Norllle MarocaineNM ISO 7402

2002

Indice de classement NM 08.0.106

Microbilogie

Directives générales pour le dénombrementsans revivification des Enterobacteriaceae

Technique NPP et méthode par comptage des colonies

N orme Marocaine homologuée

par arrêté conjoint du Ministre de l'Industrie, du Commerce, de l'Energieet des Mines et du Ministre de l'Agriculture, du Développement Rural etdes Eaux et Forêts

-- -.. ~---_._-- mu-

--.~~._-

..' ' ~' ~----------._--.--

0 --

Correspondauce

La présente norme reprend intégralement la norme ISO 7402/1993.

Modifications

Examinée et adoptée par le comité technique de normalisation des méthodes d'analyse et d'échantillonnagedes denrées alimentaires

Editée et diffusée par le Service de Normalisation Industrielle Marocaine (SNIMA)

SNIMA 2002

1

1

1..

1

2

4

4

4

NlVI ISO i402

S01VIMAlRE

1 Do Blain e d'a p pIicatio n ......

2 R éfé l'en ces no rma tiv es ... .....

3 Défini ti 0ns .......................

4 Prin cipe .....

5 Diluant, milieux de culture et réactif ..............................................

6 A p p areilla ge et verreri e .........

7 E chan till 0nn a ge .........................................................

8 Preparation de l'échantillon pour essai .

Page

,, ,-~ ..-.

---'-'.._-

49 NIode 0péra toi re ......

10 Ex pressi 0n des résultats ...........

Il Rapport d' essai ~............................................................................

Ann exe A .................Ann exe B ........A n Ilex e C.............................................................................................

,

-..-.-------....-.-----

6

7

8

10

11

11

NORME INTERNATIONALE ISO 7402:1993(F)

Microbiologie - Directives générales pour ledénombrement sans revivification desEnterobacteriaceae - Technique NPP et méthode par

~

"-

/

comptage des colonies '

"

tuent des. disposition-s valables pour la !:>rés8n1eNorme internationale. Au moment de la publication,les éditions indiquées étaient en vigueur. Toutenorme est sujette à révision et les parties prenantesdes accords fondés sur la présente Norme internatio-nale sont invitées è rechercher la possibilité d'appli-quer les édifions les plus récentes des normes

; 'par calcul dû nombre le plus probable (NPP) après indiquéesci-aprè~.Les membres de.la CEI~tdeTISO.incubation è 35_oCou37 °C en milieuliqüide;

