORISATION LISTE DES PUBLICATIONS ISSUES DE CE TRAVAIL..................................... 271

ANNEXE MATERIELS ET METHODES......................................................................................... 277

1. MATERIELS.................................................................................................................................. 279 1.1. Données epidemiologiques........................................................................................................... 279

1.1.1. Les cas de trichinelloses animales déclarés en Roumanie............................................ 279 1.1.2. Cas des trichinellose humaines déclarés en Roumanie ................................................ 279

1.2. Matériels biologiques ................................................................................................................... 279 1.2.1. Collecte des prélèvements biologique.......................................................................... 279

1.2.1.1. Muscle................................................................................................................... 279 1.2.2. Animaux de laboratoire ................................................................................................ 280 1.2.3. Souches de Trichinella ................................................................................................. 280 1.2.4. Vecteurs et souches bactériennes ................................................................................. 280 1.2.5. Amorces oligonucléotiques utilisées ............................................................................ 280

2.METHODES ................................................................................................................................... 283 2.1.Préparations du parasite et de l’antigène ....................................................................................... 283

2.1.1.Collecte des différents stades de Trichinella................................................................. 283 2.1.1.1.Purification des larves L1M................................................................................... 283 2.1.1.2.Purification des adultes .......................................................................................... 284 2.1.1.3.Purification des L1NN ........................................................................................... 284

2.1.2.Préparation des antigènes de T. spiralis ........................................................................ 284 2.1.2.1. Antigènes solubles ................................................................................................ 284 2.1.2.2. Antigènes Excrétion/Secrétion (E/S) .................................................................... 284

2.2.Préparation de sérums ................................................................................................................... 285 2.2.1.Collecte de sérums ........................................................................................................ 285 2.2.2.Préparation de sérums anti-Trichinella ......................................................................... 285 2.2.3.Obtention de sérums polyclonaux ................................................................................. 285

2.3.Méthodes d’extraction et d’analyse des acides nucléiques ........................................................... 286

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2.3.1. Extraction, purification et analyse des ARN ................................................................ 286 2.3.1.1..Extraction et purification des ARN totaux............................................................ 286 2.3.1.2.Purification de l’ARNm......................................................................................... 286 2.3.1.3.Migration de l’ARN en conditions dénaturantes et Northern blot ......................... 286

2.3.2.Extraction, purification et analyse de l’ADN................................................................ 287 2.3.2.1. Extraction de l’ADN génomique .......................................................................... 287 2.3.2.2.Extraction de l’ADN plasmidique.......................................................................... 287 2.3.2.3.Extraction de l’ADN avec des membranes DEAE cellulose ................................. 287 2.3.2.4. Digestion de l’ADN génomique et Technique de Southern blot .......................... 288 2.3.2.5.Préparation de sondes nucléiques .......................................................................... 288

2.3.2.5.1.Préparation de sondes d’ADN radioactives .................................................... 288 2.3.2.5.2. Préparation de sondes d’ADN marquées à la phosphatase alcaline .............. 289 2.3.2.5.3. Préparation de sondes d’ADN marquées à la digoxigénine .......................... 289

2.4.PCR et RT-PCR ............................................................................................................................ 289 2.5. Clonage d’un fragment d'ADN dans un vecteur plasmidique ...................................................... 290

2.5.1. Préparation du vecteur plasmidique et insertion d'ADN .............................................. 290 2.5.2. Ligature et transformation ........................................................................................... 290

2.5.2.1. Ligature ................................................................................................................. 290 2.5.2.2.Transformation des bactéries par un plasmide....................................................... 290

2.5.2.2.1.Méthode chimique .......................................................................................... 290 2.5.2.2.2.Electroporation ............................................................................................... 291

2.6. Construction de banques d’ADN complémentaires ..................................................................... 292 2.7. Identification des gènes spécifiques de T.pseudospiralis ............................................................. 294

2.7.1. Construction des banques d’ADNc soustractives des stades L1M T.spiralis vs

T.pseudospiralis et T.pseudospiralis vs T.spiralis ................................................................ 294 2.7.2. Criblage différentiel des banques d’ADNc soustractive de stades L1M de T. spiralis et T.pseudospiralis ..................................................................................................................... 295 2.7.3. Confirmation des spécificités d’espèces des clones issus des banques d'ADNc soustraites ............................................................................................................................... 295 2.7.4. Criblage des banques d’ADNc de T. pseudospiralis à l'aide de sondes nucléiques..... 295

2.9. Analyses des séquences nucléotidiques et des séquences déduites en acides aminés .................. 297 2.10. Méthodes d'analyse des protéines............................................................................................... 297

2.10.1. Expression procaryote et purification d’antigènes recombinants............................... 297 2.10.2. Analyse par transfert de Western des antigènes recombinants................................... 297 2.10.3. Immunofluorescence indirecte ................................................................................... 298 2.10.4. Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay (ELISA)................................................... 298

2.10.4.1. ELISA utilisant l’antigène E/S des L1M de Trichinella ou des protéines de recombinantes .................................................................................................................... 298

REFERENCES.................................................................................................................................... 300

Abstract ............................................................................................................................................... 333

7

Index des Tableaux et des Figures

Tableaux Page

Tableau 1: Différentes espèces ou génotypes dans le genre Trichinella ; caractéristiques principales et répartition géographique Tableau 2: Cas humains de trichinellose en Europe, liés à la consommation de viande de cheval crue ou peu cuite (d’après (Pozio and Zarlenga, 2005). Tableau 3: Principales données épidémiologiques de la trichinellose animale en Europe Tableau 4: Epidémies des trichinellose en France, répertorié par la source d’infestation Tableau 5: Les différents gènes codants pour des protéines d’E/S chez T.pseudospiralis et leurs homologues chez T.spiralis Tableau 6 Incidence relative du nombre de cas de trichinellose en Roumanie pour la période 1963-1968. Tableau 7: Incidence cumulée de la trichinellose en Roumanie pour la période l980–1989 et 1990–2004. Tableau 8: Liste des espèces hôtes collectés en Roumanie sur une période de 4 ans (2000-5) et typage des espèces infestantes Tableau 9: Amplifications de l’ADN génomique et de l’ADNc à l’aide de différents couples d’amorce chevauchant la séquence SerP. Tableau 10: Les contigs les plus abondantes en transcrits de la banque d’ADN complémentaire de larves musculaire de T.pseudospiralis Tableau 11: Tableau des différentes espèces de Trichinella utilisées Tableau 12: Vecteurs et souches bactériennes utilisés Tableau 13: Liste des oligonucléotides utilisés et leurs applications

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Figures Figure 1: Distribution géographique actuelle des espèces de Trichinella dans le monde Figure 2: Cycle parasitaire de Trichinella spiralis (Despommier et al, 2000) Figure 3a: stade adulte de T. spiralis. 3b: stade adulte de T. spiralis collecté de l’intestion de souris 4 jours aprés infestation (grossissement 80X) Figure 4a: stade adulte femelle de T. spiralis, 3 mm x 36 µm, les larves L1NN sont visibles dans l’utérus; 4b: stade adulte mâle de T. spiralis, l’appendice caudal est caractéristique, 1.5 mm x 36 µm. (Despommier et al, 2000) Figure 5: Purification de L1NN de T. spiralis collectées après mise en survie pendant 24h des adultes collectés au jour 5 après infestation, dans du milieu de culture Figure 6a: Stade infectieux de T. spiralis: larves L1M encapsulées. La cellule mourricière est bien visible; 6b: L1M T. spiralis collectées après digestion chlorhydropepsique de muscles infestés. Le parasite mesure 1 mm x 36 µm Figure 7: Diagramme montrant la durée et l’intensité des signes cliniques de la trichinellose chez l’homme (Despommier et al, 2000). Figure 8: Le nombre des porcs positifs (A) et le taux de l’infestation à Trichinella chez le porc domestique (B) en Roumanie entre 1990-2003

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Figure 9: Le nombre des cas humains de trichinellose en Roumanie entre 1990-2003 Figure 10 : Section histologique dans le muscle de la souris à 23 jours post infestation avec T.spiralis (A) et T.pseudospiralis (B). Une infiltration cellulaire massive peut être observé inter-fibrillaire et autour de la larve de T.spiralis, réponse cellulaire absente pour T.pseudospiralis ) Figure 11: Taux d’incidence cumulée des cas de trichinellose en Roumanie pour deux périodes : 1980-1989 et 1990-2004 (cas pour 1million d’habitants/an) Figure 12: Distribution des prélèvements des animaux infectés par Trichinella en Roumanie. Figure 13: Répartition des cas d’infestation animale par Trichinella en Roumanie en 2003 Figure 14: Séquence nucléotidique de tsgst24 et séquence en acides aminés déduits de TsGST24. Figure 15: Profil d’hydrophobicité de la séquence en acides aminés déduite de TsGST24, selon l’échelle de Kyte-Doolittle Figure 16: Résultats du logiciel SignalP pour la recherche de la présence d’un peptide signal dans la séquence déduite en acides aminés de la GST putative de T.spiralis Figure 17: PCR sur les ADNc des différents stades de développement de T.spiralis et d’autres espèces. Figure 18: Comparaison des séquences en acides aminés (aa) des GSTs de T.britovi, T.nativa, T.spiralis, T pseudopsiralis Figure 19: Résultats de l’expression et solubilité de la GST24 de T.spiralis. Figure 20: Purification de la GST de T.spiralis, TsGST1 Figure 21: Cinétiques d’anticorps spécifique anti TsGST24 chez des porcs expérimentalement infestés par T spiralis Figure 22: Cartographie d’épitopes du domaine de jonction de la protéine Ts SerP Figure 23: Electrophorèse des produits de PCR multiplex pour 24 isolats de Trichinella Figure 24: Electrophorèse des produits de PCR multiplex sur l’ARN mitochondrial pour différents génotypes de Trichinella. Figure 25: Criblage différentiel des colonies (I-P) issues de la banque soustractive de T.pseudospiralis

Figure 26: Les contigs issus de la banque d’ADNc des larves nouveau-nées de T.pseudospiralis, classifié en fonction de leur activité et fonction Figure 27a Venn diagram montrant les groupes de séquence issue du séquençage de fragment d’ADNc de T. spiralis. La majorité des contigs obtenus sont présents à un seul stade parasitaire en apparence (Mitreva et al, 2004) ; 27b: Diagramme représentant les clones d’ADNc identifiés par analyse de la banque soustraite. La majorité des clones ne sont pas spécifiques d’un seul stade parasitaire Figure 28: Description simplifiée de l’hybridation soustractive (SSH)

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269 300

9

Abréviations Ad Trichine de stade adulte Ad3 Trichine de stade adulte 3 jours après infection Ad5 Trichine de stade adulte 5 jours après infection ADN acide désoxyribonucléique ADNc acide désoxyribonucléique complémentaire d’un acide ribonucléique ADNg acide désoxyribonucléique génomique Ag antigéne ARNm acide ribonucléique messager ARNr acide ribonucléique ribosomique ARNt acide ribonucléique de transfert dCTP 2’ desoxycytidine 5’-triphosphate dNTP 2’-desoxyribonucléoside 5’-triphosphate ELISA enzym linked immuno sorbant assay E/S excretion-sécrétion IgA, IgE, IgG, IgM immunoglobulines A, E, G, M IPTG Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside kb kilobases kDa kilodaltons L1 larve de 1er stade de croissance L2 larve de 2ème stade de croissance L3 larve de 3ème stade de croissance L4 larve de 4ème stade de croissance L1M trichine de stade larvaire L1 musculaire L1NN trichine de stade larvaire L1 nouveau-né pb paire de base PBS phosphate buffer saline PCR polymérase chain reaction RT-PCR reverse transcriptase polymérase chain reaction SDS sodium dodecyl sulfate SSH Hybridation soustractive Taq polymérase Thermus acquaticus polymérase

TSL-1 Antigène du groupe 1 de stade larvaire de T. spiralis T.T1 Trichinella spiralis

T.T2 Trichinella nativa

T.T3 Trichinella britovi

T.T4 Trichinella pseudospiralis

T.T5, T.T6, T8 et T9

Trichinella murrelli

Trichinella T6, T8 et T9 T.T7 Trichinella nelsoni

T.T10 Trichinella papuae

T.T11 Trichinella zimbabwensis

UV ultra violets X-gal 5-bromo-4-chloro-indoyl-β-D-galactoside

11

1. INTRODUCTION

Trichinella et trichinellose

13

A. Trichinella et trichinellose :

Etat des connaissances

15

La trichinellose est une zoonose provoquée par la consommation de viande crue ou peu

cuite d’animaux (mammifères essentiellement) infestés par des larves du nématode

Trichinella. Cette zoonose est de répartition mondiale et est très directement liée à des

habitudes culinaires et alimentaires. La trichinellose humaine est une maladie régulièrement

émergente/ré-émergente dans différentes parties du monde (Dupouy-Camet, 2000; Murrell

and Pozio, 2000; Pozio, 2001a). Une étude récente estime à 11 millions le nombre de

personnes contaminées sur les différents continents (Dupouy-Camet, 2000). Trichinella est un

nématode parasite singulier puisque c’est le seul à être pluricellulaire et à avoir un

développement intracellulaire strict chez l’animal.

Trichinella spp. est un nématode parasite de vertébrés utilisant une niche particulière qu’est

la cellule musculaire. Le genre appartient à l’ordre des Trichocephalida plus étroitement

apparentés aux Trichuris trichiura et Capillaria spp. Onze espèces/génotypes ont été décrits

dans le genre Trichinella selon leur distribution géographique, leurs propriétés biologiques,

leur morphologie et différents marqueurs génétiques: Trichinella spiralis, T. nativa, T. britovi,

T. pseudospiralis, T. murrelli, T. nelsoni, T. papuae, T. zimbabwensis, T6, T8 et T9 (Pozio,

2001a; Zarlenga et al., 1999). La maladie générée par Trichinella est traduite par le terme

général de trichinellose. Les infections humaines sont principalement provoquées par T.

spiralis, puis T. nativa et T. britovi (Capo and Despommier, 1996; Moorhead et al., 1999).

Les porcs domestiques demeurent la principale source de transmission du parasite à

l’homme au niveau mondial mais le véritable réservoir semble représenté par les carnivores

sauvages. La prévalence de la trichinellose porcine est très inégale d’un continent à un autre.

La prévalence est particulièrement élevée en Europe de l’Est, en Asie, en Asie du Sud Est, au

Mexique. La Roumanie est considérée comme un pays endémique (Cuperlovic et al., 2005).

Aucune infection n’a été rapportée au Puerto Rico ou en Australie. Une nouvelle espèce, T.

papuae, plus apparentée par ses caractéristiques biologiques à T. pseudospiralis, a été décrite

récemment et a été isolée chez le porc domestique ou sauvage de Papouasie Nouvelle Guinée

(Pozio et al., 1999b).

Trichinella spp. infeste virtuellement tous les ordres des mammifères. Trichinella avec

Toxoplasma représentent les parasites les plus répandus sur la planète. Cependant, cette

répartition mondiale ne doit pas faire oublier une certaine spécificité d’espèces hôtes au sein

du genre Trichinella. Le réservoir principal de T. nativa est constitué par l’ours polaire et les

morses (MacLean et al., 1992). T. britovi très présente en Europe est une autre espèce

sylvatique principalement inféodée au renard, chat sauvage et au loup. T. nelsoni sévit en

Afrique Equatoriale et est présente chez la hyène et les grands carnivores africains (Pozio et

16

al., 1991). Le comportement charognard ou détritivore favorise la transmission de la

trichinellose au sein de la faune sauvage ou domestique (Figure 1 et tableau 1).

17

1.1. Information historique

La description de Trichinella spiralis et la découverte de son cycle parasitaire datent

du dix-neuvième siècle: en 1835, James Paget, jeune étudiant en médecine à l’hôpital Saint

Bartholomew de Londres découvre au cours d’une séance de dissection des petits grains

blancs dans la chair d’un cadavre. Il décide de les étudier au microscope et observe des vers à

l’intérieur. Richard Owen publie la description du parasite comme une nouvelle espèce qu’il

nomme Trichina spiralis (Campbell, 1983b). En 1895, Railliet, constatant que le nom de

Trichina était déjà attribué à un genre d’insecte, proposa le nom de Trichinella. La découverte

la plus ancienne de capsules de Trichinella remonte à 1200 ans avant JC, et fut faite

rétrospectivement en 1974 dans le muscle intercostal d’une momie égyptienne (Millet et al.,

1980). C’est en 1860 que des expérimentations mettent en évidence la pathogénicité et le

pouvoir létal du parasite ainsi que la transmission de la maladie à l’homme par ingestion de

viande de porc contaminée (Zenker, 1860). Les signes cliniques de la trichinellose sont alors

connus ce qui permet de décrire de nombreux cas aux Etats-Unis, en Irlande, en Grande

Bretagne et en Allemagne. A la fin du dix-neuvième siècle de fréquentes contaminations

humaines incriminant des viandes américaines sont constatées en France déclenchant une

intensification des contrôles par trichinoscopie (Chatin, 1883). En Espagne, la trichinellose est

à l’origine de l’organisation des services vétérinaires au début du siècle.

Le premier cas de trichinellose humaine et porcine, en Roumanie, a été diagnostiqué en 1868

(Scheiber, 1869). A Iassy, pendant l’hiver du 1874, dans une famille mixte allemande-

polonaise suite à un repas de saucissons crues et fumés, provenant d’un porc non-contrôlé, il y

a eu lieu la première épidémie de trichinellose a été decrite. Des six personnes qui ont

consommé la viande de porc non-contrôlée, trois sont décédées dans les semaines suivantes.

Les cas humains n’ont pas cessé de croître en nombre et gravité de forme clinique par la

suite, ce qui a imposé à partir du 1912 le contrôle obligatoire des porcs abattus dans l’abattoir

de Bucarest, et plus tard (1960) dans tous les abattoirs de Roumanie.

1.2. Le genre Trichinella

Les espèces du genre Trichinella appartiennent au phylum des nématodes. Ce sont des vers

de forme cylindrique vivipares, ayant un pseudocoelome, un tube digestif individualisé et des

18

sexes séparés. Trichinella appartient à la classe des Enoplea, l’ordre des Trichocephalida et la

famille des Trichinellidae.

Jusqu’en 1972, Trichinella spiralis était la seule espèce du genre. Aujourd’hui pas moins

de 8 espèces et 3 génotypes constituent le genre (Kapel, 2000b; La Rosa et al., 2001; Murrell

et al., 2000; Pozio et al., 2002a) (tableau 1). L’identification de l’espèce est de grande

importance pour suivre les sources de contamination d’une infection et pour déterminer le

pronostic de l’infection clinique. Seules les méthodes PCR offrent la possibilité de

différencier dans des conditions de routine les différentes espèces du genre (Pozio and La

Rosa, 2003; Wu et al., 1999a; Zarlenga et al., 1999).

Les espèces du genre Trichinella sont largement réparties sur tous les continents des zones

froides aux zones torrides (Figure 1). T. spiralis (T1) est distribuée essentiellement dans les

zones tempérées et est plus étroitement associée au porc domestique. Sa répartition est

mondiale. T. nativa (T2) et probablement la sous-espèce T6, rencontrée dans la partie Nord du

continent américain, sont associées à un climat froid (isotherme janvier <8°C). Son pouvoir

infectieux est limité chez le porc et est nul chez le rat, mais elle est couramment rencontrée

chez les carnivores sauvages, les ursidés et les morses. T. nativa présente des résistances à la

congélation très élevée (-30°C pendant plusieurs semaines/mois). T. britovi (T3) est

rencontrée principalement chez les carnivores sauvages bien que l’espèce puisse être

rencontrée chez les porcs, sangliers et chevaux. L’espèce se rencontre principalement dans les

régions tempérées d’Europe, d’Asie et a été identifié récemment en Afrique. T. britovi est

apparentée aux génotypes T8 rencontrés en Afrique et T9 identifiés au Japon. L’espèce T.

britovi présente une certaine résistance à la congélation, une infectivité modérée vis à vis de

l’espèce porcine et la formation d’une capsule moins épaisse que celle de T. spiralis. T.

murrelli (T5) est isolée en Amérique du Nord, particulièrement dans la faune sauvage, et

occasionnellement chez le cheval et l’homme. Son pouvoir infectieux chez le porc est limité

mais cette espèce a été responsable de nombreux cas humains particulièrement suite à la

consommation d’une carcasse de cheval infecté importée en France (Boireau et al., 2000). T.

nelsoni (T7) a été isolée sporadiquement de la faune sauvage en Afrique. L’espèce se

caractérise par uneforte résistance à la putréfaction à des températures élevées (>40°C). Trois

espèces du genre ne forment pas de capsule épaisse de collagène à la périphérie de la cellule

nourricière : 1. T. pseudospiralis (T4) est cosmopolite et a été isolée d’oiseaux carnivores, de

carnivores/omnivores sauvages, rats et marsupiaux sur différents continents (Europe, Asie,

Amérique) ; 2. T. papuae (T10) a été rencontrée uniquement en Papouasie Nouvelle Guinée ;

elle ne résiste pas à la congélation, presente un pouvoir infectieux modéré pour le porc et a été

19

rencontrée chez différents carnivores ; 3. T. zimbabwensis (T11) a été identifiée chez des

crocodiles élevés dans des fermes au Zimbabwe. Cette espèce peut infester les porcs, les rats

et les reptiles mais aucun cas humain n’a été décrit.

Espèce/génotype Répartition géographique

Hôtes principaux Résistance, caractéristiques de la

capsule dans les muscles

T. spiralis T.T1 Cosmopolite Porc, animaux sauvages

Faible résistance à la congélation

T. nativa T.T2 Région arctique et subarctique

Faune sauvage (carnivores) sauf rat

Résistance élevée à la congélation

(jusqu’à –30°C plusieurs mois)

T. britovi T.T3 Région paléarctique Animaux sauvages et domestiques en contact

Résistance modérée à la congélation (jusqu’à –4-5°C)

T. pseudospiralis T.T4

Cosmopolite Oiseaux et mammifères

Pas de résistance à la congélation Pas de capsule épaisse

T. murrelli T.T5 Région néarctique Animaux sauvages Résistance modérée à la congélation

T. nelsoni T.T7 Aire équatoriale africaine Animaux sauvages Tolérance à des températures élevées

T. papuae T.T10 Papouasie Nouvelle Guinée

Porc et sanglier Pas de résistance à la congélation

Pas de capsule épaisse

T. zimbabwensis T.T11

Zimbabwe Reptiles et mammifères

Pas de résistance à la congélation

Pas de capsule épaisse

T.T6 Région néarctique Animaux sauvages Résistance élevée à la congélation

T.T8 Aire subtropicale de la région éthiopienne

Carnivores et omnivores sauvages

Résistance aux températures élevées

T.T9 Japon Animaux sauvages Résistance modérée à la congélation

Tableau 1: Différentes espèces ou génotypes dans le genre Trichinella; caractéristiques

principales et repartition géographique.

20

Figure 1: Distribution géographiquFigure 2e actuelle des especes de Trichinella dans le monde:

Figure 1: Distribution géographique actuelle des espèces de Trichinella dans le monde : T.spiralis, T.nativa, T.britovi,

T pseudospiralis, T.murelli, T.nelsoni, T.papuae , T.zimbabwensis, T.6 , T.8, T9, probablement T.spiralis.

La ligne de démarcation rouge représente l’isotherme de -6°C en Janvier (d’apres Pozio et Zarlenga, 2005).

-6°C -6°C

21

1.3. Cycle parasitaire

L’infestation débute par l’ingestion de viande crue ou faiblement cuite contenant le parasite

encapuslé dans sa cellule nourricière. Le stade larve L1 musculaire (L1M) de Trichinella est

libéré sous l’action des enzymes digestives de l’estomac et de la partie proximale du tube

digestif. La partie externe de la cuticule (épicuticule) est altérée par les conditions de lyse

alcaline et par les enzymes digestives pancréatiques (Stewart et al., 1987), et permet aux

parasites libres de percevoir les marqueurs environnementaux et de discerner sa localisation

dans l’hôte soit, à ce stade, le cytoplasme de la cellule intestinale. Les parasites immatures

sont stimulés par des facteurs inconnus pour pénétrer dans l’épithélium à la base des villosités

(Wright, 1979). Le parasite se maintient dans une rangée de cellules compte tenu de sa taille.

Il va générer des tunnels dans l’épithélium au cours de sa migration à la recherche d’un

partenaire.

Les larves subissent quatre mues dans les 30 h suivant l’invasion de l’épithélium intestinal.

Les femelles mesurent jusqu’à 3,5 mm de longueur et ont un diamètre de 36 µm, alors que les

mâles sont légèrement plus courts (entre 1,0 et 1,5 mm) et ont un diamètre semblable à celui

des femelles (Despommier and Campbell, 1981) . Les accouplements se produisent dans les 3

jours suivant l’infestation et les premières larves L1 nouveau-nées (L1NN) sont émises dans

les 24 h suivant la fécondation.

Le stade L1NN mesure 0.08 mm de long et 7 µm de diamètre. Les femelles peuvent

expulser des L1NN pendant plusieurs jours surtout si aucune immunité locale protectrice ne

s’installe (exemple chez la souris nude).

Les L1NN possèdent un stylet localisé à proximité de la cavité buccale. Ce stylet est utilisé

pour pénétrer la lamina propria, puis la paroi des capillaires mésentériques ou les capillaires

lymphatiques et la cellule musculaire striée hôte. La plupart des L1NN parviennent, quelques

heures après leur émission, dans la circulation sanguine. C’est le seul stade parasitaire “libre”

non présent dans le cytoplasme d’une cellule. Les L1NN sont distribuées dans toute la

musculature striée de l’hôte par la circulation sanguine. Les muscles les plus irrigués sont

généralement les plus infestés. Les L1NN pénètrent dans une cellule musculaire striée après

avoir accompli une maturation et une croissance de 20 à 30%. Les larves L1NN ont un

tropisme remarquable pour les cellules musculaires striées et pratiquement 100% des larves

trouveront leur niche si l’hôte n’est pas immunisé. La cellule musculaire striée pénétrée par

une L1NN va subir une transformation programmée au cours des jours suivant l’invasion

(Figure 2).

22

Une cellule nourricière est construite au profit du parasite avec une perte totale de la

différenciation de la cellule musculaire striée. Le couple « parasite/cellule nourricière » peut

rester stable pendant des années. Le processus d’élaboration de la cellule nourricière dure

environ 20 jours (Despommier, 1975), ensuite un processus plus lent de synthèse progressive

de collagène va se réaliser pendant des mois générant ainsi des capsules épaisses de plusieurs

microns. Chez la souris, la larve L1M nécessite un développement d’une vingtaine de jours

Libération des L1M par la digestion pepsique

Pénétration des L1M dans les entérocytes

Accouplement libération des L1NN

Pénétration dans une fibre musculaire striée de L1NN

Altération des capillaires cardiaques ou cérébraux lors d’infestation massive

Développement de la cellule nourricière

Cellule nourricière mature

Figure 2: Cycle parasitaire de Trichinella spiralis (Despommier et al., 2000)

23

dans la cellule infectée avant d’être infectieuse pour un nouvel hôte. Chez le porc le

développement de la cellule nourricière est légèrement plus rapide assurant une infectivité des

L1M dès les 16ème-17ème jours après infestation. Quelques larves L1NN peuvent se

retrouver dans des tissus en position ectopique et vont dégénérer. Lors d’infestation massive

(plusieurs dizaines de milliers de L1M ingérées en une seule fois) la quantité des L1NN est

telle que des embols cérébraux gravissimes peuveut survenir.

1.4. Pathogénie

1.4.1. Phase entérique

La phase intestinale comprend tous les stades parasitaires: L1M, L2, L3, L4, adultes et

L1NN. L’épithélium intestinal est lésé après le passage des nombreux parasites se déplaçant

dans l’épithélium. Au cours de son passage à travers l’épithélium intestinal Trichinella libère

des antigènes provenant de sécrétions spécifiques ou des mues (Castro and Bullock, 1983)

(Figure 3 et Figure 4).

Quand les L1NN pénètrent dans la circulation sanguine des facteurs phlogogènes sont

libérés entraînant généralement une fièvre intense. Les infections bactériennes consécutives

ne sont pas décrites puisque le contenu intestinal de Trichinella est stérile et il y a peu de

contact entre le parasite et la flore intestinale. L’impact du parasite sur le tube digestif est très

variable d’un hôte à l’autre. Chez le rat le parasite va généralement déclencher une réaction

immune intestinale précoce de type hypersensibilité. Trichinella est expulsé du tube digestif

très rapidement et aucun adulte ne subsiste dans le tube digestif au-delà de 2 semaines. En

revanche, chez le porc Trichinella peut persister pendant plusieurs semaines et très peu de

marqueurs cellulaires locaux peuvent être mis en évidence (Castro and Bullock, 1983).

24

Chez les rongeurs ayant un statut immunitaire défini, le nombre de larves produites dépend de

la capacité à induire précocement une réponse immunitaire de type Th2 (Bell, 1998;

Despommier, 1983). Les interleukines ainsi que la production d’éosinophiles ou d’IgE

apparaissent comme des facteurs essentiels pour bloquer le passage des L1NN dans la

circulation sanguine (Finkelman et al., 1997; Lawrence et al., 1998; Stewart et al., 1999).

1.4.2. Phase circulante

La circulation des L1NN dans le flux sanguin peut durer plusieurs jours en fonction de

divers facteurs liés au parasite lui même, à l’espèce hôte et à son état immunitaire. Ainsi, chez

le cheval les L1NN peuvent circuler pendant plusieurs semaines, de même que chez le porc.

La durée de cette circulation est étroitement liée à la rémanence des adultes au niveau de la

muqueuse intestinale (Figure 5).

1.4.3. Phase musculaire

L’originalité du cycle de Trichinella consiste à développer un lien particulier avec la

cellule musculaire striée. Le complexe cellule musculaire dédifférenciée-parasite constitue la

véritable forme de résistance du parasite aux conditions extrêmes: congélation, putréfaction,

températures élevées (Figure 6).

La formation de la cellule nourricière a été étudiée par la réalisation d’infestation

synchrones chez la souris (Despommier et al., 1975). Ce complexe est caractérisé par une

suite graduelle de réarrangements permettant la croissance du parasite et sa nutrition. Les

Figure 5: Purification de L1NN de T. spiralis collectées après mise en survie pendant 24 h des adultes collectés au jour 5 après infestation, dans du milieu de culture (image obtenu au laboratoire).

25

myofilaments et les autres structures apparentées au tissu musculaire sont remplacés pendant

les 15 premiers jours de l’invasion cellulaire par le réticulum endoplasmique et des

mitochondries. Les noyaux sont élargis et leur nombre est réduit (Despommier et al., 1991).

Une surexpression du collagène de type IV et de type VI est détectable au niveau de la

synthèse d’ARNm spécifique et par une coloration avec des anticorps. La synthèse de

collagène est impliquée dans l’élaboration de la capsule (Polvere et al., 1997).

Une angiogènèse termine le processus de dédifférenciation et est initiée par la synthèse de

VEGF (vascular endothelial growth factor) commençant au jour 7 après la pénétration dans la

cellule musculaire (Capo et al., 1998). Un fin réseau de capillaires (veinule et artériole)

entoure alors la cellule nourricière achevée. La formation de la cellule nourricière est induite

par des secrétions du parasite qui émanent du stichosome (Despommier, 1998). Le stichosome

est un organe spécifique de Trichinella constitué d’une rangée de stichocytes, chacun d’entre

eux contient des granules sécrétoires d’un certain type morphologique. Il existe au moins 5

types distincts de stichocytes (Takahashi and Araki, 1991) en fonction de l’importance plus

ou moins grande de telle ou telle granule sécrétoire. Plusieurs protéines sont sécrétées dans le

cytoplasme de la cellule nourricière (Despommier, 1998). Certaines de ces protéines sont

retrouvées dans les noyaux de la cellule hôte et semblent persister pendant la durée de

l’infection (Despommier et al., 1990). Les glycoprotéines porteuses du sucre spécifique béta

tyvélose seraient impliquées comme facteur nucléaire (Despommier, 1998). Cependant aucun

de ces facteurs n’a été caractérisé avec certitudes à ce jour.

Les larves circulantes ont une spécificité élective vis-à-vis du tissu musculaire et les

dommages cardiaques ou cérébraux ne résultent que des agregats parasitaires générés par

a b Figure 6a: Stade infectieux de T. spiralis: larves L1M encapsulées. La cellule mourricière est

bien visible; 6b: L1M T. spiralis collectées après digestion chlorhydropepsique de muscles infestés. Le parasite mesure 1 mm x 36 µm. (image obtenu au laboratoire)

26

l’accumulation de larves L1NN dans les capillaires et la réaction inflammatoire avec

l’endothélium des vaiseaux. La nature de la spécificité tissulaire n’est pas connue. Quelques

rares L1NN peuvent migrer dans le tissu du système nerveux central et induire une réaction

inflammatoire locale. Ces larves dégénèrent plus ou moins rapidement et ne sont pas capables

de s’encapsuler. Après la pénétration des L1NN dans la cellule musculaire, une infiltration par

les cellules inflammatoires intervient et se localise aux extrémités effilées de la cellule

nourricière qui a une forme de “citron” en coupe. Un lien avec la sécrétion de glycoprotéines

portant le béta tyvelose est probable puisque ces protéines sont hautement antigéniques

(Wisnewski et al., 1993).

L’intensité de l’infection est directement corrélée au nombre de cellules transformées par le

parasite. Les manifestations cliniques dépendent cependant de l’espèce hôte, de son statut

immunitaire et du type de muscle infecté. Des hommes sont morts avec une présence de

seulement 15 larves par gramme de T. spiralis, d’autres ont survécu sans difficultés majeures.

L’évolution de la cellule nourricière est permanente, entrainant une epaissisement

progressive de la capsule qui va posséder plusieurs microns d’épaisseur en quelques mois. Les

cellules infectées rentrent ensuite dans un processus lent de dégénérescence et de calcification

qui peut durer des années (homme) mais qui peut être accéléré si une réponse immune se

développe. Des larves vivantes ont été obtenues de patients lors de biopsie près de 10 ans

après l’infestation (Dupouy-Camet et al., 2001). Des fragments de tissu musculaire infectés

gardent leur infectivité à +4°C pendant des mois.

27

1.5. Clinique La trichinellose présente des signes cliniques frustres ou peu spécifiques en début

d’infestation. Une entérite avec des douleurs intestinales plus ou moins intenses surviennent

dans les 48 heures suivant la consommation de viande contaminée. Puis après une phase de

décroissance des signes un nouveau tableau clinique apparaît, caractérisé par le tryptique:

myalgie, hyperthermie et oedème de la face. Des pétéchies sont observées notamment au

niveau des ongles mais également au niveau de la conjonctive ou des muqueuses.

L’hyperéosinophilie (5 à 50%) est constante mais brève dans le temps. Une hyperleucocytose

est présente (12 000-15 000 leucocytes/mm3). L’invasion du diaphragme et des muscles

intercostaux peut entraîner une dyspnée.

Figure 7: Diagramme montrant la durée et l’intensité des signes cliniques de la trichinellose chez l’homme (Despommier et al., 2000).

28

La phase de convalescence suit 5 à 6 semaines après l’infestation. On parle de trichinellose

chronique pour décrire ces manifestations douloureuses après un délai de plusieurs mois après

infestation. La trichinellose chronique peut se manifester chez l’homme par des épisodes de

myosite de façon cyclique pendant plusieurs années. Deux formes cliniques ont été décrites

lors d’infestation humaine à T. nativa: une myosite généralisée ou une diarrhée persistante.

Cette dernière forme clinique correspond à des infestations secondaires réitérées chez des

individus ayant une immunité protectrice (MacLean et al., 1992) (Figure 7). Il n’a pas été

possible d’établir un syndrome caractéristique de telle ou telle espèce infestante de

Trichinella, de même il est toujours difficile d’établir une dose infestante minimale pour

l’homme conduisant à des signes cliniques (Dupouy-Camet et al., 2002). La plupart des cas

cliniques sont générés par l’espèce T. spiralis (Pozio, 2001a). Les infestations par T. spiralis

sont réputées plus graves que les infections par T. britovi car cette espèce est moins

prolifiques (Pozio et al., 1993). Il a été décrit que T. murrelli induit plus fréquemment des

rashs cutanés et plus rarement des œdèmes de la face (Dupouy-Camet et al., 2001).

T. pseudospiralis semble induire des signes clinique plus longue (Jongwutiwes et al.,

1998; Ranque et al., 2000). La mortalité a été décrite lors d’infestation par la plupart des

espèces zoonotiques. T. papuae n’a jamais été détectée chez l’homme comme T.

zimbabwensis. Pour l’espèce T.papuae, les élevages porcins en Papouasie Nouvelle Guinée

sont fréquemment infestés mais aucun cas humain n’y a été répertorié (Owen et al., 2001). T.

zimbabwensis est infestante expérimentalement chez des primates (Pozio et al., 2002a).

1.6. Diagnostic

Le diagnostic de certitude vise à identifier le complexe cellule nourricière-parasite ou

à libérer, sous l’action d’enzymes protéolytiques, le parasite. Compte tenu de la taille

microscopique de la larve L1M, il est nécessaire d’utiliser un système optique (X40) pour

identifier le parasite. La PCR est un test très sensible (Dupouy-Camet et al., 1991; Wu et al.,

1999a) mais, d’application difficile actuellement, pour identifier le parasite directement dans

le muscle dans des conditions de routine.

29

1.6.1. Diagnostic chez l’Homme

Le diagnostic clinique n’est possible que chez l’homme où un tableau clinique assez

typique est observé pendant la seule phase d’état. Cependant les signes cliniques comme les

myalgies et la fièvre sont assez proches de ceux induits par une grippe, une dermatomyosite

ou certaines parasitoses comme la distomatose (Dupouy-Camet et al., 2002). Le diagnostic

chez l’homme demeure délicat dans les régions à faible endémicité et requiert un

interrogatoire précis du malade, des examens complémentaires et si possible le suivi

d’anticorps spécifiques.

L’interrogatoire des patients permet toujours de mettre en évidence une tendance à la

consommation de viande peu cuite d’espèces de mammifères (cheval, ours, sanglier, porc…,)

particulièrement sensibles à la trichinellose. L’analyse de la formule sanguine avec une forte

eosinophilie et une elevation des enzymes circulantes musculaires (créatine phosphokinase

CPK, lacticodeshydrogénase LDH) sont des bons indicateurs.

Les tests sérologiques indirects sont nombreux et font appel à la technique ELISA sous

diverses formes, à l’immunofluorescence indirecte, à la technique d’immunoempreint

(Western Blot). L’ELISA peut être positif dès la deuxième semaine après l’infestation chez

l’homme mais c’est généralement après un mois que les réactions sérologiques sont

clairement positives (Gamble, 1996, 1998; Nockler et al., 1995).

Le diagnostic de laboratoire inclut le diagnostic parasitologique, le sérodiagnostic et

l’identification par PCR.

Le diagnostic pa rasitologique est réalisé à partir d’une biopsie et demeure exceptionnel.

Il est fondé sur une digestion artificielle adaptée ou un examen microscopique après

écrasement pour identifier les larves.

L’immunodiagnostic est basé sur la détection d’IgGs spécifiques qui apparaissent dès le

10-20ème jour après infestation. Cependant, la teneur en anticorps est très variable en

fonction des individus, de la charge parasitaire et des espèces infestantes (Bruschi et al.,

1990; Pozio et al., 1993). De très nombreux tests ont été décrits mais les systèmes les plus

performants demeures l’ELISA et le Western blot pratiqués avec de l’antigène

excrétion/sécrétion (E/S) ou de l’antigène total. Le Western blot est plutôt utilisé comme test

de confirmation. L’antigène donnant la meilleure spécificité est l’antigène E/S cependant

certaines réactions croisées sont observées avec des anisakiases et des bilharzioses. Le 3,6

dideoxyhexose (béta tyvelose) est un épitope immunodominant du stade L1M bien caractérisé

actuellement. Sa production est complexe et coûteuse limitant sa diffusion mais différents

systèmes ELISA ont été validés. Cependant, le test 3,6 dideoxyhexose demeure moins

30

sensible que l’antigène E/S (Bruschi et al., 2001). L’antigène total a une meilleure sensibilité

que l’antigène E/S mais sa spécificité médiocre le rend peu utilisable en système ELISA. Le

système Western blot utilisant l’antigène total présente une bonne sensibilité et une bonne

spécificité (Yera et al., 2003). L’ELISA indirect utilisant des antigènes TSL1 immobilisés

avec l’anticorps US4 (antigène cTSL1) sur plaque ELISA présente une spécificité proche de

100% et une sensibilité >98% chez l’homme (Escalante et al., 2004).

Le diagnostic par PCR permet d’identifier sans équivoque l’espèce de parasite isolée. Le

système le plus simple et le plus sensible décrit est le test PCR multiplex (Zarlenga et al.,

1999) qui peut identifier une seule larve. Le dépistage d’antigènes circulant demeure délicat et

aucun test n’est actuellement validé chez l homme.

1.6.2. Problèmes posés par le diagnostic des trichinelloses

animales

La trichinellose animale est diagnostiquée par un test parasitologique direct (trichinoscopie

ou digestion artificielle) et lors d’enquête épidémiologique par une sérologie (ELISA, IFI,

Immunoempreinte) (Boireau et al., 1997; Gamble, 1998; Perret et al., 1997). Les animaux

infestés ne présentent pas de signe clinique; seuls les examens de laboratoire pourront attester

de l’infection par Trichinella. Les tests indirects ne sont pas validés actuellement pour la

surveillance des animaux mais il importe de mettre au point de tels tests, compte tenu de la

mise en place en 2006 de la méthode sérologique pour le suivi des élevages indemnes de

trichinellose dans l’Union Européenne (Règlement CE n° 2075/2005 du 5 décembre 2005).

1.6.2.1. Méthodes directes

Pour la detection du parasite dans les viandes: deux méthodes officielles sont utilisées. La

méthode par compression ou la digestion artificielle des muscles. Ces deux méthodes assurent

la visualisation du parasite après un grossissement de 40 à 300 fois de la préparation. La

compression consiste en un écrasement de pièces musculaires provenant des zones électives

du parasite (ex: pilier du diaphragme chez le porc, masséter ou langue chez le cheval, deltoïde

pour les carnivores). Cette méthode est peu sensible et ne convient pas pour l’espèce T.

pseudospiralis qui ne présente pas une capsule visible. La digestion artificielle des fragments

musculaires provenant de sites musculaires d’élection est une méthode de choix, cependant la

lecture demeure fastidieuse (10 à 20 minutes par digestion) et le détecteur du parasite

31

demeure toujours l’oeil humain. Une amélioration de la lecture conduisant à terme à une

automatisation est nécessaire et est en cours de validation au laboratoire.

1.6.2.2. La sérologie

La méthode est fondée sur la détection d’anticorps circulants spécifiques à l’aide d’un

antigène (soluble ou d’excrétion/sécrétion (E/S)) extrait du seul stade L1M du parasite

(Gamble, 1998; Gamble et al., 1983; Gamble et al., 2000; Gamble et al., 1996; Gamble et al.,

1988; Nockler et al., 1995; Pozio et al., 2002b). L’antigène E/S permet de réduire le nombre

de faux positifs par rapport à l’ELISA utilisant l’antigène brut mais il présente, comme chez

l’homme, une moins grande sensibilité. La sensibilité de ce dernier est proche de celle des

méthodes directes (Gamble, 1998). Le test d’immunofluorescence indirecte nécessite

l’utilisation de cryocoupes de larves L1M et le Bleu Evans, mais sa lecture est subjective

compte tenu de l’auto fluorescence de la cuticule des nématodes. La technique de détection

des antigènes circulants est peu développée et a été décrite par 2 équipes (Arriaga et al.,

1995 ; Nishiyama et al., 1992). La technique des immunoempreintes utilisant un antigène total

du stade L1M n’est pas utilisée en routine. Les techniques sérologiques actuelles ne peuvent

pas être préconisées comme test de dépistage individuel compte tenu de l’apparition tardive

des anticorps circulants après l’infestation (4 à 8 semaines en fonction des doses et de l’espèce

infestante, de l’espèce hôte). Par ailleurs chez certaines espèces hôtes comme le cheval la

réaction sérologique dirigée contre les antigènes du seul stade larvaire devient négative en 4 à

6 mois ce qui empêche définitivement l’utilisation de cette méthode pour le dépistage

individuel pour l’espèce équine (Soule et al., 1989; Soule et al., 1993a). La sérologie présente

cependant un réel intérêt dans les enquêtes épidémiologiques en matière d’élevage porcin et

permettra avec l’aide d’un test détectant les anticorps précoces de supprimer les contrôles par

sondage peu efficaces et coûteux dans certaines zones d’élevage. La détection d’anticorps

précoces nécessite cependant d’utiliser des stades antigéniques différents du seul stade L1M

(stade adulte ou stade L1NN).

Si le diagnostic direct demeure actuellement la seule méthode officielle pour le dépistage

de la trichinellose équine, il apparaît nécessaire d'améliorer sa lecture et d'optimiser le site de

prélèvement. En revanche pour l'espèce porcine la méthode sérologique pourra être adoptée

dès lors que le problème du diagnostic précoce sera résolu par introduction d'antigènes

immunodominants communs à plusieurs espèces de trichine des stades invasifs (stade adulte

ou stade L1NN).

32

1.7. Traitement

Il n’y a pas de traitement spécifique anthelminthique quand la larve musculaire est

encapsulée. Le mébendazole ou l’albendazole donnés précocément après l’infestation peuvent

réduire le nombre de larves définitivement encapsulées et atténuer les complications. Ceux-ci

sont maintenant recommandés pendant les 4-6 semaines qui suivent l’infestation. Le

mébendazole est généralement administré à la dose de 5 mg/kg mais des doses plus élevées

(20-25 mg/kg) sont préconisées dans certains pays (Dupouy-Camet et al., 2002).

L’albendazole est utilisé en France à la dose de 800 mg/jour (15 mg/kg/jour) (Dupouy-Camet

et al., 2002). Ces produits sont cependant contre-indiqués chez le jeune enfant de moins de 2

ans et chez la femme enceinte. Une corticotherapie comme la prednisolone est recommandé ;

en effet la destruction massive de L1 circulantes peut exacerber la réponse inflammatoire de

l’hôte et aggraver la clinique (Despommier, 1983) , (Dupouy-Camet et al., 2002; Pozio et al.,

2003)

1.8 Prévention et contrôle

La trichinellosis peut être évitée en faisant cuire à cœur la viande à 60°C pendant 1 minute

et à 63°C quelques secondes. La congélation n’est pas une méthode alternative recommandée

pour les animaux de chasse. Cependant certains animaux sauvages comme les ours, les ratons

laveur ont des substances musculaires prévenant la formation de cristaux lors de l’hibernation

et assurent une plus grande survie des larves contenues dans un muscle lors de la congélation.

Des études précises montrant la décroissance parasitaire suite à la congélation ont été faites

chez le porc mais ne peuvent pas être extrapolées à d’autres espèces animales. Par ailleurs les

espèces T. nativa et T. britovi présentent une plus grande résistance naturelle à la congélation.

La salaison et le fumage inactivent Trichinella seulement si la teneur en eau libre est

inférieure à 0,92% (Gamble et al., 2000). La cuisson par micro-ondes n’est pas efficace à

100% puisque dans les grandes pièces de viande les points froids subsistent inévitablement

(Capo and Despommier, 1996). L’irradiation est une méthode autorisée pour l’inactivation de

Trichinella. Le procédé demeure coûteux et est peu accepté par les consommateurs européens

actuellement.

Selon la Commission Internationale sur la trichinellose (Gamble et al., 2000);

www.med.unipi.it/ict/welcome.htm) les méthodes de contrôle chez les animaux sont

applicables

à la ferme, à l’abattoir et lors des préparations culinaires.

33

Le contrôle à la ferme est envisagé pour les élevages de porc dans le nouveau règlement

communautaire sur les zoonoses (Règlement CE n° 2075/2005 du 5 décembre 2005). Il a été

mis en place en Europe en janvier 2006. Les élevages réputés indemnes de trichinelloses

doivent répondre à une liste de critères définis comme un programme de dératisation,

l’absence de contact entre porcs et faune sauvage et la gestion des déchets. Les porcs issus de

ces fermes ne nécessiteront pas un contrôle individuel de la viande mais les élevages seront

soumis à une visite annuelle avec contrôle sérologique de tout nouvel entrant. Ce dernier point

montre tout l’intérêt de définir rapidement une méthode sérologique de référence et

d’identifier des antigènes précoces et tardifs communs aux différentes espèces de Trichinella.

Le contrôle parasitologique à l’abattoir est le seul test officiel existant actuellement. Il vise

à prévenir la maladie clinique chez l’homme. La digestion en pool est la méthode reconnue en

France actuellement chez le porc, le cheval, les animaux de chasse. Une masse de 10 g est

digérée pour le contrôle individuel des carcasses de chevaux et un échantillon d’au moins 1 g

est nécessaire chez le porc. Il est fondé sur une réglementation complexe en fonction des pays.

En Europe on peut diviser en deux grandes rubriques cette règlementation.

1.8.1. Réglementation des contrôles des viandes lors de

l’abattage dans un pays membre de l’UE

Le règlement (CE) n° 854/2004 du Parlement européen et du Conseil du 29 avril 2004 fixe les

règles spécifiques d’organisation des contrôles officiels concernant les produits d’origine

animale destinés à la consommation humaine et le règlement (CE) n° 2075/2005 du 5

décembre 2005 établit les règles spécifiques applicables aux contrôles officiels concernant la

présence de Trichinella dans les viandes. Ce règlement stipule que tout animal de boucherie

ou tout gibier sensible à Trichinella doit être soumis à la recherche de larves de trichine par

l’une des 4 méthodes décrites : (i) méthode de la digestion d’échantillons collectifs utilisant

un agitateur magnétique ; (ii) méthode de la digestion d’échantillons collectifs avec assistance

mécanique/technique de la sédimentation ; (iii) méthode de la digestion d’échantillons

collectifs avec assistance mécanique/technique de l’isolement par filtration et (iv) méthode de

la digestion pour échantillons collectifs jusqu’à 35 grammes. Le laboratoire assurant le

dépistage doit être agréé et soumis à un contrôle qualité. Des dérogations existent pour

l’espèce porcine si l’éleveur démontre que son élevage est indemne de Trichinella (respect

d’un cahier des charges). L’élevage indemne de trichine est soumis au respect de règles

34

édictées précédemment dans le paragraphe 1.8. Il est à noter qu’il n’y a pas de dérogation

pour la viande équine et le gibier. Un second type de dérogation existe pour les pays

démontrant qu’ils sont soumis à un risque négligeable de l’infection à Trichinella. Dans ce

cas il n’est plus nécessaire de démontrer une qualification des élevages hors sols. Cependant

reproducteurs et porcs plein air restent toujours soumis à un dépistage systématique.

1.8.2. Réglementation concernant l’importation de viande

de pays tiers

La Directive CEE/72/462/ (JO N° L 302 du 31/12/1972, p. 0028) du 12 décembre 1972

concernant l’inspection vétérinaire des animaux de rente définit les règles de contrôle en

matière de viande importée. Plus précisément la Directive CEE/77/96 du 21 décembre 1976,

impose la recherche de trichine pour les viandes porcines importées de pays tiers.

Historiquement la recherche de Trichinella a été mise en place pour la seule espèce porc.

Selon ce texte, le contrôle doit être effectué dans un abattoir agréé ou dans le pays membre

important la viande si le contrôle n’a pas été effectué préalablement à l’importation. La

Directive précise les sites électifs qui sont le diaphragme, la langue, les masséters ou les

muscles abdominaux (Annexe I). Cette Directive décrit trois méthodes autorisées pour le

diagnostic (Annexe I de la Dir. CEE/77/96). La viande peut néanmoins être commercialisée

sans contrôle préalable si elle a été traitée par le froid selon l’une des méthodes alternatives

décrites dans l’Annexe IV. Les méthodes de contrôle officielles pour détecter Trichinella au

laboratoire sont décrites dans l’Annexe II. Des amendements de la Dir. CEE/77/96 ont été

introduits en 1981 (81/476/CEE ; JO N° L186 du 08/07/1981, p. 0020) et en 1983

(83/91CEE ; JO N° L059 du 05/03/1983, p. 0034); en 1984 la Directive 84/319/CEE ; JO N°

L067 du 27/06/1984, p. 0034 modifie 2 des 3 méthodes et introduit 3 nouvelles méthodes de

détection groupées sous le terme générique de “méthodes par digestion". Parmi ces méthodes,

la digestion par agitation magnétique est la seule retenue en France.

36

B- Trichinella et trichinellose :

Épidémiologie actuelle

38

1.1. Cycles épidémiologiques

La transmission du parasite s’effectue par ingestion de viande contenant des larves de

Trichinella d’un animal à l’autre. Plus de 150 espèces de mammifères et d’oiseaux présents

dans les zones climatiques les plus diverses entretiennent le cycle biologique. La très grande

distribution géographique du parasite est en relation avec l’adaptation de certaines espèces à

des conditions extrèmes (temperature inferieure à -10°C pour T. nativa et temperature

superieure à 40°C pour T. nelsoni) et à son absence de développement dans le milieu

extérieur. Trichinella circulant d’un hôte à un autre par créatophagie, le parasite est

susceptible de contaminer tous les mammifères et oiseaux présentant un comportement de

carnivore ou de charognard. Il a été décrit par le passé deux cycles épidémiologiques pour

expliquer la propagation de Trichinella: un cycle domestique dans lequel la transmission du

parasite s’effectue principalement chez le porc et le rat et un cycle sauvage qui fait intervenir

des animaux sauvages, avec des « aller-retour » entre ces deux cycles pour expliquer les

contaminations mixtes (Campbell, 1983a).

Ces deux cycles peuvent se réaliser hors de la présence de l’homme mais celui-ci est

néanmoins à l’origine du cycle domestique.

1.1.1. Le cycle domestique

Ce cycle fait essentiellement intervenir le porc qui peut se contaminer de diverses

façons: par cannibalisme, par caudophagie (Hanbury et al., 1986), ou encore en ingérant des

carcasses de rat contaminées, des abats de porc ou des déchets crus mélangés à sa nourriture.

Depuis 1975, le cheval, nouvel hôte atypique a été à l’origine de la contamination de au moins

3000 personnes (Boireau et al., 2000; Dupouy-Camet, 2000). Soulé et al (1989,1993) ont

montré que le cheval était réceptif à une infestation expérimentale par differentes especes de

Trichinella. Celui-ci est à l’origine de la majorité des dernières épidémies humaines en France

et en Italie (tableau2).

Le mode d’infestation de cet herbivore n’est pas clairement établi. Deux hypothèses

sont, cependant, proposées (Pozio et al, 2000) : l’animal se contamine par ingestion de

carcasses de rongeurs contaminés dans son pâturage ou par ingestion de morceaux de viande

contaminée. Cette deuxième hypothèse, pourrait s’appuyer sur une pratique

d’"engraissement" du cheval avant son abattage. Van Knappen et al. (1987) ainsi que Murrell

et al. (2004) ont montré que des chevaux privés expérimentalement d’alimentation pendant

plusieurs jours, sont capable de consommer de la viande mélangée à leur alimentation

39

habituelle. Ils peuvent également ingérer une carcasse de rat infestée, accidentellement

incorporée à leur fourrage.

DDaattee LLooccaalliissaattiioonn// PPaayyss

NNoommbbrree ddee ccaass// DDééccèèss

PPaayyss dd’’oorriiggiinnee dduu cchheevvaall

EEssppèèccee ddee

TTrriicchhiinneellllaa

1975 Bagnolo in Piano (It) 89/0 Yougoslavie T. britovi

1975 Chatenary-Malabry (Fr) 125/0 Europe de l’est x

1984 Varese (It) 13/0 Yougoslavie x

1985 Paris, Melun (Fr) 431/2 Etats-Unis d’Amerique

T.murrelli

1985 Paris et 7 autres départements (Fr) 642/3 Pologne T. spiralis

1986 Salsomaggiore (It) 300/0 Yougoslavie T. britovi

1990 Barletta (It) 500/0 Europe de l’Est T. spiralis

1991 Clermont-Ferrand (Fr)

21/0 Etats-Unis d’Amerique

x

1993 Paris et 3 autres départements (Fr) 538/0 Canada T. spiralis

1994 Provins (Fr) 7/0 Mexique T. spiralis

1998 Haute Garonne (Fr) 128/0 Serbie T. spiralis

1998 Piacenza (It) 93/0 Pologne T. spiralis

1998 Toulouse (Fr) 404/0 Serbie T. spiralis

2000 Bitonto (It)

36/0 Pologne ou Roumanie

T. spiralis

2005 Montova (It) 7/0 ? T.britovi

Tableau 2: Cas humains de trichinellose en Europe, liés à la consommation de viande de

cheval crue ou peu cuite (d’après (Pozio and Zarlenga, 2005).

1.1.2. Le cycle sauvage

Le cycle sauvage fait intervenir des prédateurs qui dévorent une proie contaminée et

des charognards qui se nourrissent de carcasses d’animaux infestés. La pérennité du cycle

biologique de Trichinella en zone sauvage est facilitée par la résistance des larves musculaires

à la putréfaction et à des conditions extrêmes pour certains isolats. De façon schématique le

cycle sauvage peut lui même se diviser en trois cycles en fonction du climat (polaire, tempéré,

tropical).

40

� Le cycle sauvage en zone tempérée : les carnivores (renard, loup, coyote), les viverridés,

les mustélidés et les suidés sauvages en sont les hôtes principaux. Le sanglier est à l’origine

de nombreuses contaminations humaines.

� Le cycle sauvage en zone tropicale : il fait intervenir la faune locale des grands carnivores

et des charognards comme la hyène. La contamination humaine est le plus souvent due à la

consommation de viande de phacochères infestés (Le Normand, 1984). Certaines pratiques

religieuses interdisant la consommation de viande de porc, sont sans doute à l’origine des

faibles taux d’infestation chez l’homme en Afrique.

� Le cycle sauvage en zone arctique : le renard, le loup, le morse et l’ours blanc (Forbes,

2000) sont les mammifères les plus infestés par les souches arctiques qui présentent une forte

résistance à la congélation. T. nativa a un faible pouvoir infestant pour le porc.

Parmi les 11 espèces ou génotypes du genre Trichinella, l’espèce T. spiralis est transmise

plus fréquement au cours du cycle domestique. Cependant ce nématode se rencontre

également dans des espèces sauvages ce qui rend plus floue la séparation des cycles

épidémiologiques. Ces définitions ont l’avantage de montrer la prépondérance de tel ou tel

génotype dans une transmission particulière. Les animaux vivant au voisinage de l’homme

(rats, chiens, chats, renards..) contribuent à favoriser les échanges entre les deux principaux

cycles épidémiologiques. De plus, le comportement de l’homme peut non seulement

influencer la diffusion de telle ou telle espèce de trichine mais également peut contribuer à

contaminer plus massivement la faune sauvage notamment lors de pratique de chasse. Un

exemple est donné par la contamination massive de la population de loups dans certaines

régions de Sibérie. Les chasseurs ont amplifié le cycle en mettant comme proies des carcasses

de loup (Pozio et al., 2001a). Les espèces cibles infestées par Trichinella dans une région

géographique donnée sont dépendantes de la biologie des génotypes existant du parasite, du

comportement de l’homme pouvant amplifier certaines sources de contamination, des

caractéristiques de l’écosystème (Campbell, 1988). La distribution des génotypes de

Trichinella parmi les différentes espèces domestiques et sauvages montre que le risque pour

l’homme d’acquérir la trichinellose varie grandement d’un pays à un autre.

