universite d’antananarivo memoire de recherche …
TRANSCRIPT
UNIVERSITE D’ANTANANARIVO
DOMAINE SCIENCES ET TECHNOLOGIES
MENTION BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE
MEMOIRE DE RECHERCHE POUR L’OBTENTION DU DIPLOME DE
MASTER
PARCOURS : BIOTECHNOLOGIES
Présenté par RAKOTOARISOA Mialy Tsiory
Maître ès Sciences
Soutenu publiquement le 18 décembre 2017 devant le jury composé de :
Président : Pr RAHERIMANDIMBY Marson
Encadreur : Pr ANDRIANARISOA Blandine
Co-encadreur : Dr RAHARIJAONA Tovo Robin
Examinateurs : Dr HARIMALALA ANDRIAMBELO Nirina
Dr RAMAMONJISOA Daniel
REMERCIEMENTS
Avant tout, gloire à Dieu Tout puissant car sans Lui rien n’aurait pu être réalisé
Il m’est également agréable d’exprimer mes remerciements à :
Monsieur le Docteur TSIRINIRINDRAVO Herisetra Lalaina, Recteur et Chef des
unités de laboratoire de l’ASJA, de m’avoir accueillie dans ses laboratoires de recherche afin
de réaliser mon stage.
Monsieur le Professeur RAHERIMANDIMBY Marson, Doyen de la Faculté des
Sciences et Professeur titulaire à la mention Biochimie Fondamentale et Appliquée, de
m’avoir donné l’honneur, en acceptant de présider le jury de ce mémoire.
Madame le Docteur Harimalala Andriambelo Nirina et Monsieur le Docteur
RAMAMONJISOA Daniel qui ont aimablement accepté de juger mes travaux et donner leurs
aimables conseils durant les périodes de rédaction de ce mémoire et cela, malgré leurs
responsabilités innombrables.
Madame le Professeur ANDRIANARISOA Blandine, mon encadreur, enseignante à la
Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo, pour la grande disponibilité qu’elle m’a
toujours témoignée et l’intérêt qu’elle a porté à mes travaux. Je ne saurai vous remercier assez
pour vos conseils, sans lesquels j’aurai eu des difficultés dans la réalisation de mes recherches.
Monsieur le Docteur RAHARIJAONA Tovo Robin, maître de conférences, enseignant
à l’Ecole Supérieure Polytechnique d’Antananarivo, qui a accepté de m’encadrer en prodiguant
des conseils judicieux. Vos instructions m’ont été d’une grande utilité et j’en suis infiniment
reconnaissante.
Enfin et non la moindre, ma maman, mon frère et mon bien-aimé pour m’avoir toujours
soutenue et encouragée durant mes moments les plus durs, je vous serai à jamais redevable.
Bref, j’adresse toute ma gratitude à tous ceux qui ont contribué à la réalisation de ce travail, que
la Bénédiction de Dieu soit avec vous.
« J’ai compté fermement sur le Seigneur, Il s’est penché vers moi, Il a entendu mon appel. »
Psaume, 40 :1
Table des matières
TABLE DES MATIERES
GLOSSAIRE………………………………………………………………………………….i
LISTE DES TABLEAUX……………………………………………..…………………….iii
LISTE DES FIGURES…………………………………………………………………..…..iv
LISTE DES ABREVIATIONS………………………………………………………..……..v
INTRODUCTION………...………………………………….…………………………..…..1
Partie 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I. Le sol et ses polluants ......................................................................................................... 3
1. Description ...................................................................................................................... 3
2. La biologie du sol ............................................................................................................ 3
3. Les polluants du sol ......................................................................................................... 3
3.1 Polluants radioactifs ................................................................................................. 4
3.2 Polluants inorganiques ............................................................................................. 4
3.3 Polluants organiques ................................................................................................ 4
a. Les pesticides ........................................................................................................... 4
b. Les solvants organiques ........................................................................................... 5
c. Les hydrocarbures .................................................................................................... 5
c-1 Les alcanes ........................................................................................................ 5
c-2 Les alcènes et alcynes ....................................................................................... 6
c-3 Les hydrocarbures aromatiques ........................................................................ 6
II. La bioremédiation par les bactéries .................................................................................... 7
1. Définition ........................................................................................................................ 7
2. Les technologies utilisées dans la bioremédiation .......................................................... 7
3. Dégradation des hydrocarbures ....................................................................................... 8
3.1 Facteurs influençant la dégradation des hydrocarbures ........................................... 8
3.2 Métabolisme des hydrocarbures............................................................................... 9
a. Cas des alcanes ........................................................................................................ 9
b. Cas des alcènes et des alcynes……………………....……………………………10
c. Cas des Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques ............................................. 10
III. Pseudomonas putida ......................................................................................................... 11
1. Position systématique .................................................................................................... 11
2. Description .................................................................................................................... 12
3. Facteurs de croissance ................................................................................................... 12
3.1 Besoins nutritifs ..................................................................................................... 12
a. Source de carbone .................................................................................................. 12
b. Source d’azote ........................................................................................................ 12
Table des matières
c. Autres éléments nutritifs ........................................................................................ 13
3.2 Facteurs physico-chimiques ................................................................................... 13
a. Température ........................................................................................................... 13
b. Humidité et activité de l’eau .................................................................................. 13
c. pH ........................................................................................................................... 13
Partie 2: MATERIELS ET METHODES
I. Matériels ........................................................................................................................... 14
I-1. Matériels d’expérimentation ......................................................................................... 14
I-2. Matériels de laboratoire ................................................................................................. 14
I-3. Milieux de culture ......................................................................................................... 14
II. Méthodes ........................................................................................................................... 14
II-1. Prélèvement de l’échantillon de sol ............................................................................ 14
II-2. Isolement bactérien ..................................................................................................... 15
II-2.1 Préparation de la suspension mère ......................................................................... 15
II-2.2 Ensemencement ..................................................................................................... 16
II-2.3 Caractérisation des colonies isolées ....................................................................... 16
II-3. Purification .................................................................................................................... 17
II-4. Conservation.................................................................................................................. 17
II-5. Identification ................................................................................................................. 17
II-5.1 Etude des caractères morphologiques et culturaux ................................................ 17
II-5.1.1 Examen macroscopique .................................................................................. 17
II-5.1.2 Examen microscopique ................................................................................... 18
II-5.1.3 Observation à l’état frais ................................................................................. 18
II-5.1.4 Observation après coloration Gram ................................................................ 18
II-5.2 Etude des caractères physiologiques ...................................................................... 19
II-5.2.1 Détermination du type respiratoire ................................................................. 19
II-5.2.2 Recherche de l’oxydase .................................................................................. 20
II-5.3 Etude des caractères biochimiques ........................................................................ 20
II-5.3.1 Test sur milieu HAJNA-KLIGLER ................................................................ 20
II-5.3.2 Test sur milieu CITRATE DE SIMMONS .................................................... 21
II-5.3.3 Test sur milieu MANNITOL-MOBILITE-NITRATE ................................... 21
II-5.3.4 Test sur milieu LYSINE-FER ........................................................................ 21
II-5.3.5 Auxanogramme du carbone ............................................................................ 22
II-5.3.6 Test à la gélatine ............................................................................................. 22
III. Essai de traitement biologique .......................................................................................... 23
III-1.Mise en place du dispositif expérimental ..................................................................... 23
III-1.1 La préculture .......................................................................................................... 23
Table des matières
III-1.2 La préparation du sol ............................................................................................. 24
III-1.3 L’inoculation .......................................................................................................... 24
III-2.Méthodes analytiques ................................................................................................... 24
III-2.1 Dosages des hydrocarbures résiduels dans le sol ................................................... 24
III-2.2 Suivi de l’évolution de la population bactérienne .................................................. 26
III-2.2.1 Préparation de la suspension mère ........................................................................ 26
III-2.2.2 Dilutions ................................................................................................................. 26
III-2.2.3 Culture bactérienne ................................................................................................ 26
III-2.2.4 Mode de calcul pour le cas du dénombrement bactérien .................................. 26
III-2.3 Traitement des résultats en régime discontinu ....................................................... 27
III-2.3.1 Vitesse de dégradation du substrat Rs ........................................................... 27
III-2.3.2 Vitesse spécifique de dégradation du substrat QS ........................................... 27
III-2.3.3 Vitesse de production de biomasse RX ........................................................... 27
III-2.3.4 Vitesse spécifique de croissance µx ................................................................ 28
III-2.3.5 Temps de génération G ................................................................................... 28
Partie 3: RESULTATS ET INTERPRETATIONS
1. Isolement ....................................................................................................................... 29
2. Purification et conservation ........................................................................................... 29
3. Identification des souches ............................................................................................. 29
3.1 Caractères culturaux ............................................................................................... 29
3.2 Caractères morphologiques ................................................................................... 30
3.3 Caractères physiologiques .................................................................................... 31
3.4 Caractères biochimiques ....................................................................................... 32
3.5 Classification des souches ...................................................................................... 33
4. Essai biologique ............................................................................................................ 33
4.1 Teneurs en hydrocarbures résiduels ....................................................................... 33
4.2 Evolution de la population bactérienne .................................................................. 35
4.3 Traitement des résultats obtenus ............................................................................ 35
Discussions……………………………………………………………………………………37
Conclusion et perspectives...………………………………………………………………….40
Références bibliographiques………………………………………………………………….41
Annexes
Glossaire
i
Glossaire
Aliphatique : composé organique qui ne possède pas de noyau aromatique.