'""-_n__P?~~èdent le registre des Normes mternatlonales en

~~~-,.~"'~~~::.;"C~...~-:::..~::~;:::~~~~~~:=~=~,~ :~--::;:~~-.~-:~::o",:=:,==:~~=:::.,:,~::vI9U,~uL~cC_,!q::rnRcI11~PtdpDnE3_::;=~::;.. ---~-'-~",..=~~~--: ..: = :..

i_.::0~0;Z~:.;~p~r~CJ!.rnRt~g~2ges7~Golonie~.96ten1Je-s?err:milie"\J0~c:ê~:::::':~=,.:;;=;","~-=~=='::ë#0: ~~..~=tTi=':-;~:'~~:::~~~:;~;~:;=2:2...' solide après incubationè 35°C ou 37 °C;- ..~: ISO 6887:r983, MicrobIologie - OffectIVes gênerales

,

'."

. .. . pour la préparation des dilutions en vue de l'examenLa température utilisée doit faire l'objet d'un accord microbiologique..

.'; ". U ;ccc -, .'.,

entre les parties concernées et doit être mentionnée -

dans le rapport d'essaI.. .

.'" ISO 7218:1985, Microbiologie - Directives générales

-pour les examens microbiologiques:_~7'-

NOTE 1-

Dans le casdes produits réfrigérésetcongelés,,.

- --- --'-.-u_u_.--..

une température d'incubation de 30 .C est recommandée,notamment lorsque le dénombrement est effeCtué dàns uribut technologique...

. .

1 Domaine d'application

La présente Norme internationale donne des directi-ves générales pour le dénombrement des Entero-bacteriaceaedans les produits destinés è laconsommation humaine ou è l'alimentation animale

3. .Definitions

.-- Pour les besoins de la présente Norme-internationale,PourJes petits nombres, la techniqueNPP est préfé"- 1 d frable;- sinon -on -préférera -la -méthode par-comptage

es é initions suivantes s'appliq.uent,;:=~ ,. _.--

des colonies. ' .3.1 Enterobacteriaceae: Micro-organismes fermen-

.La ...présente Norme. ,internationale:n'inclut- pas ..~de]antJe. g!Ùcose_§fd6r1bao! unê~ré~ction._p~dase- ntE~-~.

technique de revivification, et les résultats ne doivent .. gative lorsque, l'essai, est effectué .selon .Iaméthode

pas être reliés aux critères ou spécifications basés sur . ->spécifiée.'-c:'~ .-' --'. . , . '.

-. -:---;,'~--"--

Jasuppôsitionqi.J'urïé'révlvificatiOn aétéeffeCtuée':;.~ -.. ... ..- :;.-:;c ..:;.-::=-:---, -,<.,._n

"- ..~ '..:-~--

-:.: ..~::'-"'.-'" m. :-~-- --u' .- . 3.2 dénombrement des u.

Enterobacteriaceae:--

Des'limites' sonfimposéès-aux possi~ili1eiâ'apJ)liëa~ Nombred'Enterobacteriaceae trouvépar~miUilitre ou -

tion de la présente Norme internationale, du fait que. -=par gramme d'échantillon lorsquêîté.ssai esteftectue:ces..rnéth()des ~()IJ~§~jettes~AE!:grande.~yaria1ion~_- __'selon1a méthode_spécifiée. .".''-~

,.

Il est recommandé d'employer.c~s méthodes et d'in-. .terpréter lesrésùltats è la.' lumière "aes:rensei~gnements .donné~er1. J O,3,;~_.T)

, .

Références normatives.

~""'~>,;~,;"",,,,",-~'...,.~

'-.- ..

,.

. . ,4.1.Préparationdesdilutions ~~;;i.~=.':'.

Les normes suivantéscontiennentdes dispositionsqui, par suite de la référence qui en est faite.consti~

- --. -.-. -..

- -..- - -

.~ ,.J '..;,c.";-'

',. .

À partir dêl;échantillon po~r ~s~a-i,~~ré~~~~tionde~;-dilutions décimales. ."

Peptone 20,09 10.09

Glucose 10,0 9 5,0 9

Hydrogénophosphatedisodique (Na2HP04) 12,90 9 6.459

Dihydrogénophosphatede potassium (KH2P04) 4.0 9 2.0 9

Bile de bœufdéshydratée 40,0 9 20,0 9

Vert brillant 0,030 9 0,015 9

Eau 1 000 ml 1 000 ml

7402:1993(F)

Dénombrement des Enterobacteriaceae

1 Technique du nombre le plus probableP)

"E2 Il est recommandé d'utiliser cette technique1ue le nombre cherché est supposé se trouver dansHvalle de 1 è 100 par millilitre ou par gramme d'échan-) pour essai.

emencement de trois tubes de milieu doublecentration avec une quantité déterminée dehantillon pour essai si le produit è examiner est Ii-je, ou avec une quantité déterminée de suspen-l mère dans le cas d'autres produits.

;emencement de trois tubes de milieu simpleIcentration avec une quantité déterminée de:hantillon pour essai si le produit è examiner est Ii-de, ou avec une quantité déterminée de suspen-n mère dans le cas d'autres produits, puis, dans lesimes conditions, ensemencement de trois tubesmilieu simple concentration avec la première dilu-1 décimale obtenue è partir de l'échantillon pour,ai ou de la suspension mè'e.

:ubation des tubes è 35 °e ou 37 °e (selon accord)ndant 24 h.