41

1.2. Répartition géographique actuelle de la

trichinellose

1.2.1. Faune sauvage et domestique

La trichinellose animale est répandue sur tous les continents à l’exception de l’Antarctique et

dans tous les climats, à l’exception des deserts (Dupouy-Camet, 2000)

1.2.1.1. Amérique du Nord

La trichinellose est largement répandue dans la faune sauvage au Canada, Groenland et

Etats-Unis d’Amérique. Au Canada, du 1980 à 1986, sur 2253 animaux sauvages comprenant

13 espèces, 57 ont été trouvés infestés avec des taux qui varient de 0,47 % pour le coyote

(Canis latrans) à 3,1 % pour le renard roux (Vulpes vulpes) et 7,9 % pour le loup (Canis

lupus)(Smith and Snowdon, 1988). Plusieurs recherches dans diverses provinces de Canada

ont montré que le parasite est bien établi dans la population des mustélidés avec des taux

d’infection qui varient du 0,9 à 9,2 % chez Martes pennanti et pouvant aller jusqu’au 33,1%

chez Martes americana (Dick et al., 1986). L’ours noir (Ursus americanus), qui peut

transmettre l’infection à l’homme, présente un taux d’infestation aux aleantours de 1,5 %

(Butler and Khan, 1992; Côté et al., 2004). Aux Etats-Unis d’Amérique, l’ours noir présente

une infestation de 1,3 % dans 5 états du nord, 1,8 % en Pennsylvanie (Schad et al., 1986),

pouvant aller jusqu’au 5-11 % dans le Montana (Worley et al., 1986), 11,1% dans l’Arizona et

au Texas (Pozio, 2001b) et 13 % en Californie (Ruppanner et al., 1982; Zimmermann, 1977).

Une étude menée entre 1966-1972 dans l’Idaho, le Montana et le Wyoming ont montré que le

grizzly était le plus infestés dans 57 ,7% de la population, suivi par le puma (Puma concolor)

(54,4%), la martre (Martes pennanti) (40%), le coyote (Canis latrans) (25 %) et le lynx roux

(Lynx rufus) (17,9%). Le renard roux (Vulpes vulpes) présentait un taux d’infestation, dans

l’Illinois et la Pennsylvanie de 15,1%(Schad et al., 1984; Snyder, 1987). En Alaska, les taux

d’infestation sont beaucoup plus importants du fait du regime carnivore obligatoire pour les

animaux sauvages. Ainsi, l’ours polaire présente un taux d’infestation de 55% à 60%

(Weyermann et al., 1993), le grizzly (Ursus arctos horribilis) de 47% suivi par l’ours noir de

27,5%(Chomel et al., 1997) et le lynx (Lynx lynx) de 21% d’infestation (Zarnke et al.,

1995). Au Groenland, les taux d’infestation sont généralement plus élevées avec 24% (7,7% -

62,2%) pour l’ours polaire (Ursus maritimus) et pouvant aller jusqu’au 72 % pour les chiens

(sledge dogs) (Forbes, 2000; Henriksen, 1989). L’ours polaire représente le réservoir principal

42

de la trichinellose dans les zones arctique, mais une autre source d’infestation pour les

hommes est représentée par la viande de morse (Odobenus rosmarus), qui peut être infectée

jusqu’a 2,4 %, suivie par celle des phoques (Phoca hispida, Erignathus barbatus) présentant

un taux d’infection de 0,1-0,4 % (Forbes, 2000).

Concernant la faune domestique, la trichinellose porcine est très réduite du fait de

l’industrialisation de la production porcine et donc de la limitation des contacts avec des

sources potentielles de Trichinella. Au Canada, une étude entreprise de 1968 à 1975 dans les

provinces Atlantiques a montré un taux d’infestation de 0,13% (Smith et al., 1976). Dans

l’Ontario de 1972 à 1978 1/221 000 porc sacrifiés a été trouvé positifs (Dick et al., 1986). En

1985 dans une étude sérologique sur 15 318 sérums de porc testés, provenant de toutes les

régions de Canada, 0,026% se sont montrés positifs (un porc de la Colombie Britannique et

trois porc du Quebec) (Smith and Snowdon, 1988). Dans la province de Nouvelle Ecosse, en

1985, 5/1009 (0,49%) porcs testés par la digestion artificielle ont été positifs avec de très

faibles infestations (0,01-0,046 larves par gramme de muscle) (Smith and Kay, 1987). De

1981 à 1983, sur 33 482 diaphragmes de porc dans les états du Middle Atlantic, 0,58 % des

prélèvements étaitent positifs (Schad et al., 1985a). Dans l’état de la Nouvelle Angleterre, sur

5 315 porc contrôlés, 0,73% était infestés par des larves de Trichinella (Schad et al., 1985b).

Selon le National Animal Health Monitoring System la prevalence de la trichinellose chez le

porc était de 1,41% en 1900, pour descendre à 0,125% dans les années 1966-1970 et arriver à

0,013 en 1995 (Gamble and Bush, 1999).

Une place a part est occupée par les chevaux destinée à la consommation dans des pays

tels que la France, l’Italie ou le Japon ; pour répondre aux exigences sanitaires faisant suites

aux importantes épidémies humaines de trichinellose en France dues à la consommation de

viande de cheval crue, 30 000 carcasses de chevaux/an sont contrôles par la méthode de la

digestion artificielle au Canada et Etats-Unis d’Amérique ; aucune larve de Trichinella n’a été

trouvée à ce jour.

1.2.1.2. Amérique Latine

Neghme et Schenone (1970) dans leur revue sur la trichinellose dans l’Amérique

Latine, ont suggéré que Trichinella avait été introduit à partir de l’Europe ou d’autres régions

a forte prévalence. La trichinellose a été décrite dans quelques pays, en particulier au

Mexique, en Argentine et au Chili, et d’une manière ponctuelle au Honduras, Costa Rica et

Bolivie (Pozio and Zarlenga, 2005; Soule et al., 1991). Dans le reste des pays d’Amérique

Latine Trichinella n’a pas été rapportée ni dans la faune sauvage ni parmi les animaux

43

domestiques. Peu d’études ont été réalisées récemment dans la faune sauvage et

synanthropique. Des rongeurs du genre Rattus, naturellement infestés par Trichinella ont été

signalés en Argentine, Chili, Uruguay, Mexique (Alvarez et al., 1970; Neghme and Schenone,

1970). Au Chili, plusieurs études faites sur les rats on montré des taux d’infestations de 25 à

47%. Au Mexique, dans la ville de Mexico City, sur 120 rats examinés par la méthode de la

digestion artificielle, aucun n’a été trouvé positif (Ortega-Pierres et al., 2000). En 1978 à

Santiago (Chili), la prévalence chez les chats etait de 3 % (Alcaino et al., 1981) ; en 1986 sur

150 chats examinés à Mexico, 6,6% était porteurs de larves de Trichinella (Palma Rodriquez,

1987). Par un test trichinoscopique, Alvarez et al., (1970), ont trouvés chez les chiens de

Santiago des taux d’infestation qui varient en fonction du quartier, allant de 2% jusqu’a 72%

pour les chiens de l’abattoir municipal. L’analyse de suidés sauvages dans le cadre d’une

étude plus récente (2006) réalisée en Guyane française, s’est révélée négative (C.Perret

communication personnelle). Concernant l’infection chez le porc, des données détaillées sont

présent dans quatre pays :

(i) Au Mexique le pourcentage d’infection varie selon la région ; ainsi une étude sérologique

sur des élvages de porcs familiaux, réalisée dans trois états différentes (Mexico, Veracruz,

Michoacan), ont révélé une pourcentage de 1 à 24% de positivité (Arriaga et al., 1989). La

digestion artificielle de 8000 échantillons dans l’état de Mexico, en 1992, a montré un taux de

positivité de 1,25%. Dans une étude récente réalisé par Dot-ELISA, sur 985 sérums de porcs

dans l’état de Zacatecas, 10 sérums ont été trouvé positifs (Ortega-Pierres et al., 2000). (ii) En

Argentine, la province de Buenos Aires est considérée comme endémique, avec des taux de

seropositivités qui en 1996 était de 12,5% allant jusqu’a 26,6% en 1999 (Ortega-Pierres et al.,

2000). (iii) Au Chili, l’infestation à Trichinella a été pendant longtemps en dessous de 0,5 %

(Ernst and Aguilar, 1978; Schenone et al., 1994). Un taux plus élevé de trichinellose allant de

5,1-43,6% se trouve dans les régions réputée endémique pour la trichinellose. Une étude

réalisée à l’aide de la trichinoscopie dans l’ensemble du pays, portant sur la période 1976-

1983 a montré une prévalence de 0,093% (Schenone, 1984). Pendant la période 1980-1989,

malgré une augmentation du nombre de porcs abattus de 2,5 fois, la prévalence de

l’infestation à Trichinella a baissé de 0,08 à 0,02% (Schenone et al., 1994). (iiii) En Bolivie,

le pays a été considéré comme indemne jusqu’au 1991 quant a été découvert le premier cas

suite à une digestion artificielle en pool, dans un abattoir communal. Une étude sérologique

d’ampleur nationale a été menée indiquant des taux de positivités de 10,2% dans l’état de

Santa-Cruz, de 12,4% Monteagudo et de 17,1% dans Vallegrande (Ortega-Pierres et al.,

2000).

44

Une mention particulière doit être faite par la découverte à Mexico City de quatre

chevaux positifs par digestion artificielle sur 80 chevaux contrôlés. Ces chevaux avait été

infectés naturellement par Trichinella spiralis comme le décrive les auteurs ; jusqu’a ce jour

ce sont les seuls cas de trichinellose chevaline décrite au Mexique (Arriaga et al., 1995).

1.2.1.3. Afrique

La trichinellose a été reconnue enzootique dans la faune sauvage en 1961 (Nelson et al.,

1961). Bien que Trichinella semble être présente dans la plupart des pays au sud de Sahara, le

parasite est moins fréquent qu’en Europe. La trichinellose a été décrite en Afrique du Sud,

Algérie, Egypte, Ethiopie, Guinée, Kenya, Mozambique, Nigeria, Namibie, Sénégal, Tanzanie

et Tunisie. Les parcs naturels du Kenya, d’Afrique du Sud et de Tanzanie, ont été les régions

les plus explorées pour la présence de la trichinellose parmi la faune sauvage. Ainsi depuis

1963, la trichinellose a été recherchée en Afrique de l’Est chez plus de 2000 animaux

sauvages représentant plus de 50 espèces (Nelson et al., 1963). Trichinella a été retrouvé chez

le potamochère (Potamochoerus porcus), le lion (Panthera leo), le léopard (Panthera

pardus), le chat serval (Felis serval), la hyène tachetée (Crocuta crocuta), la hyène rayée

(Hyaena hyaena), le chacal rayé (Canis adustus), le lycaon (Lycaon pictus). L’espèce qui

semble être le réservoir de la trichinellose est représentée par la hyène tachetée avec des

pourcentages qui vont de 23% (Pozio et al., 1997a) dans la réserve du Serengeti en Tanzanie,

à 43% en l’Afrique de l’Est (Nelson et al., 1963) et jusqu’a 85% en Afrique du Sud (Young

and Whyte, 1975). Dans un étude récente dans la faune silvatique en Guinée, parmi les 160

animaux examinés, 1,9 % des carnivores étaient infestés par Trichinella. En 1995, 39,5% des

648 prélèvements de crocodiles du Nil (Crocodylus niloticus) provenant de fermes d’élevages

du Zimbabwe se sont révélés positifs suite à l’analyse par la methode de la digestion

artificielle (Foggin et al., 1997). Dans une étude récente menée sur des varans du Nil

(Varanus niloticus) au Zimbabwe, une prévalence de 17,8 % a été trouvée. Peu de données

sont disponibles concernant l’infestation avec Trichinella dans la population de suidés

sauvages, malgré la description de plusieurs épidémies humaines de trichinellose au Kenya,

en Tanzanie, au Sénégal et en Ethiopie (Pozio et al., 2005). Nelson et al. (1963) ont trouvé

2,5 % d’infestation chez le potamochère (Potamochoerus porcus) au Kenya. Sachs (1975) a

décrit un taux d’infestation globale de 4,3% chez des phacochères (Phacochoerus

aethiopicus) provenant de plusieurs pays (Senegal, Kenya, Uganda, Tanzanie et Afrique du

Sud).

45

Dans un étude récente sur la population de rats à Alexandrie, en Egypte, Trichinella

spiralis a été identifié par la méthode de digestion enzymatique chez 13,3 % des prélèvements

(Loutfy et al., 1999). D’une manière générale, les rongeurs semblent jouer un rôle moins

important que les grands carnivores dans la transmission de la trichinellose en Afrique.

Concernant le porc domestique, peu de données sont disponibles pour l’Afrique ; ainsi au

Togo entre 1971-72 les examens trichinoscopiques réalisés sur 2976 diaphragmes de porc se

sont révélés négatifs(Soule et al., 1991). En Egypte, en 1976 une enquête portant sur 40670

carcasses de porc à l’abattoir du Caire a révélé des larves de Trichinella dans 4,53 % des cas

(El-Nawawi, 1981) et en 1988 ce taux a été de 4 % (Azab et al., 1988).

1.2.1.4. Asie

1.2.1.4.1. Moyen Orient

Les résultats concernant la trichinellose au Moyen Orient sont fragmentaires. La trichinellose

a été reconnue dans la faune sauvage en Israel, au Liban, en Turquie, en Iran et en Afganistan

chez le chien (Canis familiaris), le caracal (Caracal caracal), le renard (Vulpes vulpes), le

chacal (Canis aureus), la mangouste (Herpestes ichneumon), le sanglier (Sus scrofa) et le

hérisson (Erinaceus europaeus) (Kullmann, 1970; Merdivenci et al., 1977; Steele and

Schultz, 1978; Yamashita, 1970). En Iran la trichinellose est enzootique avec des taux de

positivités de 55,7 % pour le chacal, 25% pour le sanglier, 8,3 % pour le renard, 6,2 % pour

l’ours brun et 4,2 % pour le chien (Massoud, 1978). Du fait des préceptes religieux le porc

domestique est très peu consommé dans la région, et peu des données sont disponible; un taux

d’infestation de 15 % a été révélé en 1970 a Beyrouth (Liban) (Matossian et al., 1974). Une

épidémie récente en Turquie en 2004, impliquant plus de 400 cas humains à partir de la

viande de sanglier non-contrôlé, démontre la présence du Trichinella dans la faune sauvage et

le danger existant pour la consommation humaine (Turk et al., 2006).

1.2.1.4.2. Sud-Est Asiatique

Très peu de données sont actuellement disponibles sur l’état de la trichinellose dans la faune

sauvage dans les pays d’Asie du Sud-Est. Les seuls témoignages de la présence de

Trichinella résultent de la description de cas humains. En Thaïlande, au Laos, la

consommation de la viande de sanglier (Sus scrofa), d’ours noir (Ursus thibetanus), de chacal

(Canis aureus) ou d’écureuil sauvage a été à l’origine de plusieurs épidémies humaines de

trichinellose (Pozio and Khamboonruang, 1989; Sicard et al., 1976). En ce qui concerne le

porc, en Thailande de 1967 à 1973, 355 820 diaphragmes ont été examinés par trichinoscopie

46

dans plusieurs abattoirs du nord du pays et 0,005% ont été trouvés infestés ; l’inspection

sanitaire de 18 765 prélèvements de viande de porc a montré un pourcentage de 0,12 %

échantillons infestés par Trichinella (Veterinary Public Health Report, 1988). Au Laos et en

1975, 20 % de prélèvements effectués systématiquement dans les saucisses se sont montrés

positifs (Sicard et al., 1976); en 2006, 1 sur 11 prelevements de porc d’une regione rurale se

sont montrés positifs (Dupouy-Camet, communication personelle, 2007). En Indonesie

l’incidence chez le porc est de 0,3% (Holz, 1962). Une étude sérologique récente menée sur

424 sérums de porc du Népal ont montré la présence de deux échantillons positifs, suggérant

un faible taux d’infestation des porcs (Joshi et al., 2005). Plusieurs épidémies humaines de

trichinellose ayant comme origine la viande de porc, dans des pays comme la Malaisie, le

Laos, le Cambodge, le Myanmar montrent bien l’existence de cette infection parmi le cheptel

local des suidés, sans savoir exactement à quel niveau.

1.2.1.4.3. Extrême-Orient

Des infestations de Trichinella dans la faune sauvage au Japon ont été rapportées chez la

zibeline (Martes zibellina), l’ours noir (Ursus thibetanus), l’ours brun (Ursus arctos) et chez

le chien viverrin (Nyctereutes procyonoides) (Yamaguchi, 1991). Le premier cas de

trichinellose dans la faune domestique a été trouvé à Hokkaido, en 1957, chez un chien.

Cependant 339 chiens contrôlé à Sapporo ont tous été négatifs. Aucune cas de trichinellose

porcine n’a été identifié jusqu’a présent (Yamaguchi, 1991).

En Chine, Trichinella a été retrouvé chez l’homme et 14 espèces d’animaux sauvages et

domestiques dans toutes les provinces à l’exception de l’Isle de Hainan et Taiwan (Liu and

Boireau, 2002). La trichinellose porcine sévit en Chine à l’état endémique avec des taux de

6,7 % de positivité, détectée lors de l’abattage par la digestion artificielle, dans la province de

Hubei, de 4 ,2 % dans la province de Henan (des taux de 18,5% et de 34,2 % positifs ont été

trouvés dans les départements de Xinye et Deng) et un taux qui varie de 0,001% à 0 ,89%

pour neuf autres provinces (Liu and Boireau, 2002). La trichinellose canine pose un grâve

problème aussi, du fait des habitudes alimentaires dans le Nord de la Chine, avec des taux qui

varient en fonction des régions : 9,82 % dans la province de Jilin, 23,52 % dans la province de

Mongolie Intérieure, 35,6% dans la province de Liaoning et 39,5% - 44,8% dans la province

de Heilongjiang (Liu and Boireau, 2002). Une situation semblable existerait en Corée du Nord

(Liu, communication personnelle).

47

1.2.1.5. Australie et Nouvelle Zélande

Jusqu’en 1987 aucun cas de trichinellose n’avait été rapporté ni dans la faune sauvage, ni chez

le porc (McColl and Butler, 1982; Waddell, 1969). Suite au premier cas de trichinellose, en

1987 chez trois chats marsupiaux à queue tachetée (Dasyurus maculatus) en Tasmanie, une

enquête épidémiologique a montré la présence de Trichinella à l’état endémique en Tasmanie

avec des taux d’infection de 30 % chez les diables de Tasmanie (Sarcophilus harrisii), 30 %

pour les chats marsupiaux à queue tachetée et 36% pour les chats marsupiaux mouchetés

(Trichosurus vulpecula) (Obendorf et al., 1990a). A l’opposé la faune domestique de

Nouvelle Zélande semble être très peu infestée avec quelques cas sporadiques des rats et

porcs domestiques pour lesquels des capsules de Trichinella spiralis ont été identifiés (Cairns,

1966). En Australie pour la période 1975-1990 , 100 000 chevaux et 90 000 porc élevés en

liberté ont été testés avec des résultats négatifs (Obendorf et al., 1990a).

1.2.1.6. Europe

Le vieux continent présente la situation épidémiologique la plus diverse dans le monde, en ce

qui concerne la trichinellose, pour cela ont a choisi de présenter les principales données sous

forme de tableau (Tableau 3) (pages 49-52) :

48

Tableau 3. Principales données épidémiologiques de la trichinellose animale en Europe (sauf la France et la Roumanie)

Pays Faune sauvage Faune domestique

Iles Britanniques

Irlande

0,9% renard positif en 2003 (Rafter et al., 2005)

Royaume Uni 0/587 renard positifs en 1999-2000 (Smith et al., 2003) Pas de cas de trichinellose porcine depuis 1978 (Smith et al., 2003)

Europe Occidentale Portugal Trichinella est très rare

Un seul renard identifié en 1970 (Fraga de Azevedo et al., 1974) Très rares cas en provenance d’Espagne (de Azevedo and Palmeiro, 1970)

Espagne Trichinella est très répandue Province de Saragosse : 6,89 % chez le renard, 10,6 % chez le sanglier, 20 % chez les genettes, 33,3% chez les chats sauvages (Sanchez-Acedo et al., 1989) P. de Estremadura : 0,27 % - 0,38% chez le sanglier (Calero Carretero et al., 1989; Perez-Martin et al., 2000), 3% chez le renard (Perez-Martin et al., 2000) P. de Grenade : 2/69 sangliers, 3/72 rats gris (Rodriguez Perez et al., 1989) P.de Guadalajara: 8,9% chez le renard (Criado-Fornelio et al., 2000)

Chiens : 0/100 en Saragosse(Sanchez-Acedo et al., 1989) 1/249 en Grenade (Rodriguez Perez et al., 1989) Porc : 0,14% en Estremadura (Calero Carretero et al., 1989) 0,64 % dans les régions d ‘endémies(Calero Carretero et al., 1989)

Belgique 6,7% chez le sanglier, chez les rongeurs : 2,2% rat musqué, 6,5% rat gris, 11,1% rat noir (Fameree et al., 1981) 8000 sangliers/an inspectés, depuis 1992, un seul cas positif en 2004 (Schynts et al., 2006) 0/818 renards examinés entre 1996 et 2000 (Vercammen et al., 2002)

Pas d’infection chez le porc domestique ou le cheval (Fameree et al., 1979)

Pays-Bas Renard: 3,9 % dans le nord (van der Giessen et al., 1998), 13,1 % dans le centre (van der Giessen et al., 2001), 1,3 % sur la cote (van der Giessen et al., 2001) Sanglier: 1,8 % - 6,8 % positifs avec test serologique (van der Giessen et al., 2001)

Epidémiosurvéillance serologique depuis 1975, avec un pourcentage de 0,5% de positifs (Ruitenberg, 1979)

49

Allemagne Renard : 0,025-0,07% (Wacker et al., 1999; Wagner et al., 1988) Raton laveur : 5% (Thiess et al., 2001) Sanglier : 0,001-0,01% (Nockler, 2005)

Très rare Inférieur à 3 cas/ 40 millions de porc abattus/an (Rehmet et al., 1999) Des cas sporadiques dans les élevages de porcs familiaux (Littman et al., 2006) Pas des cas de trichinellose chevaline (15 000 chevaux abattus/an) (Nockler, 2005)

Suisse Trichinella est très rare Renard : 0,9% (Gottstein et al., 1997) Sanglier : 0/356 (Gottstein et al., 1997) Lynx, loup positifs (Muller et al., 2006)

Absente chez les porcs domestiques depuis le début du XXeme siècle (Gottstein et al., 1997)

Autriche Renard : 1,52% - 2,77% (Krois et al., 2005) Sanglier : pas de cas positifs depuis 25 ans

Les dernières cas de trichinellose porcine (12 cas) datent de 1952 et 1968 (De Carneri and Di Matteo, 1989)

Italie La trichinellose sévit à l’état endémique Renard : 3% - 35% (Pozio et al., 2001b) Loup : 30,9% (Pozio et al., 2001b) Blaireau : 8,8% (Pozio et al., 2001b) Fouine : 2,2 %(Pozio et al., 2001b) Sanglier : 0,006% (Pozio et al., 2001b)

Chien : 0,7% (Pozio et al., 2001b) Porc : 9 cas depuis 1958 avec 12 millions de porcs abattus/an(Pozio et al., 2001b)

Pays Scandinaves Norvège Peu de rapports récents

Renard :4,8%- 25% (Davidson et al., 2006; Prestrud et al., 1993) Très rare (Kapel, 1997)

Suède Renard : 4,5% (Pozio et al., 2004a) Renard arctique: 16,7% (Pozio et al., 2004a) Lynx :5%(Pozio et al., 2004a) Loup : 14,3% (Pozio et al., 2004a) Sanglier : 0,05% (Pozio et al., 2004a)

Chien : 5,1% (Lindberg et al., 1991) Porc : cas sporadiques depuis 1970 (Pozio et al., 2004a)

Finlande Rat gris : 19% (Mikkonen et al., 2005) Lynx : 53% dans le sud et 5% dans le nord (Oivanen et al., 2002; Oksanen et al., 1998) Renard : 55%(Oivanen et al., 2002) Chien viverrin : 46% (Oivanen et al., 2002) Sanglier : 0,7% (Sukura et al., 2001)

Porc : 0,004% (Oivanen et al., 2000) Chien : 7,3% (Oivanen et al., 2005)

Danemark Très rare Renard : 3/3141 (Enemark et al., 2000)

Pas de cas chez le porc domestique depuis 1929 (Kapel, 1997)

50

Pays Baltiques Lithuanie La trichinellose sévit à l’état endémique dans la faune sauvage avec 40%

chez le renard, 40% chez la marte, 32,5% chez le chien viverrin et 0,51 % chez le sanglier (Malakauskas et al., 2006)

Chien : 8,9% (Rockiene, 1994) Porc : 0,0027% en 1981-1985 ; 0,1% en 1993 (Malakauskas et al., 2006)

Lettonie Une situation semblable est présente avec des taux d’infection de 88,9% chez le lynx, 35,3% chez le chien viverrin, 28,9% chez le renard, 28,6% chez la marte et 1,3% chez le sanglier (Malakauskas et al., 2006).

Porc : 10 cas/an pour la période 1984-1990 ; 15 cas/an pour la période 1990-2000 (Malakauskas et al., 2006)

Estonie La trichinellose sévit à l’état endémique dans la faune sauvage avec 79,4% chez le loup, 50% chez le chien viverrin, 47,4% chez le lynx, 42,1 % chez le renard, 11,1% chez le rat gris et 1% chez le sanglier (Jarvis et al., 2001) Une étude entrepris dans plusieurs fermes d’élevages a révélé des taux d’infestation de 24,5% chez le renard polaire, 17,9% chez le vison et 1,4% chez le renard argenté (Jarvis et al., 2001).

Porc : 0,6% (Jarvis et al., 2001)

Europe Centrale Pologne Renard : 1% (Cabaj et al., 2000)

Sanglier : 0,16-0,5%(Ramisz et al., 2001) Porc : 0,00036% – 0,0026% (Ramisz et al., 2001) Chevaux : 3 cas qui ont été à l’origine des épidémies humaines concernant plus de 100 personnes en Italie et France (Boireau et al., 2000)

République Tchèque

Pas de rapport Pas de rapport

Slovaquie Renard : 4,1%-16,8% (Hurnikova et al., 2005) Sanglier : 0,02%-0,04% (Hurnikova et al., 2005)

En région d’endémie 2,1% des porcs sont atteints et 21,4% des rats synanthropiques (Hurnikova et al., 2005) Chien : à l’origine d’une épidémie de plus de 300 personnes en 1998 (Dubinsky et al., 2001)

Europe de Sud-Est Hongrie Trichinella est très rare

Renard : 3% (Sreter et al., 2003) Sanglier : 0,5%-1% (Nemeseri, 1970)

Porc : 3 cas isolées en 2002, 2003 (Cuperlovic et al., 2005)

Bulgarie Pas des données détaillées récentes; d’une manière générale la trichinellose sévit à l’état endémique dans la faune sauvage et domestique (Kurdova et al., 2004).

Grèce Trichinella est très rare, absence de données récentes Porc : pas des cas depuis 1982-1984 (Sotiraki et al., 2001) Chien : 4 ,6% (Frydas et al., 1995)

Albanie Statut inconnus (Cuperlovic et al., 2005) Pas de cas de trichinellose porcine (Cuperlovic et al., 2005)

51

Ex-Yugoslavie Serbie

Porc : 0,009%-0,02% (1980-1990) (Cuperlovic, 1991) 0,06%-0,17%(1994 – 2003) (Cuperlovic et al., 2005) Cheval : au cours des 10 dernières années il y a eu deux chevaux exportés à l’origine d’importantes épidémies humaines en France (Boireau et al., 2000) ; 1 cheval a été identifié à l’abattoir avant consommation

Monténégro Porc : 0,05%-0,1% (Cuperlovic et al., 2005)

Slovénie Trichinella est très rare, cas isolés chez le porc (Cuperlovic et al., 2005)

Croatie Porc : 0,05% (1980-1990) (Marinculic et al., 1991) 0,06%-0,36% (1998-2003) (Marinculic et al., 2001) Rat synanthropique : 0,2%-10,7% (Stojcevic et al., 2004)

Bosnie-Herzégovine

Porc : une moyenne de 300 cas/an pour la periode 1997-2000 (Cuperlovic et al., 2005)

Macédoine

Pour l’ensemble de la Yougoslavie Lynx : 47% Blaireau : 25% Ours brun : 16,8% Renard : 5,5% (Brglez, 1989) Pour Monténégro Sanglier : 2,33%-5,2% (Cuperlovic et al., 2005)

Porc : 0 cas/324.577 porcs abattu pour 200-2003 (Cuperlovic et al., 2005)

Russie 66 espèces de la faune sauvage et synanthropique ont été reconnues naturellement infestées par Trichinella en Russie (Bessonov, 1985)

Loup : 33,3%-65,2% (Bessonov, 1985)jusqu 97,3% dans les regions de

Tiver et Smoliensk (Casulli et al., 2001) Ours brun : 10%-54,5% (Bessonov, 1985) Chien viverrin : 32,3%-39,9% (Bessonov, 1985) Renard roux : 6,8%-37,5% (Bessonov, 1985) Lynx : 28,5% (Bessonov, 1985)

Porc : 3-4 cas/106 porcs abattus, pour la période 1979-1983 (Bessonov, 1985)

52

1.2.2. La trichinellose humaine

Dans une revue sur la trichinellose humaine, Dupouy-Camet (2000) a estimé le

nombre de personnes dans le monde atteint par une infection à Trichinella à 11 millions, la

trichinellose représentant 1,5% des épidémies d’origine alimentaire en Europe pour la période

1991-1992. Les épidémies causées par Trichinella apparaissent dans tous les pays avec une

aggravation importante en nombre de cas dans les régions pour lesquelles le contrôle sanitaire

est laissé pour compte ou dans des régions où la trichinellose sévit à l’état endémique dans la

faune sauvage avec une activité de chasse importante. La trichinellose est devenue la

principale zoonose parasitaire transmise par les aliments dans de nombreux pays (Chine,

Europe de l’Est, Argentine). Différentes revues concernant les épidémies de trichinellose

humaine survenues dans le Sud Est asiatique, l’Europe de l’Est, la Russie, l’Ukraine ou

l’Amérique latine montrent que dans ces régions les plans de surveillance sont sub-optimaux

(Cuperlovic et al., 2005; Ortega-Pierres et al., 2000; Takahashi et al., 2000).

La trichinellose porcine a disparu aux USA et au Canada avec quelques rares cas

sporadiques (Appleyard and Gajadhar, 2000; Moorhead et al., 1999). Aux USA entre les

années 1997 et 2001 une moyenne annuelle de 12 cas humains de trichinellose a été rapportée

(Roy et al., 2003). Des petites épidémies sont décrites chez des groupes de chasseurs et chez

les Esquimaux suite à la consommation de préparations culinaires à base de viande de gibier

peu cuite (Roy et al., 2003). En Amérique du Nord la majorité des cas de trichinellose

surviennent après la consommation d’animaux sauvages ou gibier infecté par T. murelli, T.

nativa ou Trichinella T6 (Moorhead et al., 1999). En Amérique du Sud ou Amérique

Centrale, la trichinellose porcine est endémique dans au moins quinze districts fédéraux.

Cependant, les données sont parcellaires puisque l’inspection est réalisée dans les seuls

abattoirs fédéraux ne recevant que les porcs d’élevages industriels (Ortega-Pierres et al.,

2000).

Des foyers de trichinellose d’origine porcine sont fréquemment rencontrés en Thaïlande

(Kaewpitoon et al., 2006) et des épidémies sporadiques ont été décrites dans différents pays

d’Asie (Cambodge, Indonésie, Laos, Malaisie et Myanmar) (Takahashi et al., 2000). De 1964

à 2002 plus de 500 épidémies ont été répertoriées en Chine conduisant à la description de

25161 cas humains et 240 morts (Liu and Boireau, 2002). Cependant cette présentation est

sous estimée puisqu’il n’y a pas encore de système de déclaration obligatoire en Chine ni de

méthodes standardisées pour le diagnostic (Liu and Boireau, 2002). Au Moyen Orient deux

53

épidémies importantes de trichinellose humaine d’origine porcine ont été decrites au Liban,

impliquant plus de 2500 personnes (Haim et al., 1997; Olaison and Ljungstrom, 1992).

Récemment une épidémie gravissime est survenue en Turquie et a provoqué plus de 600 cas

humains suite à la consommation de boulettes à base de viande de bœuf et de sanglier (Turk

et al., 2006).

En Afrique la trichinellose humaine est limitée aux chasseurs ou à des communautés non

soumises à des interdits religieux sur la viande de suidés. Des cas ont été décrits en Tanzanie,

au Kenya, en Ethiopie, et au Sénégal, après consommation de phacochère, dans les pays du

Maghreb chez des consommateurs de sanglier et chacal, et en Egypte dans des communautés

coptes, après consommation de porc.

En Europe, la trichinellose d’origine porcine a presque disparu d’Europe de l’Ouest grâce

aux conditions d’élevages industriels ; une définition des élevages indemnes de trichine a été

proposée. Plusieurs foyers épidémiques de trichinellose humaine ayant pour origine la

consommation de la viande de porc provenant d’élevages familiaux ont été decrits en

Espagne, Allemagne et Italie (Sardaigne) (Dupouy-Camet, 2006). Le sanglier est aussi à

l’origine des quelques petites épidémies chez les chasseurs en France, Espagne ou Pologne

(Dupouy-Camet, 2006). Mais depuis une trentaine d’années les plus grandes épidémies de

trichinellose observées en Europe occidentale ont été attribuées à la consommation de viande

de cheval importée soit d’Europe de l’Est soit des Etats-Unis ou Canada. La trichinellose

d’origine équine a été particulièrement importante dans deux pays, l’Italie et la France, qui

sont les deux seuls pays consommant de la viande peu cuite de cheval (Boireau et al., 2000).

Quinze épidémies ont ainsi été décrites en France et en Italie, touchant pas moins de 1031

personnes en Italie (Pozio and Zarlenga, 2005) et 2296 en France (Dupouy-Camet, 2006).

Dans l’Europe de l’Est l’endémie est persistante. En Russie, en Ukraine, en Bielorussie les

épidémies actuelles sont de plus en plus liées à la consommation de gibier ; en Russie la

viande d’ours infestés était à l’origine des 39,5% des cas pour la période 1998-2002

(Ozeretskovskaya et al., 2005). Les cas liés à la consommation de porcs domestiques sont en

régression mais persistent néanmoins en Lituanie, Lettonie, Pologne, Roumanie et dans les

Balkans (Bartuliene et al., 2005; Dupouy-Camet, 2006). Selon une enquête réalisée par la

Commission Internationale pour la Trichinellose pour l’année 2004, il a eu 1100 cas de

trichinellose en Europe, parmi lesquels 984 cas provenaient de Bulgarie, Croatie, Roumanie et

Serbie (Dupouy-Camet, 2006). La guerre qui a frappé l’ex-Yugoslavie, a entraîné une

désorganisation complète des services vétérinaires et une augmentation considérable de la

trichinellose dans la faune sauvage et domestique. Ceci a conduit à l’émergence de très

54

nombreux foyers de trichinellose humaine d’origines diverses dont certains ont été exportés

dans différents pays par le commerce d’animaux vivants (chevaux en France et Italie).

Le voyage ou l’immigration représentent une autre modalité d’importer l’infestation à

Trichinella, à partir des zones de fortes endémicité (Argentine, Chine, Laos, Roumanie, ex-

Yugoslavie) soit en consommant sur place des produits présentant un risque élevée

(préparation ou saucisses crues à base de viande de porc ou gibier non contrôlé) soit par

l’importation des tels produits dans les pays occidentaux comme ce fut le cas en Allemagne,

au Danemark, en France, en Espagne, en Italie et au Royaume-Uni (Ancelle et al., 2005;

Pozio and Marucci, 2003).

En Europe 4 espèces de trichine cohabitent (T. spiralis, T. nativa, T. pseudospiralis, T.

britovi) (Pozio, 2000). Le rôle du gibier comme source de contamination humaine s’est

gravement accru au cours des dernières années dans la plupart des pays. De nouvelles espèces

sont apparues (T. papuae et T. zimbabwensis) ou ont émergé dans de nouvelles régions : T.

pseudospiralis en France en 1998, T. britovi en Corse en 2004. L’existence d’espèces non

encapsulées infestant les reptiles et oiseaux a été récemment détectée compte tenu des

difficultés d’identifier les larves par trichinelloscopie et de leur caractère non zoonotique.

1.2.3. La trichinellose en France et en Roumanie

1.2.3.1. En France

Une enquête réalisée de 1977 à 1993 dans l’est de la France sur 5457 renard roux,

pour la recherche de larves de trichine par digestion pepsique de prélèvements musculaire, a

révélé un taux de 1,1% de positifs (Soule, 1994). Les enquêtes parasitologiques effectuées sur

des sangliers se sont révélées négatives avec quelques rares exceptions : 150 000 tests de

digestion artificielle ont été effectués à partir de prélèvements de porc ou sanglier depuis

2001 ; deux sangliers ont été saisis pour trichinellose au cours des dernières années et

récemment de nouveaux cas de trichinellose porcine ont été identifiés en Corse (Boireau,

communication personelle). Le sanglier est responsable d’épidémies anecdotiques souvent

familiales ; la fréquence de ces épidémies est en progression ces dernières décennies, signant

ainsi la présence du parasite en métropole (De Bruyne et al., 2006).

55

Bien que le porc soit le vecteur le plus anciennement connu, sa responsabilité en

France dans les cas humains est désormais négligeable. Sur plus d’un milliard de porcs

abattus depuis la dernière guerre mondiale, aucun porc issu d’un élevage industriel n’a été

impliqué dans un cas de trichinellose humaine (Pozio, 1996). Seul un élevage familial de porc

en plein air nourri occasionnellement avec des carcasses de renard a été à l’origine d’un foyer

très localisé dans la région d’Avignon en 1983 (Igual et al., 1985) (tableau 4).

La consommation de viande chevaline originaire de l’Est de l’Europe demeure le

principal risque en France d’émergence d’épidémies graves de trichinellose compte tenu de

l’habitude alimentaire. Depuis 1975 huit épidémies de trichinellose ont été provoquées en

France par la consommation de viande de cheval infectée. Ce sont les enquêtes

épidémiologiques cas-témoin associées à des foyers importants (plus de 10 cas cliniques) qui

ont permis d’incriminer le cheval comme hôte de la trichine. En 25 ans, 3326 cas de

trichinellose humaine sur un total de 6250 pour toute l’Union Européenne ont eu pour origine

la viande de cheval. Pas moins de 2296 cas ont été rapportés en France pendant cette période,

les autres cas apparaissant en Italie. L’habitus alimentaire explique l’émergence de cette

maladie dans ces deux pays qui sont les seuls au monde à consommer la viande équine peu

cuite. Même si la consommation de viande d’origine équine par habitant est plus importante

en Belgique (plus de double de celle de la France), la coutume de cuire à cœur la viande de

cheval (viande grise) empêche tout risque de transmission du parasite. Les épidémies ont

toutes eu pour origine un seul cheval infesté qui venait de différentes origines géographiques

avec toutefois une forte prédominance des pays d’Europe de l’Est.

Le premier cheval naturellement infecté par Trichinella a été saisi à l’abattoir de

Brescia en Italie en 1988. Depuis, 7 autres chevaux ont été saissis pour trichinellose en France

et en Italie (Boireau et al., 2000). Plus de 30 000 tests par digestion artificielle sont réalisés

chaque année pour la seule espèce chevaline et 2 chevaux ont été déclarés positifs en 8 ans

(Boireau, communication personnelle). L’ensemble de ces résultats montre que la prévalence

annuelle de la trichinellose équine demeure très faible (inférieure à 1/25000), mais présente

un impact majeur de sante publique.

Les espèces de trichine à l’origine des cas autochtones de trichinellose sont T. spiralis,

T.britovi et T.pseudospiralis. T. murrelli et T. nativa ont été impliquées lors des epidemies

provoquées par des viandes importées (cheval d’Amerique du Nord et ours du Canada).

56

VEHICULES DATE Département NOMBRE DE

CAS

ORIGINE DES

VIANDES 1876 60 21 1983 13 21 PORC 1998 76 3 1952 08 7 1977 66 4 1979 83 3 1982 64 5

1984 65 13 1985 18 39 1988 06 11 1992 13 4 1993 06 8 1993 06 4 1994 34 3 1998 13 4 1998 76 4 2002 11 4 2003 06 6

2006 83 4

SANGLIER

2006 83 3

France

1975 92 125 Europe de l’Est 1985 75,77 431 Etats-Unis

1985 75, 94, 92, 45, 69,

51, 57, 27 642

Europe de l’Est (Pologne ?)

1991 63 21 Etats-Unis 1993 75, 78, 77, 17 538 Canada 1994 77 7 Mexique 1998 82, 31, 81 128

CHEVAL

1998 81, 31 407 Yougoslavie

Tableau 4. Epidémies de trichinellose en France, répertorié par la source d’infestation

(CNR de Trichinella)

1.2.3.2. En Roumanie

Le premier cas de trichinellose humaine et porcine, en Roumanie, a été diagnostiqué

en 1868. Depuis, de très nombreux foyers ont été identifiés. Le système d’élevage très intensif

dans les années 1980 ( fermes d’etat comprenant plus de 50.000 têtes) et fortement contaminé

par Trichinella a conduit à une infestation massive du cheptel porcin. Selon la Commission

57

Internationale de la trichinellose, Trichinella est responsable de la zoonose majeure en

Roumanie avec 617 cas humains répertoriés par an (ce qui est bien supérieur au nombre de

cas de leptospirose ou de fièvre charbonneuse). Selon l’OIE, la Roumanie occupe la première

place en 2000 pour la trichinellose porcine avec 2872 cas déclarés (prévalence proche de celle

de la Croatie avec 2296 cas).

1.2.3.2.1. Animaux domestiques

Quatre millions des porcs ont été abattus entre 1990-1999 dans le sud du pays, et 6000 porcs

ont été trouvés infestés avec de T. spiralis (pourcentage qui varie entre 0.04% et 1.35% par

an) (Olteanu, 2001). Le taux d’infection des élevages de porc qui a dépassé les 20% dans

certaines régions au début des années 1990 (Murrell and Pozio, 2000), présentent au niveau

national, une nette décroissance de 0,09% en 1990 à 0,04 en 2003 (Figure 8). Cette très forte

incidence s’expliquait par la contamination massive d’élevages « engraisseur » par des fermes

d’état fortement contaminées et non contrôlées à la suite des changements politiquse survenus

dans ce pays. La contamination du porc apparaît liée à la consommation de rats contaminés ou

de déchets d’abattoir (eaux grasses) non stérilisés. Depuis, une décroissance constante est

survenue en Roumanie, qui demeure cependant avec un des plus forts taux de contamination

de la faune sauvage et domestique de l’Europe de l’Est. Le porc, est le vehicule principal pour

l’infestation humaine en Roumanie. Les chevaux ne sont pas abattus pour la consommation de

viande en Roumanie mais sont exportés vers l’Italie, la France et la Belgique qui collectent

80% des chevaux consommés dans le monde.

1.2.3.2.2. Faune sauvage dans les départements de Transylvanie

Un étude épidémiologique a été réalisée entre 1992-1997 dans 7 départements de

Transylvanie pour déterminer la prévalence de la trichinellose chez le sanglier et l’ours

(Gherman et al., 1998). Le nombre de sangliers reconnus positifs fut de 57 pour 12260

chassés (0,46%). L’ours a présenté un taux d’infestation de 14,83% (54 cas positifs sur 364

animaux tués). La faune sauvage reste le réservoir principal de la trichinellose et représente

pour les animaux domestiques élevés en plein air un risque majeur de contamination.

58

1312

875

2095

3172

5250

5305

6001

10540

9359

6944

2165

5069

5226

7928

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003

0,09

0,15

0,11

0,15

0,09

0,11

0,04

0,1

0,15

0,07

0,08

0,06

0,03

0,04

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003

A

B

Figure 8 : Le nombre des porcs positifs (A) et le taux de l’infestation à Trichinella chez

le porc domestique (B) en Roumanie entre 1990-2003

59

1.2.3.2.3. Trichinellose humaine

Des cas de trichinellose humaine ont été retrouvés dans toutes les provinces de la Roumanie.

Au cours des 10 dernières années il y a eu une recrudescence avec de nombreux petits foyers

dus à la consommation de porcs élevés en plein air et non soumis à l’examen trichinoscopique

obligatoire dans tous les abattoirs (Figure 9).

1.2.3.2.4. Méthode de contrôle de la trichinellose porcine

La méthode principale repose sur l’examen trichinoscopique qui, malgré son coût élevé

(temps de lecture) et la nécessité d’un équipement particulier protège le consommateur d’une

infestation massive, mais elle ne détecte pas l’infestation avec l’espèce faiblement kystogene,

T.pseudospiralis. La méthode de digestion artificielle est utilisée dans les cas de confirmation.

La méthode ELISA utilisant les antigènes Excrétion-Sécrétion n’est pas utilisée.

1.2.3.2.5. Espèces de Trichinella en Roumanie

L’espèce de trichine retrouvée majoritairement dans les cas de trichinellose animale est T.

spiralis chez les animaux domestiques, tandis que, dans le cycle sylvatique, T.britovi est

l’espèce trouvée dans 90% des cas. (Cuperlovic et al., 2005; Olteanu, 2001) affirme avoir

identifié deux autres espèces de Trichinella: T.nativa et T.pseudospiralis.

1527

2147

3014

1965

431

665

1387

1176

15171653

2037

1021 980

3649

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003

Figure 9 : Le nombre des cas humains de trichinellose en Roumanie entre 1990-2003

60

C- Trichinella et trichinellose:

Le cas de Trichinella pseudospiralis

62

Pendant les années qui ont suivis la découverte de Trichinella pseudospiralis chez un

raton laveur (Procyon lotor) en Russie (Caucase) (Garkavi, 1972), très peu de rapports ont

été documentés (Shaikenov and Boev, 1983). Cependant, en 1990-1992, de nouvelles

découvertes de ce parasite ont été réalisées en Tasmanie impliquant des marsupiaux et des

oiseaux (Obendorf and Clarke, 1992; Obendorf et al., 1990b). Dans les années suivantes, un

nombre de plus en plus important de rapports a concerné T. pseudospiralis dans la faune

domestique et sylvatique (Gamble et al., 2005; Hurnikova et al., 2005; La Rosa et al., 2001;

Oivanen et al., 2002; Pozio et al., 2004b; Pozio and Zarlenga, 2005) et chez l'homme (Pozio,

2001a). Sa présence a été montrée en Asie, Australie, Europe et en Amérique du Nord.

Aujourd'hui, ce parasite a été trouvé dans 14 espèces de mammifères et 13 espèces d’oiseaux

(Pozio, 2005). Les rapports croissants de la présence de T. pseudospiralis chez le porc

domestique et sauvage en Europe aussi bien que dans d'autres régions du monde, comme les

Etats-Unis et la Thaïlande, et le caractère zoonotique, suggèrent que cette espèce est

également à l’origine de problèmes de santé publique plus sérieux qu’initialement envisagés.

Dés sa découverte, T.pseudospiralis a intrigué le monde scientifique tout d’abord par

l’absence d’une capsule visible au microscope optique, contrastant avec celle bien visible de

l’espèce T. spiralis, ainsi que par le spectre d’hôte beaucoup plus large, car T.pseudospiralis

peut infecter les oiseaux. Malgré des différences morphologiques et biologiques concernant

surtout la longueur des adultes et larves musculaires, la production des larves nouveau-nées

par les femelles ou l’index de la capacité de reproduction chez le rat (Kapel, 2000a; Murrell et

al., 2000), les larves infestantes de deux espèces de trichine présentent la capacité de pénétrer

l’intestin grêle et de migrer dans les muscles striés.

1.1. Différences et similitudes dans la myopathie

induit par T.pseudospiralis et T.spiralis

La capsule que T.spiralis réalise dans la cellule musculaire striée, est constituée de la

cellule musculaire dédifférenciée transformée en cellule nourricière (Despommier, 1993;

Purkerson and Despommier, 1974) et d’une capsule fibreuse (la paroi) entourant la cellule.

L’intérieur de la paroi est formé de collagène produit par la cellule nourricière elle-même,

tandis que l’extérieur de la paroi est formé par les fibroblastes adjacents (Despommier, 1993;

Matsuo et al., 2000). De nombreux auteurs ont mis en doute la capacité des larves nouveau-

63

nées de T.pseudospiralis à pénétrer dans les cellules musculaires pour pouvoir induire la

formation d’une cellule nourricière. En effet des travaux de Al Karmi et Faubert (1981) et Al

Karmi et al. (1993) ont montré que les larves musculaires de T.pseudospiralis peuvent être

mobiles, en se déplaçant entre ou à travers les fibres musculaire dans un diaphragme de

souris. Précédemment (Pawlowski and Ruitenberg, 1978) font mention brièvement d’une

« pseudocapsule » autour de T.pseudospiralis. Les travaux plus récents de Xu et al.(1997) et

Sacchi et al.(2001) réalisée par microscopie électronique (TEM) ont apporté plus de

précisions ; en effet T.pseudospiralis entre dans la cellule musculaire et la transforme en une

cellule nourricière sans que celle-ci soit entourée par une capsule épaisse de collagène. Ces

travaux, corrélés avec ceux précédemment réalisés par Haehling et al.(1995), ont montré que

les larves de T.spiralis induisaient la production in vivo de collagène de type IV sur

l’extérieure de la paroi du capsule. Le collagéne est sécrèté par les fibroblastes 250 fois plus

nombreux autour des larves encapsulées de T.spiralis que les larves de T.pseudospiralis. Les

travaux de Xu et al. (1997) ont montré en même temps qu’au niveau de la structure

subcellulaire, les cellules nourricières des deux espèces se ressemblent.

Peu après la pénétration des larves nouveau-nées de T.spiralis, la cellule musculaire

perd ses myofibrilles caractéristiques et va être transformée en cellule nourricière

(Despommier et al., 1991; Jasmer, 1993; Matsuo et al., 2000). La pénétration des larves

nouveau-nées de T. pseudospiralis dans les cellules musculaires induit également la

désintégration des myofibrilles, bien qu'elle le fasse plus lentement. Ainsi Boonmars et al.

(2005) et Mastsuo et al. (2000) montrent que la myopathie induit par T.pseudospiralis à 23

jours post infestation est équivalente au niveau histopathologique avec celle induite par

T.spiralis à 10 jours post infestation. Généralement le sarcoplasme endommagé de la fibre

musculaire est rapidement isolé du sarcoplasme intact voisin pour réduire au minimum la

nécrose après des dommages musculaire (Grounds, 1991). Cet isolement est observé

également dans le cas d’une infestation avec T. spiralis. Ainsi Matsuo et al. (2000) ont

montré la formation d’une cloison intracellulaire, le sarcoplasme isolée (the sealed

sarcoplasm) est devenu la cellule nourricière où le nematode continue a vivre. Cette

compartimentalisation n’a jamais été observée avec T. pseudospiralis (Wu et al., 2001). En

conséquence, la totalité de la cellule musculaire est affectée par l’infection par T.

pseudospiralis, et un grand nombre de cellules satellites sont activées.

Les cellules satellites (myoblastes) prolifèrent en réponse aux dommages causés à la

cellule musculaire par l’infestation de Trichinella comme dans le cas de réparation d'autres

dommages musculaires (Wu et al., 2001). Dans les processus de réparation normaux, les

64

cellules satellites vont proliférer et subir une dédifférenciation pour devenir de nouvelles

cellules musculaires par fusion avec les cellules musculaires endommagées (Bischoff and

Heintz, 1994). Dans le cas de l’infestation avec Trichinella ils vont subir une activation et

une dédifférenciation en cellule nourricière (au lieu de cellules musculaire) et fusionner avec

la cellule musculaire infestée (Wu et al., 2001). L’infestation à T. pseudospiralis génère

également une prolifération des cellules satellites, plus intensivement que pour T. spiralis,

mais ces cellules développent un cytoplasme amorphe qui ne va jamais fusionner avec la

cellule nourricière (Wu et al., 2001).

Concernant la réaction musculaire de la part de l’organisme hôte, Matsuo et al. (2000)

ont pu observer l’apparition d’un septum intracellulaire dans le cas d’une infestation à

T.spiralis, utilisée pour limiter l’étendue de la myopathie. L’absence de ce septum, observé

par Wu et al., (2001), dans le cas d’une infestation à T.pseudospiralis génère une myopathie

plus étendue et plus diffuse (Boonmars et al., 2005). Ainsi à 90 jours post infestion 50% des

cellules musculaires sont affectées par la myopathie (Boonmars et al., 2005). D’une manière

générale, l’infection à T.pseudospiralis génère une myopathie qui s’installe plus lentement,

elle est plus diffuse et elle dure plus longtemps, par rapport à la myopathie induite par

T.spiralis (Boonmars et al., 2004; Boonmars et al., 2005).

Si la génétique fondamentale des mécanismes moléculaires nécessaires à la

reprogrammation du muscle squelettique est actuellement inconnue, le rôle des protéines

d’excrétion/sécrétion (E/S) larvaire dans la formation et/ou l'entretien du complexe de la

cellule nourricière est documenté (Despommier, 1990, 1993; Ko et al., 1994; Lee et al., 1991;

Leung and Ko, 1997; Yao and Jasmer, 1998). Les différences morphologique et biochimique

de la cellule nourricière de T.spiralis et T.pseudospiralis suggèrent fortement que les deux

espèces influencent la cellule musculaire de manière différente (Boonmars et al., 2004;

Bruschi et al., 2003). Cette différence peut s’expliquer par la sécrétion de parakines

spécifiques pour chacune des espèces. Le stichosome de T.spiralis, l’organe principal pour la

synthèse des protéines d’E/S, contient cinq types de granules qui diffèrent dans leur forme,

taille, contenu et distribution dans le stichosome : α1 et α2 contiennent des inclusions alors

que α0, β et γ ne contiennent pas d’inclusions (Takahashi et al., 1989). En revanche chez

T.pseudospiralis, Wu et al. (1998) ont mise en évidence seulement trois types des granules

qui sont similaires, mais différents des ceux de T.spiralis: les granules qui ne contiennent pas

d’inclusions sont équivalents aux granules β de T.spiralis, mais sont différents dans leur

morphologie. Les granules à inclusions de T.pseudospiralis (α1-like et α2-like) présentent une

ultrastructure différente de celles de T.spiralis. De plus, l’analyse biochimique des produits

65

d’E/S de T.spiralis et T.pseudospiralis ainsi que la carte des peptides d’E/S (Wu et al., 1998b;

Zhang et al., 1993) montrent l’existence des certains produits spécifiques pour chacune

d’entre elles (pour T.spiralis des protéines qui migrent à 40, 50 et 80 kDa : TSE1-4, TSE16-

25 et TSE26-27 ; pour T.pseudospiralis des protéines qui migrent à 35, 55, 60 et 90 kDa :

TPE1-9, TPE22-24, TPE25-27 et TPE28-31) et certaines communes aux deux espèces (des

peptides qui migrent à 45kDa : TSE-8/TPE-15, TSE-9/TPE-16, TSE-12/TPE-20). Les

travaux de (Li et al., 1999) ont montré encore que le profil de distribution d’epitopes E/S dans

la cellule musculaire infestée par T.spiralis ou T.pseudospiralis différent fondamentalement.

Les epitopes sont groupés autour de la cellule nourricière de T.spiralis alors qu’ils sont

disposés sur toute la longueur de la fibre musculaire infestée et des fibres adjacentes dans le

cas de T.pseudospiralis.

1.2. Réponses cellulaires comparées de

T.pseudospiralis et T.spiralis

Concernant la réponse cellulaire de la part de l’organisme hôte, T.pseudospiralis induit

une réponse moins important que T.spiralis (Kramar et al., 1981; Li and Ko, 2001) (Figure

10). De plus, des macrophages cultivés in vitro avec un extrait total des larves de

T.pseudospiralis, n’arrivent pas à produire de l’oxyde nitrique, qui joue pourtant un rôle

essentiel dans la persistance du parasite dans l’organisme hôte (Andrade et al., 2006). Ce

résultat confirme ainsi la faible réponse cellulaire induite par T.pseudospiralis.

Les mécanismes de cette adaptation sont encore inconnus, même si plusieurs

hypothèses ont été émises : une première suggestion est que T.pseudopiralis induirait une état

d’immunodépression par la sécrétion de corticostérone (Boles et al., 2000; Larsen et al., 1991;

Stewart and Larsen, 1989; Stewart et al., 1988) ; plus précisément la suppression de la

réponse chimiotactique des neutrophiles a été montrée chez la souris infestée par

T.pseudospiralis (Bolas-Fernandez and Wakelin, 1990; Kehayov et al., 1991; Shupe and

Stewart, 1991) ; enfin, la réponse cellulaire différente peut s’expliquer également par une

variation entre les antigènes de larves nouveau-nées des deux espèces induisant l’immunité de

l’organisme hôte (Bolas-Fernandez and Wakelin, 1990; Kehayov et al., 1991).

66

Les travaux de Li et Ko (2001) ont montré qu’une infection mixte des deux espèces

n’empêche pas une réponse cellulaire intense autour des capsules de T.spiralis. Recement

Furze et Selkirk (2005) et Lee et Ko (2006) ont demontré que le profil de la réponse

immunitaire (Th1/Th2) est le même pour les deux espèces. Ces resultats suggèrent que le

faible réponse cellulaire autour de la larve musculaire de T.pseudospiralis, impliquerait des

mécanismes locaux et non systémiques, comme cela avait été soupçonné auparavant.

Figure 10. Section histologique dans le muscle de la souris à 23 jours post infestation avec

T.spiralis (A) et T.pseudospiralis (B). Une infiltration cellulaire massive peut être observé

inter-fibrillaire et autour de la larve de T.spiralis, réponse cellulaire absente pour

T.pseudospiralis (d’après Li et Ko, 2001)

67

1.3. Protéines d’excrétion/sécrétion de

T.pseudospiralis et de T.spiralis

L'identification et la caractérisation des protéines E/S spécifiques des espèces

parasitaires infectantes sont fondamentales pour comprendre le mécanisme par lequel le

complexe hôte-parasite est établi et maintenu par les deux espèces. Chez T.spiralis parmi les

protéines d’E/S ont été identifiées des protéines de choc thermique (Ko and Fan, 1996), des

endonucléases (Mak and Ko, 1999), des proteases à serine (Moczon and Wranicz, 1999), des

protéines se fixant à l’ADN et des inhibiteurs de protéase à serine (Nagano et al., 2001b).

Chez T.pseudospiralis en revanche, malgré leur implication dans des réactions telles que

l’immunosuppression (Al Karmi and Faubert, 1981; Stewart et al., 1988; Stewart et al., 1985)

ou la ligation d’ADN (DNA-binding activity) (Mak and Ko, 2001), l’identification des

protéines E/S fonctionnelles est relativement limitée. Le tableau 5 résume les gènes, codants

pour des protéines E/S, identifiées jusqu’a présent chez T. pseudospiralis. Les séquences

complètes sont disponibles et la caractérisation moléculaire a été réalisée. Elles partagent un

certain degré de similitude en terme de séquence d’ADNc avec les gènes homologues de

T.spiralis. Les séquences en acides aminés déduites permettent d’obtenir des peptides

semblables pour les deux espèces de Trichinella en ce qui concerne les masses moléculaires et

l’antigenicité (Kehayov et al., 1991; Kuratli et al., 2001; Kuratli et al., 1999; Nagano et al.,

2004; Vassilatis et al., 1996; Wu et al., 1998b, 1999b; Zhang et al., 1993). La protéine de 21

kDa, localisée dans le stichosome de T.pseudospiralis présente une fonction inconnue, tout

comme son homologue, ORF 17.20, chez T.spiralis. Aucune activité protéasique ou

inhibitrice de protéase n’a pas pu être mise en évidence (Nagano et al., 2001a). Une autre

protéine localisée dans le stichosome de T.pseudospiralis a été identifiée par Chung et Ko

(1999). Celle-ci a une masse moléculaire de 23 kDa ; sa présence a été détectée dans les

produits d’E/S uniquement chez T.pseudospiralis, et le gène codant est présent en copie

unique dans le génome de T.pseudospiralis. Aucune activité spécifique n’a été détectée

encore. La protéine de 28 kDa (Tp22-3) identifiée par Nagano et al. (2002), chez

T.pseudospiralis est un autre exemple de protéine d’E/S qui partage un certain dégré

d’identité antigénique avec celle de T.spiralis comme révélé par l’analyse de Western-Blot.

