Évaluation de l'impact de nouveaux pansements biologiques sur la guérison de … ·...
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BENOÎT M.-LABBÉ
ÉVALUATION DE L’IMPACT DE NOUVEAUX
PANSEMENTS BIOLOGIQUES SUR LA GUÉRISON
DE PLAIES CUTANÉES IN VITRO
Mémoire présenté
à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en médecine expérimentale
pour l’obtention du grade de Maître ès sciences (M. Sc.)
FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL
QUÉBEC
2013
© Benoît M.-Labbé, 2013
i
Résumé
Le traitement des ulcères cutanés constitue un défi majeur et les options
thérapeutiques efficaces demeurent limitées. Le but du présent projet était de concevoir et
d’évaluer le potentiel de pansements biologiques fabriqués à partir de cellules souches
extraites du tissu adipeux (CSTA) à favoriser la guérison de plaies cutanées. Des
pansements faits de CSTA ou de CSTA différenciées en adipocytes ont été mis au point en
utilisant la technique d’auto-assemblage développée au LOEX et évalués sur un modèle
d’étude in vitro adapté pour l’étude de pansements. L’effet de ces pansements a été évalué
en mesurant la progression de la réépithélialisation des plaies in vitro, en caractérisant leur
sécrétome et en réalisant des analyses histologiques et immunohistochimiques. Cette
recherche suggère que les CSTA différenciées en adipocytes pourraient être utilisées en
complément ou alternativement aux fibroblastes dermiques pour la production de
recouvrements autologues utiles dans le traitement des plaies cutanées.
iii
Abstract
Treatment of chronic wounds remains a major challenge in clinic and efficient
treatment options are still limited. The goal of this project was to create and evaluate the
potential of bioengineered cellular wound dressings made of adipose-derived stem/stromal
cells (ASCs) for cutaneous wound healing. Dressings made of ASCs differentiated or not
towards the adipogenic lineage were produced using the self-assembly approach and were
evaluated using an adapted in vitro wound healing model. The effect of these dressings was
assessed by measuring the progression of reepithelialisation on in vitro wounds, by
characterizing dressing’s secreted products and by histological and immunohistochemical
analyses. This research suggests that ASCs could be used as an alternative or a complement
to dermal fibroblasts for the production of autologous dressings useful for healing of
chronic wounds.
v
Remerciements
Ce mémoire est d’abord le résultat d’une collaboration solide avec ma directrice de
recherche Julie Fradette Ph.D. Je tiens à la remercier chaleureusement pour sa disponibilité,
sa rigueur scientifique et son support constant tout au long de mes études graduées. Dre
Fradette est définitivement un bel exemple d’une chercheure ayant à cœur le succès de ces
étudiants et la production de recherches de qualité.
Je tiens également à remercier les membres de l’équipe LOETA qui ont été présents
au cours de mon projet pour discuter de science et relaxer de temps à autre! Un merci
particulier à Valérie Trottier, assistante de recherche de l’équipe, qui a travaillé les débuts
du présent projet et qui m’a offert une aide précieuse tout au long de l’expérimentation.
Merci à Maryse Proulx, Caroline Vincent, Guillaume Marceau-Fortier et Dominique
Mayrand pour leur support et leur aide. Merci également à Todd Galbraith pour son soutien
lors de mes premiers contacts avec le génie tissulaire, à Olivier Rochette-Drouin pour son
aide avec les microscopes ainsi qu’à Francis Charrette et à Annie Boisvert pour leur aide
avec les prises de mesures. De plus, je remercie l’ensemble des chercheurs du LOEX pour
leur contribution à la création de ce centre de recherche d’envergure.
Je veux souligner le support que m’ont offert les membres de ma famille et mon
amoureuse au cours de ce projet de maitrise. Ils ont su être présents pour moi lors des
moments plus difficiles et m’ont encouragé constamment. Merci pour votre soutien
précieux.
Finalement, je remercie la faculté de médecine de l’Université Laval et les
organismes subventionnaires de m’avoir permis de réaliser ce projet conjointement à mes
études au doctorat en médecine.
vii
À ma famille pour leur support
inconditionnel
ix
Table des matières
Résumé ..................................................................................................................................... i Abstract ................................................................................................................................. iii Remerciements ........................................................................................................................ v
Table des matières ................................................................................................................. ix Liste des tableaux ................................................................................................................... xi Liste des figures .................................................................................................................. xiii Liste des abréviations ............................................................................................................ xv 1.
Chapitre 1 - Introduction générale...................................................................................... 1 1.1 Peau normale humaine et ses composantes ............................................................ 2
1.1.1 Épiderme ............................................................................................................. 2
1.1.1.1 Couche basale ............................................................................................. 3 1.1.1.2 Couche épineuse ......................................................................................... 4 1.1.1.3 Couche granuleuse ...................................................................................... 4 1.1.1.4 Couche cornée ............................................................................................. 5
1.1.2 Jonction dermo-épidermique .............................................................................. 5 1.1.3 Derme et annexes cutanées ................................................................................. 6
1.1.4 Hypoderme (tissu adipeux humain) .................................................................... 7 1.1.4.1 Composition cellulaire ................................................................................ 8
1.1.4.1.1 Adipocytes............................................................................................. 8
1.1.4.1.2 Cellules souches extraites du tissu adipeux (CSTA)............................. 8 1.2 La guérison des plaies cutanées .............................................................................. 9
1.2.1 Physiologie de la guérison .................................................................................. 9 1.2.1.1 La phase inflammatoire .............................................................................. 9
1.2.1.2 La phase proliférative ............................................................................... 10 1.2.1.2.1 La réépithélialisation ........................................................................... 11
1.2.1.2.2 La formation du tissu de granulation .................................................. 12 1.2.1.2.3 La néovascularisation .......................................................................... 13
1.2.1.3 La phase de maturation et de remodelage ................................................. 13
1.2.2 La pathogénie des plaies chroniques ................................................................ 14 1.2.2.1 Le diabète .................................................................................................. 14 1.2.2.2 L’insuffisance veineuse ............................................................................ 16
1.2.3 Traitements des plaies cutanées ........................................................................ 17 1.2.3.1 Méthodes de base ...................................................................................... 17 1.2.3.2 Pansements synthétiques ........................................................................... 17 1.2.3.3 Pansements cellulaires .............................................................................. 18
1.3 Étude de la guérison des plaies cutanées et potentiel des cellules souches extraites
du tissu adipeux (CSTA) ................................................................................................... 23 1.3.1 Modèles animaux de la guérison des plaies cutanées ....................................... 23
1.3.2 Potentiel des cellules du tissu adipeux en guérison des plaies cutanées ........... 25 1.3.2.1 Sécrétion de molécules bioactives ............................................................ 27
1.3.2.1.1 Leptine ................................................................................................. 27 1.3.2.1.2 VEGF .................................................................................................. 28 1.3.2.1.3 Angiopoïétine-1 ................................................................................... 29
1.3.3 Peaux reconstruites et contribution du génie tissulaire (méthode d’auto-
assemblage) .................................................................................................................. 29
1.4 Problématique, hypothèse et objectifs .................................................................. 31 2 Chapitre 2 - Matériel et méthode ...................................................................................... 33
2.1 Production de peaux bilamellaires humaines reconstruites in vitro par auto-
assemblage ....................................................................................................................... 34
2.1.1 Production du derme des peaux reconstruites .................................................. 34 2.1.2 Production de l’épiderme des peaux reconstruites ........................................... 36
2.2 Production de feuillets migratoires dermiques ..................................................... 38 2.3 Production de pansements biologiques ................................................................ 38 2.4 Réalisation du modèle d’étude ............................................................................. 41
2.5 Devis expérimentaux ............................................................................................ 43
2.6 Prise de photos macroscopiques des peaux et des plaies ..................................... 44 2.7 Suivi de la progression de la réépithélialisation dans le temps ............................ 45
2.7.1 Méthode 1 ......................................................................................................... 45
2.7.2 Méthode 2 ......................................................................................................... 45 2.8 Mesure de l’aire réépithélialisée de la plaie ......................................................... 46
2.9 Analyse des peaux, des plaies et des pansements ................................................ 47 2.9.1 Analyse des peaux ............................................................................................ 47 2.9.2 Analyse des plaies ............................................................................................ 47
2.9.3 Analyse des pansements ................................................................................... 49 2.10 Dosage par ELISA des molécules sécrétées ........................................................ 49
2.11 Analyses statistiques ............................................................................................ 50 3 Chapitre 3 – Résultats ........................................................................................................ 51
3.1 Conception du modèle de guérison des plaies in vitro adapté à l’étude de
pansements biologiques .................................................................................................... 52 3.2 Progression de la réépithélialisation de plaies recouvertes de pansements
biologiques ....................................................................................................................... 61
3.3 Caractérisation de l’impact des pansements biologiques sur la réépithélialisation
68
4 Chapitre 4 – Discussion...................................................................................................... 75
4.1 Adaptation du modèle d’étude in vitro et conception des pansements biologiques
76 4.1.1 Modèle d’étude de la guérison des plaies in vitro ............................................ 76
4.1.2 Conception des pansements biologiques .......................................................... 80
4.2 Évaluation de l’efficacité des pansements biologiques ........................................ 81
4.3 Poursuite du projet sur un modèle animal ............................................................ 87 6 Chapitre 5 - Conclusion ..................................................................................................... 89
Bibliographie ....................................................................................................................... 91
xi
Liste des tableaux
Tableau 1.1 : Principaux recouvrements biologiques disponibles en clinique pour le
traitement de plaies chroniques. .................................................................................... 21
Tableau 2.1 : Populations cellulaires de fibroblastes utilisés pour la production de dermes
reconstruits et de feuillets migratoires. ......................................................................... 34 Tableau 2.2 : Composition du milieu de culture pour kératinocytes. .................................. 37 Tableau 2.3 : Populations cellulaires de CSTA et de fibroblastes utilisées pour la
production de pansements biologiques. ........................................................................ 39
Tableau 2.4 : Composition du milieu d’induction adipogénique. ....................................... 40 Tableau 2.5 : Résumé des devis expérimentaux réalisés et des principaux paramètres de
chacun. .......................................................................................................................... 44
Tableau 2.6 : Anticorps utilisés pour les marquages immunohistochimiques de plaies. .... 48
xiii
Liste des figures
Figure 1.1 : Multiples couches cellulaires résultant du processus de différenciation des
kératinocytes. .................................................................................................................. 3
Figure 1.2 : Schématisation de la jonction dermo-épidermique. ........................................... 6 Figure 1.3 : Schématisation des principales étapes de la guérison des plaies de la peau. ... 10 Figure 1.4 : Patient de 60 ans amputé de deux orteils et souffrant d’un ulcère diabétique
classiquement situé à la pointe du deuxième métatarse. ............................................... 15 Figure 1.5 : Apparence générale des principaux pansements cellulaires disponibles
commercialement. ......................................................................................................... 20 Figure 2.1 : Étapes de production de peaux bilamellaires reconstruites in vitro. ................ 36 Figure 2.2 : Étapes de production de pansements biologiques en fonction du type cellulaire
utilisé. ............................................................................................................................ 39 Figure 2.3 : Étapes de réalisation du modèle d’étude de guérison des plaies selon la
condition expérimentale à l’étude.. ............................................................................... 42 Figure 2.4 : Aspect général du modèle d’étude réalisé. ....................................................... 43
Figure 2.5 : Exemple des photos ayant servies à générer les résultats de mesure d’aire non-
réépithélialisée et d’aire totale de la plaie originale. .................................................... 46
Figure 3.1 : Aspect macroscopique d’une peau reconstruite. .............................................. 52 Figure 3.2 : Apparence macroscopique et microscopique des pansements biologiques
produits par auto-assemblage. ....................................................................................... 54
Figure 3.3 : Résumé des résultats de l’étude pilote. ............................................................ 57 Figure 3.4 : Profil de sécrétion des pansements biologiques sur une période de 48 heures en
milieu sans sérum et sans phénol. ................................................................................. 58 Figure 3.5 : Aspect au stéréomicroscope du phénomène de réépithélialisation d’une plaie
reconstruite in vitro après l’adaptation de la méthode de suivi de la
réépithélialisation. ......................................................................................................... 60
Figure 3.6 : Comparaison de l’aire ouverte des plaies en fonction du nombre de jour de
guérison et selon le pansement utilisé (première étude). .............................................. 61 Figure 3.7 : Profil de sécrétion des pansements biologiques sur une période de 24 heures en
milieu sans sérum et sans phénol. ................................................................................. 63 Figure 3.8 : Progression de la réépithélialisation en fonction du groupe expérimental à
l’étude (deuxième étude). ............................................................................................. 65
Figure 3.9 : Profil de sécrétion des pansements biologiques sur une période de 48 heures en
milieu de culture pour adipocytes. ................................................................................ 67 Figure 3.10 : Aspect histologique d’une coupe transversale de la marge d’une plaie colorée
au trichrome de Masson. ............................................................................................... 69
Figure 3.11 : Aspect histologique de la réépithélialisation six jours après la création des
plaies suite à une coloration au trichrome de Masson sur coupes transversales. .......... 71 Figure 3.12 : Analyses immunohistochimiques du phénomène de réépithélialisation en
présence de pansements biologiques après six jours de guérison. ................................ 72 Figure 3.13 : Aspect histologique au trichrome de Masson des pansements adipeux utilisés
comme recouvrement d’une plaie au fil du temps. ....................................................... 73 Figure 3.14 : Exemple d’une plaie où le feuillet migratoire n’a pas été réépithélialisé. ..... 74
xv
Liste des abréviations
(Termes en anglais inscrits en italique)
Ac Anticorps monoclonaux ou polyclonaux (M ou P)
ASCs Adipose-derived stem/stromal cells
bFGF Basic fibroblast growth factor
CHA Centre Hospitalier Affilié
CSTA Cellules souches extraites du tissu adipeux
DME Dulbecco’s modified Eagle’s medium
EGF Epidermal growth factor
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
IBMX 3-isobutyl-1-méthylxanthine
KGF Keratinocyte growth factor
LOEX Laboratoire d’Organogénèse Expérimentale
NO Oxyde nitrique
PAI-1 Plasminogen activator inhibitor-1
PDGF Platelet-derived growth factor
PGA Polyglycolic acid
PLA Polylactic acid
SVF Sérum de veau fœtal
T3 Triiodothyronine
TGF Transforming growth factor (α et β)
VEGF Vascular endothelial growth factor
VEGFR Vascular endothelial growth factor receptor (1 et 2)
1
1. Chapitre 1 - Introduction générale
2
1.1 Peau normale humaine et ses composantes
La peau humaine est un organe important ayant pour rôle principal d’être une
barrière entre l’environnement interne et externe du corps. Elle est principalement
composée de trois types cellulaires organisés en trois couches. La couche la plus
superficielle est l’épiderme, érigée par les kératinocytes, suivi du derme, essentiellement
constitué de fibroblastes, et de l’hypoderme, contenant surtout des adipocytes. La peau joue
plusieurs rôles importants en plus d’être une barrière efficace. Elle est impliquée dans la
thermorégulation du corps, dans la transmission des sensations en plus d’avoir un rôle
immunitaire. Elle possède aussi diverses fonctions endocrines, dont l’activation de la
vitamine D ainsi que la production de leptine dans son tissu adipeux (Kierszenbaum et al.,
2006).
1.1.1 Épiderme
L’épiderme est la partie la plus superficielle de la peau. Sa structure est celle d’un
épithélium pavimenteux stratifié, tout comme la majorité des épithéliums du corps humain
subissant de la friction. Il est toutefois un des seuls à être kératinisé et à contenir des
mélanocytes, assurant une protection solaire en pigmentant la peau et les poils. Il contient
aussi des cellules de Merkel servant de récepteurs sensoriels ainsi que des cellules
de Langerhans impliquées dans l’immunité cellulaire (Kierszenbaum et al., 2006). Les
kératinocytes prolifèrent et maturent de la couche basale jusqu’à la couche cornée, en
passant par les couches épineuses et granuleuse où leur morphologie et leur composition se
transforment (Fig 1.1). Les kératines, principales protéines structurales composant les
kératinocytes, possèdent des profils particuliers selon la couche et constituent près de 85%
de la masse d’un seul kératinocyte une fois la différenciation complétée (Fuchs, 1995).
Elles constituent donc des marqueurs de choix dans l’étude de la formation de l’épiderme.
3
Figure 1.1 : Multiples couches cellulaires résultant du processus de différenciation des
kératinocytes. [Figure modifiée de (Segre, 2008)]
1.1.1.1 Couche basale
La couche basale de la peau est la seule couche cellulaire où les kératinocytes
prolifèrent (Fuchs et al., 1980). Ils sont solidement attachés à la membrane basale par des
hémidesmosomes, des protéines complexes qui guident la polarisation et l’organisation
spatiale de l’épiderme en formation (Borradori et al., 1999). Cette couche contient des
cellules souches épidermiques qui expriment entre autres la kératine 19. Elles sont situées
dans la couche basale des crêtes épidermiques profondes de la peau sans poils ou dans le
renflement des follicules pileux de la peau avec poils (Michel et al., 1996, Fradette et al.,
1998). Les kératines 5 et 14 sont fortement exprimées au niveau de la couche basale. Elles
se retrouvent seulement dans les kératinocytes ayant des capacités prolifératives, leur
expression est donc régulée à la baisse dès que les kératinocytes passent à la couche
épineuse (Fuchs, 1995, Fuchs et al., 1980). La kératine 15 est également exprimée dans les
4
cellules de la couche basale, quoique de moins grande importance quantitative (Lloyd et al.,
1995). L’antigène Ki-67 est aussi un marqueur cellulaire particulier à la couche basale au
sein de l’épiderme puisqu’il est présent dans les cellules prolifératives (Gerdes et al., 1983,
Gerdes et al., 1984).
1.1.1.2 Couche épineuse
En quittant la couche basale, le profil des kératines synthétisées au sein des
kératinocytes se modifie. La présence des kératines 5 et 14 diminue et le taux de synthèse
des kératines 1 et 10 prend de plus en plus d’ampleur (Fuchs, 1995). À ce stade de
différenciation, les kératinocytes sont toujours métaboliquement actifs et demeurent liés
entre eux par des desmosomes comme dans la couche basale(Franke et al., 1987). Les 4 à 8
couches cellulaires qui composent l’épineuse prennent graduellement une forme plus plane
jusqu’à leur passage à la couche granuleuse (Fuchs, 1990).
1.1.1.3 Couche granuleuse
Dans leur transition vers la couche granuleuse, les kératinocytes stoppent leur
production massive de kératines entreprise dans les couches basale et épineuses. Les
kératinocytes acquièrent alors des granules de kératohyalines à l’intérieur de leur
cytoplasme. Celles-ci contiennent entre autres de la loricrine servant à former l’enveloppe
cornée des cornéocytes (Mehrel et al., 1990). Elles renferment également des précurseurs
de la filaggrine qui servent à l’agrégation des filaments de kératine en macrofibrilles (Dale
et al., 1978, Watt, 1989). Ces granules ont aussi un rôle à jouer dans la déshydratation et
l’aplatissement de la cellule avant son passage à la couche cornée (Dale et al., 1994).
Parallèlement à la production de ces granules, il y a formation de corps lamellaires riches
en lipides qui sont sécrétés dans l’espace intercellulaire (Kierszenbaum et al., 2006). Les
transglutaminases sont également des enzymes actifs dans la couche granuleuse qui
entreprennent la formation de l’enveloppe cornée (Buxman et al., 1975, Eckert et al., 2005).
5
1.1.1.4 Couche cornée
Une fois la couche cornée atteinte, les kératinocytes aplatis maintenant devenus des
cornéocytes ne possèdent plus de noyau et sont dépourvus d’organelles. Ils perdent le peu
de cytoplasme restant. À ce stade, ils sont remplis de filaments de kératine et entourés
d’une couche de protéines insolubles apposée sur la face interne de leur membrane
plasmatique (Watt, 1989). Les cornéocytes ont ainsi pour rôle de protéger les strates
vivantes de l’épiderme contre les forces mécaniques exercées sur la peau. Ils servent
également à l’imperméabiliser grâce aux lipides intercellulaires produits par les corps
lamellaires (Menon et al., 1997, Kierszenbaum et al., 2006). Graduellement, la
desquamation a lieu et les strates superficielles de cornéocytes se détachent de la peau. Le
délai séparant la présence d’une cellule à la couche basale et sa différenciation terminale en
cornéocyte est de deux à quatre semaines, selon le degré de renouvellement nécessaire à un
site donné de la peau (Fuchs, 1995).
1.1.2 Jonction dermo-épidermique
La membrane basale séparant le derme de l’épiderme, aussi appelée jonction dermo-
épidermique, se divise en quatre structures distinctes lorsque visualisée par microscopie
électronique (Fig 1.2). La première structure de la jonction dermo-épidermique est
constituée de la membrane plasmatique des kératinocytes basaux de l’épiderme. Ces
kératinocytes sont soutenus par des filaments intermédiaires de kératine 5 et 14 contenus
dans leur cytoplasme (Fuchs et al., 1994). Leur membrane plasmatique s’attache aux autres
structures de la jonction dermo-épidermique grâce à des hémidesmosomes (Borradori et al.,
1999). Ces hémidesmosomes utilisent des intégrines spécialisées dans la liaison des
laminines (α6β4 et α3β1) (Watt, 2002) afin de se lier aux filaments d’ancrage des deux
structures suivantes, la lumina lucida et la lumina densa. La laminine 5 est l’un des
principaux constituants de ces ancrages, accompagnée des laminines 6 et 10 qui s’y
retrouvent de façon moins abondante (Aumailley et al., 1996, Aumailley et al., 1999). La
laminine 5 est d’ailleurs un marqueur spécifique de la membrane basale des épithéliums
pavimenteux (Nishiyama et al., 2000). La troisième structure de la jonction dermo-
6
épidermique, la lumina densa, est principalement constituée de collagène de type IV. Enfin,
la lamina reticularis, dernière structure de la membrane basale, est surtout formée des
collagènes de types I et III. Des fibres de collagène de type VII servent à ce niveau de
filaments d’ancrage entre la lumina densa et la lumina reticularis et assurent la stabilité de
la cohésion entre la membrane basale et le derme.