Jartir du nombre de tubes confirmés positifs, calculnombre le plus probable ci'EnterÇJbacteriaceae,par

lIiTitreou par gramme d'échantillon pour essai auJyen de la table NPP (voir annexe A).

2.2 Comptage des colonies

JTE 3 1\ est recommandé d'utiliser cette techniquersque le nombre cherché est supposé supérieur è 100 parillilitre ou par gramme d'échantillon pour essai.

nsemencement en profondeur du milieu gélosé à laile, au cristal violet et au glucose, coulé dans deuxoÎtes de Petri, avec une quantité déterminée deéchantillon pour essai si le produit à examiner est li-uide, ou avec une quantité déterminée de la sus-,ension mère dans le cas d'autres produits.lecouvrement avec une couche du même milieu.

)ans les mêmes conditions, ensemencement d'au-res paires de boîtes avec les dilutions décimales ob-enues è partir de l'échantillon pour essai ou de laiuspension mère.

ncubation des boîtes à 35 °e ou 37 °e (selon accord)Jendant 24 h :!: 2 h.

~ partir du nombre de colonies caractéristiquesconfirmées par boîte de Petri. calcul du nombred'Enterobacteriaceae par millilitre ou par grammed'échantillon pour essai. .

2

5 Diluant, milieux de culture et réactif

5.1 Généralités

Pour les pratiques courantes de laboratoire, voirl'ISO 7218.

5.2 Diluant

Voir l'ISO 6887 et la norme spécifique traitant duproduit à analyser.

5.3 Milieux de culture

5.3.1 Milieu tamponné, à la bile, au vert brillantet au glucose (milieu E.E.)

5.3.1.1 Composition

a)

Milieudouble.concentration.

b)

Milieu simpleconcentration

5.3.1.2 Préparation

Dissoudre les composants ou le milieu complet dés-hydraté dans l'eau, en portant le tout è ébullition. Nepas chauffer le milieu plus de 30 min. Refroidir le mi-lieu rapidement.

Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu'après ébulli-tion, il soit de 7,2 à 25 °e.

Répartir le milieu de culture par quantités de 10 mldans des tubes stériles (6.8).

Ne pas stériliser le milieu è l'autoclave.

Le milieu peut être conservé 1 semaine au maximumentre 0 °C et 5 °e.

5.3.2 Gélose à la bile, au cristal violet et auglucose (VRBG)

5.3.2.1 Composition

Peptone

Extrait de levure

Sels biliaires

GlucoseChlorure de sodiumRouge neutre

Cristal violetAgar-agar, en poudre ou en flocons

Eau

7,0 93,0 91,5 9

10,0 95,0 9

0,03 9

0,002 98è18g1)

1 000 ml

1) Selon le pouvoir gélifiant de l'agar-agar.

5.3.2.2 Préparation

Dissoudre les composants ou le milieu complet dés~hydraté dans l'eau, en portant le tout à ébullition. Nepas chaufferie milieu plus de 30 min.c-<oc"=,--=H~"

--~ --- -,~ __0'__-__n_..- .

-'.. - - .- ..- - .-.:,- -

,

-- -~- -- -

._-~- --'.-, __'_.n,-~---_._---

'=-'-=-''-''~~-'''-'''~~ --- - -. - - ---- ---~ ~-- -~ u -- -- -- -'--"-

,.--.--.

Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu'après ébulli-tion, il soit de 7,4 à 25°C.

Répartir le milieu de culture dans des tubes stérilesou dans des flacons stériles (6.5) de 500 ml de capa-cité maximale.

Ne pas stériliser le milieu à l'autoclave.

Préparer ce milieu extemporanément (voir 9.2.2 et9.3.1 ).

5.3.2.3 Préparation des boîtes de gélose(seulement nécessaire pour la technique NPP - voir9.2.2)

Transférer immédiatement environ 15 ml du milieu deculture, refroidi à environ 45 "C, dans des boîtes dePetri (6.3) et laisser se solidifier.

Juste avant l'emploi, sécher les boîtes de gélose, depréférence avec le couvercle enlevé et la surface dela gélose tournée vers le bas, dans une étuve (6.3)jusqu'à séchage de la surface de la gélose.

Si elles ont été préparées à l'avance, les boîtes degélose non séchées ne doivent pas être conservéesplus de 4 h à la température ambiante ou plus d'unjour entre 0 °C et 5°C.

ISO 7402:1993(F)

5.3.3 Gélose glucosée

5.3.3.1 Composition

Tryptone

Extrait de levure

Glucose

Chlorure de sodium

Pourpre de bromocrésol

Agar-agar

Eau

10,0 g

1,5 9

10,0 9

5,0 9

0,015 98gè18g1)

1 000 ml

1) Selon le pouvoir gélifiant de l'agar-agar.

5.3.3.2 . Préparation

Dissoudre les composants ou le milieu complet dés-hydraté dans l'eau, en chauffant si nécessaire.

Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu'après stérili-sation, il soit de 7,0 à 25°C.

Répartir le milieu de culture par quantités de 15 mldans des tubes (6.8).

Stériliser~nl'éI~!o_clave (6.1) régl~~à"J 2JoC pendéln~ .

15 min. ccn -,n-.n-.. --c-c-n-c c-

Maintenir les tubes en position verticale.

Le milieu peut être conservé 1 semaine au maximumentre 0 "C et 5 "C.

Juste avant l'emploi, chauffer dans de l'eau bouillanteou sous courant de vapeur pendant 15 min, puis re-froidir rapidement à la température d'incubation.

5.3.4 Gélose nutritive

5.3.4.1 Composition

Extrait de viande de bœuf

PeptonèAgar-agar, en poudre ou flocons

Eau

3,0 9

5,0 98à18g1)

1 000 ml

1) Selon le pouvoir gélifiant de l'agar-agar.

5.3.4.2 Préparation

Dissoudre les composants ou le milieu complet dés-hydraté dans l'eau, en chauffant si nécessaire.

Ajuster le pH, si nécessaire, de sorte qu'après stérili-sation, il soit de 7,0 à 25 "C.

3

Il est important que le laboratoire reçoive un échan-.. 1,O.g =.o~ o.till()nréellérI!~nr}eprè5erltatif,

-..non endomm-agé ou

,.-c. _.J00 ml-_",- modifiélors-du transportet-del'entreposage."'----

L'échantillonnage ne fait pas partie de la méthodespécifiée dans la présente Norme internationale. S'iln'existe pas de Norme internationale spécifique àl'échantillonnage du produit concerné, il est recom-mandé que les parties concernées se mettent d'ac-cord à ce sujet.

ISO 7402:1993(F}

Répartir le milieu de culture dans des tubes ou desflacons (6.8) de 500 ml de capacitémaximale.

Stériliser à l'autoclave (6.1) réglée à 121 'C durant15 min.

5.3.4.3 Préparation des boîtes de gélose (voir9.4.1)

Transférer immédiatement environ 15 ml du milieu deculture, puis refroidir à environ 45 'C, dans des boîtesde Petri (6.6) et laisser se solidifier.

Juste avant l'emploi, sécher les boîtes de gélose, depréférence avec le couvercle enlevé et la surface dela gélose tournée vers le bas, dans une étuve (6.3)jusqu'à séchage de la surface de la gélose.

Si elles ont été préparées à l'avance, les boîtes degélose non séchées ne doivent pas être conservéesplus de 4 h à la température ambiante ou plus d'unjour entre 0 'C et 5 'C.

5.4 Réactif pour "essai à "oxydase

5.4.1 Composition

Dichlorhydrate de N,N,N',N' -tétraméthyl-p-phénylène diamine

Eau- -- u

dU_---------

5.4.2 Préparation

Dissoudre le réactif dans l'eau froide.

Préparer le réactif immédiatement avant usage.

6 Appareillage et verrerie

NOTE 4 Le matériel à usage unique est acceptable aumême titre que la verrerie réutilisable, si ses spécificationssont similaires.- . .

Matériel courant de laboratoire de microbiologie, etnotamment:

6.1 Appareil pour la stérilisation en chaleur sèche(four) ou en chaleur humide (autoclave)

Voir l'ISO 7218.

6.2 Étuve,37 'C :t 1 'C.

réglable à ou

6.3 Enceinte de séchage ou étuve, réglable entre35 'C :t 1 'C et 55 'C :t 1 'C.

4

6.4 pH-mètre, précis à :t 0,1 unité pH à 25 "C.

6.5 Bain d'eau, ou dispositif similaire, réglable à45 'C :t 1 'C.

6.6 Boîtes de Petri, en verre ou en matière plasti-que, de diamètre 90 mm à 100 mm.

6.7 Anse bouclée, d'un diamètre d'environ 3 mm,et fil droit en platine iridié ou en nickel-chrome, oubaguette de verre ou anse bouclée à usage unique.

NOTE 5 Le nickel-chrome ne convient pas pour l'essai àl'oxydase (voir 9.4.2.1).

6.8 Tubes à essai, de dimensions16 mm x 160 mm et 20 mm x 200 mm environ, etflacons ou fioles, de capacité comprise entre 150 mlet 500 ml.

6.9 Pipettes graduées à écoulement total, de ca-pacités nominales de 1 ml et 10 ml, graduées res-pectivement en 0,1 ml et 0,5 ml.

7 Échantillonnage

8 Préparation de l'échantillon pour essai

Préparer l'échantillon pour essai conformément à laNorme internationale spécifique du produit concerné.S'il n'existe pas de Norme internationale spécifique,il est recommandé que les parties concernées semettent d'accord à ce sujet.

9 Mode opératoire

9.1 Prise d'essai, suspension mère etdiiutions .. .

àVoir l'ISO 6887 et la norme spécifique traitant duproduit concerné.

Préparer une seule série de dilutions décimales àpartir de l'échantillon pour essai si le produit est li-quide, ou de la suspension mère dans le cas d'autresproduits.