La Tp22-3 a été immunolocalisée dans les granules β du stichosome des larves musculaires

(30 jour post infestation) et dans les granules I du stichosome des adultes (6 jours post

infestation). La fonction ainsi que l’activité de cette protéine sont inconnues pour le moment.

68

Une nouvelle protéine d’E/S avec une masse moléculaire de 34 kDa a été identifiée

récemment chez T.pseudospiralis par Nagano et al. (2006). Elle présente une similarité

importante (55-66%) avec les protéines Rcd1 (required cell differentiation) des autres

eucaryotes. Elle est exprimée préférentiellement au stade larve musculaire et est localisée au

niveau des stichocytes ; sa fonction exacte est inconnue, mais elle pourrait être impliquée, en

tant que co-facteur de la transcription, dans la dédifférenciation musculaire en coopération

avec d’autres produits E/S (Nagano et al., 2006). La séquence homologue du gène codant

pour la proteine de 34 kDa de T.pseudospiralis a été retrouvée (400/1200 bp) dans la banque

d’EST de T.spiralis (tableau 5). De plus amples caractérisations ont été réalisées sur les

protéines Tp38 et Tp53 de T.pseudospiralis, qui présentent un degré différent d’identité avec

les séquences déjà décrites pour Ts43 et Ts53 de T.spiralis (Nagano et al., 2004). Les deux

gènes sont présents en copie unique dans le génome de T.pseudospiralis, Tp38 ayant une

activité immunodominante plus faible que Tp53. Les travaux précédents ont montré que les

deux protéines sont formées d’un mélange de peptides avec une masse moléculaire similaire

(9 peptides pour la bande de 38 kDa et 12 peptides pour celle de 53 kDa), présentant tous une

antigenicité TSL-1 (Trichinella spiralis larva antigène group 1, contenant le beta tyvelose,

Appleton et al., 1991) (Wu et al., 1998b, 1999b). Seulement 3 peptides sont reconnus par les

anticorps anti-Tp38 ou anti-Tp53. Ils ont une localisation similaire avec ceux de T.spiralis,

dans les granules alpha (Tp38) et beta (Tp53) du stychocyte ; une différence notable est

l’absence de Tp38 dans les noyaux et le cytoplasme de la cellule nourricière contrairement au

Ts43 (Arasu et al., 1994; Nagano et al., 2004; Romaris et al., 2001; Vassilatis et al., 1992). De

plus la détection de Tp38 est limitée au stade larve musculaire (13-33 jours post infestation),

tandis que Tp53 est détectée uniquement à partir de 23 jours post-infestant. Ces resultats

suggèrent que Tp38 joue un rôle dans la dédifférenciation de la cellule musculaire et la

formation de la capsule, alors que la Tp53 est impliquée dans la persistance parasitaire et la

modulation de la réponse immunitaire (Nagano et al., 2004; Wu et al., 2002). Un profil

similaire de détection à été retrouvé chez T.spiralis (Wu et al., 2002). Selon les travaux de

Kuratli et al., (1999, 2001), la protéine TsJ5/TpJ5 est impliquée in vitro dans l’inhibition de la

liaison ADN : myosine D chez la souris.

69

Tableau 5 : Les différents gènes codants pour des protéines d’E/S chez T.pseudospiralis et leurs homologues chez T.spiralis (EST= Express Sequence Tag ; WB= Western Blot)

Clone

Identité avec la séquence

nucléotidique de T.spiralis

Identité avec la séquence en amino acides de

T.spiralis

Masse moléculaire

(kDa)

Séquence similaire chez T.spiralis

Référence bibliographique

Tp21-3

87%

76% 21 ORF 17.20 (Nagano et al., 2001a)

Tp3-1

- - 23 - (Chung and Ko, 1999)

Tp22-3

-

- WB positif avec extraits total de L1M T.spiralis

28 - (Nagano et al., 2002)

Tp8

94% (EST)

- 34 BQ541501 (Nagano et al., 2006)

Tp38

90%

84% 38 Ts43

(Nagano et al., 2004; Vassilatis et al., 1992; Vassilatis et al., 1996)

Tp53

85%

68% 53 Ts53 (Nagano et al., 2004; Zarlenga and

Gamble, 1990)

TpJ5

86%

83% 105 TsJ5 (Kuratli et al., 2001)

70

1.4. Expression différentielle de gènes chez

T.pseudospiralis et T.spiralis

Une partie de protéines exprimées par Trichinella et identifiées jusqu’à présent sont

représentées par des protéines codées par des gènes de « ménage ». Elles ont un impact faible vis

à vis de l’organisme hôte, même si elles jouent probablement une fonction important dans la

survie du parasite. C’est le cas du gène tbhsp qui code pour la protéine de choc thermique de

70kDa de l’espèce Trichinella britovi (Vayssier et al., 1999). Ce gène est exprimé aussi bien par

T.spiralis que par T.pseudospiralis à toutes les stades étudiés : Ad-6 jours post infesation, L1NN,

L1M-15 jours post infestation et L1M-35 jours post infestation (Wu et al., 2002). Une différence

est tout de même notable dans le niveau d’expression de ce gène, pour les différents stades

parasitaires des deux espèces de Trichinella, avec un ratio de 0,35 pour les L1NN et de 0,95, 0,95

et 1,31 pour les Ad6, L1M-15 jpi et L1M-35jpi. Le ratio d’expression représente le résultat de la

PCR semiquantitative utilisant le gene 18S de l’ARNr de Trichinella spiralis comme gène

standard. L’expression du gène tsj5, qui code pour une protéine impliquée dans la myogénèse,

permet la construction du tissu musculaire propre au parasite (Lindh et al., 1998). Ce géne

présente un profil similaire pour son expression à tbhsp pour les quatre stades parasitaires et les

deux espèces T.spiralis et T.pseudospiralis (Wu et al., 2002). Ainsi la proteine codée par tsj5 est

identifiée à tous les stades parasitaires pour les deux espèces, avec une différence dans leur

niveau d’expression : un ratio de 0,40 pour les L1NN, 0,68, 0,74 et 1,29 pour les Ad-6 jpi, L1M-

15 jpi et L1M-35 jpi respectivement.

Plusieurs protéines d’excrétion/sécrétion ont été identifiées chez Trichinella. Leur

antigénicité a été décrite. Ces protéines induisent une réaction immunitaire vis à vis du parasite

qui n’est pas protectrice. Récemment, Wu et al. (2002) ont regardé si des protéines telles que

Tp38/Ts43, Tp53/Ts53 ou TsORF préalablement identifiés dans les produits d’E/S, présentaient

un profil d’expression différent chez les Ad6, L1NN, L1M-15 jpi et L1M-35 jpi de T.spiralis et

T.pseudospiralis. Ces travaux ont montré que les gènes tp38/ts43, tp53/ts53 ou tsorf, sont

exprimée de façon spécifique à certains stades. Ainsi l’expression du gène codant pour

Tp38/Ts43 a été identifiée chez les larves musculaires (15 et 35 jours post infestation) de

T.spiralis et de T.pseudospiralis mais elle n’a pas pu être détectée chez les Ad6 ou les L1NN. Il

existe une différence dans le niveau d’expression entre les deux types de larves musculaires avec

un niveau plus élevé pour les larves âgées de 35 jours par rapport aux larves de 15 jours post-

71

infestation (le ratio d’expression est de 1,04 et de 0,54 pour T.spiralis respectivement de 1,16 et

0,67 pour T.pseudospiralis). Un profil différent d’expression a pu être mis en évidence pour

tp53/ts53 et tsorf, qui sont exprimés aux stades Ad6 et L1M-35 jpi pour les deux espèces de

Trichinella. En revanche ces gènes ne sont pas exprimés aux stades L1NN et L1M-15 jpi.

Aucune différence majeure n’a pas été mise en évidence en ce qui concerne le niveau

d’expression pour les stades Ad6 et L1M-35 jpi entre T.spiralis et T.pseudospiralis. Le même

profil d’expression a pu être détecté pour la protéine Tp22-3 (Nagano et al., 2002) par analyse

de Western Blot à partir des extrait totaux des Ad6, L1NN, L1M-15jpi et L1M-35jpi de T.spiralis

et T.pseudospiralis. Aucun signal positif n’a été obtenu pour les larves nouveau-nées ou les

larves musculaires de 15 jours post infestation. L’analyse par RT-PCR a confirmé ce résultat,

signifiant que la protéine est probablement excrétée après la formation de la capsule.

L’analyse des cinq gènes codant pour des protéines d’E/S ou pour les gènes de

« ménage », nous montrent des différences pour les deux espèces de Trichinella dans leur niveau

d’expression pour différents stades parasitaires (Ad6, L1NN, L1M-15 jpi et L1M-35 jpi) : des

différences mineures pour les protéines de structure et des différences majeures pour les protéines

E/S sont observées. Le niveau d’expression des protéines d’E/S change avec la formation de la

capsule aussi bien pour T.spiralis que pour T.pseudospiralis, ce qui est en parfaite concordance

avec le phénotype des larves non-infestantes (L1M-15 jpi) ou infestantes (L1M-35 jpi). En

revanche, aucune différence significative n’a pas pu être observée dans leur niveau d’expression

entre les deux espèces de Trichinella, qui se differencient dans la formation de leur capsule ou

dans la réaction de l’organisme hôte.

En conclusion, lors de la transformation de la cellule musculaire en cellule nourricière,

les deux espèces de Trichinella, T. spiralis et T. pseudospiralis influencent la cellule musculaire

hôte d’une manière différente. La réponse cellulaire induite par les deux espèces différent aussi,

avec une plus faible réponse cellulaire autour de la larve musculaire de T.pseudospiralis en

comparaison avec celle induite par T.spiralis. L’ensemble de ces résultats peut s’expliquer par la

sécrétion de protéines d’excrétion/sécrétion spécifiques pour chacune des espèces. L’expression

différentielle des gènes codant pour des protéines d’excrétion/sécrétion chez T.pseudospiralis et

T.spiralis montre un changement de profil après la formation de la capsule. En revanche aucun

gène spécifique d’espèce pouvant expliquer en partie les différences notables entre les deux

espèces n’etait pas caractérisé quand nous avons initié cette étude.

72

2. Objectifs et stratégie de recherche

74

Les objectifs du travail concernent l’analyse de la diversité génétique des populations de

trichine dans une région à forte prévalence et l’identification de marqueurs génétiques pour

différencier les espèces européennes notamment en se focalisant sur l’espèce Trichinella

pseudospiralis. Pour cela seront identifiées et caractérisées, les espèces agents étiologique des

cas de trichinellose sylvatiques et domestiques en Roumanie. Une comparaison avec les espèces

de trichine isolées en France sera effectuée. La prévalence de l’espèce de trichine non encapsulée

(T.pseudospiralis) sera définie en Roumanie. Un isolement et une caractérisation des gènes

spécifiques de T.pseudospiralis et l’analyse de leur antigénicité seront réalisés.

Objectif général

L’objectif de l’ensemble des recherches menées concerne la lutte contre les trichinelloses

animales en Europe et tout particulièrement en Roumanie, un foyer important de trichinellose

humaine et animale au cours des dernières 25 années. En France, les dernières grandes épidémies

de trichinellose affectant plusieurs centaines de personnes provenaient de l’importation de

chevaux d’un pays de l’Europe de l’Est (Roumanie, Serbie ou Pologne). La Roumanie comme

nouvel état membre de l’UE nécessite une adaptation de ses plans de surveillances en matière de

trichinelloses animale et aussi une réévaluation de son système officiel de contrôle fondé sur la

trichinoscopie de la viande. Cette technique, lourde et moins sensible que la digestion artificielle,

ne permet pas de détecter l’espèce Trichinella pseudospiralis qui est néanmoins infestante pour

l’homme. Or la France a été le premier pays européen où une infestation humaine avec T.

pseudospiralis a été signalée en 2000 par Ranque et al. en Camargue. Depuis, l’espèce non-

encapsulée de T.pseudospiralis a été signalée dans la faune sauvage ou chez le porc domestique

dans un tiers des pays de l’Europe. Une recherche de cette espèce particulière a été entreprise

dans le delta du Danube.

La cellule nourricière pour les espèces de Trichinella capsulées (T. spiralis comme prototype)

et non-capsulées (T.pseudospiralis comme prototype) différent

fondamentalement. Or la biologie de ce complexe cellulaire explique la rémanence du parasite

chez son hôte. En effet, les espèces kystogènes survivent de nombreuses années chez les

mammifères hôtes à l'inverse des espèces non-kystogènes plus rapidement éliminés par différents

facteurs dont la réaction immunitaire de l'organisme hôte. A l'inverse les espèces non-kystogènes

ont un plus large spectre d'hôtes (et sont donc invasives pour les espèces aviaires).

75

L’ensemble de ces données justifie la stratégie d’identifier et caractériser des gènes spécifiques

pour T.pseudospiralis qui pourraient aboutir au développement d’un test de diagnostic

sérologique spécifique d’espèce chez le porc et le sanglier.

Objectifs scientifiques Ils étaient doubles et concernaient:

1. l’analyse de la diversité des génomes de Trichinella dans une région européenne ayant

une forte prévalence. La Roumanie a été choisie comme région géographique cible.

2. l’analyse de la diversité des gènes dans le genre Trichinella, avec une attention

particulière pour les espèces non-capsulées.

Pour ces deux parties l’étude s’est focalisée sur l’espèce T. pseudospiralis puisque sa prévalence

n’était pas connue avec précision en Europe et cette espèce apparait comme la plus divergente

dans le genre Trichinella compte tenu de l’absence d’une cellule nourricière visible au

microscope et de quelques difference morphologiques.

Afin d’identifier les différentes espèces de Trichinella sévissant en Roumanie, plusieurs études

complémentaires ont été menées. Tout d’abord, des analyses rétrospectives des résultats

d’analyse officielles des contrôles porcins joints à la description du nombre de cas cliniques de

trichinellose ont été réalisées. Si les études de ce type étaient nombreuses en Europe, aucun bilan

précis ne faisait état de la trichinellose (humaine ou animale) en Roumanie au début de cette

étude. Dès lors, une comparaison des situations épidémiologiques en Roumanie et en Europe était

tentante, ce qui a été réalisée. Des enquêtes de terrain utilisant la surveillance de différentes

espèces animales cibles (cheval, porcs notamment) ont ensuite été menées. Nous nous sommes

intéressés à identifier les différentes espèces de Trichinella circulant dans la faune sauvage et

domestique en Roumanie pour pouvoir répondre à la question « Quel cycle épidémiologique

permet la contamination des espèces sauvages et domestiques ? ». Les souches roumaines de

trichine isolées de différentes espèces animales ont été comparées à des souches françaises

notamment celles provenant des derniers épisodes de trichinellose. La surveillance de l’espèce

équine a été entreprise en Roumanie puisqu’aucune étude de grande ampleur n’avait été réalisée.

Cette étude était particulièrement importante car, la France importe principalement des pays

d’Europe de l’Est 80% des chevaux consommés. La Roumanie est un des principaux pays

fournissant des animaux vivants ou des carcasses de chevaux abattus aux trois pays

consommateurs de viande équine que sont la Belgique, la France et l’Italie. Compte tenu des

habitudes culinaires, seules la France et l’Italie présentent un risque.

76

La seconde partie de notre étude a concerné l’analyse de marqueurs génétiques permettant la

différenciation des espèces au sein du genre Trichinella ou expliquant leur biologie différente en

fonction des espèces hôtes. Cette approche s’est tout d’abord focalisée sur la comparaison de

protéines conservées dans le genre Trichinella (GST 24, sérine protéase). Des marqueurs

concernant la variation au sein du genre Trichinella ont ensuite été définis avec le séquençage des

gènes codant pour les ARN mitochondriaux dans différentes espèces du genre. L’espèce

T.pseudospiralis était très divergente pour l’ensemble de ces marqueurs étudiés mais dans tous

les cas les différences portaient sur le pourcentage d’identité d’un gène homologue. Afin

d’identifier des gènes spécifiques de l’espèce T pseudospiralis différentes approches ont été

menées :

1) Approche par l'analyse comparative de transcriptomes

Des banques d'ADNc représentatives de Trichinella pseudospiralis (Tps) et Trichinella spiralis

(Ts) ont été établies au stade Ll musculaire (L1M) en utilisant des parasites purifiés après passage

dans des conditions identiques. Des banques d’ADNc soustractives Tps-Ts et Ts-Tps ont été

établies.

2) Approche par l’analyse d’EST

10.000 EST provenant des banques des stades Adulte, L1nouveaux nées (L1NN), L1M de

l’espèce non-capsulée Trichinella pseudospiralis ont été préparés puis séquencés. Une analyse

avec les EST de l’espèce capsulée Trichinella spiralis a été réalisée pour pouvoir identifier des

séquences spécifiques.

78

3. Résultats

80

I. Variabilité temporelle et spatiale de

Trichinella La décroissance de l’incidence de la trichinellose humaine est liée à la maîtrise de

l’élevage porcin de type hors sol et à la puissance des contrôles sanitaires mis en place. Le

développement de l’élevage au contact de la faune sauvage ou l’insuffisance du contrôle

vétérinaire (dérèglement par des conflits militaires, coût…) sont les deux causes principales de

l’émergence de cette parasitose chez l’homme dans différentes parties du monde. Comme facteur

potentialisant existe l’habitus alimentaire ; le choix délibéré de consommer des aliments peu cuits

repose sur un comportement alimentaire souvent très codifié transmissible de génération en

génération. Le caractère « héréditaire » explique la stabilité dans certaines régions du monde de

ces coutumes associées à des pathologies transmises par voie alimentaire. Un exemple de ces

habitus alimentaires et de leur impact sur le nombre de cas de trichinellose est décrit dans la

première étude menée en Roumanie.

1. Dispersion de Trichinella dans une région à

forte endémicité La première partie du travail a concerné l’analyse de la dispersion de Trichinella en

Roumanie prise comme région à forte endémicité. La multiplicité des espèces sévissant dans le

temps et l’espace dans ce pays a été analysée.

Tout d’abord nous nous sommes intéressés à montrer le lien entre le nombre de cas de

trichinellose en Roumanie et les habitudes alimentaires des populations d’origine allemande

implantées depuis plusieurs siècles dans des régions bien précises. Ces populations ont importé

l’habitude de consommer de la viande de porc sous forme de saucisses, habitude se perpétuant

jusqu’à aujourd’hui. Nous avons ensuite analysé les répartitions spatiales des cas de trichinellose

et le degré de l’infestation à Trichinella dans la faune sauvage et domestique. Une enquête a été

menée chez un herbivore particulièrement sensible à Trichinella (le cheval). Au cours des

multiples enquêtes décrites seules deux espèces de Trichinella ont pu être identifiées en

Roumanie.

81

1.1. La découverte de la trichinellose, un aperçu sur

l’histoire de la trichinellose en Roumanie (article 1)

La Roumanie est un des pays les plus affectés au monde par le parasite Trichinella avec 780 cas

humains déclarés sur 3109 en 2004 (enquête de la Commission Internationale pour la

Trichinellose en 2004, http ://monsite.wanadoo.fr/intcomtrichinellosis/). Il est probablement

correct de supposer que la trichinellose, était présente en Roumanie, longtemps avant la

découverte de Trichinella spiralis par James Paget en 1835. Compte tenu des différentes origines

de la population actuelle roumaine, de sa forte sédentarité, il était intéressant de corréler les pics

d’anadémies de trichinellose avec un comportement alimentaire particulier. Les premiers résultats

ont tenté de conforter cette hypothèse. La population de la Roumanie se compose d'indigènes

aussi bien que de Hongrois et d’Allemands ayant émigré pendant les 10ème et 12ème siècles. Ces

deux dernières populations sont situées d'une matière prédominante en Transylvanie. A l’aide des

données épidémiologiques et historiques collectées en Roumanie, les conditions géographiques et

socio-culturelles qui ont influencé l'apparition de la trichinellose en Roumanie ont été étudiées

puisque les habitudes culinaires de ces différentes populations diffèrent considérablement. Les

quatre premier cas de trichinellose rapportés depuis 1874 en Roumanie sont répartis chez des

familles à dominante germanique, après consommation de saucisses ou de jambon cru de porc. La

plus forte répartition actuelle de la maladie se situe en Transylvanie, région ayant eu une

influence germanique importante. Ainsi tous les contés présentant plus d’1 anadémie pour 10 6

personnes/an sont localisés en Transylvanie. Si la Roumanie est divisée en trois parties

(Transylvanie, Région limitrophe de la Transylavie, Région du Sud-Est non limitrophe de la

Transylvanie) selon un gradient Nord-Ouest/Sud-Est, l’incidence moyenne diminue

progressivement d’Ouest en Est (Tableau 6).

Tableau 6. Incidence relative du nombre de cas de trichinellose en Roumanie pour la période

1963-1968.

Région Population à

risquea

Anadémies Incidenceb Risque relatif

Transsylvanie 39,700,902 43 1.08 5,31

Comtés limitrophes 30,809,184 20 0.65 3,18

Province du Sud-Est 44,108,892 9 0.20 1c

a Nombre de personnes/an b Nombre d’anadémies pour 106 personnes/an.

Test du Khi-deux: Khi-deux=25.73 (df=1), p=4 10-7 c référence

82

Ainsi l'analyse de ces premières données épidémiologiques conforte que l'apparition de la

trichinellose en Roumanie a eu une cause déterminante socio-culturelle liée à des habitudes

particulières d’alimentation des populations allemandes établies pendant longtemps en Roumanie

1.2. L’émergence de la trichinellose humaine en

Roumanie (article 2)

Une collecte de l’ensemble des données disponibles en Roumanie en matière de trichinellose

humaine a été entreprise sur une période de 25 ans

Le contexte politique a été profondément remanié en Roumanie dans les années 1990. Des

dérèglements majeurs (passage de la propriété collective à la propriété individuelle), des

changements des modes d’élevages drastiques (passage quasi généralisé des fermes d’état

gigantesques de plus de 50 000 têtes à un élevage familial), l’absence de mesures sanitaires dans

une période de profond bouleversement ont entraîné une émergence dramatique du nombre de cas

de trichinellose en Roumanie après 1990. Plus de 28 000 cas ont été identifiés pour une période

de 25 ans (1980-2004) en Roumanie et ont été soumis à une analyse statistique utilisant R, qui est

un langage et environnement pour les calculs statistiques et représentations graphiques (Ihaka and

Gentleman, 1996). Les agrégats spatiaux et temporels ont été corrélées en utilisant le logiciel

SaTScan (Kulldorff and Information Management Services Inc., 2004.) La mortalité a été très

inférieure à 1% mais des coûts en matière de santé publique ont été sévères dans un contexte

économique très difficile. Si l’incidence moyenne des cas de trichinellose est de 51 cas par

million par an, une augmentation majeure de cette incidence est observée entre 1990-2004 par

rapport aux années 1980-1989 (multiplication d’un facteur 3,66) (Figure 11 et Tableau 7).

Comme observée précédemment l’incidence moyenne observée en Transylvanie a été de 82,2 cas

par million par an au lieu de 35,7 cas par million et par an pour les autres régions.

83

Tableau 7 Incidence cumulée de la trichinellose en Roumanie pour la période l980–1989 et

1990–2004.

Localisation Périodes Cas Population Incidence* (95% CI†)

Transylvanie 1980-1989 2.610 73.836.943 35,3 (34,0–36,7)

1990-2004 12.381 108.549.279 114,1 (112,1–116,1)

Période

totale 14.991 182.386.222 82,2 (80,9–83,5)

Autres

Comtés 1980-1989 1.735 148.012.596 11,7 (11,2–12,3)

1990-2004 11.567 224.883.050 51,4 (50,5–52,4)

Période

totale 13.302 372.895.646 35,7 (35,1–36,3)

Totalité du

pays 1980-1989 4.345 221.849.539 19,6 (19,0–20,2)

1990-2004 23.948 333.432.329 71,8 (70,9–72,7)

Période

totale 28.293 555.281.868 51,0 (50,4–51,6)

* Cas pour 106 personnes par an † CI: Intervalle de confiance

10 50 200

10 50 200

1980-1989 1990-2004

Figure11 : Taux d’incidence cumulée des cas de trichinellose en Roumanie pour deux périodes :

1980-1989 et 1990-2004 (cas pour 1million d’habitants/an). La ligne bleue represente la bordure

Est de la Transylvanie.

84

1.3. Le contexte actuelle de la trichinellose

1.3.1. Emergence de l’infestation à Trichinella et la

trichinellose en Roumanie (article 3)

Face à l’émergence dramatique de la trichinellose en Roumanie après la déstabilisation politique

et économique des années 1990, l’incidence et la prévalence de la trichinellose humaine et des

infections animales par Trichinella ont été analysées en détail pour la période 1997-2004. Cette

analyse a été rendue possible grâce à une meilleure collecte des données concernant la clinique

humaine et la surveillance animale. Cette analyse a été effectuée au niveau des départements pour

mieux comprendre l’évolution de la trichinellose, sa persistance et ses réservoirs, les régions à

risques.

Avec une incidence annuelle de 55.1 cas par million d’habitant, la trichinellose demeure la

première zoonose parasitaire en Roumanie pour la période considérée (1997-2004). Les

infestations animales sont toutes aussi importantes. Des prévalences de 0,08 cas pour 102 porcs

examinés, 0,9 cas/102 sangliers, 13.1 cas/102 ours, ont été décrits. La Roumanie représente un des

pays avec la plus forte infection à Trichinella dans la faune sauvage et domestique. L'analyse de

l'incidence humaine et des données animales de prévalence ont comme conséquence de souligner

un paradoxe dans les répartitions géographiques. Si l’incidence de la trichinellose est deux fois

plus haute en Transylvanie par rapport aux autres départements de la Roumanie, la prévalence de

l’infection à Trichinella chez le porc est très inférieure soulignant à nouveau l’importance de

l’habitus culinaire pour révéler la maladie humaine. Le niveau trés élevée des infections à

Trichinella chez l’animal justifie cependant une surveillance accrue chez différentes espèces

animales cibles dont le cheval.

1.3.2. Analyse de la contamination des espèces animales

sauvages et domestiques par Trichinella en Roumanie.

1.3.2.1. Faune sauvage (articles 4 et 5)

Différentes espèces de trichine ont été identifiées dans 54 prélèvements de la faune sauvage sur

un total de 140 prélèvements répartis dans 17 contés (Figure 12). La plupart des isolats ont été

collectés rapidement après la mort de l’animal et une trentaine de souches a pu être propagée sur

85

souris. Parmi les 182 prélèvements d’oiseaux détritivores collectés dans le delta du Danube aucun

ne s’est révélé positif au test de digestion artificielle (avec une sensibilité optimale de 1larve pour

100g de viande). Le typage des isolats a été réalisée par un test PCR multiplex comme décrit par

Zarlenga et al (1999). Seules les espèce T spiralis et T britovi ont pu être identifiées. Il existe une

forte prévalence de l’espèce T britovi dans la faune sauvage (24 isolats) par rapport à T spiralis (3

isolats). Le loup (31,4%) suivi du chat sauvage (14,3%) et du renard (7%) représentent les

principaux carnivores infectés en Roumanie (Tableau 8). Le chacal doré essentiellement inféodé

au Nord de l’Afrique étend son aire jusque dans le Sud-Est de l’Europe. Ce carnivore est

également porteur de larves de Trichinella en Roumanie. Un seul individu a pu être obtenu

pendant la période de 3 ans de la surveillance de la faune sauvage en Roumanie. Le taux

d’infestation par l’espèce T britovi était de 55 larves par grame pour un muscle électif comme le

muscle tibial. Il n’a pas été possible de différencier les espèces selon le gradient de température

de janvier.

Figure 12 : Distribution des prélèvements des animaux infectés par Trichinella en Roumanie. Le

gradient de température moyen est indiqué soulignant les régions de montagnes et de plaines. La

température de janvier a été prise comme référence. Deux espèces de trichine ont été identifiées.

(carte realisée avec l’aide de l’Institut National de Meteorologie et Hydrologie de Bucarest)

86

Hôtes Nombre d’animaux infectés/examinés (%)

Moyenne larves/g (limites)

Contés d’origine Nombre d’isolats identifiés/Espèce de Trichinella

MAMMIFÈRES

Ours (Ursus arctos) 2/2 19.5 (6-31) CJ, MS 1, Ts; Porc domestique 21/21 102 (1-506) B,BH, CJ, CV,

MS, PH, SM, TL 9, Ts; 1, Tb

Chien domestique 2/2 20.5 (6 - 35) AB, HD 1, Tb; Chat sauvage (Felis

silvestris) 4/28 (14,3) 37,4 (0.4 - 120) BR, BV, CJ, CS,

HG, NT, MS 4; Tb

Lynx (Lynx lynx) 3/5 7.2 (4.2 – 10) CV, NT, BN 3, Tb Chacal doré (Canis aureus) 1/1 45.5 TL 1, Tb Renard roux (Vulpes vulpes) 5/71 (7) 86 (4.3 – 400) CJ, CV, HG 1, Ts ; 4, Tb Loup (Canis lupus) 11/35 (31,4) 11,3 (0.1-34) AB, BN, CJ, CS,

CV, HD, MM 9, Tb

Sanglier (Sus scrofa) 5/5 43,4 (0,1-148.5) CJ, MS 1, Ts; 3, Tb OISEAUX

Rapaces

Buzzard (Buteo buteo) 0/12 - SM - Autour des palombes (Accipiter gentilis)

0/2 - SM -

Epervier d’Europe (Accipiter

nisus) 0/1 - SM -

Duc (Asio otus) 0/13 - SM - Hibou de grange (Tyto alba) 0/4 - SM - Corvidés

Corneille à capuchon (Corvus corone cornix)

0/59 - BN, CJ, HG, TL -

Corbeau Freux(Corvus

frugilegus) 0/51 - CJ, TL -

Choucas des tours (Corvus

monedula) 0/20 - AB, BH, CJ, HG,

TL -

Pie (Pica pica) 0/20 - BH, HG -

AB=Alba-Iulia; B=Bucharest; BH=Bihor; BN=Bistrita-Nasaud, CJ=Cluj; CV=Covasna; CS=Caras-Severin;

HD=Hunedoara; HG=Harghita; MM=Maramures; MS=Mures; NT=Neamt; PH=Prahova; SM=Satu-Mare,

TL=Tulcea Ts = T.spiralis; Tb = T.britovi

Tableau 8. Liste des espèces hôtes collectés en Roumanie sur une période de 4 ans (2000-5) et

typage des espèces infestantes.

87

1.3.2.2. Animaux d’élevage

1.3.2.2.1. Le cheval

1.3.2.2.1.1. La trichinellose d’origine chevaline (article 6)

La viande de cheval n’est pas consommée de manière régulière en Roumanie à

l’exception des périodes de guerres, de grandes famines ou par certaines catégories sociales

(pauvres ou gitans). Néanmoins, depuis l’ouverture économique du pays en 1990 et surtout sous

l’influence occidentale, Françaises et Italienne en particulier, la consommation nationale de

viande de cheval commence à s’étendre comme le témoigne l’ouverture d’une première

boucherie chevaline dans l’est de la Roumanie, à Bacau (Cironeanu et Ispas, 2002). La

consommation de viande chevaline demeure cependant très anecdotique même si la production de

viande de cheval est conséquente. La Roumanie représente cependant un des principaux pays

exportateurs dans l’Union Européenne à coté de la Pologne et des pays de l’ex Yougoslavie

(Serbie, Croatie).

Si la trichinellose d’origine chevaline n’a pratiquement pas d’impact en Roumanie, du fait

de la très faible consommation de viande équine localement ( inferieur à 0,1kg/habitant/an), il

n’en est pas de même pour la France et l’Italie, les deux principaux pays consommateurs de

viande crue/peu cuite de cheval au monde (Boireau et al., 2000). L’importation de viande ou

d’animaux vivants sensibles en provenance de pays ayant une forte prévalence de cas de

trichinellose a été une source importante de cas de trichinellose humaine non autochtone en

France. Ainsi plusieurs dizaines de milliers de chevaux élevés dans les pays d’Europe central ou

d’Europe de l’Est sont importés chaque année en France. Si aucun cas de trichinellose humaine

d’origine chevaline n’a été signalé en Roumanie, en revanche, depuis 1975, neuf épidémies,

concernant plus de 1800 cas de trichinellose due à la consommation de viande de cheval importée

d’un pays de l’Europe de l’Est ont été rapportés (Boireau et al., 2000). Le nombre de cas de

trichinellose humaine suite à l’importation a été le plus important en France justifiant une analyse

épidémiologique fine dans les pays exportateurs les plus infestés ce qui a été appréhendé dans les

différentes analyses épidémiologiques qui suivent en Roumanie. Une enquête spécifique

concernant l’infestation à Trichinella chez le cheval en Roumanie a donc été conduite afin de

comprendre les sources et causes de la contamination de cet herbivore.

88

1.3.2.2.1.1.1. Enquête épidémiologique chez le cheval Une enquête chez le cheval a été réalisée dans des régions à forte contamination par Trichinella

de la faune domestique et sauvage.

-Enquête sérologique

Un total de 6011 échantillons de sérum de cheval provenant de différentes parties de la Roumanie

ont été collectés. Ces sérums ont été prélevés sur des chevaux provenant principalement de

secteurs où l'incidence de l’infection à Trichinella chez les porcs était élevée (cf Figure 01 article

6). Ces échantillons ont été analysés avec un système ELISA indirect fondé sur un antigène E/S

(L1M de Trichinella spiralis) calibré par l’ISS à Rome (Laboratoire Communautaire de référence

Parasites). 17 échantillons de sérum ont été trouvés douteux ou positifs en ELISA. Une seconde

analyse par ELISA et Western blot (utilisant un antigène soluble totale des larves L1M de

Trichinella spiralis) a été réalisée. Un seul échantillon s’est révélé positif par Western Blot. Le

cheval a été consigné et, lors de son abattage la digestion artificielle a été réalisée sur les muscles

électifs avec 100g de viande. Aucune larve de Trichinella n’a été trouvée.

-Enquête à l’abattoir

Les résultats négatifs de l’enquête sérologique provenaient d’un échantillonnage insuffisant pour

obtenir un animal positif. De ce fait afin d’augmenter la taille de l’échantillonnage une

surveillance a été réalisée dans deux abattoirs avec mise en place du test direct de contrôle de

Trichinella puisque ce test évite les faux positifs par rapport au test ELISA indirect. La

surveillance a été réalisée dans les abattoirs d’Alexandria et de Timisoara. Ces abattoirs exportent

sur le marché de l’UE mais n’utilisaient pas encore le test de digestion artificielle qui a été

implanté dans ces abattoirs lors de l’enquête. Un contrôle individuel de 25838 carcasses de

chevaux a été réalisée sur une période de 2 ans. Aucun cheval n’ a été trouvé positif.

Ces résultats montrent la trés faible prevalence de la trichinellose équine qui est trés inférieure à

1 cheval pour 30 000 sur une période de 2 ans même dans une zone de trés forte endémie. Le

caractère exceptionnel de l’infestation à Trichinella chez cet herbivore renforce l’hypothèse de la

seule contamination accidentelle de l’infestation et exclut la période d’engraissement comme

facteur de risque.

1.3.2.2.2. Le porc

L’espèce porcine a été soumise à un contrôle individuel en utilisant le test Trichinelloscopique (2-

3 fois moins sensible que la méthode de référence)(Beck et al., 2005; Forbes et al., 2003). Ainsi

89

pour l’année 2003 plus de 1300 porcs ont été bloqués à l’abattoir après un contrôle individuel

(Figure 13). Ces chiffres sont en progression par rapport aux années 2001 et 2002 (895) mais

restent très en deçà des chiffres obtenus au cours des années 1992-4 (9359 et 10540

respectivement).

Figure 13: Répartition des cas d’infestation animale par Trichinella en Roumanie en 2003. 1312

porcs ont été décelés positifs (3.182.189 contrôlés). 25% des ours contrôlés ont été détectés

positifs et 80 sangliers sur 2432 ont été saisis pour infestation par Trichinella. Carré rouge:

porcs/élevages positifs; carré verts: ours positifs ; carré bleu: sangliers positifs.

En résumé : Les dispersions spatiale et temporelle de deux espèces de trichine ont été montrées

en Roumanie, pays de forte endémicité. Des enquêtes diverses dans la faune sauvage et

domestique ont tenté d’identifier une troisième espèce : Trichinella pseudospiralis qui n ‘a pas

été décrite formellement à ce jour en Roumanie. Les prévalence des infestations animales et

humaines ont été décrites sur une période de 25 ans. Le nombre de cas recensés de trichinellose

dépasse celui décrit officiellement en Chine pendant la même période. En parallèle la très forte

contamination du cheptel porcin a été montrée avec des saisies annuelles dépassant 1000 animaux

actuellement. Il est en de même de la faune sauvage pour laquelle différentes espèces hôtes

omnivores ou carnivores apparaissent fortement à très fortement contaminées.

Sangliers Ours Porcs

90

ARTICLES « EPIDEMIOLOGIE DE

LA TRICHINELLOSE EN

ROUMANIE » (1-6)

92

ARTICLE 1 à soumettre

Trichinellosis in Romania: a history of food habits

Radu Blaga 1,2, *, Benoit Durand3, Vasile Cozma2 et Pascal Boireau1

Radu BLAGA, DVM Benoit DURAND, PhD, DVM Vasile COZMA, PhD, DVM Pascal BOIREAU PhD, DVM

1. Joint Research Unit BIPAR INRA AFSSA ENVA UPVM, 23, avenue du Général de Gaulle BP 67– 94703 MAISONS-ALFORT cedex, France

2. University of Agricultural Sciences et Veterinary Medecine, calea Manastur nr 3-5, 400372 Cluj-Napoca, Romania

3. Epidemiology Unit, AFSSA/LERPAZ, 23, avenue du Général de Gaulle BP 67– 94703 MAISONS-ALFORT cedex, France

* Corresponding author:

Tel: +33 149771328 Fax: +33 149771316 E-mail: [email protected]

93

ABSTRACT

Romania is one of the most affected countries in the world by trichinellosis with 780

humans cases out of 3109 in 2004 (ICT survey of 2004,

http://monsite.wanadoo.fr/intcomtrichinellosis/). It is probably correct to assume that

trichinellosis, was present in Romania, long before the discovery of Trichinella spiralis by

James Paget et Richard Owen in 1835, but its dispersion certainly differs upon the

origins of the population that is concerned. The population of Romania is composed of

natives as well as Hungarians et Germans, migrated during the 10th et 12th century, the

former two populations being situated predominately in Transylvania. Using historical et

early epidemiological data, we investigate whether the geographical et socio-cultural

conditions have influenced the emergence of trichinellosis in Romania, since the food

habits differs greatly. The analysis of these early epidemiological data confirm thus the

conclusions suggested by the available historical data: a strong socio-cultural

determinant for the emergence of trichinellosis in Romania, through the particular food

habits of German populations established for a long time in Romania. As these

populations became established mainly in specific areas of Romania (of Transylvania),

this socio-cultural determinant also induced the specific geographic distribution of

trichinellosis, with an elevated incidence rate in Transylvania; a distribution which was

still observed in the 60’s. Similarly according to Hall, cited by Gould (1945), the

population group which is most frequently infected in epidemics of trichinellosis in the

United States, are the Germans.

94

Trichinellosis, a worldwide zoonosis, is due to the ingestion of raw or undercooked meat

containing viable muscle larvae of Trichinella. Romania represents one of the permanent

foci of trichinellosis, with the most numerous human et animal cases that are described

in the world 1,2,3,4.

The objective of this short note is, using historical et early epidemiological data, to

investigate whether the geographical et socio-cultural conditions have influenced the

emergence of trichinellosis in Romania.

Romania is situated in the South-Eastern part of Central Europe at the contact with

Eastern Europe et the Balkan peninsula. The Carpathian Mountains, of which the

Transylvanian Alps are part of, cut through Romania in a wide arc from North to

Southwest establishing a natural barrier between the Transylvania et the rest of

Romania. What do we call today Romania, has long been divided between the Austro-

Hungarian empire, including Transylvania, et the Ottoman empire, that included

Wallachia et Moldavia (fig 1). The former two regions got the name of Romania after

their unification in 1859, an independent state that incorporated Transylvania in 1918.

The existence of the almost impregnable barrier of Carpathians, representing the border

line between the two empires, enabled a different historical et social evolution of the

populations on the two mountain sides. Being under Hungarian occupation since the 10th

century until 1918 et colonized with Germans (Sachs) coming from Saxony, from the

end of the 12th century, the population of Transylvania is a mixture of Romanians (59%),

Hungarians (25%) et Germans (9.5%) 5. In spite of a long period of close living, the three

populations preserved their identity, mainly due to the social segregation that existed,

Germans et Hungarians representing the dominant groups. Conversely Wallachia et

Moldavia (named Romania from 1859), in spite of a vasality towards the Ottoman

95

empire since the 16th century until 1877, were never colonized, therefore the population

presented a more homogenate degree.

Consequently, in Romania, different food habits existed with regard to eating meat:

Germans were famous for their fondness for raw pork et pork products 6 ; Hungarians,

used to eat well cooked or roasted meat as revealed by Ballagi in 19137. On contrary,

Romanians were eating mostly vegetables et other no-meat products, the meat

consumption being reduced (2kg/year/person in country side) et “the habit of eating

raw pork-meat not yet accepted by them” 8,9,10.

Few epidemiological data about trichinellosis in Transylvania are available before 1918,

mainly due to the inaccessibility of the Austrian-Hungarian archives of that time,

therefore the following description is referring to Romania before 1918 (Wallachia et

Moldavia) et after 1918 (including Transylvania).

On the 4th of October 1868, Scheiber did the first discovery of muscular larvae of the

Trichinella spiralis in “Coltea” hospital of Bucharest during an autopsy 11. On the 15th of

February 1869, Kopernitzki, noticed the presence of some white shady spots in the

muscles, that analysed by microscope revealed to contain a coiled parasite of Trichinella

spiralis 12. One year later in 1870, Scheiber discovers a new case of trichinellosis 12.

Later cases of trichinosis were reported in Romania by several authors 13- 24 .

Certainly, trichinellosis was present at a larger extent, demonstrated by the first

epidemics which took place in Iasi, in a German-Polish family of brewery workers, who

ate in the winter of 1874, raw sausages et ham 25. Due to an unusual long typhoid fever,

dr. Brindza et dr. Konya had the idea to verify by microscope examination the remaining

meat et by-products. Not surprisingly they found ”a tremendous number of small worms

that were freely ranging in the whole parts of the meat” 26, identified as Trichinella

spiralis. Four weeks later 3 out of the 6 members of the family died. Two important

96

epidemics of trichinellosis, following eating raw et smoked pork-meat, were reported in

Transylvania, in Medias et Biertan (a German population region) in 1933, affecting 7 et

respectively 10 persons; none of them died 27. In 1944, in Sibiu (a German predominant

city), another 4 persons got infected, after eating raw smoked pork sausage; one of

them died 28.

The first Trichinella infection in pig was discovered on the 27th of December 1868, in

Reni, Ismail county, in the S-E of Romania. Another positive Trichinella pork-meat was

discovered in Iasi in a sausage shop, after the 1st tragic epidemics of trichinellosis in

1875. Early pork meat inspection regulations available only in different parts of Romania

et for limited time (1865-1866, 1868-1869, 1874 -1875), gave mostly poor results in

finding infected pork meat. The regular inspection of pork meat in the slaughter house,

was imposed beginning with 1913 in the Bucharest slaughter house, leading to an

identification of 43 carcases (0,06%) of Trichinella positive pigs, in the first 2 years;

similarly percentages it was reported for the first years of meat inspection in Germany.

In conclusion, the available historical data show that, in the today’s Romania,

trichinellosis was already present in human at the end of the 19th century. The four first

reported epidemics occurred either in patients of German origin living in Wallacho-

Moldavia area, or in patients of unreported origin living on the other side of the

Carpathian mountains, in Transylvanian areas where German settlements are known to

be ancient et majority/preponderant/predominant.

However, the available historical data are geographically biased, as they mainly concern

the Wallacho-Moldavia part of the today’s Romania. The earliest epidemiological data

covering the whole country are more recent as they were collected in the 1960’s:

Lupascu reported in 1970 the number of trichinellosis outbreaks per county between

1963 et 1968 29. During this period, 72 outbreaks were reported across Romania, the

97

majority of which (60%, n=43) occurred in Transylvania. We used the 1966 census data

30 to compute, from these raw incidence data, an average incidence rate per county

(number of outbreaks per person–year). The corresponding map (Fig. 2) shows that in

Transylvania, the majority of the counties were affected, as the incidence rate was non-

null in 13 counties out of 16 (82%). Conversely, in the Wallacho-Moldavia area,

trichinellosis outbreaks were reported in approximately half of the counties (13 counties

of 25, 52%). All the counties for which the incidence rate was above 1 outbreak per 106

person–year were located in Transylvania, but two (Fig 2), both sharing a common

border with the two most affected Transylvanian counties. These two counties, in which

the incidence rate is respectively of 2.94 et 4.02 outbreaks per person–year, are also the

areas in which the German settlements are the most ancient (Fig 2).

Finally, we split Romania into three areas: the Transylvanian counties, the counties

sharing a common border with Transylvania, et the other, south-eastern counties. The

average incidence rate in these three areas shows a progressive et linear decrease from

Transylvania to the south-eastern counties (Table 1, Fig. 3). Taking as a reference the

south-eastern counties, relative risks can be computed, that yield a value of 3.18 for the

buffer counties, et of 5.31 for the Transylvanian counties.

The analysis of these early epidemiological data confirm thus the conclusions suggested

by the available historical data: a strong socio-cultural determinant for the emergence of

trichinellosis in Romania, through the particular food habits of German populations

established for a long time in Romania. As these populations became established mainly

in specific areas of Romania (of Transylvania), this socio-cultural determinant also

induced the specific geographic distribution of trichinellosis, with an elevated incidence

rate in Transylvania; a distribution which was still observed in the 60’s. Similarly

98

according to Hall 31,32, cited by Gould, the population group which is most frequently

infected in epidemics of trichinellosis in the United States, are the Germans.

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99

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100

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:1472 - 1486

102

Table 1. Geographic variations of the Trichinella outbreaks incidence rate in Romania, 1963-1968.

Area Population at riska Outbreaks Incidence rateb Relative risk

Transsylvanian counties 39,700,902 43 1.08 5,31

Intermediate counties 30,809,184 20 0.65 3,18

South-eastern counties 44,108,892 9 0.20 1c

a Number of persons-years b Number of outbreaks per 106 persons-years. Chi-square test for trends in proportions: chi-square=25.73 (df=1), p=4 10-7 c reference

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Transsylvania Buffer Other counties

Area

Tri

chin

ella

out

brea

ks

inci

denc

e ra

te

Fig.3: Geographic variations of the Trichinella outbreaks incidence rate in Romania, 1963-1968.

104

ARTICLE 2 sous presse

ARTICLE 3 soumis à Veterinary Parasitology

Heterogeneity of human trichinellosis et animal Trichinella infection in Romania: a

geographical paradox due to ancestral food habits et political changes

R.Blaga* 1,2, B.Durand 3, A.Stoichici 4, S.Antoniu 5, C.Gherman 2, C.M.Cretu6, N.Stefan 4,

V.Cozma 2 et P.Boireau1

1 JRU BIPAR INRA AFSSA ENVA UPVM, 23, avenue du Général de Gaulle BP 67–

94703 MAISONS-ALFORT cedex, France

2 University of Agricultural Sciences et Veterinary Medicine, Faculty of Veterinary Medicine,

Parasitology Unit, calea Manastur nr 3-5, 400372 Cluj-Napoca, Romania

3 Epidemiology Unit, AFSSA, 23, avenue du Général de Gaulle BP 67– 94703 MAISONS-

ALFORT cedex, France

4 Institute for Diagnosis et Animal Health, str. Dr. Staicovici nr. 63, 76202, Bucharest,

Romania

5 University of Agronomical Sciences et Veterinary Medicine, Faculty of Veterinary

Medicine, Parasitology Unit, 105 Splaiul Independentei, 050097 Bucharest, Romania

6 “Carol Davila” University of Medicine et Pharmacy, Faculty of Medicine, Parasitology Unit,

19 – 21 str. Gerota, 020027 Bucharest, Romania

105

*Corresponding author :

Radu BLAGA

Tel : 33 1 49 77 13 00

Fax : 33 1 49 77 13 16

E-mail address : [email protected]

The work was done as follows: collecting the human et animal epidemiological data was done by

in the parasitology unit of “Carol Davila” University of Medicine et Pharmacy, Faculty of

Medicine, Bucharest respectively in the parasitology unit of the University of Agronomical

Sciences et Veterinary Medicine, Faculty of Veterinary Medicine Bucharest. A preliminary

analysis of the raw data was done in the parasitology unit of the University of Agricultural

Sciences et Veterinary Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Cluj-Napoca. The final

epidemiological analysis was done jointly in the parasitology et epidemiology unit of AFSSA,

Maisons-Alfort et the Institute for Diagnosis et Animal Health, Bucharest.

2 tables et 3 colour Figures

Summary With an incidence of 55,1 cases/106 man-year of trichinellosis over a period of 8 years et a

prevalence of 8 cases/104 tested animals for pigs, 9 cases/103 for wild boars, 13,1 cases/102 for

bears, Romania represents the country with the most extensive Trichinella infection in the world.

The uneven repartition of populations of German origin, who colonized specific areas of

Romania (Transylvania) beginning with the end of the 12th century, et their particular food habits

(raw pork meat et sausage consumption) was taken into account though, when analysing

trichinellosis epidemiological data in Romania. Analysis of human incidence et of animal

106

prevalence data result in an apparent geographical paradox: whereas the trichinellosis incidence

rate is twice higher in Transylvania than in the other counties, the Trichinella infection

prevalence in pig is much lower. Hypotheses et facts contributing to the heterogeneity of human

trichinellosis et Trichinella infection cases in Romania are discussed.

Introduction

Several foodborne parasitic infections are transmitted to humans because of improper

animal breeding, food handling or both (Hui et al., 1994). Human trichinellosis may be acquired

through consumption of undercooked meat, containing infective larvae of Trichinella, of both

domestic animals et wildlife. As many as 11 million persons throughout the world may be

infected (Dupouy-Camet, 2000). A recent study in southeastern Europe (Cuperlovic et al., 2005)

has revealed high incidence of human trichinellosis et high prevalence of Trichinella infection in

countries like Bulgaria, Croatia, Romania et Serbia. According to the International Commission

on Trichinellosis, Romania is one of the most affected countries in the world, with 780 human

cases reported in 2004, out of 3,109 cases reported worldwide (International Commission on

Trichinellosis. Evaluation of human cases reported in 2004). Both the domestic et sylvatic cycles

of Trichinella are present in Romania (Pozio, 2001), but the incidence of human trichinellosis

depends mainly on the human behaviour, on the food habits. The today Romania is divided by

the natural barrier of Carpathians into Transylvania, et Wallacho-Moldavia, regions inhabited by

populations of diverse ethnic origins. Previous studies about trichinellosis in Romania (Lupascu

et al., 1970; Olteanu, 1996; Olteanu, 2001; Cironeanu et Ispas, 2002), were about national-level

data et did not attempt to analyse the geographic variations, or to correlate the incidence of

human trichinellosis with the prevalence of Trichinella infection.

The aim of this study is, using passive human trichinellosis surveillance data et active

Trichinella infection surveillance in pig et game animals, to investigate the extensiveness of the

Trichinella infection in humans et animals in Romania, over the period of 1997–2004, revealing

the existing differences among the various regions of Romania. Epidemiological significance of

these differences is discussed.

Material et Methods

107

Human trichinellosis data

Census data were obtained online from the National Institute of Statistics, Bucharest, for 1992 et

2002, et for each Romanian county (Romanian National Institute of Statistics). Trichinellosis data

were obtained from the National Institute for Medical Statistics, Bucharest, which is in charge of

the centralization of passive surveillance data for such diseases, the notification of which is

compulsory. Cases inclusion criteria are based upon the clinical signs (high fever, periorbital or

facial oedema et myalgia), each case being confirmed by positive biological tests results

(eosinophilia, leucocytosis, high levels of muscle enzymes in serum). The collected data covered

a 8 years period ranging from 1997 to 2004, for each county of Romania.

Animal data of Trichinella infection

Trichinella infection data were obtained from the Institute for Diagnosis et Animal Health,

Bucharest. These data are the result of Trichinella infection active surveillance in domestic et

game species, conducted in Romania according to the following rules:

a mandatory trichinelloscopic exam is performed for each pig slaughtered in a public or private

slaughterhouse;

home-slaughtered pigs et game animals may also be tested by trichinelloscopy, on the request of

the owner of the carcass.

The distinction between the two pig population is based upon the place where the animals have

been slaughtered: in an abattoir or at home. In both cases, the trichinelloscopic exam is performed

by a veterinarian under the direct authority of the county veterinary chief officer according to the

law 215/2004(Veterinary Sanitary Law nr.215/2004). The number of tested animals et the

trichinelloscopy results were collected separately for abattoir- et home-slaughtered pigs, for wild

boars et bears. These four data sets covered a 8 years period ranging from 1997 to 2004, for each

Romanian county.

Descriptive analysis of human et animal data for trichinellosis et Trichinella infection

Trichinellosis incidence rates were computed in number of cases per 106 man-year. For 2002,

census data were directly used. For intermediate years (1997–2001), population data were

linearly extrapolated from the 1992 census data. For 2003 et 2004, data from the 2002 census

were used. Trichinellosis incidence et Trichinella infection prevalence variations were then

analysed in time et space. For both, data from the Transylvanian counties were also compared

108

with data from the other Romanian counties. The latter comparison was also conducted for

Trichinella infection data. Statistical analyses were done using R (Ihaka et Gentleman, 1996).

Cluster analysis of human et animal data for trichinellosis et Trichinella infection

A spatial cluster analysis was conducted using the SaTScan software (Kulldorff, SaTScanTM

version 6.0 ). This software allows to both locate et test the significance of clusters, et to compute

the clusters-associated relative risks (RR). It implements a cluster-detection test based upon a

spatial scan statistic that may be used to detect both high- et low-rates areas. We used a procedure

based on a Poisson model (Kulldorf, 1997): circles of varying radiuses are sequentially centred

on each county centroid, et the ratio of cases to controls is computed for the areas inside et

outside the circle. The likelihood of the inside to outside ratio, assuming a Poisson distribution of

cases, allows to select the most likely cluster: the cluster that is the less likely to have occurred by

chance. The procedure is then repeated for detecting secondary clusters. The significance level of

the clusters is computed using a resampling procedure (1000 iterations): only the clusters for

which this p-value was above 0.05 were retained for mapping. Cluster analysis was first applied

to the trichinellosis incidence data. For Trichinella infection cases, cluster analysis was done

separately for each of the four data set (home- et abattoir-slaughtered pigs, wild boars et bears).

In each of these data sets, for some of the year-county pairs, no animal had been tested. These

situations were treated as missing data when performing the cluster analysis.

Results

Human trichinellosis incidence rate

Between 1997 et 2004, 9,645 human trichinellosis cases were reported in Romania. Taking into

account census data, this Figure corresponds to an incidence of 55,1 cases/106 man-year (Table

1). The incidence rate obtained for Transylvanian counties (83.1 cases/106 man-year) is

significantly higher than the incidence rate obtained for the other counties (41.6 cases/106 man-

year), as indicated by non-overlapping confidence intervals (Table 1).

The yearly variation of the trichinellosis incidence rate shows an overall decline over the 8 years

period, from 91.6 cases/106 man-year in 1997 down to 36.0 cases/106 man-year in 2003. The

Transylvania vs other counties difference remains valid during the whole period (Figure 1).

Geographic variations of the incidence rate show a relatively homogeneously high incidence rate

in Transylvanian counties, the incidence rate being more heterogeneous in the rest of the country,

109

with the lowest values in Eastern counties et higher rates in some of the Southern counties

(Figure 2).

Human trichinellosis cases cluster analysis for the period of 1997–2004 confirm these geographic

variations et yields two main clusters: a low-rates area in the North-East (the most significant

cluster, RR=0.2) et a high-rates area in the Western part of Romania (RR=8.1) (Figure 3).

Trichinella infection prevalence in pig et in game animals

The Trichinella infection prevalence rate varies widely according to the host species, et is

increased by a x10 factor from pig (8 cases/104 tested animals) to wild boar (9 cases/103 tested

animals) et to bear (13.1 cases/102 tested animals) (Table 2).

The country-level prevalence rates observed in home- et abattoir-slaughtered pigs are relatively

close, the former being however significantly higher than the latter, as indicated by non-

overlapping confidence intervals (Table 2). Marked geographic differences are observed between

Transylvania et the other counties, the prevalence rate being lower for Transylvania than for the

other counties, both for home- et abattoir-slaughtered pigs, with a prevalence ratio of 0.56 for

home-slaughtered pigs et 0.13 for abattoir-slaughtered pigs.

The annual variations of the infection prevalence rate in home- et abattoir-slaughtered pigs

confirms the difference between Transylvania et the other counties, as the rates obtained for

Transylvania are always under the rates obtained for the other counties (Figure 1).

The map of the counties prevalence rate (Figure 2) shows that, if the counties prevalence rates are

relatively homogeneous within Transylvania, wide variations exists among the other counties. In

particular, the North-Eastern counties show low prevalence rates, both in home- et abattoir-

slaughtered pigs. Conversely, these prevalence rates are much higher in the Southern counties,

especially in abattoir-slaughtered pigs, with Figures reaching 1% in some counties.

The Transylvania vs other counties difference observed in pig prevalence is not found in game

animals. In wild boars, the two prevalence rates are very close (8.4 vs 8.9, Table 2), the difference

being non-significant (chi-squared test: χ2=0.173, 1 degree of freedom, p=0.68). In bears, the two

prevalence rates are even closer (13.1 vs 13.2, Table 2). No clear trend is observed in yearly

variations of the wild boars et bears prevalence rates (Figure 1).

110

However, maps of counties prevalence rates show important heterogeneities (Figure 2). In wild

boar these heterogeneities seem relatively similar to those observed for pigs: the highest

prevalence rates are found in the South-Eastern counties with prevalence rates above 5% of the

tested animals in four counties; whereas the North-Eastern counties show very low prevalence

rates. The map obtained for bears closely reflects the distribution of this species, tested animals

originating exclusively from counties located along the Carpathian chain (except another

mountainous area in the North-West, et in Romania’s capital: Bucharest). No marked variations

of the prevalence rate are observed, the overall level being very high, with Figures above 50% in

three counties.

Cluster analysis of Trichinella infection cases in pigs gives very close results for home- et

abattoir-slaughtered pigs (Figure 3). For home-slaughtered pigs, the most significant cluster is a

low-rates area (RR=0.2) located in the northern half of the country, on both sides of the

Carpathians. Exactly the same low-rates area is obtained for abattoir-slaughtered pigs, as a

secondary cluster (RR=0.08). For this latter category of pigs, the most significant cluster is a

high-rates area located south of the Carpathians, with a RR of 13.5. A similar secondary cluster is

also obtained, approximately at the same location, for home-slaughtered pigs (RR=2.5). The

nature et location of the clusters obtained for wild boars data are roughly similar to those obtained

for pigs: the most significant cluster is a high-rates area located in the south-eastern part of the

country (RR=3.6), whereas the north-eastern countries form a low-risk area (RR=0.11). A single

cluster was obtained for bears (p=0.047, RR=6.3), located in the western part of Romania.