Figure 1.2 : Schématisation de la jonction dermo-épidermique. [Figure modifiée de (Karp,
2004)]
1.1.3 Derme et annexes cutanées
Le derme est principalement constitué de cellules mésenchymateuses nommées
fibroblastes qui sont reliées entre elles par une solide matrice extracellulaire. Il se divise en
deux couches plus ou moins bien définies où la composition de sa matrice varie. La couche
la plus proximale à l’épiderme est la couche papillaire, constituée de fibroblastes, de fibres
de collagène fines et de fibres élastiques. Elle contient les capillaires sanguins qui
fournissent les nutriments nécessaires à la formation de l’épiderme ainsi que des
terminaisons nerveuses. La couche réticulaire est quant à elle composée de fibres de
collagène organisées en faisceaux épais ainsi que de fibres élastiques grossières en plus des
fibroblastes. Elle contient un réseau sanguin, lymphatique et nerveux de plus gros calibre
que la couche papillaire (Kierszenbaum et al., 2006).
7
Le derme est le siège d’annexes cutanées telles que les poils, les glandes sébacées et
les glandes sudoripares. La tige des poils traverse l’épiderme et est solidement ancrée dans
le derme par le follicule pileux. Les poils ont différentes fonctions selon leur emplacement,
que ce soit de filtrer l’air passant par le nez ou d’isoler le cuir chevelu. Une glande sébacée
s’associe à chaque follicule pileux au niveau de la peau pour produire du sébum, une
substance grasse possédant des propriétés antimicrobiennes. Les glandes sudoripares
contribuent pour leur part à la régulation de la température corporelle en laissant échapper
la sueur dans de petits pores jusqu’à la surface de la peau (Kierszenbaum et al., 2006).
Le derme a pour rôle d’offrir à la peau à la fois une résistance mécanique contre les
traumatismes ainsi qu’une souplesse qui permet l’amplitude des mouvements. Il aurait
aussi un rôle important à jouer dans la régulation de l’épithélialisation par le remodelage du
collagène et la production de facteurs de croissance (Coulomb et al., 1989). Dans des
études in vitro, la co-culture de fibroblastes et de kératinocytes accentue la prolifération des
kératinocytes et la morphologie de l’épiderme qui en résulte se rapproche davantage à celle
de la peau normale humaine que lorsque les kératinocytes prolifèrent en absence de
fibroblastes (El-Ghalbzouri et al., 2002, El Ghalbzouri et al., 2003). La prolifération des
kératinocytes serait même doublée lorsqu’en co-culture avec des fibroblastes (Goulet et al.,
1996).
1.1.4 Hypoderme (tissu adipeux humain)
L’hypoderme est la troisième et dernière couche de la peau. Sa distinction avec le
derme est graduelle, aucune membrane définie ne les sépare. Aussi appelé tissu adipeux
sous-cutané, il joue plusieurs rôles physiologiques importants en plus d’être un soutien
indispensable pour le derme et l’épiderme qui le recouvre. L’hypoderme est un coussin
précieux pour amortir les chocs et joue un rôle de thermorégulation. Il constitue une réserve
énergétique importante. Sa distribution varie selon le sexe et l’indice de masse corporelle.
8
1.1.4.1 Composition cellulaire
Les constituants principaux du tissu adipeux sont les adipocytes et les cellules
stromales/souches adultes qui résident dans le tissu adipeux.
1.1.4.1.1 Adipocytes
Les adipocytes blancs sont les principaux constituants du tissu adipeux humain. Ils
servent notamment à stocker de l’énergie sous forme de triglycérides. Ils sont également
responsables de la production de leptine, une hormone responsable du contrôle de la satiété
(Voir section 1.3.2.1.1 Leptine). La large gouttelette lipidique contenue dans leur
cytoplasme occupe près de 95% de l’espace cellulaire; le reste du volume cellulaire est
occupé par le noyau aplati contre la membrane cytoplasmique ainsi que d’une fine couche
de cytoplasme au pourtour (Kierszenbaum et al., 2006).
Le tissu adipeux présente un profil de sécrétion intéressant, notamment de
molécules actives dans les processus liés à la guérison des plaies. Campbell et al. ont
d’ailleurs tenté de cultiver des kératinocytes directement sur une couche de cellules
adipeuses afin de vérifier l’impact des adipocytes sur la prolifération des kératinocytes. Ils
ont constaté que la prolifération des kératinocytes était accélérée lorsque les deux types
cellulaires étaient en contact direct, de même que lorsque les kératinocytes étaient cultivés
dans un milieu conditionné préalablement par des adipocytes (Campbell et al., 2010). De
telles observations avaient d’ailleurs été décrites précédemment en utilisant des techniques
de co-culture (Aoki et al., 2004, Misago et al., 1998, Sugihara et al., 2001).
1.1.4.1.2 Cellules souches extraites du tissu adipeux (CSTA)
Plusieurs tissus humains sont connus pour contenir une sous-population cellulaire
décrite comme étant des cellules souches. Trois conditions définissent ce qu’est une
population de cellules souches; elle doit être capable de s’auto-régénérer, elle doit présenter
une fonctionnalité et une viabilité à long terme et doit pouvoir se différencier en plusieurs
types de cellules spécialisées (Zuk et al., 2002, Verfaillie, 2002). Plusieurs populations de
9
cellules mésenchymateuses contiennent des cellules souches multipotentes, dont la moelle
osseuse (Prockop, 1997, Pittenger et al., 1999, Jiang et al., 2002), le derme (Toma et al.,
2001, Toma et al., 2005) et le cordon ombilical (Wang et al., 2004).
Les CSTA, ou cellules souches/stromales extraites du tissu adipeux, résident dans le
tissu adipeux humain. Ces cellules souches multipotentes décrites pour la première fois en
2001 ont la capacité de se différencier en différents types cellulaires tels que les
chondrocytes, les ostéoblastes, les adipocytes, les cellules neuronales et les cellules
musculaires lisses (Zuk et al., 2001, Safford et al., 2002, Zuk et al., 2002). Près de 2% des
cellules contenues dans le tissu adipeux auraient d’ailleurs des propriétés de cellules
souches (Strem et al., 2005). Les propriétés des CSTA en regard de la guérison des plaies
sont abordées à la section 1.3.2.
1.2 La guérison des plaies cutanées
La peau est un organe volumineux qui est susceptible de subir divers traumatismes
tels que des brûlures, des coupures et des ulcères. Pour être en mesure de réparer et de
résister à ce risque éminent de lésions, elle est munie d’un processus de guérison efficace et
rapide qui lui permet de recouvrir partiellement ou totalement ses fonctions initiales. Ce
processus continu de guérison se divise classiquement en trois phases qui s’entrecroisent,
soit la phase inflammatoire, la phase proliférative et la phase de remodelage.
1.2.1 Physiologie de la guérison
1.2.1.1 La phase inflammatoire
Une lésion traumatique de la peau provoque le bris localisé de l’épiderme et du
derme à un degré variable. Une lésion qui atteint le tissu conjonctif brise également des
capillaires et des vaisseaux de petit calibre. Le sang qui s’échappe et qui entre en contact
avec les tissus lésés forme en quelques minutes seulement un « bouchon plaquettaire »
permettant de stopper le saignement. Au cours des heures suivantes, ce bouchon est
remplacé par une structure de fibrine plus résistante et plus durable. La dégranulation des
10
plaquettes de ce bouchon temporaire ainsi que les cellules du tissu conjonctif local
stimulent alors le recrutement de cellules immunitaires telles que les monocytes et les
polynucléaires neutrophiles vers le site de la plaie (Singer et al., 1999). Ces cellules
débarrassent le site des débris cellulaires, des pathogènes et des corps étrangers s’étant
infiltrés par la plaie (Stadelmann et al., 1998). Les monocytes et les macrophages jouent
également un rôle chimiotactique sur les cellules endothéliales et sécrètent des facteurs de
croissance stimulant la prolifération des fibroblastes du derme (Hunt, 1988, Adamson,
2009). Ces mécanismes d’attraction et de nettoyage initient la guérison et préparent la plaie
aux étapes de guérison subséquentes.
1.2.1.2 La phase proliférative
La phase proliférative comprend trois étapes coordonnées assurant la réparation de
tous les compartiments initiaux de la peau. Ces trois processus sont la réépithélialisation, la
formation d’un tissu de granulation et la néo-vascularisation (Fig 1.3).
Figure 1.3 : Schématisation des principales étapes de la guérison des plaies de la peau.
[Figure modifiée de (Martin, 1997)]
11
1.2.1.2.1 La réépithélialisation
La réépithélialisation d’une plaie est le phénomène par lequel les kératinocytes
reconstruisent une nouvelle couche épithéliale par des processus de migration, de
prolifération et de différenciation cellulaires. Le but premier de ce processus est de rendre à
la peau ses fonctions de protection contre l’environnement extérieur et
d’imperméabilisation du corps. Elle débute quelques heures seulement après l’apparition de
la plaie (Singer et al., 1999). La production de plasmine par les cellules épithéliales en
marge de la plaie permet une dissolution locale du caillot de fibrine et libère l’espace
nécessaire à la migration des kératinocytes. Simultanément, le taux de mitose des
kératinocytes augmente (Stadelmann et al., 1998). De plus, la désorganisation des
desmosomes et des hémidesmosomes retenant habituellement les kératinocytes en place
permet aux cellules de la marge d’effectuer librement un mouvement latéral dirigé vers la
zone lésée (Singer et al., 1999, Hackam et al., 2002). Les kératinocytes utilisent diverses
intégrines nouvellement synthétisées pour parvenir à s’accrocher au derme et à se déplacer
vers le site de la plaie (Martin, 1997). Ce sont les kératinocytes de la couche basale qui ont
la capacité de migrer. Une étude sur un modèle de culture organotypique montrerait
toutefois un phénomène complémentaire de « saute-mouton » qui permettrait aux
kératinocytes suprabasaux de participer à la migration. Ils passeraient par-dessus les
cellules basales et s’apposeraient à leur tour à la jonction dermo-épidermique (Garlick et
al., 1994, Laplante et al., 2001).
Différentes explications ont été avancées pour comprendre cette capacité des
kératinocytes à reconnaitre le besoin de migrer et de proliférer de manière organisée pour
recouvrir une plaie. La présence d’une zone non recouverte de kératinocytes entrainant un
bris du contact cellule-cellule pourrait suffire à initier la migration et la prolifération
cellulaire (Singer et al., 1999). Des molécules produites localement telles que l’EGF, le
PDGF, le TGFα et β et le KGF pourraient aussi contribuer à activer les processus de
guérison de l’épithélium (Singer et al., 1999, Barrandon et al., 1987, Moulin, 1995).
D’autres molécules telles que la leptine, le VEGF et l’angiopoïétine-1 seraient impliquées
dans le processus de réépithélialisation (tel que revu à la section 1.3.2.1 Sécrétion de
molécules bioactives), mais leur rôle spécifique dans l’initiation de la réépithélialisation
12
reste à préciser. Un autre mécanisme suggéré est la modification du potentiel
transépithélial. La création d’une plaie modifie ce potentiel et crée un champ électrique qui
s’aligne vers le centre de la plaie, ce qui pourrait diriger le phénomène de réépithélialisation
(Dube et al., 2010). Enfin, les variations de la concentration d’oxyde nitrique (NO) produit
par les kératinocytes au site de plaie pourraient aussi être un facteur important. Une faible
concentration serait liée à une stimulation de la prolifération tandis qu’une forte présence
réduirait la prolifération et activerait la différenciation (Hackam et al., 2002).
Les zones réépithélialisées reforment progressivement de nouveaux desmosomes et
hémidesmosomes qui serviront d’assise à la formation d’un nouvel épiderme fonctionnel.
Une nouvelle membrane basale se forme par le dépôt de collagène de type IV et de
laminine 5 à la jonction dermo-épidermique (Laplante et al., 2001, Kirfel et al., 2004,
Aumailley et al., 1996). D’abord près des marges et ensuite au centre, la différenciation
des kératinocytes s’active pour former un nouvel épiderme possédant toutes les couches
fonctionnelles initiales (Martin, 1997). Il y a également un déplacement passif des couches
supérieures de la marge de la plaie vers le centre (Laplante et al., 2001).
1.2.1.2.2 La formation du tissu de granulation
La formation d’un tissu de granulation se traduit par le développement d’un
nouveau tissu conjonctif remplaçant celui lésé. Les fibroblastes et les cellules endothéliales
prolifèrent et s’organisent pour progressivement recréer un compartiment dermique
fonctionnel. Les macrophages jouent aussi un rôle important en fournissant plusieurs
facteurs de croissance stimulant l’action des fibroblastes et des cellules endothéliales. Les
fibroblastes synthétisent et organisent alors une nouvelle matrice extracellulaire formée
entre autres de fibres de collagène, de fibres élastiques et de glycosaminoglycanes tels que
l’acide hyaluronique (Singer et al., 1999, Stadelmann et al., 1998).
13
1.2.1.2.3 La néovascularisation
Pour soutenir la formation du tissu de granulation, un réseau de capillaires sanguins
est formé par la migration et la prolifération de cellules endothéliales. Des molécules
importantes telles que le bFGF et le VEGF sont liées à l’initiation de cette
néovascularisation (Singer et al., 1999, Stadelmann et al., 1998). Le bFGF est le principal
médiateur de l’angiogenèse durant les premiers jours de guérison tandis que le VEGF
produit par les fibroblastes et les kératinocytes environnants exerce un effet prédominant en
phase de guérison plus avancée (Nissen et al., 1998). D’une manière analogue au
kératinocytes en migration qui dissolvent localement à l’aide de plasmine le caillot de
fibrine lors de la réépithélialisation, les cellules endothéliales stimulent une protéolyse
dirigée du tissu de granulation pour parvenir à créer un nouveau réseau de capillaires
(Martin, 1997).
1.2.1.3 La phase de maturation et de remodelage
Le remodelage du tissu de granulation vers un tissu sain et fonctionnel s’effectue
par un phénomène lent de synthèse et de dégradation des collagènes au sein du derme
(Stadelmann et al., 1998, Singer et al., 1999). Diverses métalloprotéinases caractérisent les
étapes de réorganisation du collagène (Singer et al., 1999). Certains fibroblastes adoptent
un phénotype de myofibroblastes et se contractent pour réduire la superficie de la plaie dès
la deuxième semaine de guérison (Stadelmann et al., 1998, Larochelle et al., 2004,
Tomasek et al., 2002). La solidité de la cicatrice en formation s’accroît au fil des semaines
au rythme de l’accumulation du collagène. Une fois le remodelage terminé, la peau
retrouve environ 70% de sa résistance initiale (Singer et al., 1999).
Dans un contexte physiologique, la guérison d’une plaie est un processus constant et
fiable. Toutefois, plusieurs maladies peuvent influer son déroulement. De fait, le
dérèglement d’un ou plusieurs mécanismes de guérison d’une plaie peut entraîner un retard
et même une chronicisation de la lésion cutanée. Des maladies bien connues, telles que le
diabète et l’insuffisance veineuse, sont à l’origine de problèmes importants de guérison.
14
1.2.2 La pathogénie des plaies chroniques
Les plaies chroniques sont causées par différents types de pathologies, tels que des
maladies vasculaires, métaboliques ou neurologiques (Fauci et al., 2008). Malgré des écarts
marqués dans les étiologies pouvant expliquer leur apparition, les conséquences
individuelles et collectives des ulcères qui résultent de ces problématiques de santé se
ressemblent. Les traitements ont aussi beaucoup de points en commun. Ce sont surtout les
personnes âgées qui sont atteintes de plaies chroniques, car l’efficacité de leurs mécanismes
intrinsèques de guérison des plaies est réduite (Mustoe, 2004). Les principales causes
d’ulcération chronique sont les plaies de pression, l’insuffisance artérielle, le diabète et
l’insuffisance veineuse (Brunicardi et al., 2006, Mustoe, 2004). Ces deux dernières seront
abordées plus en détail.
1.2.2.1 Le diabète
Il y avait 1,84 million de personnes atteintes du diabète de type 1 ou 2 dans la
population âgée de plus de 12 ans au Canada en 2010, soit 6,4% de la population générale
(StatCan, 2011). Il est prédit que ce nombre bondira au cours des 15 prochaines années
avec l’augmentation de l’incidence de l’obésité. Au Québec, la proportion de diabétiques
est moindre que dans l’ensemble du pays, mais demeure tout de même alarmante (Aras,
2011). Parmi les patients atteints du diabète, 15% auront un ou plusieurs ulcères au cours
de leur vie (Jeffcoate et al., 2003). Ces lésions sont très majoritairement localisées au
niveau des membres inférieurs (Fig 1.4). Quinze à 27% des ulcères diabétiques conduiront
à une amputation au niveau de l’articulation métatarsophalangienne, de la cheville ou
même du genou (Jeffcoate et al., 2003). Près de 50% des personnes amputées à la suite
d’un ulcère diabétique compliqué décèderont dans les trois années suivant la procédure
(Jeffcoate et al., 2003, Fauci et al., 2008).
15
Figure 1.4 : Patient de 60 ans amputé de deux orteils et souffrant d’un ulcère diabétique
classiquement situé à la pointe du deuxième métatarse. [Figure tirée de (Wolff et al., 2005)]
L’une des principales complications du diabète expliquant la formation d’ulcères est
l’apparition progressive d’une neuropathie périphérique. Les pieds sont la première zone
corporelle atteinte par cette destruction des fines fibres nerveuses sensitives. Les personnes
atteintes subissent une réduction de la sensibilité à la douleur ainsi qu’une détérioration de
leur capacité à se situer dans l’espace (proprioception). Elles sont donc davantage sujettes à
subir un traumatisme à leur insu ou à exercer une pression excessive au niveau de leurs
pieds (Fauci et al., 2008). Cette déficience à reconnaitre la douleur augmente le risque de
lésions aiguës au niveau des pieds et augmente par le fait même le risque qu’une plaie
banale devienne un ulcère chronique.
Le diabète provoque également une dégradation de la microvascularisation
corporelle, particulièrement en périphérie. Ce réseau vasculaire endommagé nuit à
l’oxygénation et au transport des substances essentielles au maintien d’une peau intacte
(Jeffcoate et al., 2003). Le diabète amène aussi un dérèglement dans la sécrétion de facteurs
importants dans la guérison des plaies normales. Les personnes diabétiques ont entre autres
des taux de KGF diminués, ce qui pourrait expliquer partiellement les problèmes de
réépithélialisation (Hackam et al., 2002).
16
Enfin, le diabète provoque des changements dans l’efficacité et la stabilité du
système immuno-inflammatoire. L’hyperglycémie réduit entre autres la fonctionnalité et la
prolifération des leucocytes (Jeffcoate et al., 2003) et favorise une présence accrue de
substances pro-inflammatoires telles que TNF-α, IL-1 et IL-6 dans le sérum et au site des
plaies des patients diabétiques (Tellechea et al., 2010). Les leucocytes de patients
diabétiques ont également une capacité de chimiotactisme réduite ainsi qu’un défaut à
s’autoactiver (Delamaire et al., 1997). Les plaies chroniques deviennent donc des portes
d’entrée facilement accessibles à des bactéries telles que Staphylococcus aureus à l’origine
de cellulites et d’ostéomyélites ou Clostridium perfringens à l’origine de la gangrène
gazeuse (Fauci et al., 2008, Jeffcoate et al., 2003).
1.2.2.2 L’insuffisance veineuse
L’insuffisance veineuse est un problème du retour sanguin vers le cœur qui se
manifeste principalement au niveau des membres inférieurs. D’ailleurs, plus de la moitié
des cas d’ulcères au niveau des membres inférieurs sont partiellement ou totalement causés
par un problème associé à la circulation veineuse (Gillespie et al., 2010). Elle est rencontrée
plus fréquemment chez les femmes dans un ratio de 2,8 femmes pour 1 homme (Bevis et
al., 2011). Plus de 600000 personnes aux États-Unis souffrent d’un ou de plusieurs ulcères
veineux (Cherubino et al., 2011).
L’accumulation de sang veineux entraine la formation d’œdème chronique au
niveau des pieds, des chevilles et des jambes atteintes. La pression exercée sur les petits
capillaires des tissus par l’œdème diminue la perfusion et favorise la nécrose de la peau
(Loots et al., 1998, Fauci et al., 2008). Les différents facteurs responsables de maintenir
une guérison des plaies normale qui sont transmis par le sang sont alors moins accessibles
localement (Fauci et al., 2008). Cette pression chronique modifie aussi la morphologie des
capillaires et augmente leur perméabilité, les rendant parfois incapables de retenir les
protéines plasmatiques et la fibrine (Loots et al., 1998). L’apparition d’ulcères est souvent
précédée d’une dermatite progressive et ces ulcères sont généralement localisés au niveau
des malléoles externes (Fauci et al., 2008).