Anthropique : qui est causé par l’homme.
Bioaccumulation : processus par lequel certaines substances endogènes ou exogènes, présentes
en faible quantité, voient leur concentration augmenter dans un organe, un organisme, une
chaîne alimentaire (ou trophique), un écosystème.
Biodégradation : décomposition partielle ou totale d'un produit par un agent biologique.
Biofilm : structure hétérogène constituée par des populations bactériennes englobées dans une
matrice extracellulaire, fixée sur des surfaces naturelles ou artificielles.
Biosurfactant : composé actif biologique qui favorise la solubilisation et l'émulsion de
composés organiques.
Biovar : groupe de microorganismes qui possèdent les mêmes caractères biochimiques ou
physiologiques et se différencient sur les caractères génétiques.
Cancérigène : qui peut provoquer, aggraver ou sensibiliser un cancer ou son apparition
Consortium : association de bactéries
Contaminant : composé ou substance étrangère qui affecte la qualité d’une matière.
Craquage thermique : décomposition de fractions pétrolières sous l’influence de la chaleur.
Organotrophe : microorganisme qui métabolise des composés organiques comme source de
carbone et d’énergie.
Oxygénases : enzymes qui oxydent un substrat en y transférant un atome d'oxygène.
Pédogenèse : ensemble des processus (physiques, chimiques et biologiques) qui aboutisse à la
formation d’un sol.
Glossaire
ii
Persistant : composé est qualifié de persistant quand son élimination par des voies biologiques
est impossible ou très lente.
Phytopathogène : agent biologique susceptible de provoquer une maladie chez un végétal.
Pioverdine : sidérophore (chélateur de fer) produit par des bactéries à Gram négatif.
Prototrophe : organisme vivant capable de proliférer dans un milieu de base sans nécessiter la
présence de facteurs de croissance particuliers.
Psychrotrophe : microorganisme capable de se développer à des températures très basses allant
de 0°C à +4°C.
Pyrolyse : décomposition thermique de matières organiques en l'absence d'oxygène ou en
atmosphère pauvre en oxygène.
Rizhosphère : partie du sol pénétrée par les racines des plantes et les microorganismes associés
Tellurique : qui est relatif à la terre, provient de la terre
Tératogène : qui engendre des malformations
Tumorigène : qualifie une cellule susceptible de dégénérer en tumeur
Ubiquitaire : omniprésente dans un environnement.
Liste des tableaux
iii
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Conditions environnementales assurant la bioremédiation ..................................... 8
Tableau 2 : Caractères culturaux des souches bactériennes isolées ......................................... 29
Tableau 3 : Caractères morphologiques des souches bactériennes isolées .............................. 31
Tableau 4 : Caractères physiologiques des souches bactériennes isolées ................................ 31
Tableau 5 : Caractères biochimiques des souches bactériennes isolées ................................... 32
Tableau 6 : Identités des souches pures bactériennes isolées ................................................... 33
Tableau 7 : Variation de la concentration en hydrocarbures résiduels..................................... 34
Tableau 8 : Vitesses spécifiques correspondant à la formation de biomasse et à la dégradation
du substrat ................................................................................................................................ 36
Liste des figures
iv
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Voie de dégradation des alcanes par oxydation terminale, sub- et bi-terminale…..10
Figure 2 : Voies métaboliques de la dégradation du cycle aromatique: cas du benzène ......... 11
Figure 3 : Géolocalisation du site d’échantillonnage ............................................................... 15
Figure 4 : Suspension mère avant ensemencement .................................................................. 16
Figure 5 : Colonies obtenues sur gélose au cétrimide après incubation .................................. 29
Figure 6 : Evolution du taux de dégradation durant l’expérimentation ................................... 34
Figure 7 : Evolution de la concentration en biomasse en fonction de la concentration en
hydrocarbure lors de la culture sur un sol pollué de Pseudomonas putida .............................. 35
Figure 8 : Courbes des vitesses spécifiques correspondant à la biomasse μ, au substrat QS lors
de la culture en batch sur sol pollué avec huile de vidange de Pseudomonas putida .............. 36
v
LISTE DES ABREVIATIONS
°C : degré Celsius
C : carbone
COV : Composé Organique Volatil
EPA : Environmental Protection Agency
g : gramme
h : heure
H : hydrogène
HAP : Hydrocarbure Aromatique Polycyclique
Hcr : hydrocarbure résiduel
INERIS : Institut National de l’Environnement Industriel et des Risques
INRS : Institut National de la Recherche Scientifique
j : jour
LDA : Lysine DésAminase
LDC : Lysine DéCarboxylase
min : minute
N : azote
P : phosphore
PCA : Plate Count Agar
PGPR : Plant Growth-Promoting Rhizobacteria
pH : potentiel d’hydrogène
POP : Produit Organique Persistant
Ppm : partie par million
UFC : Unité Formant Colonie
INTRODUCTION
GENERALE
Introduction
1
Depuis plusieurs décennies, les activités de l’homme ne cessent de s’accroître,
engendrant ainsi une production massive de polluants dans l’environnement. Le sol se trouve
être le plus touché par ce fléau puisque selon l’INRP (Inventaire National des Rejets de
polluants) au Canada en 1992, presque 53,3 % des rejets dus aux activités agricoles,
industrielles et urbaines sont déversés dans le sol. Ces produits de rejets peuvent contenir
différents composés tels que des solvants organiques, des pesticides, des métaux lourds et bien
d’autres encore (Robert, 1996).
Parmi les composés les plus polluants se trouvent les hydrocarbures pétroliers qui
sont des composés organiques très mobiles, ce qui signifie que ces polluants peuvent se
retrouver dans le sol, l’eau, l’atmosphère et aussi dans la chaîne alimentaire. Ces composés sont
non seulement très persistants mais aussi très nocifs aussi bien pour l’homme que pour
l’environnement. En effet, certains d’entre eux peuvent engendrer des tumeurs, des cancers et
même des mutations chez l’homme (Surridge et al., 2009). Du point de vue environnemental,
la présence de ces composés dans le sol inhibe la croissance des microorganismes telluriques,
empêchant ainsi le sol d’assurer ses fonctions et provoquant ainsi un déséquilibre dans
l’écosystème.
De ce fait, la réhabilitation des sols pollués est devenue non seulement une
nécessité mais surtout une obligation. D’ailleurs, la loi canadienne stipule d’ores et déjà la
dépollution de tous les sites contaminés issus des industries d’extraction pétrolière, de raffinage
ou de distribution.