Discussion

Human trichinellosis incidence

Nine thousand six hundred forty five human trichinellosis cases were reported in Romania from

1997 to 2004, which corresponds to an incidence rate of 55,1 cases/106 man-year. However this

average incidence uncovers a significant geographic variation, when analysing separately

Transylvanian data et data from other Romanian counties: the incidence rate for Transylvanian

counties (83.1 cases/106 man-year) is twice higher than the incidence rate obtained for the other

counties (41.6 cases/106 man-year), a difference that remains valid throughout the whole 8 years

period.

A first argument to explain this marked difference could be a more exhaustive identification of

cases in Transylvania than in the other counties. However, each of the 42 counties of Romania

has a similar medical infrastructure, under the direct authority of the Health Ministry, employing

111

medical practitioners that have a basic know how of human trichinellosis, et no practical

argument support this hypothesis

The higher trichinellosis incidence in Transylvania is better explained by the food habits of the

local populations. Romania’s physical geography is characterized by the presence of a mountains

chain (the Carpathians) which splits the country in two main regions. This physical barrier has

also long been a political barrier, as the North-West part of today Romania (Transylvania) was

until 1918 a province of the Austro-Hungarian Empire. The populations living on each side of the

Carpathians evolved thus relatively separately throughout history. In particular, specific areas of

Transylvania have been colonized by populations of German origin, beginning with the end of

the 12th century, populations which have kept their specificities et language until today et, in

particular, their food habits (raw pork meat et sausage consumption). Conversely, the remainder

of today Romania was never colonized by foreign populations, moreover in Romanian traditional

gastronomy the habit of eating raw pork-meat is absent (Cazacu, 1999). This uneven repartition

of populations of German origin, et the particular food habits of these populations is probably the

major factor that explains trichinellosis incidence variations on both sides of the Carpathians.

Trichinella infection in pig et game animals

Two very different types of pig production systems exist in Romania: backyard pigs (1 or 2

animals per unit) are raised for familial consumption et are most of the time slaughtered at home

(some animals being slaughtered in a neighbouring abattoir); et indoor pigs originating from large

industrial production units, that are slaughtered only in abattoirs (often included in the production

unit). For abattoir-slaughtered pigs, Trichinella infection surveillance can be considered

exhaustive. It is not the case for the other categories of animals (home-slaughtered pigs et game

animals) that are tested on the request of the carcass owner: the corresponding data may thus be

biased. However, as Trichinella infection in animals does not induces any clinical signs, or

visible lesions, it was considered that the potential bias was negligible, et that, for each county,

active surveillance data were representative of the whole population.

Trichinella infection surveillance is performed in Romania using trichinelloscopy. This method

presents a significant lower sensitivity comparing with the artificial digestion (Forbes et al., 2003;

Beck et al., 2005), the recommended method for the diagnostic of Trichinella infection in

domestic et wild animals in European Union (Gamble et al., 2000; Webster et al, 2006).

Therefore part of the Trichinella infection cases are not revealed by this technique, the prevalence

rate being thus certainly under-estimated.

Each datum is a count of trichinelloscopic exams results for a given year et county. Geographic et

cluster analyses thus only make sense if it can be assumed that the animals tested in a given

112

county have been raised (or shooted for game animals) in the same county. By definition, this

assumption is checked for home-slaughtered pigs; it also seem reasonable for game animals. For

abattoir-slaughtered pigs, this assumption may be questionable; however, as large industrial

production units often include their own abattoir, it was assumed that the geographic bias was

negligible.

Results obtained for Trichinella infection in game species show high prevalence rates levels, of

the order of 10% for bears et of 10‰ for wild boars. A large circulation of Trichinella in wildlife

thus exists in Romania, the difference between bears et wild boar being explained by diet

differences et by a greater longevity for bears.

The overall infection prevalence rate obtained for pigs is of the order of 8 cases per 10,000 tested

animals. However, as for trichinellosis, marked geographic differences are observed between

Transylvania et the other counties, the prevalence rate being lower for Transylvania than for the

other counties (Table 2). This results holds both for home- et for abattoir-slaughtered pigs (while

being more marked in the latter case), with a prevalence ratio (Transylvania vs other counties) of

0.56 for home-slaughtered pigs, et of 0.13 for abattoir-slaughtered pigs.

This difference may be explained by a less efficient trichinelloscopic exam in Transylvania, but

no field data support this hypothesis. Recent Romanian history, with the end of the communist

period in 1989–1990 better explains these differences, as the political changes induced profound

modifications of animal et meat production structures. In particular, industrial pig production

structures evolved from state farms before the change of the regime to private structures

afterwards. The 1965–1979 active surveillance data in pigs coming from 115 state industrial pigs

production units (3 to 8 million of pigs controlled per year) have been published by Cironeanu

(1981). Most of these production units were located in southern Romania, et very few in

Transylvania. No infection cases were found et, at that time, industrialized farms were thus

considered as Trichinella-free. However, from 1982, several factors led to an exponential growth

of the number of Trichinella infected animals in these industrial production units: the use of non-

sterilized abattoir leftovers in pigs’ diet, the shortage of animal food leading to cannibalism, et

poor hygiene conditions with the spread of rats (Cironeanu et Ispas, 2002). By the end of 1980’s,

95% of Trichinella infected pigs originated from such farms (Olteanu, 2001). In the beginning of

1990’s, the large industrial state farms started to sell livestock to the small, private farms,

spreading Trichinella infection in neighbouring areas, so that by 1992, 40% of Trichinella

infection cases were registered in small private farms (Olteanu, 1996; Cironeanu et Ispas, 2002).

As most of the initial state industrial production units were located in southern Romania, one can

assume that this infection spreading occurred mainly there: this could explain the today lower

113

incidence rates observed in Transylvania, et the convergent high-rates clusters observed in

southern Romania for home- et abattoir-slaughtered pigs infection prevalence.

Comparison of human trichinellosis incidence with animal Trichinella infection prevalence

Comparison of the results obtained for human trichinellosis with Trichinella infection in pig leads

to a geographical paradox: whereas the trichinellosis incidence rate is twice higher in

Transylvania than in the other counties, the Trichinella infection prevalence is approximately

twice lower in home-slaughtered pigs, et 8 times lower in abattoir-slaughtered pigs. This result is

confirmed by cluster analysis: comparison of human trichinellosis clusters with animal infection

clusters does not reveal similarities. In particular, there is almost no overlap between the high-

rates area obtained for human trichinellosis incidence et those obtained for Trichinella incidence

in pig. The situation is complicated by the fact that previous studies have shown that 95% of the

reported human trichinellosis cases originated from pork meat consumption (Cironeanu et Ispas,

2002).

However, for geographical similarities to be observed between human trichinellosis data et

animal Trichinella infection data, it has to be assumed that locally tested pig or game animal

carcasses are also locally consumed. This assumption seems reasonable for home-slaughtered

pigs et probably also for game animals. It is more questionable for abattoir-slaughtered pigs, the

meat of which is sold through commercial networks, not necessarily local. Nevertheless, the lack

of similarities between trichinellosis incidence clusters et home-slaughtered pigs’ prevalence

clusters leads to suggest that the contamination level of meat et meat products is not the main

determinant of trichinellosis incidence rate variations.

Other factors have to be incriminated among which the local population’s food habits, as

described above, but also the exhaustiveness of food safety controls: a lower proportion of home-

slaughtered pigs submitted to the trichinelloscopic exam could also explain the higher

trichinellosis incidence rate in Transylvania. Field data support this argument, as in the Jiu Valley

(Hunedoara county), where the incidence of trichinellosis is particularly high (Cristea, 1998).

This miner region is emblematic for the emergence of trichinellosis in more serious conditions

with the change of the political regime: all the valley being highly industrialized, the home

slaughtered pigs are raised in the suburbs of the cities in very poor hygiene conditions. Local

populations have a low education level et ignore trichinellosis, thus often neglect the

trichinelloscopic exam. Cristea (1998) has showed that all the trichinellosis outbreaks observed in

the Jiu Valley had as an origin pig meat with no inspection for Trichinella.

In conclusion, with an incidence of 55,1 cases/106 man-year of trichinellosis over a period of 8

years et a prevalence of 8 cases/104 tested animals for pigs, Romania represents the country with

114

the most extensive Trichinella infection in the world. Geographical comparison of human

trichinellosis incidence data with animal Trichinella infection prevalence Figures suggests that, in

Romania, rather than the circulation level of the parasite in domestic et game animals, it is the

populations’s food habits, combined with the exhaustiveness of the food safety controls that are

the main determinants of the geographic variations of human trichinellosis incidence rate. The

importance of the former point has also been demonstrated in south-central America, where

human trichinellosis is present where the Spanish or German customs prevail (Argentina, Chile et

Mexico), whereas the infection has never been reported in Brazil, where Portuguese customs

prevail (Kim, 1983; Pozio, 2000, Pozio et Zarlenga, 2005). The latter point should be enhanced

by animal health services, in particular with the use of artificial digestion instead of the

trichinelloscopic exam.

Finally, besides this conclusion, a specific result obtained in this study deserves attention: cluster

analysis show the existence of a low-rates areas in the North-Eastern Romanian counties, which

is obtained at the same time for human trichinellosis incidence et for Trichinella infection

prevalence in home- et abattoir-slaughtered pigs, et in wild boars. Furthermore, in bears, part of

this low-risk area is also obtained as a non-significant (thus not shown on the map) low-risk

cluster. Further investigations are needed to explain this intriguing result.

Acknowledgments

This work was supported by grants of the EU TRICHIPORSE contracts (QLRT-2000-01156,

QLK1-CT-2002-02826), BRANCUSI (PAI-Programmes 06182SK) and MetVetNet

(Trichinet/Trichimed et Med Vet Net).

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http://www.cdep.ro/pls/legis/legis_pck.htp_act?ida=49982 (in Romanian)

117

24. Webster P, Maddox-Hyttel C, Nöckler K, Malakauskas A, van der Giessen J, Pozio E, et

al., 2006, Meat inspection for Trichinella in pork, horsemeat et game within the EU:

available technology et its present implementation Euro Surveill. 11(1) [Epub ahead of

print]

118

Table 1. Cumulated human trichinellosis incidence in Romania, 1997–2004.

Area Cases Populationa Incidenceb(95% CIc)

Transylvania 4,715 56,746,300 83.1 (80.7–85.6)

Other

counties

4,930 118,394,994 41.6 (40.5–42.8)

Whole

country

9,645 175,141,294 55.1 (54.0–56.2)

a Man-year

b Cases per 106 man-year

c CI: confidence interval

119

Table 2. Trichinella infection in domestic pig (home- et abattoir-slaughtered) et in wildlife (wild

boar et bear), Romania, 1997–2004

Area

Infection

cases

Tested

animals Prevalencea (95% CIb )

Home-slaughtered pigs Transylvania 2 633 4 318 678 6.1 (5.8–6.3)

Other counties 7 015 6 494 672 10.8 (10.6–11.1)

Whole country 9 648 10 813 350 8.9 (8.7–9.1)

Abattoir-slaughtered

pigs Transylvania 2 387 12 694 988 1.9 (1.8–2.0)

Other counties 15 893 11 031 977 14.4 (14.1–14.6)

Whole country 18 280 23 726 965 7.7 (7.6–7.8)

Wild boars Transylvania 159 19 027 8.4 (7.1–9.8)

Other counties 96 10 798 8.9 (7.2–10.9)

Whole country 255 29 825 8.6 (7.6–9.7)

Bears Transylvania 100 766 13.1 (10.8–15.7)

Other counties 39 296 13.2 (9.6–17.7)

Whole country 139 1 062 13.1 (11.1–15.3)

a Prevalence units: pigs: infection cases per 104 tested animals; wild boars: infection cases per 103

tested animals; bears: infection cases per 100 tested animals.

b CI: confidence interval

120

Figure 1. Trichinellosis incidence rate et Trichinella infection prevalence rate in domestic pig

(home- et abattoir-slaughtered) et in wildlife (wild boar et bear), Romania, 1997–2004 (thin line:

Transylvania, dashed line: other counties, thick line: whole country).

Human trichinellosis

Home-slaughtered pigs

Abattoir-slaughtered pigs

Wild boars

Bears

121

Figure 2. Trichinellosis incidence rate et Trichinella infection prevalence rate in Romanian

counties in domestic pig (home- et abattoir-slaughtered) et in wildlife (wild boar et bear), 1997–

2004. Thin blue line: Transylvanian border

Human trichinellosis

11

11

111

11

11

111

11

11

111



Wild boars

Bears

122

Figure 3. High- et low-rates clusters of Trichinellosis et of Trichinella infection in domestic pig

(home- et abattoir-slaughtered) et in wildlife (wild boar et bear), Romania, 1997–2004.

Trichinellosis cases

Bears



Wild boars

Thin blue line: Transylvanian border

123

ARTICLE 4 à soumettre Identification of Trichinella isolates from Romania using PCR-based methods

R.Blaga 1,2, *, C.Gherman 2, V.Cozma 2, A.Glemarec1, E.Pozio3 et P.Boireau1

1 JRU BIPAR INRA, AFSSA, ENVA, UPVM, 23 avenue du Général de Gaulle BP 67–


2 University of Agricultural Sciences et Veterinary Medicine, Faculty of Veterinary

Medecine, Parasitology Unit, calea Manastur nr 3-5, 400372 Cluj-Napoca, Romania 3 Department of Infectious, Parasitic et Immunomediated Diseases, Istituto Superiore di

Sanità, viale Regina Elena 299, 00161 Rome, Italy



124

1. Introduction

Trichinellosis, a food-borne parasitic zoonosis, which affects more than 11 million people

worlwide (Dupouy-Camet, 2000) represents the major zoonosis in Romania with more than

28,000 human cases over the last 25 years (Blaga et al., in press). Both domestic et sylvatic

trichinellosis exists in Romania (Pozio, 2001a), the first cycle having somehow dramatically

emerged in Romania over the last 15 years due to recent political et economical changes

(Cuperlovic et al., 2005). The incidence of Trichinella-infected pigs passed from 0,02% in 1970

(Cironeanu 1974) to 0,11% in 1992 (Olteanu, 1996) et to 0,15% in 1999 (Olteanu, 2001).

Moreover, if for the period 1984 -1989, 95% of the Trichinella-infected animals were originated

from large, industrialized farms, by 1992 40% of trichinellosis cases were originated from

backyard pigs, potentially in contact with wildlife (Olteanu, 1996).

First extensive investigations in Romania for Trichinella infection in wildlife et

synanthropic animals have been done in 1960’s over a 10 years period et were summarized by

Lupascu et al. (1970), who is reporting 12 species harboring the parasite, with the following

incidences: wolf (Canis lupus) 38,53%, European wild cat (Felis silvestris) 23,08%, red fox

(Vulpes vulpes) 22%, European mink (Mustela lutreola) 14,3%, bear (Ursus arctos) 10,2%,

martens (Martes martes) 8,16%, European hamster (Cricetus cricetus) 6,3%, Eurasian badger

(Meles meles) 5,8%, rat (Rattus norvegicus) 5,53%, polecat (Putorius putorius) 5, 37%,

European otter (Lutra lutra) 2,08% et wild-boar (Sus scrofa ferus) 0,2%. Nesterov et al. (1991) is

reporting a slight decrease of Trichinella incidence in wildlife of Romania over a 20 years period

of collecting game animals: 30,5% in wolf, 21,5% in wild cat, 15,8% in red fox, 18,5% in bear,

13,5% in martens, 6,08% in Eurasian badger, 5,2% in polecat et 0,14% in wild-boar.

Despite the increase of human et domestic trichinellosis in the last 15 years in Romania,

no extensive molecular investigation of the etiological agents involved in the outbreaks or

elucidation of any potential transmission between domestic et sylvatic cycles has been performed

recently. All the previous identifications of Trichinella infected animals were assumed to be

T.spiralis by lack of availability of competitive diagnostic tools (Lupascu et al., 1970), although

some authors were claiming the presence of T.britovi, T.nativa et T.pseudospiralis (Olteanu,

1996(Cuperlovic et al., 2005) in Romania. Therefore the present study was conducted to identify

the existing Trichinella spp. in wildlife reservoirs et domestic animals, by means of PCR-based

methods, assessing an eventually transmission between the two existing cycles. The potential

influence of climate on the distribution of Trichinella species was also evaluated.

125

2. Materials et methods

2.1 Sample collection et parasite isolation

140 sylvatic animals (28 european wild cats, 5 eurasian lynx, 1 golden jackal, 71 red foxes, 35

wolves) were collected from local hunters originating from 17 counties of Romania for

trichinelloscopic examination. 182 raptorial et carrion-feeding birds were collected mainly from

the Danube Delta in the South-East of Romania, et respectively Transylvania. 30 muscle samples

originating from naturally Trichinella-infected animals (bear, domestic pig, domestic dog et wild

boar) were obtained from state veterinary inspection services where they already had been tested

for Trichinella during routine meat inspection (table 1). Latitude et longitude of the location

where animals were collected were recorded.

A preliminary trichinelloscopic exam was performed for the sylvatic samples as follows:

28 small pieces of muscle tissue (20 mm2) weighting 0,5 g were removed from each sample.

Trichinelloscopy analysis were operated with three samples et were examined individually for

Trichinella larvae using a trichinoscope with 15x et 40x magnification. After positive

identification of encysted muscle larvae (ML) of Trichinella sp., 100 g of infected tibial muscle,

diaphragm or intercostals muscles were analyzed by artificial digestion following standard

procedures(Gamble et al., 2000). No trichinelloscopic exam was performed for the avian samples,

but the artificial digestion using 100 g of breast muscle. After digestion, larvae of Trichinella sp.

were washed several times in cold water, counted in triplicate et fixed in 70% ethanol for

molecular typing.

2.2 DNA purification et genotyping

Crude deoxirobonucleic acid (DNA) from one to five larvae was prepared according to the

protocol of Pozio et LaRosa (2003) slightly modified: single larvae were washed five times in

PBS et then placed each larva in 5µl of PBS in a 0,5 ml tube. 2µl of Tris-HCl pH 7.6 was added,

overlaid with a drop of mineral oil et heated to 90°C for 10 min et then cool on ice. 3µl of

proteinase K solution (final concentration of 100µg/ml) was added et incubate at 48°C overnight.

Before using the crude DNA, the samples were heated up to 90°C for 10 minutes et cool on ice.

5 µl of crude DNA were used in a multiplex PCR for genotyping Trichinella isolates according to

the published protocol of Zarlenga et al. (1999). PCR-amplified products were separated by

electrophoresis in a 2% agarose (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germany) gel with

TAE buffer et stained with ethidium bromide. Single larvae from three encapsulated reference

126

strains were used as controls (Trichinella spiralis (ISS51), Trichinella nativa (ISS10) et

Trichinella britovi (ISS100)).

3. Results

Trichinella sp. larvae were detected in 24 of the 140 sylvatic animals examined, covering

17 counties, representing 42% of the whole Romania. All 30 samples of naturally infected

animals, collected from the local veterinary services, permitted us to recover viable larvae of

Trichinella. On contrary no Trichinella larvae were detected in the breast muscle samples of the

182 birds examined.

Out of the 54 isolates that were subjected to PCR analysis, only 40 of them permitted a

molecular typing of Trichinella species. Trichinella britovi et Trichinella spiralis were the only

two species identified. T.britovi is the most prevalent species (n=26) among all the isolates

followed by T.spiralis (n=14). With regard to the host origin, the predominant species identified

in domestic animals was T.spiralis in nine cases et T.britovi in two cases. For the wildlife

isolates, T.britovi is the prevailing species, identified in 24 cases, while T.spiralis was identified

in 3 cases. No mixed infection cases have been found. The geographical distribution of the

Trichinella species showed that only four counties presented both species infection in animals.

The highest prevalence of Trichinella infection was detected in wolf with 31,4%, followed by

European wild cat with 14,3% et red fox with 7%.

4. Discussion

Four species of Trichinella are found up to date in Europe: Trichinella spiralis (cosmopolitan),

T.britovi (in wildlife from mountainous areas), T. nativa (in wildlife from colder et northern

regions) et T. pseudospiralis (a cosmopolitan nonencapsulating species) (Pozio et Zarlenga,

2005). The isotherm –4°C in January seems to be the southern border of distribution for T.nativa

(Pozio et Zarlenga, 2005) while the isotherm –6°C in January can arbitrarily be assigned as the

northern border of distribution for T.britovi (Pozio, 2001a). Furthermore, T.pseudospiralis has

been documented in the recent years in the wildlife or domestic animals of several European

countries: Italy (Pozio et al., 1999a), France (Ranque et al., 2000), The Netherlands (van der

Giessen et al., 2001), Finland (Oivanen et al., 2002), Sweden (Pozio et al., 2004a), Lithuania

(Malakauskas et al., 2006), Germany (Nockler et al., 2006), et Georgia (Pozio et Zarlenga, 2005).

The role of birds as a host of T.pseudospiralis has been documented in 14 different raptorial et

carrion feeding species (Pozio, 2005), therefore unsurprisingly, the first European human

outbreak involving T.pseudospiralis was reported in Camargue, France, a swampy region of the

127

Rhone River Delta, representing an important stop-over point for migrating birds (Ranque et al.,

2000). Similarly, the wetlands of Danube River Delta in Romania, appear to be the crossroad of

six major migratory routes of birds, providing critical wintering et feeding habitat for over a

million birds of 100 species. Many of these birds summer in northern Europe et Asia, including

Siberia et Mongolia, et return on their fall migration in August to October. An investigation in

birds et domestic et game animals for isolation of T.pseudospiralis, was considered as appropriate

in this highly exposed region.

During our study, two species of Trichinella have been identified: T.spiralis et T.britovi. These

findings are consistent with the few molecular investigations done previously (Pozio, 2001a;

Pozio and Zarlenga, 2005) et discordant with the previous reports of T.nativa et T.pseudospiralis

in Romania (Olteanu, 1996;(Cuperlovic et al., 2005). Actually, T.nativa was first reported to be

isolated in 1986 (Olteanu, 1986), both in domestic et wild animals, the morphology of kysts et

larvae being the only criteria used to identify the species, no further analysis was conducted.

Unfortunately the isolates have not been maintained on mice, any present molecular investigation

being impossible though. Concerning T.pseudospiralis, it was first described by Garkavi in 1972,

but interestingly several reports of free Trichinella larvae in bird’s muscle have been done by

then (Rausch et al., 1956; Zimmermann and Hubbard, 1969). Similarly Olteanu (1986) is

reporting that in 1962 during trichinelloscopy analysis of two Corvus frugilegus, he noticed the

presence of free larvae of Trichinella. Since no further analysis have been performed at that time

(measurement of muscle larvae, cross breeding experiments), we can only suppose that the larvae

belonged to T.pseudospiralis.

The present results provide a strong indication for the existence of two Trichinella species in

domestic et wildlife animals for the moment, the improved sensitivity of the identification

method used (PCR-based methods vs morphological identification) may account for this findings.

T.pseudospiralis is probably present in Romania, no sound proof being yet available. On

contrary, T.nativa is unlikely to be present in Romania since the isotherm –4°C in January, its

southern border of distribution, passes away from the north of Romania (Figure 1).

Geographically, the distribution of Trichinella species in Romania, does not show a species-

specific cluster, like described in Bulgaria (Kurdova et al., 2004), both species being present over

the entire examined counties (Figure 1). Similar findings were reported in Lithuania, Letonia et

Estonia (Malakauskas et al., 2006).

The high prevalence of Trichinella spp. in Romanian wildlife, confirmed by the present study,

represents an important danger for transmission into the domestic cycle, especially where free

ranging animals have contact to wildlife reservoirs or to wildlife carcasses. The detection of

128

T.britovi in only a limited number (2) of the domestic animals, similar as for T.spiralis in wild

life animals (3), strongly suggests a bilateral transmission, which exists between the two cycles,

at a limited extent. The domestic animals that were diagnosed with T.britovi were a free ranging

dog from a mountainous region et a back yard pig from the Danube Delta, confirming the above

mentioned hypothesis. Similarly the wild life animals found infected with T.spiralis were a bear,

a red fox et two wild boars explained mainly by their diet habits, while the strictly carnivorous

species (wolf, lynx) were found to harbor only T.britovi. An interesting example of the flow

between the two cycles represents the bear population in some districts of Romania (Brasov,

Central Romania), where they have developed a habit of feeding from garbage cans at night,

exposing them to potentially sources of T.spiralis (Aves Foundation,

http://www.ursusarctos.ro/garbage/raport.htm). The epizootological situation encountered in

Romania appears similar to that found in other countries of Central, Southern et Eastern Europe

(Cuperlovic et al., 2005; Pozio, 2001a) or in the Baltic States (Malakauskas et al., 2006).

Few countries are reporting the presence of all the four species of Trichinella, namely Finland,

Lithuania, Sweden et Russia (Pozio et Zarlenga, 2005 (Malakauskas et al., 2006), Romania is

harbouring for the moment only two species. Since T.pseudospiralis is hardly to be detected by

the compressorium method, which is still the official method used for meat inspection for pigs et

game animals in Romania, its confirmed detection may represent a high risk for food safety.

References

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131

Figure 1: Distribution of animals infected with Trichinella spp. in Romania according to the climate zones. The colour regions represent the minimum values in January for 1960-2000. (according to National Institute of Meteorology and Hydrology, Bucharest)

133

ARTICLE 5 soumis à Journal of Wildlife Diseases

SHORT COMMUNICATION

First identification of Trichinella sp. in golden jackal (Canis aureus) in Romania

R.Blaga 1,2, C.Gherman 2, V.Cozma 2 et P.Boireau1

1 JRU BIPAR INRA, AFSSA, ENVA, UPVM, 23 avenue du Général de Gaulle BP 67–


2 University of Agricultural Sciences et Veterinary Medicine, Faculty of Veterinary

Medecine, Parasitology Unit, calea Manastur nr 3-5, 400372 Cluj-Napoca, Romania

Corresponding Author

Radu BLAGA

23 avenue du Général de Gaulle BP

67– 94703 MAISONS-ALFORT cedex, France

Telephone: 0033 1 49 77 46 55

Fax: 0033 1 49 77 13 16

Email: [email protected]

134

Abstract: Larvae of Trichinella sp. were identified by both trichinelloscopy et artificial

digestion in a golden jackal (Canis aureus) in Romania. Using a multiplex polymerase chain

reaction biotyping method, the larvae were identified as Trichinella britovi. This is the first

report of Trichinella sp. in a jackal in Romania, confirming thus the high prevalence of

trichinellosis among carnivores of wildlife.

Key words: Canis aureus, jackal, trichinellosis, Trichinella britovi, Romania

135

The golden jackal (Canis aureus) is widespread in North et North-East Africa, occurring from

Senegal on the West coast of Africa to Egypt in the East. It has expanded it’s range from the

Arabian Peninsula into western Europe to Austria et Bulgaria (Genov et Wassiley, 1989), et

eastwards into Turkey, Syria, Iraq, Iran, Central et southeastern Asia (Baillie et

Groombridge,1996). Several authors have been previously identified the golden jackal in

Romania, summarized by Angelescu (2002), but no investigations for Trichinella sp. have

been done yet. Here we report the first identification of Trichinella sp. in a golden jackal

hunted in the beginning of July 2006 in the Southeast Romania, in Babadag Forest (44°90’N,

28°71’E), Tulcea.

Muscles samples were taken form the anterior tibial muscle, which is considered one of the

favored sites for Trichinella larvae in carnivores (Kapel et al., 1994, 1995) et the diaphragm,

for comparison reasons. A preliminary trichinelloscopic exam was done as follows: 28 small

pieces of muscle tissue (20 mm2) weighting 0,5 g were removed from each sample.

Trichinelloscopy analysis were operated with three samples for each type of muscle et were

examined individually for Trichinella larvae using a trichinoscope with 15x et 40x

magnification. After positive identification of encysted muscle larvae (ML) of Trichinella sp.,

100 g of infected tibial muscle et respectively diaphragm were analyzed by artificial

digestion. Within 24 hours upon arrival of the muscular probes, avoiding the freezing, each

tissue sample was minced into 3 mm pieces in a grinder et digested separately at 45°C +/- 2°C

in 2L of a digestion solution of 1% HCl et 1% pepsin (1:10000 NF, Merck KGaA, Darmstadt,

Germany) in a 3L beaker on a heated magnetic stirrer. Complete digestion was achieved after

1,5 hours, having less than 0.2 g of tissue retained on the 200µm sieve. Particulate matter in

the filtrate was concentrated by several sediment-decant cycles. The final 20 ml of sediment

was transferred to a petri dish et examined by microscope at 20-30x magnification. Larvae of

136

Trichinella sp. were washed several times in cold water et counted in triplicate under a

microscope.

Crude deoxirobonucleic acid (DNA) from five larvae was prepared for the polymerase chain

reaction (PCR) molecular typing according to the protocol of Pozio et LaRosa (2003) slightly

modified: single larvae were washed five times in PBS et then placed each larva in 5µl of

PBS in a 0,5 ml tube. 2µl of Tris-HCl pH 7.6 was added, overlaid with a drop of mineral oil et

heated to 90°C for 10 min et then cool on ice. 3µl of proteinase K solution (final

concentration of 100µg/ml) was added et incubate at 48°C overnight. Before using the crude

DNA, the samples were heated up to 90°C for 10 minutes et cool on ice. 5 µl of crude DNA

of single larva were used in a multiplex PCR using the primer set I et II according to a

published protocol (Zarlenga et al., 1999) with slight modifications: amplifications were

performed using a 94°C for 1 min denaturation step, 55°C , 1 min annealing step et a 72°C for

1 min extension step. 35 cycles of this program were run with 1,5 units of Taq polymerase

enzyme (Promega, Madison, Wisconsin, USA) per sample. PCR-amplified products were

separated by electrophoresis in a 2% agarose (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim,

Germany) gel with TAE buffer et stained with ethidium bromide. ML of the three European

encapsulate strains were used as controls ( Trichinella spiralis (ISS51), Trichinella nativa

(ISS10) et Trichinella britovi (ISS100)).

The preliminary trichinelloscopic exam, identified encysted ML of Trichinella sp. in both the

tibial muscle (Figure 1) et the diaphragm. Using the artificial digestion, the intensity of the

infection reached 55 larvae per gram (LPG) for the tibial muscle et 36 larvae per gram (LPG)

for the diaphragm, confirming thus the tibial muscle, as the predilection site for Trichinella

sp. investigations in jackal too. 80% of the larvae were motile with the round shape

characteristic of free, living Trichinella sp. muscle larvae. Analysis of the PCR-amplified

larval genomic DNA showed a double band pattern with a first band at 127 base pairs et a

137

second one at 253 base pairs which is indicative of Trichinella britovi (Figure 2). The control

DNA samples of the reference isolates, mentioned above, generated characteristic amplified

fragments, confirming thus the identity of the jackal isolate as Trichinella britovi (Figure2).

T. britovi is the etiological agent of infection of the sylvatic carnivores living in

temperate areas of the Palearctic region from the Iberian Peninsula to Kazakhstan, Iran et

Turkey (Pozio et Zarlenga, 2005). In Romania, the major reservoir of trichinosis appears to be

in the wildlife, particularly the carnivores, with prevalence as high as 38,5% for wolves

(Canis lupus), 22% for foxes (Vulpes vulpes) et 23,08% for wildcats (Felis silvestris)

(Lupascu et al., 1970). Therefore, unsurprisingly the first golden jackal for whom we had the

chance to perform a trichinelloscopic exam, has revealed positive for Trichinella infection.

Previous Trichinella infection cases in jackal, have been reported in two neighboring

countries of Romania, the former republic of Yugoslavia et Bulgaria (Rukavina et Brglez,

1970 ; Kurdova et al., 2004), countries presenting similarly, a high prevalence rates of

trichinellosis in the wildlife (Kim, 1983). Improper hunting behavior, with the habit of leaving

the animal carcasses in the field after skinning, has been documented as the main cause of

such a high prevalence rate in Romania (Cironeanu, 1974), similarly to other regions of the

world: Kazahkstan (Batkaev et Vakker, 1992); Spain (Perez-Martin et al., 2000) Russia

(Pozio et al., 2001) et France (P Boireau, personal communication). Significantly, by

incinerating the viscera of field-dressed animals in a wild game park in USA, the prevalence

rate of Trichinella infection cases in wild boar has been reduced from 76% to 3.6% (Worley

et al., 1994).

Since sylvatic T.britovi has the potential to be transmitted from a wild animal reservoir

to domestic, free ranging pigs (Pozio, 2000), the present finding, emphasize the need of an

active surveillance program for Trichinella spp. in wildlife. Special attention must be given to

the wild carnivores, being an accurate revelator of the present epidemiological situation.

138

Literature cited

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140

Figure 1 : Encysted larva of Trichinella britovi in the tibial muscle of golden jackal (Canis aureus) (trichineloscopy 40x)

Figure 2. Electrophoretic pattern of multiplex PCR amplification of Trichinella larvae from reference isolates of Trichinella (lane 2 : T.spiralis, lane 3 : T.nativa, lane 4 T.britovi) et unknown sample of golden jackal (lane 5). Lane 1 TrackIt 100 bp DNA ladder (Invitrogen)

1 2 3 4 5

300-

200-

100-

141

ARTICLE 6 à soumettre

Horse trichinellosis in Romania: epidemiological survey and parasitological findings

Radu Blaga 1,2,*, Cretu CM3, Gherman C 2, Draghici A4, Pozio E5, Noeckler K6, Kapel C7, Dida I4, Vasile Cozma2 et Pascal Boireau1

Joint Research Unit BIPAR INRA AFSSA ENVA UPVM, 23, avenue du Général de Gaulle BP 67– 94703 MAISONS-ALFORT cedex, France University of Agricultural Sciences et Veterinary Medecine, calea Manastur nr 3-5, 400372 Cluj-Napoca, Romania Carol Davila University of Medecine et Pharmacy, str. Gerota nr.19–21., 020027 Bucharest, Romania University of Agronomical Sciences et Veterinary Medecine, Bulevardul Marasti nr. 59, 011464, Bucharest, Romania Department of Infectious, Parasitic et Immunomediated Diseases, Istituto Superiore di Sanità, viale Regina Elena 299, 00161 Rome, Italy Federal Institute for Risk Assessment, Diedersdorfer Weg1, D-12277 Berlin, Germany Danish Centre for Experimental Parasitology 100 Dyrlaegevej, DK-1870 Frederiksberg C, Copenhagen,Denmark.

First two authors contributed equally to the article



142

1.Introduction

Trichinellosis, a worldwide zoonosis, is due to the ingestion of raw or undercooked meat

containing viable muscle larvae of Trichinella. Herbivorous animals are, by virtue of their

diet, outside the major transmission cycles of trichinellosis (Campbell , 1983). However, in

the last 30 years, the horse appeared as a novel vector of Trichinella infection as 14 outbreaks

associated with the ingestion of horsemeat were reported, involving more than 3350 persons

(Boireau et al., 2000; Pozio and Zarlenga, 2005). All outbreaks occurred in France et Italy,

exclusively, despite the fact that worldwide, other countries, such as Belgium, have higher

average per capita of consumption of horsemeat. This discrepancy is mainly attributed to the

food habits of consumption of raw or under-cooked meat including steak tartare (Boireau et

al., 2000). Veterinary et epidemiological investigations in correlation with these outbreaks

determined that the infected horsemeat originated mainly from countries of Eastern Europe

(Poland, former-Yugoslavia et Romania), as well as USA, Canada et Mexico (Boireau et al.,

2000; Pozio and Zarlenga, 2005). A relationship between swine et horse Trichinella infection

has been stated (Murrell et al., 2004) et a possible association between infection in horses et

wildlife or fur reared animals has been postulated (Pozio et al., 2001c) in countries where

trichinellosis is endemic either in the domestic or the sylvatic cycle or both.

Romania, one of the principal horse exporters in European Union, has experienced a dramatic

increase in the human et swine trichinellosis along with the economical et political changes in

the 1990’s, like most of the South-eastern European countries (Cuperlovic et al., 2005). Few

data et scattered studies were available concerning horse trichinellosis in Romania (Pozio et

al., 2002b; Pozio et al., 1997c; Sofronic-Milosavljevic et al., 2001). The aim of this study was

to perform a survey of horses from various Romanian regions with different indirect et direct

tests to identify Trichinella infection. Epidemiological investigations were conducted for the

serological positive horses to determine the potential risk factors for contamination with

Trichinella. Few false positive cases could be detected indicating the low level of horse

contamination in Romania.

143

2. Materials et methods

2.1.Serum samples

Serum/blood samples were collected between May-November 2001 et 2002 from 5992 horses

in 32 counties of Romania with various Trichinella infection prevalence (Figure 1). The

serum samples were obtained as a complementary of national epidemiological studies

concerning the equine infectious anemia (EIA), therefore they were originating from horses

bred for labor et not for slaughtering. After sample collection, blood was allowed to clot at

room temperature. The serum was then collected et frozen at -80°C.

2.2.Serological methods

3000 serum samples obtained in 2001 were analysed in Istituto Superiore di Sanita in Rome,

Italy by ELISA using three different antigens: Excretion/Secretion (E/S), Crude Worm

Extract (CWE) et synthetic tyvelose glycan-BSA (stg-BSA). 2992 serum samples obtained in

2002 were first analyzed by the Faculty of Veterinary Medicine of Bucharest, using an E/S

ELISA kits originated from the Institute for Risk Assessment, Berlin, Germany. The positive

samples issued from the first screening were tested by the same E/S ELISA kit in Germany,

by a standard ELISA using three different antigens (E/S, CWE et stg-BSA) in Italy et by

Western Blot in AFSSA, Maisons-Alfort, France. All ELISA tests are based on the same

protocol described in the Manual of Standard (OIE) (2004).

2.2.1.ELISA using three different antigens (E/S, CWE et stg-BSA)

ELISA assays using three different antigens were performed according to the method

described by Pozio et al. (2002).

2.2.2. ELISA developed by the Institute for Risk Assessment, Berlin, Germany

Serum, diluted 1:100, et meat juice samples, diluted 1:10, were tested in duplicate by ELISA

using T. spiralis E/S antigen. The ELISA was performed according to the protocol described

by Nockler et al. (1995) for the detection of anti- Trichinella IgG.

ELISA results were evaluated as sample/positive control (S/P) ratio (%) by comparing the

mean OD value of the sample with the mean OD value of the positive control serum (each

144

previously corrected for the mean OD values of the blank plate). A S/P ratio of 8% was

considered as the cut-off et samples higher than 8% were classified as positive.

2.2.3.Western Blot analysis

Protein components of T.spiralis ES antigens were electrophoretically separated on 8.0%

sodium dodecyl sulfate polyacrylamide-gel (SDS-PAGE), according to Laemmli (1970), et

transferred to nitrocellulose sheets, as performed by Towbin et al. (1979). Reference et

ELISA-positive horse serum samples were diluted at 1:500, et goat anti-horse IgG with

alkaline phosphatase (Jackson ImmunoResearch Europe, UK), diluted at 1:10.000, was used

as conjugate. The immunoblot was evaluated using chromogenes principles (BCIP/NBT

detection reagents, Sigma Aldrich, France).

3. Parasitological examinations

Horse meat samples slaughtered in Romania (n=25.838) for the period 2001-2004 et one

serological positive horse were analyzed for infection by Trichinella larvae using the artificial

digestion method (Gamble et al., 2000). Two slaughtered houses have been opened since

September 2001, in the south et the west of Romania (Alexandria et Timisoara, respectively).

The slaughtered horses are coming from all counties of Romania, et their main destination is

the export for European Union countries.

To evaluate the specificity of serological analyses, the intestinal helminth fauna was studied.

Fecal samples, collected directly from the rectum of 17 serological positive horses were

examined by flotation method. Positive samples were cultured at 26°C for 8 days to identify

the third larval stage at the species level, in accordance with Soulsby (1965).

4. Epidemiological investigations related to serological positive horses

The farms from which the serological positive horses where originating were traced back. On-

farm investigations included interviews of the farm owner et his family on the history of the

serological positive horses, its care et management, particularly the types of feed given.

Veterinary health status of horses was asked to the local veterinarian. Confirmed cases of

trichinellosis in domestic or game animals et humans were of interest either in the present

farm or in the neighborhoods.

145

3. Results

3.1. Serological survey of 5992 horses throughout Romania

Out of the 3000 serum samples tested by ISS in 2001, none of them were higher than the cut-

off values for ELISA using CWE, ES et stg-BSA antigens, respectively, as established

previously by Pozio et al. (2002).

17 out of the 2992 samples (0,56%) collected in 2002 in Romania were above the cut-off

values for ELISA using ES, as established previously by BfR. 8 out of the 17 serological

positive samples were confirmed as positive by BfR using the same ELISA ES technique.

None of the 8 positive samples were higher than the cut off values when tested by ISS using

ELISA with CWE, ES et stg-BSA antigens. One (horse n° 12) of eight positive samples

identified by BfR, was find to react specifically with the 40, 43, 46 et 94 kDa TSL-1 antigens

when Western Blot was performed (Figure 2).

3.2 Parasitological examination

Out of the 25.838 horses slaughtered in Alexandria et Timisoara between 2001-2004, no one

was found to present Trichinella larvae in the muscles. The serological positive horse (n° 12)

identified two times by ELISA ES et by Western Blot, was digested entirely; no Trichinella

larvae were found. Three out of the positive horses double identified by ELISA ES were

examined by artificial digestion, at the moment of their slaughtering et naturally death,

respectively. No Trichinella larvae were found. The fecal samples analysis showed mixed

infestations of the serological positives horses by Gasterophylus inermis, Parafilaria

multipapilosa, Parascaris equinus, Trichodontophorus spp., Trichonema spp et

Strongyloides spp.

3.3. Epidemiological investigation

An epidemiological investigation was performed in the farms et neighbourhoods where the

serological positive horses have been identified. The results concerning the positive horse n°

12 , confirmed two times by ELISA et one time by Western Blot, emphasised that: several

cases of trichinellosis in pigs have been registered in the same village (Movilita village,

Vrancea County), but not in the farm of the owner of the positive horse. No other cases of

trichinellosis in humans or any other animals have been registered in that farm. More than

that, in Vrancea County there was not any new registered case in humans, during the

146

respective period. The prevalence of pig trichinellosis for 2002 in Vrancea was 0,01%.

Regarding all the other 16 positive horses, an epidemiological survey has been performed in

the farms et neighbourhood, trying to obtain some more relevant data in both humans et

animals. The results emphasized that 14 out of 17 positive horses (coming from private farms)

were in a good shape, being used in domestic activities, agriculture, or for work in the forest.

They presented a good clinical status, appreciated by the local veterinarians. Prophylactic

measures for anthrax, or screening serology for infectious anemia or glanders have been

performed. Trichinellosis in pigs had been mentioned before in those villages, but not in the

respective farms. Horses were fed with natural fodder, but never with proteinic flour, or

proteinic vitamins/minerals. During 2002, in the respective counties the prevalence of

trichinellosis in backyard pigs home slaughtered was 0,02%-0,08%. No humans cases were

registered in the investigated farms or villages, the trichinellosis in the whole county declining

comparing to the previous years.

4. Discussion

With an incidence of 51.0 cases per 106 persons per year of trichinellosis over a period of 25

years, et a prevalence of 8 cases/104 tested animals for pigs, 1% for wild boars et 10% for

bears for the last 8 years, Trichinella et trichinellosis represent a major concern for Romania

et Europe (Blaga et al., in press). 95% of human trichinellosis cases originate from pork

consumption, no horse – related trichinellosis cases have been mentioned up to date in

Romania (Cironeanu, 2002). On contrary three large outbreaks in France et Italy involving

horses from an undefined country of Eastern Europe might incriminate Romania as potential

origin (Boireau et al., 2000; Pozio and Zarlenga, 2005). In this study ELISA et Western Blot

analysis were used to determine the presence of specific antibodies against Trichinella in

5992 horse serum samples collected between 2001-2002.

17 of the 2992 samples (0,56%) collected in 2002, were found positive when tested in

Romania by an ES ELISA technique. Similar results were obtained by Diaconu et al., (1994)

when he obtained 0,5% positives results of 2370 horse serum samples tested by an ELISA kit

(Elitrich, Pasteur). Employing an ES ELISA, Pozio et al. (2002) testing 433 Romanian horses

slaughtered in Italy, found six of them (1,4%) reacting positively. On contrary, the

serosurvey carried out by Sofronic-Milosavljevic et al. (2001) on 5.267 horses from Romania

showed a considerable higher seroprevalence (5,9%) by ELISA ES, suggesting that the

147

antigens used in the assays had a low sensitivity (Pozio et al., 2002b). Interestingly, a limited

number (8/17) of the serological positive horses detected in Romania, were confirmed by ES

ELISA in BfR et none of them (0/17) when tested by CWE, ES et stg-BSA ELISA in Rome.

The present result confirm the differences observed by Sofronic-Milosavljevic et al. (2001)

when testing the same sera samples by ES ELISA in two different locations, who found a

variation of the positive results (5,9% in Romania et 0,3% in Italy). The present differences

among the results of several reference laboratories (BfR, ISS) underline the necessity of

reproducible standardized serological methods used for survey in Trichinella endemic

regions.The practice of horse breading in Romania has a long tradition, but the consumption

of horse meat remains limited. Instead, large number of horses are bred for being slaughtered

et exported in EU. Between 2001-2004 25.838 horses were slaughtered in Alexandria et

Timisoara et examined by artificial digestion. None of them presented a Trichinella infection,

consistent with the previous worldwide estimations of 8 cases per 106 slaughtered horses

(Pozio et al., 2002b) or lower than 0,001% (Boireau et al., 2000). In Eastern Europe, the

feeding of meat or food waste to the horses under extremely poor nutrition conditions looks to

be a common practice among horse dealers from exporting centers. It represents a short term

tactic to rapidly increase horse weight et conditioning prior to sale (Murrell et al., 2004). On

the other hand another situation is present for the everyday peasant using his horse for

laboring et giving it mainly a herbivorous diet supplemented in minerals, as it has been

identified during our epidemiological study. Therefore the discovery of two positive horses

during a routine veterinary inspection in Italy in 1997 et 2001 (Pozio et al., 1997c; Pozio and

Zarlenga, 2005), originating from exporting centers is not surprisingly when comparing with

the 25.838 negative tests performed during 2001-2004 in slaughter houses which receive

horses of regular private persons. Similarly the origin of the tested horses might explain the

negative results of the 3017 sera compared to the 433 serum samples showing 0,7%, - 2,5%

positive results analyzed by ISS (Pozio et al., 2002b). The results of the present study confirm

previous findings that serological methods cannot be used to detect Trichinella infection in

horses because of false positive results.

148

Figure 1. Number of horse serum samples collected in Romania, per department, between 2001 et 2002. The two blue stars represent the horse-slaughter houses in Alexandria (Teleorman department) et Timisoara (Timis department) where 25.838 samples were analysed by artificial digestion between 2001-2004.

149

Figure 2. Western Blot analysis of T.spiralis E/S antigens recognized by serum samples collected from eight ELISA-positive horses. Lanes: 1. horse number 12 (VN), 2. horse number 22 (DJ), 3. horse number 37 (SM), 4. horse number 39 (SM), 5. horse number 40 (DJ), 6. horse number 41 (CS), 7. horse number 42 (CS), 8 horse number 45 (SM), 9. serum of T.spiralis experimentally infected horse, 10. negative serum of horse, MW: molecular weight in kDa

94 46 43 40

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MW (kDa)

151

II. Variabilité génétique au sein du genre

Trichinella

Les enquêtes épidémiologiques menées en Roumanie devaient permettre de montrer la

variabilité spatiale et temporelle des infections à Trichinella dans un pays de forte endémicité.

La seconde partie du travail s’est intéressée à la variabilité au sein du genre Trichinella en se

focalisant fortement sur les différences génétiques entre Trichinella spiralis prise comme

espèce prototype et Trichinella pseudospiralis, espèce la plus éloignée du genre. Avant

d’aborder les différences génétiques/antigéniques propres à ces deux espèces très éloignées

une analyse de gènes ayant une fonction conservée (GST et serine protéase) a été réalisée.

Compte tenu de l’importance biologique de ces deux familles de gènes, ces cibles semblaient

pertinentes pour obtenir des gènes d’intérêt pour analyser la variabilité intra-genre tant sur le

plan génétique qu’antigénique.

1. Gènes codant pour des protéines

conservées dans le genre Trichinella Deux familles de gènes ont été analysées compte tenu de leur importance dans les fonctions

biologiques de nématodes : une enzyme impliquée dans les phénomènes redox (la glutathion

S transférase) et une sérine protéase ayant un double domaine catalytique.

La survie de l’espèce Trichinella, dépend en partie des activités de désintoxication des

glutathion S-transférases (GSTs). Les Glutathions -S-Transférases (GSTs) sont des enzymes

qui conjuguent un glutathion (tripeptide) à des groupes électrophiles de molécules

hydrophobes organiques. Ce conjugué devient soluble, et peut être éliminé plus facilement de

la cellule (Vibanco-Pérez et al., 1998). Ces enzymes peuvent détoxifier aussi bien des

composés endogènes qu’exogènes, comme les produits secondaires de la péroxidation des

lipides, provenant des cellules effectrices du système immunitaire de l’hôte (Liebau et al.,

1994 ; Sommer et al., 2003). Deux GSTs présentes dans le sérum de lapins artificiellement

infestés par T. spiralis et localisées au niveau des glandes sécrétrices (stichocytes) des L1M,

ont été mises en évidence par Rojas (1997). Mais leurs séquences nucléotidiques et protéiques

n’étaient pas connues au départ de cette étude.

152

Les protéases sont des molécules dont le rôle biologique est fondamental pour tous les

organismes vivants et en particulier pour les parasites. D’autre part, leur implication dans le

phénomène de virulence parasitaire a clairement été démontrée (Trap et al, 2000). Les

protéases à sérine constituent la famille protéasique la plus représentée chez les parasites dont

certains membres ont déjà été identifiés chez Trichinella. Les protéases à cystéine seraient

impliquées dans la balance de la réponse immunitaire TH1/TH2. Peu de gènes codant pour

des protéases avaient été caractérisés chez Trichinella au début de notre travail.

1.1. Clonage et analyse de l’expression de la

Glutathion S Transferase de Trichinella (article 7)

1.1.1. Détermination de la séquence nucléotidique d’une

GST de T.spiralis

Le clone LN069 disponible au laboratoire présentait une séquence en acides aminés déduite

ayant des signatures apparentées à la famille des Glutathion S-Transférase. Cet ADNc était

issu d’une banque d’ADNc soustractive (Adulte+L1NN)-L1M. Une partie de cette séquence a

été amplifiée avec les amorces T-512F et T-512R, et a été marquée non-radioactivement à la

digoxigénine. La sonde a été utilisée pour cribler une banque phagique d’ADNc Adultes J5,

afin d’obtenir un ADNc complet codant pour une GST. Douze ADNc indépendants ont été

reconnus par cette sonde et ont été séquencés complètement sur les deux brins d’ADN après

excision des phages. Après comparaison des séquences nucléotidiques obtenues, il s’est avéré

que les clones sélectionnés portaient des séquences identiques avec une légère variation en 5’

du fait de la longueur inégale de 3 clones. A pu être établie une séquence unique résultante

appelée tsgst1 (Figure 14). Un seul cadre de lecture a été obtenu et présentait une longueur de

615 nucléotides. La séquence en acides aminés déduite codait pour un peptide de 205 appelé

TsGST24. Le clone 12 étant le plus long a servi de base pour les amplifications ultérieures.

153

1.1.2. Analyse de la séquence nucléotidique de TsGST1

Au niveau du premier codon ATG de la séquence, il y a une purine en position -3, comme le

prévoit la règle de Kozak (Kozak, 1991), mais il y a une cytosine au lieu d’une guanine en

position +4. Il y a un signal de polyadénylation « ATAAA » en position 804 en 3’. La

séquence en acides aminés, Figure 14, est déduite par traduction de la séquence nucléique en

utilisant le code génétique standard.

M 1

CAC GAG TTG AAG TGT CTC TCG AGC AGT TTG AAA GTT GCG ACT CTT GCT AAA ATG 54

P L Y K L V Y F P I R G L A E P I R 36

CCA CTA TAC AAG TTG GTT TAC TTT CCT ATA AGG GGC TTG GCA GAA CCC ATA CGA 108

L L L H D Q R V E F L D N R I Q Q K 54

CTG TTG CTT CAT GAT CAA AGA GTT GAA TTT CTT GAC AAC CGT ATT CAG CAA AAA 162

D W P E I K S Q M L F G Q V P C L Y 72

GAT TGG CCC GAA ATA AAG TCC CAA ATG TTG TTC GGG CAA GTT CCA TGT CTT TAT 216

E D D Q P I V Q S G A I M R H L G R 90

GAG GAT GAT CAG CCG ATC GTT CAA TCT GGA GCT ATA ATG CGT CAT CTG GGG CGT 270

R F G L Y G N A E E M T Y V D Q I Y 108

CGA TTT GGC TTG TAT GGA AAC GCA GAA GAA ATG ACT TAC GTC GAC CAA ATA TAC 324

E G V V D L R L K Y A R L I Y S D S 126

GAG GGC GTT GTT GAT TTG CGA TTA AAA TAT GCT CGT CTG ATA TAC AGC GAT TCT 378

F H E S K G K F I N E V L P D E L A 144

TTT CAT GAG TCA AAG GGT AAA TTT ATT AAC GAA GTG TTG CCA GAT GAA TTG GCG 432

K F E K I L T G K K Y I L D D E I T 162

AAA TTT GAA AAA ATA CTT ACA GGA AAG AAA TAC ATT TTG GAT GAC GAG ATA ACC 486

F A D Y A L A E L L D V L L I L S S 180

TTT GCC GAC TAT GCA TTG GCT GAA CTT CTG GAC GTG CTT TTG ATA CTT TCG TCA 540

S C L E N F T A L T I Y H S R F M N 198

AGT TGC TTG GAA AAT TTT ACA GCA CTG ACG ATT TAT CAT TCA CGC TTT ATG AAT 594

R P N L K R Y L S S D I R K N A K I 216

CGT CCA AAT TTG AAA AGA TAT TTG TCA TCA GAT ATT CGT AAA AAT GCT AAG ATA 648

N G N E N K * 205

AAT GGG AAT GAA AAC AAA TGA ATT TAA TTA TTT ATT ATG ATG AAA TTT CTG CTG 702

GAT TAG GGT TAT TCG TGT GTG CTG TGA TAT TTA TAT GCC GTT TTC TAA TGG GAT 756

TGT GAT TAA TTG TTA TGC GAT CGC ATA GTA GTT TCA GAT TAC TCT AGT GAA GAT 810

GAT AAT TTC TGT GTA TTT TAG GGT TTT GTA TTT GAA TAA AAA GCA GTT TAA AAA 864

AAA AAA AAA AAA AA 878

Figure14 : Séquence nucléotidique de tsgst24 et séquence en acides aminés déduits de TsGST24. Le cadre de lecture et sa traduction sont en rouge. Les positions des acides aminés par rapport au premier codon ATG et les positions des acides nucléiques par rapport au début de la séquence sont indiquées dans la marge à droite.

154

La comparaison par Blastp de la séquence protéique déduite à une banque généraliste de

séquences protéiques (banque « nr ») montre une identité forte avec certaines séquences de

GSTs de nématodes: 48% d’identités avec la GST de la classe Pi de Dirofilaria immitis, 46%

d’identités avec la GST de Wuchereria bancrofti (Rathau et al., 2003), 47 % d’identités avec

la GST de Onchocerca volvulus (Liebau et al., 1996) et 43% avec Caenorhabditis elegans

(Weston, et al., 1989).La présence d’un peptide signal a été recherchée dans la séquence en

acides aminés déduite en utilisant le logiciel SignalP 3.0. Les probabilités de SignalP-NN sont

ambigües, puisque d’après ces données TsGST24 pourrait être une protéine sécrétée.

L’analyse du profil d’hydrophobicité a été faite pour aider à la résolution du problème

concernant la présence ou non d’un peptide signal, en utilisant l’échelle de Kyte-Doolittle

(Kyte and Doolittle, 1982). Il existe une région hydrophobe dans la partie N-terminale de

TsGST24, mais cette région n’est pas une région hydrophobe typique d’un peptide signal

(Figure 15). En revanche, les probabilités fournies par SignalP-HMM sont presque nulles

pour l’existence des régions c, n et h du peptide signal sur les vingt premiers acides aminés de

TsGST24 Figure 16).

Figure 15 : Profil d’hydrophobicité de la séquence en acides aminés déduite de TsGST24, selon l’échelle de Kyte-Doolittle. Les chiffres sur l’axe horizontal indiquent la position de chaque acide aminé. L’hydrophobicité est indiquée par des valeurs positives sur l’axe vertical, l’hydrophilicité est indiquée par des valeurs négatives. Le cadre indique la région hydrophobe en partie N-terminale de la séquence protéique. Cette région n’est pas assez hydrophobe pour être un peptide signal.

155

Figure 16 : Résultats du logiciel SignalP pour la recherche de la présence d’un peptide signal

dans la séquence déduite en acides aminés de la GST putative de T.spiralis. SignalP-NN

(Neural Network) : fonctionne sur la comparaison avec des séquences de peptides signaux

d’une banque de données, et la probabilité que la séquence soit un peptide signal est indiquée

par le S-score, moyenne entre moyenne-S et max Y (Nielsen et al, 2004), le C-score qui

indique la position du site de clivage, entre la partie « peptide signal » et la protéine en tant

que telle, le Y-score qui est une moyenne entre le C-score et le S-score (Nielsen et al, 1997).

SignalP-HMM (Hidden Markov Model) : indique la probabilité que chaque région de la

séquence soit une région polaire, chargée positivement (n-region), une région hydrophobe (h-

region), un site de clivage (c-region) de peptide signal, indications des régions typiques d’un

peptide signal.

156

1.1.3. Etude de la présence de la GST de T.spiralis au cours

des différents stades de développement du parasite et chez

les autres espèces

Une PCR a été réalisée à partir des banques d’ADNc des différents stades du développement

du parasite chez T.spiralis, en utilisant les amorces T512R et T512F. Les ADNc des autres

espèces de Trichinella spp aux stades L1M et Adultes J5 ont été amplifié en même temps

(Figure 8).

Une bande d’ADN de 353 bp est spécifiquement amplifiée à tous les stades de développement

de Trichinella, et dans toutes les espèces analysées.

1.1.4. Etude de la variabilité de la séquence de la GST chez

T.nativa, T.britovi, et T.pseudospiralis

Les séquences codantes complètes de GST de T.nativa et T.britovi ont été amplifiées à partir

des banques d’ADNc avec les amorces GST1F et GST1R (Figure 17). L’ADN a été cloné

dans le vecteur PCRII-TOPO. La séquence de la GST de T.pseudospiralis n’a pu être

amplifiée avec ces deux amorces malgré trois essais de PCR et avec des quantités différentes

d’ADNc. Les clones codant pour la GSTde T pseudospiralis ont été obtenus après criblage

d’une banque d’ADNc du stade L1M de T pseudospiralis. Après clonage, et extraction des

plasmides, trois plasmides issus de trois clones indépendants ont été séquencés sur les deux

brins de l’insert. Une séquence nucléotidique résultante pour chacune des espèces de trichine

amplifiée a été obtenue par un alignement multiple entre les trois séquences. Les séquences en

acides aminés déduites sont nommées respectivement TnGST24, TpsGST24 et TbGST24. Les

alignements des cadres de lecture de TnGST24, TbGST24 et TsGST24 donnent des identités

de 96 % entre TnGST24 et TsGST24 et entre TbGST24 et TsGST24 sur les séquences

nucléotidiques. La séquence nucleotidique de tpsgst24 a une identité de 88% avec celle de

tsgst24. En revanche l’identité entre les séquences nucléotidiques de TnGST24 et TbGST24

est de 99%. Les séquences nucléotidiques des cadres ouverts de lecture de TsGST24,

TbGST24 et TnGST24 ont été alignées, ainsi que les séquences protéiques déduites (Figure

18). TnGST24 et TbGST24 ont des séquences déduites en acides aminés identiques alors que

TpsGST24 présente 76% d’identité avec TsGST24. TpsGST24 a 206 aa soit un de plus que

TsGST24 dans la partie N terminale de la protéine. TpsGST24 présente de ce fait un meilleur

157

pourcentage d’identité avec OvGST2 d’O.volvulus et la GST1 de C elegans que TsGST24

(52% et 50% au lieu de 51% et 47%).