.

9.2 Technique NPP

9.2.1 Ensemencement et incubation

Prendre trois tubes de milieu double concentration[5.3.1.1, a)]. Transférer, dans chacun de ces tubes,avec une pipette (6.9), 10 ml de l'échantillon pour es-sai si le produit est liquide, ou 10 ml de la suspensionmère dans le cas d'autres produits.

Prendre trois tubes du milieu simple concentration[5.3.1.1, b)]. Transférer, dans chacun de ces tubes,avec une nouvelle pipette (6.9), 1 ml de l'échantillonpour essai si le produit est liquide, ou 1 ml de la sus-pension mère dans le cas d'autres produits.

Prendre trois autres tubes de milieu simple concen-tration [5.3.1.1, b)]. Transférer, dans chacun de cestubes, avec une nouvelle pipette (6.9), 1 ml de lapremière dilution décimale (10-1) de l'échantillon pouressai si le produit est liquide, ou 1 ml de la premièredilution décimale de la suspension mère (10-2) dansle cas d'autres produits.

Faire incuber ces neuf tubes durant 24 h à 35°C ou37 cC.

ISO 7402:1993(F)

Recommencer ces opérations avec des dilutions suc-cessives, à l'aide d'une nouvelle pipette stérile, pourchaquedilution décimale. -

9.3.1.2 Couler, dans chaque boîte de Petri, environ15 ml du milieu gélosé à la bile, au cristal violet et auglucose (5.3.2), préparé puis refroidi è environ 45 .Cau bain d'eau (6.5). Le temps qui s'écoule entre la finde la préparation de la suspension mère (ou de la di-lution au 10-1 dans le cas d'un produit liquide) et lemoment où les dilutions entrent en contact avec lemilieu (5.3.2) ne doit pas dépasser 15 min.

Mélanger soigneusement l'inoculum au milieu par desdéplacements horizontaux des boîtes et laisser lemélange se solidifier en posant les boîtes de Petri surune surface fraîche et horizontale.

9.3.1.3 Après solidification du mélange, ajouter unecouche superficielle composée d'environ 10 è 15 mldu milieu gélosé è la bile, au cristal violet et au glu-cose (5.3.2), préparé puis refroidi comme décrit en9.3.1.2, afin d'empêcher l'étalement des colonies etd'obtenir des conditions de semi-anaérobiose. Laisserse solidifier comme décrit ci-dessus.

.

9.3.1.4 Inverser les boîtes préparées et les incuberà l'étuve réglée à 35°C ou 37 °C (selon accord) durant

Ensemencer en stries une anse (6.7) de chacune des 24 h.. . .

neuf cultures incubées (voir 9.2.1). sur des boîtes de u.u_._~_u~-=.~. . . .- .

§~~~;.~),à~: f~:~;i~~~~~~tf~sVi~~~~:tèa~5g:~c~~e3~v~~"--~'--9~3:2---C~mpiige~f;sélectï'é)nC"dtfs:c~lonies"-'"

(selon accord) durant 24 h.

9.2.2 Isolement

9.2.3 Sélection des colonies pour confirmation

À partir des boîtes incubées en 9.2.2, présentant undéveloppement de colonies caractéristiques roses àrouges (avec ou sans halo de précipité). ou incolores,muqueuses, prélever au hasard cinq de ces coloniesen vue de la confirmation biochimique (voir. 9.4.2) àeffectuer après une sub-culture (voir 9.4.1).

9.3 Technique par comptage des colonies

9.3.1 Ensemencement et ihcubation

9.3.1.1 Prendre deux boîtes de Petri stériles (6.6). Àl'aide d'une pipette stérile (6.9). transférer, dans cha-cune de ces boîtes, 1 ml de l'échantillon pour essaisi le produit est liquide, ou 1 ml de la suspensionmère dans le cas d'autres produits.

Prendre deux autres boîtes de Petri stériles. À raided'une nouvelle pipette stérile (6.9), transférer 1 ml dela première dilution décimale (10-1) de l'échantillonpour essai si le produit est liquide, ou 1 ml de la pre-mière dilution décimale de la suspension mère (10-2)dans le cas d'autres produits.

Choisir les boîtes (9.3.1.4) contenant moins de 150colonies caractéristiques (voir 9.2.3) ayant un diamè- -tre de 0,5 mm ou plus. Compter ces colonies sus-pectes. Prélever au hasard cinq de ces colonies surchacune. des boîtes de Petri de la confirmation bio-chimique (voir 9.4.2) à effectuer après une sub-culture(voir 9.4.1). .

Considérer la détermination sans valeur si la moitiéou plus de la surface d'une boîte est envahie. Simoins de la moitié de la surfac.e d'une boîte est en-vahie, effectuer le décompte des colonies sur la partieclaire et. extrapoler pour que le nombre .correspondeà la surface totale de la boîte.