17
1.2.3 Traitements des plaies cutanées
1.2.3.1 Méthodes de base
Les infections doivent être prises en charge rapidement par un antibiotique
approprié. Un antibiotique topique peut être suffisant, mais le recours à un traitement
systémique est souvent nécessaire (Fauci et al., 2008, Jeffcoate et al., 2003). L’utilisation
systématique d’antibiotiques en présence d’ulcères n’est toutefois pas recommandée,
l’amélioration globale de la guérison étant minime ou nulle en absence d’infection sévère
(O'Meara et al., 2000, Game et al., 2012). Le débridage grossier des tissus nécrosés et la
diminution de la charge exercée sur la plaie font couramment partie du traitement des
ulcères (Bennett et al., 2003, Brunicardi et al., 2006). L’utilisation de bas-pression est une
méthode efficace de favoriser la guérison de plaies causées par l’insuffisance veineuse
(Fauci et al., 2008).
La prévention joue également un rôle de premier plan dans le traitement et la prise
en charge des ulcères chroniques chez les patients à risque. Les principales mesures
recommandées pour réduire le risque de chronicisation des plaies sont de choisir avec soin
des chaussures appropriées, d’effectuer quotidiennement des mesures d’hygiène et une
inspection des pieds, de réduire les comportements à risque de blessures (Ex. marcher pieds
nus) et de consulter rapidement un professionnel en présence d’une blessure (Fauci et al.,
2008). Dans le cas du diabète, un contrôle strict de la glycémie ainsi qu’une réduction des
facteurs de risque cardiovasculaire contribuent à réduire l’incidence des plaies chroniques
(DCCT_Research_Group, 1993, UKPDS_Group, 1998). Globalement, les traitements de
base devraient toujours être employés avant d’avoir recours à des technologies plus
complexes et souvent plus coûteuses (Harding et al., 2002).
1.2.3.2 Pansements synthétiques
Il existe de nombreux types de pansements ou de techniques de traitement des
ulcères diabétiques et veineux. Parmi les technologies disponibles, il est difficile de statuer
sur celles qui devraient être mise de l’avant en premier dans le traitement des ulcères
18
diabétiques, tel que conclu par une revue récente et exhaustive des méthodes disponibles
(Game et al., 2012). L’utilisation d’un recouvrement d’hydrocholloïde, combiné ou non à
un antiseptique topique, ou l’utilisation d’un recouvrement dit « sans adhérence »
(pansement muni d’une substance grasse lubrifiante) semble présenter le même profil
d’avantages dans le traitement (Game et al., 2012, Jeffcoate et al., 2009). Notons que
l’utilisation d’une chambre hyperbare semble avoir une efficacité notable et prévient
plusieurs complications graves (Londahl et al., 2010), malgré le fait que cette alternative
coûteuse ne soit pas disponible dans tous les milieux. De plus, les pansements à pression
négative pourraient présenter des avantages dans les délais de guérison, mais
principalement lorsqu’utilisés dans le traitement de plaies postopératoires (Game et al.,
2012, Blume et al., 2008).
1.2.3.3 Pansements cellulaires
Lorsque les options de traitement s’épuisent pour les patients atteints d’ulcères
chroniques, il est possible d’avoir recourt à des alternatives dites cellulaires ou biologiques.
Ces technologies en développement depuis les années 80 commencent à entrer sur le
marché et à faire leurs preuves comme étant cliniquement efficaces et sécuritaires. Une
méta-analyse des différents recouvrements cellulaires commercialement disponibles montre
d’ailleurs une supériorité globale de ces technologies par rapport au traitement
conventionnel et une réduction notable du taux d’infection des plaies chroniques traitées
(Teng et al., 2010).
Le premier tissu reconstruit approuvé et utilisé pour le traitement d’ulcères
chroniques a été Apligraf®. Il a été approuvé pour le traitement des ulcères veineux en
1998 et pour le traitement des ulcères diabétiques en 2000 en démontrant qu’il augmente le
nombre de fermeture complète des plaies (47% versus 19% des contrôles sur 6 mois pour
les ulcères veineux) en plus d’augmenter la vitesse de guérison complète (Zaulyanov et al.,
2007, Falanga et al., 1999). Ces premières utilisations remontent à 1995 comme un
recouvrement potentiel de plaies post-chirurgicales (Eaglstein et al., 1995). Ce
recouvrement bilamellaire est composé de fibroblastes néonataux ensemencés dans une
matrice de collagène bovin de type I recouvert de kératinocytes néonataux. Il s’agit donc
19
d’un recouvrement allogénique contenant des cellules vivantes. Son mécanisme d’action est
imprécis, mais il est avancé que l’action de cytokines sécrétées par le pansement telles que
les interférons α et β, le PDGF et certaines interleukines ainsi que la sécrétion de
composantes servant à la formation de matrice extracellulaire seraient à l’origine des effets
bénéfiques d’Apligraf® [revu dans (Zaulyanov et al., 2007, Shevchenko et al., 2010)]. Il est
actuellement le pansement biologique le plus couramment utilisé dans les cliniques
spécialisées de traitement des plaies chroniques et constitue depuis l’étalon de comparaison
dans l’étude d’autres types de pansements cellulaires. La Figure 1.5 A-B illustre
l’utilisation d’Apligraf® pour recouvrir un ulcère chronique.
D’autres pansements cellulaires sont composés d’un seul type cellulaire, dont
Dermagraft®, qui contient uniquement des fibroblastes néonataux. Ces fibroblastes sont
ensemencés dans une matrice de polyglactine dégradable. Ce pansement est actuellement
reconnu efficace pour recouvrir des ulcères veineux et diabétiques (Marston et al., 2003,
Omar et al., 2004). Il agirait favorablement sur la néovascularisation et favoriserait
également la migration des kératinocytes de la marge d’une plaie (Shevchenko et al., 2010).
La manière d’utiliser Dermagraft® en clinique est illustrée à la Figure 1.5 C-D.
20
Figure 1.5 : Apparence générale des principaux pansements cellulaires disponibles
commercialement. Apligraf® est commercialisé dans un contenant rigide (A) et doit être
appliqué au-delà des marges de la plaie (B), tandis que Dermagraft® est disponible dans
une enveloppe souple et doit être ajusté à la forme de la plaie (D). [Figure modifiée de
(Harding et al., 2002)]
Il existe aussi quelques types de recouvrements cellulaires constitués seulement de
kératinocytes. Les principales caractéristiques de ces pansements, ainsi que celles des
pansements composés de fibroblastes seulement ou d’une combinaison (incluant Apligraf®
et Dermagraft®), sont résumées dans le Tableau 1.1.
21
Tableau 1.1 : Principaux recouvrements biologiques disponibles en clinique pour le traitement de plaies chroniques. [Tableau traduit
et adapté de(Shevchenko et al., 2010)]
Nom
commercial
(Compagnie)
Représentation
schématique
Type
cellulaire
Source
cellulaire
Source
matricielle
Composition
matricielle Utilisation
Apligraf
(Organogenesis)
K / F Allogénique Xénogénique Collagène
bovin
Temporaire;
ulcères diabétiques
et veineux
OrCel
(Ortec
International)
K / F Allogénique Xénogénique
Éponge de
collagène
bovin
Temporaire;
brûlures surtout
(plaies sans
indication
officielle)
MySkin
(CellTran)
K Autologue Synthétique
Support de
silicone et
enduit de
surface
Permanent;
ulcères diabétiques
et plaies de
pression
BioSeed-S
(BioTissue
Technologies)
K Autologue Allogénique Scellant de
fibrine
Permanent;
ulcères veineux
Dermagraft
(Advanced
Biohealing)
F Allogénique Allogénique et
synthétique
PGA, PLA
et matrice
extracellulaire
Temporaire;
ulcères diabétiques
et veineux
Abréviations : K, kératinocytes; F, fibroblastes; PGA, acide polyglycolique; PLA, acide polylactique.
22
Le coût de production de pansements partiellement ou entièrement composés de
cellules est élevé et le bénéfice coût-efficacité d’utiliser de telles technologies a été remis
en question par plusieurs auteurs (Dinh et al., 2006, Langer et al., 2009). Des pansements
comme Apligraf® ont un coût unitaire de 28$/cm2 de pansement, ce qui surpasse
grandement le coût d’un pansement plus traditionnel (Shevchenko et al., 2010). Il est donc
important que les sommes sauvées par la réduction de la morbidité et de la durée du
traitement surpassent ces coûts supplémentaires (Dinh et al., 2006). Une revue
systématique récente des deux principaux pansements cellulaires commercialisés
(Apligraf® et Dermagraft®) conclut que ces deux types de pansement ont un ratio coût-
efficacité favorable lorsqu’utilisés chez des patients correctement sélectionnés (Langer et
al., 2009), c’est-à-dire des patients pour qui une démarche de recouvrement de plaie
traditionnelle prolonge notablement la durée du traitement. Le marketing, la disponibilité et
la facilité d’utilisation (souvent décrit en anglais comme étant le « off-the-shelf use ») et la
capacité de production de masse sont également des facteurs importants du succès
commercial de ces pansements (Mansbridge, 2006).
Il existe d’autres types de recouvrement ne contenant pas de cellules vivantes, mais
plutôt une matrice biologique servant à aider les mécanismes de guérison du corps à rebâtir
le site d’une plaie. Une étude récente comparant les bénéfices d’utiliser une matrice de
collagène nommée PriMatrix® en comparaison à l’utilisation d’Apligraf® conclut que la
matrice appliquée de manière permanente au site de la plaie a permis de favoriser la
guérison plus rapidement qu’Apligraf®, quoique les deux méthodes se soient avérées
efficaces (Karr, 2011). Les différentes matrices à l’étude en guérison des plaies sont revues
de manière extensive par Shevchenko et al (Shevchenko et al., 2010).
Certaines équipes de recherche envisagent de combiner les stratégies ayant un
potentiel de promouvoir la guérison des plaies. En plus de concevoir un recouvrement ou
une matrice contenant des cellules, ils proposent de modifier génétiquement ces cellules
afin de les rendre productrices de molécules pro-angiogéniques ou de molécules favorables
à la réépithélialisation. Ces stratégies de thérapie génique ont été revues par Branski et plus
récemment par Gauglitz (Branski et al., 2009, Gauglitz et al., 2011).
23
1.3 Étude de la guérison des plaies cutanées et potentiel des
cellules souches extraites du tissu adipeux (CSTA)
Afin de décrire les mécanismes de guérison de la peau et d’étudier des pistes de
solution en ce qui a trait au traitement des ulcères chroniques, des études in vitro et in vivo
sont nécessaires avant d’envisager une transition clinique. Divers modèles ont été mis au
point pour permettre des recherches fondamentales représentatives de la guérison humaine.
Les cellules souches extraites du tissu adipeux ont d’ailleurs été l’objet de plusieurs études
visant à caractériser leur potentiel à favoriser la guérison d’une plaie, entre autres par
l’utilisation de tels modèles. Les propriétés sécrétoires des CSTA et des adipocytes
présentent également un potentiel prometteur afin de favoriser la guérison des plaies. Ces
cellules constituent une avenue intéressante dans la création de technologies servant à
guérir des plaies chroniques.
1.3.1 Modèles animaux de la guérison des plaies cutanées
L’utilisation de modèles animaux est largement répandue dans l’évaluation de
méthodes de traitement des plaies ainsi que dans l’étude des différentes phases de la
guérison. Il existe plusieurs techniques afin de recréer un environnement se rapprochant au
maximum de la guérison physiologique des plaies humaines. Il est possible de recréer des
conditions pathologiques par des interventions locales ou systémiques chez des animaux,
tels que l’induction d’un diabète insulinorésistant ou l’ischémie locale.
La souris demeure l’animal le plus fréquemment utilisé en raison de son
accessibilité et de la variété des types disponibles commercialement. Afin d’évaluer
l’impact de différentes interventions voulant favoriser la guérison des plaies, plusieurs
types de souris ont été utilisés jusqu’à ce jour. Plus spécifiquement pour l’étude du
potentiel de guérison des CSTA, certaines études ont utilisé des souris athymiques (Kim et
al., 2007) et d’autres des souris diabétiques db/db (Nambu et al., 2009, Amos et al., 2010).
Ces dernières ont une mutation génétique rendant le récepteur de la leptine inefficace, ce
24
qui provoque une prise de poids rapide, l’induction d’un diabète insulinorésistant dès les
premières semaines de vie et une diminution de leurs capacités de guérison.
D’autres stratégies afin d’altérer la guérison normale des souris ont été explorées au
cours des dernières années. L’irradiation est une méthode permettant d’atténuer les
mécanismes de régénération locaux et systémiques par une destruction importante de la
moelle osseuse, méthode déjà utilisée pour l’évaluation d’injections intraveineuses de
CSTA (Ebrahimian et al., 2009). Une autre technique consiste à provoquer l’ischémie
locale du tissu cutané. Elle consiste à implanter chirurgicalement un aimant circulaire sous
la peau d’une souris et d’ajouter en surface un second aimant de force variable. Selon la
durée de la présence de l’aimant et la pression créée sur le tissu, une plaie se forme
graduellement au centre secondairement au manque de perfusion (Reid et al., 2004, Fang et
al., 2008). Des souris athymiques sont également utilisées pour évaluer certains
recouvrements de CSTA (Altman et al., 2009), malgré que ce type de souris ne présente pas
d’anomalie franche dans les mécanismes de guérison. Elles sont utiles pour l’évaluation de
xénogreffes humaines et permettent l’étude détaillée de certains mécanismes de guérison
tels que l’angiogenèse à l’aide de cellules marquées (Davidson, 1998).
Peu importe le type de souris utilisé, il faut tenir compte des mécanismes
particuliers de la guérison cutanée des rongeurs afin que les plaies produites s’apparentent à
celle de l’humain. Les rongeurs possèdent globalement les mêmes phases de guérison
décrites précédemment, mais le phénomène de contraction de la plaie est prédominant
parmi les divers mécanismes (Davidson, 1998, Hayward et al., 1991, Fang et al., 2008).
Près de 90% de la fermeture d’une lésion cutanée chez les rongeurs serait attribuable à la
contraction (Hayward et al., 1991). Il est donc primordial de contrôler cette variable pour
préserver la validité du modèle. L’une des techniques les plus répandues dans la littérature
récente consiste à fixer à la peau une « attelle » faite de silicone ayant une forme de beigne.
Une fois la plaie faite, le dispositif est centré autour de la plaie, collé à la peau et fixé par
des sutures afin de supporter les marges de la plaie et retenir la force de contraction. Cette
technique simple permet l’étude plus juste du phénomène de réépithélialisation autant chez
les souris saines que diabétiques d’après une étude détaillée de la technique (Galiano et al.,
2004). Contrairement aux chambres de Fusenig utilisées dans l’évaluation de greffe cutanée
25
chez le rongeur (Worst et al., 1974), cette méthode assure le support des tissus environnants
tout en permettant à l’épiderme au pourtour de la plaie de refermer la plaie avec un
minimum de contraction.
Le porc est également un modèle intéressant pour l’étude de la guérison des plaies.
Le porc Yorkshire est probablement le modèle d’étude se rapprochant le plus des
mécanismes de guérison de la peau humaine, particulièrement dans l’étude de la
réépithélialisation (Vardaxis et al., 1997, Wang et al., 2000, Fang et al., 2008). La
contraction est peu présente et les phénomènes de granulation et de réépithélialisation
s’approchent de ceux chez l’humain. La principale limite de ce modèle est technique; les
coûts d’hébergement et d’achat des animaux ainsi que le nombre limité d’animaux pouvant
être utilisés rendent la validité statistique des études limitée (Davidson, 1998). Malgré ces
limites, le porc permet de produire de multiples plaies par animal et constitue un modèle de
choix dans l’étude de la réépithélialisation. Le porc a d’ailleurs déjà été utilisé pour l’étude
des CSTA dans le traitement de plaies cutanées (Fu et al., 2007, Forcheron et al., 2012,
Hadad et al., 2010)
Un autre modèle utilisé est l’oreille de lapin ischémique. En procédant à la ligature
de deux des trois principales artères d’une oreille, il est par la suite possible de créer des
plaies se comportant comme des ulcères chroniques (Steinberg et al., 2012, Ahn et al.,
1990). Certains auteurs choisissent d’effectuer des plaies sur le lapin normal plutôt que la
souris normale puisque la contraction y serait moins importante (Stoff et al., 2009).
1.3.2 Potentiel des cellules du tissu adipeux en guérison des plaies
cutanées
Les cellules souches extraites du tissu adipeux sont actuellement utilisées dans
plusieurs domaines liés à la médecine régénératrice. Elles présentent l’avantage technique
d’être une source abondante de cellules souches et facilement accessible. Elles sont entre
autres utilisées expérimentalement dans la reconstruction orthopédique (Rada et al., 2009)
et urologique (Jack et al., 2009). Elles font également l’objet d’études cliniques dans le
traitement des fistules anales (Garcia-Olmo et al., 2009).
26
Les CSTA font également l’objet de beaucoup d’attention dans le traitement des
plaies cutanées, dont les ulcères diabétiques et veineux. Différentes techniques
d’administration des CSTA sont actuellement à l’essai, tel que revu récemment par
Cherubino (Cherubino et al., 2011) et par notre propre équipe (Labbé et al., 2011b). La voie
d’administration la plus fréquemment utilisée dans la littérature est l’application locale
d’une suspension contenant des CSTA ou l’injection locale de celles-ci (Nie et al., 2011,
Stoff et al., 2009, Lim et al., 2010, Lu et al., 2008, Park et al., 2008, Steinberg et al., 2012,
Amos et al., 2010, Maharlooei et al., 2011). D’autres équipes ont plutôt misé sur la
possibilité de manipuler le véhicule servant à administrer les CSTA. Notons entre autres
l’utilisation de matrices de collagène (Nambu et al., 2009, Nambu et al., 2007), de matrices
faites d’une combinaison collagène-élastine (de Vries et al., 1995) ou de matrices de
fibroïne-chitosane (Altman et al., 2009). Jusqu’à ce jour, très peu d’études proposent une
matrice manipulable et exempte de biomatériau exogène pour mettre une plaie en contact
avec des CSTA ou des adipocytes.
De nombreux auteurs concluent qu’il existe un effet bénéfique notable d’appliquer
des CSTA à une plaie. Parmi ceux-ci, Nie et al. conclut que les cellules souches extraites
du tissu adipeux auraient des effets bénéfiques sur les phénomènes de réépithélialisation
ainsi que sur la formation d’un tissu de granulation, lorsqu’injectées au site d’une plaie. Les
effets ont été observés sur des plaies de rats diabétiques, mais aussi de rats non-diabétiques
(Nie et al., 2011). Cette même étude montre également que les cellules souches sécrètent
des cytokines qui favoriseraient la néovascularisation au site d’une plaie tel que le VEGF
(Nie et al., 2011). Maharlooei et al. a également obtenu des résultats similaires, mais sans
conclure que cet effet bénéfique à la guérison est médié par une vascularisation accrue.
L’effet bénéfique serait attribuable à un autre mécanisme pour le moment inconnu.
Les cellules souches extraites du tissu adipeux agiraient également sur la
prolifération des fibroblastes du derme. Le contact direct entre ces deux types cellulaires
ainsi que les effets paracrines des CSTA favoriseraient le rétablissement du compartiment
dermique dans un contexte de guérison de plaie (Kim et al., 2007). Ces résultats ne sont
toutefois pas confirmés par Maharlooei qui observe une légère baisse du taux de
prolifération des fibroblastes du derme (Maharlooei et al., 2011).
27
La plupart des études comparant l’effet des CSTA en guérison des plaies utilisent le
véhicule seul ou un placebo comme comparatif afin de conclure de l’efficacité. Deux études
récentes ont utilisé des fibroblastes dermiques à titre de comparatif, jugeant qu’il s’agit
probablement du contrôle se rapprochant le plus de l’utilisation actuelle de thérapies
cellulaires (décrites dans la section Pansements cellulaires 1.2.3.3) (Steinberg et al., 2012,
Nie et al., 2011). Dans ces deux études, Nie démontre la supériorité des CSTA par rapport
aux fibroblastes pour favoriser la fermeture de plaies chroniques tandis que Steinberg
conclut que leurs effets s’équivalent (Nie et al., 2011, Steinberg et al., 2012).
1.3.2.1 Sécrétion de molécules bioactives
Les cellules souches extraites du tissu adipeux présentent un potentiel important
pour favoriser la guérison de plaies chroniques. Ces cellules se caractérisent par leur
capacité à produire une quantité notable de substances favorisant la réépithélialisation, la
prolifération des cellules du derme ainsi que l’angiogenèse (Cherubino et al., 2011). Des
molécules produites par les adipocytes ont également un potentiel notable pour favoriser la
fermeture de plaies. Parmi ces substances, la leptine, le VEGF et l’angiopoïétine-1
présentent un intérêt particulier pour leurs effets multiples dans le processus de guérison.
1.3.2.1.1 Leptine
La leptine occupe une place importante dans la physiologie adipeuse et constitue
une molécule d’intérêt dans la compréhension de l’obésité et de ses effets depuis sa
découverte en 1994 (Friedman et al., 1998, Auwerx et al., 1998, Zhang et al., 1994). La
leptine agit sur le contrôle de la satiété au niveau de l’hypothalamus. Lorsque sécrétée, elle
diminue la faim et augmente la lipolyse ayant lieu dans les réserves adipeuses. Elle majore
aussi à la hausse la sensibilité des cellules à l’insuline. Une mutation de son récepteur
entraine chez la souris comme chez l’homme une obésité importante (Mantzoros et al.,
2011). Cette observation a d’ailleurs donné lieu à divers modèles pour l’étude de l’obésité,
du métabolisme des lipides et de la guérison des plaies (tel que revu dans la section 1.3.1).