TnGST24 -MPLYKLVYFDIRGLAEPIRLLLHDQRVQFLDNRIQQKDWP--EMKSQMLFGQVPCLYED 57 TbGST24 -MPLYKLVYFDIRGLAEPIRLLLHDQRVQFLDNRIQQKDWP--EMKSQMLFGQVPCLYED 57 TsGST24 -MPLYKLVYFPIRGLAEPIRLLLHDQRVEFLDNRIQQKDWP--EIKSQMLFGQVPCLYED 57 TpsGST24 MAPKYKLAYFAIRGLAEPIRLLLHDQKVNFEDERFDKKDWP--EIKPKMLFGQVPCLYED 58 OvGST2 --MSYKLTYFSIRGLAEPIRLFLVDQDIKFIDDRIAKDDFS--SIKSQFQFGQLPCLYDG 56 GSTP1-1 -MPPYTVVYFPVRGRCAALRMLLADQGQSWKEEVVTVETWQEGSLKASCLYGQLPAFQDG 59 *.:.** :** . .:*::* ** .: :: . . : .:*.. :**:*.: :. TnGST24 DQPIVQSGAIMRHLGRRFGLYG-NAEEMTYVDQIYEGVVDLRLKYARLIYSDSFHDSKGK 116 TbGST24 DQPIVQSGAIMRHLGRRFGLYG-NAEEMTYVDQIYEGVVDLRLKYARLIYSDSFHDSKGK 116 TsGST24 DQPIVQSGAIMRHLGRRFGLYG-NAEEMTYVDQIYEGVVDLRLKYARLIYSDSFHESKGK 116 TpsGST24 DKPIVQSGAIMRHLGRRFGLYG-NADEMTYVDVVYEGIVDLRLKYARLIYGDFSDEAKCK 117 OvGST2 DQQIVQSGAILRHLARKYNLNGENEMETTYIDMFCEGVRDLHVKYTRMIYMAYETE-KDP 115 GSTP1-1 DLTLYQSNTILRHLGRTLGLYGKDQQEAALVDMVNDGVEDLRCKYISLIYTNYEAG-KDD 118 * : **.:*:***.* .* * : * : :* . :*: **: ** :** * TnGST24 FVNEVLPDELAKFEKILT----RKKYILDDEITFADYALAELLDVLLILSSTCLENFTAL 172 TbGST24 FVNEVLPDELAKFEKILT----RKKYILDDEITFADYALAELLDVLLILSSTCLENFTAL 172 TsGST24 FINEVLPDELAKFEKILT----GKKYILDDEITFADYALAELLDVLLILSSSCLENFTAL 172 TpsGST24 FVNEVLPVELARFEKLLT----GKQYILNDEITFADYALVELLDVLLVLSSTCLEKFPAL 173 OvGST2 YIKSILPGELAKFEKLLATRGNGRNLILGDKISYADYALFEELDVHQILDPHCLDKFPLL 175 GSTP1-1 YVK-ALPGQLKPFETLLSQNQGGKTFIVGDQISFADYNLLDLLLIHEVLAPGCLDAFPLL 177 ::: ** :* **.:*: : *:.*:*::*** * : * : :* . **: *. * TnGST24 TIYHSRFMNRPNLKNYLSSDIRKKTKINGNENK 205 TbGST24 TIYHSRFMNRPNLKNYLSSDIRKKTKINGNENK 205 TsGST24 TIYHSRFMNRPNLKRYLSSDIRKNAKINGNENK 205 TpsGST24 KTFHAQFMDRPNLKKYLSSDFRKNAKINGNDKQ 206 OvGST2 KTFHQRMKDRPKLKEYCEKRDAAKVPVNGNGKQ 208 GSTP1-1 SAYVGRLSARPKLKAFLASPEYVNLPINGNGKQ 210 . : :: **:** : . : :*** ::

Figure 18 : Comparaison des séquences en acides aminés (aa) des GSTs de T.britovi,

T.nativa, T.spiralis, T pseudopsiralis, par un alignement multiple en utilisant le logiciel Multialign. Les aminoacids en commun ont une marque « étoile », les changements conservatifs sont avec deux points et les changements partiels sont avec un point.

Figure 17 : PCR sur les ADNc des différents stades de développement de T.spiralis et d’autres espèces. Gel à 1,5% d’agarose. Puits 1 : témoin positif (ADNc LN069), 2 : L1NN ( ADNc fragments longs), 3 : L1NN (ADNc fragments courts), 4 : Adulte J3, 5 : Adulte J5, 6 : L1M, 7 : marqueur de masse moléculaire 1 kb Promega, 8 : T.spiralis (L1M) ISS 406 (isolat européen), 9 : T.pseudospiralis (L1M), 10 : T.britovi (Ad/L1NN), 11 : T.nelsoni (L1M), 12 : T.nativa (L1M), 13 : génotype T5 de Trichinella (L1M), 14 : témoin eau.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

500 bp

250 bp 353 bp

158

1.1.5. Peut-on utiliser TsGST24 comme antigène de

diagnostic sérologique pour différencier les infestations

par T spiralis de celle par T pseudospiralis ?

Compte tenu de la distance en aa entre TsGST24 et TpsGST24 il était tentant d’analyser le

pouvoir antigénique différentiel pour une espèce hôte infestée respectivement par T spiralis

ou T pseudospiralis. Pour cela la protéine a été exprimée en système procaryote, purifiée puis

utilisée en système ELISA vis à vis de sérums de porcs expérimentalement infestés.

1.1.5.1. La protéine exprimée en système procaryote est soluble

La séquence nucléotidique de TsGST24 a été amplifiée avec GST1F et GST1R à partir du

clone 12. Le produit PCR a été purifié puis cloné dans le vecteur pET102. Après expression

en E.coli BL21 Star (DE3), lyse des bactéries et centrifugation à 20 000g du produit de lyse,

les protéines solubles du surnageant sont séparées par SDS-PAGE (Figure 19). La masse

attendue de la protéine de fusion thioredoxine-TsGST24 est de 37 kDa. La bande d’intérêt est

visible dans le surnageant de lyse des bactéries, signifiant que le peptide recombinant est

exprimé sous forme soluble. Après passage des surnageants contenant les protéines solubles,

sur colonne contenant le glutathion et après plusieurs élutions avec une solution de glutathion

à 10 mM, les éluats ont été analysés par la technique SDS-PAGE sur des gels à 15 %

d’acrylamide (Figure 20). Il a été possible dans ces conditions de purifier une protéine de 37

kDa. La protéine de fusion thioredoxine-TsGST24 exprimée est capable de se lier au

glutathion suggérant la conservation de son activité enzymatique et de sa structure spatiale.

30 kDa

40 kDa

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figure 19: Résultats de l’expression et solubilité de la GST24 de

T.spiralis. Migration dans un gel à 15 % d’acrylamide par SDS-

PAGE de mélanges protéiques. Puits 1 : marqueur Bench Mark

Protein Ladder (Invitrogen), 2 : surnageant après lyse du culot de la

culture induite et centrifugation à 20 000g, 3 : culot de la culture

bactérienne avant induction, 4 : culot de la culture après 4h

d’induction. La position de la protéine d’intérêt est indiquée par une

flèche.

159

1.1.5.2. Analyse de l’antigénicité de TsGST24

La présence d’anticorps anti-TsGST24 dans les sérums de porcs EOPS expérimentalement

infestés avec 20 00 L1M de T.spiralis a été recherchée dans un premier temps par Western

blot. La cavéoline (peptide non reconnu par les sérums de porcs) fusionnée à la thioredoxine

de T.spiralis a été produite, et a servi de témoin pour l’éventuelle réaction croisée de la

thioredoxine fusionnée avec la TsGST24. La thioredoxine-cavéoline n’est pas détectée, alors

que la thioredoxine-TsGST24 est détectée à la fois avec des sérums à 12, 20 et 60 jours pi,

après transfert ou dépôt sur membrane avec ou sans dénaturation (Westerns blots et dots blots,

respectivement).

1.1.5.3.ELISA indirect

La présence d’anticorps anti-TsGST24 dans les sérums de porcs a été recherchée par ELISA

indirect construit en utilisant la protéine recombinante TsGST24. Un signal positif est obtenu

précocement en utilisant les porcs expérimentalement avec de fortes doses de Trichinella

spiralis (Figure 21). Les faibles doses infestantes ne permettent pas d’obtenir des anticorps

spécifiques anti GST24.

TsGST1 30 kDa

Figure 20 : Purification de la GST de T.spiralis, TsGST1. Migration dans un gel à 15 %

d’acrylamide par SDS-PAGE de protéines. Puits 1 : Marqueur de masse moléculaire (Bench

Mark Protein Ladder, Invitrogen), 2 : culot de la culture bactérienne avant induction, 3 : culot

de la culture après 4h d’induction, 4 : lysat de la culture bactérienne induite, après passage sur

colonne glutathion, 5, 6 et 7 : lavages de la colonne, 8 : première élution, 9 : deuxième

élution, 10 : troisième élution.

40 kDa

160

En résumé, une séquence d'ADN apparentée à la famille de gène de GST a été identifiée

dans une banque soustraite d’ADN complémentaire de larves nouveau-nées de T. spiralis.

Cette séquence a été utilisée pour la réalisation d’une sonde employée pour le criblage d'une

banque d’adulte contenant les larves nouveau-nées (Ad5) de T. spiralis. Suite au criblage, la

séquence identifiée présentait un cadre ouvert de lecture de 615 bp (tsgst24) codant pour une

protéine de 205 acides aminés (24 kDa) qui ont partagé 47% à 52% de l'identité avec les

GSTs intracellulaire de 24 kDa apparenté à la class pi d'autres nématodes. D'ailleurs, la

comparaison de T. spiralis GST (tsgst24) avec la proteine homologue de T. britovi (tbgst24)

et T. nativa (tngst24) a indiqué une conservation de nucléotides inter espèces à la hauteur de

96%. La séquence de la GST de T. pseudospiralis (tpsgst24) identifiée présente 88%

d’identité avec tsgst24. Des informations complémentaires concernant l’activité enzymatique

et la localisation de la protéine TsGST24 ont été décrites dans l’article 7. La séquence

nucléotidique de la GST 24 permet de montrer la variabilité génétique au sein du genre

Trichinella pour 4 espèces étudiées. La reconnaissance précoce de TsGST24 avec les sérums

de porcs infestés par les seules fortes doses parasitaires n’a pas permis son utilisation pour

différencier les animaux infestés par T spiralis ou T pseudospiralis.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

J-5 J0 J5 J10 J15 J20 J25 J30 J40 J50 J60

1T1

8T1

9T1

Jours

Antibody kinetics in the serum of conventional pigs infected by T. spiralis with THX-TsGST24

Figure 21: Cinétiques d’anticorps spécifique anti TsGST24 chez des porcs expérimentalemnet infestés par T spiralis. L’ELISA indirect est fondé sur la protéine recombinante purifiée THX-TsGST24. Les sérums de porcs conventionnels expérimentalement infestés par 200 L1M (porc 9T1) or 20 000 L1M (porcs 1T1, 8T1) de T. spiralis ont été utilisés vis à vis de l’antigène recombinant purifié.

161

1.2. Clonage et caractérisation d’une protéase à

sérine ayant un double domaine catalytique (article

8)

La première partie de ce travail a consisté à amplifier les ARNm de T. spiralis avec des

amorces spécifiques de la séquence protéasique étudiée puis de les séquençer. Les ARNm de

T. spiralis du stade L1M ont été transformés en ADNc avec l’amorce RT2 puis ont été

amplifiés avec le couple d’amorce RT1-RT2 par PCR. Une seule bande de 2kb a été obtenue,

purifiée puis clonée dans le vecteur TOPO. L’amplification positive au stade L1M confirme

l’expression à tous les stades parasitaires de Trichinella (la précédente séquence avait été

obtenue à partir d’ADNc du stade AdL1NN). La séquence consensus appelée SerP résulte de

la conservation nucléotidique maximale parmi les trois séquences utilisées pour obtenir le

consensus.

La séquence en acides aminées (aa) déduite de SerP est constituée de 650 résidus (dénommée

SerP). La protéine déduite a une masse moléculaire théorique de 69,49 kDa et avec un pHi

estimé à 8,4. L’ADNc séquencé est donc composé de 1953 pb (34% de A, 18,5% de C,

21,2% de G et 26,3% de T). Le pourcentage guanine-cytosine est de 39,7% et apparaît proche

de celui obtenu pour d’autres gènes clonés et séquencés chez Trichinella (Su et al., 1991;

Sugane and Matsuura, 1990; Vayssier et al., 1999). Il est cependant bien plus élevé que celui

calculé pour le génome entier de Trichinella (35%, (Hammond and Bianco, 1992). L’analyse

de la séquence en aa déduite révèle la présence de deux signatures de protéases à sérine

constituées de trois acides aminés entourés d’une séquence conservée qui forment la triade du

site actif. Ces trois aa sont une histidine, un acide aspartique et une sérine, respectivement en

position 389, 142/444 et 233/533 (Figure 01, Article 8). L’histidine de la triade catalytique du

premier domaine est remplacée par une arginine en position 88 (Figure 01, Article 8). Plus

précisément l’utilisation d’un logiciel de prédiction des domaines catalytiques de protéases à

sérine (Bateman et al., 2002) a indiqué que les deux domaines catalytiques putatifs sont

présents sur la séquence de la protéine entre le aa 39 et 277 pour le premier domaine (alpha)

et entre les aa 340 et 577 pour le deuxième domaine (béta). Ces deux domaines peptidiques

sont prédits (comparaison de PFAM) comme appartenant à la sous famille de la trypsine.

162

1.2.1. Le gène codant pour la SerP de T spiralis (Ts SerP)

est en copie unique dans le génome de Trichinella

Afin de déterminer le nombre de gène codant pour la protéine SerP l’ADN génomique des

larves L1M de T spiralis a été digéré par les enzymes de restriction TaqI et EaeI qui ne

possèdent pas de site de coupure dans la sonde « SerP » de 924 pb et par l’enzyme Asp 700

qui possède un site unique de coupure situé à 223 pb de l’extrémité 5’ de la sonde.

L’hybridation de l’ADNg de Trichinella digéré par TaqI et avec la sonde de 924 pb a révélé

un seul fragment de restriction de 5,7 kb. Deux bandes d’ADNg, de 6,05Kb et 3,3Kb ont été

hybridés lorsque celui-ci était digéré par Asp 700. Ces résultats signifient la présence d’un

seul gène SerP codant pour SerP chez Trichinella.

La taille du gène et le nombre minimal d’introns ont été déterminés en réalisant

l’amplification de différents fragments chevauchants de SerP (en utilisant en parallèle de

l’ADNc et de l’ADN génomique de Trichinella. Les principaux résultats obtenus des

différentes amplifications sont mentionnés dans le tableau 9.

Couples d’amorces ADN génomique (en pb) ADNc SerPseq (en pb) P11-P13 +100 P10-P2 +200 P8-P7 +400 P5-P13 +200 P1-P7 0 amplification 2000 P1-P9 570 Tableau 9 : Amplifications de l’ADN génomique et de l’ADNc à l’aide de différents couples

d’amorce chevauchant la séquence SerP.

L’amplification de l’ADNg en utilisant le couple d’amorce P11-P13 a permis d’amplifier un

fragment qui a une taille de 100pb supérieure à celle du fragment amplifié à partir d’ADNc

SerP avec le même couple d’amorces ce qui montre l’existence d’au moins un intron d’une

taille équivalente entre les deux oligonucléotides utilisés. De même avec le couple d’amorces

P10-P2 la présence d’au moins un intron d’une taille de 200pb est détecté. Il n‘existe pas

d’intron de ce fait entre P13 et P10. Le fragment amplifié avec le couple d’amorces P8-P7 et

l’ADN génomique a une taille supérieure de 400pb par rapport à la taille du fragment amplifie

à partir d’ADNc avec le même couple d’amorce ce qui montre la présence d’au moins un

intron d’une taille de 100 pb entre les séquences oligonucléotidiques P8 et P11 mais pas

163

d’intron entre P5 et P8. Le fragment amplifié avec le couple d’amorces P1-P9 a une taille

supérieure de 570pb par rapport à la taille du fragment amplifié à partir d’ADNc avec le

même couple d’amorces ce qui montre la présence d’au moins un intron d’une taille de 370

pb entre les séquences codant entre P1 et P5. Ces différents résultats montrent que le gène

SerP a au moins 4 introns.

1.2.2. SerP est constitué par un double motif catalytique

separé par un pont hydrophyle

Le profil d’hydrophobicité de la séquence en acides aminés déduite, obtenu par la méthode de

Kyte et Doolittle (1982) combiné avec le profil d’hydrophilicité obtenu par la méthode de

Hopp-Woods (1981), montre que la protéine est hydrophile sur la majorité de sa longueur.

Une région hautement hydrophile (encadrée) située entre les aa 265 et 365, correspond à la

région qui relie les deux domaines catalytiques. Deux autres pics hautement hydrophobes ont

été identifiés, et sont situés pour le premier au niveau de la séquence N terminale de la

protéine (séquence correspondant à la séquence signal) et pour le second vers le 550ème aa.

Cette topographie suggère une différence importante dans la conformation spatiale des 2

domaines.

1.2.3. Cartographie des épitopes de SerP

Comme pour la protéine GST24 une analyse de l’antigénicité de SerP a été conduite. La

protéine recombinante du domaine bêta de SerP (βSerP) a été produite mais n’a pas été

reconnue par le sérum de porcs expérimentalement infecté par T spiralis (20000L1M).

Compte tenu du caractère trés hydrophile du « pont » reliant les deux domaines catalytiques

une synthèse de peptides chevauchant a été réalisée. Une analyse préalable « in silico » a été

menée pour déterminer les domaines les plus probables pour être antigénique. La synthèse de

8 peptides a ainsi été réalisée. (Figure 22 ) Ces peptides ont ensuite été fixés sur une plaque

ELISA et soumis à une analyse avec un sérum de porc expérimentalement infecté par T.

spiralis (20000L1M). Aucun peptide ne s’est révélé antigénique.

164

Figure 22: Cartographie d’épitopes du domaine de jonction de la protéine Ts SerP. Les

paramètres les plus importants déduits de l’analyse in silico ont été indiqués sous la séquence

en aa déduite : Hydrophilicité, probabilité d’être exposé, mobilité, stucture alpha hélice

prédite, index d’antigénicité.

PPSEM

1

PPSEM

3

PPSEM

2

PPSEM

4

PPSEM5

PPSEM6

PPSEM7 PPSEM8

165

En résumé: Le cDNA codant pour une protéase à sérine, Ts SerP, a été amplifié par PCR en

utilisant des amorces dégénérées et un criblage de la banque d’ADN complémentaire

d’adultes-larves nouveaux née de Trichinella spiralis. L’analyse de la séquence a indiqué la

présence de deux domaines protéasique du type de la trypsine. Ces domaines sont séparés par

un domaine hydrophile potentiellement antigénique. Le Southern blot à indiqué qu’un seul

gène était transcrit en un ARNm d’une taille de 2.3 kb pour les stades larves musculaires et

adultes de T. spiralis. Le peptide recombinant chevauchant le domaine bêta de SerP (βSerP) a

été produit mais n’est pas reconnu par les sérums de porcs infestés par T.spiralis. Il en est de

même pour le peptide de jonction entre les deux domaines protéasiques qui n ‘est pas

antigénique malgré une analyse in silico favorable.

2. Gènes variables dans le genre Trichinella L’analyse de deux gènes conservés chez Trichinella (GST24 et SerP) a montré la difficulté

d’utiliser ces cibles pour obtenir des différences génétiques ou antigéniques entre espèces du

genre. Leur faible antigénicité ne permet pas de différencier par ELISA indirect en utilisant

les protéines ou peptide de synthèse différentes espèces de trichine infestantes (surtout lors de

faible infestation). La taille de tsgst24, le nombre d’intron de SerP ne permet pas de mettre en

place un test PCR différentiel suffisamment sensible (gène en copie unique) et robuste. Il

était donc nécessaire dans le but d’analyser et de mettre en évidence un marqueur simple

différenciant les espèces européennes de Trichinella, d’étudier un gène ayant une meilleure

variabilité génétique, facilement amplifiable. L’ARN mitochondrial a été pris comme cible

puisque des résultats partiels obtenus par W. Cabaj (2004) montraient une bonne distinction

entre T spiralis et T britovi.

166

2.1. Analyse des gènes codant pour l’ARN ribosomal

mitochondrial (article 9)

2.1.1. Clonage et séquence des gènes codant pour les

ARNr mitochondriaux de T nativa, T britovi, T

pseudospiralis.

En utilisant les amorces rmS et rmL déduites de la séquence nucléotidique publiée de l’ADN

mitochondrial de T spiralis, les séquences de T nativa, T britovi et T pseudospiralis ont été

obtenues avec les tailles respectives attendues de 972 et 1256 pb. Le niveau d’identité entre

les gènes des différentes espèces est compris entre 85 et 96% montrant une variation

significative intra genre.

2.1.2. Développement d’un test de typage des espèces de

Trichinella par une PCR multiplex

En se fondant sur les variations dans la séquence nucléotidique des différents génes

ribosomiques identifiées pour les différentes espèces de Trichinella analysées il a été possible

de déterminer en utilisant deux couples d’amorces une amplification simple ou multiple

permettant de différencier aisément par la taille les différentes espèces européennes. Le profil

a été reproduit de multiple fois avec différents isolats de la même espèce. Le typage est

reproductible avec une larve musculaire conservée en éthanol ou 1 ng d’ADN de Trichinella.

167

Figure 23 Electrophorèse des produits de PCR multiplex pour 24 isolats de Trichinella. Ligne 1 et 26 100 bp Ladder (Invitrogen), ligne 2-8 isolats T.spiralis (ISS 004, 51, 104, 534, 596, 889, 1100), ligne 9-12 isolats T.nativa isolates (ISS 10, 42, 70, 42), ligne 13 -24 isolats T.britovi (ISS 100, 137, 235, 1497, 1572, 1573, 1574, 1575, 1576, 1577, 1578, soumise), ligne 25 isolats T.pseudospiralis (ISS 13) population paléartique.

Figure 24 : Electrophorèse des produits de PCR multiplex sur l’ARN mitochondrial pour différents génotypes de Trichinella. Ligne 1 et 15 100 bp Ladder (Invitrogen), ligne 2

T.spiralis (ISS 004), ligne 9-12 isolats T.nativa isolates (ISS 10, 42, 70, 42), ligne 3 T.britovi (ISS 100), ligne 4 T.nativa (ISS 042), ligne 5 T.pseudospiralis (ISS 13) population paléartique, ligne 6 T.pseudospiralis (ISS 141) isolat Australien, ligne 7 T.pseudospiralis (ISS 470) Isolat néartique, ligne 8 Trichinella murrelli (ISS 35), ligne 9 Trichinella T6 (ISS 34), ligne 10 Trichinella nelsoni (ISS 37), ligne 11 Trichinella T8 (ISS 124), ligne 12 Trichinella T9 (ISS 408), ligne 13, Trichinella papuae (ISS 572), ligne 14 Trichinella zimbabwensis (ISS 1029)

168

En résumé : À ce jour, quatre espèces du genre Trichinella ont été identifiés en Europe, en

Russie et jusque dans l’est de la Chine: Trichinella spiralis, Trichinella nativa, Trichinella

britovi et Trichinella pseudospiralis. Une méthode PCR robuste a été définie pour différencier

ces quatre espèces en utilisant l’ADN ribosomal mitochondrial. Les séquences d'ADN codant

pour la petite et la grande sous-unités de l’ARN ribosomique mitochondrial (mt-rrnS et mt-

rrnL) des quatre espèces ont été rapportées. La comparaison des séquences pour aboutir à une

PCR multiplex a été effectuée. La PCR multiplex mitochondriale a été réalisée avec succès

sur 24 isolats d’Eurasie. La méthode de PCR basée sur l’amplification de l’ADN ribosomal

mitochondrial a été établie comme méthode de typage sensible et reproductrice pour l'Eurasie

afin d’identifier les quatre espèces de Trichine existantes. Le typage a été appliqué aux isolats

roumains et français collectés au cours des 3 dernières années et a confirmé l’existence de

deux espèces de Trichinella circulantes dans ces deux pays : T britovi et T spiralis. Cependant

il n’a pas été possible de différencier ces différents isolats par les marqueurs analysés.

169

ARTICLES VARIABILITE

GENETIQUE AU SEIN DU GENRE

TRICHINELLA (7-9)

171

ARTICLE 7 soumis à Molecular and Biochemical

Parasitology

ISOLATION, BIOCHEMICAL ANALYSIS, ET LOCALIZATION

OF A NOVEL GLUTATHIONE S-TRANSFERASE

FROM TRICHINELLA

Bahuon Celinea, Blaga Radua, c,*, ** , Fu BaoQuand, Liu MingYuanb, Le Rhun Daniellea,

Glemarec Audreya et Boireau Pascala

a JRU BIPAR INRA AFSSA ENVA UPVM, 94703 MAISONS-ALFORT cedex, France.

b Jillin University of Agriculture et Animal Sciences, 130062, Changchun, P.R. China. c University of Agricultural Sciences et Veterinary Medicine, 400372 Cluj-Napoca, Romania.

d Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, 730046,

Lanzhou, P.R. China.

* Equally first author

**Corresponding author:

Tel: 00 33 1 49 77 13 00

Fax: 00 33 1 49 77 13 16

E-mail address: [email protected]

Note: Nucleotide sequence data reported in this paper are available in the GenBankTM

database under the accession numbers DQ159094 (TsGST24), DQ159095 (TpsGST24),

172

DQ159096 (TbGST24), DQ159097 (TnGST24). Deduced amino acids sequences reported in

this paper are available in the GenBankTM database under the accession numbers ABA42914

(TsGST24), ABA42915 (TpsGST24), ABA42916 (TbGST24), ABA42917 (TnGST24).

173

Abstract

Survival of Trichinella sp., a pathogenic nematode parasite, is likely dependent upon the

detoxification activities of the glutathione S-transferases (GSTs). A DNA sequence similar to

the GST gene family was first identified from a subtracted cDNA library of T. spiralis New

Born Larvae (NBL) by suppression subtractive hybridization, et was used as a probe for the

screening of a T. spiralis Adult with hatched larvae (Ad5) cDNA library. The clones

identified from the screening had an identical full length open reading frame of 615 bp

(tsgst24) coding for a protein of 205 amino acids (24 kDa) that shared 47% to 52% of identity

with the 24 kDa pi class intracellular GSTs of other nematodes. Moreover, the comparison of

the sequence of T. spiralis GST (tsgst24) with those amplified from T. britovi (tbgst24) et T.

nativa (tngst24) revealed a high interspecies nucleotide conservation (96% of identity). The

GST of T. pseudospiralis (tpsgst24) presented 88% identity with tsgst24. The open reading

frame coding for T. spiralis GST24 was expressed in a prokaryotic system et the soluble

recombinant protein was purified by glutathione-affinity columns. TsGST24 enzymatic

activity was proved to be different from the activity of mammalian pi class GSTs, et other pi

class related nematode GSTs. With the universal substrate 1-chloro-2, 4-dinitrobenzene

(CDNB), the specific activity of TsGST24 was 3.79 µmole.min-1(mg protein)-1. The tissue

distribution of TsGST24 was examined by immunohistochemistry in muscular larvae (ML) of

T. spiralis. TsGST24 was located in the stichocytes et the genital primordium.

Keywords Trichinella; 24 kDa glutathione-S-transferase; pi class; immunolocalization

174

Introduction

Trichinella is one of the most widespread parasites infecting humans et animals in all

climates, except deserts. As many as 11 million people world wide may be infected [1].

Trichinella, similar to other parasitic organisms, might be able to survive in an

immunologically competent host by employing a variety of immune evasion strategies et

defense mechanisms, including the detoxification mechanism of glutathione S-transferases [2-

6]. Glutathione S-transferases (GSTs) are an ancient superfamily of multifunctional proteins,

found in all living organisms, with fundamental roles in cellular detoxification metabolism.

Their main chemistry is to catalyze the conjugation of the reduced glutathione (GSH) to a

wide range of exogenous et endogenous electrophilic substrates, to form more soluble, non-

toxic peptide derivates, ready to be excreted [7-10]. GSTs are involved in protecting tissues

against oxidative damage by the hydroperoxides of phospholipids, fatty acids et DNA [11].

Some parasite GSTs might also catalyze the GSH-dependent isomerization of metabolites

such as prostaglandins, et as a result, the parasite might modulate the immune system of the

host [5, 12, 13]. To date et based on several criteria (amino acid/nucleotide sequence identity,

physical structure of the genes et immunoreactivity properties), seven classes of the most

abundant GST subfamily, the cytosolic GSTs, are recognized in mammals: alpha, mu, pi,

sigma, theta, zeta et omega. Within each proposed GST class, the amino acid (AA) sequence

identity is broad, sharing > 40% identity, et between classes the identity is <25% [14].

In spite of increasing attention on parasitic GSTs, there is limited information on designating

GST classes in nematodes. Primary AA sequence alignment of helminth GSTs with

mammalian GST classes confirms that non-mammalian GST classes are expressed in

parasites adopting though the existing mammalian system [15]; thus, there is a mu class

comprising Schistosoma japonicum GST [16], Fasciola hepatica 47GST [17], S.mansoni

26GST [18], a pi class comprising the Onchocerca volvulus GST2 [19], a sigma class

comprising S.mansoni 28GST [18], O. volvulus GST1 [20, 21], et an omega class comprising

S.mansoni GST (SmGSTO) [18], O. volvulus GST3 [22]. Recently at least two major

nematode generic GST classes have been identified by the analysis of the theoretical

proteome of Caenorhabditis elegans, including proteins also expressed in Heligmosmoides

polygyrus bakeri, Haemonchus contortus, et Ascaris suum [15;23]. The GST subfamily

appears to be larger than thought, especially for non-mammalian GSTs.

GSTs have long been considered as targets for the development of antiparasitic drugs or

vaccines [22]. The protective role of GSTs has been described in S. mansoni where

175

vaccination with a 28 kDa GST has induced protection against experimental infection in rats,

mice [24] et sheep [25] while GST26 of F. hepatica induces protection in sheep [26]. To date,

only one GST was identified in T. spiralis (TsGST28) showing a high species-specificity

[27], yet several parasitic worms possess more than one GST: OvGST1 to 3 for O. volvulus

[19, 28, 29] Fh GST1, 7, 47, 51 for F. hepatica [30]. Here we report the identification of a

novel GST from T. spiralis of 24kDa et apparently related to the pi class of GSTs. The

homologous sequence was obtained for three other Trichinella species: T. nativa, T. britovi et

T. pseudospiralis. The aim of this work was to characterize, express et locate within the

parasite the novel GST of T. spiralis.

Materials et methods

Parasite isolation

Muscle-stage larvae (ML) of T. pseudospiralis (ISS 13) were recovered from infected OF1

mice at 35 days post-infection (dpi) by artificial digestion as described in Gamble et al. [31].

Adult worms of T. spiralis ISS 534, T. nativa (ISS 531) et T. britovi (ISS 137) were obtained

from mouse washed intestines, 5 days post-infection (Ad5).

RNA extraction et construction of cDNA libraries

Total RNA extraction from ML et Ad5 was performed according to Chomczynski et Sacchi

[32]. Poly (A) RNA was purified using a Poly (A) Quick mRNA Isolation Kit (Stratagene)

according to the manufacturer’s instructions. λ ZAP II cDNA libraries of T. spiralis (ISS

534), T. nativa (ISS 531), T. britovi (ISS 137) Ad5 stage et T. pseudospiralis cDNA libraries

of ML stage were established as in Vayssier et al. [33] using the ZAP-cDNA Synthesis Kit et

ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit (Stratagene).

Screening of a T. spiralis Ad5 et T. pseudospiralis ML cDNA libraries

The T512 clone encoding for a protein similar to the O. volvulus GST (OvGST2), was

obtained from a subtractive cDNA library after depletion of the New Born Larvae (NBL)

mRNA by Ad3+ML mRNA from T. spiralis (ISS 534) using a PCR-select cDNA subtraction

kit (Clontech) as performed by Fu et al [34]. This clone was used in amplification with the

T512 forward et reverse primers 5’CCTATAAGGGGCTTGGCAGAACCC et

176

5’GCCAATTCATCTGGCAACACTTCG to produce a nucleic probe of 353 bp. Following a

standard PCR with the Novataq PCR kit (Novagen) (94°C for 5 min, then 30 cycles at 94°C

for 30 s, 58°C for 30 s, 72°C for 30 s, followed by a final extension at 72°C for 10 min) et a

DNA purification using QIAquick PCR purification (Qiagen), the amplified probe was

labeled with a DIG high prime labeling kit (Roche), et used to screen 3x 104 phages of a T.

spiralis Ad5 cDNA library et 3x 104 phages of a T. pseudospiralis ML cDNA library,

following the instructions of ZAP express cDNA synthesis kit (Stratagene). Following two

rounds of hybridization, seven positives clones for each Trichinella species were selected et

the recombinant plasmids were excised under in vivo conditions from the lambda ZAP II

phage (Stratagene) according to the manufacturer’s recommendations.

Cloning of T. nativa et T. britovi GSTs

The cDNA libraries of T. nativa et T.britovi Ad5 were used as template in a PCR reaction

(95°C for 5 min, then 30 cycles at 94°C for 1 min, 56°C for 1 min, 72°C for 1 min) with the

recombinant Taq DNA polymerase (Invitrogen) using GST1F

5’CACCATGCCACTATACAAGTTG et GST1R 5’TCATTTGTTTTC ATTCCCATTT3’

deduced primers from tsgst24 sequence. PCR products were purified, cloned into the PCR II-

TOPO vector (Invitrogen), et then transformed into TOP10 E. coli. The plasmid for three

independent clones for each Trichinella species was sequenced.

Sequencing, nucleotide et amino acid sequence analysis

The inserts of recombinant plasmids were sequenced completely on both strands using the T3

et T7 universal primers by the Qiagen Sequencing Service (Hilden, Germany) et analyzed by

homology search using BLAST programs on the National Center for Biotechnology

Information web server. Multiple sequence alignments were performed with the BLAST

program [35], et comparison with EST libraries of T. spiralis ML, Ad et NBL [36] were

performed using Parasite Genomes Wu-Blast2 (http://www.ebi.ac.uk/blast2/parasites.html).

Comparison of AA sequences was done according to Katoh et al. [37].

Prokaryotic expression of tsgst24

Following PCR amplification with primers GST1F et GST1R, the full length ORF of the T.

spiralis GST (tsgst24) was cloned into the pET102 vector (Invitrogen) in frame with the E.

coli thioredoxin. The resulting recombinant vector pET102-TsGST24 was used to transform

BL21 Star (DE3) E. coli. The transformed E. coli strain was grown at 37°C in LB medium

177

supplemented with ampicillin (50 µg/ml) overnight at 200 rpm. The culture was centrifuged at

4°C for 15 min at 3000 g. Pellets were analyzed by standard SDS-polyacrylamide gel

electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing conditions [38], et the proteins were stained by

the Coomassie blue R250.

Protein solubilization was obtained by incubation of a bacterial pellet with lysis buffer (25

mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 10 mM Beta-mercaptopethanol, 0.5% Triton X-100, 10

mM imidazole), 1 mg/ml lysozyme in TEN buffer (50 mM Tris-HCl pH 6.8, 1 mM EDTA,

150 mM NaCl). The reaction was performed at room temperature (RT) for 1h. Cells were

broken by sonication (5 min, 7s on, 3s off) followed by three cycles of freezing (5 min, -

80°C) et thawing (5 min, RT). The suspension was centrifuged at 20000 g for 30 min at 4°C,

in order to separate soluble et insoluble proteins. The supernatant was passed on glutathione

sepharose 4B beads (Amersham) for purification by affinity chromatography of the rThx-

TsGST24. The thioredoxin was separated from TsGST24, directly on the beads, by digestion

with four units of enterokinase (Invitrogen) overnight at 37°C in 200 µl of enzyme buffer et

shaking at 120 rpm. Following three washes with PBS, the rTsGST24 was eluted with 10 mM

reduced glutathione in 50 mM Tris-HCl pH 8.0. Protein concentrations were determined by

measurement at 280 nm using GenQuant Pro spectrophotometer (Amersham), et commercial

GSTP1-1 (Invitrogen) as a control.

Native size determination

Non-denaturing PAGE was used to determine the molecular mass of the native protein [39].

Migration of protein markers (bovine serum albumin et chicken egg albumin) et the purified

GST in non-denaturing gels of different acrylamide concentrations were used to calculate the

molecular mass of the native protein according to Sigma Technical Bulletin MKR-137.

Enzymatic assays

Chemicals

1-chloro- 2,4 – dinitrobenzene (CDNB), Ethacrynic acid (EA), reduced glutathione (GSH), β

nicotinamide adenine dinucleotide 2’ phosphate reduced tetrasodium salt (NADPH), GSH

reductase, 1,2 – dichloro -4- nitrobenzene (DCNB), et Cumene hydroperoxide (CH) were

purchased from Sigma.

Assays

CDNB, DCNB et EA assays were performed as described by Habig et Jakoby [40]. GST P1-1

(Invitrogen) was used as a positive control.

178

Briefly, 1 mM CDNB in ethanol, 1 mM GSH, et purified recombinant GST proteins were

incubated in 100 mM sodium phosphate buffer at pH 6.5. The final ethanol concentration was

1.67%. CDNB was added to start the reaction. After mixing, the formation of GSH conjugate

was monitored at 340 nm at 30°C. One mM DCNB in ethanol, 5 mM GSH, et purified GST

proteins were incubated in 100 mM sodium phosphate buffer pH 7.5. The final ethanol

concentration was 1.67%. DCNB was added to start the reaction. After mixing, the formation

of GSH conjugate was monitored at 345 nm at 30°C.0.2 mM EA in ethanol, 0.25 mM GSH, et

purified recombinant GST proteins were incubated in 100 mM sodium phosphate buffer at pH

6.5. The final ethanol concentration was 1.67%. EA was added to start the reaction. After

mixing, the formation of GSH conjugate was monitored at 270 nm at 30°C. The CH assay

was performed as described previously by Reddy et al. [41]. 1.2 mM CH in 100 mM Tris-

HCl, pH 7.2, 1 mM GSH, 0,2 mM NADPH, 1 unit of GSH-reductase, were mixed in 100 mM

Tris-HCl pH 7.2, et purified recombinant GST proteins were added to start the reaction. After

mixing, the formation of GSH conjugate was monitored at 340 nm at 30°C.

Reactions had to be linear for at least one min to be included in calculation of the specific

activity. Measurements were made using a Secomam 750 spectrophotometer (Secomam).

Specific activity in µmol.min-1 (mg protein)-1= (∆ Absorbance/min) x (1/protein in mg)/ε,

where ε is micromolar absorbance coefficient, given the fact that 1 cm path length cuvettes

are used. Values for ε are 9.6 (CDNB), 8.5 (DCNB), 6.22 (CH) et 5.0 (EA), according to

Habig et Jakoby [40].

Preparation of immune serum against rTsGST24

Three µg of the purified rTsGST24 protein were injected subcutaneously in a volume of 100

µl with adjuvant (ISA70, Seppic) at day 0 et 28 for each of the ten OF1 mice. Serum samples

were collected at day 49 after the first injection.

Standard ELISA for titration of IgG1 et IgG2 in immune serum

Microplates were coated with 100 µl of a 100 µg/ml solution with rTsGST24, diluted in 15

mM Na2CO3, 34.8 mM NaHCO3 et incubated 2 h at 37°C. Wells were then washed five times

in 0.5 % Tween 20 (Sigma). Wells were saturated with 200 µl of a saturation buffer (0.5 %

gelatin (Merck) , 0.5 % Tween 20, in PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10.1 mM Na2HPO4,

1.8 mM KH2PO4 pH 7.3)), et were incubated for 30 min at 37°C. Two hundred µl of serum

diluted in the saturation buffer were deposited into each well. Microplates were then

incubated for 1 h at 37°C, et washed five times. One hundred µl of anti-mouse secondary

179

antibody labeled with peroxidase (Sigma) was diluted 1:20000 in saturation buffer et

distributed in each well, before incubation for 1 h at 37°C, et five washings. The TMB 2 color

substrate (Zymed Cliniscience) was distributed in wells, et the color development was

stopped after 15 min of incubation at RT by addition of 0.5 M H2SO4. The color density was

measured at 450 nm.

Protein analysis

Total soluble antigen was prepared from T. spiralis (ISS 104) ML resuspended in NaCl

solution (1g/L). The suspension was subjected to three cycles of freezing-thawing. The larval

fragments were then sonicated three times for 5 min at 4°C, et the supernatant was collected

after centrifugation at 30000g for 1 h at 4°C.

One dimensional SDS-PAGE of the purified recombinant protein or soluble extract of

Trichinella worm was performed by the method of Laemmli [38]. Western blot analysis was

performed with 50 µg of T. spiralis ML total soluble extract et 0.2 µg or 1 µg of rTsGST24

that were first separated by SDS-PAGE et then electro-transferred onto Hybond P PVDF

membranes following the manufacturer’s instructions (Amersham). Membranes were pre-

hybridized for 1 h in 5% non-fat milk in TBS-T (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl,

0.1% Tween 20). After two washes in TBS-T for 1 min et 3 washes in TBS-T for 5 min,

membranes were incubated with sera from rTsGST24 sensitized mice diluted in TBS 1:100 or

1:500 for 1 h. After washing, membranes were incubated for 20 min with the goat anti-mouse

IgG alkaline phosphatase labeled antibodies (Sigma) diluted in TBS 1:10000. After washing,

membranes were incubated for 30 min with the NBT/BCIP color substrate (Amresco).

Indirect immunofluorescence antibody test (IIF)

ML were washed in PBS before inclusion in Tissue Tek (Miles scientific) et freezing at -

20°C. After one wash in PBS for 5 min, the cryostat sections of T. spiralis (ISS104) ML were

incubated for 1 h with primary antibody diluted 1:500 in PBS-20% normal goat serum

(Gibco), followed by three washes in PBS-T (0.05% Tween 20, Sigma) et incubation 1 h at

37°C with Alexa fluor 488-labelled goat anti-mouse immunoglobulins (Invitrogen). Cryostat

sections were then washed three times as previously, et counterstained for 1 min in Evans

Blue diluted 1:5000 in PBS, at RT, et then washed. Nuclear staining was performed by

incubating cryostat sections with Hoechst dye Nr 33258 (Bisbenzimide, Sigma) diluted

1:20000 in PBS for 45 min at RT before being washed et visualized with an epifluorescent

microscope.

180

Results

Isolation of gst24 from Trichinella spiralis (tsgst24)

Among the selected clones of a previously subtracted cDNA library established by Fu et al.

[34], a cDNA clone (T512) encoding for a GST was partially sequenced. Derived primers

from the T512 cDNA sequence were used in a PCR amplification to generate a nucleic probe

used in the screening of a cDNA library of T. spiralis Ad5. Following two rounds of

hybridization, seven clones were selected et their respective cDNA inserts were completely

sequenced on both strands. A consensus nucleotide sequence was deduced (Fig. 1). The

cDNA was 615 bp long with an open reading frame for a protein of 205 amino acid residues

(TsGST24) having a calculated molecular mass of 23.9 kDa et an isoelectric point of 6.83. No

signal peptide was found according to the Hidden Markov Model [42]. A Blastp search on the

NCBI non-redundant sequence database [35; 43] indicated that the protein is homologous to

the previously described pi class GST of other nematodes. The percentage of identity varies

from 47% for C. elegans GST1 (GenBank accession no NP_499006), to 49% for Brugia

malayi (GenBank accession no CAA73325), 50% for Wuchereria brancofti (GenBank

accession no AAO45827), 51% for O. volvulus OvGST2 (GenBank accession no CAA58767)

et 52% for Dirofilaria immitis (GenBank accession no P46426). Blast searching of the tsgst24

ORF on expressed sequence tags (ESTs) of T. spiralis ML, Ad et NBL [36] revealed 98%

identity with T. spiralis ML sequences (GenBank accession number BG520152, et

BG353762) on 535 bp et 503 bp sequences, respectively, et 69% with NBL et adult EST

sequences (GenBank accession numbers BQ693232 et BQ542178) on 514 bp et 540 bp

sequences, respectively.

Cloning et sequencing of the gst24 of T. nativa (tngst24), T. britovi (tbgst24) et T.

pseudospiralis (tpsgst24)

Derived primers from the tsgst24 ORF sequence (GST1F et GST1R), were used in PCR

amplification with cDNA libraries of T. nativa Ad5 et T.britovi Ad5 as template, to isolate

tngst24 et tbgst24. Screening of a T. pseudospiralis ML cDNA library was needed to isolate

tpsgst24.

181

Comparison of the nucleotide sequences revealed 99% identity between tngst24 et tbgst24 (2

different nucleotides), et 96% identity between tngst24 et tsgst24 as well as between tbgst24

et tsgst24 (19 different nucleotides). The sequence of tpsgst24 presents 88% identity with

tsgst24. Comparison of the deduced AA sequences revealed that TnGST24 et TbGST24 were

homologous et showed 10 AA difference with TsGST24 (Fig. 2). TpsGST24 shares 77%

identity with TsGST24 with 44 different AA et 76% identity with TnGST24, TbGST24 with

49 different AA. TpsGST24 has 206 AA residues, one more than TsGST24 in the N-terminal

part after the first methionine, et shares stronger identity with OvGST2 of O. volvulus et

GST1 of C. elegans than TsGST24 (52% et 50% instead of 51% et 47%, respectively).

Expression of the rTsGST24

The full length ORF of TsGST24 was subcloned into the pET102 expression vector in frame

with the E. coli thioredoxin (Thx) gene to facilitate the generation of a soluble protein,

correctly folded, et presenting full biological activity [44]. The solubility of rThx-TsGST24

produced was demonstrated after centrifugation at 20000 g. rThx-TsGST24 was purified by

glutathione-affinity columns confirming the native form of the recombinant protein. The

thioredoxin was cleaved off from rTsGST24, enabling to perform additional biochemical

experiments. After cleavage of the thioredoxin peptide, rTsGST24 was subjected to both non-

denaturing PAGE et SDS-PAGE. Analysis of the purified protein preparations by SDS-PAGE

revealed the presence of a single protein band with a molecular mass of 24 kDa (Fig. 3). The

calculated molecular mass of the native protein in non-denaturing PAGE conditions was 52

kDa ± 3.5 kDa. This result suggests that rTsGST24 is catalytically active as a homodimer.

Glutathione S-transferase activity

The specific activities of rTsGST24 determined with a range of electrophilic substrates in

spectrophotometric assays are listed in Table 1. The substrate activity profile of rTsGST24

was determined using various substrates which have been shown to have partial specificity for

the different mammalian GST classes [45]. The specific activities of the positive control

(human GST P1-1) are filling the criteria for the pi class. Results of other invertebrate GSTs

182

from Rojas et al. [27] (TsGST28), Liebau et al. [2] (O. volvulus OvGST2), Salvatore et al.

[30] (F. hepatica FhGST) et Campbell et al. [15] (H. polygyrus bakeri rHpolGS) are

displayed for comparison.

The highest activity of rTsGST24 was observed with the universal substrate, CDNB. The

specific activity for this substrate was determined to be 3.79 (±0.26) µmol.min-1 (mg protein)-

1. rTsGST24 presents a low level activity with ethacrynic acid, a substrate preferentially

conjugated by the pi class of mammalian GSTs. There is a relatively low level of activity with

the alpha class marker substrate, CH. On contrary, there is a noticeable activity (>0.5

µmol.min-1 (mg protein)-1) with the mu family marker substrate, DCNB.

The selenium independent GSH peroxidase activity of rTsGST24 is very limited, since

activity is detectable at very low levels, 0.023 (±0.015) µmol.min-1 (mg protein)-1 with the

model lipid hydroperoxide substrate, CH.

Detection of rTsGST24 in soluble extracts et localization of rTsGST24

rTsGST24 monospecific serum was prepared using the purified recombinant protein to

immunize mice. The collected IgG1 et IgG2a from immunized mice serum was titrated by

standard ELISA using coated soluble rTsGST24 at day 14, 28 et 42 after the first injection.

The highest titre was obtained at day 42 (data not shown). Serum was then collected at day

49. Western blot using either rTsGST24 or ML total soluble extract revealed a 24 kDa band

when serum of mice injected with rTsGST24 was used (Fig. 4). A second band of ≈ 48 kDa,

which is the size of the expected dimeric form, was also detected in total soluble extract.

Immunolocalization of TsGST24 was then performed by IIF test on cryostat sections of ML

(Fig. 5). A bright positive signal could be observed in the cytoplasm of the stichocytes et on

the genital primordium. Staining of the nuclei with Hoechst dye demonstrated a correlation

between high signal et high density of nuclei, typical of the genital primordium et also with

the low density of large nuclei typical of the stichocytes area.

Discussion

In this study, a novel T. spiralis glutathione S-transferase of 24 kDa was characterized et

differs from the already published TsGST28 of Rojas [27]. The corresponding GST

nucleotide sequences of T. nativa (tngst24), T.britovi (tbgst24) et T. pseudospiralis (tpsgst24)

were also cloned. Like other members of the GST superfamily, including nematode et

trematode GSTs, TsGST24 contains typical N-terminal (cd03076) et C-terminal (cd03210)

183

domain structures, as displayed in NCBI Blastp program [46]. Perbandt et al. [6] caracterised

the reduced glutathione (GSH) binding site (G-site) of OvGST2 et the Human pi class GST,

GSTP1-1. The G-site of TsGST24 is identical to the site described in OvGST2 et GSTP1-1,

except for a valine instead of a leucine at position 51 et a valine instead of an arginine at

position 95 (Fig. 2). The highly conserved residues Y 8, P 52, D 58, A 66, I 67 et D152, that

have been found in all known GST sequences [47], are also present in TsGST24. Moreover

seven of the conserved AA residues lining the glutathione-binding region, as described for the

glutathione sulfonate-bound pi class GST [48] are present in TsGST24 (Y8, G13, K43, Q50,

P52, Q63 et S64). When the AA sequence encoded by tsgst24 was compared with other

sequences using Blastp analysis [35; 43], the highest identity was scored with D. immitis GST

(52%), GenBank accession no P46426, O. volvulus OvGST2 (51%), GenBank accession no

CAA58767, W. brancofti (50%) GenBank accession no AAO45827, B. malayi (49%),

GenBank accession no CAA73325, all GSTs belonging to the pi class. The A. suum GST

(sigma class) [49] is less similar with only 34% identity, the O. volvulus secreted OvGST1

(sigma class) [19] presenting 32% identity et the S. mansoni Sm26 (mu class) [50] has 28%

sequence identity with TsGST24. The above analysis clearly indicates that TsGST24 is

topologically related to the pi class GSTs, reiterating earlier observations that the pi class

GSTs are highly conserved across organisms [47]. The other three Trichinella GSTs

(TnGST24, TbGST24 et TpsGST24) that have been isolated present similar structures,

incorporating the highly conserved AA. The non-encapsulated Trichinella species, T.

pseudospiralis that phylogenetically drifted away from the other three encapsulated species

[51], presents a pi class GST that has only 77% identity, confirming thus the genetic distance

between the encapsulated et non-encapsulated Trichinella species [52, 53].

Interestingly, the comparison of tsgst24 with the T. spiralis EST sequences from the

Washington University Nematode EST Project [36], identified NBL et Ad gst nucleotide

sequences presenting only 69% identity. This suggests that either there is a novel gst,

corresponding to the Ad/NBL of T. spiralis, or could be the gene coding for TsGST28 [27], as

no nuclear sequences are available, since the protein has been isolated by affinity

chromatography.

In order to characterize the enzymatic activities, the purified rTsGST24, without any

additional AA sequence, mimics the native protein, making these studies very relevant. The

rTsGST24 has the expected theoretical size of 24 kDa; a native soluble fraction of 52 kDa ±

3.5 kDa, presenting enzymatic activity, was obtained et strongly suggests that rTsGST24 is

active as a dimer, confirming that all soluble GSTs characterized to date are active as dimers

184

[54]. The substrate specificity of rTsGST24 was determined with a range of various

electrophilic substrates (Table1).The highest activity was observed with the universal

substrate CDNB, comparable to that of other helminths, e.g. O. volvulus [2,19, 28], S.

mansoni, S.japonicum [55], F. hepatica [30], being 2-10 times higher than that of TsGST28

[27]. Unlike rOvGST2, rTsGST24 is not very active with EA, a substrate preferentially

conjugated by the pi class GSTs. Specific activity towards EA is above 1 µmol.min-1 (mg

protein)-1 for a pi class GST according to Eaton et Bammler [45], while rTsGST24 EA

specific activity is 0.16 µmol.min-1 (mg protein)-1 . The activity of rTsGST24 towards EA is

more similar to the one described by Salvatore et al [30] for a mu class GST of F. hepatica.

Current GST classification schemes use AA sequence similarity et gene organization; even in

the most homologous GSTs, about one- third of the changes are localized to the substrate

binding site, making intra-class substrate variation possible [56]. It might be the case for

TsGST24, since the substrate binding site (G-site) varies in two AA out of seven, when

compared to OvGST2 et human GSTP1-1 [6].

rTsGST24 has the ability to reduce CH, though this activity is very limited as it is just above

the limit of detection (0.01 µmol.min-1 (mg protein)-1 according to Liebau et al. [2]. This

demonstrates, at least to some extent, that rTsGST24 can act as a selenium-independent GSH

peroxydase, which would indicate a protective role against lipid peroxidation [27]. Selenium-

independent glutathione peroxydase activity has also been observed in D. immitis [57], et O.

volvulus [2]. Moreover, crystallization et structure analysis must be performed in order to

better understand the biochemical affinities of rTsGST24.

To aid in assessing the functional role of TsGST24 in T. spiralis, the antigen TsGST24 was

localized by immunodetection at the light microscopic level in muscular larvae. Specificity of

the serum was analysed on ML total soluble extracts. TsGST24 is localized primarily in the

cytosolic part of the genital primordium et the excretory glands, the stichocytes (Fig. 5). The

absence of the signal peptide along with the immunofluorescent pattern distribution indicates

that the cloned rTsGST24 is intracellular. Not surprisingly TsGST28 [27] was also

immunolocalized in the stichocytes, since this organ plays a crucial role in the life cycle of

Trichinella, presenting major enzymatic functions [58; 59]. OvGST2 has a different

distribution, as it is located throughout the syncytial hypodermis, as well as in the uterine

epithelium [2]. The potential functional differences between rTsGST24 et OvGST2, in spite

of a similar biochemical structure, suggest that a more related TsGST exists, which could be

the second gene identified in the T. spiralis EST library.

185

Due to the protective role of GSTs described in helminths, these enzymes are leading targets

for parasite vaccine development. The lack of immunological identity between TsGST28 et

several parasites as tested by Rojas [27], suggests that TsGSTs could be relevant candidates

for protection against trichinellosis. Evaluation of the protective potential of rTsGST24 is in

progress.

Acknowledgements

The authors are grateful to Romel Hernandez-Bello from the Cinvestav (Mexico) as a Ph.D.

student, to Evelyne LeNaour as a laboratory assistant, to Véronique Lainé-Prade for the

preparation of the total soluble antigen of T. spiralis et also to Dr. Theo Bammler from the

University of Washington, USA, et Dr. Gun Stenberg from Institute of Biochemistry,

Uppsala, Sweden, who kindly answered my numerous questions on GST activity tests.

This work was supported by grants from the EU TRICHIPORSE contracts (QLRT-2000-

01156, QLK1-CT-2002-02826), MetVetNet (Trichinet/Trichimed), Ecos M01A02-10 et from

the animal care department of INRA.

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193

Specific activity (µmol min-1 (mg protein)-1)

CDNB EA DCNB CH

GST P1-1 83.2 ± 6.53 1.61 ± 0.40 0.23 ± 0.04 0.24± 0.05

TsGST24 3.79±0.26 0.16 ± 0.03 0.61±0.19 0.023±0.015

TsGST28 0,365 –1.773 - - 0.406 – 0.611

rHpolGST 1.34785± 0.05077 0.535± 29.14 - 0.54536± 0.02069

rOvGST2 2.130± 0.108 1.017± 0.256 nd 0.191±0.033

Fh GST 11.5 ± 0.6 0.150±0.10 - -

Criteria for

Mammalian

GST pi class

50 < X < 150

X >1

X < 0.5

X < 0.5

Table 1: Substrate specificities of rTsGST24, compared with the activity of mammalian GST,

class pi towards the same substrates. nd = not detectable. All values are the means ± standard

deviation of at least triplicate determinations. GST P1-1 was used as a positive control.

CDNB =1-chloro-2,4–dinitrobenzene, EA = ethacrynic acid, DCNB = 1,2–dichloro-4-

nitrobenzene, CH = cumene hydroperoxide.

194

cacgagttgaagtgtctctcgagcagtttgaaagttgcgactcttgctaaaatgccacta

H E L K C L S S S L K V A T L A K M P L

tacaagttggtttactttcctataaggggcttggcagaacccatacgactgttgcttcat

Y K L V Y F P I R G L A E P I R L L L H

gatcaaagagttgaatttcttgacaaccgtattcagcaaaaagattggcccgaaataaag

D Q R V E F L D N R I Q Q K D W P E I K

tcccaaatgttgttcgggcaagttccatgtctttatgaggatgatcagccgatcgttcaa

S Q M L F G Q V P C L Y E D D Q P I V Q

tctggagctataatgcgtcatctggggcgtcgatttggcttgtatggaaacgcagaagaa

S G A I M R H L G R R F G L Y G N A E E

atgacttacgtcgaccaaatatacgagggcgttgttgatttgcgattaaaatatgctcgt

M T Y V D Q I Y E G V V D L R L K Y A R

ctgatatacagcgattcttttcatgagtcaaagggtaaatttattaacgaagtgttgcca

L I Y S D S F H E S K G K F I N E V L P

gatgaattggcgaaatttgaaaaaatacttacaggaaagaaatacattttggatgacgag

D E L A K F E K I L T G K K Y I L D D E

ataacctttgccgactatgcattggctgaacttctggacgtgcttttgatactttcgtca

I T F A D Y A L A E L L D V L L I L S S

agttgcttggaaaattttacagcactgacgatttatcattcacgctttatgaatcgtcca

S C L E N F T A L T I Y H S R F M N R P

aatttgaaaagatatttgtcatcagatattcgtaaaaatgctaagataaatgggaatgaa

N L K R Y L S S D I R K N A K I N G N E

aacaaatgaatttaattatttattatgatgaaatttctgctggattagggttattcgtgt

N K - I - L F I M M K F L L D - G Y S C

gtgctgtgatatttatatgccgttttctaatgggattgtgattaattgttatgcgatcgc

V L - Y L Y A V F - W D C D - L L C D R

atagtagtttcagattactctagtgaagatgataatttctgtgtattttagggttttgta

I V V S D Y S S E D D N F C V F - G F V

tttgaataaaaagcagtttaaaaaaaaaaaaaaa

Figure 1: Nucleotide et deduced AA sequences of TsGST24. T512F et T512R sequences are

underlined. GST1F et GST1R are in bold letters. Start et stop codons are framed.