9.4 Confirmation

9.4.1 Sub-culture

Ensemencer en stries sur des boîtes de gélosenutritive (5.3.4) chacune des colonies sélectionnéesen vue de la confirmation (voir 9.2.3 et 9.3.2).

Faire incuber ces boîtes durant 24 h :!::2 h à 35 .C ou37 .C (selon accord). Sélectionner une colonie bienisolée è partir de chacune des boîtes incubées en vuede confirmation biochimique (voir 9.4.2).

5

ISO 7402:1993(F)

9.4.2 Confirmation biochimique

9.4.2.1 Essai à l'oxydase

À l'aide d'une anse bouclée ou d'un fil en platine iridiéou d'une baguette de verre (6.7). prendre une fractionde chacune des colonies bien isolées (9.4.1) et ense-mencer par stries sur papier filtre humecté de réactif,(5.4) ou sur un disque disponible dans le commerce.Il ne faut pas utiliser d'anse ni de fil métallique ennickel-chrome.

Considérer l'essai comme négatif si la couleur du pa-pier filtre imbibé de réactif n'a pas viré dans les 10 s.

Pour les disques prêts è l'emploi, se conformer auxindications du fabricant.

9.4.2.2 Essai de fermentation

Repiquer les mêmes colonies sélectionnées en9.4.1, avec un fil à ensemencer (6.7). dans des tubescontenant du milieu glucosé (5.3.3). Faire incuber du-rant 24 h à 35°C ou 37 °C (selon accord).

Si une couleur jaune se développe dans la totalité du-contenu du tube, la réacti)n est considérée commepositive. La plupart des souches produisent du gaz.

10 Expression des résultats-"- - - ---.

""---.-.....-...----.-..

-10.1 Calcul du nombre le plus probable - .-'-"-----.

(NPP)

10.1.1 Compter le nombre de tubes donnant uneréaction positive pour chaque dilution.

10.1.2 Si l'une des colonies caractéristiques (9.2.3)sélectionnées à partir d'une sub-culture (voir 9.4.1) estoxydase négative et glucose positif, le tube qui est èl'origine de cette sub-culture doit être considérécomme positif.

10.1.3 Au moyen de la table de NPP (voirannexe A). déterminer, è partir du nombre de tubespositifs dans les différentes dilutions, le coefficient dunombre le plus probable (NPP).

10.1.4 Dans le cas de produits liquides, le nombred'Enterobacteriaceae par millilitre est égal au coeffi-cient NPP divisé par 10. Dans le cas d'autres produitspour lesquels des suspensions mères sont préparées,le nombre par gramme est égal au coefficient NPP.

tO.2 Calcu! à partir du nombre de coionies

10.2.1 Généralités

Si au moins 80 % des colonies caractéristiques sé-lectionnées (voir 9.3.2) sont oxydase négative et glu-cose positif, et donc confirmées comme étant des

6

-. -_.'--,-' ._-~---,

"---_.--

Enterobacteriaceae, le nombre de micro-organismesprésents sera le même que celui trouvé au comptageeffectué en 9.3.2.

Dans tous les autres cas, le nombre doit être calculéà partir du pourcentage de colonies oxydase négativeet glucose positif par rapport au nombre total de co-lonies sélectionnées (voir 9.3.2).

Arrondir le résultat à un nombre entier de colonies.

10.2.2 Cas général

Calculer le nombre N d'Enterobacteriaceae par millili-tre ou par gramme de produit, à l'aide de l'équationsuivante:

N=L>

(n, + 0, 1~)d

est la somme des colonies comptéesaprès identification sur toutes les boîtesretenues;

est le nombre de boîtes retenues à la pre-mière dilution;

.

~ est .Ie-nombre de boîtes retenues à la--~-c.. c~~--~~.~:~=-~~JjE3tJ~lèmedilutlQft;=" -

n,

est le taux de dilution correspondant è lapremière dilution.

Arrondir les résultats calculés è deux chiffres siani-ficatifs.

v

d

Noter comme résultat le nombre d'Entero-bacteriaceae par millilitre ou par gramme de produit,exprimé par un nombre compris entre 1,0 et 9,9 mul-tiplié par 1Cf, où x est la puissance appropriée de 10.

EXEMPLE

Un dénombrement direct d'Enterobacteriaceae adonné les résultats suivants:

- à la première diiution (10-3) retenue: -66 et 80 co-

lonies;

- è la seconde dilution (10-4) retenue: 4 et 7 colo-nies.

On été repiquées:

- pour 66 colonies: 5 colonies,dont4ont réponduaux critères, d'où a = 50;

- pour 80 colonies: 5 colonies, dont 3 ont réponduaux critères, d'où a = 48; -

- pour 7 colonies: 5 colonies, dont 4 ont réponduaux critères, d'où a = 6; .