28
La leptine a aussi fait l’objet d’études sur son rôle dans la guérison des plaies de la
peau. Elle serait un facteur important dans la réépithélialisation des plaies chez les souris
diabétiques. L’administration topique et systémique de leptine chez ces animaux réduirait
entre autres l’atrophie des langues de migration aux marges de la plaie, favorisant ainsi une
fermeture plus rapide des lésions (Frank et al., 2000, Ring et al., 2000). Les kératinocytes
en marge d’une plaie seraient d’ailleurs particulièrement sensibles à la leptine grâce à un
sous-type de récepteur (ObRb) exprimé durant la guérison d’une plaie (Frank et al., 2000).
L’application topique de leptine aurait également un effet favorable sur les plaies non
diabétiques (Frank et al., 2000).
La sécrétion locale de leptine est augmentée durant la guérison, suggérant que la
leptine aurait potentiellement un effet de régulateur dans les mécanismes physiologiques
(Murad et al., 2003, Poeggeler et al., 2010). La leptine agirait sur l’épithélium en guérison
en favorisant entre autres la production de VEGF (Stallmeyer et al., 2001). Les cellules
endothéliales seraient également influencées par la présence de leptine, favorisant ainsi
positivement l’angiogenèse associée à la guérison cutanée (Poeggeler et al., 2010, Liapakis
et al., 2008).
1.3.2.1.2 VEGF
Le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire, ou VEGF, est une protéine
principalement impliquée dans la migration et la prolifération endothéliale lors de la genèse
de nouveaux vaisseaux sanguins (Ferrara et al., 2003). Elle est surtout produite par les
cellules endothéliales, mais elle est également retrouvée dans le sécrétome des cellules
stromales (Rehman et al., 2004) et des adipocytes du tissu adipeux (Rega et al., 2007).
En plus de l’effet angiogénique du VEGF qui contribue à la guérison des plaies, la
molécule aurait un effet direct sur les kératinocytes en guérison. Les kératinocytes seraient
munis de récepteurs VEGFR-1 et VEGFR-2 sur leur membrane cytoplasmique. En
exposant les kératinocytes en monocouche à du VEGF, il y aurait augmentation du taux de
prolifération et de la vitesse de migration (Man et al., 2006). L’effet du VEGF en guérison
29
des plaies serait donc médié par deux mécanismes, c’est-à-dire en agissant à la fois sur
l’angiogenèse et directement sur les kératinocytes.
1.3.2.1.3 Angiopoïétine-1
L’angiopoïétine-1 est un facteur de croissance vasculaire sécrété entre autres par les
cellules stromales adipeuses (Nakagami et al., 2006) et les adipocytes (Dallabrida et al.,
2003). Il y a une production endogène accrue d’angiopoïétine-1 autant dans les plaies de
souris normales que de souris diabétiques (Kampfer et al., 2001). L’application
d’angiopoïétine-1 exogène sur des plaies chez la souris diabétique accélèrerait la vitesse de
fermeture des plaies en augmentant la vitesse de régénération du derme et de l’épiderme.
Cet effet serait médié entre autres par une angiogenèse accrue (Cho et al., 2006).
1.3.3 Peaux reconstruites et contribution du génie tissulaire (méthode
d’auto-assemblage)
La méthode d’auto-assemblage est une technique de culture cellulaire in vitro
favorisant la production et l’organisation de matrice extracellulaire endogène et permettant
de créer des tissus manipulables tridimensionnels. Il s’agit d’une technique d’intérêt à la
fois pour la création de modèles d’études de la peau humaine de même que pour
l’utilisation des CSTA sous la forme de tissus manipulables.
La culture en présence de sérum et de vitamine C permet ainsi de produire des tissus
reconstruits totalement humains et exempts de biomatériau synthétique ou exogène
(L'Heureux et al., 1998). Cette technique a été utilisée pour la reconstruction cutanée et
permet d’obtenir des peaux reconstruites représentatives de la peau normale humaine
(Pouliot et al., 2002, Michel et al., 1999). Ces peaux ou substituts cutanés sont dotés d’un
derme reconstruit à partir de fibroblastes sur lesquels des kératinocytes sont ensemencés et
stimulés à former un épiderme présentant une couche cornée. La peau produite présente
histologiquement toutes les couches épidermiques et exprime aux endroits appropriés des
marqueurs tels que la kératine 10 et le collagène de type IV.
30
Un modèle in vitro de réépithélialisation des plaies cutanées humaines a été
développé au LOEX à partir de ces substituts cutanés (Laplante et al., 2001)et a été utilisé
précédemment dans l’étude de la réépithélialisation (Dube et al., 2010). Il consiste à réaliser
une plaie circulaire sur une peau reconstruite et d’apposer par la suite un feuillet migratoire
de fibroblastes dermiques sous la plaie pour permettre aux kératinocytes de proliférer et de
migrer vers le site de la plaie. Le modèle est entièrement conçu à partir de cellules
humaines. Il est possible à partir de photos macroscopiques de visualiser avec une bonne
précision le front de migration des kératinocytes (Laplante et al., 2001).
La méthode d’auto-assemblage a également été adaptée à la culture des cellules
stromales extraites du tissu adipeux par l’équipe de Dre Fradette au LOEX. Cette technique
permet de produire des stromas à partir de CSTA sur lesquels des kératinocytes peuvent
être ensemencés pour former des substituts cutanés (Trottier et al., 2008). La technique
adaptée, qui consiste à procéder à l’induction des CSTA vers la lignée adipeuse tout en
stimulant la production de matrice, permet la création de substituts adipeux manipulables
reconstruits à partir de CSTA (Vermette et al., 2007). Elle permet également la
reconstruction de peaux tricouches, c’est-à-dire dotée d’un hypoderme sous le derme et
l’épiderme (Trottier et al., 2008). La technique d’auto-assemblage adaptée permet donc de
produire des tissus manipulables contenant des adipocytes matures à partir de CSTA, et ce,
sans l’ajout de biomatériau exogène. L’épaisseur de ces tissus peut être ajustée par le
regroupement de plusieurs feuillets cellulaires cultivés individuellement.
31
1.4 Problématique, hypothèse et objectifs
Malgré les récentes avancées dans le traitement des plaies chroniques, de nombreux
patients demeurent dans l’incapacité de reprendre un niveau de fonctionnement optimal en
raison de plaies persistantes. La chronicité de ces lésions prolonge les temps
d’hospitalisation et expose les patients à plusieurs complications sévères passant de
l’infection à l’amputation. Dans un contexte épidémiologique où la prévalence du diabète et
de ses complications immédiates ne cessent d’augmenter, la diversité des options
thérapeutiques et leur efficacité à permettre la guérison de plaies cutanées chroniques sont
une préoccupation clinique importante.
L’étude de la guérison des plaies est complexe et nécessite l’utilisation de modèles
d’étude afin de décortiquer les mécanismes qui la sous-tendent et de les évaluer. La
reconstruction tissulaire par la méthode d’auto-assemblage est une stratégie intéressante
afin de produire des peaux permettant l’étude de la guérison cutanée. Les connaissances
actuelles sur la formation et la structure normale de la peau permettent entre autres
d’utiliser ce modèle dans l’évaluation détaillée de la guérison.
Les cellules souches extraites du tissu adipeux (CSTA) possèdent des propriétés les
rendant attrayantes en guérison de plaie cutanée. En plus d’être une source cellulaire
abondante et disponible, les CSTA et les adipocytes ont montré être favorables au
processus de guérison par leurs sécrétions protéiques. Des tissus conjonctifs ou adipeux
peuvent d’ailleurs être produits par auto-assemblage à partir de CSTA sans ajout de
biomatériau exogène, ce qui pourrait permettre la création de technologies efficaces et
facilement disponibles en clinique (« off-the-shelf »).
L’hypothèse de travail est que les CSTA différenciées ou non in vitro en
adipocytes et utilisées sous la forme de pansements biologiques produits par génie tissulaire
favoriseront la guérison de plaies cutanées in vitro de manière comparable ou supérieure à
des pansements formés de fibroblastes dermiques. L’utilisation de CSTA pour former des
pansements influencerait positivement la formation d’un nouvel épiderme par rapport aux
fibroblastes dermiques qui sont actuellement utilisés pour former les pansements
32
biologiques disponibles commercialement. La présence d’adipocytes dans les pansements
serait également bénéfique sur la réépithélialisation par le biais du sécrétome produit
localement.
Le premier objectif spécifique poursuivi est de produire par génie tissulaire des
pansements biologiques humains facilement manipulables et pouvant aisément servir de
recouvrement pour une plaie cutanée. La composition des pansements sera évaluée
macroscopiquement, microscopiquement et par des coupes histologiques. La capacité des
pansements à produire des molécules bioactives favorables à la guérison des plaies sera
quantifiée à l’aide de dosages protéiques de type ELISA. La conception d’un modèle de
guérison des plaies adapté à l’étude de pansements biologiques permettra également de
décrire l’utilisation en plus de permettre leur évaluation plus détaillée.
Le second objectif spécifique poursuivi est de comparer le potentiel des
pansements biologiques produits à favoriser la fermeture d’une plaie cutanée in vitro en
mesurant et en comparant la progression de la réépithélialisation selon le type de pansement
appliqué. Des photos macroscopiques permettront de mesurer et de comparer la cinétique
de guérison des plaies selon le pansement utilisé. Des colorations histologiques et
immunohistochimiques permettront de caractériser le processus de réépithélialisation.
Les pansements biologiques constitués de CSTA et conçus par génie tissulaire
constituent une avenue intéressante pour le traitement d’ulcères et de plaies chroniques. Ils
s’ajouteraient à l’arsenal thérapeutique actuel et permettront peut-être de traiter plus
facilement les atteintes cutanées réfractaires. Les CSTA pourraient constituer une
alternative intéressante et accessible pour optimiser la production actuelle de pansements
cellulaires. Le projet représente ainsi un espoir supplémentaire vers l’élaboration de
technologies cliniques efficaces pour accélérer la guérison des plaies.
33
2 Chapitre 2 - Matériel et méthode
34
2.1 Production de peaux bilamellaires humaines reconstruites
in vitro par auto-assemblage
Les étapes menant à la production de peaux bilamellaires humaines reconstruites in
vitro par auto-assemblage sont illustrées à la Figure 2.1. Les cellules utilisées pour la
production de peaux reconstruites, de feuillets migratoires dermiques et de pansements
biologiques ont été prélevées des tissus de donneurs sains ayant consenti de manière libre à
une procédure chirurgicale esthétique. Les donneurs ont consenti à ce que leurs tissus
résiduels soient utilisés dans le cadre du projet de recherche approuvé par le comité
d’éthique du Centre Hospitalier Affilié (CHA).
2.1.1 Production du derme des peaux reconstruites
Un traitement à la thermolysine est effectué sur les biopsies de peau prélevées. Cette
technique permet de séparer l’épiderme du derme et de subséquemment mettre en
suspension les cellules de chaque compartiment (Larouche et al., 2009, Auger et al., 1995,
Germain et al., 1993). Des fibroblastes sont ainsi isolés du compartiment dermique tandis
que des kératinocytes sont extraits du compartiment épidermique. Les cellules sont
congelées dans l’azote liquide au passage 0 et sont disponibles pour une utilisation
prochaine. Le Tableau 2.1 décrit les différentes populations cellulaires utilisées pour la
production de dermes reconstruits.
Tableau 2.1 : Populations cellulaires de fibroblastes utilisés pour la production de dermes
reconstruits et de feuillets migratoires.
Population
cellulaire Âge Sexe
Passage
utilisé Contexte d’utilisation
Fibro♀21 21 ans Femme P4 Étude pilote
F150698♀25 25 ans Femme P4-P5 Première, deuxième et troisième étude
Des fibroblastes sont décongelés et ensemencés dans des flacons Nunc© de 75 cm2 à
une densité de 8 x 103 cellules/cm2 pour procéder à leur amplification. Des comptes au
35
bleu de trypan permettent de déterminer le nombre de cellules et la viabilité de celles-ci
avant l’ensemencement. Les cellules sont cultivées durant sept jours dans un milieu
d’expansion 1:1 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DME) : Ham’s F12 (H) medium
(Invitrogen, Burlington, ON, Canada) additionné de 10% de sérum de veau fœtal (SVF,
Hyclone, Logan, UT, USA) et d’antibiotiques (100 UL/ml pénicilline et 25 µg/mL
gentamicine, Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA). Ce milieu est utilisé uniformément pour
la culture des fibroblastes et des CSTA servant aux pansements ainsi que pour la culture
des fibroblastes des peaux reconstruites et des feuillets migratoires. Les cellules à
confluence sont alors trypsinées et des comptes au bleu de trypan et au Coulter (Coulter
Counter, Beckman Coulter, FL, USA) sont effectués pour déterminer à nouveau le nombre,
la viabilité et la grosseur des cellules. Les cellules sont incubées à 37°C dans 8% de CO2 et
les milieux de culture sont changés tous les deux ou trois jours.Ces étapes d’amplification
sont répétées jusqu’au passage 3 ou 4 pour obtenir suffisamment de cellules.
Les fibroblastes sont ensuite trypsinés et ensemencés (1,56 x 104 cellules/cm2)dans
des plaques six puits Nunc (VWR international, Mississauga, Ont, Canada, puits de 9,6
cm2) contenant un ancrage de papier filtre (Whatman, Fisher Scientific, Ottawa, Ont,
Canada) (Labbé et al., 2011a). Des lingots en acier inoxydable sont ajoutés quelques heures
suivant l’ensemencement pour maintenir l’ancrage au fond du puits. Les ancrages rendent
les feuillets plus faciles à manipuler (superficie interne de l’ancrage de 3,5 cm2/feuillet) et
préviennent la contraction des cellules (Lopez Valle et al., 1992). Les cellules sont cultivées
dans le même milieu de culture que lors de l’amplification pour une durée de 28 jours, à
l’exception qu’il est additionné de 50 µg/mL (250 µM) d’acide ascorbique (Sigma) préparé
du jour dans le but de stimuler la production et l’organisation de la matrice extracellulaire
(L'Heureux et al., 1998, Michel et al., 1999). Les milieux de culture sont changés tous les
deux ou trois jours dans des conditions d’incubation similaire à l’étape d’amplification.
36
Figure 2.1 : Étapes de production de peaux bilamellaires reconstruites in vitro.
Après 28 jours en culture, les fibroblastes ont formé des feuillets cellulaires
manipulables qui peuvent être empilés. Pour recréer le compartiment dermique de la peau
reconstruite, deux feuillets sont empilés et brochés ensemble par l’ancrage en conservant
l’orientation originale. Cet empilement de feuillets a pour but de produire un tissu plus
épais. Un anneau d’ensemencement, deux éponges faites de Merocel© et trois petits poids
en acier sont ajoutés sur chaque empilement pour assurer une meilleure cohésion des
feuillets entre eux. Après 24 heures, les Merocel© et l’anneau sont retirés et les petits poids
sont placés sur l’ancrage pour maintenir l’empilement immergé dans le milieu de culture.
L’empilement demeure en culture pour trois jours dans un pétri contenant du milieu
d’expansion additionné d’acide ascorbique avant d’être utilisé comme support à
l’ensemencement des kératinocytes.
2.1.2 Production de l’épiderme des peaux reconstruites
Parallèlement, des kératinocytes sont décongelés et ensemencés dans des flacons
Nunc© de 75 cm2 à une densité de 6,6 x 103 cellules/cm2 pour procéder à leur
amplification. Ils sont ensemencés conjointement à des 3T3 irradiés de souris à une densité
de 2 x 104 cellules/cm2 qui servent de couche nourricière aux kératinocytes en culture
(Green et al., 1979). Les cellules sont cultivées dans un milieu pour kératinocytes décrit au
37
Tableau 2.2. Les conditions d’incubation sont les mêmes que pour les fibroblastes et les
milieux de culture sont changés tous les deux ou trois jours.Habituellement après cinq jours
de culture, les kératinocytes ont atteint une confluence de 80% et sont trypsinés. Un anneau
d’ensemencement est alors placé sur chaque empilement de fibroblastes (derme reconstruit)
pour permettre l’ajout de 8 x 105 kératinocytes par peau, soit 2,3 x 105 cellules/cm2. Cette
étape est effectuée au troisième jour suivant l’empilement des feuillets dermiques. Pour
permettre la prolifération des kératinocytes, la peau est laissée en culture immergée pendant
sept jours dans un milieu pour kératinocytes additionné d’acide ascorbique (50 µg/ml).
Tableau 2.2 : Composition du milieu de culture pour kératinocytes. [Traduit de (Larouche
et al., 2009)]
Composante Concentration
3:1 DME : Ham’s F12 medium (Invitrogen) 95% (v/v)
Sérum Fetal clone II (Hyclone) 5% (v/v)
Insuline (Sigma) 5 g/mL
Hydrocortisone (Calbiochem, San Diego, CA) 0.4 g/mL
Toxine du cholera (Sigma) 10-10 M
EGF (Austral Biologicals, San Ramon, CA, USA) 10 ng/mL
Pénicilline G et gentamicine (Sigma) Pénicilline G 100 IU/mL
Gentamicine 25 mg/mL
Abréviations : DME, Dulbecco’s modified Eagle’s medium; EGF, Epithelial growth factor.
Les peaux sont ensuite placées à l’interface air-liquide durant 14 jours pour
permettre une différenciation appropriée des kératinocytes de l’épiderme. Les peaux sont
déposées sur de petites tables en plastique conçues pour permettre au derme d’être en
contact avec le milieu de culture et à l’épiderme d’être en contact avec l’air. Une plaque de
plastique dotée d’un trou au centre et deux poids sont placés par-dessus l’ancrage pour
maintenir la peau en place (Dube et al., 2010). L’EGF normalement contenu dans le milieu
de culture pour kératinocytes est retiré pour favoriser la différenciation plutôt que la
prolifération cellulaire. Les peaux sont incubées à 37°C dans 8% de CO2 et les milieux de
38
culture sont changés tous les deux ou trois jours. Au septième des 14 jours de culture à
l’interface air-liquide, les peaux sont soulevées et replacées sur les tables pour prévenir
l’adhésion. Le temps total de production d’une peau reconstruite depuis l’étape
d’ensemencement en plaque des fibroblastes est de 52 jours en utilisant la technique
présentée.
2.2 Production de feuillets migratoires dermiques
Des fibroblastes dermiques sont décongelés et ensemencés dans des flacons Nunc©
de 75 cm2 à une densité de 8 x 103 cellules/cm2 pour procéder à leur amplification suivant
les mêmes étapes que celles décrites à la section 2.1 pour les fibroblastes servant à la
reconstruction du compartiment dermique. Au passage 4 ou 5, les fibroblastes sont
trypsinés et ensemencés en plaque. Ils sont gardés en culture pendant 28 jours dans un
milieu d’expansion additionné d’acide ascorbique (50 µg/ml) pour former des feuillets
manipulables (comme à la section 2.1). Chaque feuillet individuel peut alors être utilisé
comme feuillet migratoire sous une plaie (tel que décrit à la section 2.4).
2.3 Production de pansements biologiques
Les étapes menant à la production de pansements biologiques sont illustrées à la
Figure 2.2. Des cellules stromales/souches extraites du tissu adipeux (CSTA) sont
prélevées du lipoaspirat obtenu de patientes subissant une intervention esthétique. Par une
technique de digestion à la collagénase précédemment décrite (Zuk et al., 2001, Hauner et
al., 1989), des CSTA sont extraites et mises en culture pour sept jours. Les cellules sont
alors trypsinées, congelées dans l’azote liquide au passage 0 et disponibles pour une
utilisation prochaine. Des fibroblastes dermiques ont été extraits d’une biopsie de peau
prélevée lors d’une lipectomie par une technique similaire de digestion à la collagénase
(Trottier et al., 2008) et congelés dans l’azote jusqu’à leur utilisation. Les populations
cellulaires utilisées ont été décongelées d’une banque préalablement produite au sein de
l’équipe de Dre Fradette. Le Tableau 2.3 décrit les différentes populations cellulaires
utilisées pour la production de pansements biologiques.
39
Tableau 2.3 : Populations cellulaires de CSTA et de fibroblastes utilisées pour la
production de pansements biologiques.
Population
cellulaire Âge Sexe
Passage
utilisé Contexte d’utilisation
200705FLP♀33
(Fibroblastes) 33 ans Femme P3
Pilote, deuxième et troisième
étude
200705LA♀33 (CSTA)
33 ans Femme P3 Pilote, deuxième et troisième
étude
070207LA♀36 (CSTA)
36 ans Femme P3 Première étude
Les CSTA et les fibroblastes sont décongelés et ensemencés respectivement dans
des flacons Nunc© de 75 cm2 à une densité de 8 x 103 cellules/cm2 pour procéder à leur
amplification. La technique de culture et le milieu d’expansion utilisés sont similaires à ce
qui a été précédemment décrit à la section 2.1 pour les fibroblastes dermiques servant à la
production de la peau reconstruite. Ces étapes d’amplification sont répétées jusqu’au
troisième passage pour les CSTA ainsi que les fibroblastes dermiques.
Figure 2.2 : Étapes de production de pansements biologiques en fonction du type cellulaire
utilisé.