195

TnGST24 -MPLYKLVYFDIRGLAEPIRLLLHDQRVQFLDNRIQQKDWP--EMKSQMLFGQVPCLYED 57 TbGST24 -MPLYKLVYFDIRGLAEPIRLLLHDQRVQFLDNRIQQKDWP--EMKSQMLFGQVPCLYED 57 TsGST24 -MPLYKLVYFPIRGLAEPIRLLLHDQRVEFLDNRIQQKDWP--EIKSQMLFGQVPCLYED 57 TpsGST24 MAPKYKLAYFAIRGLAEPIRLLLHDQKVNFEDERFDKKDWP--EIKPKMLFGQVPCLYED 58 OvGST2 --MSYKLTYFSIRGLAEPIRLFLVDQDIKFIDDRIAKDDFS--SIKSQFQFGQLPCLYDG 56 GSTP1-1 -MPPYTVVYFPVRGRCAALRMLLADQGQSWKEEVVTVETWQEGSLKASCLYGQLPAFQDG 59 *.:.** :** . .:*::* ** .: :: . . : .:*.. :**:*.: :. TnGST24 DQPIVQSGAIMRHLGRRFGLYG-NAEEMTYVDQIYEGVVDLRLKYARLIYSDSFHDSKGK 116 TbGST24 DQPIVQSGAIMRHLGRRFGLYG-NAEEMTYVDQIYEGVVDLRLKYARLIYSDSFHDSKGK 116 TsGST24 DQPIVQSGAIMRHLGRRFGLYG-NAEEMTYVDQIYEGVVDLRLKYARLIYSDSFHESKGK 116 TpsGST24 DKPIVQSGAIMRHLGRRFGLYG-NADEMTYVDVVYEGIVDLRLKYARLIYGDFSDEAKCK 117 OvGST2 DQQIVQSGAILRHLARKYNLNGENEMETTYIDMFCEGVRDLHVKYTRMIYMAYETE-KDP 115 GSTP1-1 DLTLYQSNTILRHLGRTLGLYGKDQQEAALVDMVNDGVEDLRCKYISLIYTNYEAG-KDD 118 * : **.:*:***.* .* * : * : :* . :*: **: ** :** * TnGST24 FVNEVLPDELAKFEKILT----RKKYILDDEITFADYALAELLDVLLILSSTCLENFTAL 172 TbGST24 FVNEVLPDELAKFEKILT----RKKYILDDEITFADYALAELLDVLLILSSTCLENFTAL 172 TsGST24 FINEVLPDELAKFEKILT----GKKYILDDEITFADYALAELLDVLLILSSSCLENFTAL 172 TpsGST24 FVNEVLPVELARFEKLLT----GKQYILNDEITFADYALVELLDVLLVLSSTCLEKFPAL 173 OvGST2 YIKSILPGELAKFEKLLATRGNGRNLILGDKISYADYALFEELDVHQILDPHCLDKFPLL 175 GSTP1-1 YVK-ALPGQLKPFETLLSQNQGGKTFIVGDQISFADYNLLDLLLIHEVLAPGCLDAFPLL 177 ::: ** :* **.:*: : *:.*:*::*** * : * : :* . **: *. * TnGST24 TIYHSRFMNRPNLKNYLSSDIRKKTKINGNENK 205 TbGST24 TIYHSRFMNRPNLKNYLSSDIRKKTKINGNENK 205 TsGST24 TIYHSRFMNRPNLKRYLSSDIRKNAKINGNENK 205 TpsGST24 KTFHAQFMDRPNLKKYLSSDFRKNAKINGNDKQ 206 OvGST2 KTFHQRMKDRPKLKEYCEKRDAAKVPVNGNGKQ 208 GSTP1-1 SAYVGRLSARPKLKAFLASPEYVNLPINGNGKQ 210 . : :: **:** : . : :*** ::

Figure 2: Multiple alignments of deduced AA sequences of TnGST24 (GenBank accession no

ABA42917), TbGST24 (GenBank accession no ABA42916), TpsGST24 (GenBank accession

no ABA42915), TsGST24 (GenBank accession no ABA42914), Onchocerca volvulus

OvGST2 (GenBank accession no CAA58767) et Human GSTP1-1(GenBank accession no

CAA30894). The * marks sequence identities, et : or . marks sequence homologies. Residues

of the G-site are colored in bold.

196

Figure 3: SDS PAGE of purified fractions of recombinant proteins. Lane 1: 4 µg of

rTsGST24-thx 37 kDa, lane 2 Low Molecular Weigh marker (Amersham), lane 3: 3.5 µg of

rTsGST24.

45 kDa

30 kDa

1 2 3

197

Figure 4: A: Detection of TsGST24 by western blot on 50 µg of total antigen extract of

T.spiralis ML with Alexa fluor 455 labelled anti-mouse anti-IgG as secondary antibody. Lane

1 : negative control (OF1 naive mouse serum 1 :100), lane 2 : positive control (OF1 mice

T.spiralis infected mouse serum 1 :100), lane 3 : conjugate control, lane 4 : rTsGST24 anti

serum 1 :100, lane 5 : Ponceau S staining of 0,2 µg of purified rTsGST24, lane 6 : Ponceau S

staining of Invitrogen Bench Mark Ladder. B: Detection of 1µg of rTsGST24 with rTsGST24

anti serum 1:500.

1 2 3 4 5 6

25 kDa

50 kDa

ML Total Antigen rTsGST24

A B

198

Figure 5: Localisation of TsGST24 on cryostat sections of T.spiralis ML by indirect

immunofluorescence. A: localisation of TsGST24 in the stichocytes et the genital primordium

B: Hoechst coloration of nuclei. The region with high density of nuclei is the genital

primordium, C: negative control, D: negative control with Hoechst nuclei coloration

Stichocytes

Genital primordium

A B

C D

0 ,1 mm

Anterior part

Posterior part

0 ,1 mm

0 ,1 mm 0 ,1 mm

199

ARTICLE 8 publié

207

ARTICLE 9 soumis à Journal of Parasitology

RH: BLAGA ET AL.-MITOMULTIPLEX IDENTIFICATION OF TRICHINELLA

Use of the Mitochondrial Small and Large Subunit

Ribosomal RNA genes for the differentiation of four

Trichinella species by multiplex PCR amplification

Radu Blaga*, BaoQuan Fu†, Franck Le Guerhier, Danielle Le Rhun, Evelyne Le Naour,

Audrey Glemarec, MingYuan Liu‡, Vasile Cozma*

et Pascal Boireau

JRU BIPAR INRA AFSSA ENVA UPVM, 94703 MAISONS-ALFORT cedex, France

[email protected]

ABSTRACT: Up to date, four species of the Trichinella genus have been identified in

Europe, Russia, et the east part of China: Trichinella spiralis, Trichinella nativa, Trichinella

britovi et Trichinella pseudospiralis. The aim of this work was to establish a reliable PCR-

based method to differentiate these four species using mitochondrial rDNA as an easy to use

genetic marker. Full length DNA sequences coding for the small et large mitochondrial rRNA

(mt-rrnS et mt-rrnL) of the four species were reported. Sequence comparison leading to a

multiplex PCR using mitochondrial primers was performed. The mitochondrial multiplex

PCR was successfully tested on 24 Eurasian isolates et as low as one larvae or 1 ng of

genomic DNA of the above mentioned species could be detected. The PCR-based method of

mitochondrial rDNA amplification was established as a sensitive et reproductive diagnostic

method for the four Eurasian Trichinella species.

Differentiating the Trichinella species has been a permanent objective since 1972, when four

sibling species were proposed for the Trichinella genus, Trichinella spiralis, Trichinella

nativa, Trichinella nelsoni et Trichinella pseudospiralis, based mainly upon differences in

208

host infectivity, geographic location et distinguishable morphological characters (Garkavi,

1972; Britov et Boev, 1972). Up to date, eight species et three genotypes of Trichinella have

been identified worldwide (Murell et al., 2000; Pozio et Zarlenga, 2005). In Europe, four of

them are present: T. spiralis, with predominant hosts of domestic et sylvatic swine,

synanthropic animals et a broad range of sylvatic carnivores (Pozio, 2001; Dick et Pozio,

2001); T. nativa affecting mostly the sylvatic carnivores living in the frigid zones of Europe

(Pozio et Zarlenga, 2005); T. britovi identified mostly in the sylvatic carnivores of the

temperate areas of Europe; T. pseudospiralis with domestic hosts et sylvatic mammals as well

as birds, et is present in Finland, France, Georgia, Germany, Italy, Lithuania, Netherlands,

Slovakia, Sweden et Russia (Pozio et Zarlenga, 2005; Nockler et al., 2006).

Various biochemical methods were employed for species differentiation, such as the analysis

of the host antibody responses to different species of Trichinella (Rodriguez-Perez et al.,

1989; Kehayov et al., 1991; Boireau et al., 1997), the isoenzyme analysis (Flockhart et al.,

1982; Mydynski et Dick, 1985; Marinculic et al., 1991; La Rosa et al., 1992; Pozio et al.,

1992), the restriction enzyme analysis (RFLP) (Curran et al., 1985; Klassen et al., 1986;

Dame et al., 1987; Minchella et al., 1989) et the use of DNA probes (Chambers et al., 1986;

Klassen et al., 1986; Dame et al., 1987; Zarlenga et al., 1991; Snyder et al., 1993).

Tremendous advances in genotyping Trichinella isolates have been done using PCR

technology to amplify random polymorphic DNA (RAPD) (Bandi et al., 1993; Dupouy-

Camet et al.,1994; Tighe et al., 1994), or specific nuclear DNA sequences such as expansion

segment 5 (ESV) of rRNA (Arriaga et al., 1995; Zarlenga et al., 1996; Gasser et al., 1998;

Appleyard et al., 1999), expansion segment 5 (ESV) et internal transcribed spacer (ITS)

(Zarlenga et al., 1999), expansion segment 5 (ESV) D4 et D5 (Gasser et al., 2005), 5S of

rRNA (Rombout et al., 2001; van der Giessen et al.; 2005; De Bruyne et al., 2005), Ts43

glycoprotein gene (Wu et al., 1998, 1999) et Ts 53kDa E/S antigen gene (Soule et al., 1993).

Few sequences of mitochondrial DNA (mtDNA) have been used to differentiate the

Trichinella species et these include cytochrome oxidase subunit I (cox I) (Nagano et al., 1999)

et large-subunit ribosomal RNA (rrnL) (Borsuk et al., 2003). Mitochondrial DNA is

maternally inherited et evolves independently from et more rapidly than the nuclear genome

(Brown, 1985; eterson et al., 1995, 1998), presenting higher substitution rates than the nuclear

sequences (Blouin, 2002). It therefore provides a useful tool for analysis of genetic variation

within et among parasite populations (Zhang et al., 1998; La Rosa et al., 2001) et for the

systematics, ecology et epidemiology of nematodes (Hu et al., 2004). Moreover, mtDNA has

a major advantage over nuclear DNA in that in comparison to only two copies of nuclear

209

DNA, there are thousands of copies of mtDNA in each cell making mtDNA analysis a more

sensitive assay et thus more successful on highly degraded specimens (e.g. field recovered

larvae). The aim of this work was to establish a simple et reliable PCR-based method to

differentiate the four Trichinella species described in Europe, using two RNA genes of the

mitochondrial genome as molecular markers.

MATERIALS ET METHODS

Parasite strains et DNA Isolation

All Trichinella species et unclassified genotypes used in this study are described in detail

(code, original hosts, country of origin) in Table 1. They were maintained by serial passages

in OF1 female mice under specific quality control. Muscle larvae (ML) were recovered from

muscle tissue of infected mice by a standard pepsin-HCl digestion method (Gamble et al.,

2000). Genomic DNA was obtained from a pool of approximately 300 ML of Trichinella

species using the Genomic DNA from Tissue kit (Macherey–Nagel) according to the

manufacturer’s instructions for mouse or rat tails protocol. DNA concentrations were

determined spectrophotometrically. Crude DNA from single larvae was also prepared

according to the protocol of Pozio et La Rosa (2003) with a slight modification: a single

larvae was washed five times in PBS et then placed in 5 µl of PBS in a 0.5 ml tube; 2 µl of 1

mM Tris-HCl, pH 7.6, was added, overlaid with a drop of mineral oil et heated to 90°C for 10

min et then cooled on ice; 3 µl of proteinase K solution (final concentration of 100 µg/ml)

was added et samples were incubated at 48°C overnight; samples were heated up to 90°C for

15 minutes et cooled on ice. Samples were stored at -20°C prior to PCR test.

Cloning, sequencing et sequence analysis of mitochondrial small et large subunit

ribosomal RNA genes

Primers 1 - 4 (FMSSU1, FMSSU2, RMLSU1, RMLSU2) (Table 2), deduced from the

published sequence of the mitochondrial genome of T.spiralis (Lavrov et Brown, 2001;

accession number: NC_002681), were used to amplify the small et large subunit ribosomal

RNA genes (mt-rrnS et mt-rrnL, respectively) of T. nativa (ISS 042), T. britovi (ISS 100) et

T. pseudospiralis (ISS 13). PCR was performed in a 50 µL reaction volume containing 10

mM Tris-HCl, pH 8.5, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 µM dNTPs, 1.25 units Taq DNA

210

polymerase (Promega, Madison, Wisconsin, USA), 0.5 µM of each primer et 50 ng of

template DNA. All reactions were performed in a Bio-Rad iCycler under the following PCR

conditions: 1 cycle at 94°C for 5 min, 35 cycles of 94°C for 1 min, 55°C for 1 min, 72°C for

1.5 min et 1 extension cycle at 72°C for 10 min. The amplicons were electrophoresed on a

1% agarose gel (Sigma-Aldrich Chemie) et visualised under an ultraviolet transilluminator

after staining with ethidium bromide. Two µl of fresh PCR product was cloned into the

plasmid pCR 2.1 using the TOPO T/A cloning kit (Invitrogen) according to the

manufacturer’s instructions. Three recombinant plasmids for each mitochondrial gene of each

Trichinella species were sequenced by a capillary sequencer (Applied Biosystems 3700) in

both directions. The resulting sequences were aligned et analysed by means of MultAlin

(Corpet, 1988), a multiple sequence alignment program.

Mitochondrial multiplex PCR

The mitochondrial multiplex reaction consisted of the concomitant use of 8 primers (primers

no. 5-12;Table 2). Primers 5 et 6, designed from a conserved DNA region among the four

Trichinella species, were directed to amplify a single, cross-specific DNA fragment of 551 bp

for all Trichinella species serving as an internal control for the integrity of the PCR reaction.

Primers 7-12, however, were designated to amplify a single, species-specific DNA fragment

(649 bp, 426bp, 371 bp et 276bp, respectively) for each of the four Trichinella species (Figure

1A). Genomic DNA (50 ng) from each Trichinella species was amplified in a 50 µl PCR

reaction volume including 10 mM Tris-HCl, pH 8.5, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 µM

dNTPs, 1.25 units Taq DNA polymerase (Promega, Madison, Wisconsin, USA) et 0.5 µM of

each primer. Reactions were run in a Bio-Rad iCycler under the following conditions: 1 cycle

at 94°C for 5 min, 35 cycles of 94°C for 1 min, 55°C for 1 min, 72°C for 1 min et 1 extension

cycle at 72°C for 10 min. Reaction products (7 µl) were separated on a 2% agarose gel

(Sigma-Aldrich Chemie) et detected by ethidium bromide staining. Photographs were taken

with a Bio-Rad Doc Gel XR digital imager.

RESULTS

Mitochondrial rRNA genes of T.nativa, T.britovi and T.pseudospiralis

The PCR amplification, using the pair of primers FMSSU1/RMLSU1 et FMSSU2/RMLSU2,

generated products of expecting sizes (972 bp et 1256 bp, respectively) for T. nativa (ISS

211

042), T. britovi (ISS 100) et T. pseudospiralis (ISS 13) (data not shown). Following cloning et

sequencing, the mitochondrial small subunit (SSU) et large subunit (LSU) nucleotide

sequences of T. spiralis, T. nativa, T. britovi et T. pseudospiralis were aligned et analyzed by

means of MultAlin (Corpet, 1988). The levels of pair-wise nucleotide sequence differences

are shown in table 3. Altogether 326 bp of the total 1709 bp were found to be variable among

the four species. The T.spiralis nucleic sequences present 94%, 93.4% et 85.5% identity with

those of T.britovi, T.nativa et T.pseudospiralis, respectively. When comparing the T.nativa

sequences there is a 96% identity with the similar sequences of T.britovi et 85.1% with

T.pseudospiralis. Additionally, 85% of identity exists between the T.britovi sequences et the

T.pseudospiralis nucleic sequences of mitochondrial rDNA genes.

Mitochondrial Multiplex polymerase chain reaction (MitoMultiplex)

When mitochondrial multiplex PCR was performed on the crude genomic DNA of the four

Trichinella species (T. spiralis, T. nativa, T. britovi et T. pseudospiralis), a unique double

band profile with a cross-specific DNA fragment of 551 bp, et a second species-specific band

of 649 bp, 426 bp, 371 bp et 276 bp, respectively, was obtained (Figure 1B). The specific

profile was reproducible for 24 isolates of the four Trichinella species (Figure 2). When the

mitochondrial multiplex PCR was extended to the other Trichinella species et genotypes

described up to date worldwide, a single PCR fragment of 551bp was obtained for T.

pseudospiralis from Nearctic regions, T. murrelli, T. nelsoni, T8, T9, T. papuae et T.

zimbabwensis (Figure 3), corresponding to the cross-specific DNA fragment amplified by

primers 5 et 6. A double band pattern was obtained for T.pseudospiralis from Australian

regions et T6, similar to the profile of T.pseudospiralis from Palearctic regions et T.nativa,

respectively. Positive amplification for all Trichinella species et genotypes was obtained with

as low as one larva or 1 ng of genomic DNA.

DISCUSSION

Mitochondria are subcellular organelles where oxidative phosphorylation takes place, et

contain a mitochondrial (mt) genome which is distinct but cooperates with the nuclear

genome of the cell. Studying mt genomes has been important for various fundamental areas,

including mt biochemistry, physiology et molecular biology (Hu et al., 2004). To date, more

than 894 mt genomes have been sequenced for a range of metazoan organisms, including 17

species of parasitic nematode (Organelle Genome resources of the National center for

212

Biotechnology Information:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/ORGANELLES/mztax_short.html).

The analyses of the substitution patterns for mt genes (cox1 et nad4) of nematodes have

indicated that they yield useful markers for identifying, differentiating et determining

relationships of closely related species (Hu et Gasser, 2006). Concerning the Trichinella

genus, a recent study used the variation in the mitochondrial rrnL gene along with two other

nuclear genes in order to develop the first robust et comprehensive analysis of the phylogeny

of Trichinella (Zarlenga et al., 2006).

The multiplex PCR developed herein exploits the sequence variability within the

mitochondrial small et large subunit rRNA genes (rrnS, rrnL) in order to differentiate T.

spiralis (649 bp), T. nativa (426 bp), T. britovi (371 bp) et T. pseudospiralis (276bp) species

from other described Trichinella species or genotypes (Pozio et Zarlenga, 2005). To obviate

the need for additional control reactions, a cross-specific primer pair was designed to generate

a PCR product (551 bp) for all Trichinella species to be differentiated et used as an internal

control for the integrity of the reaction. The unique double band profiles of the mitochondrial

multiplex polymerase chain reaction amplification were conserved among the 24 isolates of

the four Trichinella species tested (Figure 2). The isolates analysed were sufficiently diverse

in geographical origin to support the claim that the banding patterns presented here will

persist as reference profiles for each species. The previous PCR-based methods using

mitochondrial genes either need a more laborious technique like PCR-RFLP (Nagano et al.,

1999) or could not differentiate but two species of Trichinella: T.spiralis et T.britovi (Borsuk

et al., 2003). Nevertheless, mixed species infection has been observed in wild boars infected

by T. spiralis et T. britovi (Pozio et al., 1997), T.spiralis et T.pseudospiralis (Nockler et al.,

2006) et in foxes, cats et racoon dogs infected by T. spiralis et T. nativa, T. spiralis et T.

britovi, or T. britovi et T. nativa (Kapel et al., 2001). Rombout et al. (2001) were only able to

resolve a mixture of different species after hybridization, using the 5S rDNA ITS, et the other

PCR-based methods need several PCR runs performed on single larvae taken from the same

sample to identify species mixtures. When mitochondrial multiplex PCR was applied to

samples containing a mixture of T. spiralis, T. nativa, T. britovi or T. pseudospiralis species,

the specific amplified profile could lead to their precise identification (data not shown).

Furthermore, in our study, the identification of a double band pattern among T. pseudospiralis

isolates et the correlation of this pattern to the geographical origin of the isolates (i.e. isolates

from the Palearctic et Australian regions vs. isolate from the Nearctic region) (Figure 3),

213

support the findings of Zarlenga et al. (1996) et La Rosa et al. (2001) who for the first time,

presented evidence of well-differentiated et identifiable populations of T. pseudospiralis.

If by means of the mitochondrial multiplex PCR method, a positive discrimination can be

made between the four species of Trichinella et the other species et genotypes, no

discrimination can be made between T6 et T.nativa as their profiles are the same (Figure 3);

this is also consistent with the adversity in differentiating them by PCR-RFLP (Nagano et al.,

1999). On the contrary, a positive discrimination was possible between T. britovi et T9, which

supports the findings of Nagano et al. (1999), who defined it as a new genotype, namely

Trichinella T9.

In conclusion, mitochondrial multiplex PCR has proven to be an easy to use new technique

for differentiation of the four Trichinella species identified in Europe. One major advantage is

the flexibility for this technique to be used on a pool of larvae to identify mixed species

infection or at the level of single larvae, when studying the genetic structure of different

Trichinella spp. isolates or populations. However, prior to routine application in the field, a

validation of the specific PCR profiles is being carried out by extensive analysis of more

Eurasian isolates et of a variety of field recovered larvae. Moreover the use of the cross-

specific primers, designed from a conserved region of the mitochondrial DNA, may be

extended to other nematodes, representing a molecular marker at the species level.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors are grateful to Dr. Edoardo Pozio (ISS) for providing us the Trichinella species.

This work was supported by grants of the EU TRICHIPORSE contracts (QLRT-2000-01156,

QLK1-CT-2002-02826), MetVetNet (Trichinet/Trichimed et Med Vet Net), NEMAGECO-

ICONES (2006) et BIOSCOPE

DNA sequences were deposited into GenBank under accession numbers DQ159091,

DQ159092, DQ159093

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220

FIGURE 1. (A) Schematic representation of the expected amplified PCR products for the

four Trichinella species (in red species-specific primers, in blue cross-specific primers)

(B) Electrophoresis of the mitochondrial multiplex PCR products Line 1: 100 bp Ladder

(Invitrogen) line 2 T.spiralis (ISS 004), line 3 T.britovi (ISS 100), line 4 T.nativa (ISS

042), line 5 T.pseudospiralis (ISS 13)

221

FIGURE 2. Electrophoresis of the mitochondrial multiplex PCR products of the 24

Trichinella isolates Line 1 et 26 100 bp Ladder (Invitrogen), line 2-8 T.spiralis isolates (ISS

004, 51, 104, 534, 596, 889, 1100), line 9-12 T.nativa isolates (ISS 10, 42, 70, 42), line 13 -24

T.britovi (ISS 100, 137, 235, 1497, 1572, 1573, 1574, 1575, 1576, 1577, 1578, under

submission), line 25 T.pseudospiralis (ISS 13) Palearctic population.

222

FIGURE 3 Electrophoresis of the mitochondrial multiplex PCR products of the Trichinella

species, genotypes et populations Line 1 et 15 100 bp Ladder (Invitrogen), line 2 T.spiralis

(ISS 004), line 3 T.britovi (ISS 100), line 4 T.nativa (ISS 042), line 5 T.pseudospiralis (ISS

13) Palearctic population, line 6 T.pseudospiralis (ISS 141) Australian isolate, line 7

T.pseudospiralis (ISS 470) Nearctic isolate, line 8 Trichinella murrelli (ISS 35), line 9

Trichinella T6 (ISS 34), line 10 Trichinella nelsoni (ISS 37), line 11 Trichinella T8 (ISS 124),

line 12 Trichinella T9 (ISS 408), line 13, Trichinella papuae (ISS 572), line 14 Trichinella

zimbabwensis (ISS 1029)

223

TABLE 1. Species, origin et localization of the Trichinella genotypes tested by mitochondrial multiplex PCR. The Trichinella pseudospiralis isolates used in this study are from the Palearctic region (ISS 13), the Australian region (ISS 141) et the Nearctic region (ISS 470).

224

TABLE 2 Species-specific et cross-specific primers used for the amplification of the

mitochondrial SSU et LSU rDNA of T.nativa (ISS042), T.britovi (ISS100) et

T.pseudospiralis (ISS 13) (1-4) et for the mitochondrial multiplex PCR (5-12)

225

TABLE 3 Levels of identity (in red) et pair wise sequence differences (in black) among

mitochondrial small et large subunit rDNA genes of the four Trichinella genotypes

* University of Agricultural Sciences et Veterinary Medicine, 400372 Cluj-Napoca, Romania † Key Laboratory of Veterinary Parasitology of Gansu Province, State Key Laboratory

of Veterinary Etiological Biology, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese

Academy of Agricultural Sciences, 730046, Lanzhou, P. R. China

‡ Key Laboratory of Zoonoses, Ministry of Education, Institute of Zoonoses, Jilin

University, 5333 Xian Road, 130062 Changchun, P. R. China

226

3. Etude différentielle du transcriptome de

deux espèces de Trichinella

3.1. L’analyse de banques d’ADNc soustractive pour

deux espèces du genre Trichinella

Les gènes conservés pouvaient coder des antigènes d’intérêt mais dans les deux exemples que

nous avons présentés (la protéase à sérine et la GST24) aucun site antigénique majeur n’a pu

être identifié pour établir un ELISA indirect différenciant différentes espèces du genre

Trichinella. La seconde stratégie pour obtenir des cibles différentielles était d’obtenir des

banques soustractives pour deux espèces éloignées sur le plan de la conservation des

nucléotides pour le genre Trichinella. Les séquences que nous avons comparées montrent que

T spiralis et T pseudospiralis divergent le plus (83-85% d’identité). Par ailleurs ces deux

espèces ont une biologie très contrastée : gradient de températures large et espèces hôtes très

diverses pour T pseudospiralis, maturation de la cellule nourricière différente entre les deux

espèces. Ces différents points permettaient de renforcer l’intérêt d’obtenir des gènes

spécifiquement exprimés pour chacune des espèces étudiées.

Une banque d’ADNc soustractive a été réalisée à partir de 100.000 larves musculaires de

Trichinella pseudospiralis et Trichinella spiralis obtenues 35 jours post-infestation. Les

ARNm purifiés par OligodT cellulose ont ensuite servi de matrice pour établir la banque

d’ADNc soustractive T.pseudospiralis versus T.spiralis et respectivement T.spiralis versus

T.pseudospiralis. La pureté des banques soustractives a été vérifiée en hybridant 96 colonies

choisies au hasard de ces deux banques avec une sonde soustraite et non soustraite issues des

deux espèces de Trichinella. Le résultat de l’hybridation radioactive (Figure 25) nous a

conduit à séquencer les clones A1,5,7,11 ; B3,11,12 ; H4,24 ; I2,5,7 ; J1 ; K12 ; M5 ;

N3,8,15 ; O2 et P5 qui apparaissaient spécifiques de T. pseudospiralis, ainsi que les clones

D2 ; F3,9 ; G7 ; I15 ;

227

N19 et O1 spécifiques de T. spiralis. Les clones L14,21 donnaient un signal positif à la fois

pour T. spiralis et T. pseudospiralis alors que le clone J9 était négatif pour les deux espèces.

L’analyse des séquences a été réalisée par BLAST sur les banques de données.

A

B

Figure 25 Criblage différentiel des colonies (I-P) issues de la banque soustractive de T.pseudospiralis (versus T.spiralis) avec des sondes soustraites spécifiques pour T.

pseudospiralis (A) et T.spiralis (B)

228

Concernant les clones spécifiques de T. pseudospiralis (longueur des inserts : entre 658pb et

807pb), une identité à hauteur de 86% - 90% avec la séquence de la sous-unité 16S de l’ARNr

mitochondrial de Trichinella spiralis a été obtenue. Les séquences nucléotidiques entières

sont identiques (81,5 - 83,1%).

Concernant les clones spécifiques de T. spiralis (longueur des inserts :entre 168pb et 775pb),

des séquences identiques à hauteur de 99% -100% avec la séquence de la sous-unité 16S de

l’ARNr mitochondrial de Trichinella spiralis ont été déterminées.

A partir de 30 clones séquencés, 28 d’entre eux contiennent des fragments de la séquence de

la sous-unité 16S d’ARNr mitochondrial de Trichinella spiralis. Une clone contient la

sequence du internal transcriber spacer 2 de T.pseudospiralis et une clone contient des

sequences du plasmide de clonage.

Ces résultats ont montré la difficulté pour le genre Trichinella de purifier des ARNm

expliquant le fort degré de contamination par l’ARNr mitochondrial. Aucun gène spécifique

d’espèce n’a pu être isolé par cette approche.

3.2. Analyse partielle d’une banque d’ESTs de

T.pseudospiralis, comparaison avec la banque d’EST

publiée de T.spiralis

Les ESTs (Expressed Sequence Tags, ou Etiquettes de Séquences Transcrites)

représentent des courtes séquences résultant du séquençage partiel des clones issus de

banques d’ADNc. Pour chaque clone, quelques centaines de nucléotides (200 à 700) sont

séquencés une seule fois ("single pass") à chaque extrémité de l'ADNc inséré. L'information

peut donc n'être que partielle par rapport à la taille de certains ADNc (qui peut atteindre

plusieurs milliers de nucléotides), mais elle est suffisante pour caractériser de manière

univoque chaque clone. Les ESTs du fait de leur nature constituent une catégorie de

séquences nucléotidiques « à part », et une ressource essentielle pour les biologistes, utilisées

pour le « clonage in silico » et constituant actuellement l'outil principal de détermination des

exons dans les séquences génomiques d'eucaryotes supérieurs. Les avantages des EST sont

représentés par l’énorme quantité et diversité des données des banques d'EST ; l’évaluation du

taux d'expression des gènes et la reconstitution via les contigs des séquences complètes

d'ADNc. Ces séquences permettent de dresser un inventaire des gènes transcrits (par exemple

dans un organe ou à un stade de développement donné). Les inconvénients des EST sont le

229

taux d'erreur élevé (environ 3%) ; les séquences "contaminées" par des séquences d'introns, de

régions intergéniques, de vecteurs d'expression ou d'adaptateurs et l’annotation incomplète

des EST. La séquence des EST ne correspondant qu'aux extrémités 3' ou 5' des ADNc, des

séquences distinctes d'EST issues d'un même gène peuvent être interprétées dans un premier

temps comme issues de gènes différents. Une comparaison des EST et des séquences d'ADN

génomique permet de lever cette ambiguïté et d'associer différents EST à un gène unique. Il

est aussi nécessaire de séquencer un grand nombre d’EST pour pallier à ce morcellement de la

connaissance des séquences produites. Dans le cadre de ce projet l’objectif est d’obtenir 100

000 EST pour 4 stades parasitaires différents.

La comparaison des séquences EST entre elles, permet d'aligner les parties qui se recouvrent

partiellement ou qui se chevauchent. Les séquences chevauchantes peuvent être assemblées

en enchaînements plus grands que l'on appelle des contigs (à partir du mot contiguous). Le

terme contig a été défini par Staden en 1979 ; il représente une séquence génomique continue

et ordonnée générée par l'assemblage des clones d'une librairie génomique (sous forme de

plasmides, cosmides, BACs ou YACs) qui se chevauchent. Cette opération d'assemblage est

effectuée par des programmes informatiques tels que: Phrap ; CAP3 ("Contig Assembly

Program") ou TIGR Assembler. Dans le cas présent les contigs reflètent la réitération d’une

séquence et la taille du contig est liée en partie au nombre d’ARNm produit par un même

gène.

Les séquences d'EST représentent aujourd'hui le quart des nucléotides collectés dans les

banques généralistes et plus de la moitié des entrées (ce sont des séquences courtes ce qui

explique cette différence de proportion entre quantité de nucléotides et entrées). Le NCBI et

l'EBI produisent chacun une banque ne contenant que des EST, et il existe plusieurs banques

spécialisées dans le traitement et l'analyse des EST, offrant différents niveaux d'analyse et

d'interprétation de cette information (allant d'une simple classification des séquences jusqu'à

un assemblage des séquences similaires permettant de reconstituer les séquences exoniques, et

même de mettre en évidence des structures d'épissage alternatif) : UniGene, développée au

NCBI (National Center for Biotechnology Information), TGI, développée au TIGR (The

Institute for Genomics Research), STACK, développée au SANBI (South-African National

Bioinformatics Institute), et EGI, la plus récente, développée à l'EBI (European

Bioinformatics Institute).

Récemment différentes banques d’EST correspondant à différents stades de l’espèce T

spiralis ont été publiés. Plus de 3500 contigs ont été décrits pour T spiralis. Il apparaissait

plus efficace compte tenu des résultats obtenus par l’approche banque soustractive de réaliser

230

le séquençage des différents stades parasitaires de l’espèce T pseudospiralis pour obtenir la

réponse aux questions posées concernant l’existence de gènes et antigènes spécifiques à

chacune des espèces de Trichinella. Deux banques d’ADNc ont été préparées et utilisées. La

première correspondait au stade L1M et la seconde au stade L1 nouveau-née. Le séquençage

de 400 clones du stade L1M a été réalisé pour valider la première banque d’ADNc du stade

L1M. La longueur moyenne des fragments a été de 850 pb avec un contenu en GC de 39%.

En revanche 5% des clones présentaient des séquences trop courtes pour être exploitées. Suite

à l’analyse effectuée sur GenBank les séquences restantes ont été groupées en 230 contigs qui

comprenaient entre 1 EST et jusque 80 ESTs dans un cas extrême. En dehors du contig

comprenant les 80 ESTs, apparentés à la sous-unité 16S d’ARNr mitochondrial de T.spiralis,

les contigs restants comprenaient un EST dans 94% des cas (215 contigs), 2 ESTs dans 4,3%

des cas (10 contigs), 4 ESTs dans 0,5% des cas (1 contigs), 5 ESTs dans 0,5% des cas (1

contigs) et 7 EST dans 1% des cas (2 contigs). Parmi les 15 contigs les plus abondants en

transcrits (tableau 10), il n’y a que 3 contigs qui présentent une similitude avec des séquences

préalablement décrits chez Trichinella : il s’agit de l’ARNr mitochondrial de T.spiralis rRNA

(contig TPML001.cl), l’ORF 11.30 de T.spiralis (contig TPML004.cl) et du gène de 21 kDa

de T.pseudospiralis dont le produit d’expression se retrouve dans l’antigène

d’excrétion/sécrétion (contig TPML006.cl). Les deux contigs qui contiennent les plus grand

nombre de transcrits (7 ESTs), présentent un gène codant pour une protéine de choc

thermique (HSP) (TPML002.cl) ainsi qu’une nouvelle protéine, a fonction inconnue

(TPML003.cl), qui a une identité de 90% avec la séquence nucléique homologue de

T.spiralis. Parmi les 15 contigs les plus abondantes, issus de la banque d’ADNc de larve

musculaires de T.pseudospiralis, 6 contigs ne présentent pas des séquences homologue dans

la banque d’EST de T.spiralis. Parmi ces 6 contigs, 3 d’entre eux correspondent à des

nouvelles protéines ayant une fonction inconnue (TPML010.cl, TPML012.cl, TPML015.cl) et

trois présentent une similitude avec des protéines déjà existantes dans GenBank

(TPML007.cl, TPML008.cl, TPML014.cl). L’analyse des 9 contigs comprenant des

séquences avec des homologues dans la banque d’ADNc de T.spiralis, révèle qu’une identité

moyenne de 85% est obtenue entre les séquences homologues confirmant la division en deux

groupes du genre Trichinella ainsi que les résultats parcellaires obtenus pour les gènes codant

pour des protéines à fonction conservée (ex GST24).

Une comparaison BLASTX a été réalisée avec l’ensemble des contigs contre 3 bases des

données : protéines appartenant à C.elegans, protéines appartenant à d’autres nématodes et

protéines appartenant à d’autre organisme. Pour les 230 contigs, une majorité (154 contigs

231

(68%)) présentaient une homologie avec des protéines d’autres organismes, parmi lesquelles

56 contigs (24%), présentaient une homologie avec des protéines d’arthropodes. Tout aussi

nombreux, 57 contigs (25%), présentaient une homologie avec des protéines de C.elegans.

Pour ce qui est la fonction putative d’EST de T.pseudospiralis, par hybridation avec un motif

structural ou enzymatique, la classification de « gene ontology » a révélé qu’une grande

majorité des contigs, 135 (54%), présentent des protéines avec une fonction inconnue. Parmi

les protéines identifiées les plus abondantes sont les enzymes métaboliques (32 contigs, 15%),

les protéines structurales et ARN ribosomaux (14 contigs, 6% ; 13 contigs, 5%).

Dans l’ensemble des 230 contigs, seulement 11 ont eu une homologie avec des protéines de

T.spiralis ou T.pseudospiralis préalablement décrites. 48 contigs (21%) représentent des

nouvelles séquences par rapport à T.spiralis et ne présentent pas d’homologues dans la

banque d’ESTs de T.spiralis. 21 contigs (9%) ne présentant pas d’homologues ni dans

GenBank ni dans la banque d’ESTs de T.spiralis.

Le séquençage de la banque EST du stade L1NN a été réalisé pour 10.000 clones et a permis

de sélectionner 3000 contigs dont la répartition est décrite dans la Figure 26

232

Numéro du contig

Nombre d’ESTs

par contig

BLASTX sur GenBank

Numéro d’accès sur GenBank

Numéro d’accès sur la banque

d’ESTs de

T.spiralis TPML001.cl 80 T.spiralis mitochondrial rRNA AF293969 BG354889

TPML002.cl 7 Artemia franciscana small heat shock/alpha-crystallin protein precursor AAB87967.1 BG520339

TPML003.cl 7 Sequence nouvelle - BG354906

TPML004.cl 5 T.spiralis hypothetical ORF 11.30 precursor AAB48488.1 BG354772

TPML005.cl 4 Caenorhabditis elegans Hmg protein 1.2, isoform c AAK67238 BG732185

TPML006.cl 2 T.pseudospiralis 21 kDa excretory/secretory protein AAF79206.1 BG354784

TPML007.cl 2 Xenopus tropicalis MGC69184 protein AAH74606 -

TPML008.cl 2 Anopheles gambiae ENSANGP00000014275 XP_318433 -

TPML009.cl 2 Caenorhabditis elegans putative protein of bilaterial origin NP_501358 BG354911

TPML010.cl 2 Sequence nouvelle - -

TPML011.cl 2 Apis mellifera similar to ENSANGP00000016723 XP_394872 BQ692709


TPML013.cl 2 Caenorhabditis elegans Ribosomal Protein (rpl-12) NP_502542 BQ541496

TPML014.cl 2 Drosophila pseudoobscura GA12132-PA EAL25834 -


Tableau 10 : Les contigs les plus abondantes en transcrits de la banque d’ADN complémentaire de larves musculaire de T.pseudospiralis

233

.

En résumé : L’analyse du transcriptome différentiel T spiralis /T pseudospiralis a été rendu

possible par le séquençage de différente banques d’ADNc de T pseudospiralis. En effet

l’analyse par banque SSH s’est trouvée limitée compte tenu de l’impossibilité d’éliminer

complètement les ARN ribosomiques mitochondriaux. En revanche l’analyse des premiers

résultats de séquençage montre l’existence de gènes nouveaux pour l’espèce T pseudospiralis

qui seront utiles pour le développement de test spécifique d’espèce et pour l’analyse de la

diversité genique intra genre.

Figure 26 : Les contigs issus de la banque d’ADNc des larves nouveau-nées de T.pseudospiralis, classifié

en fonction de leur activité et fonction

235

4. Discussion

237

1. Epidémiologie de la trichinellose dans un

pays de l’Europe : la Roumanie

La Roumanie est située dans le Sud-est de l’Europe Centrale, partie intégrante de

l’Europe de l’Est et de la presqu’île Balkanique. Les Carpates, dont les alpes de Transylvanie

font partie, traversent la Roumanie sous forme d’un arc du Nord au Sud-ouest, établissant une

barrière naturelle entre la Transylvanie et le reste de la Roumanie. Ce qu’on appelle

aujourd’hui la Roumanie a été longtemps divisé entre l’empire Austro-hongrois, incluant la

Transylvanie, et l’empire Ottoman incluant la Valachie et la Moldavie (Figure 1, article 1). Ces

deux dernières régions ont pris le nom de la Roumanie en 1859, état indépendant qui a inclus la

Transylvanie à partir du 1918.

L’existence de la barrière presque imprenable des Carpates, représentant la frontière

entre deux empires, a permis une évolution historique et sociale différente des populations des

deux côtés de la montagne. La Roumanie a été imprégnée avec des populations d’origine

allemandes (Sachs et Svabs) à partir du 12éme siècle, et aujourd’hui la population de la

Transylvanie représente un mélange de Roumains (59%), Hongrois (25%) et Allemands (9,5%)

(http://en.wikipedia.org/wiki/Transylvania). En dépit d’une très longue période de cohabitation,

les trois populations ont préservé leur identité culturelle et nationale, principalement due à la

ségrégation sociale existant avec les Allemandes et les Hongrois comme populations

dominantes. La Valachie et la Moldavie, en dépit d’une vassalité envers l’empire Ottoman

depuis le XVIe siècle et jusqu’en 1877, n’ont jamais été colonisées, la population roumaine

étant beaucoup plus homogène.

Ces prémisses historiques ont joué un rôle important dans l’apparition des premiers cas

de trichinellose humaine compte tenu des habitus culinaires contrastés et par la suite pour la

détection des premières cas d’infection à Trichinella chez les animaux.

1.1. La trichinellose humaine en Roumanie

Le mélange de trois populations d’origines diverses, a généré l’existence de plusieurs

habitudes alimentaires en Roumanie, spécialement en ce qui concerne la consommation de la

viande : les populations de souche allemande sont réputées pour leur préférence à manger de la

238

viande de porc peu cuite (Gould, 1945), les Hongrois mangent la viande bien cuite (Ballagi,

1913), alors que les Roumains mangent principalement légumes et autres produits non-carnés,

la consommation de la viande étant réduite (inferieure à 2kg/année/habitant de la compagnie)

(Felix,1869; Stoica, 1891; Cazacu,1999). De ce fait, une différence significative a toujours été

présente entre la Transylvanie et le reste de la Roumanie en ce qui concerne le nombre des cas

de trichinellose. Ainsi la première étude épidémiologique couvrant chaque département de la

Roumanie réalisée pour les années 1963-1968 (Lupascu et al., 1970), montre que 60% (n=43)

des épidémies sont enregistrées en Transylvanie, avec une décroissance progressive et linéaire

de l’incidence de la trichinellose dans les départements de la Transylvanie vers les

départements du Sud-est (tableau 6). Les données historiques montrent aussi une forte

influence socio-culturelle, liée à des habitudes particulières d’alimentation, dans la découverte

de la trichinellose en Roumanie car, les quatre premières épidémies de trichinellose

répertoriées jusqu’au 1945, ont été signalées dans des familles à dominante germanique ou

situées dans des régions à forte présence allemande (Sibiu, Medias en Transylvanie).

Une analyse de la situation plus récente de la trichinellose en Roumanie a été réalisée

dans notre étude au cours des 25 dernières années (1980-2004), avec une comparaison entre la

Transylvanie et le reste de la Roumanie. Deux périodes distinctes ont été analysées: 1980-1989

et 1990-2004, avant et après la chute du régime communiste en Roumanie. 28,293 cas de

trichinellose humaine ont été rapportés pour cette période, ce qui correspond à une incidence

moyenne de 51 cas par million par an. Les cas positifs de trichinellose, rapportés à l’Institut

National de Statistique Médicale, ont été diagnostiqués suites aux signes cliniques (fièvre,

œdème faciale ou periorbital et myalgie), une anamnèse (consommation des viandes non-

contrôlés, modalités de cuisson) et des tests biologique (éosinophilie, leucocytose, niveau

élevée des enzymes musculaire dans le sérum). Les tests confirmatoires sérologiques ou

histologiques n’ont pas été réalisés d’une manière courante à cause de leur coût prohibitif. De

ce fait, une surestimation du nombre des cas de trichinellose est possible, mais il reste tout de

même sensiblement élevé, spécialement en comparaison avec d’autres pays (Cuperlovic et al.,

2005). Si une telle surestimation existait, à défaut de preuve contraire on peut supposer qu’elle

est sensiblement égale dans le temps et l’espace, ce qui signifie que les différences observées

restent valides.

Une nette augmentation de l’incidence moyenne de la trichinellose pour la période

1990-2004 (71.8 cas par million par an) vs 1980-1989 (19.6 cas par million par an) est

démontrée. De même une plus forte prévalence en Transylvanie (82.2 cas par million par an) vs

le reste de la Roumanie (35.7 cas par million par an) est observée. Pour expliquer ces variations

239

significatives aussi bien temporelles que géographiques mises en évidence pendant la période

d’étude (tableau 7), quatre explications sont possibles : (i) tout d’abord il existe une forte

variation dans la circulation du parasite au sein des animaux domestiques et sauvages ; en

Roumanie cette population animale est représentée par le cheptel porcin, car 95% des cas de

trichinellose humaines proviennent de la consommation de viande de porc (Cironeanu, 2002) ;

(ii) des variations dans l’efficacité contrôle sanitaire-vétérinaire des produits d’origine animale

existent : seul le test trichinoscopique est largement utilisé; (iii) une variation dans le niveau de

la consommation de la viande ainsi que dans les habitudes alimentaires existent et enfin (iv) la

proportion des cas positifs qui sont déclarées peut varier.

Chacun de ces quatre points peut expliquer partiellement la croissance significative de

l’incidence de la trichinellose humaine entre les périodes 1980-1989 et 1990-2004. La

circulation de Trichinella dans le cheptel porcin apparaît avoir augmenté de façon considérable

à la fin du régime communiste (Cironeanu, 2002), ce qui a généré une dispersion de

l’infestation dans le pays, avec la fermeture des grands complexes d’exploitations après le

changement du régime (Olteanu, 1997). L’augmentation du niveau de contamination des

produits d’origine porcine est une résultante expliquant les cas humains. Le changement

politique et économique en début des années 1990 a entrainé un bouleversement dans l’activité

sanitaire-vétérinaire, ce qui a généré une baisse de l’efficacité des ces contrôles. La

consommation de viande a augmenté considérable, en début des années 1990, car la « carte

mensuelle » restreignant cette consommation avait disparu avec les nouveaux changements.

Une situation similaire a été déjà signalée en Chine avec une corrélation entre l’augmentation

de la consommation de viande et le nombre des cas de trichinellose (Liu and Boireau, 2002).

Une sous-déclaration du nombre des cas de trichinellose existait probablement avant 1990, car

l’existence de ces cas représentait une « honte » pour les autorités médicales locales qui

préféraient l’ignorer ou rapporter des chiffres plus modestes (Cironeanu et Ispas, 2002 ;

Cristea, 1998). En dépit de ce dernier point la croissance de l’incidence de la trichinellose de

1980-1989 à 1990-2004 reste significative.

En analysant les causes possibles des variations géographiques notables entre la

Transylvanie et le reste des départements de la Roumanie au regard de l’incidence de la

trichinellose, trois des quatre causes ci-dessus mentionnées peuvent être exclues. Les données

épidémiologiques pour 1997-2004 concernant l’infection à Trichinella chez les porcs familiaux

et hors-sol montrent une prévalence de l’infection de 2 à 8 fois inferieure en Transylvanie par

rapport au reste de la Roumanie (article 3). Le réseau national médical et sanitaire-vétérinaire

dispose des mêmes structures dans tous les départements, employant des cadres médicaux et

240

vétérinaires ayant un niveau de connaissance comparable de la trichinellose ou de l’infection à

Trichinella. L’explication d’une différence significative pour cette variation géographique de

l’incidence de la trichinellose réside dans les traditions culinaires des populations d’origine

allemandes présentes en Transylvanie, comme cela a déjà été démontré pour les périodes

antérieures (1868-1945 ; 1963-1968). L’implantation de ces populations d’origine germanique

en Transylvanie correspond aux régions avec une forte incidence pour la trichinellose. Ces

régions obtenues suite à l’analyse de regroupements statistiques pour la période 1980-1989 et

1990-2004 sont : Caras-Severin et Hunedoara dans l’ouest de la Roumanie, et Brasov et

Covasna dans le centre de la Roumanie. Cette différence significative entre la Transylvanie et

le reste de la Roumanie, reste valable tout au long de ces deux périodes, représentant une

preuve solide de l’importance majeure jouée par les habitudes alimentaires dans la variation

géographique. Ces mêmes habitudes alimentaires ont contribué à la découverte de la

trichinellose en Roumanie et plus récemment à sa forte émergence bénéficiant des changements

politiques et économiques au début des années 1990.

1.2. L’infection à Trichinella chez les animaux

domestique et la faune sauvage en Roumanie

Le premier cas de trichinellose animale a été identifié chez un porc le 27 Décembre

1868, dans le Sud-est de la Roumanie. Ce n’est qu’en 1913 avec l’ouverture de l’abattoir de

Bucarest qu’un examen trichinoscopique se met en place après plusieurs tentatives échouées de

réaliser une détection systématique de l’infection à Trichinella chez le porc dans différentes

régions de la Roumanie. Ces essais avaient été réalisés pour de courtes périodes de temps

(1865-1866, 1868-1869, 1874 -1875).

Plusieurs études ont été menées pour avoir une image plus fidèle de la situation

épidémiologique actuelle de l’infection à Trichinella chez les animaux en Roumanie. Dans un

premier temps ont été collectées les données épidémiologiques de l’Institut de Diagnostique et

Sante Animale (IDSA), qui a pour mission de centraliser ces données pour l’espèce porcine, le

sanglier et l’ours ; une enquête terrain a ensuite été menée en même temps pour l’espèce

chevaline et pour sept autre espèces d’animaux sauvages

241

1.2.1. L’infection à Trichinella chez le porc, le sanglier et

l’ours en Roumanie

L’analyse des données épidémiologiques de l’IDSA couvre la période 1997-2004.

L’existence de deux systèmes d’élevage porcin en Roumanie est mise en évidence. L’élevage

de porcs familiaux ou plein air (1-2 porcs/foyer) demeure une composante importante du

paysage agricole roumain. Ces porcs sont élevés pour la consommation locale et sont sacrifiés

à l’intérieur même de la « ferme » par des procédées traditionnels (dans peu de cas, les porcs

familiaux sont sacrifiés dans un abattoir proche). A l’opposé existe le porc hors-sol, originaire

des grandes fermes de type « industriel » qui sont sacrifiés uniquement dans un abattoir. Tous

les porcs familiaux ou hors-sol sacrifiés dans un abattoir sont systématiquement contrôlés par

trichinoscopie. Les résultats de ces tests sont collectés de façon exhaustive. Au contraire, les

porcs familiaux ou le gibier sont analysés à la demande par trichinoscopie. Un manque

d’information pour ces petits propriétaires est à l’origine d’une non prise en compte du risque

sanitaire et de la quasi absence de contrôle pour ces porcs fermiers. Il est à souligner également

que le test trichinoscopique est très généralisé en Roumanie mais qu’il demeure 2-3 fois moins

sensible que le test de digestion artificielle (Beck et al., 2005; Forbes et al., 2003). La méthode

de digestion artificielle est la méthode officielle de diagnostique de la trichinellose animale au

sein de l’Union Européenne (Gamble et al., 2000; Webster et al., 2006). Elle devra être

généralisée en Roumanie prochainement.

Les données épidémiologiques représentent des analyses trichinelloscopiques pour un

département et une certaine période/année. Pour ces raisons les analyses par regroupement

géographique présentent une importance dans la mesure où les animaux analysés sont élevés ou

chassés (pour le gibier) dans le même département. Cette hypothèse est à priori valable pour

les porcs familiaux ou le gibier. Pour les porcs hors-sol, cette hypothèse pourrait être atténué du

fait des circuits commerciaux étendus pouvant dépasser la surface d’un département. En

Roumanie, ces circuits sont cependant quasiment inexistants, chaque grand complexe

d’engraissement détenant son propre abattoir. Le biais géographique a donc été considéré

comme négligeable.

La prévalence de l’infection à Trichinella chez le gibier est de l’ordre de 10% pour

l’ours et de 10‰ pour le sanglier. La circulation du parasite est donc très importante dans la

faune sauvage. La différence marquante entre les deux espèces trouve une explication dans les

habitudes alimentaires différentes de deux espèces (le sanglier est un omnivore avec une

dominante végétarienne tandis que l’ours est un omnivore avce une préférance pour le régime

242

carné) ainsi que par leur espérance de vie (l’espérance de vie d’un sanglier est de 13 ans tandis

que celle d’un ours est de 30 ans). La prévalence de l’infection à Trichinella chez le porc (les

deux populations confondues) est de l’ordre de 8 cas pour 10,000 animaux testés. Comme pour

la trichinellose humaine, une différence géographique peut être observée entre la Transylvanie

et le reste de la Roumanie, avec une prévalence nettement inférieure en Transylvanie. Cette

situation est valable pour les deux types de populations de porcs (les résultats sont plus

accentués pour les porcs hors-sol) avec un ratio de la prévalence de l’infection à Trichinella,

Transylvanie vs le reste de la Roumanie, de 0.56 pour les porcs familiaux et de 0.13 pour les

porcs hors-sol.

Cette différence géographique peut s’expliquer par un examen trichinoscopique moins

efficace en Transylvanie, mais comme déjà mentionné ci-dessus, aucun argument ne soutient

cette hypothèse. L’explication de cette situation paradoxale doit être cherchée dans le

bouleversement de l’industrie du porc initié par le changement politique de 1989-1990, avec un

passage rapide des grandes fermes qui appartenait à l’état à un système entièrement privé avec

des fermes familiales. Pendant la période 1965-1979, l’epidemiosurveillance réalisée dans 115

grandes fermes d’état (3-8 millions de carcasses contrôlées par an) n’a révélé aucun cas

d’infection à Trichinella, ces fermes étant déclarées indemnes de Trichinella (Cironeanu,

1981). La majorité de ces fermes étaient situées dans le sud de la Roumanie, très peu en

Transylvanie, principalement pour des raisons climatiques et l’abondance locale de la

nourriture spécifique. A partir du 1982, plusieurs facteurs ont contribué à l’augmentation

exponentielle du nombre de cas de trichinellose porcine : l’utilisation dans la nourriture de

restes d’abattoir non-stérilisés, des fréquents phénomènes de cannibalisme générés par la

manque de nourriture et, enfin la dégradation des conditions d’hygiène avec l’apparition des

rats (Cironeanu et Ispas, 2002). Ainsi vers la fin des années 1980, 95% des porcs ayant une

infection à Trichinella provenait d’une grande ferme d’état (Olteanu, 2001). Par la suite, en

début des années 1990, avec les changements politiques et le passage de la propriété collective

à la propriété individuelle, les grandes fermes d’état ont commencé à vendre leur cheptel, en

dispersant ainsi l’infection à Trichinella dans les régions avoisinantes. L’étude réalisée en

1992, montre que 40% des cas de trichinellose porcine provenaient d’exploitations (Olteanu,

1996 ; Cironeanu et Ispas, 2002). Or la majorité des grandes fermes d’état étaient situées dans

le sud de la Roumanie ; on peut supposer que l’infection à Trichinella chez le porc a été

principalement diffusée dans cette région là, ce qui peut expliquer les différences

géographiques entre la Transylvanie et le reste de la Roumanie en ce qui concerne la

prévalence de l’infection pour les porcs familiaux et les porcs hors-sol.

243

Au début du XXe siècle, le seul abattoir autorisé à sacrifier les porcs était celui de

Bucarest, où arrivaient des porcs de l’ensemble de la Roumanie. L’incidence de la trichinellose

animale dans le seul abattoir de Bucarest peut ainsi nous donner une idée de l’étendue de la

trichinellose animale dans l’ensemble du pays : pour la période 1913-1952, parmi les 4 312 184

porcs sacrifiés, 3 443 ont été trouvés positifs, ce qui représente une prevalence de 0,077%

(Cironeanu, 1970). Pour la période suivante, 1956-1967 quand d’autres abattoirs en Roumanie

ont été autorisés à sacrifier des porcs, l’prevalene nationale de la trichinellose est descendue à

0,048% (Cironeanu, 1970) ; entre 1967 et 1982, peu de données sont disponibles ou fiables,

certains auteurs (Cironeanu, 2002) parlent d’une incidence de 0,05% sur l’ensemble du

territoire roumain.

La comparaison de ces données avec celles obtenues pour une période plus récente

(1997-2004) nous révèlent que d’une manière générale la présence du parasite dans le cheptel

porcin au niveau national est restée en dessous de 0,1%, avec peu de variations notables.

1.2.2. L’infection à Trichinella chez le cheval en Roumanie

95% des cas de trichinellose humaine en Roumanie sont provoqués par de la viande de

porc (Cironeanu et Ispas, 2002). Jusqu’a présent aucun cas de trichinellose humaine n’a été

rapporté ayant comme origine de la viande de cheval, mais trois grandes épidémies de

trichinellose qui ont eu lieu en France et en Italie ont impliqué des chevaux originaires d’un

pays de l’Europe de l’Est non-identifié. La Roumanie demeure un pays potentiel fournisseur de

chevaux présentant une infection à Trichinella compte tenu de la prévalence très élevée dans la

faune sauvage, de Trichinella. Une enquête sérologique a été menée sur le terrain entre 2001-

2002 pour aboutir à la collecte de 5992 sérums de chevaux. Ces sérums ont été analysés par

ELISA et Western Blot. L’analyse dans un premier temps (2001) des 3000 sérums par l’ISS à

Rome (Laboratoire Communautaire de référence Parasites) par de l’ELISA en employant trois

antigènes différents (un extrait total d’antigène, un antigène d’excrétion/sécrétion : E/S et le

béta tyvelose) s’est révélée négative. Dans une seconde analyse (2002) que nous avons

coordonné, un ELISA-E/S a révélé 17 sérums de chevaux positifs pour 2992 (0,56%) sérums

testés. Des résultats similaires (0,5% sur 2370 sérums) ont été obtenus par Diaconu et al.

(1994) employant un kit de diagnostique ELISA (Elitrich, Pasteur, Roumanie). Dans une autre

étude, à partir de 433 chevaux originaires de Roumanie et abattus en Italie, Pozio et al. (2002),

utilisant un ELISA-ES, trouvent 1,4% (n=6) positifs alor que Sofronic-Milosavljevic et al.

244

(2001), employant une ELISA-ES, trouvent un pourcentage beaucoup plus élevé de 5,9%

positifs (sur 5267 sérums). Ces différences suggérent le manque de spécificité des antigènes

utilisés (Pozio et al., 2002c). Parmi les 17 sérums positifs identifiés en Roumanie, seulement 8

ont été confirmés par un ELISA-ES realisé par le BfR à Berlin. Ces différences de résultats

entre les laboratoires pour les mêmes échantillons de sérums ont été déjà remarquées par

d’autre auteurs (Sofronic-Milosavljevic et al., 2001) et indiquent un manque de répétabilité du

test ELISA utilisé pour le cheval. Ces différences soulignent la nécessité de standardiser les

méthodes sérologiques pour une utilisation dans les zones endémiques. Quant à l’utilisation du

Western Blot, un seul sérum sur 17 c’est révélé positif. Le cheval en cause a été examiné par le

test de digestion artificielle après abattage. Aucune larve de Trichinella n’a été retrouvée, dans

plusieurs sites musculaires de prédilection (langue, muscle de la bouche, masséters, piliers),

montrant la limite des tests sérologiques dans la détection de l’infection à Trichinella chez le

cheval.