- pour 4 colonies: les 4 se sont toutes révélées êtrele microorganisme recherché.

Il s'ensuit que

N=l>

(n, +0,1~)d

66 + 48 + 6 + 4(2+0,2) x 10-3

124= 56 363

2,2 x 10-3

Arrondir à deux chiffres significatifs, soit 56 000 ou5,6 x 104 Enterobaeteriaeeae par millilitre ou grammede produit.

10.2.3 Estimation des petits nombres

Si les deux boîtes, au niveau de l'échantillon pour es-sai (produits liquides) ou de la suspension mère (au-tres produits), contiennent moins de 15 colonies, fairela moyenne m des colonies comptées sur les deuxboîtes.

Donner le résultat sous la forme:

- nombre estimé (NE)d'Enterobacteriaceae par mil-lilitre:

, ,NE= m(produits liquides)~u --- ~ ~

- nombre estimé (NE) d'Enterobacteriaceae pargramme:

NE= m x el' (autres produits), d étant le tauxde dilution de la suspension mère.

10.2.4 Aucune colonie caractéristique

Si les deux boîtes, au niveau de l'échantillon pour es-sai (produits liquides) ou de la suspension mère (au-tres produits), ne contiennent aucune coloniecaractéristique, donner le résultat sous la forme

ISO 7402:1993(F)

- moins de 1 micro-organisme par millilitre (produitsliquides);

- moins de 1 x el' micro-organisme par gramme(autres produits), d étant le taux de dilution de lasuspension mère.

10.3 Fidélité

10.3.1 Méthode NPP

Il est connu que des variations importantes peuventêtre observées avec la technique du NPP. Les résul-tats obtenus selon cette méthode doivent être utilisésavec prudence. Les limites de confiance sont don-nées dans l'annexe A.

10.3.2 Méthode pour comptage des colonies .'

.-Pour des raisons d'ordre uniquement statistique, dans95 % des cas, les limites de confiance de la méthodepar comptage des colonies varient de :t 16 % à:t 52 %'); pour des dénombrements inférieurs à 15colonies par boîte, les limites de confiance sont don-nées dans l'annexe B. En pratique, des variations plusimportantes encore peuvent être observées et, enparticulier, entre les résultats obtenus par différentsopérateurs.

".Rapportd'essai.Le'rapport' â'essaiâ6it ïndiqÜerlà-méthoâe' utilisée,'latempérature d'incubation et les résultats obtenus. Ildoit, en outre, mentionner tous les détails opératoiresnon prévus dansla présenteNormeinternationale,ou -facultatifs, ainsi que les incidents éventuels suscepti-bles d'avoir agi suries résultats.

Le rapport d'essai doit donner tous les rensei-gnements nécessaires à l'identification complète del'échantillon.

1) Voir Cowell N. D. and Morisetti M. D.. J. Sei. Fd. Agrie., 20, 1969, p. 573.

7

ISO 7402:1993(F)

Annexe A(normative)

Détermination du nombre le plus probable

Voir tableau A1 et tableau A.2.

Nombre de résultatspositifs

oooooo1111111

oo1123ooo1122

o1o

.1ooo12

.0

1o1

CoefficientNPP1)

Tableau A.1

Catégorie2) .lorsque le nombred'essais est

2 3 5

Limites de confiance1)3)

~ 95 % ~ 99 %10

< 0,30 0,00 0,94 0,00 1,40.. 0,30 3. 2 2 --. 2 .10,01' 0,95. .0,00 u~- 1,40

0,30 2 1 1 1 1 0,01 1,00 0,00 1,60.0,61 HO

_u--3m3 3-3-:---0,121,70 0,05--2,50

0,62 3 2 2 2 1 0,12 1,70 0,05 2,500,94 0 0 0 0 3 0,35 3,50 0,18 4,600,36 1 1 1 1 1 . 0,02 1,70 0,01 2,500,72 2 2 1 1 1 0,12 1,70 0,05 2,501,1 O.

° °3 3 0,4 3,5 0,2 4,6

0,74 1 11 1 1 '0,132,00 0,06 2,70 -1,1 3 3 2 2 2. 0,4 3,5- 0,2 - 4,6 -

1,1 -.2 2L___1--_J.-OA- 3,5. 0,2 4,61,5 3 3 . 3 '3' 2.' 0;5' 3,8 0,2

.5,2

-~~~:~;&962-=~~;=- ~}~~~t~i~ii~-rfZ-;;~~~t~~~~~ ~-~0~i5~~2;:;3\8b~i .~g,J7~~~...~~~go~~~-c:,-

=:c:ëcc1;4~=.ccê-==c22C'-~-.~i=='1==1=-~=1-~-" =0;4='='~~~~ë.3;5~""-""'+0;2~---~4,6 =2,0 O. 3 3 3 3 0,5 3,8 0,2 5,2

.1,5 .1'. 11 - 1.

1 '.0,4 - 3,8 .:0,2 .5,2.2,0 2

- 2 1 1 0,5 3,8 0,2,5,22,7 -0 3 3 3 3 0,9 9,4 0,5 14,22,1 1 11. 1 '. 1 0,5 4,0 0,2 5,62,8 3 2 2 2.. 1. 0,9 9.4 0,5 14,23,5 0

°0 0 3 0,9 .9.4u - 0,5 14,2

2,9 32 2 2-

0,9 9.4 0,5-

14,2

3,6 03 3 3 3 0,99.4 0,5 -- 14,22,3 L 1 1 , 1 . 0,5 . 9.4 0,3 14,23,8 1

-1 1 1 -, 0,9 .10.4 .._0,5 --- - 15,7_..

6,4-

3 3 2- --2--:-2 -1,6 - 18,1- ~-1,0'--- 25,0..- -4,3 1 1.1 .. nu

11. <0,9 18,1.0,5 . 25,0

7,5 1 1 1 ..1.._1_=:. 1,7 19,9 -: 1,1 .27,0

12 3 2- 2 -- .2 .1. 3 36.. -2 44

16-0 00 -- ..3 3-.3 38.-- ..2 - 529,3 1 1 1 11-1,8 36,0 .1,243,015 1 -