A ce propos, plusieurs technologies de traitement, dont nombreuses d’entre elles
ont déjà fait leurs preuves, sont maintenant offertes pour traiter toute une variété de
contaminants. Parmi ces diverses techniques se trouvent les procédés physiques et les procédés
chimiques. Ces procédés ont recours à l’incinération, à l’enfouissement ou à l’utilisation de
produits chimiques pour éliminer les polluants. Cependant, ces méthodes sont susceptibles
d’engendrer encore plus d’effets néfastes sur le milieu à dépolluer. Le développement de
nouveaux procédés impliquant des organismes ou microorganismes vivants représente une
solution alternative écologique, mais également moins coûteuse que les procédés chimiques ou
physiques (Ballerini et Vandecasteele, 1999). La bioremédiation fait donc appel à l’utilisation
des bactéries afin de ramener la quantité de polluants en dessous de la valeur seuil et dans le
délai imparti pour éviter la dispersion du contaminant.
Introduction
2
Malgré l’appréciation et l’efficacité que porte la bioremédiation, cette méthode
reste encore peu maîtrisée. Les microorganismes dégradant les hydrocarbures ne sont pas
encore tous connus et les technologies de traitement biologique ont besoin d’être mises au point
pour garantir leur efficacité. Par conséquent, avancer les recherches dans ce domaine est d’une
grande utilité afin d’améliorer le système utilisé en augmentant la capacité de dégradation des
microorganismes.
C’est pourquoi cette étude s’est orientée vers la bioremédiation des sols pollués
par les hydrocarbures par Pseudomonas putida. L’objectif principal est donc de mettre au point
un système de bioremédiation efficient tout en tenant compte des différents facteurs favorisant
cette activité bactérienne. Dans cette optique, cette recherche consiste à isoler une souche de
Pseudomonas putida à partir d’un sol puis de réaliser un essai de traitement biologique au
moyen de cette souche. La capacité de dégradation de cette souche ainsi que la cinétique
bactérienne seront aussi évaluées tout au long du processus.
Pour mieux cerner cette étude, ce mémoire se divise en trois parties : en première
partie se trouve l’ensemble des recherches bibliographiques, la deuxième partie concerne les
matériels et méthodes qui vont détailler l’approche méthodologique adoptée durant les
manipulations effectuées et enfin les résultats et discussions se trouvent à la troisième partie.
SYNTHESE
BIBLIOGRAPHIQUE
Synthèse bibliographique
3
I. Le sol et ses polluants
1. Description
Le sol est défini comme la couche superficielle de la croûte terrestre. Il provient de la
pédogenèse qui est un ensemble de processus d’altération des roches mères sous l’action de
l’eau, de l’air et des êtres vivants. Les composés organiques présents dans le sol sont issus de
la dégradation des matières organiques mortes. Le sol forme ainsi un système hétérogène et
complexe constitué d’un ensemble de quatres fractions différentes : les minéraux solides,
la matière organique, la phase gazeuse, et la phase liquide (Raoul, 2003). De ce fait, le sol est
une réserve et fournisseur d’éléments indispensables à la croissance des végétaux et
microorganismes qu’il abrite. A ce titre, le sol est, par son organisation et son fonctionnement,
un véritable système écologique dynamique (Robert, 1996).
2. La biologie du sol
Le sol est un milieu vivant dans lequel se développe une multitude d’organismes variés
appartenant aux règnes animal et végétal. La qualité biologique des sols fait référence à
l'abondance, à la diversité et à l'activité des organismes hébergés dans le sol. Les
microorganismes telluriques contribuent à la mise en équilibre de l’écosystème terrestre
puisqu’ils assurent des fonctions essentielles comme la dégradation des matières organiques, la
production de nutriments pour les plantes, la fixation d’azote, la dégradation des polluants, etc.
(Lemanceau et Heulin, 1998).
Le sol, bien que pouvant être restauré et plus ou moins reconstitué, reste une ressource non
renouvelable en raison de la longue période nécessaire aux processus de sa formation. Cette
propriété le rend particulièrement sensible aux agressions anthropiques telles que les pollutions.
3. Les polluants du sol
Le sol est dit contaminé lorsqu’il contient des composés susceptibles de causer des
altérations (biologiques, physiques ou chimiques) de l’écosystème. Au-delà d’un certain seuil,
le polluant présent dans le sol induit des impacts négatifs sur tout ou partie de l’environnement
en général (Chassin et al., 1996). En fonction de la durée de dégradation, les polluants sont
classés comme suit : les polluants récalcitrants ou persistants et les polluants biodégradables.
Un contaminant est persistant lorsque son élimination biologique est très lente ou impossible.
Un polluant biodégradable par contre, est un composé qui peut être facilement décomposé par
des organismes vivants.
Synthèse bibliographique
4
Les polluants du sol sont très diversifiés. Ils peuvent être inorganiques, organiques ou
radioactifs et sont pour la plupart du temps issus des activités anthropiques.
3.1 Polluants radioactifs
Les polluants radioactifs sont les déchets nucléaires qui proviennent des centrales nucléaires,
des sites d’extraction de minerais et des hôpitaux. Les polluants radioactifs sont des polluants
persistants et durant sa désintégration, ces composés émettent des rayonnements nocifs pour
l’homme. Les éléments radioactifs présents dans le sol peuvent être absorbés par les végétaux,
ingérés ou inhalés par les animaux. Par conséquent, les polluants radioactifs s’intègrent dans la
chaîne alimentaire, entraînant ainsi malformations, mutations génétiques et cancers chez
l’homme (Jammet et al.,1968).
3.2 Polluants inorganiques
Les polluants inorganiques sont principalement les métaux lourds (plomb, mercure, zinc,
cadmium, nickel, arsenic). Ils proviennent des sites d'enfouissement, des déchets domestiques
et industriels, des sites d'extraction de minerais. Les métaux lourds sont à l’état de trace dans le
sol mais ces composés peuvent s’accumuler dans l’environnement puisqu’ils sont très
persistants. Lorsqu'ils se retrouvent en grande quantité dans la nature, ils deviennent nocifs et
peuvent modifier la fertilité des sols. Ils peuvent également contaminer les cours d'eau et des
réserves souterraines (Lemière et al., 2001).
3.3 Polluants organiques
Parmi les polluants organiques, il y a les matières organiques mortes (fumier), les hydrocarbures
(pétrole et dérivés) et les produits organiques persistants (POP) comme les solvants, les
pesticides et les insecticides. En faible quantité, ces éléments s'incorporent facilement dans
l'environnement. Toutefois, l'utilisation en grande quantité de ces contaminants amène une
saturation du sol et induit une toxicité chez les organismes telluriques et l’homme (Christian,
1996).
a. Les pesticides
Les pesticides ou produits phytosanitaires désignent l'ensemble des produits chimiques, naturels
ou de synthèse, destinés à repousser ou détruire les nuisibles (microbes, animaux ou végétaux).
Certains pesticides sont des composés solubles dans l’eau et certains se transforment en d’autres
métabolites toxiques, une utilisation excessive induit l’accumulation de ces produits toxiques
Synthèse bibliographique
5
dans le sol. Les microorganismes telluriques se trouvent donc affectés par cette accumulation,
entrainant ainsi la diminution de la productivité du sol (Hayo, 1997).
b. Les solvants organiques
Les solvants organiques sont des composés qui ont le pouvoir de former avec d’autres
substances une solution homogène. Ils sont utilisés instantanément ou en association avec
d’autres agents chimiques pour dissoudre des matières premières. Ils sont aussi utilisés comme
agents de nettoyage ou comme correcteurs de viscosité. D’une manière générale, les solvants
sont des substances potentiellement toxiques pour l’homme, il s’avère aussi que la microflore
du sol se trouve affectée par cette toxicité, ce qui contribuera à la détérioration de la qualité du
sol (Mousel et al., 1985).
c. Les hydrocarbures
Les hydrocarbures sont des molécules organiques formées uniquement d’atomes de carbone et
d’hydrogène de formule brute : CnHm où n et m sont des entiers naturels. Ces molécules
organiques peuvent être linéaires ou cycliques, présentant des ramifications ou non. D’une
manière générale, les hydrocarbures sont regroupés en deux types de molécules : les
aliphatiques et les aromatiques (Fingas et al., 2009). Selon la nature de leur liaison chimique,
les hydrocarbures peuvent être saturés ou insaturés et sont classés parmi les groupes suivants :
les alcanes, les alcènes et alcynes et les composés aromatiques.