Les CSTA et les fibroblastes sont ensuite trypsinés et ensemencés (1,56 x 104
cellules/cm2) dans des plaques six puits Nunc© (VWR International) avec un ancrage de
papier filtre (Whatman). Les feuillets cellulaires destinés à créer des pansements de CSTA
et des pansements de fibroblastes sont mis en culture en utilisant les mêmes techniques
40
servant à concevoir le derme des peaux reconstruites à la section 2.1. Les cellules sont
cultivées pour une durée de 28 jours et additionnées de 50 µg/mL (250 µM) d’acide
ascorbique préparé du jour.
Pour les CSTA destinées à former des pansements adipeux, la technique
d’ensemencement est similaire à celle précédemment décrite. Le milieu d’expansion est
utilisé durant les 10 premiers jours de culture. Après ces 10 jours, les CSTA sont induites à
se différencier en adipocytes grâce à l’ajout d’un cocktail adipogénique (Deslex et al.,
1987, Hauner et al., 1989). La composition du milieu d’induction qui permet la
différenciation des CSTA est décrite au Tableau 2.4. Après trois jours d’induction, la
culture est poursuivie pendant 15 jours avec un milieu adipogénique composé de milieu
d’expansion additionné de 100 nM d’insuline, 0,2 nM de T3 et 1 M de dexaméthasone. Ce
milieu permet la formation de feuillets contenant des adipocytes. Les différents milieux de
culture et d’induction utilisés sont additionnés d’acide ascorbique (50 µg/ml) durant les 28
jours de culture des feuillets.
Tableau 2.4 : Composition du milieu d’induction adipogénique. [Tableau traduit de (Labbé
et al., 2011a)]
Composante Concentration
1:1 DME : Ham’s F12 medium (Invitrogen) 96% (v/v)
Sérum de veau fœtal (Hyclone) 3% (v/v)
IBMX (Sigma) 0.25 mM
Rosiglitazone (Cederlane, Horby, ON, Canada) 1 M
Insuline (Sigma) 100 nM
Dexaméthasone (Sigma) 1 M
T3 (Sigma) 0.2 nM
Pénicilline G et gentamicine (Sigma) Pénicilline G 100 IU/mL
Gentamicine 25 mg/mL
Abréviations : DME, Dulbecco’s modified Eagle’s medium; IBMX, 3-isobutyl-1-
méthylxanthine; T3, triiodothyronine.
41
Après 28 jours en culture, les fibroblastes, les CSTA non-induites et les CSTA
induites à se différencier en adipocytes ont formé des feuillets cellulaires manipulables qui
sont utilisés pour former trois types de pansement. Des empilements de deux ou trois
feuillets de chaque type respectif sont utilisés selon l’étude réalisée (décrit à la section 2.5).
Les feuillets cellulaires sont empilés et brochés ensemble par l’ancrage et gardés en culture
pendant sept jours de la même manière que celle décrite pour les compartiments dermiques
à la section 2.1. La durée totale de la production d’un pansement biologique depuis l’étape
d’ensemencement en plaque est de 35 jours en utilisant la technique présentée.
2.4 Réalisation du modèle d’étude
Les étapes de production des peaux reconstruites, des pansements biologiques et des
feuillets migratoires sont coordonnées de telle sorte que la production prenne fin le même
jour. Les étapes de la réalisation du modèle d’étude ainsi que les principales conditions
expérimentales sont illustrées à la Figure 2.3.
42
Figure 2.3 : Étapes de réalisation du modèle d’étude de guérison des plaies selon la
condition expérimentale à l’étude. Cette figure représente une schématisation transversale
du modèle d’étude en utilisant des pansements formés de trois feuillets cellulaires.
Abréviations : CSTA, Cellules stromales/souches extraites du tissu adipeux; F, Feuillet de
fibroblastes dermiques; K, Kératinocytes.
Au jour de création des plaies, les peaux sont retirées des tables de plastique et
déposées au fond d’un pétri humidifié de milieu. Une photo macroscopique de chaque peau
est prise telle que décrite à la section 2.6. Une plaie de 8 mm de diamètre est alors faite sur
chaque peau reconstruite à l’aide d’un échantillonneur cutané (Acuderm, Fort Lauderdale,
FL, USA). Cette étape doit être effectuée avec soin pour s’assurer que la plaie est dotée de
marges uniformes. Un feuillet migratoire maintenu dans son orientation originale est
ensuite broché sous la plaie et servira de surface de migration pour les kératinocytes lors de
la réépithélialisation. Une seconde photo macroscopique de la plaie est prise après l’ajout
du feuillet migratoire. Le montage est alors replacé sur une table de plastique en interface
air-liquide. Un pansement biologique est ensuite ajouté selon la condition expérimentale.
L’orientation du pansement est soit maintenue dans l’orientation originale d’empilement
des feuillets ou inversée avant d’être apposé sur la plaie (paramètre qui variera selon
43
l’expérience, voir Tableau 2.5). De plus, il n’est pas broché pour qu’il puisse être
facilement retiré lors de la prise de photo quotidienne. Un milieu de culture pour
kératinocytes sans EGF et contenant 2% de sérum H plutôt que 5% est utilisé pour toutes
les conditions expérimentales. La quantité de sérum est diminuée dans le but de favoriser la
détection des effets possibles des pansements. Un changement de milieu est effectué au
troisième jour suivant la plaie. L’aspect général du montage réalisé est illustré à la Figure
2.4.
Figure 2.4 : Aspect général du modèle d’étude réalisé (A-B).
2.5 Devis expérimentaux
Le présent projet a évalué cinq conditions expérimentales distinctes au cours des
différentes cultures réalisées. La Figure 2.3 illustre d’ailleurs les principales conditions
expérimentales réalisées. Le Tableau 2.5 résume l’ensemble des cultures réalisées, les
principaux paramètres de chacune ainsi que les conditions expérimentales à l’étude. Le
nom de chaque expérience est celui utilisé dans la section Résultats.
44
Tableau 2.5 : Résumé des devis expérimentaux réalisés et des principaux paramètres de
chacun.
Nom de
l’expérience
réalisée
Conditions
expérimentales
à l’étude
Nombre de
montage pour
chaque condition*
Pansement
double (D)
ou triple (T)
Méthode de
prise de photo
utilisée
Étude pilote F, S, A, ØP n = 5 n = 5 D Méthode 1**
Première étude S, A n = 9 D Méthode 2
Deuxième étude F, S, A, A2J, ØP n = 2 n = 5 T Méthode 2
Troisième étude F, S, A n = 6 T Méthode 2
*, Les nombres de montages en double représentent le nombre de montages par groupe
pour des séries biopsiées aux 3e et 6e jours de guérison respectivement. Les cases uniques
représentent des tissus qui ont été biopsiés au 6e jour de guérison.
**, Cette expérience a été réalisée en maintenant les pansements dans leur orientation
originale d’empilement. Les pansements sont inversés pour les autres études.
Abréviations : F, Pansement de fibroblastes; S, Pansement de CSTA; A, Pansement
adipeux; A2J, Pansement adipeux remplacé à chaque 2 jours de guérison; ØP, Plaie sans
pansement. Les Méthodes 1 et 2 sont décrites à la section 2.7.
Le nombre de plaies pour chacun des groupes a été déterminé en considérant la
disponibilité du matériel, les ressources humaines disponibles, la faisabilité technique ainsi
que l’analyse statistique prévue.
2.6 Prise de photos macroscopiques des peaux et des plaies
Des photos macroscopiques sont prises au moment de l’assemblage du modèle
d’étude pour qualifier l’aspect général de l’épiderme différencié et les contours de la plaie
(fait une seule fois au jour zéro pour toutes les plaies, tel que décrit à la section 2.4). Une
caméra Canon EOS Rebel XS (Canon, Mississauga, ON, Canada) est fixée à un trépied et
déposée sur une surface plane. Le tout est collé provisoirement à la surface pour assurer la
stabilité du positionnement au cours de l’utilisation. Le pétri contenant la peau ou la plaie à
photographier est alors déposé sous l’appareil ajusté pour une prise de photo en mode
rapproché. Une règle est photographiée à titre d’échelle de mesure.
45
2.7 Suivi de la progression de la réépithélialisation dans le
temps
Deux méthodes de prise de photos ont été utilisées au cours du présent projet. Dans
les deux cas, ces méthodes ont été utilisées pour suivre dans le temps l’aire des plaies qui
s’est refermée en distinguant le front de migration des kératinocytes qui est visible. Des
photos ont été prises à chaque jour de guérison débutant par le jour 0 où la plaie a été faite
jusqu’au jour 6.
2.7.1 Méthode 1
Les photos ont été prises à partir d’un stéréomicroscope Nikon SMZ800 (Nikon,
Mississauga, ON, Canada) équipé de la caméra Nikon Coolpix 4500 (Nikon). Le pétri
contenant le montage formé de la plaie et du pansement (tel que décrit à la section 2.4) a été
placé directement sur la surface du stéréomicroscope pour la prise de photo en présence du
pansement. Deux photos avec des conditions de luminosité et de contraste différentes ont
été prises pour chaque montage. Une règle a été photographiée à intervalle régulier pour
servir d’échelle de mesure.
2.7.2 Méthode 2
Les photos ont été prises en utilisant le même équipement qu’à la méthode
précédente. Sous une hotte à flux laminaire, la plaque de plastique et les poids déposés sur
le montage ont été placés temporairement dans un pétri de transfert. Le pansement a ensuite
été délicatement retiré et déposé face vers le bas dans un autre pétri de transfert humidifié
de milieu de culture. La peau lésée a été déposée au fond d’un pétri humidifié pour la prise
de photo avec deux conditions d’éclairage différentes. Le montage a ensuite été réassemblé
et le pétri replacé à l’incubateur. Une règle a été photographiée à intervalle régulier pour
servir d’échelle de mesure.
46
2.8 Mesure de l’aire réépithélialisée de la plaie
Les photos prises pour suivre la progression de la réépithélialisation dans le temps
ont été analysées en utilisant le logiciel Image J (NIH, disponible en ligne à
http://rsbweb.nih.gov/ij). L’aire non-réépithélialisée ainsi que l’aire totale de la plaie
d’origine ont été mesurées pour chaque plaie avec l’outil de création de polygone ajusté à
l’échelle de mesure tel que montré à la Figure 2.5. Toutes les plaies ont été mesurées par
deux personnes différentes, dont une à l’aveugle, pour confirmer la reproductibilité des
mesures prises. Le pourcentage de variation inter-évaluateur pour chaque mesure n’a jamais
excédé 3% et se situe en moyenne à 1,0%.
Figure 2.5 : Exemple des photos ayant servies à générer les résultats de mesure d’aire non-
réépithélialisée et d’aire totale de la plaie originale. Le cercle pointillé contient l’aire qui
n’est pas encore réépithélialisée tandis que le cercle plein contient l’aire de la plaie
originale (photo prise avec la Méthode 2). Abréviations : FM, Feuillet migratoire; P, Peau
intacte; Z, Zone réépithélialisée. Ligne pointillée : front de migration.
La proportion de l’aire de la plaie qui est non-réépithélialisée à un jour donné a
ensuite été exprimée en pourcentage à l’aide de la formule suivante : (Aire non-
réépithélialisée / Aire totale de la plaie au jour 0) x 100. Des moyennes regroupant tous les
montages d’une même condition expérimentale ont ensuite été calculées pour chaque jour
de mesure et analysées graphiquement à l’aide de GraphPad Prism 5 (GraphPad Software,
La Jolla, CA, USA). Les résultats sont finalement exprimés sous forme de graphe relatant
la progression de la guérison en fonction du temps pour chaque condition expérimentale.
P
FM
Z
47
2.9 Analyse des peaux, des plaies et des pansements
La peau coupée au moment de faire la plaie est utilisée pour effectuer des analyses
qualitatives telles que des colorations histologiques au trichrome de Masson. De plus, à
différents temps lors de la guérison, des biopsies des plaies en cours de réépithélialisation
ainsi que des pansements de chaque type étudié sont utilisés pour des analyses
histologiques et des détections immunohistochimiques.
2.9.1 Analyse des peaux
Des biopsies ont été réalisées sur des morceaux de peau retirés en effectuant les
plaies (au jour 0). Pour chacune des expériences décrites au Tableau 2.5, six biopsies ont
été conservées et découpées en quatre morceaux égaux. Deux des quatre morceaux produits
ont été fixés au formol tamponné à 10% et enrobés dans la paraffine. Des coupes
transversales de 5µm ont ensuite été colorées au trichrome de Masson pour évaluer l’aspect
histologique général des peaux le jour correspondant à celui de la réalisation du montage.
Les deux autres morceaux de chaque biopsie ont été enrobés frais sans fixation dans la
solution Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA) et congelés à -80oC.
2.9.2 Analyse des plaies
Toutes les plaies réalisées au cours des différentes études ont été biopsiées. Tel que
décrit dans le Tableau 2.5, des plaies ont été biopsiées après trois et six jours afin de
décrire qualitativement la progression de la guérison dans le temps. Chaque plaie a été
coupée en quatre fines lisières afin de préserver l’architecture complète du front de
migration. Deux lisières par plaie ont été colorées au trichrome de Masson par la même
technique que pour les peaux. Des photos de ces coupes colorées ont ensuite été prises à
partir d’un microscope AxioObserver Z1 (Zeiss, Mississauga, ON, Canada) à l’aide d’une
caméra AxioCam ICc1 (Zeiss). Elles ont été prises en utilisant un objectif 10X DICI
accompagné du filtre approprié. Une seule photo de chaque plaie a été obtenue à partir
d’une mosaïque de photos individuelles. Cette photo a été assemblée par le logiciel
48
AxioVision 4.2.8 (Zeiss). Les deux autres lisières réalisées sur chaque plaie ont été
enrobées fraiches sans fixation dans la solution Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek) et
congelées à -80oC.
En plus des colorations histologiques, des analyses immunohistochimiques ont été
réalisées sur les lisières de plaies biopsiées lors de la deuxième étude. Pour chaque groupe
expérimental, les tissus congelés de trois plaies ont été analysés. Des coupes de 5 µm
d’épaisseur ont été produites avec un cryostat Leica CM3050 (Leica Microsystems Inc.,
Bannockburn, USA), fixées à l’acétone et rincées avec un tampon saline phosphate (PBS).
Les coupes ont ensuite été incubées avec un anticorps primaire pour une période de 45
minutes. Des contrôles négatifs ont été réalisés avec anticorps isotypique lorsque
disponibles ou par omission de l’anticorps primaire. L’anticorps secondaire a ensuite été
incubé selon l’anticorps primaire utilisé. Les anticorps utilisés pour chaque coloration sont
résumés dans le Tableau 2.6. Tous les anticorps ont été dilués dans une solution de PBS
contenant 1% (masse/volume) d’albumine sérique bovine (BSA, Sigma). De plus, une
contre coloration au Hoechst 33258 (Sigma, 5mg/ml) pour la visualisation des noyaux a
aussi été effectuée. Les coupes ont été visualisées en fluorescence à partir d’un microscope
AxioObserver Z1 (Zeiss) en utilisant un objectif 10X. Des photos de chaque plaie ont été
obtenues à partir d’une mosaïque de photos individuelles assemblée par le logiciel
AxioVision 4.2.8 (Zeiss).
Tableau 2.6 : Anticorps utilisés pour les marquages immunohistochimiques de plaies.
Molécule
marquée Anticorps Concepteur Dilution
Collagène de
type IV Primaire AcP de lapin (IgG) anti-collagène de type IV Abcam 1/100
Secondaire Ac de chèvre anti-IgG de lapin (Alexa 532) Invitrogen 1/400
Kératine 10 Primaire AcM de souris (IgG1) anti-kératine 10 Cedarlane 1/100
Secondaire Ac de lapin anti-IgG de souris (Alexa 488) Invitrogen 1/800
Ki-67 Primaire AcM de souris (IgG1) anti-Ki67 Pharmingen 1/400
Secondaire Ac de lapin anti-IgG de souris (Alexa 488) Invitrogen 1/800
Abréviations : Ac, Anticorps; AcM, Anticorps monoclonaux; AcP, Anticorps polyclonaux.
49
2.9.3 Analyse des pansements
Des pansements de chaque type réalisé au cours des différentes études ont été
biopsiés. Les pansements ayant servi à recouvrir les plaies ainsi que des pansements
demeurés en culture immergée comme contrôles ont été biopsiés après six jours afin de
mesurer leur épaisseur et de décrire qualitativement leur aspect général. Chaque pansement
a été coupé en quatre fines lisières et deux d’entre elles ont été colorées au trichrome de
Masson par la même technique que pour les peaux et les plaies. Des photos de ces coupes
colorées ont ensuite été prises à partir d’un microscope AxioObserver Z1 (Zeiss) à l’aide
d’une caméra AxioCam ICc1 (Zeiss). Elles ont été prises en utilisant un objectif 10X DICI
accompagné du filtre approprié. L’épaisseur de ces coupes a également été mesurée à l’aide
du logiciel AxioVision 4.2.8 (Zeiss) à partir des photos réalisées. Les deux autres lisières
réalisées sur chaque plaie ont été enrobées fraiches sans fixation dans le gel Tissue-Tek
OCT (Sakura Finetek) et congelées à -80oC.
2.10 Dosage par ELISA des molécules sécrétées
Les profils de sécrétion de la leptine, de l’angiopoïétine-1 et du facteur de
croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) ont été quantifiés par ELISA à partir des
surnageants de culture des différents types de pansement à l’étude. Ces profils ont été
réalisés à partir de surnageants de culture prélevés au jour de la création de la plaie (jour 0)
afin de connaitre le potentiel sécrétoire des pansements au moment de leur mise en place
sur les plaies. Les surnageants ont été conservés à -80oC jusqu’à leur analyse (entre 6 à 12
mois). Des dosages ELISA (Duosets, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) spécifiques à
chacune des trois molécules humaines ont été réalisés en suivant les instructions fournies
par le fabricant. Des milieux de culture sans cellule ont été utilisés comme contrôles et leurs
valeurs ont été soustraites lors de l’analyse des surnageants. Chaque analyse a été répétée
deux fois et les valeurs moyennes de ces deux répétitions ont été présentées à la section
Résultats.
50
2.11 Analyses statistiques
Des analyses statistiques telles que le Test de Student non-pairé ainsi que le Two-
way ANOVA suivi de post-tests de Bonferroni ont été utilisés pour comparer les aires
réépithélialisées dans le temps en fonction du groupe expérimental. Des Tests de Student
non-pairés et des One-way ANOVA suivi de post-tests de Bonferroni ont servi à l’analyse
des profils de sécrétion quantifiés par ELISA. Des Tests de Student non-pairés ont
également servi à comparer l’épaisseur des pansements selon le temps d’utilisation.
L’ensemble de ces analyses ont été effectuées à partir du logiciel GraphPad Prism 5
(GraphPad Software). Toutes les marges d’erreur sont exprimées en écart type.
51
3 Chapitre 3 – Résultats
52
3.1 Conception du modèle de guérison des plaies in vitro
adapté à l’étude de pansements biologiques
Un modèle de guérison des plaies conçu in vitro par la technique d’auto-assemblage
a été développé au LOEX par l’équipe de Dre Véronique Moulin au début des années 2000
(Laplante et al., 2001). Afin d’adapter ce modèle à l’étude de pansements biologiques, des
peaux bilamellaires reconstruites in vitro ont été créées à partir de deux feuillets de
fibroblastes dermiques sur lesquels des kératinocytes ont été ensemencés. Après un temps
de prolifération suffisant et des conditions de différenciation à l’interface air-liquide (voir
section 2.1), les peaux ont développé un épiderme possédant toutes les couches
différenciées représentatives d’une peau normale humaine (Fig 3.1). Un feuillet migratoire
composé de fibroblastes dermiques a ensuite été apposé en dessous de la peau blessée pour
permettre la migration des kératinocytes, recréant ainsi le modèle original de guérison des
plaies conçu précédemment.
Figure 3.1 : Aspect macroscopique d’une peau reconstruite. Les photos représentent
l’apparence des peaux reconstruites avant d’effectuer une plaie (A) et après la plaie et
l’ajout d’un feuillet migratoire composé de fibroblastes dermiques (B). Le modèle de
guérison de plaie conçu par auto-assemblage et développé au LOEX (Laplante et al., 2001)
permet de produire des peaux possédant un épithélium uniformément différencié (A) ainsi
que des plaies circulaires aux marges bien définies (B). Barre de mesure = 1 cm.
Abréviations : An, Ancrage; P, Peau.
53
Notre technique adaptée permettant l’étude des effets de pansements biologiques sur
la guérison de plaies cutanées a d’abord consisté en l’ajout de pansements biologiques sur
les plaies durant le processus de guérison. Les études précédemment réalisées à partir du
modèle de Laplante (Dube et al., 2010) ou utilisant une version modifiée de ce modèle
(Carrier et al., 2008) n’avaient jamais évalué la possibilité de comparer l’effet de
pansements apposés sur une plaie.
À partir de la technique d’auto-assemblage développée au LOEX (Michel et al.,
1999) ainsi que l’expertise de l’équipe de Dre Fradette en reconstruction du tissu adipeux
(Vermette et al., 2007), des pansements biologiques ont été conçus à partir de fibroblastes
dermiques et à partir de cellules stromales/souches extraites du tissu adipeux (CSTA). En
présence d’acide ascorbique et de sérum de veau fœtal, ces deux types cellulaires ont
produit et organisé une matrice extracellulaire résistante qui a permis après 28 jours de
culture de soulever et d’empiler des feuillets cellulaires conjonctifs. De plus, une partie des
cultures de CSTA ont été induites par l’ajout d’un cocktail d’induction adipogénique durant
la culture pour produire des feuillets adipeux empilables. Par la méthode décrite à la section
2.2, deux ou trois feuillets cellulaires ont été empilés pour former chacun des types de
pansement étudiés (voir Tableau 2.5).Un temps de culture de sept jours a permis d’obtenir
une bonne cohésion entre les feuillets des pansements avant leur ajout sur des plaies.