En Roumanie l’habitude de la consommation de la viande de cheval est limitée aux

périodes de grandes famines (guerres, mouvements sociales et politiques ou calamitées

naturelles). En revanche la tradition d’éleveurs de chevaux n’est pas moins présente en

Roumanie avec une connotation économique élevée dans un pays où 50% de la population est

rurale. La majorité des chevaux actuellement vendus pour leur viande sont soit exportés en

Europe de l’Ouest (Italie, France , Belgique) soit abattus dans un des deux abattoirs agréés par

l’UE pour des exportation vers la Belgique. Jusqu’au 2001, la date de l’ouverture du premier

abattoir spécialisé dans la viande de cheval, les chevaux étaient exportés vivant dans des pays

telle que l’Italie ou la France, le test de digestion artificielle se réalisant sur place. Pour la

période 2001-2004, 25.838 chevaux ont été abattus dans les abattoirs d’Alexandria et

Timisoara ; au départ seul le test trichinoscopique a été utilisé, conformément à la loi sanitaire-

vétérinaire roumaine (Loi nr 215/27.05. 2004). Lors de l’enquête que nous avons effectué, le

test de digestion artificielle a été mis en place dans ces abattoirs. Aucun cas positifs n’a été

détecté pendant la période d’étude, ce qui confirme les estimations précédentes de l’ordre de

moins de 0,001% (Boireau et al., 2000). La découverte de chevaux positifs en Roumanie (4/11

en 1993 ; Cironeanu et Ispas, 2002), ou originaires de Roumanie (2 en 1997, 2001, en Italie ;

(Pozio et al., 1997c; Pozio and Zarlenga, 2005)) au regard des 25.838 chevaux négatifs

analysés doit être interprété dans son contexte. Cette analyse confirme la faible prévalence de

l’infection à Trichinella chez le cheval en Roumanie, malgré les quelques cas identifiés ainsi

que les limites des tests de diagnostique sérologique pour l’espèce chevaline (niveau élevés de

faux positifs) dans une zone de très forte endémie de trichinellose.

245

1.2.3. L’infection à Trichinella dans la faune sauvage et

l’identification des espèces de Trichinella sévissant en

Roumanie

Dans les années 1960 Lupascu et al. (1970) réalisent les premières identifications de

l’infection à Trichinella chez 12 espèces d’animaux sauvage montrant que la prévalence la plus

élevée était identifiée chez le loup (Canis lupus) 38,53%, le chat sauvage (Felis silvestris),

23,08% et le renard roux (Vulpes vulpes) 22%. L’analyse réalisée par Nesterov et al. (1991)

couvrant une période de 20 ans, montre que la prévalence de l’infection à Trichinella chez les

animaux sauvages a baissé, mais les mêmes espèces se retrouvent avec la plus haute

prévalence : le loup avec 30,5%, le chat sauvage avec 21,5% et le renard roux avec 15,8%.

Notre étude, qui porte sur un nombre relativement limité d’exemplaires (n=140), souligne des

prévalences avec des taux inférieurs (sauf pour le loup en tant que super carnivore) par rapport

aux analyses précédentes de l’infection à Trichinella dans la faune sauvage: loup 31,4%, chat

sauvage 14,3% et renard roux 7%. Ces taux sont relativement élevés par rapport aux pays

limitrophes à l’exception des pays de l’ex-Yougoslavie où la trichinellose est endémique dans

la faune sauvage. En Hongrie la trichinellose animale est peu décrite avec un taux de

prévalence de 3% chez le renard (Sreter et al., 2003). La prévalence élevée de l’infection à

Trichinella dans la faune sauvage en Roumanie est confirmée par notre enquête. Elle représente

un risque important et constant pour une introgression dans le cycle domestique, spécialement

là où les élevages plein air sont développés.

Une analyse des espèces de Trichinella présentes en Roumanie nous a permis de

retracer les principaux cycles, avec leur éventuelle mixité. En effet nous avons mis en

évidence la détection de T.britovi, espèce emblématique pour le cycle sauvage dans les zones

tempérées, dans un nombre limité d’isolats provenant des animaux domestiques (n=2). De

même T.spiralis, espèce retrouvée le plus souvent dans le cycle domestique, a été isolée chez

les animaux sauvages (n=3), ce qui suggère fortement une transmission bilatérale entre les deux

cycles. Ces échanges ne sont cependant pas majoritaires. Les animaux domestiques retrouvés

avec une infestation à T.britovi ont été un chien gardien d’un troupeau des moutons dans une

région montagneuse et un porc élevé en plein air dans le Delta du Danube. Les animaux

sauvages infestés avec T.spiralis étaient représentés par un ours, un renard et deux sangliers. Le

loup ou le lynx sont infectés par la seule espèce T.britovi compte tenu de leur habitus

alimentaire strictement carnivore.

246

Un exemple de transmission d’espèces entre les deux cycles de Trichinella sévissant en

Roumanie est représenté par la population d’ours de certains départements du centre du pays

(Brasov, Covasna). Ces animaux ont pris l’habitude de se nourrir à partir des décharges

ménagères des villes et villages ; ils s’exposent ainsi aux sources potentielles de T.spiralis

(Aves Foundation, http://www.ursusarctos.ro/garbage/raport.htm).

Certains auteurs ont decrit l’existence de deux autres espèces européennes en

Roumanie : T.nativa et T.pseudospiralis (Olteanu, 1996 ; (Cuperlovic et al., 2005). L’espèce T.

nativa, a été décrite en Roumanie chez les animaux domestique et sauvages dès 1986 (Olteanu,

1986) ; la morphologie du capsule et des larves représentaient cependant les seuls critères

objectifs d’identification ; il n’y a pas eu de passage des isolats sur des souris et aucune

identification biomoléculaire n’a été possible. T.pseudospiralis a été rapportée formellement

par Garkavi en 1972 ; plusieurs notes font mention de larves de Trichinella « libres » dans la

musculature des oiseaux : (Rausch et al., 1956; Zimmermann and Hubbard, 1969). De même,

Olteanu a présenté une note en 1986 avec une observation de larves musculaires libres de

Trichinella chez un Corvus frugilegus lors d’une analyse trichinoscopique réalisée en 1962.

Aucune autre information supplémentaire (analyse morphologique des larves, passage chez la

souris) n’a cependant été rapportée pour ce cas.

Les résultats de notre étude montrent l’identification de deux espèces de Trichinella (T.spiralis

et T.britovi) en Roumanie ce qui conforte les quelques rares analyses biomoléculaires

effectuées sur des isolats d’origine roumaine (Pozio, 2001a; Pozio and Zarlenga, 2005).

T.nativa n’est probablement pas présente en Roumanie, puisque l’isotherme de -4°C en janvier

apparaît limité pour cette espèce. En revanche, la présence de T.pseudospiralis n’est pas à

exclure. L’identification de cette espèce dans plusieurs pays européens le démontre bien : Italie

(Pozio et al., 1999a), France (Ranque et al., 2000), Finlande (Oivanen et al., 2002), Suède

(Pozio et al., 2004a), Lituanie (Malakauskas et al., 2006), Allemagne (Nockler et al., 2006), et

Georgie (Pozio et Zarlenga, 2005). L’analyse menée dans une région cible (Delta du Danube)

n’a cependant pas permis son isolement, le nombre de prélèvements examinés (n=186) restant

encore limité.

En résumé la situation epizootologique retrouvée en Roumanie est similaire à celle des

autres pays de l’Europe Centrale et de l’Est (Cuperlovic et al., 2005; Pozio, 2001a) ou des états

baltiques (Malakauskas et al., 2006). Pour l’instant peu de pays ont rapporté l’identification sur

leur territoire des quatre espèces de Trichinella existante en Europe à l’exception de la

Finlande, la Lituanie, la Suède et la Russie (Pozio et Zarlenga, 2005; (Malakauskas et al.,

247

2006). Il existe en Roumanie deux espèces identifiées chez plusieurs espèces hôtes sauvages ou

domestiques : T.spiralis et T.britovi. La détection de l’espèce non-encapsulée de T.

pseudospiralis en Roumanie, pays où la méthode officielle de détection de l’infestation à

Trichinella reste la trichinoscopie poserait un sérieux problème de santé publique, puisque le

trichinoscope ne peut pas détecter les larves de cette espèce.

1.3. Comparaison de l’incidence de la trichinellose

humaine et la prévalence de l’infection à Trichinella

chez les animaux en Roumanie

Etant en possession des données épidémiologiques détaillées par départements, par

années et par espèces une comparaison entre la trichinellose humaine et les infection à

Trichinella chez les animaux était intéressante. Celle-ci a été réalisée pour la période 1997-

2004 et a révélé un paradoxe géographique : si l’incidence de la trichinellose est deux fois plus

élevée en Transylvanie que dans le reste de la Roumanie, la prévalence de l’infection à

Trichinella chez les porcs familiaux est deux fois inférieure en Transylvanie et huit fois

inférieure pour les porcs hors-sol. Ce résultat est confirmé par l’analyse des regroupements

géographiques effectués: la comparaison des regroupements humains et animaux ne révèle

aucune similarité ; de plus, la superposition est très limitée entre les régions à forte incidence

en trichinellose humaine et les régions à forte prévalence en infection à Trichinella chez le

porc. La situation est d’autant plus compliquée que l’étude de Cironeanu et Ispas (2002)

montrent que 95% des cas de trichinellose humaine proviennent de la consommation de viande

de porc.

Dans cette analyse il a été supposé que les animaux testés localement étaient

consommés dans le même département, ce qui généralement est valable pour les porcs

familiaux ou le gibier mais ne l’est pas forcément pour les porcs hors-sol soumis à un marché

national. Les comparaisons effectuées suggèrent que la viande et son niveau d’infestation avec

le parasite ne représentent pas forcément le déterminant principal de la variation géographique

de l’incidence de la trichinellose. D’autres facteurs peuvent être incriminés comme les

habitudes alimentaires mais également l’ampleur et l’efficacité du contrôle trichinoscopique.

Le pourcentage des porcs familiaux soumis à l’examen trichinoscopique est nettement inférieur

248

en Transylvanie par rapport au reste du pays ce qui peut expliquer une incidence de la

trichinellose plus élevée dans cette région. Les données épidémiologiques ont tendance à

confirmer cette hypothèse, spécialement dans une zone réputée pour son endémicité : la vallée

du Jiu en Transylvanie (département de Hunedoara). Cette zone (dominante minière de

l’économie) est emblématique pour l’émergence dramatique de la trichinellose accompagnant

les changements politiques du début des années 1990 : les populations rurales qui peuplent le

bassin de Jiu dans son ensemble ont essayé de concilier leurs besoins économiques avec l’état

industrialisé de la vallée en élevant des porcs familiaux. Le résultat est que les porcs familiaux

ont été élevés dans des conditions d’hygiène déplorable, en plein air avec un accès aux

décharges communales. Les populations locales ont eu un faible accès à l’éducation pendant

cette période de trouble et ont ignoré le risque posé par la trichinellose. L’examen

trichinoscopique a été très peu utilisé. Ainsi, Cristea (1998) montre que toutes les épidémies de

trichinellose dans le bassin de Jiu sont dues à la viande de porc non-soumise au contrôle

sanitaire-vétérinaire pour la période 1990-1997.

Lors de cette comparaison, un résultat a été révélé : une région dans le Nord-Est de la

Roumanie (la Moldavie) présente une faible incidence de la trichinellose humaine et une faible

prévalence de l’infection à Trichinella chez le porc familial, le porc hors-sol et le sanglier. Une

forte influence de la religion dans la vie sociale des habitats, avec de nombreux carêmes et

abstinences de produits carnés, peut partiellement expliquer ce résultat, qui nécessite tout de

même des investigations épidémiologiques plus poussées.

En conclusion, avec une incidence de 55,1 cas de trichinellose par million de personnes

par an pour les 8 dernières années et une prévalence de 8 cas d’infection à Trichinella pour 10

000 porcs testés, 10 cas pour 1000 sangliers testés et 10 cas pour 100 ours testés, la Roumanie

reste le pays avec la plus forte infestation à Trichinella au monde. La comparaison

géographique de l’incidence de la trichinellose humaine avec la prévalence de l’infection à

Trichinella chez les animaux suggèrent fortement l’influence d’habitudes alimentaires

contrastées des populations locales sans exclure toutefois des manquements graves dans les

contrôles sanitaires. L’importance des habitudes alimentaires dans l’émergence de la

trichinellose humaine a été déjà démontrée en Amérique Centrale et du Sud dans les pays où

les habitudes culinaires d’origines espagnoles et allemandes sont présentes (Argentine, Chili

ou Mexico), alors qu’au Brésil, où les habitudes culinaires d’origine portugaise sont

dominantes, la trichinellose humaine est sporadique.

249

2. Epidémiologie moléculaire de la

trichinellose

Un intérêt majeur de la biologie moléculaire dans le domaine de l’épidémiologie des

trichinelloses animales réside dans la caractérisation rapide des espèces de trichine en cause.

Les techniques d’amplification génique utilisées ne nécessitent pas un passage préalable chez

l’animal de laboratoire et permettent ainsi de garder toute la diversité génétique de l’isolat

proprement dit. Par ailleurs, les techniques PCR quoique nécessitant un laboratoire spécialisé

sont maintenant accessibles à de nombreux laboratoires d’analyses de routine et sont beaucoup

moins fastidieuses à mettre en place que les tests isoenzymatiques utilisés au début pour le

typage des parasites. De plus elles peuvent être utilisées sur une seule larve ou des fragments

de larve.

2.1. Les tests PCR utilisés pour le typage des espèces

de Trichinella

Les techniques PCR sont hautement sensibles pour détecter des parasites monocellulaires

ou typer les espèces en parasitologie (Comes et al., 1996). Plusieurs protocoles ont été définis

pour identifier les espèces de trichine au cours de la précédente décennie. Bandi et al. [1993]

ont été les premiers à montrer l’utilité de la technique pour identifier des marqueurs d’espèce à

partir d’une seule larve musculaire. Diverses stratégies existent actuellement pour typer les

espèces de Trichinella en utilisant la technique PCR et peuvent être regroupées en quatre

catégories.

a) Détection d’une séquence répétée de 1,6kb (pPRA probe) (Arriaga et al., 1995; Dick et

al., 1992; Dupouy-Camet et al., 1991; Soule et al., 1993b). Les séquences répétées

parasitaires étant dispersées dans le génome, le nombre de cibles est important,

augmentant ainsi la sensibilité de la technique. Cette méthode a été utilisée pour détecter

des larves L1M directement dans les muscles ou pour typer certains isolats. Des

différences dans la longueur des produits amplifiés permettent de séparer T. spiralis de

250

T. nelsoni. Aucune amplification n’est obtenue avec T. pseudospiralis, T. nativa et T.

britovi.

b) Amplification aléatoire par PCR (RAPD) (Bandi et al., 1995; Dupouy-Camet et al.,

1994; Liu et al., 2001; Tighe et al., 1994). Dans les conditions opératoires, le fragment

amplifié n’est pas connu puisque la séquence nucléotidique servant à l’amplification par

la polymérase est courte (<10 nucléotides) multiple ou unique, mais toujours aléatoire.

Cette méthode est utilisée sur des larves purifiées ou l’ADNc d’un isolat

c) Détection d’un fragment de gène connu. L’identification d’une espèce de trichine peut

être obtenue par un profil caractéristique d’une séquence codant pour (i) le segment V

(Expansion Segment V) de l’ARN ribosomique (Appleyard et al., 1999; Arriaga et al.,

1995; Gasser et al., 1998; Zarlenga et al., 1996), (ii) le segment V (ESV) avec ses sous-

unités D4 et D5 (Gasser et al., 2005), (iii) la région inter génique de la la sous-unité 5S

de l’ARN ribosomal (De Bruyne et al., 2005; Rombout et al., 2001; van der Giessen et

al., 2005), (iv) la glycoprotéine Ts43 (Wu et al., 1999a; Wu et al., 1998a) (v) l’antigène

d’E/S Ts 53kDa (Soule et al., 1993b), (vi) la sous-unité I du gène mitochondrial

cytochrome oxydase (cox I) (Nagano et al., 1999) (vii) la grande sous-unité ribosomique

de l’ARN mitochondrial (rrnL) (Borsuk et al., 2003)

d) PCR multiplex nichée (Kapel et al., 2001; Zarlenga et al., 1999): compte tenu de la

multiplicité des espèces dans le genre Trichinella, un seul couple d’amorces ne permet

pas d’amplifier une séquence d’une longueur caractéristique d’une espèce donnée de

Trichinella. Il est nécessaire d’amplifier plusieurs fragments spécifiques d’une seule

espèce avec des amorces différentes pour obtenir un profil type pour un des 10

génotypes de Trichinella. La PCR multiplex est ciblée sur le ESV (expansion segement

V) du gène de la grande sous unité ribosomique ainsi que sur l’ITS1 (internal transcribed

spacer 1) et l’ITS2 (internal transcribed spacer 2) avec une combinaison de cinq

oligonucléotides différents. Elle est dite nichée puisque la localisation du fragment

d’ADN génomique à amplifier nécessite une amplification préalable plus vaste de la

séquence génomique. Cette technique augmente de façon considérable la sensibilité et

évite toute hybridation moléculaire secondaire. La PCR s’effectue dans ces conditions

en deux temps. Un premier temps permet d’amplifier un grand fragment d’ADN non

visible en gel d’agarose. Une seconde amplification ciblée sur une séquence interne de

ce fragment permet la visualisation directe en gel d’agarose coloré par le BET de

bande(s) d’ADN spécifique(s).

251

2 .2 Analyse comparative des différentes méthodes de

typage moléculaire

Les procédures RAPD produisent généralement un profil à bandes multiples. Le nombre

élevé de bandes co-migrant à la même taille peut être utilisé comme témoin interne. Cependant,

la RAPD permet l’identification d’une espèce si l’échantillon est conservé correctement et si la

larve est extraite du tissu musculaire. Cette méthodologie ne s’applique pas au typage direct

dans un tissu infesté et ne sera pas opérante lors d’infestations mixtes. Des nombreux

problèmes dans la reproductibilité du signal PCR généré par la qualité variée de l’ADN,

contaminants, conditions de la réaction ou machines à PCR, ont généré des variations

importantes entre les différents isolats soumis à l’identification (MacPherson et al., 1993).

Ainsi une technique RAPD alternative a-t-elle été développée par (Wu et al., 1997) qui ont

identifié des différences de séquences nucléotidiques spécifiques d’espèce à partir de fragments

amplifiés de façon aléatoire, utilisé pour différentier T. spiralis et T. pseudospiralis. Dans la

continuité de ce travail des oligonucléotides spécifiques de ces séquences ont été établis pour

permettre une amplification ciblée de tous les génotypes existants à l’époque (Wu et al.,

1998a). La longueur de ces séquences n’étant pas spécifique d’espèce, seule une cartographie

de restriction secondaire permettait d’établir un profil de restriction unique.

Plusieurs investigations ont été effectuées à l'aide des amorces spécifiques de

génotypes combinées avec la variation de la longueur de séquence d'ESV afin de différencier

les divers génotypes de Trichinella (Zarlenga and Dame, 1992). Ainsi Arriaga et al. (1995) ont

rapporté l’identification sans équivoque de T. spiralis dans la viande chevaline obtenue à partir

d’un l'abattoir à Mexico. Appleyard et al. (1999) ont démontré qu’en utilisant des amorces

d'ESV, on pouvait différencier T. spiralis, T. pseudospiralis, et T. nelsoni de tous les autres

génotypes sylvatiques. Un deuxième couple d'amorce dérivé à partir de la séquence de T.

murrelli a pu alors être utilisé pour différencier clairement parmi les génotypes sylvatiques T.

nativa, T. britovi, T.murrelli et T. T6.

Une procédure PCR visant à exploiter les variations au sein de la région inter génique

de la sous-unité 5S de l’ARN ribosomal, a été réalisée par Rombout et al. (2001), qui a pu ainsi

différentier 8 espèces de Trichinella (T1-T8) suite à un transfert inverse d’ADN « Reverse

Line Blot » (RLB). En utilisant les mêmes séquences cibles, De Bruyne et al. (2005) ont

remplacé le RLB, avec une étape de séquençage plus facile à réaliser dans les conditions

actuelles.

252

D'autres efforts de recherches sur la séquence d'ESV, ainsi que sur les séquences d’ITS1

et 2 ont mené au développement d'une PCR multiplex (Zarlenga et al., 1999)qui peut sans

équivoque distinguer toutes les espèces actuellement identifiées de Trichinella. L'amorce

d'ESV universelle est capable de séparer aisément T. spiralis, T. nelsoni, T. pseudospiralis et T.

papuae de tous les autres génotypes sylvatique. Quatre amorces additionnelles (pour les ITS1

et ITS2) spécifiques de chaque génotype différent T. britovi, T. murrelli, Trichinella T6 et T.

nelsoni. Suite à une PCR multiplex avec les cinq paires d’amorces combinées décrites il est

possible de séparer tous les génotypes connus. Le système fonctionne sur un groupe de larves

ou sur des larves isolées. Ainsi, le test d’amplification multiplex développé par Zarlenga et al.

(1999) apparaît actuellement comme un des outils les plus simples et résolutifs pour typer les

espèces de Trichinella.

Les techniques PCR mentionnées ci-dessus ont pour cibles des séquences nucléaires.

Seulement deux séquences de l’ADN mitochondrial ont été utilisées pour le typage des espèces

de Trichinella (cox I, Nagano et al., 1999 et rrnL, Borsuk et al., 2003). Les gènes

mitochondriaux des nématodes sont des marqueurs intéressants pour l’identification, la

différentiation et la phylogénie des espèces proches (Hu et Gasser, 2006). L’ADN

mitochondrial (ADNmt) est maternellement hérité et évolue indépendamment et plus

rapidement que le génome nucléaire (Anderson et al., 1998; Anderson et al., 1995; Brown,

1985). Il présente un degré de substitution plus élevé que les séquences nucléaires (Blouin,

2002).

De plus, l’ADNmt présente un avantage majeur compte tenu de son existence en

centaine de copies par cellules, ce qui rend la PCR plus sensible notamment avec des

prélèvements de terrain en mauvaise état. La PCR Multiplex mitochondriale exploite la

variabilité dans les séquences mitochondriales de la petite et de la grande sous-unité

ribosomales (rrnS, rrnL) pour différentier les quatre espèces de Trichinella présentes en

Europe : T.spiralis, T.nativa, T.britovi et T.pseudospiralis. L’utilisation des amorces

universelles pour amplifier une bande commune de 551 bp évite la nécessité d’utiliser d’autres

témoins positifs pour identifier les espèces. Cette bande commune représente en même temps

un témoin interne positif pour l’intégrité de la réaction. Le profil unique pour chaque espèce a

été conservé sur un large panel d’isolats d’origines géographiques variées et peuvent être

utilisés comme profils de référence pour les espèces européennes. Les techniques de PCR

développées antérieurement et utilisant l’ADNmt ne pouvaient pas différentier directement les

253

quatre espèces européennes de Trichinella (Borsuk et al., 2003). Elles nécessitaient une étape

de digestion enzymatique supplémentaire (Nagano et al., 1999).

Dans le cas d’une infection à Trichinella avec plusieurs espèces (T.spiralis et T.britovi,

T.spiralis et T.pseudospiralis, (Nockler et al., 2006; Pozio et al., 1997b); T. spiralis et T. nativa

ou T. britovi et T. nativa, (Kapel et al., 2001) peu de techniques exceptée la technique de

Rombout et al. (2001) sont capables d’identifier simultanément les espèces incriminées. Les

autres techniques nécessitent plusieurs séries de PCR sur des larves isolées pour pouvoir

identifier les différentes espèces. Cette étape complique le processus de l’identification. Dans le

cas de la PCR Multiplex mitochondriale, le profil spécifique pour chacune des espèces permet

l’identification d’une infestation multiple directement. Aucune différentiation n’est possible en

revanche entre T.T6 et T.nativa ce qui confirme la difficulté de les différencier par PCR-RFLP

(Nagano et al., 1999). Au contraire, une discrimination positive a été possible entre T. britovi et

T9, ce qui soutient les résultats de Nagano et al. (1999), qui considère cet isolat comme un

nouveau génotype, à savoir Trichinella T9.

2.3. Limites actuelles du typage par PCR

L’extraction de l’ADN à partir d’une pièce musculaire, la qualité de la matrice à

amplifier sont des facteurs limitants importants pour le typage de Trichinella. Un échantillon de

1g a été utilisé par Viveros et al. (2001), pour détecter 2 chevaux positifs sur 90. Une autre

analyse par les mêmes auteurs avait permis d’identifier 11 chevaux infestés à l’abattoir

municipal de Mexico sur 80 testés. La limite de sensibilité est de 0,06L1M (7ng d’ADN

génomique). La PCR apparaît comme la méthode la plus sensible assurant l’identification

d’échantillons positifs non détectés par d’autres méthodes.

Les limites de la techniques PCR sont liées à la difficulté d’identifier de nouvelles

espèces directement au sein d’une population et surtout la technique PCR ne permet pas de

différencier deux isolats de la même espèce. Le séquençage du gène nad4 de l’ADNmt a été

décrit par Blouin (2002) comme « le meilleur choix » pour caractériser des populations

proches. L’AFLP (amplified fragment length polymorhism) utilisée avec succès pour

différentier des populations du nématode Oesophagostomum bifurcum chez des primates

humains et non-humains au Ghana (de Gruijter et al., 2005), a été employée par Mikkonen et

al. (2005) pour différentier des isolats de T.nativa. Les profils obtenus présentaient une

254

hétérogénéité excessive, qui nécessite des mises au point supplémentaires ainsi qu’un

traitement informatique des représentations d’électrophorèses en gel d’agarose. La forte

homozygotie allélique, générée par une propagation quasi clonale au sein du genre Trichinella,

rendent les techniques de PCR décrites insuffisantes pour caractériser un isolat (Liu Mingyuan

et al., 2001). Pourtant une variation intra espèce a été mise en évidence au niveau de certains

microsatellites [TGC] n pour l’espèce T. pseudospiralis (Zarlenga et al., 1996) : Zarlenga et al.

ont pu différentier ainsi trois populations pour cette espèce (Australe, Paléarctique,

Néarctique), mais cette méthode n’apparaît pas généralisable actuellement aux autres espèces.

En conclusion, une méthode PCR multiplex robuste a été définie pour différencier les quatre

espèces identifiés en Europe, en Russie et jusque dans l’est de la Chine: Trichinella spiralis,

Trichinella nativa, Trichinella britovi et Trichinella pseudospiralis en utilisant l’ADN

ribosomal mitochondrial. La méthode de PCR basée sur l’amplification de l’ADN ribosomal

mitochondrial a été établie comme méthode de typage sensible et reproductrice pour l'Eurasie.

Le typage a été appliqué aux isolats roumains et français collectés au cours des 3 dernières

années et a confirmé l’existence de deux espèces de Trichinella circulantes dans ces deux

pays : T britovi et T spiralis. Cependant il n’a pas été possible de différencier ces différents

isolats par les marqueurs analysés (mt-rrnS et mt-rrnL).

3. Comparaison Trichinella spiralis et

Trichinella pseudospiralis

3.1 Analyse comparative des protéines hautement

conservées

3.1.1. GST

Les Glutathione S-transferases (GST) sont des enzymes appartenant a une superfamille

d’anciennes protéines identifiées chez tous les organismes vivantes, avec des rôles

fondamentaux pour la détoxification cellulaire. De même, les GSTs sont impliquées dans la

255

protection tissulaire intervenant contre la destruction oxydative causée par les hydroperoxides

de phospholipides, les acides gras ou l’ADN (Hayes et Strange, 2000). Certaines GSTs de

parasites sont impliquées dans la modulation du système immunitaire de l’hôte intervenant

dans l’isomérisation GSH-dépendante de métabolites telles que les prostaglandines (Angeli et

al., 2001; Johnson et al., 2003; Ouaissi et al., 2002). Du fait de leur implication dans de

nombreux processus métaboliques fondamentaux les GSTs sont considérées comme des cibles

préférentielles pour le développement des vaccins et des antiparasitaires (Brophy et Pritchard,

1994). Aussi, un rôle protecteur a-t-il été décrit chez le rat, la souris ou le mouton, contre une

infestation expérimentale avec Schistosoma mansoni, suite à la vaccination avec une GST de

28kDa de S. mansoni (Balloul et al., 1987 ; Taylor et al., 1998). La GST26 de F.hepatica,

utilisée comme vaccin, induit un état de protection chez le mouton (Sexton et al., 1990).

Certains parasites présentent plusieurs GST : pour Onchocerca volvulus il y a trois

GST décrites (OvGST1, OvGST2, OvGST3) (Liebau et al., 2000; Liebau et al., 1994b; Liebau

et al., 1994c); pour Fasciola hepatica il y a quatre GST : FhGST1, FhGST7, FhGST47,

FhGST51 (Salvatore et al., 1995) et trois pour Schistosoma mansoni : 26GST, 28GST et

SmGSTO (Girardini et al., 2002). Dans le genre Trichinella, jusqu’au présent, une seule GST,

TsGST28, avait été décrite par Rojas et al.(1997), mais sa séquence nucléique ou protéique

n’est pas décrite. Dans l’article 7 nous présentons l’identification d’une nouvelle GSTs de

Trichinella pour les 4 espèces européennes: TsGST24, TnGST24, TbGST24, TpGST24. La

GST24 de Trichinella présente comme toutes les autres GST24 deux domaines caractéristiques

pour les parties N-terminale (cd03076) et C-terminale (cd03210) (Marchler-Bauer et al., 2005).

Jusqu’au présent sept classes de la sous-famille des GSTs cytosoliques ont été reconnues chez

les mammifères : alpha, mu, pi, sigma, theta, zeta et omega (Hayes et al., 2005). Ces séquences

sont différenciées sur la base de plusieurs critères (identités des séquences

nucléiques/protéiques, structure des gènes ou propriétés immunologiques). Peu d’informations

concerne la classification propres des GSTs cytosoliques des nématodes. Les GSTs de

nématodes suivent de prés le système de classification des mammifères (Campbell et al., 2001)

et sont décrites comme appartenant à une classe mu (Lim et al., 1994 ; Rossjohn et al., 1997;

Girardini et al., 2002), à une classe pi (Liebau et al., 1994a), à une classe sigma (Girardini et

al., 2002 ; Sommer et al., 2001 ; Sommer et al., 2003) ou à une classe omega (Giardini et al.,

2002 ; Brophy et al., 1994). Le site de fixation du glutathion réduit des TsGST24, TnGST24,

TbGST24, TpGST24, présentent une identité avec celui de la OvGST2 et GSTP1-1 (la GST

humaine de classe Pi), comme décrit par Perbandt et al. (2005). Il existe cependant quelques

variations: la leucine et l’arginine en position 51 et 95 respectivement sont remplacées par une

256

valine (Fig. 2). Les acides aminés hautement conservés Y 8, P 52, D 58, A 66, I 67 et D152

sont retrouvés dans chacune des séquences de GST caractérisées jusqu’au présent (Rathaure et

al., 2003). Ils sont retrouvés dans les séquences de la GST24 de Trichinella. De plus, les sept

acides aminés (Y8, G13, K43, Q50, P52, Q63 et S64) qui réalisent la région d’ancrage du

glutathion tel que cela a été décrit pour la classe Pi des GSTs (Reinemer et al., 1991), sont

présents dans la séquence protéique de TsGST24, TnGST24, TbGST24, TpGST24. L’activité

enzymatique de la rTsGST24 avec l’EA, un substrat conjugué préférentiellement par les GSTs

de la class Pi, est faible: 0.16 µmol.min-1 (mg protein)-1 pour rTsGST24 contre 1 µmol.min-1

(mg protein)-1 pour une GST de la classe Pi comme défini par Eaton et Bammler (1999). Cette

activité ressemble plus à l’activité décrite par Salvatore et al., (1995) pour une GST de la classe

mu de F. hepatica. La comparaison réalisée à l’aide du logiciel BlastP (Altschul et al., 1997 ;

Schaffer et al., 2001) montre une identité élevée de la séquence de TsGST24 avec celles des

GTSs appartenant à la classe Pi : 52% avec la séquence GST de D. immitis (P46426), 51%

avec la séquence OvGST2 de O. volvulus (CAA58767), 50% avec la séquence GST de W.

brancofti (AAO45827) et 49% avec la séquence GST de B. malayi (CAA73325). Une identité

moins importante a été révélée avec les GSTs appartenant à d’autres classes : 32-34% avec

celles de la classe sigma (A.suum GST et OvGST2) ou 28% avec celle de la classe mu (Sm26

GST).

Cette analyse globale indique l’appartenance de GST24 du genre Trichinella à la classe

Pi, malgré une activité déficitaire de la rTsGST24 avec le substrat spécifique de cette classe. En

effet, même pour les GSTs les plus homologues, environ un tiers des changements en acides

aminés sont localisés au niveau du site de fixation du substrat. Ceci rend la variation de

substrats intra-classe possible (Platel et al., 1999). TsGST24 présente des différences au niveau

de son site de fixation du glutathion avec deux acides aminés sur sept modifiés quand on

compare la séquence de Trichinella avec celle d’OvGST2 et celle de la GSTP1-1 humaine.

L’espèce non-encapsulée, T. pseudospiralis présente une séquence protéique homologue à celle

de T.spiralis avec une conservation de 77%, ce qui confirme l’éloignement phylogénétique

dans le genre Trichinella entre ces deux espèces (Boireau et al., 1997; Pozio, 2001a; Zarlenga

et al., 2006).

rTsGST24 a la capacité de réduire le CH, bien que cette activité soit très limitée et se situe

juste au-dessus de la limite de la détection (0.µmol 01.minute-1 (protéine de magnésium)-1

selon Liebau et al. (1996). Ceci démontre que rTsGST24 peut agir en tant que peroxydase

indépendante du sélénium. La GST24 de Trichinella pourrait ainsi avoir un rôle protecteur

contre la peroxydation des lipides (Rojas et al., 1997). Une activité similaire a été observée

257

chez les GSTs de D. immitis (Jaffe and Lambert, 1986), et O. volvulus (Liebau et al., 1996).

Pour faciliter l’évaluation du rôle fonctionnel de TsGST24 chez T. spiralis, une

immundétection a été réalisée au niveau des larves musculaires. La TsGST24 est localisée

principalement dans le cytosol du primordium génital, des glandes excrétoires, dans les

stichocytes. L'absence du signal peptide jointe à sa localisation indiquent que la TsGST24 est

intracellulaire. OvGST2 a une distribution différente et est située dans l’hypoderme syncytial

ainsi que dans l'épithélium utérin (Liebau et al., 1996). Les différences fonctionnelles

potentielles entre rTsGST24 et OvGST2 suggèrent l’existence d’une autre GST plus proche au

sein du genre Trichinella. La comparaison de tsgst24 avec les EST de T. spiralis (Mitreva et

al., 2004)a permis d’identifier une séquence additionnelle homologue aux stades Ad et L1NN ;

le pourcentage d’identité de cette séquence est de 69%. Cette nouvelle séquence pourrait être

celle codant pour TsGST28 (Rojas et al., 1997). Une autre hypothèse suggère l’existence d’une

troisième GST spécifique pour le stade Ad/LNN de T. spiralis, une GST plus proche de

OvGST2 que la TsGST24.

Pour tester l’immunoréactivité de la TsGST24 un ELISA indirect a été réalisé avec de

sérums de porcs expérimentalement infestées avec des doses très variées par animal: 200 et 20

000 larves musculaires de T.spiralis. Une réponse positive a été observée dés le 15eme jour

post infestation, mais uniquement pour les porcs infestés a de fortes doses parasitaires. Ce

résultat indiquait qu‘une différentiation de l’infestation à T.spiralis de celle à T.pseudospiralis

ne pouvait pas se réaliser sur une simple réaction immunologique générée par la GST24. Au

contraire le manque d'identité immunologique entre la TsGST28 et plusieurs espèces de

parasites (F.hepatica, S.bovis, S.mansoni, D.immitis, T.canis et Anisakis sp.) démontré par

Rojas et al. (1997), fait des TsGSTs des candidats appropriés pour la protection contre le

trichinellose.

3.1.2. TsSerP

Les parasites comme tout autre organisme vivant expriment une grande diversité

d’enzymes protéolytiques qui vont activement participer à différentes étapes de leur cycle

biologique: invasion de la cellule ou de l’organisme hôte, nutrition du parasite ou modulation

du système immunitaire (McKerrow, 1989; Trap and Boireau, 2000). Chez Trichinella,

l’introduction de produits d’E/S de larves L1NN ou larves L1M dans des cultures de myocytes

induit la formation de structures nodulaires, chacune contenant plusieurs cavités. La formation

258

de ces cavités résulte probablement d’une activité enzymatique qui pourrait faire intervenir des

protéases (Leung and Ko, 1997). En effet des activités protéasiques ont été identifiées dans les

produits d’E/S ou dans les extraits totaux des trois stades antigéniques majeurs de Trichinella

(Criado-Fornelio et al., 1992; de Armas-Serra et al., 1995; Moczon and Wranicz, 1999; Ros-

Moreno et al., 2000; Todorova, 2000; Todorova et al., 1995; Todorova and Stoyanov, 2000).

Des protéases à sérine et des métalloprotéases ont été majoritairement identifiées dans des

produits d’E/S et des extraits de larves musculaires de T. spiralis (Lun et al., 2003; Nagano et

al., 2003; Romaris et al., 2002). Criado-Fornelio et al (1992) suggèrent que ces protéases

produites par un stade parasitaire qui ne présente pas le stylet oral, agiraient comme des

enzymes lytiques des matrices extracellulaires et des tissus intestinaux, facilitant ainsi la

pénétration de Trichinella dans les entérocytes.

Dans l’article 8 nous avons décrit l’identification d’une serine protéase (TsSerP) à

double domaine catalytique chez Trichinella spiralis. La famille des protéases à sérine est

majoritaire chez les nématodes parasites (Trap and Boireau, 2000). L’implication de protéases

à sérine dans la virulence de nématodes parasites comme Necator americanus (Brown et al.,

1995; MacLennan et al., 1997) et Trichostrongylus vitrinus (MacLennan et al., 1997) a

clairement été démontrée. La présence de protéase ayant plusieurs domaines catalytiques est

peu commune. L’oviductin de Xenopus laevis (Lindsay et al., 1999a) ou de Bufo japonicus

(Hiyoshi et al., 2002) contient deux domaines de protéase à sérine. L’ovochymase de X. laevis

(Lindsay et al., 1999b) et la polyserase-I humaine (Cal et al., 2003) sont des protéines

mosaïques présentant trois domaines de protéase à sérine qui sont libérées après la traduction

d'un produit unique d’une polyprotéine. Bien que le premier domaine catalytique de la TsSerP

ne possède pas la triade protéolytique canonique, en raison de la substitution de l’histidine dans

le site actif, sa capacité à fixer le substrat peut être conservée. La comparaison de la séquence

entière de cette nouvelle protéase avec des protéases à serine connues suggère que la TsSerP

est un précurseur de protéine avec un site de clivage situé entre la lysine 38 et l’isoleucine 39.

La protéine présente ainsi 629 acides aminés et une masse moléculaire apparente de 67.5 kDa.

L’immunodétection réalisée avec un sérum spécifique anti-Trx-βSerP (le deuxième domaine

catalytique du TsSerP) a permis d’identifier un polypeptide de 69kDa dans les antigènes

solubles des larves musculaires de T. spiralis. Les deux domaines de la protéase à sérine de

Trichinella spiralis ne sont donc pas séparés lors de sa maturation post traductionnelle.

Selon l’analyse de Southern Blot, le gène codant pour TsSerP est présent en copie unique dans

le génome de Trichinella. L’identification de plusieurs autres protéases à sérine chez T.spiralis

comme la kallikréine exprimée aux stades adultes et L1M (Trap, 2001)), une glycoprotéine

259

sécrétée avec des activités de protéase spécifique pour du stade L1M (Nagano et al., 2003;

Romaris et al., 2002) ou une protéase à serine spécifique pour le stade L1NN (Liu et Boireau,

communication personelle) indique l’existence d’une superfamille multigénique de protéases à

sérine dans le genre Trichinella. Cette organisation multigénique a déjà été mise en évidence

chez Fasciola hepatica (Heussler and Dobbelaere, 1994), Haemonchus contortus (Cox et al.,

1990) et Aspergillus flavus (Ramesh et al., 1994) qui présentent des protéases à cystéine

appartenant à une famille multigénique. Il a été démontré que la partie C-terminale du domaine

catalytique est cruciale pour réguler le site actif et le déclenchement de certains changements

conformationels (Krem et al., 1999). Chaque membre de ces familles de protéases peuvent

avoir un rôle différent dépendant de la modalité de la régulation (constitutif ou stade-

spécifique), de la localisation (intestinale ou excrétée), de la présence d'un domaine de

régulation (dans la partie N ou C terminale) ou de la variation de la séquence en acide aminé.

L’expression du gène codant pour TsSerP a été montrée pour les trois stades étudiés

(Ad, L1NN, L1M), indiquant son expression constitutive. En revanche, l’expression de la

kallikréine n’a pas été detectée au stade L1M. Ces deux résultats montrent que ces deux

protéases de la même famille (protéases à sérine) sont régulées de façon différente par le

parasite. La TsSerP, n’étant pas détectée dans les produits d’E/S. L’homologue de la TsSerP a

été récemment identifiée dans les produits d’E/S de T.pseudospiralis, par le séquençage de

novo, suite à une analyse par la technique de MS/MS (Robinson et al., 2006). Les protéases à

domaines multiples sont généralement synthétisée comme des protéines liées à la membrane

subissant un processus protéolytique pour donner naissance à une enzyme active (Cal et al.,

2003). Selon cette hypothèse, la TpSerP présente une masse moléculaire de 40 kDa alors que

la masse moléculaire de son homologue, la TsSerP, détecté par le Western Blot est de 67,5

kDa.

La TpSerP n’a pas été détectée parmi les produits d’E/S des larves musculaires de

T.pseudospiralis si ce n’est après une longue période d’incubation (>> 6h). La protéine

homologue n’a pas été détectée chez T.spiralis à aucune de ces période, ce qui est en accord

avec nos résultats. Après 20h d’incubation in vitro, la cuticule des larves musculaires de

T.pseudospiralis ont un aspect intègre mais semblent détachée du corps de la larve, donnant

l’impression que les larves musculaires sont débarrassées de leur cuticule. Ce processus n’est

pas visible chez les larves de T.spiralis même dans une culture in vitro de longue durée. Ces

différences importantes suggèrent que l’apparition de la TpSerP dans le surnageant d’une

culture in vitro de larves musculaires de T.pseudospiralis est en accord avec un rôle potentiel

dans le processus de mue (Robinson et al., 2006). En conclusion, l'expression constitutive et la

260

localisation de TsSerP, ainsi que la détection de son homologue chez T.pseudospiralis, suggére

une fonction dans le processus de mue, cette protéase jouant un rôle principal dans le cycle

biologique du parasite.

Afin d’analyser la possibilité de construire un ELISA spécifique d’espèce avec cette

protéine, une analyse de l’antigénicité de TsSerP a été réalisée. Les peptides chevauchant de

TsSerP couvrant le domaine bêta ou le domaine hydrophile, n’ont pas été reconnus par le

sérum de porc infesté avec T. spiralis. Bien que certaines protéases de parasite se soient

avérées des antigènes immunodominants (Nagano et al., 2003; Romaris et al., 2002), TsSerP

apparaît faiblement antigénique.

3.2. Comparaison globale du transcriptome de

T.spiralis et T.pseudospiralis

3.2.1. Méthode d’hybridation soustractive

Au cours des dernières années, plusieurs gènes parasitaires exprimés de façon différentielle ont

été décrits. Ainsi des gènes spécifiques de Plasmodium ont été identifiés lors de l’invasion de

l’intestin moyen du moustique en utilisant la méthode d’hybridation soustractive (SSH)

(Dessens et al, 2000). Une banque d’ADNc de Plasmodium falciparum spécifique du stade

sporozoite a été générée en utilisant la SSH (Fidock et al, 2000). La SSH a été appliquée avec

succès pour identifier des gènes exprimés différentiellement chez des souches virulentes de

Trypanosoma cruzi (Weston et al, 1999). Des gènes impliqués dans le parasitisme du nématode

à capsules Hétérodera (expression des transcrits identifiés dans les cellules de la glande

oesophagienne) et deux gènes exprimés préférentiellement au stade amastigote de Leishmania

mexicana ont été identifiés par la technique SSH (Gao et al, 2001). De même, des gènes liés au

développement du cestode Bothriocephalus acheilognathi ont été identifiés (Luo et al, 2004).

Mak et al (2001) ont caractérisé 3 gènes induits par choc thermique en utilisant la méthode

SSH chez Trichinella au stade L1M. Plus récemment à partir d’une banque d’ADNc de

T.spiralis réalisée par la technique de SSH, Fu et al (2005) ont identifiés 24 clones qui se sont

révélés être exprimés de façon différentielle au stade L1NN. Comme T.spiralis et

T.pseudospiralis représentent deux espèces du même genre mais ayant une biologie très

contrastée dans la formation de la cellule nourricière, un spectre d’hôtes très varié et une

261

« virulence » différente il devenait tentant de sélectionner par la méthode SSH des gènes

spécifique de l’espèce T.pseudospiralis.

La méthode SSH est un outil d’analyse globale du transcriptome, puissant qui permet

d’enrichir en deux étapes PCR la fraction des gènes spécifiquement exprimés (Diatchenko et

al., 1996). La technique permet de soustraire simultanément les transcrits communs de deux

banques d’ADNc et peut sélectionner les transcrits spécifiques peu abondants puisqu’une étape

d’amplification existe. Une des limites de la technologie réside cependant au niveau de

l’efficacité de la soustraction. Celle-ci peut aller de 25 à 30%. Pour les banques d’ADNc du

stade L1NN ou adulte réalisé par Fu et al. (2005) l’efficacité a été supérieure à 50% mais pour

d’autres nématodes parasite à Galle l’approche s’est révélée infructueuse (P. Abad,

communication personnelle). Cette différence d’efficacité obtenue pour d’autres nématodes

pourrait être liée, entre autre, à la plus forte clonalité intra espèce dans le genre Trichinella (Liu

et al., 2001). Pour la soustraction entre les deux espèces de Trichinella, le rendement a été

inférieur à 10% car à partir de 30 clones séquencés, 90% d’entre eux contenaient des fragments

de la séquence de la sous-unité 16S d’ARNr mitochondrial de Trichinella spiralis. C’était

d’autant plus surprenant qu’une purification spécifique des ARNm oligo dT cellulose avait été

effectuée avant l’étape de la synthèse d’ADNc. Deux hypothèses sont à émettre : (i) soit il

s’agit d’une contamination avec l’ARN ribosomal due à un rendement médiocre de la

purification des ARNm par rapport aux ARNr (ii) soit lors de la sélection de l’ARNm à l’aide

d’oligo dT, la sous unité 16S de l’ARNr mitochondrial a été copurifiée. Cette dernière

hypothèse est à privilègier car cette espèce d’ARNr a déjà été décrite récemment chez

Trichinella spiralis dans une banque soustractive obtenue par la même technique (SSH) (Gare

et al., 2004). Les clones sélectionnés présentaient tous un signal de polyadénylation. La

présence fréquente de la sous unité d’ARNr 16S mitochondrial polyadénylée a été décrite chez

d’autres organismes comme Fasciola hepatica (Zurita et al.,1988), Echincoccocus granulosus

(Fernandez et al., 2002), Xenopus laevis (Kobayashi et al., 1998) et Drosofila melanogaster

(Benkel et al., 1988). Ces ARNr mitochondriaux polyadenylés ont été généralement retrouvés

lors du dévelopement embryonnaire ou larvaire des organismes; aussi ces types d’ARNr ont-ils

été localisés chez les embryons de Xenopus à l’extérieur de mitochondrie, associé avec le

germe plasma (the germ plasma) ; la polyadénylation est dans ce cas le facteur déclenchant le

transport par la membrane de l’organelle.

262

3.2.2. ADNc-AFLP

D’autres techniques auraient pu être envisagées comme la méthode ADNc-AFLP qui permet

d’identifier des gènes différentiellement exprimés ainsi que des transcrits polymorphes chez

des organismes eucaryotes ou procaryotes. Décrite par Bachem et al (1996), cette technique se

fonde principalement sur l'AFLP (Vos et al, 1995). Ces méthodes basées sur une amplification

sélective de fragments de restriction ne diffèrent que par la nature du matériel biologique

utilisé: ADNc double brin (ADNc-AFLP) ou ADN génomique (AFLP). Contrairement aux

techniques basées sur l'hybridation telles que l’ADNc biopuces ou la SSH, l’ADNc-AFLP

permet de faire la distinction entre des transcrits différentiellement exprimés issus de gènes

appartenant à une famille multigénique. Cette approche présente également l'avantage de ne

nécessiter aucune connaissance préalable du transcriptome étudié, ce qui en fait un outil très

efficace dans l'identification de nouveaux gènes. Cependant, sa mise au point est longue et

fastidieuse puisque l’étape d’amplification sélective doit être particulièrement bien calibrée

pour aboutir à des résultats reproductibles. De plus, les mutations ponctuelles dans les

séquences codantes sont suffisantes pour caractériser la séquence comme non exprimée

différentiellement ce qui entraîne un bruit de fond important. Le grand intérêt de cette méthode

par rapport à la technique SSH est de pouvoir couvrir statistiquement l’ensemble du

transcriptome ce qui n’est pas le cas des autres technologies. La technique de l’ADNc-AFLP a

déjà été employée avec succès pour identifier des gènes impliqués dans la pathogénicité ou

l'avirulence d'organismes phytoparasites. Ainsi, chez le nématode à capsules Globodera

rostochiensis, l'analyse comparative du transcriptome à différents stades de développement a

permis de mettre en évidence des transcrits surexprimés exclusivement au stade infestant (Qin

et al, 2000). Trois d'entre eux codent pour des protéines potentiellement sécrétées par la glande

dorsale du nématode. Une autre étude basée sur l'analyse différentielle de souches isogéniques

de la bactérie Xanthomonas campestris pv. vesicatoria a été réalisée afin de déterminer le profil

d'expression des gènes du groupe hrp impliqués dans la pathogénicité de la bactérie (Noel et al,

2001).

3.2.3. Le séquençage des banques d’ADNc

Cependant de toutes les méthodes, le séquençage de banques d’ADNc apparaît comme la plus

résolutive pour identifier des gènes d’intérêt par comparaison de transcriptome. Cette méthode

a été déjà appliquée à de nombreux parasites et plusieurs nématodes comme Meloidogyne

incognita (McCarter et al, 2003), Strongyloides ratti (Tompson et al, 2005), Heterodera

263

schachtii (Vanholme et al., 2005), Dirofilaria immitis (Yin et al., 2006) et récemment chez T.

spiralis (Mitreva et al., 2004). Un des biais de cette stratégie réside dans la représentativité des

sequences analysées et la représentativité du génome séléctionné pour l’espèce analysée. Les

nématodes, en dépit d’une morphologie généralement uniforme, présentent une diversité

inégalée au niveau moléculaire (Mitreva et al. 2005). Aussi, l’analyse comparative des

séquences restera une méthode à employer dans l’identification des gènes et la détermination

de leurs fonctions chez les espèces proches comme S.stercoralis/C.elegans (Mitreva et al.,

2004) ou du même genre C.brigssae/C.elegans (Stein et al., 2003), ou A.caninum/A.ceylanicum

(Mitreva et al., 2005). Une autre limite de cette technique est la représentativité des séquences

de l’organisme modèle. Par exemple pour T.spiralis l’analyse de 3454 contigs résultant du

séquençage de 10130 EST des banques d’ADNc de L1NN, L1M et d’adultes indique que

seulement 12,6% des gènes sont trouvés en commun pour 2 ou 3 stades parasitaires. Ces

résultats montrent que la plupart des séquences sont uniques pour chacun des stades ce qui

apparaît en contradiction avec les ésultats obtenus par Fu (2005) pour les banques d’ADNc

soustractives obtenus pour les mêmes stades parasitaires (Figure 26). L’hybridation de banques

d’ADNc spécifiques de stades avec une sonde déplétée spécifique d’un stade a révélé

l’existence de moins de 2% de clones exprimés dans chacune des banques d’ADNc spécifique

de stade. Par ailleurs, des clones identifiés comme spécifiques de stade par la méthode SSH

n’ont pas été identifiés par séquençage d’EST de T. spiralis. Parmi les 45 séquences

nucléotidiques différentiellement exprimées 40% ne sont pas présentes dans la banque d’EST

publiée, 9 clones appartiennent au stade Ad5 et 7 au stade L1NN (Fu, 2005). Neuf de ces

séquences n’ont aucune homologie avec des gènes connus. Ces résultats suggèrent une bonne

résolution de la technique SSH et un échantillonnage insuffisant pour le séquençage d’EST

puisque la méthode SSH a bien permis l’identification de clones spécifiquement exprimés à un

ou plusieurs stades mais la banque EST n’a pas permis d’identifier certaines de ces cibles (Fu,

2005).

Nous avons réalisé le séquençage partiel de Trichinella pseudospiralis pour deux stades

parasitaires et plus de 5000 clones d’ADNc. L’analyse partielle de la banque comprenant 230

contigs d’ESTs du stade L1M de l’espèce T. pseudospiralis a révélé qu’une grande majorité

des séquences (54%) codaient pour des protéines avec une fonction inconnue. La comparaison

avec la banque d’ESTs de T.spiralis montre que pour l’ensemble des 230 contigs seulement 11

présentent une homologie avec des protéines de T.spiralis ou de T.pseudospiralis

préalablement décrites. Parmi les 15 contigs les plus abondants en transcrits, 6 contigs ne

présentent pas de séquence homologue dans la banque d’EST de T.spiralis et correspondent à

264

de nouvelles séquences. Un résultat similaire est obtenu par Mitreva et al. (2005), qui suite à la

comparaison réalisée pour A.caninum vs A.ceylanicum a identifié 3 des 10 contigs les plus

abondants spécifiques de l’espèce. D’une manière générale 34% des 4020 contigs de

A.caninum ont une homologie chez A.ceylanicum et 44% des 3369 contigs de A.ceylanicum ont

également une homologie chez A.caninum. Le pourcentage de contigs homologues entre

T.spiralis et T.pseudospiralis s’élève à 79%, niveau qui trouve une explication dans la

disproportion des contigs comparés : 230 pour T.pseudospiralis vs 3454 pour T.spiralis.

Malgré ce niveau élevé d’homologie, 21% des contigs représentent des séquences nouvelles

n’étant pas retrouvé dans la banque d’EST de T.spiralis alors que 9% des contigs représentent

des séquences sans homologie ni dans GenBank ni dans les banques d’EST.

En conclusion, l’analyse de deux gènes conservés chez Trichinella (GST24 et SerP) a montré

la difficulté d’utiliser ces cibles pour obtenir des différences génétiques ou antigéniques entre

espèces du genre. Leur faible antigénicité ne permet pas de différencier par ELISA indirect en

utilisant les protéines ou peptide de synthèse différentes espèces de trichine infestantes (surtout

lors de faible infestation). La comparaison globale du transcriptome de T.spiralis et

T.pseudospiralis indique que la technique SSH est utile pour l'identification des gènes

spécifiques de stade de Trichinella mais elle a montré ses limites pour l’identification des gènes

spécifiques d’espéce dans le genre. Cependant le séquençage de banques d’ADNc spécifiques

d’espèces confirme que cette technique peut apporter plus d’information sur l’identification des

gènes impliqués dans les différences biologiques d’espèces des Trichinella.

265

Figure 27a: Diagramme de Venn montrant les groupes de séquence issue du séquençage de fragment d’ADNc de T. spiralis. La majorité des contigs obtenus sont présents à un seul stade parasitaire en apparence (Mitreva et al., 2004).

Figure 27b: Diagramme représentant les clones d’ADNc identifiés par analyse de la banque soustraite. La majorité des clones ne sont pas spécifiques d’un seul stade parasitaire (Fu, 2005)

L1NN 22 Ad3 12

Ad5 12

1

8+6+16

4 2+4

2+2

L1M

109 3.1%

711, 20.6%

1588, 46.0%

157, 4.5%

121, 3.5%

54, 1.5%

714, 20.7%

L1M 1908, 55.2%

Adultes 995, 28.8%

L1NN 1046, 30.3%

267

5. Conclusions et Perspectives

269

L’étude spatiale et temporelle de la dispersion de la trichinellose en Roumanie, a révélé

que 28.293 cas de trichinellose humaine ont été rapportés pour la période 1980-2004, ce qui

correspond à une incidence moyenne de 51 cas par million par an. En parallèle, la très forte

contamination du cheptel porcin ou de la faune sauvage avec des taux de prévalence qui varie

de 8 cas pour 10.000 porcs testés, à 10 cas pour 100 ours testés, ont révélé que la Roumanie

représente un des pays avec la plus forte endémicité au monde. La comparaison géographique

de l’incidence de la trichinellose humaine avec la prévalence de l’infection à Trichinella chez

les animaux suggère fortement que, excepté le niveau relativement élevé de la circulation du

parasite dans la faune sauvage et domestique, ce sont les habitudes alimentaires des populations

locales combinées avec la faiblesse des contrôles sanitaires-vétérinaires qui sont les principales

causes des cas cliniques.

Le nombre d’animaux ayant une infestation à Trichinella est probablement sous-estimé

compte tenue de la méthode de détection utilisée : la trichinoscopie est une méthode qui

présente un seuil de détection inférieur à la méthode de digestion enzymatique. Cette dernière

est la méthode officielle de diagnostique de la trichinellose animale au sein de l’Union

Européenne. Dans ces conditions et plus particulièrement en raison de l’entrée récente de la

Roumanie en Union Européenne, l’objectif prioritaire pour l’avenir est l’adoption de la

digestion enzymatique comme méthode officielle de diagnostique. Un contrôle systématique

des carcasses par cette méthode pourra nous aider à répondre à deux questions essentielles :

1. est-ce que T.pseudospiralis existe en Roumanie? pour l’instant il n’y a que deux

espèces de Trichinella (T.spiralis et T.britovi) qui ont aient identifiées par les

moyens de la biologie moleculaire parmi les isolats roumains

2. peut-on identifier des chevaux positifs et à quelle fréquence ?

La méthode de PCR basée sur l’amplification de l’ADN ribosomal mitochondrial utilisé pour le

typage des souches de Trichinella collectées en Roumanie et en France a été établie comme

une méthode de diagnostique sensible et reproductrice. De plus elle a été employée au cours

des trois dernières années afin d’identifier les quatre espèces de Trichine existantes dans

l’Europe et l’Asie. Cependant il n’a pas été possible de différencier les isolats roumains ou

français par les marqueurs analysés. La forte clonalité au sein du genre Trichinella rend cette

différence impossible actuellement. Un deuxième futur objectif portera sur l’identification de

marqueurs microsatellites et la mise en place d’une PCR capable de retracer géographiquement

chaque isolat.

270

Une forte différence existe entre T.spiralis et T.pseudospiralis, deux espèces qui diffèrent dans

leur biologie, virulence et spectre d’hôte. L’analyse de deux gènes conservés chez Trichinella

(GST24 et TsSerP) a montré la difficulté d’utiliser ces cibles pour obtenir des différences

génétiques ou antigéniques entre T.spiralis et T.pseudospiralis. Leur faible antigénicité ne

permet pas non plus de différencier les deux espèces par ELISA indirect en utilisant les

protéines ou peptides de synthèse, surtout lors de faible infestation. En revanche, l’analyse

partielle du transcriptome différentiel T spiralis /T pseudospiralis montre l’existence de gènes

nouveaux pour l’espèce T. pseudospiralis qui seront utiles pour le développement de tests

spécifiques d’espèce et pour l’analyse de la diversité intra genre. La poursuite du séquençage

avec une analyse des nouveaux transcrits afin d’identifier les gènes différentiellement exprimés

chez T.pseudospiralis, représente la continuation naturelle de ce travail de thèse.