Bien que certains hydrocarbures soient issus de formation biologique, les hydrocarbures les
plus polluants sont ceux qui sont issus d’une formation géochimique, il s’agit ici de produits
pétroliers qui sont constitués à 80% d’hydrocarbures saturés et aromatiques. Leur présence dans
le sol est liée aux industries de raffinage, de transformation, de stockage et de distribution de
pétrole. Certaines pollutions sont aussi issues des sous-produits pétroliers rejetés (notamment
les huiles moteurs usagées) (Tarayre 2012).
Par ailleurs, la structure moléculaire des hydrocarbures influe sur leurs propriétés physico-
chimiques. En d’autres termes, plus le nombre d’atomes de carbone est important, plus la
solubilité, la volatilisation et surtout la biodégradabilité diminuent (Tarayre, 2012). Les sous-
produits pétroliers obtenus en fonction du domaine d’ébullition sont annexés dans l’annexe 4.
c-1 Les alcanes
Les alcanes sont des hydrocarbures aliphatiques saturés caractérisés par la présence de liaisons
simples entre les atomes de carbone. De formule brute CnH2n+2 où n est un entier naturel, les
Synthèse bibliographique
6
alcanes forment deux grands groupes : les hydrocarbures à chaîne ouverte (linéaires ou
ramifiés) et les cyclanes à chaîne fermée.
Chez l’homme, la plupart des alcanes à chaîne linéaire n’induisent aucun effet toxique (Fiches
de toxicologie de l'INRS : Institut National de la Recherche Scientifique). Cependant, il existe
des molécules cycliques, comme l’hexane qui peut provoquer des tumeurs pulmonaires. Par
ailleurs, la volatilité des alcanes diminue avec le nombre d’atome de carbone. Il est à noter que
les dérivés pétroliers contiennent 36 à 42 % d’alcanes.
c-2 Les alcènes et alcynes
Les alcènes et les alcynes sont des hydrocarbures non saturés caractérisés respectivement par
la présence d’une double et d’une triple liaison entre deux atomes de carbone.
De formule brute CnH2n, les alcènes sont obtenus par craquage thermique des hydrocarbures
pétroliers ou aussi par hydrogénation des alcynes. L’alcène le plus courant est l’éthylène qui
est utilisé dans le domaine agroalimentaire pour la maturation des fruits ou pour éviter la
germination des tubercules (Saada et al., 2003).
D’autre part, les alcynes, de formule brute CnH2n-2 sont issus de la déshydrogénation thermique
des alcanes à haute température. L’alcyne le plus utilisé est l’acéthylène qui est un composé
inflammable utilisé en tant que combustible.
La plupart des alcènes et des alcynes sont des composés organiques volatiles (COV), ce qui
signifie que ces composés ne présentent aucun danger vis-à-vis du sol. D’ailleurs, ces composés
sont biodégradables avec une demi-vie allant de 90 à 220 jours (Saada et al., 2003).
c-3 Les hydrocarbures aromatiques
Les hydrocarbures aromatiques sont des composés organiques qui possèdent un ou plusieurs
cycles à doubles liaisons alternées. Le noyau aromatique peut être du benzène ou des dérivés
benzéniques (toluène, xylène, etc.) (Vollhardt et Schore, 2004). Les hydrocarbures aromatiques
sont produits en quantité importante dans l’activité humaine, notamment dans les processus
de pyrolyse et de combustion mis en œuvre dans l’industrie, le transport et le chauffage
(Técher, 2011). Cependant, une grande fraction des hydrocarbures aromatiques polycycliques
présents dans la nature proviennent des dérivés pétroliers.
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des molécules potentiellement
toxiques, dus au faite que ces molécules sont tumorigènes, tératogènes et cancérigènes
Synthèse bibliographique
7
(Bouchez et al., 2001). Les hydrocarbures présents dans le sol sont susceptibles de contaminer
d’autres milieux tels que les nappes phréatiques, les lacs et les rivières.
La biodégradabilité des HAP diminue avec le nombre de cycles de la molécule. En d’autres
termes, les composés ayant un faible poids moléculaire sont plus solubles et plus volatils. En
revanche, les composés de poids moléculaires élevés sont très persistants et par conséquent
bioaccumulables (Kanaly et Harayama, 2000). La demi-vie des HAP peut aller de 20 jours à 3
ans selon le nombre de cycle (INERIS, 2014)
De façon générale, la plupart des HAP sont pratiquement insolubles dans l’eau. Cependant,
leur solubilisation peut être favorisée par des biosurfactants (rhamnolipide) produits par des
bactéries ou des solvants organiques (acétone, alcool) (Cooper et al., 1980).
II. La bioremédiation par les bactéries
1. Définition
La bioremédiation est un processus biologique qui consiste à réduire le niveau de pollution
présent dans l’air, dans l’eau ou dans le sol. La biotransformation et la biodégradation font
partie de la bioremédiation. L’objectif de la biotransformation est d’augmenter l’hydrosolubilité
des substances toxiques afin d’accélérer sa dégradation. Tandis que la biodégradation consiste
surtout en la décomposition du polluant en divers éléments dépourvus d’effets néfastes sur le
milieu naturel. D’une manière générale, durant la bioremédiation, les polluants organiques sont
transformés en molécules moins polluantes (en termes de persistance et de toxicité) (Bocard,
2006). Les bactéries prennent une part importante dans cette décontamination naturelle, du fait
de leurs capacités à s’adapter à la toxicité des polluants en développant une machinerie
enzymatique permettant de dégrader et/ou d’utiliser ce polluant pour leur survie et leur
développement.
2. Les technologies utilisées dans la bioremédiation
Afin que la bioremédiation soit efficace, la bactérie utilisée doit avoir une aptitude à dégrader
les composés organiques présents dans le site à dépolluer. Il est aussi important que la bactérie
présente une tolérance face au pouvoir toxique du polluant. En outre, les bactéries utilisées
peuvent être indigènes, déjà présentes dans la zone polluée, ou d’origine exogène, ajoutées au
milieu pollué (El Fantroussi et Agatos, 2005).
Synthèse bibliographique
8
Les technologies les plus utilisées dans la bioremédiation sont les suivantes :
La bio-augmentation : les bactéries sélectionnées sont mises en culture au laboratoire
sous forme de suspension puis réintroduites dans le sol contaminé. La culture peut
comprendre une ou plusieurs espèces de microorganismes endogènes ou exogènes. La
bio-augmentation est largement utilisée pour décontaminer les sites contenant des
hydrocarbures (Lens et al., 2005).
la bio-stimulation : cette technique consiste à stimuler l’activité des populations
microbiennes endogènes par apport de nutriments et par ajustement des conditions du
milieu (potentiel d’hydrogène, humidité) (El Fantroussi et Agatos, 2005). La bio-
stimulation est surtout utilisée dans les cas des traitements in-situ.
3. Dégradation des hydrocarbures
3.1 Facteurs influençant la dégradation des hydrocarbures
Plusieurs facteurs sont mis en jeu lors de la dégradation des polluants par les bactéries. Les
conditions environnementales doivent être optimales afin d’assurer non seulement la croissance
des bactéries mais aussi l’efficacité de la bioremédiation (Rajaona, 2015). Le tableau 1 affiche
les paramètres à fixer pour une bioremédiation efficiente.
Tableau 1 : Conditions environnementales assurant la bioremédiation
Paramètres Valeur optimale de dégradation d’hydrocarbure
Humidité 25-28 % de la capacité de rétention en eau de la
matrice
pH 5,5-8,8
Contenu en oxygène Aérobie
Contenu en nutriments C :N :P=100 :5 :1
Oligo-éléments Fonction de l’espèce
Température (C°) 15-30
Concentration en hydrocarbure Inférieure à 50000 ppm
Type de sol Contenu en argile faible
Source : Vidali, 2001
Synthèse bibliographique
9
3.2 Métabolisme des hydrocarbures
Pour métaboliser les hydrocarbures, la bactérie peut suivre deux voies différentes :
le co-métabolisme : un métabolisme durant lequel le polluant dégradé n’intervient pas
dans la croissance cellulaire, c’est-à-dire qu’il ne constitue pour le microorganisme ni
une source de carbone, ni une ressource énergétique. La dégradation du polluant est
conditionnée par la présence d'un deuxième substrat (co-substrat) permettant la
croissance de la bactérie (Christian et al., 1996).
la biodégradation : elle se distingue du co-métabolisme par le fait que le micro-
organisme utilise le polluant comme source de carbone et d'énergie assurant ainsi sa
croissance (Christian et al., 1996).