L’aspect macroscopique (Fig 3.2 A-C) et microscopique (D-F) des pansements conçus
montre que de nombreux adipocytes sont présents dans les pansements adipeux produits
grâce au cocktail d’induction adipogénique (F), ce qui donne une apparence plus blanchâtre
macroscopiquement (C).
Les pansements produits sont suffisamment résistants pour pouvoir être manipulés
et déplacés sans un risque élevé de déchirure. Ils peuvent être pliés raisonnablement pour
s’adapter à la surface à recouvrir sans qu’ils ne se détachent de l’ancrage. Au cours des
études réalisées utilisant ces pansements, aucun bris n’a été observé malgré des
manipulations fréquentes lors des prises de photos macroscopiques pour suivre le
phénomène de réépithélialisation (voir Méthode 2, section 2.7.2.).
54
Figure 3.2 : Apparence macroscopique (A-C) et microscopique (D-F) des pansements
biologiques produits par auto-assemblage. Les pansements faits de fibroblastes dermiques
(A, D), de cellules souches/stromales extraites du tissu adipeux (CSTA) (B, E) ou de CSTA
exposées au cocktail d’induction adipogénique (adipeux) (C, F) possèdent une matrice
extracellulaire les rendant facilement manipulables. De nombreux adipocytes composent les
pansements faits de CSTA induites (F), les rendant plus blanchâtres (C). Barres de mesure
= 1 cm (A-C), 50 µm (D-F).
Une étude pilote a d’abord permis d’apporter les modifications nécessaires à la
méthode de suivi de la fermeture des plaies dans le temps. Précédemment au LOEX (Dube
et al., 2010), les photos des plaies prises quotidiennement à l’aide d’un stéréomicroscope
étaient réalisées en présence du montage servant à la culture en interface air-liquide (tel que
vu à la Fig 2.4). Le pétri contenant le montage expérimental et la plaie a été directement
placé sur le stéréomicroscope (voir Méthode 1, section 2.7.1) et la photo a été prise en
présence de milieu de culture sous la peau au cours de cette étude pilote. Malheureusement,
cette méthode n’a pas permis d’obtenir des photos permettant de visualiser l’aire
réépithélialisée pour tous les groupes expérimentaux. Tel qu’attendu, il a été possible de
mesurer l’aire réépithélialisée des plaies recouvertes d’un pansement composé de
fibroblastes dermiques ou de CSTA (Fig 3.3 A-B). Toutefois, en présence d’un pansement
adipeux, le front de migration normalement perceptible par cette méthode de prise de photo
a été impossible à distinguer, masqué par les adipocytes remplis de lipides (C). Cette
opacité a ainsi privé l’étude de certains résultats clés.
55
Un autre obstacle rencontré au cours de cette étude pilote a été l’arrêt prématuré de
la progression de la réépithélialisation des plaies. Tel que vu à la Figure 3.3 D, la fermeture
des plaies recouvertes de pansements de fibroblastes ou de CSTA progresse jusqu’à trois
jours de guérison. Au cours de ces trois jours, les plaies recouvertes de pansements faits de
fibroblastes dermiques ou de CSTA se sont réépithélialisées à des rythmes comparables (p
> 0,05 aux jours 1, 2 et 3 de guérison, Test de Student non pairé, n = 10 dans les deux
groupes). À partir du quatrième jour, la fermeture des plaies est ralentie et il y a atteinte
d’un plateau sans fermeture complète des plaies. Au jour 4, les plaies recouvertes d’un
pansement de fibroblastes dermiques étaient réépithélialisées en moyenne de 72,7 ± 6,7%
de leur surface totale et les plaies recouvertes de pansements de CSTA de 74,7 ± 7,6%. Ces
valeurs ont plafonné jusqu’au sixième jour de guérison et sont demeurées similaires (p >
0,05 aux jours 4 et 6 de guérison, Test de Student non pairé, n = 7 au jour 4 et n = 5 au jour
6 dans les deux groupes).
L’arrêt de progression constaté graphiquement est confirmé par l’analyse
histologique réalisée sur les plaies après six jours de guérison en présence d’un pansement
(Fig 3.3 E). Les kératinocytes ont progressé de la marge de la plaie (MP) vers le centre (C)
pour finalement rebrousser chemin et commencer à épithélialiser la surface interne du
pansement (indiqué par des têtes de flèche). L’apparition progressive de cohésion entre les
pansements utilisés et les feuillets migratoires de fibroblastes sous les plaies pourrait
expliquer cet arrêt de progression. Le plateau observé sur le graphe correspondrait au
moment où les kératinocytes ont été incapables de se glisser sous les pansements pour
poursuivre leur réépithélialisation sur les feuillets migratoires. La force de la cohésion entre
le pansement et le feuillet migratoire étant devenue trop forte, les kératinocytes en
prolifération auraient alors cessé leur progression organisée et dirigée vers le centre de la
plaie pour plutôt épithélialiser les pansements.
Il n’a donc pas été possible au cours de cette étude d’évaluer l’effet des pansements
jusqu’à la fermeture complète de la plaie puisque la progression de la réépithélialisation a
été affectée par la cohésion entre le pansement et le feuillet migratoire. Il est tout de même
possible d’affirmer que durant les trois premiers jours de guérison, les pansements faits de
fibroblastes dermiques ou de CSTA semblent avoir eu un impact équivalent sur le
56
phénomène de réépithélialisation. Notons que les résultats de l’étude pilote ainsi que des
études subséquentes sont soutenus par le fait que les populations cellulaires utilisées pour
produire les pansements proviennent toutes du même patient. Les fibroblastes dermiques et
les CSTA ont en effet été prélevés du même sujet, réduisant ainsi la possibilité de
variations interpersonnelles lors de la comparaison de différents types cellulaires. Cette
force de l’étude pilote ainsi que des études subséquentes élimine un facteur confondant
majeur qui pourrait nuire à l’interprétation des résultats.
57
Figure 3.3 : Résumé des résultats de l’étude pilote. L’aspect macroscopique du phénomène
de réépithélialisation de plaies reconstruites in vitro recouvertes d’un pansement de
fibroblastes (A), d’un pansement de CSTA (B) ou d’un pansement adipeux (C) est
présenté. La réépithélialisation des plaies recouvertes d’un pansement adipeux n’a pu être
mesurée à cause de l’opacité du pansement en C. Les mesures de l’aire ouverte des plaies
au fil du temps et selon le pansement utilisé sont illustrées graphiquement (D) (N = 1 même
patient duquel les fibroblastes et les CSTA utilisés ont été prélevés, n = 10 plaies par
groupe aux jours 1, 2 et 3, n = 7 au jour 4 et n = 5 au jour 6). L’aspect histologique de la
réépithélialisation six jours après l’ajout d’un pansement biologique fait de CSTA et suite à
une coloration au trichrome de Masson d’une coupe transversale est illustrée (E). La
cohésion progressive entre le pansement et le feuillet migratoire (flèche) a stoppé la
fermeture de la plaie et a amené les kératinocytes à épithélialiser la surface interne du
pansement (indiqué par des têtes de flèches). Barres de mesure = 300 µm (A-C), 1 cm (E).
Abréviations : C, Centre de la plaie; MP, Marge de la plaie, Pans, Pansement.
58
L’étude pilote a également permis d’évaluer une première fois le profil de sécrétion
des différents pansements biologiques conçus. Des dosages ELISA ont permis de quantifier
au jour 0 les quantités de leptine, de VEGF et d’angiopoïétine-1 produites dans les 48
heures précédant la mise en place des pansements sur les plaies. Le milieu de culture utilisé
durant cette période était un milieu sans sérum et sans phénol afin de réduire au minimum
la quantité de protéines pouvant provenir du sérum bovin et ainsi cibler la production réelle
des pansements.
Figure 3.4 : Profil de sécrétion des pansements biologiques sur une période de 48 heures en
milieu sans sérum et sans phénol. ***, p < 0,001. One-way ANOVA suivi de post-tests de
Bonferroni, n = 3 pour chaque molécule analysée. Abréviation : Pans, Pansement.
Tel qu’attendu, la quantité de leptine produite par les pansements adipeux est
grandement supérieure à celle produite par les pansements de fibroblastes ou de CSTA,
respectivement de 24 et 31 fois plus élevée sur une période de 48 heures. La quantité
59
d’angiopoïétine-1 est également deux fois plus abondante dans les surnageants des
pansements adipeux que ceux de CSTA ou de fibroblastes. Quant au VEGF, sa présence est
deux fois plus élevée dans les surnageants de pansements faits de CSTA que ceux des
pansements adipeux ou de fibroblastes.
Il a été nécessaire d’adapter la méthode de suivi de la progression de la
réépithélialisation afin de permettre l’évaluation de tous les types de pansement jusqu’à une
guérison complète des plaies. Les études suivantes ont donc été réalisées avec la Méthode 2
(voir Méthode 2, section 2.7.2) qui a été adaptée à partir des observations faites au cours de
l’étude pilote. Cette technique améliorée a permis d’accentuer le contraste lumineux
permettant de distinguer la zone nouvellement réépithélialisée et a éliminé le blocage fait
par les adipocytes des pansements adipeux (Fig 3.5). Cette technique de retrait quotidien du
pansement, combinée au fait que l’orientation des pansements a été inversée avant qu’ils ne
soient placés sur la plaie, a également permis de prévenir la formation de cohésion entre le
pansement et le feuillet migratoire. Le retrait temporaire du pansement durant la photo a
donc amélioré la clarté des zones réépithélialisées, prévenu la cohésion et ainsi facilité
l’analyse des photos prises quotidiennement.
Ces modifications de la méthode originale (Méthode 1) ont permis de suivre
pendant six jours la progression de la guérison à l’aide de photos dans les études
subséquentes, peu importe le type de pansement utilisé. La Figure 3.5 montre un exemple
de la progression de la réépithélialisation d’une plaie recouverte d’un pansement de CSTA
(A, C, E) et d’une plaie recouverte d’un pansement adipeux (B, D, F). Le pansement a été
retiré pour chacune des photos. La clarté et la précision avec laquelle il est maintenant
possible de suivre la réépithélialisation surpassent largement ce qui pouvait être fait lors de
l’étude pilote (Fig 3.3).
60
Figure 3.5 : Aspect au stéréomicroscope du phénomène de réépithélialisation d’une plaie
reconstruite in vitro après l’adaptation de la méthode de suivi de la réépithélialisation.
Aspect d’une plaie ayant été recouverte d’un pansement de CSTA après 2, 4 et 6 jours de
guérison respectivement (A, C, E). Aspect d’une plaie ayant été recouverte d’un pansement
adipeux après 2, 4 et 6 jours de guérison respectivement (B, D, F). Le pansement a été
retiré temporairement pour la prise des photos. Barres de mesure = 300 µm.
61
3.2 Progression de la réépithélialisation de plaies recouvertes
de pansements biologiques
Le but des études subséquentes a entre autres été de déterminer si la présence
d’adipocytes dans un pansement pouvait jouer un rôle bénéfique sur le phénomène de
réépithélialisation en comparaison avec un pansement composé uniquement de CSTA. Il
est suggéré que les pansements adipeux pourraient sécréter plusieurs facteurs tels que la
leptine qui seraient favorables au phénomène de réépithélialisation des kératinocytes. Au
cours de cette première étude évaluant l’effet des pansements adipeux, la réépithélialisation
a été suivie quotidiennement et des mesures de l’aire réépithélialisée ont été réalisées sur
une période de six jours (Fig 3.6).
Figure 3.6 : Comparaison de l’aire ouverte des plaies en fonction du nombre de jour de
guérison et selon le pansement utilisé (première étude). Une fermeture quasi-complète des
plaies a été atteinte (n = 9 plaies par groupe aux jours 1 et 2, n = 3 aux jours 3 à 6). *, p <
0.0001, Test de Student non-pairé. Abréviation : Pans, Pansement.
62
D'abord, on note que pour les deux groupes expérimentaux la progression de la
fermeture des plaies s'est déroulée de manière continue jusqu'à la fermeture quasi-complète
de celles-ci. Contrairement à l'étude pilote où un plateau était observé graphiquement dès le
quatrième jour de guérison, l'action d'avoir retiré les pansements quotidiennement pour la
prise de photos semble avoir prévenu la cohésion du pansement à la plaie. La Méthode 2 a
donc permis de comparer la progression de la guérison de plaies selon le pansement utilisé
jusqu'à la fermeture complète, ce qui constitue une amélioration importante de la méthode
expérimentale initiale.
Au deuxième jour de guérison, la surface ouverte des plaies est significativement
plus petite lorsque la plaie est recouverte d’un pansement adipeux (46,1 ± 3,4%) que
lorsque la plaie est recouverte d’un pansement composé uniquement de CSTA (53,7 ±
3,1%) (p < 0,0001, Test de Student non-pairé). Cette différence s’est dessinée dès le
premier jour de guérison sans toutefois être significative (p = 0,0879). Cette tendance se
dissipe à partir du troisième jour et les mesures d’aires sont similaires (p > 0,05, Test de
Student non-pairé fait pour chaque jour) jusqu’à la fermeture presque totale des plaies au
sixième jour de guérison. À noter qu’au moment de cette étude, les pansements biologiques
fabriqués par auto-assemblage étaient constitués de l’empilement de deux feuillets
cellulaires plutôt que de trois tel que dans la prochaine étude présentée.
Les profils de sécrétion de la leptine, du VEGF et de l’angiopoïétine-1 présentent
les mêmes tendances que lors de l’étude pilote. La leptine et l’angiopoïétine-1 produites par
les pansements adipeux sont respectivement 25 et 2,6 fois plus abondantes que les quantités
produites par les pansements de CSTA. Le VEGF est à nouveau davantage retrouvé dans le
milieu de culture des pansements de CSTA, tel qu’observé précédemment, de l’ordre de 2,4
fois plus. Les dosages réalisés lors de cette étude quantifiaient au jour 0 les molécules
produites dans les 24 heures précédentes la mise en place des pansements sur les plaies
dans un milieu sans sérum et sans phénol (Fig 3.7).
63
Figure 3.7 : Profil de sécrétion des pansements biologiques sur une période de 24 heures en
milieu sans sérum et sans phénol. **, p entre 0,01 et 0,001, ***, p < 0,001. Test de Student
non-pairé, n = 3 pour chaque molécule analysée. Abréviation : Pans, Pansement.
Plusieurs hypothèses ont été formulées après l’obtention de ces résultats pour tenter
d’expliquer le changement de tendance dans les courbes de réépithélialisation des plaies
après le deuxième jour de guérison. Elles ont par ailleurs guidé les choix de conditions
expérimentales qui ont mené à la conception d’une deuxième étude sur la réépithélialisation
de plaies en présence de pansements biologiques.
Premièrement, le nombre de cellules contenues dans un pansement était peut-être
insuffisant pour qu’un effet soutenu puisse mener à des différences marquées dans la
vitesse de réépithélialisation. Pour tenter d’augmenter la quantité de molécules actives
produites (tels que le VEGF, la leptine, ...), les pansements de la deuxième étude ont été
conçus avec trois feuillets cellulaires plutôt que deux, la prémisse étant que plus de cellules
dans un pansement procurerait un effet plus notable sur la guérison.
64
Deuxièmement, les pansements étant en contact indirect avec le milieu de culture et
exposé à l’air durant plusieurs jours, peut-être y aurait-t-il une dégradation des pansements
au fil du temps, en particulier pour les pansements adipeux. Pour vérifier cette hypothèse,
une condition expérimentale dans laquelle les pansements sont remplacés par de nouveaux
tous les deux jours a été ajoutée. Cette condition a pour but de vérifier la tendance observée
précédemment, c’est-à-dire que les pansements adipeux semblent accélérer la fermeture de
plaies en début de guérison seulement. Cette condition permet aussi de s’approcher de la
réalité clinique, où les pansements sont généralement changés plus fréquemment qu’à tous
les six jours. Ce groupe expérimental veut également valider l'hypothèse de travail selon
laquelle le sécrétome des pansements adipeux est favorable à la réépithélialisation. Bref, en
réduisant l’impact d’un possible épuisement cellulaire (en utilisant régulièrement un
pansement neuf), un pansement qui contient plus de cellules actives à un temps donné
devrait favoriser une fermeture des plaies plus rapide. Notons que puisque ce genre de
groupe expérimental demande de produire trois fois plus de pansements qu’à l’habitude
pour un même nombre de plaies, il a été choisi que la condition serait réalisée seulement
pour évaluer des pansements adipeux.
Des conditions expérimentales ont également été ajoutées à titre de groupes de
contrôle dans cette deuxième étude. Dans le but de comparer les pansements adipeux et les
pansements de CSTA au type de pansement actuellement utilisé en clinique, des
pansements composés de fibroblastes dermiques ont été conçus (la faisabilité d’étudier les
effets de pansements faits de fibroblastes dermiques a d’ailleurs déjà été évaluée lors de
l’étude pilote). De plus, des plaies non recouvertes d’un pansement ont été ajoutées à
l’étude à titre de contrôle comparatif.
La deuxième étude a donc été conçue en incluant cinq groupes expérimentaux. Cette
étude avait pour but de vérifier si la présence de pansements faits de CSTA ou de
pansements adipeux influencerait favorablement la réépithélialisation de plaies
reconstruites in vitro comparativement à des pansements faits de fibroblastes dermiques.
Malheureusement, des problèmes d’ordre technique (abordés dans la section 3.3 et le
Chapitre 4) ont privé l’étude de la condition évaluant l’effet de pansements faits de CSTA.
La progression de la guérison pour chaque groupe est présentée à la Figure 3.8.
65
Figure 3.8 : Progression de la réépithélialisation en fonction du groupe expérimental à
l’étude (deuxième étude). Les cellules utilisées pour former tous les types de pansement
proviennent du même patient (N = 1). *, p< 0,05, comparaison de Pans. Adipeux Ch.2JVs
Pans. Fibroblastes ou Pans. Adipeux. #, p< 0,01, comparaison de Sans Pansement Vs Pans.
Fibroblastes ou Pans. Adipeux. Two-way ANOVA suivi de post-tests de Bonferroni, n = 7
plaies par groupe du jour 0 à 3 et n = 5 plaies du jour 4 à 6 pour les plaies sans pansement
et les pansements de fibroblastes, n = 4 plaies du jour 0 à 3 et n = 3 plaies du jour 4 à 6 pour
les pansements adipeux et adipeux changés aux 2 jours (Ch.2J). Abréviation : Pans,
Pansement.
L’analyse statistique utilisée a été un Two-way ANOVA suivi de post-tests de
Bonferroni pour comparer chacun des groupes avec tous les autres. Ce type d’analyse
permet de comparer chacun des groupes à tous les jours de guérison tout en considérant
l’ensemble de la courbe de progression du groupe donné. Aux premier et deuxième jours de
guérison, aucune différence n’a été observée entre les groupes (p > 0,05, post-tests de
Bonferroni pour toutes les comparaisons possibles). Des différences significatives entre les
groupes expérimentaux ont toutefois été observées à partir du troisième jour où l’aire des
plaies sans pansement (25,3 ± 4,5%) était significativement plus petite que celle des plaies
66
recouvertes d’un pansement de fibroblastes (35,3 ± 3,1%) ou d’un pansement adipeux (35,1
± 9,2%) (p < 0,01, post-tests de Bonferroni pour toutes les comparaisons). De plus, au
quatrième jour, les plaies recouvertes d’un pansement adipeux changé tous les deux jours
(Ch.2J) (12,7 ± 5,2%) étaient significativement plus petites que les plaies recouvertes d’un
pansement de fibroblastes (21,6 ± 3,5%) ou d’un pansement adipeux demeuré en place
depuis le début de la guérison (23,0 ± 9,1%) (p < 0,05, post-tests de Bonferroni pour les
deux comparaisons). Aux deux derniers jours, aucune différence n’a été observée (p > 0,05,
post-tests de Bonferroni pour toutes les comparaisons possibles) puisque les aires à
refermer étaient devenues minimes (< 10,0% d’aire ouverte pour tous les groupes).
Globalement, la surface des plaies recouvertes d’un pansement adipeux changé tous
les deux jours s’est réépithélialisée de 10% de plus que les plaies recouvertes d’un
pansement adipeux ou fait de fibroblastes après quatre jours de guérison. Ceci pourrait
signaler que les propriétés sécrétoires favorables à la guérison dont disposeraient les
pansements adipeux se dégradent avec le temps. De plus, il est envisageable que dans un
environnement de culture favorable comme celui utilisé dans ce modèle, les plaies sans
pansement se refermeraient plus rapidement que les autres conditions expérimentales en
absence du poids exercé par les pansements sur les plaies (voir Discussion). Pourtant, les
plaies recouvertes d’un pansement adipeux remplacé aux deux jours se sont refermées aussi
rapidement que celles sans pansement, signalant possiblement un effet provenant du
pansement (p > 0,05, post-tests de Bonferroni pour tous les jours comparés).
Le profil sécrétoire des pansements triples utilisés lors de cette étude a été évalué
dans des conditions différentes de celles présentées précédemment. La période de culture
faite dans les heures précédentes la mise en place des pansements sur les plaies a été
réalisée dans du milieu adipogénique pour tous les types de pansements plutôt que du
milieu sans sérum et sans phénol. Les dosages ont été faits après une période de 48 heures
(Fig 3.9).