271

VALORISATION Liste des publications issues de ce

travail

272

PUBLICATIONS INTERNATIONALES

1) Catherine Trap, Baoquan Fu, Franck Le Guerhier, Mingyuan Liu, Danielle Le Rhun,

Thibault Romand, Catherine Perret, Radu Blaga, Pascal Boireau : Cloning et analysis of a

cDNA encoding a putative serine protease comprising two trypsin-like domains of

Trichinella spiralis. Parasitology Research 2006, 98, 288-294

2) Radu Blaga, Benoit Durand, Silvia Antoniu, Calin Gherman, Carmen M. Cretu, Vasile

Cozma et Pascal Boireau A dramatic increase in the incidence of human trichinellosis in

Romania over the last 25 years: impact of political changes et regional food habits

American Journal of Tropical Medecine et Hygiene, in press

3) R.Blaga, B.Durand, A.Stoichici, S.Antoniu, C.Gherman, C.M.Cretu, N.Stefan, V.Cozma et

P.Boireau: Heterogeneity of human trichinellosis et animal Trichinella infection in

Romania: a geographical paradox due to ancestral food habits et political changes,

submitted to Journal of Veterinary Medecine series B

4) R.Blaga, C.Gherman, V.Cozma et P.Boireau: First identification of Trichinella sp. in

golden jackal (Canis aureus) in Romania submitted to Journal of Wildlife Diseases

5) Bahuon Celine, Blaga Radu, Fu BaoQuan, Liu MingYuan, Le Rhun Danielle, Glemarec

Audrey et Boireau Pascal: Isolation, biochemical analysis et localization of a novel

Glutathione S-transferase from Trichinella submitted to Molecular et Biochemical

Parasitology

6) Radu Blaga, BaoQuan Fu, Franck Le Guerhier, Danielle Le Rhun, Evelyne Le Naour,

Audrey Glemarec, MingYuan Liu, Vasile Cozma et Pascal Boireau: Use of the

Mitochondrial Small et Large Subunit Ribosomal RNA genes for the differentiation of four

Trichinella species by multiplex PCR amplification submitted to Journal of Parasitology

273

PARTICIPATION AUX CONGRES INTERNATIONALES

PROCEEDINGS

1. IXth European Multicolloquium of Parasitology, Valencia , Spain, 18-23 July 2004 Pascal Boireau, Isabelle Vallée, Franck Le Guerhier, Radu Blaga, Fu Baoquan, Romel

Hernandez-Bello, G. Ortega Pierres et Liu Mingyuan. Trichinella antigens et immunodominant

epitopes. Proceedings of IX European Multicolloquium of Parasitology – EMOP, Valencia,

Spain, 2004, 181-188

PUBLICATIONS

1. Xth International Congress Of Parasitology, Vancouver, Canada, 4-9 August 2002

Trap Catherine, Fu Baoquan, Le Rhun Danielle, Liu Ming Yuan, Blaga Radu, Perret Catherine

et Boireau Pascal : “Characterisation of a new chimeric serine protease gene of Trichinella

spiralis” dans le livre des résumés p. 97

2. IXth European Multicolloquium of Parasitology, Valencia , Spain, 18-23 July 2004

C.M. Cretu , I.Dida, P.Boireau, R.Blaga, E.Pozio, C.Gherman, V.Cozma : « Epidemiological

aspects of Trichinella infection in humans et animals in Romania » dans le livre des résumes p.

369

3. XIth International Congress of Trichinellosis, San Diego, USA, 10 –15 august 2004

E. Pozio, F. Serrano, P. Dubinsky, W. Cabaj, R. Blaga, I. Dida, D. Christensson, K. Noekler,

G. Marucci et G. La Rosa: “Relationships between Trichinella et host species in Europe.”

dans le livre des résumes p. 27

COMMUNICATIONS ORALES

1. Parasitic Zoonoses Symposium: Importance of the laboratory diagnosis in parasitic

diseases. 12 May, Bucharest, Romania

274

C.Gherman , R.Blaga, V.Cozma, A.Mihalca, P.Boireau: “The incidence of Trichinella spp.

infestation in wildlife carnivores from Romania”

2. Nematode Parasites Symposium : genetic diversity, virulence genes, diagnosis et control

method 26th November, 2004, Maisons-Alfort, France

Blaga R., Le Guerhier F., Cozma V., Le Rhun D., Le Naour E., Boireau P. : “ Molecular

identification of Trichinella pseudospiralis by amplification of the Large Subunit ribosomal

mitochondrial RNA gene”

3. XIth International Congress Of Parasitology, Glasgow, UK, 6-11 august 2006

R. Blaga, B.Fu, F. Le Guerhier, D. Le Rhun, E. Le Naour, A. Glemarec, V. Cozma et

P. Boireau : « Molecular identification of the four European Trichinella species by

amplification of the Small et Large Subunit Ribosomal mitochondrial RNA genes”

POSTERS

1. XIth International Congress Of Parasitology, Glasgow, UK, 6-11 august 2006

R.Blaga, B.Durand, V.Cozma et P.Boireau: “The emergence of trichinellosis in Romania: a

history of food habits”

R.Blaga, B.Durand, S.Antoniu, A.Stoichici, C.Gherman, N.Stefan, V.Cozma et P.Boireau

“Trichinellosis et Trichinella infection in wildlife et domestic animals in Romania”

P. Boireau, P. Macé, C. Lelong , I. Vallée, R. Blaga, M. Varady , P. Dubinsky , O. Huin :

“Automation of the reading et recognition of Trichinella sp after digestion test”

Bahuon C, Blaga R, Glemarec A, Vallee I, Deville S, Le Rhun D, Le Guerhier F,Noeckler K,

Serrano F, Boireau P : “ Evaluation of a 24kDa Glutathione S-Transferase (GST24) of

Trichinella spiralis for diagnosis, vaccine development et characterisati

2. Seminaire « Programmes INRA des génomique animale, végétale et des

microorganismes », Paris, 2-3 décembre 2004

275

R. Blaga, Fu Baoquan, F. Le Guerhier, C. Vivares, Liu Mingyuan, P. Boireau : « Séquençage

des banques d’ADNc des stades Adulte/L1 nouveau née et L1 musculaire de Trichinella

pseudospiralis »

Rapports à diffusion restreinte

1. I. Vallée, R.Blaga, R. Hernandez, JF Fabien, P.Boireau : «Rapport sur la contamination de

deux porcs corse par Trichinella britovi », rapport pour la DGAL, mars 2004

2. I.Vallée, A. Glémarec, R.Blaga, C.Perret, P.Macé, M.Cote, P.Boireau : «Rapport sur la

contamination par Trichinella spiralis d’un sanglier dans le departement du Var », rapport pour

la DGAL, juin 2006

3. I.Vallée, P.Macé, A.Heckman, R.Blaga, C.Perret, P.Boireau : «Rapport sur la contamination

par Trichinella spiralis d’un porc industriel dans le departement du Finistère », rapport pour la

DGAL, janvier 2007

277

ANNEXE Matériels et méthodes

279

1. Matériels

1.1. Données epidemiologiques

1.1.1. Les cas de trichinelloses animales déclarés en

Roumanie

Le nombres des cas de trichinelloses animales/année pour les espèces domestiques et la faune

sauvage soumis à un contrôle à l’abattoir obligatoire a été collecté avec l’aide de l’Institut de

Diagnostique et Santé Animale (IDSA) de Bucarest, Roumanie. La collecte de données s’est

éntendue sur 8 ans, du 1997 à 2004 et comprend les porcs familiaux, les porcs issus d’élevage

hors sol, les sangliers et les ours abattus pendant cette période, pour chacun des 42

départements de la Roumanie.

1.1.2. Cas des trichinellose humaines déclarés en Roumanie

Le nombre de cas de trichinellose humaines/année a été obtenu de la part de l’Institut National

de Statistique Medicale (INSM) de Bucarest, Roumanie, qui est en charge de centraliser de

telles données. L’étude epidemiologique s’étend sur 25 ans, de 1980 à 2004, avec des données

pour chacun des départements de la Roumanie. La définition d’un cas clinique de trichinellose

tombe dans la responsabilité des cliniciens et praticiens hospitaliers (pour plus des détails sur

l’algorithme utilisé voir article 2), l’INSM collectant seulement le nombre des cas de

trichinellose humaines par département par année.

1.2. Matériels biologiques

1.2.1. Collecte des prélèvements biologique

1.2.1.1. Muscle

Des prélèvements des muscles (tibial, intercostaux, piliers diaphragmatique) provenant des

animaux domestiques et de la faune sauvage ont été réalisés entre 2001-2006 sur l’ensemble

des régions de la Roumanie. Les prélèvements des animaux domestiques ont été effectués par

les services vétérinaires départementaux lors de l’abattage, tandis que les prélèvements de la

280

faune sauvage ont été réalisés auprès des chasseurs. 5 à 50 g de tissus ont été collectés pour

chaque exemplaire examiné.

1.2.2. Animaux de laboratoire

Des souris de laboratoire de souche OF1 femelles, âgées d’au moins 3 mois, et des rats de

souche Wistar femelles âgées de 6 mois ont été utilisées pour la conservation des souches de

Trichinella et la collecte du parasite. Des souris femelles Balb/C ont servi à produire des

anticorps polyclonaux contre des protéines recombinantes. Des porcs EOPS German Yorkshire

et des porcs conventionnels ibériques ont servi à obtenir des sérums positifs et négatifs vis à vis

de T. spiralis (ISS004) et T.pseudospiralis (ISS13).

1.2.3. Souches de Trichinella

Les diférentes isolats et espèces de Trichinella utilisés sont décrits dans le tableau 1. Pour le

maintien des souches, des souris femelles OF1 de 3 mois ont été infestées per os avec 300

larves L1 dans un volume de 30 µl d’eau.

1.2.4. Vecteurs et souches bactériennes

Les vecteurs et souches bactériennes utilisés sont mentionnés dans le tableau 12.

1.2.5. Amorces oligonucléotiques utilisées

Les oligonucléotides utilisés ont été synthétisés par Oligoexpress et Proligo. Livrés sous forme

lyophilisée, ils ont été repris dans de l'eau de façon à obtenir une concentration de 20 µM, puis

répartis en fractions aliquotes et conservés à -20°C (tableau 13).

281

Tableau 11. Tableau des différentes espèces de Trichinella utilisées.

Espèces de

Trichinella Identification Espèce hôte Origine

T . spiralis ISS 004 Porc (Sus scrofa) USA (Maryland)

T.spiralis ISS 51 Porc (Sus scrofa) Allemagne

T. spiralis ISS 104 Homme France

T. spiralis ISS 534 Porc (Sus scrofa) Chine (Henan)

T . spiralis ISS 596 Chat (Felis silvestris catus) France

T . spiralis ISS 889 Cheval (Equus caballus) Serbie

T . spiralis ISS 1100 Cheval (Equus caballus) Serbie T . spiralis ISS 1208 Ours brun (Ursus arctos) Roumanie T . spiralis ISS 1329 Renard (Vulpes vulpes) Roumanie T . spiralis ISS 1499 Porc (Sus scrofa) Roumanie T . spiralis ISS 1500 Porc (Sus scrofa) Roumanie T . spiralis ISS 1501 Porc (Sus scrofa) Roumanie T . spiralis ISS 1502 Porc (Sus scrofa) Roumanie T . spiralis ISS 1504 Porc (Sus scrofa) Roumanie T . spiralis N/A Porc (Sus scrofa) Roumanie T . spiralis N/A Porc (Sus scrofa) Roumanie T . spiralis N/A Porc (Sus scrofa) Roumanie T . spiralis N/A Sanglier (Sus scrofa ferus) Roumanie

T . nativa ISS 10 Ours polaire (Ursus maritimus) Norvege

T . nativa ISS 42 Ours polaire (Ursus maritimus) USA (Alaska)

T . nativa ISS 70 Loup (Canis lupus) Russie (Primorsk)

T . britovi ISS 100 Loup (Canis lupus) Italie

T . britovi ISS 137 Renard (Vulpes vulpes) France (Lozère)

T . britovi ISS 235 Porc(Sus scrofa) Italie

T. britovi ISS 1497 Porc(Sus scrofa) France (Corsica)

T. britovi ISS 1572 Renard (Vulpes vulpes) France (Corsica)

T. britovi ISS 1573 Porc (Sus scrofa) France (Corsica)




T. britovi ISS 1577 Porc (Sus scrofa) France (Corsica) T. britovi ISS 1578 Porc (Sus scrofa) France (Corsica) T. britovi ISS 1617 Sanglier (Sus scrofa ferus) France (Var) T. britovi ISS1209 Renard (Vulpes vulpes) Roumanie T. britovi ISS 1210 Loup (Canis lupus) Roumanie T. britovi ISS 1325 Lynx (Lynx lynx) Roumanie T. britovi ISS 1326 Lynx (Lynx lynx) Roumanie T. britovi ISS 1327 Loup (Canis lupus) Roumanie T. britovi ISS 1328 Loup (Canis lupus) Roumanie T. britovi ISS 1330 Chat sauvage (Felis sylvestris) Roumanie T. britovi ISS 1331 Chat sauvage (Felis sylvestris) Roumanie T. britovi ISS 1332 Sanglier (Sus scrofa ferus) Roumanie T. britovi ISS 1444 Loup (Canis lupus) Roumanie T. britovi ISS 1445 Chat sauvage (Felis sylvestris) Roumanie T. britovi ISS 1505 Loup (Canis lupus) Roumanie T. britovi ISS 1506 Chien (Canis lupus familiaris) Roumanie T. britovi ISS 1503 Porc (Sus scrofa) Roumanie

282

T. britovi N/A Sanglier (Sus scrofa ferus) Roumanie T. britovi N/A Chat sauvage (Felis sylvestris) Roumanie T. britovi N/A Loup (Canis lupus) Roumanie T. britovi N/A Sanglier (Sus scrofa ferus) Roumanie T. britovi ISS 1721 Loup (Canis lupus) Roumanie T. britovi ISS 1724 Lynx (Lynx lynx) Roumanie T. britovi N/A Renard (Vulpes vulpes) Roumanie T. britovi ISS 1726 Renard (Vulpes vulpes) Roumanie T. britovi ISS 1727 Renard (Vulpes vulpes) Roumanie T. britovi ISS 1722 Loup (Canis lupus) Roumanie T. britovi ISS 1725 Chacal doré (Canis aureus) Roumanie T. britovi ISS 1723 Loup (Canis lupus) Roumanie

T . pseudospiralis ISS 13 Raton laveur (Procyon lotor) Russie (Caucasus)

T. pseudospiralis ISS 141 Tigre de tasmanie (Dasyurus maculatus) Australie

(Tasmanie) T. pseudospiralis ISS 470 Vautour noir (Coragypus atratus) USA (Alabama)

T. murrelli ISS 35 Ours noir (Ursus americanus) USA (Pennsylvania)

T6 ISS 34 Grizzly (Ursus arctos horribilis) USA (Montana) T. nelsoni ISS 37 Phacochère (Phacochoerus aethiopicus) Tanzanie

T.8 ISS 124 Hyène tachetée (Crotuca crotuca) Afrique du Sud (Kruger)

T.9 ISS 408 Ours noir du japon (Ursus thibetanus japonicus) Japan (Iwasaki, Aomori prefecture)

T. papuae ISS 572 Porc(Sus scrofa) Papua New Guinea (Bula Plain)

T. zimbabwensis ISS 1029 Crocodile du Nil (Crocodylus niloticus) Zimbabwe (Victoria falls)

Tableau 12: Vecteurs et souches bactériennes utilisés.

Vecteurs Cellules hôtes Référence Application

Uni-ZAP XR vecteur/ phagemide vecteur pBluescript II SK(+)

XL1-Blue MRF’ SOLR

Stratagene Construction des banques d’ADNc des L1M, Ad3 et Ad5

ZAP Express vecteur/ phagemide vecteur pBK-CMV

XL1-Blue MRF’ XLOLR

Stratagene Construction de la banque d’ADNc de L1NN

pT-Adv vecteur TOP10F’ Clontech Clonage T/A de produits PCR pour les banques d’ADNc soustractives de L1NN, Ad3 et Ad5

pET28 vecteur Novablue/BL21 (DE3)

Novagen Clonage/Expression

pGEX-4T-1 vecteur

JM105/BL21 Amersham Clonage/Expression

pET102/D- TOPO vecteur

TOP10/BL21star (DE3)

Invitrogen Clonage/Expression

PCRII-TOPO vecteur TOP10 Invitrogen T/A clonage de produits PCR

283

Tableau 13: Liste des oligonucléotides utilisés et leurs applications.

Oligonucléotides Séquences Applications

T3 5’-ATTAACCCTCACTAAAG-3’ pBK-CMV, pBS promoteur T3 T7 5’-ATTACGACTCACTATAG-3’ pBK-CMV, pBS promoteur T3 SSHPCR primer1 5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’ Hybridation Soustractive Nested PCR primer1 5’-CGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’ Hybridation Soustractive Nested PCR primer2R 5’-GCGTGGTCGCGGGCCGAGGT-3’ Hybridation Soustractive FMSSU1 CAACCACACTCTATTCAACGAC Amplification mt-rrnS et mt-rrnL FMSSU2 GGTTAGGTGAGATATTGCCTGC Amplification mt-rrnS et mt-rrnL RMLSU1 GTGTATTGAGTGTCTCTTCGAG Amplification mt-rrnS et mt-rrnL RMLSU2 GGATGGTTTGGCTTTGGTTAG Amplification mt-rrnS et mt-rrnL

GFMitoID TCTTCTGGAAGGAGGACCTA PCR –multiplex mitochondrial GF2MitoID CTAATAATCACAACCTTTTTTGGG PCR –multiplex mitochondrial

GRMitoID ATGCTACCTTTGCACGGTCA PCR –multiplex mitochondrial GR2MitoID GGGTGACGGGCAATATGTGCA PCR –multiplex mitochondrial

FTspMitoID AAACCACTTCTCTCCCCCAA PCR –multiplex mitochondrial FTnaMitoID TACATATTTTATACAATCAC PCR –multiplex mitochondrial

RTbrMitoID GGTTAGTGTAAGTGTCGTTGA PCR –multiplex mitochondrial FTps1MitoID C AACAACACCTCAGCTAAC PCR –multiplex mitochondrial TsGSTPF1 5’-CCTATAAGGGGCTTGGCAGAACCC-3’ PCR clonage

TsGSTPR1 5’-GCCAATTCATCTGGCAACACTTCG-3’ PCR clonage

TsGSTPF2 5’-CACCATGCCACTATACAAGTTG-3’ Expression TsGSTPR2 5’-TCATTTGTTTTCATTCCCATTT-3’ Expression TsSerP Primer1 5’-GCTCATGTTGGGCWKTC-3’ PCR dégénérée clonage TsSerP Primer1 5’-CCAYGAGTTRGCAAYRAKCC-3’ PCR dégénérée clonage

TsSerP SERLIC1 5’-GGTATTGAGGGTCGCTCAAACAGAGT GTCTGGTGGATGG-3’

Expression

TsSerP SERLIC2 5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTAGGCAGA GG AGTCATAAATCTGC-3’

Expression

2.Méthodes

2.1.Préparations du parasite et de l’antigène

2.1.1.Collecte des différents stades de Trichinella

2.1.1.1.Purification des larves L1M

L'extraction des larves L1 infestantes (L1M) de Trichinella a été réalisée selon des conditions

standardisées (Gamble et al., 2000), soit à partir des souris infestées depuis plus de 35 jours et

euthanasiées, soit à partir des prélèvements de muscle collecté sur le terrain. Le principe de

cette extraction repose sur la digestion pepsique des muscles de souris préalablement infestées

284

par Trichinella afin de ne recueillir que les larves L1 infestantes par simple décantation. Les

larves sont alors maintenues en culture (10 000 larves/ml) à 37°C en atmosphère humide

pendant 20 h dans du RPMI 1640 (TechGen) contenant 1% de pyruvate (Sigma), 15% de

sérum de veau foetal (SVF) décomplémenté (Gibco), 1% de L-glutamine (Sigma), de la

pénicilline 100 U/ml et de la streptomycine 100 µg/ml (Gibco). Les larves L1M sont collectées

par une centrifugation pendant 5 min à 700 g ou par décantation.

2.1.1.2.Purification des adultes

Les rats Wistar infestés oralement à 10 000 L1M ont été sacrifiés 3 ou 5 jours après infestation,

afin de collecter des adultes de 3 jours (Ad3) et des adultes de 5 jours (Ad5). Les intestins

grêles prélevés ont été ouverts sur toute la longueur, rincés, puis mis à incuber à 37°C en

solution saline. Après 2 h d’incubation, les parasites ont été récoltés puis lavés plusieurs fois en

PBS.

2.1.1.3.Purification des L1NN

Les adultes collectés à J+6 ont été incubés dans un milieu de culture pendant 24 h pour

permettre l’expulsion des larves nouveau-nées (L1NN). Les L1NN sont récoltés par passage

sur un filtre 45 µm puis sont soumis à une centrifugation de 10 000 g pendant 5 min. L’absence

d’adulte a été vérifiée à la loupe binoculaire pour chaque préparation.

2.1.2.Préparation des antigènes de T. spiralis

2.1.2.1. Antigènes solubles

Les antigènes solubles totaux ont été préparés à partir des parasites collectés précédemment.

Pour celà, les préparations parasitaires ont été soumises à 3 cycles de congélation/

décongélation, puis soniquées 3 fois pendant 5 min à 4°C. L’homogénat a été centrifugé

pendant 1 h à 30 000 g, à 4°C. Le surnageant a été collecté et sa concentration en proteine

soluble a été mesurée à l’aide du kit ProteinAssay ECL (Amersham).

2.1.2.2. Antigènes Excrétion/Secrétion (E/S)

Quelques modifications au protocole décrit précédemment par Gamble et al. (1988) ont été

apportées pour la préparation d’antigène Excrétion/Secrétion (E/S) à partir de larves L1M. Les

285

larves ont été lavées 5 fois en milieu RPMI 1640 additionné de pénicilline (500 U/ml) et de

streptomycine (500 U/ml) avant d’être mises à incuber à la concentration de 5 000 larves/ml à

37°C, en atmosphère contenant 10% de CO2. Le milieu de culture etait du RPMI 1640

supplémenté en 1% glutamine, 1% pyruvate, 250 U/ml de pénicilline et 250 µg/ml de

streptomycine. Après 18-20 h d’incubation, les parasites ont été éliminés par filtration et le

milieu a été récolté. Le milieu a été concentré par le système Ultrafree-CL low binding

cellulose 5000 (Millipore). Les antigènes E/S ainsi obtenus ont été conservés à -80°C après

détermination de la concentration protéique.

2.2.Préparation de sérums

2.2.1.Collecte de sérums

6011 sérums de chevaux provenant des régions à forte prévalence de trichinelloses animales en

Roumanie ont été collectés entre 2002-2004.

2.2.2.Préparation de sérums anti-Trichinella

T. spiralis (ISS004), T. britovi (ISS100), T. nativa (ISS010), T. pseudospiralis (ISS013) ont été

utilisés pour l'infestation de porcs EOPS et conventionnels avec 200, 1 000, 20 000 larves

infestantes. Des prélèvements sanguins ont été réalisés 2 jours avant l'infestation, à 5, 10, 15,

20, 25, 30, 40, 50, 60 jours post infestations. Les sérums ont été obtenus après centrifugation à

2000 g.

2.2.3.Obtention de sérums polyclonaux

Des souris Balb/C ont reçu, par voie sous-cutanée, 50 µg de protéine recombinante mélangée a

part égale avec l'adjuvant Montanide ISA206 (SEPPIC). Une injection de rappel de 50 µg de

protéine recombinante a été administrée à 3 semaines d’intervalle. Les sérums ont été récoltés 3

semaines après le second rappel. Le sérum pré-immun a été prélevé et conservé à -20°C jusqu’à

utilisation.

286

2.3.Méthodes d’extraction et d’analyse des acides

nucléiques

2.3.1. Extraction, purification et analyse des ARN

2.3.1.1..Extraction et purification des ARN totaux

L’ARN total de Trichinella a été extrait selon la méthode décrite par Chomczynski & Sacchi

(1987). Pour celà, les parasites ont été congelés en azote liquide et conservés à -70°C. Ils sont

ensuite resuspendus en solution dénaturante (4 M thiocyanate de guanidium, 25 mM sodium

citrate, pH 7, 100 mM 2-mercaptoéthanol, 0,5% N-laurylsarcosine) et broyés à 4°C en Potter de

Dounce. L’homogénat (1 ml) est ensuite vortexé fortement dans un mélange composé de 0.1 ml

d’acétate de sodium (2 M, pH4), 1 ml de phénol saturé en eau et 0,2 ml de chloroforme-

isoamyl alcool (24:1). Après une incubation de 15 min à 4°C, le mélange est centrifugé 20 min

à 4°C à 12 000 g. L’ARN est précipité par adjonction d’un volume égal d’isopropanol froid,

puis centrifugé pendant 15 min à 4°C, à 12 000 g. Le culot d'ARN est lavé en éthanol à 75%,

séché à l’air, resuspendu en eau traitée au DEPC (diéthylpyrocarbonate) et conservé à –70°C.

2.3.1.2.Purification de l’ARNm

L’ARNm a été purifié à partir de l’ARN total en utilisant le kit poly(A) Quick mRNA Isolation

(Stratagene).

2.3.1.3.Migration de l’ARN en conditions dénaturantes et Northern

blot

Les échantillons d’ARN total sont dénaturés pendant 5 min à 60°C, puis séparés en gel

d’agarose dénaturant à 1,2%, contenant du formaldéhyde 0,7 M en MOPS. La présence d’ARN

est visualisée sous UV et photographiée. Le gel est placé pendant 15 min dans de l’eau distillée

puis est ensuite transféré dans du SSC 20X. Le gel est posé au dessus de papiers filtres dans

l’appareil de transfert. La membrane de nylon Hybond-N (Amersham), préalablement

humectée dans du SSC 20X, est mise sur le gel et recouverte d’une épaisseur de papier

Whatman. Une épaisseur de papier absorbant placée au dessus du papier Wattman reçoit une

masse d’environ 500 g. L’appareil de transfert est rempli de SSC 20X. Le transfert par

287

capillarité s’effectue pendant une nuit à température ambiante. A la fin du transfert, l’ARN est

fixé à la membrane de nylon par exposition aux UV (Stratalinker, Stratagene). Une

préhybridation de 2 h en tampon d’hybridation (SSC 5X, solution de Denhardt’s 5X, SDS

0,5%, formamide 50% et ADN de sperme de saumon dénaturé 20 µg/ml) précède l’hybridation

à 42°C toute une nuit avec la sonde radioactive. Les membranes sont ensuite lavées 2 fois

pendant 15 min à température ambiante en SSC 2X, SDS 0,1% puis 2 fois pendant 15 min à

65°C en SSC 0,1X, SDS 0,1% avant d’être exposées au film X-ray pendant 3 jours à –80°C.

2.3.2.Extraction, purification et analyse de l’ADN

2.3.2.1. Extraction de l’ADN génomique

L’ADN génomique de T. spiralis a été isolé à partir de larves L1M à l’aide du kit DNeasy

Tissue Isolation (Qiagen).

2.3.2.2.Extraction de l’ADN plasmidique

L’ADN plasmidique a été extrait à l’aide des kits « Mini/Midi/Maxi QIAGEN plasmid »

(Qiagen).

2.3.2.3.Extraction de l’ADN avec des membranes DEAE cellulose

La membrane DEAE de cellulose (Schleicher et Schuell) est chargée positivement. On

l’introduit dans le gel d’agarose au cours de la migration, ce qui conduit l’ADN (chargé

négativement) à migrer au sein, de la membrane et à se fixer. On recueille l’ADN après la

migration en plongeant la membrane dans un liquide d’élution.

La membrane DEAE cellulose est découpée à la taille du fragment d’ADN à extraire, avec

quelques millimètres de plus de chaque côté. On équilibre ensuite la membrane pendant 5 mn

dans de l’EDTA 10 mM, puis 5 mn dans du NaOH 0,5N. Six lavages sont effectués dans de

l’eau. La membrane est placée verticalement dans le gel, à l’endroit où l’on a fait une incision,

c’est à dire juste après la bande d’ADN fluorescente aux UV. La migration est ensuite

poursuivie pour permettre le transfert de l’ADN dans la membrane. La membrane est ensuite

rincée dans 50 mL de tampon de faible salinité (2.5 mL de Tris HCl 1M, 1.5 mL NaCl 5M et 1

mL d’EDTA 0.5M). L’ADN est élué dans 1 mL de tampon riche en sel (2.5 mL de Tris HCl

1M, 10 mL de NaCl 5M et 1 mL d’EDTA 0.5M), pendant 30 minutes à 65°C.

288

L’ADN est ensuite purifié avec un mélange volume à volume de phénol/chloroform saturé en

Tris-EDTA, puis précipité en éthanol en présence d’acétate de sodium 3M pH=5.2 à –20°C

pendant 12 h. Après centrifugation le culot est ensuite rincé avec de l’éthanol à 70%, puis séché

avant d’être resolubilisé dans de l’eau et quantifie.

2.3.2.4. Digestion de l’ADN génomique et Technique de Southern

blot

L’ADN génomique de Trichinella a été digéré par diverses endonucléases de restriction une

nuit à 37°C puis séparé sur un gel à 0,8% d’agarose. A la suite de l’électrophorèse, l’ADN est

observé sous UV puis photographié. Après dénaturation et neutralisation, le gel est placé sur

une épaisseur de papier dans l’appareil de transfert. La membrane de nylon Hybond N+

(Amersham) trempée au préalable dans du SSC 20X est placée directement sur le gel puis

l’équivalent de deux centrimetres de papier Whatman sont placés au dessus de la membrane.

Du papier absorbant est posé sur l’ensemble. Le transfert est facilité par la pose d'une charge

d’environ 500 g sur le papier absorbant. Le transfert par capillarité s’effectue en SSC 20X, à

température ambiante pendant toute la nuit. L’ADN est fixé à la membrane de nylon sous UV

(Stratalinker, Stratagene). La membrane est mise en hybridation une nuit à 55°C avec la sonde

marquée à la phosphatase alcaline. Ensuite, la membrane est lavée en conditions stringentes, le

CDP-star (Amersham) est ajouté sur la membrane. L’exposition au film X-ray est réalisée

pendant 1 h à température ambiante.

2.3.2.5.Préparation de sondes nucléiques

2.3.2.5.1.Préparation de sondes d’ADN radioactives

Des sondes d’ADN radiomarquées ont été préparées à l’aide du kit «Rediprime II»

(Amersham). 25 ng d’ADN sont dénaturés dans 45 µl de tampon TE pendant 5 min dans l’eau

bouillante. Après dénaturation, l’ADN est placé 5 min dans de la glace, puis centrifugé

brièvement à 4°C. L’ADN dénaturé est alors mélangé au tube réactionnel auquel on ajoute 5 µl

de 32P dCTP (Amersham). La réaction de marquage est incubée à 37°C, puis est stoppée à

l’aide d’EDTA 0,2 M. Lors de l’hybridation, il convient de dénaturer puis de placer l’ADN

marqué dans la glace.

289

2.3.2.5.2. Préparation de sondes d’ADN marquées à la phosphatase alcaline

Les sondes d’ADN marquées à la phosphatase alcaline ont été réalisées à l'aide d’un système

« Alk Phos direct labelling et detection » (Amersham). 10 ng d’ADN sont ajoutés à 10 µl

d’H2O, puis dénaturés 5 min dans l’eau bouillante. L’ADN dénaturé est ensuite placé 5 min

dans de la glace puis centrifugé brièvement à 4°C. 10 µl de tampon de réaction sont ajoutés à

l’ADN dénaturé froid et mélangés. 2 µl de la solution de « cross-linkage » sont ajoutés.

L’incubation du tube réactionnel est de 30 min à 37°C. La sonde marquée peut être utilisée

immédiatement ou conservée à -20°C.

2.3.2.5.3. Préparation de sondes d’ADN marquées à la digoxigénine

Les sondes d’ADN marquées à la digoxigénine (DIG) ont été préparées avec le kit « DIG high

prime DNA labeling et detection starter » (Roche). Jusqu’à 3 µg d’ADN sont ajoutés à 16 µl

d’H2O, puis dénaturés 10 min dans l’eau bouillante. L’ADN dénaturé est ensuite placé 5 min

dans de la glace pilée et centrifugé brièvement à 4°C. 4 µl de DIG-High prime sont ensuite

ajoutés à l’ADN froid et incubés 16 h à 37°C. La réaction est stoppée à l’aide d’EDTA 0,2 M.

La sonde marquée peut être utilisée immédiatement, ou conservée à -20°C.

2.4.PCR et RT-PCR Les amorces d’oligonucléotides ont été synthétisées par Oligoexpress. A la réception, les

amorces sont dissoutes en eau stérile à la concentration de 20 µM et stockées à -20°C. Une

réaction PCR standard de 50 µl comporte 5 µl de tampon PCR 10X (Tris HCl 10 mM pH 8,3;

KCl 50 mM; MgCl2 1,5 mM; gélatine 0,01% w/v), 1 µl de dNTP 10 mM, 1 µl de Taq

polymérase (1U/µl) (Promega), 1 µM de chaque amorce et de 10 à 100 ng d’ADN. Le

programme standard choisi est le suivant: Dénaturation : 94°C 1 min; Hybridation : 55°C 1

min; Synthèse : 72°C 1 min (35 cycles). Les produits PCR sont analysés en gel d’agarose à 1%

contenant 0,5 µg/ml de bromure d’éthidium (BET). Les produits PCR sont purifiés à l’aide du

kit QIAquick PCR purification (Qiagen). Les RT-PCR sont réalisées à parti de l'ARNm de

Trichinella à l’aide des kit Access RT-PCR (Promega).

290

2.5. Clonage d’un fragment d'ADN dans un vecteur

plasmidique

2.5.1. Préparation du vecteur plasmidique et insertion

d'ADN

Le vecteur plasmidique et produit de PCR sont digérés par des enzymes de restriction, puis

séparés par électrophorèse en gel d’agarose. Les bandes d’intérêt sont ensuite découpées à

partir du gel sous UV, puis purifiées, grâce au kit "Qiaquick Gel Extraction "(Qiagen).

2.5.2. Ligature et transformation

2.5.2.1. Ligature

L'ADN ligase du bactériophage T4 catalyse la formation de liaisons phosphodiester entre les

extrémités 3' OH et 5' P de fragments d'ADN. Elle est utilisée pour joindre des fragments

d'ADN présentant soit des extrémités cohésives soit des extrémités franches. La ligature

s'effectue dans un volume de 20 µl en présence de tampon ligase (Tampon ligase 10X: Tris pH

7,6, 0,66 M; MgCl2 66 mM; DTT 0,1 M), d'ATP (1 mM), l'insert d'ADN (50 à 100 ng), du

vecteur (10 à 100 ng), d'ADN ligase de T4 (Boehringer) (0,5 unité si les extrémités sont

cohésives, 5 unités si les extrémités sont franches). L'incubation a lieu à 12°C pendant 16

heures.

2.5.2.2.Transformation des bactéries par un plasmide.

2.5.2.2.1.Méthode chimique

Obtention de bactéries compétentes (Hanahan, 1985)

Dans un erlenmeyer de 200 ml, 30 ml de milieu SOB (bactotryptone 2%; extrait de levure

0,5%; NaCl 0,05%) supplémenté en MgCl2 20 mM sont ensemencés avec 0,3 ml d'une

préculture d'une souche d'E. coli.(Tableau 12) La suspension bactérienne est incubée à 37°C

jusqu'à l'obtention d'une DO égale à 0,5. L'erlenmeyer est alors placé 10 mn dans de la glace

fondante. Puis la culture bactérienne est centrifugée 12 mn à 2000 tr/mn à 4°C. Le culot

bactérien est repris dans 1/3 du volume initial, dans du tampon TFB à 0°C (4-morpholine

291

éthane sulfonate de potassium pH 6,1, 10 mM; RbCl 100 mM; MnCl2 45 mM; CaCl2 10 mM

et chlorure d'hexamine de cobalt 3 mM) puis laissé 10 mn sur de la glace fondante avant d'être

centrifugé comme précédemment. Le culot est repris dans 1/12,5 du volume initial de tampon

TFB à 0°C. Ensuite sont ajoutés successivement 84 µl de DMSO, puis après 5 mn, 84 µl de

DTT 2,25 M et enfin après 10 mn, 84 µl de DMSO. Les cellules sont utilisées après 5 mn de

latence à 0°C.

Transformation

L'ADN ligaturé est transfecté en utilisant 200 µl de cellules compétentes préparées selon la

méthode de Hanahan. Le témoin "cellules compétentes" est réalisé en ajoutant aux cellules à

tester 1 ng de plasmide. La ligase est contrôlée (témoin ligature) en utilisant dans le mélange

réactionnel de ligature 200 ng de vecteur linéarisé. Le témoin "déphosphorylation" est réalisé

dans les mêmes conditions que précédemment mais en prenant 200 ng d'un vecteur linéarisé et

déphosphorylé.

Après 10 mn dans la glace fondante les bactéries subissent un choc thermique de 2 mn à 42°C

puis sont remises à 0°C avant d'être reprises en suspension dans 800 µl de milieu L. Après 1 h

d'incubation à 37°C les bactéries sont étalées à raison de 200 µl par boîte de Pétri sur du milieu

L gélosé additionné de l'antibiotique adéquat (cf. tableau 2). Les clones apparaissent après 12 à

24 h d'incubation à 37°C.

2.5.2.2.2.Electroporation

Préparation de bactéries compétentes

Les bactéries sont dîtes compétentes pour l’électroporation lorsqu’elles sont conservées dans

un milieu ni trop alcalin, ni trop salin, et qu’elles sont aptes à être transformées. Pour préparer

ces bactéries, il faut la veille au soir ensemencer 50 mL de milieu SOB (sans Mg 2+ ) avec une

culture saturée de DH5α conservée en glycérol. Le lendemain on ensemence 0.5 mL de la

culture précédente dans 500 mL de SOB (sans Mg 2+ ) placé dans l’incubateur agitant à 37 °C,

jusqu’à obtenir une DO de 0.7 à 0.8 (phase exponentielle de la croissance bactérienne) à une

longueur d’onde de 600 nm, de la culture. Trois lavages successifs sont réalisés par

centrifugation dans de grands volumes d’eau bi distillée. Les bactéries sont réparties en fraction

aliquotes à raison de 200 µL par tube en présence de 20 % de glycérol stérile à –70°C.

292

Electroporation des bactéries compétentes

80 µL de bactéries compétentes sont mélangée avec 20 ng d’ADN pendant 2 minutes dans de

la glace pilée, puis le mélange est placé dans des cuves à électroporation stérilisées. Après

électroporation 1 mL de SOC est ensuite rapidement introduit dans chaque cuve puis

l’ensemble est laissé 5 mn dans de la glace. La cuve est placée dans l’incubateur agitant 1 heure

à 37 °C. Pour sélectionner les bactéries transformées, la suspension bactérienne est étalée sur

un milieu LB Agar, avec Ampicilline à 50 µg/µL-1.

2.6. Construction de banques d’ADN complémentaires Les banques d’ADNc λZAP II des stades L1M, Ad3 et Ad5 de T. pseudospiralis et T.spiralis

ont été réalisées selon les instructions du fabricant à l’aide des kits ZAP-cDNA synthesis kit et

ZAP-cDNA gigapack III Gold Cloning (Stratagene). La banque d’ADNc λZAP express du

stade L1NN a été realisée à l’aide des kits ZAP express cDNA synthesis kit et ZAP express

cDNA gigapack III Gold Cloning (Stratagene).

Brièvement, après dénaturation thermique de l’ARNm de Trichinella, celui ci est mis en

présence d’une transcriptase inverse (Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase),

d’une amorce poly dT contenant la séquence du site de restriction reconnue par Xho I, ainsi que

des quatre désoxyribonucléotides, dont le dCTP méthylé. Le premier brin d’ADNc est donc

synthétisé. De plus ces dCTP méthylés lui confèrent une protection contre l’enzyme Xho I

utilisée ultérieurement lors de l’établissement de la banque. La synthèse du deuxième brin

d’ADNc est obtenue par l’action conjointe de deux enzymes. Tout d’abord la RNase H qui

provoque l’hydrolyse ménagée de l’ARN libérant les extrémités 3’OH du brin servant ainsi

d’amorce pour la synthèse du second brin d’ADNc. Cette synthèse s’effectue grâce à l’action

d’une deuxième enzyme, l’ADN polymérase I qui utilise donc les amorces d’ARN pour

synthétiser le second brin, avant de les détruire. Une troisième enzyme, la Pfu ADN

polymérase, est utilisée en complément de l’ADN polymérase I. Celle ci va permettre d’obtenir

des bouts francs aux extrémités du brin ainsi que de réparer et de combler les trous laissés par

l’ARN polymérase I.

Cet ADNc double brin est ensuite mis en présence des adaptateur Eco RI qui grâce à l’action

enzymatique de l’ADN ligase du phage T4 ont étre liés aux extrémités de l’ADNc. Ces

adaptateurs sont non phosphorylés, pour éviter qu’il y ait formation de concatémères « Eco RI-

293

Eco RI ». Après inactivation de la ligase, l’ADN est mis en présence de la kinase

polynucléotide T4 afin que les adaptateurs soient phosphorylés, puis d’une enzyme de

digestion Xho I. De cette façon, l’insertion des fragments d’ADNc dans le vecteur phagique

λZAP II est orientée.

Les banques d’ADN sont ensuite titrées. Le titrage représente la première validation du travail

réalisé. D'autre part, il permet de connaître la quantité de phages recombinants que l’on va

amplifier. Une fois titrées on amplifie les banques en infectant des bactéries (XL1-Blue MRF’)

par les phages recombinants. On collecte ensuite les banques que l’on stocke. Les banques

amplifiées sont de nouveau titrées.

Cette manipulation nous permet d’obtenir à partir de banques phagiques, des banques d’ADNc

plasmidiques. Cela permet de manipuler plus facilement les banques d'ADNc.

L’excision se réalise en infectant simultanément des bactéries XL1-Blue MRF’ avec les phages

recombinants (λZAP II) et un phage auxiliaire de type filamenteux qui possède les protéines

nécessaires à l’excision du plasmide pBluescript SK ou pBK-CMV. Ce phage auxiliaire

possède une mutation ambre qui l’empêche de se répliquer. Mais les bactéries XL1-blue MRF’

possèdent le gène qui supprime cette mutation. Ainsi, après pénétration des deux phages dans

les bactéries, les protéines du phage auxiliaire reconnaissent l’origine de réplication des phages

f1 située aux extrémités du plasmide pBS SK ou pBK-CMV et une endonucléase coupe les

deux brins d’ADN des phages λZAP II. La synthèse du brin positif est ensuite initiée au niveau

du site de coupure et s’achève au site de terminaison. Ces brins néo synthétisés sont ensuite

répliqués, circularisés et encapsidés à l’aide du phage auxiliaire. Ces nouveaux phages obtenus

ont une forme réplicative de type plasmidique: ce sont des phagémides.

Les bactéries tuées par chauffage libèrent les phagémides recombinants sous forme de

particules filamenteuses. Les plasmides recombinants sont ensuite amplifiés en infectant les

bactéries SOLR ou XLOLR, bactéries dans lesquelles le phage auxiliaire est défectif pour la

réplication. Il ne possède pas de site de reconnaissance du phage λZAP II. Une extraction de

l’ADN plasmidique à partir des bactéries SOLR ou XLOLR transfectées, suivie d’une

purification sur colonne, permet d’obtenir la banque sous forme plasmidique.

294

2.7. Identification des gènes spécifiques de

T.pseudospiralis

2.7.1. Construction des banques d’ADNc soustractives des

stades L1M T.spiralis vs T.pseudospiralis et T.pseudospiralis

vs T.spiralis

La construction des banques d’ADNc soustractives de stade L1M a été réalisée selon les

recommandations techniques de Clontech avec le kit «PCR Select cDNA Subtraction» (Figure

9). La synthèse des différents ADNc a été réalisée à partir de 2 µg d’ARNm de L1M de

T.spiralis et respectivement T.pseudospiralis. Brièvement, l’ADNc du stade L1M de T.spiralis

est considéré comme ADNc dit “Tester”, et le stade L1M de T.pseudospiralis est considéré

comme le “Driver” et viceversa. Deux adaptateurs nucléiques 1 et 2R ont été séparément

ligaturés à l’ADNc “Tester” pour former les molécules dites «Tester1» et «Tester2R». Un

premier tour d’hybridation moléculaire a été opéré en mélangeant l’ADN “Tester1” avec de

l’ADNc “Driver” préalablement dénaturé. Il en a été de même avec l’ADNc “Tester2R”. Une

seconde étape d’hybridation a été réalisée en mélangeant les 2 solutions précédentes avec à

nouveau de l’ADNc Driver préalablement dénaturé. Une première PCR dite PCR de

suppression a ensuite été réalisée afin d’amplifier de façon exponentielle les seules molécules

d’ADNc possédant des adaptateurs différents à chaque extrémité et correspondant donc à des

séquences exprimées différentiellement au stade L1NN. Une fraction du produit de cette PCR a

finalement servi de matrice pour une seconde PCR (PCR nichée) afin d’amplifier suffisamment

de molécules d’ADNc exprimées de façon différentielle. La banque d’ADNc soustraite a été

clonée dans le vecteur pT-Adv («AdvanTAge PCR cloning kit») selon le protocole du fabricant

(Clontech). Les bactéries E. coli Top 10F ont ensuite été transformées par les produits de

ligature, puis sélectionnées sur gélose ad hoc.

295

2.7.2. Criblage différentiel des banques d’ADNc

soustractive de stades L1M de T. spiralis et T.pseudospiralis

Le criblage différentiel a été réalisé en utilisant le kit «Differentially Screening kit» selon les

recommandations du fabricant (Clontech). Brièvement, des colonies recombinantes choisies au

hasard ont été cultivées en milieu ad hoc, puis deux empreintes de leur ADN plasmidique ont

été réalisées sur des membranes de nylon Hybond N+ (Amersham). Chaque membrane a

ensuite été hybridée avec une sonde radiomarquée spécifique du stade soustrait (sonde directe)

et une sonde spécifique de la partie complémentaire soustraite (sonde reverse). L’ADN

plasmidique d’un clone bactérien recombinant ayant hybridé avec la seule sonde directe est

considéré comme porteur probable d’ADNc de Trichinella exprimé spécifiquement au stade

L1NN ou Ad. Les clones bactériens sont cultivés pour réaliser une préparation d’ADN

plasmidique («Qiaprep, miniprep») selon les recommandations du fabricant (Qiagen). Les

séquençages ont été effectués par Qiagen.

2.7.3. Confirmation des spécificités d’espèces des clones

issus des banques d'ADNc soustraites

La spécificité d’espèces des clones a été confirmée par hybridation spécifique de l'ADN

plasmidique des banques d'ADNc. Les ADN plasmidiques de banque des stades L1M de T.

spiralis et T.pseudospiralis ont été digérés avec EcoRI et XhoI et séparés sur gel d'agarose à

0,8%. Après électrophorèse, les ADN ont été transférés sur membrane Hybond N+

(Amersham) par capillarité, puis hybridés avec une sonde radioactive d'ADNc.

2.7.4. Criblage des banques d’ADNc de T. pseudospiralis à

l'aide de sondes nucléiques

A dessein de reconstruire le cadre ouvert de lecture d’un gène d’intérêt, une sonde nucléique a

été marquée à la DIG et le criblage d’une banque d’ADNc phagique a été réalisé avec le kit

«DIG High Prime DNA labeling et Detection Starter kit I» selon les recommandations du

fabricant (Roche).

296

Première hybridation moléculaire, préparation de l’ADNc double brin digéré par RsaI

Figure 28: Description simplifiée de l’hybridation soustractive (SSH). En bleu sont représentés

les brins d’ADN cible à soustraire. En vert l’ADNc du stade L1M qui est mis en excès. On a

pris soin préalablement d’ajouter deux oligonucléotides différents à deux lots séparés d’ADN

cible. Seul est amplifié l’ADN ayant les deux oligonucléotides différents en final.

Mélange

Seconde hybridation avec L1M en excés préparé extemporanément Remplissage des extrémités 3’ terminales

Amplifications avec et

L1M en excés

L1M Ts L1M Tps

+

297

2.9. Analyses des séquences nucléotidiques et des

séquences déduites en acides aminés

Des études d’homologie ont été réalisées en utilisant le logiciel BLAST (Altschul et al., 1997;

Bork et al., 1997) sur le site de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Les alignements de

séquences multiples ont été réalisés à l’aide du logiciel Multalin (Corpet, 1988) sur le site de

l’INRA de Toulouse (http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/). Le logiciel SignalP (Nielsen et

al., 1997) a été utilisé pour la recherche de peptides signaux à partir de séquences d’acides

aminés (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP). Les recherches de domaines dans les

séquences protéiques ont été réalisées à l’aide du logiciel SMART (Schultz et al., 1998)

(http://smart.embl-heidelberg.de/smart).

2.10. Méthodes d'analyse des protéines

2.10.1. Expression procaryote et purification d’antigènes

recombinants

Les bactéries E. coli BL21Star (DE3), BL21(DE3) et BL21 ont été transformées par le

plasmide recombinant pour l’expression protéique induite par IPTG. L’expression des

protéines de fusion a été observée par marquage au bleu de Coomassie après séparation

dénaturante SDS-PAGE (Laemmli, 1970) Les protéines de fusion ont été purifiées en

conditions dénaturantes par affinité au Ni-NTA (Ni-NTA spin columns kit; Ni-NTA beads)

selon les recommandations du fournisseur (Qiagen).

2.10.2. Analyse par transfert de Western des antigènes

recombinants

Les protéines séparées par SDS-PAGE ont été électro-transférées sur des membranes Hybond P

PVDF suivant les instructions du fournisseur (Amersham). Les membranes ont été pré-

hybridées pendant 1 h en TBS-T (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween20 0,1%) et

5% de lait écrémé. Après 2 lavages en TBS-T pendant 1 min, puis 3 lavages en TBS-T pendant

5 min, les membranes ont été incubées pendant 1 h avec les sérums de porc dilués au 1/200 en

298

TBS. Après lavages, les membranes ont été incubées pendant 20 min avec l’anticorps

secondaire de lapin anti-IgG de porc marqué à la phosphatase alcaline (A1192, Sigma) dilué au

1/30 000, puis avec le substrat NBT/BCIP (E116, Interchim) pur pendant 30 min pour la

révélation du marquage.

2.10.3. Immunofluorescence indirecte

Les larves L1M ou adultes sont lavés 2 fois avant d'être inclus dans le TissueTek (Miles

Scientific) et congelés à -20°C. Après avoir été fixées dans l'acétone, les coupes sont incubées

1h avec l'anticorps primaire de souris dilué au 1/100 dans le tampon de lavage PBS pH7.4,

Tween 20 0.1%. Après 3 lavages de 5 min chacun, les coupes sont incubées 1h avec l'anticorps

de chèvre anti-immunoglobuline de souris, marqué à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC)

(Biosys, KPL) et dilué au 1/50 dans la solution de lavage. L'excès d'anticorps marqués FITC est

éliminé par 3 lavages. Les coupes sont colorées au Bleu Evans avant d'être examinées sous un

microscope à épifluorescence.

La coloration des noyaux des cellules de Trichinella a été réalisée avec le colorant de Hoechst

(bis-benzimide-Sigma) dilué à 0.5µg/ml. Après une incubation de 15 minutes avec le colorant,

les coupes sont lavées par du PBS puis sont visualisées sous un microscope à épifluorescence

en lumière bleue.

2.10.4. Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay (ELISA)

2.10.4.1. ELISA utilisant l’antigène E/S des L1M de Trichinella ou

des protéines de recombinantes

L’étape de la fixation des différents antigènes s’effectue sur des microplaques non prétraitées à

la streptavidine, pendant 2h à 37°C. La concentration d’antigène adsorbé à la surface des puits

est pour l’Ag E/S de 1,25 µg/ml en PBS 1X, et de 100 µg/ml en 15 mM Na2CO3, 34.8 mM

NaHCO3 pour les protéines recombinantes rTsGST24. La plaque ELISA est ensuite laver 3 fois

(PBS 1X, Tween 20 à 0,05%) avant d’être saturer à température ambiante, pendant 1 h, avec

une solution de lait écrémé dilué à 2 % dans la solution de lavage. 100 µl de sérum de porc

dilué au 1/20 dans la solution de dilution 2 sont ensuite déposés dans chaque puits. Après 30

min d’incubation à 37°C, la plaque est lavée 3 fois, puis sont déposés 100 µl/puits de la

solution de conjugué (protéine G-peroxidase (P-8170, Sigma) dilué au 1/32000 dans la solution

299

de dilution 1. Après 30 min d’incubation à 37°C, la plaque est lavée 3 fois, puis 100 µl d’une

solution de substrat 3,3’,5,5’ tetramethylbenzidine-hydrogen peroxide (TMB 3) sont déposés.

Au terme de 20 min d’incubation à température ambiante dans le noir, 100 µl/puits d’une

solution d’arrêt (H2SO4 0.5 M) sont ajoutés. La lecture des densités optiques s’effectue à 450

nm.

301

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333

Geographical and genetic variability within Trichinella

genus: study case of a high endemic area

Abstract

With an incidence of 51.0 cases per 106 persons per year of trichinellosis et a prevalence

of 8 cases/104 tested animals for pigs, 9 cases/103 for wild boars, 13,1 cases/102 for bears,

Romania represents the country with the most extensive Trichinella infection in the world.

Geographical comparison of human trichinellosis incidence data with animal Trichinella

infection prevalence figures suggests that, in Romania, it is the local populations’s food habits,

combined with the exhaustiveness of the food safety controls that are the main determinants of

the geographic variations of human trichinellosis incidence rate. During the numerous field

studies, only two species of Trichinella have been identified in Romania: T.spiralis et T.britovi.

Various investigations in the domestic et wildlife animals attempted to identify a third species:

Trichinella pseudospiralis that was not formerly described up to date in Romania.

In the second part of the work the variability within the Trichinella genus was explored,

focusing on the genetic differences between Trichinella spiralis as a prototype et Trichinella

pseudospiralis, the most genetically drifted away species of the genus. Two families of genes

were analysed, due to their important biological functions for nematodes: an enzyme involved

in the redox processes (the glutathion S transferase) et a serine protease presenting a double

catalytic domain (TsSerP). The analysis of the two genes showed the difficulty of identifying

genetic or antigenic targets for a distinction between species of the same genus. Their weak

antigenicity does not allow any differentiation between Trichinella species by means of indirect

ELISA (especially in case of weak infestation). The size of tsgst24, the number of intron of

SerP does not allow neither the setting up of a differential PCR test sufficiently sensitive

(unique copies of the gene) et robust. It was therefore necessary in order to obtain a simple

marker capable of differentiating the four European species of Trichinella, to study an easily

amplifiable gene presenting a better genetic variability. The mitochondrial DNA was taken as a

target since partial results showed a good distinction between T spiralis et T britovi. A PCR

based method using the mitochondrial ribosomal DNA was established as a sensitive et

reproducible method for typing the four Trichinella species of Eurasia.

The conserved genes could have contain highly antigentic epitopes, but in the two

examples that we have explored (the serine protease et GST24) no major antigenic site was

334

identified in order to establish an indirect ELISA differentiating the different species of

Trichinella. A second strategy to obtain differential targets was to obtain a subtractive cDNA

library by means of subtractive suppression hybridisation (SSH) of the two genetically drifted

away species of Trichinella. No species-specific gene was isolated by this approach. The

analysis of the differential transcriptome of T spiralis /T pseudospiralis was rendered possible

by sequencing 10.000 EST coming from different cDNA libraries of T pseudospiralis. 21% of

the ESTs represents new sequences which were not found in the EST database of T.spiralis,

while 9% of the ESTs represents sequences without homology neither in the GenBank nor in

any other database. The SSH technique have proved to be a useful method for the

identification of stage-specific genes while it SSH showed poor results in identifying species-

specific genes within the Trichinella genus. The analysis of the first results of sequencing of

cDNA libraries of T.pseudospiralis show the presence of new genes for this species, that will

be useful for the development of a specific test as well as the analysis of intra-genus genetic

variation.

Keywords: Trichinella, Romania, epidemiology, mitochondrial RNA, GST, specific genes,

genetic variability, sequencing

335

RESUME La première partie du travail a concerné l’analyse de la dispersion de Trichinella en Roumanie prise comme région à forte endémicité. Avec une incidence de 51 cas de trichinellose par million de personnes par an et une prévalence de 8 cas d’infection à Trichinella pour 10 000 porcs testés, 10 cas pour 1000 sangliers testés et 10 cas pour 100 ours testés, la Roumanie reste le pays avec la plus forte infestation à Trichinella au monde. La comparaison géographique de l’incidence de la trichinellose humaine avec la prévalence de l’infection à Trichinella chez les animaux suggèrent fortement l’influence d’habitudes alimentaires contrastées des populations locales sans exclure toutefois des manquements grâves dans les contrôles sanitaires. La multiplicité des espèces sévissant dans le temps et l’espace dans ce pays a été analysée. Au cours des multiples enquêtes décrites seules deux espèces de Trichinella ont pu être identifiées en Roumanie chez plusieurs espèces hôtes sauvages ou domestiques : T.spiralis et T.britovi. Des enquêtes diverses dans la faune sauvage et domestique ont tenté d’identifier une troisième espèce : Trichinella pseudospiralis qui n’a pas été décrite formellement à ce jour en Roumanie. La seconde partie du travail s’est intéressée à la variabilité au sein du genre Trichinella en se focalisant fortement sur les différences génétiques entre Trichinella spiralis prise comme espèce prototype et Trichinella pseudospiralis, espèce la plus éloignée du genre. Deux familles de gènes ont été analysées compte tenu de leur importance dans les fonctions biologiques de nématodes : une enzyme impliquée dans les phénomènes redox (la glutathion S transférase) et une sérine protéase ayant un double domaine catalytique (TsSerP). L’analyse de deux gènes a montré la difficulté d’utiliser ces cibles pour obtenir des différences génétiques ou antigéniques entre espèces du genre. Leur faible antigénicité ne permet pas de différencier par ELISA indirect en utilisant les protéines ou peptides de synthèse différentes espèces de trichine infestantes (surtout lors de faible infestation). La taille de tsgst24, le nombre d’intron de SerP ne permettent pas de mettre en place un test PCR différentiel suffisamment sensible (gène en copie unique) et robuste en utilisant ces deux cibles. Il était donc nécessaire dans le but d’analyser et de mettre en évidence un marqueur simple différenciant les quatre espèces européennes de Trichinella, d’étudier un gène ayant une meilleure variabilité génétique, facilement amplifiable. L’ADN mitochondrial a été pris comme cible puisque des résultats partiels montraient une bonne distinction entre T spiralis et T britovi. La méthode de PCR basée sur l’amplification de l’ADN ribosomal mitochondrial a été établie comme méthode de typage sensible et reproductrice pour l'Eurasie afin d’identifier les quatre espèces de Trichine existantes. Une seconde stratégie pour obtenir des cibles différentielles était d’obtenir des banques soustractives (SSH) pour deux espèces éloignées sur le plan de la conservation des nucléotides pour le genre Trichinella. Aucun gène spécifique d’espèce n’a pu être isolé par cette approche. L’analyse du transcriptome différentiel T spiralis /T pseudospiralis a été rendue possible par le séquençage des 10.000 EST issues de différente banques d’ADNc de T

pseudospiralis. 21% des EST représentent des séquences nouvelles n’étant pas retrouvées dans la banque d’EST de T.spiralis, alors que 9% des contigs représentent des séquences sans homologie ni dans GenBank ni dans les banques d’EST. La technique de SSH est utile pour l'identification des gènes spécifiques de stade de Trichinella mais elle a montré ses limites pour l’identification des gènes spécifiques d’espèce dans le genre. En revanche l’analyse des premiers résultats de séquençage des banques d’ADNc de T.pseudospiralis ont montré l’existence de gènes nouveaux pour cette espèce qui seront utiles pour le développement de test spécifique d’espèce et pour l’analyse de la diversité génique intra genre. Mots clés : Trichinella, Roumanie, épidémiologie, ADN mitochondrial, GST, gènes spécifiques, variabilité génétique, séquençage

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