Par ailleurs, les hydrocarbures sont métabolisés via une réaction d’oxydation, la bactérie utilise
donc l’oxygène comme accepteur d’électron dans un milieu aérobie et des nitrates ou du fer
ferrique dans un milieu anaérobie. Toutefois, dans la plupart des cas, la dégradation se déroule
en milieu aérobie.
a. Cas des alcanes
La première étape dans la dégradation aérobie des alcanes est catalysée par des oxygénases .Il
existe deux principales voies d’oxydation : l’oxydation terminale et l’oxydation sub-terminale.
L’oxydation terminale :
L’oxydation terminale est le principal processus utilisé par la plupart des bactéries. L’alcane est
oxydé en alcool primaire, puis en aldéhyde et finalement en acide gras correspondant (Rehm,
2008). L’acide gras formé est oxydé par β-oxydation pour former par la suite de l’acétyl-CoA
qui sera à son tour métabolisé dans le cycle de Krebs. Il est à noter que lorsque l’acide gras se
forme, une deuxième oxydation peut se produire au niveau du groupement méthyl-ω pour
donner un diacide qui sera transformé à son tour en acétyl-CoA par β-oxydation, il s’agit ici
d’une oxydation bi-terminale (Rehm, 2008).
L’oxydation sub-terminale :
Cette réaction conduit à la formation d’alcool secondaire qui sera oxydé en cétone. La
dégradation du cétone par incorporation d’un atome d’oxygène conduit à la formation d’un
ester (réaction de type Bayer-Villiger) qui sera clivé par une estérase en alcool et acide gras
(Gonçalves et al., 2004). La réaction d’oxydation de l’alcane est montrée par la figure 1.
Synthèse bibliographique
10
Figure 1 : Voie de dégradation des alcanes par oxydation terminale, sub- et bi-terminale
(source : Beilen et al., 2003)
b. Cas des alcènes et des alcynes
La dégradation des alcènes et des alcynes suit la même voie que celle des alcanes. En effet,
le composé est oxydé en position terminale pour donner un alcool primaire ω-insaturé. Ce
dernier sera oxydé à son tour pour donner un acide. L’acide correspondant obtenu est
transformé en acétyl-CoA par β-oxydation. L’acétyl-CoA s’infiltre par la suite dans le cycle de
Krebs pour fournir de l’énergie à la bactérie (Soltani, 2004).
c. Cas des Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques
La bactérie oxyde initialement l’hydrocarbure aromatique par incorporation de deux atomes
d’oxygènes moléculaires pour former un diol (Gibson et al., 1975). Cette réaction est catalysée
par une enzyme, la dioxygénase. Par la suite le diol formé est converti en catéchol par une
déshydrogénase (Gibson et al., 1968). Le catéchol à son tour est clivé par oxydation en position
para ou ortho pour former d’un côté un alcool primaire et d’un autre côté un alcool secondaire.
Toutefois, les deux voies aboutissent à la formation d’acide qui sera métabolisé par β-oxydation
pour produire de l’acétyl-CoA. La figure 2 montre la dégradation du benzène en milieu aérobie.
Synthèse bibliographique
11
Figure 2 : Voies métaboliques de la dégradation du cycle aromatique: cas du benzène
(source: Gibson et al., 1975)
III. Pseudomonas putida
1. Position systématique
La classification suivante est basée sur celle de Migula en 1894 (Nelson et al, 2002) :
Règne: BACTERIA
Embranchement: PROTEOBACTERIA
Classe: GAMMA PROTEOBACTERIA
Ordre: PSEUDOMONADALES
Famille: PSEUDOMONADACEAE
Genre: Pseudomonas
Espèce: putida
Synthèse bibliographique
12
2. Description
Pseudomonas putida est une bactérie ubiquitaire mais elle est surtout rencontrée dans la zone
rizhosphérique de Pinus radiata (Mukerji et al., 2006). La plante et la bactérie effectuent une
symbiose durant laquelle la bactérie se développe à partir des nutriments fournis par les racines
et à son tour, la bactérie induit la croissance de la plante et la protège contre les agents
phytopathogènes (Lucas et al., 1989).
Pseudomonas putida est une bactérie en forme de bacille, non sporulante et Gram négatif. Sa
mobilité est assurée par des flagelles polaires. La bactérie se distingue par la production de
pigments jaune-vert fluorescents (pyoverdine ou pseudobactine) dans des conditions de carence
en fer. Du point de vue métabolique, la bactérie est classée de chimio-organotrophe en raison
de sa capacité à métaboliser une large gamme de composé organique pour sa croissance
(Golovleva et al., 1992). Parmi ces composés organiques, il y a les hydrocarbures aromatiques
et aliphatiques qui sont des polluants potentiellement toxiques pour l’homme (Mazzeo et
al.2010).
Du point de vue environnemental, Pseudomonas putida peut non seulement métaboliser les
polluants organiques mais elle a aussi une capacité à tolérer les contraintes environnementales.
3. Facteurs de croissance
Malgré le fait que Pseudomonas putida soit une bactérie peu exigeante (prototrophe), la bactérie
ne peut se développer correctement que lorsque les conditions de croissance sont remplies.
3.1 Besoins nutritifs
a. Source de carbone
Le carbone est l'un des éléments les plus abondants chez la bactérie. Pseudomonas putida est
capable de métaboliser un grand nombre de composés carbonés afin de lui fournir du carbone
et de l’énergie (Lemanceau P. et al., 1998).
b. Source d’azote
Les bactéries ont besoin de substances azotées pour synthétiser leurs protéines et acides
nucléiques. Pseudomonas putida n’est pas capable de capter l’azote atmosphérique, par contre
la bactérie peut assimiler l’azote sous forme organique ou minéral (Mazzeo et al.2010).
Synthèse bibliographique
13
c. Autres éléments nutritifs
Pseudomonas putida est une bactérie peu exigeante. La présence d’une source de carbone et
d’azote peut suffire à sa croissance (Larpent et Sanglier, 1992).
3.2 Facteurs physico-chimiques
a. Température
La température optimale de croissance de Pseudomonas putida est située entre 25 et 30°C.
Toutefois, la bactérie peut croître à des températures très basses allant jusqu’à 4°C, la bactérie
est donc qualifiée de bactérie psychrotrophe (Weidemeier et al., 1999).
b. Humidité et activité de l’eau
La disponibilité en eau affecte considérablement la croissance des bactéries. Pour sa croissance,
Pseudomonas putida a besoin d’une activité de l’eau égale à 0,97. En outre, une humidité
supérieur à 30% inhibe le développement de la bactérie (Weidemeier et al., 1999).
c. pH
Nombreux sont les microorganismes qui croissent dans une gamme de pH variant de 6,5 à 7,5
(Bouwer et Zehnder, 1993). Pseudomonas putida a une croissance optimale à un pH entre 7 et
7,6 ; la bactérie est classée parmi les neutrophiles.
MATERIELS ET METHODES
Matériels et méthodes
14
I. Matériels
I-1. Matériels d’expérimentation
Afin de réaliser cette étude, les matériels suivants ont été utilisés :
Sol : le sol doit être homogène et exempt de contamination pour ne pas fausser les
résultats.
Sciure de bois : la sciure de bois ne doit pas contenir des composés chimiques qui
pourraient inhiber la croissance de la bactérie. La sciure utilisée dans cette étude est
issue du Pinus radiata.
Huile moteur : l’huile de vidange pour moteur diesel issue du garage d’entretien
d’automobile de l’ASJA a été utilisée.
I-2. Matériels de laboratoire
Les matériels utilisés lors des analyses physico-chimiques et microbiologiques sont les
suivants :
Verreries : ballons, Erlenmeyer, tube à essai, bécher, boîte de Pétri, pipette graduée.
Petits matériels : spatule, couteau, anse d’inoculation, bec bunsen, balance, plaque
chauffante, micropipette.