67
Figure 3.9 : Profil de sécrétion des pansements biologiques sur une période de 48 heures en
milieu de culture pour adipocytes. **, p entre 0,01 et 0,001, ***, p < 0,001. One-way
ANOVA suivi de post-tests de Bonferroni, n = 3 pour chaque molécule analysée.
Abréviations : Pans, Pansement.
Les valeurs obtenues suivent les mêmes tendances statistiques que dans les deux
analyses réalisées précédemment. Toutefois, l’ampleur des valeurs et les différences
numériques entre les groupes varient légèrement pour les trois molécules analysées. Pour la
leptine, des quantités un peu plus importantes de la molécule sont détectées par ELISA
dans les milieux de culture des pansements de fibroblastes et de CSTA. En comparaison
avec l’étude pilote où la quantité de leptine détectée pour ces deux types de pansement était
à peu près nulle (1,9 ± 0,4 ng/mL pour les pansements de fibroblaste et 1,5 ± 0,3 ng/mL
pour les pansements de CSTA dans l’étude pilote), les pansements de fibroblastes et de
CSTA auraient sécrétés plus de leptine dans un milieu de culture pour adipocytes en 48
heures que dans un milieu sans sérum et sans phénol (13,2 ± 6,5 ng/mL pour les
pansements de fibroblaste et 9,9 ± 3,4 ng/mL pour les pansements de CSTA dans la
68
deuxième étude). Cette différence d’amplitude de la leptine est à peu près nulle pour les
pansements adipeux, les valeurs étant à peu près similaires (46,6 ± 6,7 ng/mL pour les
pansements adipeux de l’étude pilote et 48,0 ± 4,6 ng/mL pour les pansements adipeux de
la deuxième étude). Les conditions de prélèvements étant similaires et les populations
cellulaires utilisées étant les mêmes dans l’étude pilote, il est justifié de questionner l’effet
qu’a pu avoir le milieu de culture adipogénique sur les résultats obtenus. De plus, le fait
que les pansements soient composés de trois feuillets cellulaires plutôt que deux comme
dans l’étude pilote aurait pu expliquer la présence de quantités de leptine supérieures dans
les analyses de la deuxième étude pour tous les groupes, mais la valeur obtenue pour les
pansements adipeux est pourtant similaire. Les valeurs obtenues pour les dosages du VEGF
et de l’angiopoïétine-1 diffèrent également. Une baisse de la quantité d’angiopoïétine-1
d’environ 70% est notée pour les trois types de pansements. Pour le VEGF, cet écart est
d’environ 30% pour les pansements de fibroblastes et de CSTA tandis que la valeur est
comparable pour les pansements adipeux.
La troisième étude avait pour but de comparer les mêmes conditions expérimentales
que la deuxième étude réalisée. L’objectif premier était d’obtenir des résultats pour des
plaies recouvertes de pansements de CSTA puisque ce groupe n’était pas disponible dans la
deuxième étude à cause d’ennuis techniques. Malheureusement, ces mêmes ennuis
techniques ont empêché de retirer toute donnée sur la réépithélialisation des plaies dans la
troisième étude. Le sujet sera abordé dans à la section 3.3 et dans le Chapitre 4.
3.3 Caractérisation de l’impact des pansements biologiques sur
la réépithélialisation
Dans le but d’observer qualitativement la réépithélialisation des plaies, des analyses
histologiques ont été réalisées. Des coupes transversales de 5 µm colorées au trichrome de
Masson ont été réalisées à partir de biopsies de plaies sans leur pansement et préalablement
enrobées dans la paraffine. Cette coloration permet de mettre en évidence en bleu les
collagènes du derme et du feuillet migratoire tandis que les kératinocytes sont colorés en
différentes teintes de rose selon la couche observée. La Figure 3.10 est un exemple
représentatif du phénomène de migration des kératinocytes observé dans le modèle de
69
guérison de plaie adapté à l’étude de pansements. Sur cette coupe, le feuillet migratoire
placé sous la plaie (en bleu) sert de surface aux kératinocytes qui migrent de la gauche vers
la droite (en rose). Les lettres MP désignent la marge de la plaie de laquelle les
kératinocytes ont débuté leur migration. En plus de la migration primaire des kératinocytes,
une partie de l’épiderme différencié (indiquée par Épi) glisse secondairement vers la zone à
réépithélialiser. L’exemple présenté est une plaie qui avait été recouverte d’un pansement
de fibroblastes pendant trois jours de guérison.
Figure 3.10 : Aspect histologique d’une coupe transversale de la marge d’une plaie colorée
au trichrome de Masson. Barre de mesure = 500 µm. Abréviations : Épi, Épiderme
différencié glissant vers le centre de la plaie; MP, Marge de la plaie.
D’autres colorations au trichrome de Masson ont également permis d’observer le
phénomène de réépithélialisation des plaies en fonction de la condition expérimentale à
l’étude. Grâce à une mosaïque de multiples photos d’une même coupe, l’ensemble de la
guérison d’un même montage expérimental a pu être observé. Cette technique a permis de
visualiser sur une même photo des plaies sur une longueur d’environ 1000 mm, facilitant
ainsi l’interprétation globale. À la Figure 3.11, une coupe représentative de chaque groupe
expérimental de la deuxième étude est présentée. Sur chacune, les lettres MP représentent
les marges de plaies de part et d'autre de la plaie circulaire initiale et la lettre C désigne la
petite région au centre de chaque plaie qui n’est pas encore réépithélialisée. Peu importe la
condition expérimentale, la migration semble se dérouler de manière organisée et est
relativement uniforme. De plus, il est intéressant d’observer que les plaies qui étaient
recouvertes d’un pansement (A-C) semblent avoir un front de migration d’une épaisseur
comparable qualitativement à celle observée sur une plaie sans pansement (D).
Des analyses immunohistochimiques ont également permis de qualifier le processus
de réépithélialisation des plaies exposées ou non aux pansements étudiés (Fig 3.12). Un
70
marqueur de la différenciation des kératinocytes (K10), un marqueur de la jonction dermo-
épidermique (Collagène de type IV) ainsi qu’un marqueur des cellules prolifératives de
l’épiderme (Ki-67) ont permis de constater que la réépithélialisation en présence d’un
pansement de fibroblastes (A-C) ou d’un pansement adipeux (D-E) s’organise d’une
manière comparable à celle observée dans une plaie in vitro non exposée à un pansement
(G-I). D’une manière analogue à l’exemple présenté à la Figure 3.10, ces photos réalisées
par immunofluorescence exposent une partie intacte de la peau reconstruite, la marge de la
plaie (MP) ainsi que la partie proximale du front de migration des kératinocytes.
Des mesures ont été réalisées sur des photos de coupes histologiques telles que
présentées à la Figure 3.13 afin de comparer l’épaisseur moyenne des pansements selon le
type cellulaire et le temps d’utilisation. Les pansements mesurés sont ceux de la deuxième
étude. Les pansements triples faits de fibroblastes ont une épaisseur moyenne de 46,7 ± 2,6
µm (n = 5) après avoir été utilisés comme recouvrement durant six jours sur une plaie in
vitro, tandis que des pansements similaires conservés en culture parallèlement durant six
jours ont une épaisseur moyenne de 74,2 ± 4,5 µm (n = 3). Les pansements de fibroblastes
ayant servi de recouvrement sont donc 1,6 fois plus minces après une utilisation de six
jours et cette différence est statistiquement significative (p = 0,0008). Les pansements
adipeux ont eu aussi tendance à s’amincir suite à leur utilisation, mais dans une moindre
mesure. Les pansements adipeux utilisés comme recouvrement pendant six jours (48,6 ±
1,7 µm, n = 5) sont 1,3 fois plus minces que ceux conservés en culture (62,6 ± 9,5 µm, n =
3). Cette tendance n’est toutefois pas statistiquement significative (p = 0,065). Enfin,
notons que les pansements adipeux qui ont été retirés des plaies après 48h ont une épaisseur
moyenne de 66,4 ± 10,8 µm (n = 5), ce qui est comparable aux pansements du même type
maintenu en culture. Ces résultats suggèrent donc que l’utilisation prolongée a un impact
considérable sur l’épaisseur des pansements, et par le fait même, possiblement sur leurs
effets. Ces données quantitatives de l’épaisseur des tissus sont soutenues par l’observation
qualitative des coupes histologiques. La Figure 3.13 illustre l’amincissement qu’ont subi
les pansements adipeux après 0, 2, 3 et 6 jours d’utilisation comme recouvrement.
Quelques adipocytes demeurent bien visibles après six jours de culture (D). Il est toutefois
difficile de conclure si leur nombre total s’est modifié en cours d’utilisation.
71
Figure 3.11 : Aspect histologique de la réépithélialisation six jours après la création des plaies suite à une coloration au trichrome de
Masson sur coupes transversales. Les plaies étaient recouvertes soit d’un pansement de fibroblastes (A), d’un pansement adipeux (B),
d’un pansement adipeux changé aux 2 jours (C) ou sans pansement (D). Barres de mesure = 1 mm. Abréviations : C, Centre de la
plaie; MP, Marge de la plaie.
72
Figure 3.12 : Analyses immunohistochimiques du phénomène de réépithélialisation en présence de pansements biologiques après six
jours de guérison. Les plaies étaient recouvertes soit d’un pansement de fibroblastes (A-C), d’un pansement adipeux (D-F) ou sans
pansement (G-I). Les couches suprabasales de la peau intacte et du front de migration expriment K10 (A, D, G). Le collagène IV est
exprimé à la jonction dermo-épidermique (indiqué par des têtes de flèches) (B, E, H). Des cellules exprimant Ki-67 sont localisées à la
couche basale de la peau intacte et du front de migration (indiqué par des têtes de flèches) (C, F, I). Barre de mesure = 200 µm.
Abréviations : MP; Marge de la plaie.
MP
MP
MP
73
Figure 3.13 : Aspect histologique au trichrome de Masson des pansements adipeux utilisés
comme recouvrement d’une plaie au fil du temps. Les pansements présentés sont
représentatifs de la moyenne et ont servi de recouvrement durant 0 jour (A), 2 jours (B), 3
jours (C) et 6 jours (D). Barre de mesure = 50 µm.
Finalement, l’analyse histologique offre une piste d’explication aux ennuis
techniques rencontrés avec le groupe expérimental évaluant les pansements de CSTA de la
deuxième étude et avec l’ensemble de la troisième étude. À la Figure 3.14, la
réépithélialisation qui devrait normalement se diriger vers le centre de la plaie en migrant
sur le feuillet migratoire (tel que montré à la Figure 3.10) semble avoir été entravée par un
manque de cohésion entre le feuillet migratoire et la peau lésée. En effet, les kératinocytes
qui auraient dû se diriger vers la plaie semblent s’être glissés entre le feuillet migratoire et
la surface inférieure du derme reconstruit, tel qu’indiqué par la flèche. La plaie n’a donc
pas été réépithélialisée tel qu’attendu malgré un temps de guérison suffisant. L’exemple
présenté est une plaie de la deuxième étude après six jours de guérison et qui était
recouverte d’un pansement de CSTA.
74
Figure 3.14 : Exemple d’une plaie où le feuillet migratoire n’a pas été réépithélialisé. Le
manque de cohésion entre la peau lésée et le feuillet migratoire a amené les kératinocytes à
épithélialiser la surface inférieure du derme reconstruit (tel qu’indiqué par la flèche). Barre
de mesure = 200 µm. Abréviations : FM, Feuillet migratoire; MP, Marge de la plaie.
MP
FM
75
4 Chapitre 4 – Discussion
76
4.1 Adaptation du modèle d’étude in vitro et conception des
pansements biologiques
4.1.1 Modèle d’étude de la guérison des plaies in vitro
La présente recherche a permis de mettre au point un modèle de guérison des plaies
adapté à l’étude de pansements biologiques. Ce modèle conçu à partir des travaux réalisés
par l’équipe de Dre Véronique Moulin au LOEX (Laplante et al., 2001) a permis de
mesurer le phénomène de réépithélialisation en présence de pansements dans un
environnement in vitro. Les peaux conçues par auto-assemblage possèdent un épithélium
uniformément différencié et permettent de créer des plaies circulaires aux marges bien
définies assurant une standardisation de l’aire à réépithélialiser (Fig 3.1).
Plusieurs défis techniques ont rendu difficile la conception de ce modèle adapté et
demeurent des considérations importantes pour son utilisation future dans l’évaluation de
pansements biologiques ou d’autres technologies. D’abord, l’étude pilote montre clairement
que la cohésion inattendue entre les pansements et les plaies peut altérer de manière
considérable le processus de réépithélialisation. Toutes les plaies de cette étude n’ont
d’ailleurs pu reformer en entier leur épiderme malgré un temps de culture suffisant (Fig
3.3). Cette cohésion s’explique principalement par la présence d’acide ascorbique dans le
milieu dans lequel les plaies ont été cultivées. L’acide ascorbique est un cofacteur
important de la formation de la matrice extracellulaire et constitue la pierre angulaire de
l’auto-assemblage (L'Heureux et al., 1998). Les pansements, eux-mêmes constitués de
cellules mésenchymateuses capables de produire de la matrice extracellulaire rappelons-le,
ont été stimulés autant que les cellules des plaies à renouveler et à produire davantage de
matrice, entrainant ainsi de la cohésion. De plus, l’orientation du pansement peut avoir eu
une influence sur la formation de cohésion et a possiblement favorisé l’adhésion cellulaire
(tel que décrit plus loin).
Il est incertain si la présence d’acide ascorbique a été salutaire dans l’ensemble des
études réalisées. La raison de procéder à l’ajout de 50 µg/ml d’acide ascorbique était
77
toutefois très claire : le feuillet migratoire ajouté au jour 0 de guérison doit adhérer à la
plaie afin d’agir comme surface migratoire pour les kératinocytes. Cet ajout permet aussi
d’assurer l’intégrité des plaies pendant le processus de guérison de six jours. Le retrait
quotidien des pansements pour la prise de photo (Méthode 2) a permis d’empêcher la
cohésion avec le feuillet migratoire en plus de favoriser une prise de photos plus fiable et
définie de la migration des kératinocytes. Elle a permis de comparer l’effet réel de chaque
type de pansement sur la réépithélialisation sans endommager les kératinocytes (Fig 3.5).
Il demeure probable que même en absence d’acide ascorbique ajouté, il y aurait eu
un certain degré de cohésion entre le pansement et le fond de la plaie in vitro. La capacité
des cellules à produire de la matrice n’est pas complètement dépendante de l’acide
ascorbique (Kim et al., 2011). Notons que la cohésion est d’ailleurs loin d’être un
phénomène unique aux pansements biologiques et au modèle d’étude actuel. En clinique
par exemple, les pansements secs forment de l’adhérence notable au fond d’une plaie en
moins de 24 heures! In vivo, l’agrégation plaquettaire et la production rapide de fibrine
créent une adhérence en quelques heures seulement (Singer et al., 1999). L’utilisation d’une
mince couche d’un lubrifiant entre le pansement et la plaie pourrait être une piste de
solution si l’utilisation de pansements biologiques adipeux ou faits de CSTA devient une
réalité en clinique. Certains pansements commerciaux contiennent d’ailleurs des lubrifiants
à même leur matériel synthétique (Adaptic® ou Mepitel®) afin de réduire la cohésion
(Terrill et al., 2000). Il faudrait toutefois s’assurer de la perméabilité d’une telle substance
aux molécules produites par le pansement afin de ne pas nuire à son effet.
Tel que décrit plus tôt, l’objectif principal d’ajouter de l’acide ascorbique était de
favoriser l’adhésion du feuillet migratoire à la plaie pour permettre la migration des
kératinocytes. La forte cohésion entre le pansement et la plaie a été un problème pour
l’étude de la réépithélialisation. Ironiquement, la principale faiblesse du modèle actuel est
un manque de cohésion, puisque l’adhésion du feuillet migratoire avec la plaie ne se
produit pas toujours comme souhaité. En effet, lors de la deuxième étude, toutes les plaies
qui étaient prévues pour l’évaluation des pansements de CSTA n’ont pu être utilisées à
cause d’une cohésion incomplète ou nulle du feuillet migratoire à la plaie, tel que le
suggère la Figure 3.14. La présence d’un espace entre le feuillet migratoire et la peau lésée
78
semble avoir empêché la migration normale des kératinocytes vers le centre de la plaie. La
réépithélialisation n’a donc pas débuté de façon uniforme et il a été impossible d’extraire la
moindre donnée de ce groupe. Ce déficit de cohésion du feuillet migratoire a également
provoqué l’échec de l’ensemble de la troisième étude puisqu’aucune des plaies n’a été en
mesure de débuter la réépithélialisation. Ce problème ne s’était pourtant pas produit lors de
l’étude pilote ni à la première étude. Durant celles-ci, tous les montages ont pu être utilisés.
Les conditions expérimentales ont pourtant peu ou pas changé entre les différentes
études réalisées; il est donc difficile d’expliquer avec certitude ce qui aurait pu nuire ou
améliorer la cohésion du feuillet migratoire d’une étude à l’autre. L’un des seuls
changements importants réalisés entre la première et la deuxième étude est le nombre de
feuillets contenus dans chaque pansement. En effet, tel que décrit au Chapitre 3, afin de
maximiser l’effet possible des pansements biologiques, les pansements ont été conçus à
partir de trois feuillets cellulaires plutôt que deux lors de la deuxième et la troisième étude.
Ce changement a certainement augmenté le poids de chaque pansement et ceci pourrait
avoir empêché la cohésion des feuillets migratoires.
Le jour du montage, le feuillet migratoire est placé sous la plaie et le pansement est
ajouté par-dessus. Le montage est ensuite placé sur une petite table trouée en plastique
assurant que la plaie soit à la fois en contact avec le milieu de culture et l’interface air-
liquide. Cette table bien conçue offre toutefois un soutien limité au feuillet migratoire qui,
sous le poids d’un pansement plus pesant, pourrait s’être décollé suffisamment de la surface
inférieure de la plaie pour empêcher sa cohésion avec le derme reconstruit. Puisque les
populations cellulaires ayant servi à la fabrication des plaies et des pansements sont
demeurées les mêmes, que les temps de culture sont demeurés constants d’une étude à
l’autre et que les milieux de culture de la deuxième et de la troisième étude étaient les
mêmes que lors de la première, il y a peu de place pour une explication biochimique à ce
déficit de cohésion.
Une solution envisageable à ce problème serait l’inversion du feuillet migratoire
avant de l’apposer sous la plaie. Lors de la culture des feuillets en plaque, les cellules
ensemencées adhèrent au plastique et se multiplient. Elles produisent également de la
matrice extracellulaire, stimulées par la présence d’acide ascorbique. Cette production
79
s’effectue surtout par-dessus les cellules, et non entre les cellules et la surface de plastique à
laquelle ils adhèrent (Fradette, J., observations personnelles). Ceci fait en sorte que les
cellules d’un feuillet se retrouvent davantage dans la partie inférieure du feuillet et la
matrice dans la partie supérieure. Si l’on plaçait la surface « riche en cellules » plus près de
la base du derme reconstruit où se trouve la plaie, peut-être que les molécules d’adhésion
telles que les intégrines disponibles à la surface de la membrane cellulaire serait plus
promptes à se lier. Cette explication a d’ailleurs justifié l’inversion du pansement au
moment de l’appliquer à la plaie afin de réduire sa cohésion, telle que réalisée à la suite de
l’étude pilote. Ce changement simple à exécuter au moment de l’application du feuillet
migratoire mériterait d’être tenté lors d’études in vitro futures.
Malgré cette faiblesse importante du modèle in vitro, il présente plusieurs avantages
notables, dont le principal est le contrôle précis des variables à l’étude. En effet, le modèle
permet entre autres d’utiliser un échantillon de plaies ayant des propriétés biologiques
similaires puisqu’elles sont toutes produites à partir des mêmes populations cellulaires.
Certes, les pansements devront un jour être évalués sur des échantillons moins homogènes
afin de prouver leur efficacité à plus grande échelle, mais le contrôle optimal des
variabilités interpersonnelles que pourrait entrainer l’utilisation de populations provenant
de multiples donneurs pour créer les plaies permet de réduire les biais possibles et renforce
les conclusions tirées.
Le modèle permet également de vérifier précisément l’effet des pansements sur la
réépithélialisation. Contrairement à un modèle animal où une guérison plus rapide de
l’épiderme pourrait être médiée par plusieurs mécanismes à la fois, les plaies in vitro
conçues par auto-assemblage permettent d’isoler l’action de réépithélialisation. Cette force
du modèle est toutefois à double tranchant dans la recherche actuelle puisque l’hypothèse
de travail et la littérature proposent que les CSTA et le tissu adipeux pourraient être
bénéfiques à la guérison de manière substantielle par leurs effets sur l’angiogenèse. Cet
aspect de la guérison n’est pas évalué étant donné l’absence de cellules endothéliales dans
le modèle. Il est quand même possible d’évaluer l’effet direct des molécules
proangiogéniques sur la réépithélialisation, puisque cet effet a déjà été décrit (Man et al.,
2006).
80
4.1.2 Conception des pansements biologiques
Ce projet de recherche a également permis de concevoir et de tester des pansements
biologiques conçus à partir de cellules souches extraites du tissu adipeux par la méthode
d’auto-assemblage. Les méthodes de culture bien établies de l’équipe de Dre Fradette ont
permis de créer des feuillets cellulaires de CSTA et de tissu adipeux facilement
manipulables et robustes (Fig 3.2) (Vermette et al., 2007).