, ._1 L- L .. 3 382 52

21 2 __1- 1 - . ,-, .- 3 40 . 2 56

29 3 3---3 2 - .-:2. .- 9 - - 99 5- -152

24 1 1 1. -1..-'-. 4. _99 3- 15246 , --_n:':11 .-:.:,. :-:':-':'':'1:''-:''--9 .198 - 5 283H

110 , 11 1 -1 .20400 10 570> 110

.

.~u ,2... .0,

.':':.-'C==.2ë::..'::'..-0

2 0212 12 12 22 22 22 32 33 03 03 03 13 13333333333

122223333

2o12o,2o,o

-12o123o123o123

1) D'après De Man, J. C., Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17,1983, pp.301-305.

2) VoirtableauA.2..

3) Les limites de confiance données dans ce tableau ne sont destinées qu'à fournir quelques notions de l'influence desvariations statistiques sur les résultats. Il y ,aura toujours d'autres sources de variations qui peuvent même,quelquefois,..être plus importantes.

..

. ..

'8

Catégorie1) Définition

Lorsque le nombre de bactéries dans le produit est égal au NPP trouvé, le résultat est un de ceux qui ont le1 plus de chances d'être obtenus. Il existe tout au plus 5 % de chances d'obtenir un résultat qui est le moins

probable que le moins probable dans cette catégorie.

Lorsque le nombre de bactéries dans le produit est égal au NPP trouvé. le résultat est un de ceux qui ont le2 moins de chances d'être obtenus. que même le moins probable dans la catégorie 1, mais il existe tout au plus

1 % de chances d'obtenir un résultat qui est le moins probable que le moins probable dans cette catégorie.

Lorsque le nombre de bactéries dans le produit est égal au NPP trouvé. le résultat est un de ceuxiqui ont le3 moins de chances d'être obtenus. que même le moins probable dans la catégorie 2, mais il existe tout au plus

0.1 %;de chances d'obtenir un résultat- qui est le moins probable que le moins probable dans cette catégorie.

Lorsque le nombre de bactéries dans le produit est égal au NPP trouvé, le résultat est un de ceux qui ont léo moins de chances d'être obtenus, que même le moins probable dans la catégorie 3. Il n'existe qu'une chance

de 0,1 % d'obtenir un résultat dans cette catégorie, sans que rien ne soit faux. --. -.

1) Avant de commencer les essais, il faut décider quelle catégorie sera acceptable, c'est-à-dire seulement la catégorie 1,1 et 2, ou même 1. 2 et 3. Si la décision est très importante. pour être prise sur la base des résultats, on acceptera seu-lement les résultats de la catégorie 1 ou tout au plus ceux des catégories 1 et 2. Les résultats de la catégorie 0 devrontêtre considérés avec la plus grande prudence. -

ISO 7402:1993(F)

Tableau A.2 - Catégories

-- -~-~--- -'-'-~---~~ ~

~-"------._~- --

,--_o. ,

,

'-- -

. .

- - - -~ ~ ~--- ". ---, - -~--" '

...-- "' '-~-

___no

' '--"---" '--'" -- -.--.. .. .. -. -- -.-.---

..-

.- -.-. '--r--- ---

--'---' '-

--

_U

'-' " - -'-.---------- ~---',._~-".,---~

,--' -

-.

- --- --' "- ,'--- -,,-----

9

ISO .7402:1993(F)

Annexe B(normative)

Limites de confiance des estimations des petits nombres de colonies

Les limites de confiance au niveau 95 % des estimations des petits nombres. lorsque le nombre de colonies re-tenues sur les boîtes est inférieur à 15 micro-organismes, sont données dans le tableau B.1.

Tableau 8.1

Nombre demicro-organismes

Limites de confiance au niveau 95 %

inférieure supérieure.

.1

2

3

4

5

6

7

8

9

"=""~c.="'.'.c~."'.1 0

<1

<1

<11

2

2234

24

5

6

910121314

121314

15

--- -~ u_.

-'" ~---.---~ -. .

192021

23

-- --- -- --------------

10

Références normatives Normes marocaines correspondantes

ISO 6887-] NM 08.0.100

ISO 7218 NM 08.0.101

NM ISO 7402

ANNEXE C(informative)

CORRESPONDANCE DES REFERENCES NORMATIVES DE LA PRESENTENORME AVEC LES NORMES MAROCAINES

"

---'-''''-,.- --"'-' n_-..---..---

-.

-L

."

n.---

-~ " -.. --~ ~.,----- '-'---' --- ""'-.. --- - -

--

11

ISO 7402:1993(F)

-.- -.-" ~--. ._---.-

- --"---..----

- -------.

----._-

CDU 579.672'842.1/.2:57.087.23Descripteurs: produitagricole, produitalimentaire, produitd'alimentationanimale, essai, analyse microbiologique,détermination;microorganisme. bactérie, entérobactériacéae, comptage des bactéries. conditions générales.

Prix basé sur 10 pages