Gros matériels : autoclave, hotte à flux laminaire, étuves, réfrigérateur.
I-3. Milieux de culture
Les milieux de culture utilisés sont les suivants :
Milieu sélectif : gélose au cétrimide
Milieu électif : PCA (Plat Count Agar), Hajna-Kligler, citrate de Simmons, Mannitol
Mobilite Nitrate, lysine-fer, EPT (Eau Peptonée Tamponnée)
II. Méthodes
II-1. Prélèvement de l’échantillon de sol
a. Principe
L’échantillonnage est réalisé dans les conditions d’asepsie, loin des sources de contamination
et des activités humaines.
Matériels et méthodes
15
b. Mode opératoire
Les prélèvements ont été réalisés sur trois pieds de Pinus différents, à 15 cm de profondeur afin
d’atteindre la zone racinaire. 10 g de sol sont prélevés dans des bocaux stériles, puis ramenés
au laboratoire pour être analysés. L’échantillonnage s’est déroulé dans la région Vakinankaratra
dans la commune urbaine d’Antsirabe II dans le fokotany de Morahita, dont les coordonnées
GPS (Global Positioning System) sont : 19°93’59’’ S ; 47°569 E.
Figure 3 : Géolocalisation du site d’échantillonnage (Source : Google map)
II-2. Isolement bactérien
L’isolement consiste à séparer les différents types de souche bactérienne contenus dans les
échantillons de sol.
II-2.1 Préparation de la suspension mère
Pour réaliser la suspension mère de la figure 4, 10g d’échantillon de sol à analyser est
mélangé avec 90 ml de NaCl 9°/OO pour obtenir un volume total de 100 ml.
Matériels et méthodes
16
II-2.2 Ensemencement
La gélose au cétrimide est le milieu sélectif utilisé pour l’isolement et l’identification des
espèces de germe de Pseudomonas (Public Health England, 2015).
La gélose en surfusion est coulée dans des boîtes de Pétri. Après solidification du milieu, 1 ml
de la suspension mère est ensemencé à la surface de la gélose. Enfin, les boîtes sont renversées
et incubées à 30°C pendant 48 heures.
II-2.3 Caractérisation des colonies isolées
Les colonies isolées sont caractérisées à l’œil nu afin de déterminer le nombre de type de colonie
dans l’échantillon de sol analysé. La caractérisation de chaque colonie se base sur les
caractéristiques suivantes : forme, taille, relief, contour, consistance, chromogenèse, etc...
Toutes les colonies qui présentent les mêmes caractéristiques font partie d’un seul type de
colonie. Le nombre de type de colonie déterminé équivaut au nombre de souche isolée à partir
de chaque échantillon de sol.
Figure 4 : Suspension mère avant ensemencement (source : auteur, 2017)
Matériels et méthodes
17
II-3. Purification
La purification a pour but de ré-isoler les différents types de colonie présent à la surface d’un
milieu afin d’obtenir des cultures pures. Une culture pure contient une population homogène
formée par des colonies identiques en tout point.
Chaque type de colonies trouvé est repiqué dans une boîte de Pétri muni préalablement de la
gélose au cétrimide. La méthode d’ensemencement est celle du quadrant. L’incubation se fait
pendant 24 heures à 30°C.
Le repiquage de chaque type de colonies est répété plusieurs fois jusqu’à l’obtention d’une
souche pure.
II-4. Conservation
La conservation des souches pures se fait sur gélose pente .Chaque souche pure est ensemencée
en strie serrée partant du fond vers le haut d’un tube vissé prémuni de la gélose au cétrimide
coulé en pente. La culture est incubée durant 24 heures à 30°C avant d’être conservée au
réfrigérateur à 4°C pendant 3 mois.
II-5. Identification
L’identification microbienne doit toujours être menée sur des souches pures. Elle aboutit à la
détermination du genre et de l’espèce auxquels appartient chaque souche microbienne.
L’identification des souches bactériennes se base sur les caractères morphologiques, culturaux,
physiologiques et biochimiques.
II-5.1 Etude des caractères morphologiques et culturaux
Dans cette étude, pour chaque souche bactérienne pure, un examen macroscopique des colonies
constitutives est effectué, puis un examen microscopique des cellules formant ces colonies.
II-5.1.1 Examen macroscopique
Chaque souche pure est observée à l’œil nu afin de déterminer leurs caractères culturaux
notamment : la taille, la forme, l’aspect de la surface, la coloration, la consistance et l’opacité.
La fluorescence est aussi observée à la lumière ultra-violette à une longueur d’onde de 310nm.
Matériels et méthodes
18
II-5.1.2 Examen microscopique
Un échantillon de chaque souche pure est observé sous microscope. L’observation est réalisée
à l’état frais et après coloration Gram.
II-5.1.3 Observation à l’état frais
a. Principe
L’examen à l’état frais est une observation pour déterminer les caractéristiques des cellules
vivantes : sa morphologie, son mode de regroupement et sa mobilité.
b. Mode opératoire
Une ansée de la souche microbienne est mélangée avec une goutte d’eau distillée préalablement
déposée sur une lame stérile et dégraissée. L’ensemble est ensuite recouvert d’une lamelle
stérile en évitant de faire des bulles d’air. L’observation s’effectue au fort grossissement
(objectif x100) afin de déterminer la morphologie, le mode de regroupement et la mobilité des
cellules.
II-5.1.4 Observation après coloration Gram
a. But
La coloration de Gram permet non seulement de confirmer la forme et le mode de groupement
des cellules mais aussi de déterminer le type de la bactérie selon la structure de sa paroi.
b. Principe
La coloration est basée surtout sur la capacité des bactéries à retenir la coloration du violet de
gentiane. Les bactéries Gram + résistent à la décoloration par l’alcool et retiennent donc leur
coloration violette. Par contre, les bactéries à Gram – laissent pénétrer l’alcool qui va lessiver
le complexe violet de gentiane-lugol. Elles sont ensuite colorées en rose après coloration à la
fuschine de Ziehl.
c. Mode opératoire
La méthode commence tout d’abord par la préparation d’un frottis. Pour se faire, un
prélèvement issu d’une suspension de la souche bactérienne à étudier est étalé en couche mince
sur une lame. Après séchage à l’air libre et fixation par flambage, le frottis ainsi préparé est
coloré par une solution de violet de Gentiane pendant une minute puis rincé avec de l’eau du
robinet. Pendant une minute, le frottis est ensuite recouverte par du Lugol qui va servir de
Matériels et méthodes
19
mordant. Par la suite, pour la différenciation des germes, le frottis est décoloré par de l’alcool
à 70° puis rincer avec de l’eau du robinet. Le frottis est ensuite recoloré avec du fuschine de
Ziehl 10 % pendant une minute. Enfin, le frottis est lavé avec de l’eau du robinet et séché avec
du papier joseph avant d’être observé sous microscope à l’objectif x100 dans de l’huile
d’immerssion. Suivant leur coloration, les bactéries sont classées en :
- Bactérie à Gram + : de coloration violette
- Bactérie à Gram - : de coloration rose
II-5.2 Etude des caractères physiologiques
II-5.2.1 Détermination du type respiratoire
a. Principe
Ce test consiste à étudier le comportement de la bactérie vis-à-vis de l’oxygène de l’air. Selon
leur condition de croissance, les bactéries sont classées parmi les suivantes :
- Anaérobies strictes : qui ne croissent qu’en l’absence d’oxygène.
- Aérobies strictes : qui exigent de l’oxygène pour son développement.
- Aéro-anaérobies facultatives : qui croissent aussi bien en présence qu’en absence
d’oxygène, mais préférant l’aérobiose.
- Anaéro-aérobies facultatives : qui croissent aussi bien en présence qu’en absence
d’oxygène, mais préférant l’anaérobiose.
- Microaérophiles : les bactéries qui ont besoin d’une faible quantité d’oxygène pour se
développer.
b. Mode opératoire
Le milieu de culture utilisé pour déterminer le mode respiratoire des bactéries est le Plate Count
Agar (PCA).
Le milieu de culture préalablement préparé est coulé dans des tubes vissés, puis refroidi.