Le temps de production des pansements demeure une considération importante afin
de faciliter la translation de cette technologie vers une utilisation clinique pratique.
Actuellement, 35 jours sont nécessaires à la création des pansements adipeux ou de CSTA.
Les feuillets nécessitent une culture en présence d’acide ascorbique de 28 jours avant d’être
empilés et mis en culture pour sept jours supplémentaires. Ce temps de culture pourrait être
réduit grandement par l’utilisation d’un système de culture dynamique. Tel que décrit par
Marceau-Fortier, le temps de culture des feuillets de CSTA lorsqu’exposés à des conditions
dynamiques peut être réduit de moitié (de 28 à 14 jours) et tout de même permettre de
produire des feuillets manipulables (Fortier et al., 2011). Le temps de production total d’un
pansement de CSTA qui utiliserait cette technique serait alors de 21 jours plutôt que 35, ce
qui constituerait une nette amélioration. D’autres optimisations telles que l’ajustement des
densités d’ensemencement cellulaires sont actuellement en cours dans le laboratoire afin de
réduire le temps de production des pansements.
Une autre alternative future serait l’ajout de kératinocytes à la surface des
pansements, tel qu’utilisé dans la majorité des recouvrements actuellement disponibles sur
le marché. La présence de kératinocytes pourrait conférer une protection accrue tout en
contribuant à la sécrétion de molécules bioactives (Rochon et al., 2010). Le traitement se
rapprocherait alors d’une greffe autologue. Il serait intéressant de vérifier si ce type de
recouvrement, qui est plus long à produire, procurerait un avantage substantiel par rapport à
la conception actuelle des pansements.
81
4.2 Évaluation de l’efficacité des pansements biologiques
Plusieurs études ont été réalisées dans le présent projet afin de vérifier l’effet des
pansements biologiques faits de CSTA ou de tissu adipeux. La vérification de l’hypothèse
de travail par l’évaluation de la réépithélialisation et par la quantification des molécules
bioactives sécrétées selon le type de pansement utilisé a été le fil conducteur tel que décrit
au cours du Chapitre 3. Différentes méthodes ont été utilisées afin de vérifier l’efficacité,
dont la comparaison à des pansements de fibroblastes au cours de la deuxième étude. Ce
type cellulaire a servi de comparatif puisque les pansements biologiques actuellement
disponibles sur le marché sont constitués de fibroblastes. Il s’agit d’ailleurs du contrôle se
rapprochant le plus de l’utilisation actuelle de thérapies cellulaires selon plusieurs auteurs
(Steinberg et al., 2012, Nie et al., 2011).
C’est la deuxième étude présentée ici qui constitue la meilleure évaluation de
l’efficacité des pansements sur la réépithélialisation. Quoique incomplète par rapport au
devis expérimental prévu initialement (le groupe évaluant les pansements de CSTA a été
perdu), cette étude a permis de comparer les pansements adipeux à des pansements de
fibroblastes de même qu’à des plaies sans pansement. Un groupe expérimental additionnel
dans lequel les pansements adipeux étaient changés en cours de guérison a également
permis de vérifier s’ils subissaient une dégradation et possiblement une perte d’efficacité
dans le temps. Ce changement de pansement a été appliqué seulement aux pansements
adipeux tel qu’expliqué au Chapitre 3 (section 3.2), ce qui limite la portée des conclusions
qui peuvent en être tirées.
Les pansements adipeux et les pansements de fibroblastes maintenus en place
pendant les six jours de guérison semblent avoir eu un effet comparable sur le phénomène
de réépithélialisation puisqu’aucun écart significatif n’a été détecté (Fig 3.8). Il n’y a que
les pansements adipeux changés en cours de guérison qui sont parvenus à accélérer la
vitesse de fermeture des plaies de manière significative par rapport à ces deux derniers, de
l’ordre de 10% d’aire recouverte supplémentaire après quatre jours de guérison. Cet écart
modeste numériquement est toutefois une constatation intéressante dans le contexte d’étude
actuel.
82
D’abord, il est important de reconnaitre les limites du modèle à exposer les écarts.
Premièrement, la petite taille de la plaie et le court temps de guérison nécessaire à sa
fermeture rendent la mise en évidence de différences numériques ardue. Un effet important
du pansement est nécessaire pour être en mesure de montrer un écart statistique en peu de
temps comparativement à des modèles d’étude où les plaies chroniques produites tardent à
guérir. En effet, au moment où les courbes graphiques se distinguent et se séparent les unes
des autres, le centre de la plaie est pratiquement atteint (Fig 3.8). Dans la plupart des études
de guérison in vivo de plaies chroniques disponibles dans la littérature, le délai pour
l’atteinte d’une guérison complète, même dans un modèle non pathologique, se situe entre
10 et 21 jours. Un tel délai entre le début de l’intervention et la fermeture de la plaie facilite
la mise en évidence d’un effet même minime puisqu’un faible avantage appliqué
quotidiennement à la vitesse de réépithélialisation s’accumule au fil des jours et devient
notable. Le délai de guérison alloué est donc un facteur déterminant pour permettre la mise
en évidence de différences qui existent réellement. L’agrandissement de la taille des plaies
in vitro à 10 ou 12 mm de diamètre pourrait être envisagé.
Deuxièmement, le milieu de culture utilisé après la création des plaies est
relativement riche en facteurs de croissance et en éléments nutritifs. Malgré que la quantité
de sérum bovin qu’il contient ait été limitée à 2%, ce milieu de culture « pour kératinocytes
» contenant des additifs tels que de l’insuline et de l’hydrocortisone est optimal à la
croissance de ceux-ci. Il est possible que les molécules bioactives produites par les
pansements aient eu un impact limité dans ce contexte puisque les kératinocytes étaient
déjà dans un environnement favorable à leur croissance. Il est difficile de déterminer avec
certitude la quantité minimale de sérum avec laquelle il est possible de maintenir des
conditions de croissance acceptables tout en permettant l’expression des effets biologiques
des pansements. Une réduction de la quantité de sérum bovin à 1% ou même à 0,5%
pourrait être une alternative dans des expérimentations de guérison des plaies in vitro
futures. Une autre alternative pourrait être l’utilisation d’un milieu de culture défini avec
lequel un contrôle des variables est facilité.
Les conditions de culture favorables dans lesquelles évoluent les plaies de tous les
groupes favorisent donc la guérison sans intervention. Il devient alors encore plus difficile
83
de montrer un effet des pansements dans ce contexte. Les plaies sans pansement se sont
d’ailleurs refermées à une vitesse comparable aux plaies pour lesquelles le pansement
adipeux a été changé tous les deux jours. Si le milieu de culture utilisé dans le modèle in
vitro n’avait pas été suffisamment riche en facteurs de croissance et en éléments nutritifs,
les plaies sans pansement ne se seraient pas refermées aussi rapidement. De plus, tel que
mentionné dans le Chapitre 3, la force mécanique qu’exerce probablement le pansement sur
les kératinocytes en migration donne une longueur d’avance aux plaies sans recouvrement.
Il est donc compréhensible que ces plaies ont connu une progression avantageuse dans la
deuxième étude et cette observation supporte l’explication selon laquelle le modèle rend la
mise en évidence d’écarts statistiques difficiles. Notons également que l’absence de
pansement n’est pas souvent une option en clinique puisqu’un recouvrement est nécessaire
pour protéger la plaie contre le frottement et l’infection. Les plaies sans pansement
constituent donc un comparatif intéressant dans le projet actuel, mais il ne reflète pas
exactement la réalité clinique.
Le but de cet argumentaire est de remettre en contexte les résultats obtenus et non
de discréditer le modèle. Tel que décrit plus tôt, le modèle in vitro adapté permet d’évaluer
de manière isolée le phénomène de réépithélialisation et présente la force majeure d’offrir
des conditions d’étude similaires pour chaque plaie. Le fait que des différences entre les
pansements adipeux maintenus en place pendant six jours et ceux changés tous les deux
jours aient pu être mises en évidence mérite donc une attention particulière. De plus, le fait
que les pansements adipeux se soient comportés de manière similaire aux pansements de
fibroblastes confirme l’intérêt de ces cellules. Elles pourraient devenir une alternative ou un
complément intéressant dans la conception et la production de pansements biologiques. Les
CSTA et par extension le tissu adipeux constituent, rappelons-le, une source accessible et
abondante de cellules pouvant servir de matériel de construction pour des pansements. Le
projet actuel confirme ainsi la pertinence d’évaluer le potentiel du tissu adipeux pour le
traitement des plaies. Le potentiel des CSTA seules, quoique bien décrit dans la littérature
comme étant favorable à la guérison des plaies sous forme d’injection ou en application
locale (Cherubino et al., 2011), devra être exploré davantage sous forme de pansement
avant de pouvoir conclure.
84
L’altération possible des pansements au fil du temps est un élément important à
considérer dans l’utilisation des pansements biologiques faits de tissu adipeux, mais aussi
dans l’utilisation de pansements biologiques en général. Il est très probable que l’exposition
à l’air rende les pansements moins efficaces au fil du temps, comme en témoigne
l’avantage qu’ont eu les plaies où le pansement adipeux a été changé tous les deux jours.
L’analyse histologique des pansements adipeux supporte cette hypothèse. En effet, les
pansements adipeux maintenus en place durant six jours semblent avoir perdu une part
importante de leur volume (Fig 3.13).Implicitement, cette perte de volume pourrait se
traduire par une baisse d’efficacité de ces pansements. La protection du contact direct avec
l’air est donc un déterminant important dans l’amélioration de la durée de vie et de
l’efficacité des pansements. Il serait également pertinent de procéder à des tests de viabilité
cellulaire sur les pansements par une technique d’identification des cellules mortes par
fluorescence. Ceci permettrait de vérifier la survie globale des cellules selon le temps
d’utilisation.
Afin de protéger les pansements, l’application d’une pellicule plastifiée de type
Tegaderm® pourrait être bénéfique. Appliquée sur le dos d’un animal par exemple, elle
servirait à la fois à maintenir le pansement en place et à le protéger de l’air ambiant. Une
autre méthode qui pourrait être efficace serait l’ajout de kératinocytes à la surface externe
du pansement. Une telle mesure complexifierait la production des pansements en y ajoutant
une étape supplémentaire, mais pourrait en même temps offrir un pouvoir sécrétoire
additionnel puisque les kératinocytes produisent des facteurs de croissance favorables à la
réépithélialisation (Martin, 1997, Stadelmann et al., 1998). Cette avenue a déjà été explorée
lors de travaux précédents au laboratoire et mérite d’être réenvisagée.
La quantification des molécules bioactives produites par les pansements a été une
étape importante de ce projet. L’étude pilote, en plus de permettre de vérifier la faisabilité
du projet et d’optimiser la méthode d’évaluation, a permis de vérifier pour une première
fois le potentiel sécrétoire des pansements au moment précédant leur mise en place sur les
plaies. La Figure 3.4 rapporte que la leptine, tel qu’attendu, est quasi exclusivement
produite par les pansements adipeux (46,6 ± 6,7 ng/mL comparativement à 1,9 ± 0,4 et 1,5
± 0,3 ng/mL par les pansements de fibroblastes ou de CSTA respectivement). Ce résultat
85
corrobore la littérature à l’effet que la production de leptine est une fonction spécialisée des
adipocytes (Friedman et al., 1998) et concorde avec les résultats précédemment obtenus au
sein de l’équipe. Une production plus abondante d’angiopoïétine-1 par les pansements
adipeux est également observée telle que précédemment décrite (Dallabrida et al., 2003).
Elle est deux fois plus abondante dans les surnageants des pansements adipeux que dans
ceux de fibroblastes ou de CSTA. Le VEGF est quant à lui produit davantage par les
pansements de CSTA que par les pansements adipeux. Il est également intéressant de
constater que les pansements adipeux et les pansements de fibroblastes ont produit une
quantité comparable de VEGF.
Dans les études subséquentes (première et deuxième étude), les différences
quantitatives notées dans les sécrétions des pansements se sont maintenues. La Figure 3.7
qui compare des pansements doubles de CSTA à des pansements adipeux lors de la
première étude confirme les tendances observées à l’étude pilote. La deuxième étude
évaluant des pansements triples montre également (Fig 3.9) les mêmes tendances, quoique
l’ampleur des valeurs quantitatives diverge. Notons que les dosages protéiques de cette
étude ont été faits dans des conditions différentes puisque le milieu prélevé était du milieu
adipogénique plutôt que du milieu sans sérum et sans phénol comme dans les deux analyses
précédentes. Tous les pansements ont été conservés dans ce milieu pendant 48 heures, mais
seulement les pansements adipeux y avaient été préalablement exposés. Cette étape a donc
possiblement surestimé la détection dans les surnageants des pansements de fibroblastes et
de CSTA, pour la leptine tout au moins.
Des résultats précédemment obtenus par l’équipe tendaient à montrer que les tissus
contenant des adipocytes produisaient une quantité significativement plus élevée de VEGF
que les CSTA, observation qui diffère dans l’analyse actuelle. Cette divergence notable
s’explique probablement par l’utilisation de milieux de culture différents au cours de ces
deux analyses. En effet, le milieu de culture à base d’EGM2 utilisé précédemment par
l’équipe pourrait avoir favorisé une production plus importante de VEGF par les adipocytes
que le milieu adipogénique actuel. Dans une moindre mesure, le moment choisi pour
induire la différenciation adipocytaire pourrait aussi avoir modifié la production de VEGF.
L’induction était habituellement effectuée au septième jour de culture tandis qu’elle est
86
réalisée au dixième jour dans la conception actuelle des pansements. Cette induction plus
tardive pourrait avoir réduit le nombre d’adipocytes retrouvés dans les feuillets cellulaires
produits et ainsi avoir affecté à la baisse la production de VEGF. De plus, des différences
dans les populations cellulaires utilisées pourraient expliquer en partie la variation de
détection du VEGF.
Il serait également pertinent de procéder à la détection quantitative de molécules
autres que la leptine, le VEGF et l’angiopoïétine-1. Le PDGF serait une molécule d’intérêt
puisque son effet favorable à la guérison des plaies, plus précisément sur la croissance de
l’épithélium, est bien décrite (Singer et al., 1999). Cette molécule serait retrouvée en
quantité appréciable dans le tissu adipeux (Pallua et al., 2009). Le PAI-1, une molécule
produite par les CSTA ainsi que les adipocytes (Bastelica et al., 2002, Crandall et al.,
2000), est reconnue comme étant entre autres impliquée dans l’angiogenèse et serait
également une cible pertinente.
L’effet des différents pansements a finalement été qualifié par des analyses
histologiques et immunohistochimiques. Des coupes transversales de plaies complètes
colorées au trichrome de Masson ont permis de constater que la migration des kératinocytes
se déroule de manière organisée, peu importe le type de pansement utilisé (Fig 3.11). Les
fronts de migration des plaies recouvertes d’un pansement ont d'ailleurs une apparence
comparable à ceux d’une plaie sans pansement. De plus, les analyses
immunohistochimiques de marqueurs spécifiques suggèrent que la différenciation des
kératinocytes (K10), la formation d’une jonction dermo-épidermique (Collagène de type
IV) et la présence de cellules prolifératives de l’épiderme (Ki-67) sont qualitativement
comparables en présence ou non d’un pansement (Fig 3.12). Un décompte des cellules
exprimant Ki-67 pourrait permettre de comparer quantitativement l’expression selon le type
de pansement utilisé et ainsi valider l’observation qualitative.
Ces résultats confirment que la présence d’un pansement sur une plaie n’est pas
nuisible à la réépithélialisation lorsque la cohésion du pansement avec le feuillet migratoire
est prévenue. La pression exercée sur les kératinocytes par le pansement aurait pu favoriser
la formation de langues de migration plus minces ou nuire à l’organisation et la
différenciation d’un nouvel épiderme, ce qui n’est pas le cas dans les analyses effectuées.
87
Les coupes histologiques indiquent que les kératinocytes ont été en mesure de migrer et de
former un nouvel épiderme possédant les caractéristiques morphologiques d’une peau
normale malgré cette pression. De même, les marqueurs immunohistochimiques supportent
cette affirmation puisque leur localisation et leur organisation se comparent à celle d’une
peau humaine normale.
4.3 Poursuite du projet sur un modèle animal
L’évaluation des pansements biologiques faits de CSTA ou de tissu adipeux sur un
modèle animal constitue la prochaine étape de ce projet. Tel que discuté, le modèle in vitro
permet de mettre en évidence les effets possibles des pansements, mais certains paramètres
limitent les conclusions qui peuvent être tirées. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle
animal afin de confirmer ou non le potentiel des pansements de CSTA ou de tissu adipeux
tout en reproduisant le plus fidèlement possible l’utilisation clinique envisagée.
Plusieurs types d’animaux ont déjà été utilisés pour l’évaluation des effets des
CSTA sur la guérison des plaies de la peau, tel que revu à la section 1.3.1 et 1.3.2. Certains
auteurs ont utilisé des animaux sans pathologie particulière tandis que d’autres ont choisi
des animaux irradiés, ischémiques ou diabétiques.
Les souris diabétiques offrent un modèle d’étude particulièrement intéressant pour
l’évaluation des pansements biologiques. Le diabète est la cause la plus répandue d’ulcères
chroniques chez l’homme et son mécanisme pathologique est particulièrement susceptible
de répondre à une intervention favorisant potentiellement l’angiogenèse. De bonnes études
récentes ont d’ailleurs utilisé ce modèle pour évaluer le potentiel des CSTA dans la
guérison des plaies (Amos et al., 2010, Nambu et al., 2009). L’évaluation du potentiel des
cellules adipeuses appliquées directement sur une plaie diabétique animale n’a jusqu’à ce
jour jamais été évaluée, ce qui constitue un intérêt supplémentaire à utiliser ce modèle.
La contraction est un mécanisme de guérison particulièrement actif chez les
rongeurs et il sera essentiel de réduire son impact afin de pouvoir reproduire le plus
fidèlement possible la guérison humaine (Davidson, 1998). Une technique couramment
88
utilisée dans la littérature consiste à ancrer les marges de la plaie à l’aide d’une rondelle de
silicone afin de retenir la peau saine en périphérie de la plaie. Cette technique est
relativement simple à réaliser et peut être accomplie à faible coût. Une autre alternative
dans l’évaluation des pansements serait le porc, mais les coûts reliés à l’utilisation de ces
animaux restreignent la faisabilité d’utiliser une telle technique (Galiano et al., 2004).
La manière dont le pansement est utilisé sur les animaux est une autre considération
importante. En clinique, les pansements synthétiques servant à recouvrir des plaies
chroniques sont généralement changés trois fois par semaine. Il serait donc raisonnable de
procéder à l’étude animale des pansements de CSTA et de tissu adipeux en les changeant à
tous les deux jours tel que réalisé précédemment in vitro. Il demeure essentiel de tenter
d’optimiser la durée de vie de ces pansements afin d’éventuellement en faire une alternative
clinique encore plus attrayante et pratique à utiliser.
Enfin, l’utilisation de souris diabétiques comme modèle serait une occasion idéale
de tenter de protéger davantage la surface externe des pansements adipeux ou de CSTA.
L’utilisation d’un adhésif servant à la fois de protection pour le pansement et de support
pour son maintien en place permettra peut-être d’optimiser son effet et de préserver son
épaisseur initiale.
89
6 Chapitre 5 - Conclusion
90
Le projet actuel a permis d’adapter un modèle de guérison des plaies in vitro à
l’utilisation et l’évaluation de pansements biologiques. Il a également été possible de
caractériser les forces et les faiblesses du modèle pour l’étude de l’efficacité de ces
pansements sur le phénomène de réépithélialisation.
L’utilisation des techniques de culture bien établies par Dre Fradette a également
permis de concevoir avec succès des pansements biologiques faits de CSTA ou de tissu
adipeux par la technique d’auto-assemblage. Ces pansements se sont avérés être robustes et
faciles d’utilisation. L’utilisation des CSTA, une source abondante et accessible de cellules
souches, constitue une avenue de choix afin de permettre la création de technologies de
pointe en guérison des plaies.
La recherche actuelle et la littérature suggèrent que le tissu adipeux pourrait avoir
un effet bénéfique sur la guérison des plaies. Le tissu adipeux pourrait être utilisé en
complément ou alternativement aux fibroblastes dermiques pour la production de
recouvrements autologues utiles dans le traitement des plaies cutanées comme des ulcères
diabétiques. Les pansements contenant des adipocytes semblent avoir un potentiel au moins
équivalent à ceux faits de fibroblastes dermiques, soit le type cellulaire actuellement utilisé
dans la plupart des pansements biologiques disponibles commercialement.
De plus, la quantification de molécules bioactives confirme que les CSTA et le tissu
adipeux produisent des facteurs proangiogéniques susceptibles de favoriser la guérison de
plaies pathologiques in vivo tels que les ulcères diabétiques. La mise en évidence d’une
considération majeure, l’exposition à l’air, dans l’efficacité et la durabilité des pansements
oriente les améliorations prioritaires à apporter au concept de pansement biologique pour
des études in vitro futures. La présente recherche confirme que la guérison des plaies en
présence de pansements biologiques semble se dérouler de manière organisée.
La pertinence d’évaluer les pansements de CSTA et les pansements adipeux sur un
modèle animal est importante. Cette démarche constitue la prochaine étape afin de
caractériser pleinement l’effet de ces pansements. Le potentiel de cette technologie pour le
traitement des ulcères chroniques est grand et mérite d’être approfondi dans un futur
proche.
91
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