L’ensemencement se fait en profondeur par une seule piqûre centrale. Après 24 heures
d’incubation à 30°C, cinq cas peuvent se présenter :
- Développement en profondeur des bactéries caractérisé par une turbidité dans la partie
inférieure de la ligne d’ensemencement : il s’agit de bactéries anaérobies strictes.
- Prolifération des bactéries dans la zone superficielle du milieu de culture : ces bactéries
sont classées parmi les aérobies strictes.
Matériels et méthodes
20
- Développement sur toute la ligne d’ensemencement avec une abondance près de la zone
superficielle : ce sont les bactéries aéro-anaérobies facultatives.
- Croissance des bactéries sur toute la hauteur du milieu de culture avec une abondance
dans la zone plus profonde : il s’agit de bactéries anaéro-aérobies facultatives.
- Développement dans la zone intermédiaire anaérobie-aérobie : ce sont des bactéries
microaérophiles.
II-5.2.2 Recherche de l’oxydase
Le test consiste à mettre en évidence la capacité que possède la bactérie à oxyder un réactif
incolore (la N-diméthyl-paraphénylène diamine) en un dérivé violet brunâtre. Ce test est réalisé
en déposant sur une lame un petit disque de papier Whattman n°1 imprégné du réactif. Une
ansé de la souche à étudier est ensuite déposée sur le disque, une coloration violet brunâtre
apparait immédiatement si la bactérie en question possède de l’oxydase dans son système
enzymatique. Dans le cas contraire, le disque reste incolore, la bactérie ne possède donc pas de
l’oxydase (Public Health England, 2015).
II-5.3 Etude des caractères biochimiques
L’étude des caractères biochimiques consiste à déterminer le métabolisme des bactéries.
L’étude est réalisée sur des galeries biochimiques comme : le milieu Hajna-kligler, le milieu
Citrate de Simmons, le milieu Mannitol-Mobilité-Nitrate, le milieu Lysine-fer.
II-5.3.1 Test sur milieu HAJNA-KLIGLER
a. Principe
Le test sur HAJNA-KLIGLER consiste à détecter la fermentation du glucose et/ou du lactose
par la bactérie. Le milieu est de couleur rouge et est composé de deux parties : le culot formé
par le glucose et la pente par du lactose. La fermentation du glucose et du lactose provoque
l’alcalinisation du milieu qui se traduit par un virage au jaune. Si la bactérie fermente le glucose,
le culot vire au jaune. Tandis que la fermentation du lactose vire la pente au jaune. Le virage de
couleur est indiqué par un indicateur de pH qui est le rouge de phénol. Durant la fermentation,
la bactérie produit du gaz qui se traduit par l’apparition de bulles ou de poche de gaz dans le
milieu.
Par ailleurs, la présence du thiosulfate réductase dans le système enzymatique de la bactérie
est justifiée par la formation d’un précipité noir dans le milieu, ce précipité noir étant du sulfure
d’hydrogène (H2S).
Matériels et méthodes
21
b. Mode opératoire
Après coulage du milieu, l’ensemencement se fait par une piqûre centrale dans le culot suivie
d’une striation suivant la pente. L’incubation se fait à 30°C pendant 24 heures.
II-5.3.2 Test sur milieu CITRATE DE SIMMONS
a. Principe
Ce test est utilisé pour déterminer si la bactérie est capable d’utiliser le citrate comme seul
source de carbone provocant ainsi l’alcalinisation du milieu. Le milieu étant de couleur verte
vire donc au bleu, cela est dû à un indicateur de pH qui est le bleu de Bromothymol.
b. Mode opératoire
L’ensemencement se fait par une strie centrale à 1 cm du fond vers l’ouverture. La lecture est
réalisée après 24 heures d’incubation à 30°C.
II-5.3.3 Test sur milieu MANNITOL-MOBILITE-NITRATE
a. Principe
Ce test consiste tout d’abord à déterminer la fermentation du mannitol par la bactérie : si la
réaction s’avère positive, le milieu de culture étant de couleur rouge vire au jaune. Ce virage de
couleur est marqué par un indicateur de pH qui est le rouge de phénol.
La mobilité des bactéries est observée par la turbidité du milieu, les germes non mobiles restent
sur la ligne d’ensemencement.
La réduction du nitrate par le nitrate réductase est mise en évidence par la présence de nitrites
formés qui donne une coloration rose en présence du réactif de GRIESS.
b. Mode opératoire
Après coulage du milieu de culture, l’ensemencement se fait par une piqûre centrale s’arrêtant
à 1 cm du fond du tube. L’incubation se fait pendant 24 heures à 30 °C. La turbidité du milieu
et le virage de la coloration du milieu sont observés en premier. La détermination de la réduction
du nitrate s’en suit par un ajout de quelques gouttes de réactif de GREISS.
II-5.3.4 Test sur milieu LYSINE-FER
a. Principe
Le test sur LYSINE-FER consiste à détecter la présence de la lysine décarboxylase (LDC), la
lysine désaminase (LDA) et le thiosulfate réductase. Ce test permet aussi de déterminer si la
Matériels et méthodes
22
bactérie utilise le glucose comme source de carbone. La présence de la lysine décarboxylase est
marquée par une coloration violette du milieu et une pente de couleur rouge veineux indique la
présence de la lysine désaminase. Le noircissement du culot affirme la présence du thiosulfate
réductase.
b. Mode opératoire
L’ensemencement se fait par une piqûre centrale dans le culot suivie par des stries serrées
suivant la pente. L’incubation se fait toujours à 30°C pendant 24 heures. Le germe est glucose
positif si le milieu de coloration violette vire au jaune. Le noircissement du milieu est issu de
la production de sulfure d’hydrogène.
II-5.3.5 Auxanogramme du carbone
a. Principe
L’identification des souches de levure par la méthode d’auxanogramme se fait par la
vérification de la différence de métabolisme des sucres simples. Le milieu de culture utilisé
comporte l’eau distillée stérile additionnée d’un sucre précis. Les sucres utilisés sont le
tréhalose, le saccharose et le xylose (Latour et al., 1997).
b. Mode opératoire
Après coulage du milieu liquide, la souche à identifier est ensemencée à l’aide d’une anse
chargée d’inoculum. La préparation est incubée à 30°C pendant 48 à 72h avant de vérifier le
pH de chaque souche pure de Pseudomonas avec le pH-mètre. L’utilisation du sucre dans le
milieu par la souche entraîne une acidification du milieu vérifiée par la diminution du pH du
milieu.
II-5.3.6 Test à la gélatine
a. Principe
Ce test consiste à déterminer la présence de la gélatinase dans le système enzymatique de la
bactérie. Sous l’action de cette enzyme, la gélatine est hydrolysée et se liquéfie. Le milieu de
culture utilisé est composé de gélose nutritive et de gélatine d’origine bovine à 5% (Nelson,
2002).
b. Mode opératoire
Le milieu de culture est coulé dans des tubes puis refroidi dans un endroit plus froid de la
paillasse. L’ensemencement se fait par une piqûre centrale, les tubes sont ensuite incubés à
Matériels et méthodes
23
30°C pendant 48 heures. Après incubation, les tubes sont placés à 4°C avant la lecture des
résultats. En effet, la réfrigération (+4°C) permet d’avoir la consistance solide de la gélatine
(absence de gélatinase). Dans le cas contraire (présence de gélatinase) la gélatine perd sa
structure et reste liquide à 4°C.
III. Essai de traitement biologique
L’essai biologique consiste à utiliser une souche bactérienne pour dépolluer un sol contaminé
aux hydrocarbures. L’expérimentation s’étale sur 3 mois avec des analyses microbiologiques
et physico-chimiques qui s’effectuent toutes les 3 semaines.
III-1. Mise en place du dispositif expérimental
a. Principe
Cette expérience consiste à favoriser la capacité des bactéries à dégrader les hydrocarbures
présents dans le sol. Tous les paramètres favorisant cette activité bactérienne sont donc
rapportés dans le dispositif expérimental. La bactérie utilisée est préalablement mise en culture
afin d’augmenter le nombre de biomasse. En occurrence, la méthode utilisée durant cette
expérience est l’association entre la bio-stimulation et la bio-augmentation, une méthode qui
s’avère être efficace selon El Fantroussi et Agathos en 2005.
b. Mode opératoire
L’essai biologique est réalisé dans un bac en verre étanche de 15 cm de hauteur, de 30 cm de
longueur et de 10 cm de largeur recouvert d’un papier en aluminium perforé. Le verre est utilisé
pour éviter l’interaction avec le milieu extérieur et aussi pour faciliter la maîtrise des différents
paramètres. Le papier en aluminium perforé servira par contre de couvercle pour le dispositif
tout en assurant l’apport en oxygène dans le milieu. Le bac est préalablement stérilisé à 121°C
à 1,5 bar pendant 20 mn avant la réalisation de l’essai biologique.
La mise en place du dispositif expérimental se déroule en 3 étapes :
III-1.1 La préculture
Pseudomonas putida est ensemencé dans un milieu de culture liquide. Trois ansées de la souche
bactérienne sont ensemencées dans 100ml de bouillon nutritif. La préparation est incubée à
30°C pendant 24 heures. Cette préculture permet non seulement de revivifier les bactéries mais
aussi de faciliter son inoculation dans le sol.
Matériels et méthodes
24
III-1.2 La préparation du sol
La masse du sol utilisée est de 500g (poids sec). Afin qu’il n’y ait pas de compétition entre les
microorganismes déjà présents dans le sol et les bactéries à inoculer, le sol est tout d’abord
autoclavé à 121°C à 1.5 bars pendant 2 heures. Après autoclavage, le sol est séché dans une
étuve à 103°C pendant 24 h puis placé dans un dessiccateur jusqu’à refroidissement. Ce
traitement vise à réduire de façon significative la teneur en eau (humidité du sol qui doit être
comprise entre 20% à 27% de matière fraîche). Le polluant organique utilisé étant l’huile de
vidange, 9 g de cette huile sont versés dans le sol puis mélangés de façon à ce que la répartition
soit bien homogène. 2 g de levure de bière sont autoclavés puis broyés et ensuite mélangés dans
le sol, ce qui constitue la source d’azote. Enfin, pour aérer le sol et éviter qu’il s’entasse, 150 g
de sciure de bois de Pinus (représentant 30% du poids du sol) sont mélangés à l’ensemble
(RAJAONA, 2015).
III-1.3 L’inoculation
Après avoir préparé le sol, 100ml de préculture sont inoculés dans le sol préalablement préparé.
La concentration de l’inoculum doit être comprise entre 2.106 UFC/g à 2.108 UFC/g, ce qui
correspond à la concentration bactérienne de la rhizosphère. Après l’inoculation, 20 ml d’eau
distillée sont versées hebdomadairement dans le sol (Bidaud, 1998).
Le dispositif expérimental ainsi obtenu est placé à l’abri de la lumière à la température ambiante
à 23°C. Le sol est remué hebdomadairement afin d’assurer le contact du substrat avec la
biomasse ainsi que l’apport en oxygène dans le sol.
III-2. Méthodes analytiques
III-2.1 Dosages des hydrocarbures résiduels dans le sol
Extraction au Soxhlet: Méthode EPA (Environmental Protection Agency) 3540C
a. Principe
Cette étape consiste à utiliser du solvant (hexane) pour extraire l’hydrocarbure présent dans le
sol. L’extrait obtenu est ensuite concentré puis pesé, la valeur obtenue indique ainsi la masse
d’hydrocarbure résiduel présent dans l’échantillon de sol analysé.
Quelle que soit la procédure employée, l’analyse des hydrocarbures dans le sol comprend trois
étapes incontournables :
Matériels et méthodes
25
- La préparation de l'échantillon de sol qui consiste à sécher le sol à l’étuve
- L’extraction des hydrocarbures contenus dans l’échantillon, dont l’objectif est de
transférer les composés de la matrice solide vers la matrice liquide qui est le solvant.
- Le dosage de l’extrait obtenu
b. Mode opératoire
L’échantillonnage du sol à analyser suit la méthode des quartiers. 10g de sol sont alors prélevés
puis séchés dans une étuve à 103°C pendant 24 heures ; à la sortie de l’étuve, le sol est placé
dans un dessiccateur jusqu’à refroidissement. Après la préparation du sol s’enchaine
l’extraction de l’hydrocarbure.
L’extraction à reflux s’effectue dans un Soxhlet en utilisant de l’hexane comme solvant. Pour
ce faire, 5 g de sol préalablement séché sont placés dans une cartouche d’extraction puis
immergés avec 150 ml d’hexane. L’extraction dure 16 heures et le produit d’évaporation est
recueilli dans un ballon de 250 ml contenant des pierres ponce. Le ballon est ensuite placé dans
un rotavapor pour évaporer l’hexane. Les résidus de solvant et d’eau présents dans le ballon
sont enlevés par un étuvage à 103°C pendant 15 min, suivi d’un refroidissement dans un
dessiccateur. Le ballon est pesé afin d’en déduire la quantité d’hydrocarbure extrait.
La formule suivante permet d’avoir la concentration en hydrocarbure résiduel ( Hcr) :
Hcr = 𝑚1−𝑚2
𝑚3 (g/g)
m1 : masse du ballon et l’extrait (g)
m2 : masse du ballon vide (g)
m3 : masse de l’échantillon de sol (g)
Taux de dégradation (T)
Le taux de dégradation correspond à la quantité d’hydrocarbure dégradée par rapport à la
quantité d’hydrocarbure initiale. Il est donné par la formule suivante :
T = [𝐻𝑐𝑖]−[𝐻𝑐𝑓]
[𝐻𝑐𝑖] x100 (%)
[Hci] : concentration en hydrocarbure initiale (g/g)
[Hcf] : concentration en hydrocarbure finale (g/g)
Matériels et méthodes
26
III-2.2 Suivi de l’évolution de la population bactérienne
L’accroissement de la quantité de biomasse est évaluée durant toute l’expérience afin d’en
déduire sa vitesse de croissance.
III-2.2.1 Préparation de la suspension mère
Pour préparer la suspension mère, 10g d’échantillon de sol à analyser sont mélangés avec une
solution d’EPT jusqu’à un volume final de 100 ml. L’ensemble est ensuite mélangé.
III-2.2.2 Dilutions
Une dilution en cascade est effectuée à partir de la suspension mère. 1 ml de la suspension mère
est introduit dans un tube stérile, puis additionné de 9 ml d'eau distillée, il s’agit de la dilution
10-1. 1ml de ce mélange est ensuite versé dans un autre tube contenant 9 ml de diluant : cette
solution correspond à la dilution 10-2 et ainsi de suite jusqu'à la dilution finale.
III-2.2.3 Culture bactérienne
Le milieu de culture utilisé est la gélose au cétrimide. Après avoir coulé le milieu de culture
dans des boîtes de Pétri, 1ml de chaque dilution est ensemencé dans chacune des boîtes.
L’incubation se fait pendant 24 h à 30°C. Après incubation, les colonies formées sont comptées.
III-2.2.4 Mode de calcul pour le cas du dénombrement bactérien (norme ISO 7218)
Le nombre total des colonies présentes dans l’unité d’échantillonnage est donné par la formule
suivante :
∑ c 1 VSM
N = ——————— x — x ——
(n1 + 0,1 n2) x d V VPR
Légende :
∑ c= nombre total de colonies sur les boites retenues.
n1= nombre de boites retenues à la dilution la plus faible.
n2= nombre de boites utilisées à la seconde dilution retenues.
d= facteur de dilution à partir duquel les premiers comptages sont réalisés.
Matériels et méthodes
27
V = volume de prise d'essai inoculé en ml.
VSM = volume en ml de la suspension mère.
VPR = volume de produit (ml) ou masse du produit (g) ou surface du produit (cm2) ayant
constitué la suspension mère.
III-2.3 Traitement des résultats en régime discontinu
III-2.3.1 Vitesse de dégradation du substrat Rs
Rs correspond à la quantité d’hydrocarbure dégradé par la biomasse en unité de temps.
Pour un système en batch, elle est donnée par la formule suivante :
dS : variation de la concentration en substrat (g/g)
dt : variation de temps en jour (j)
III-2.3.2 Vitesse spécifique de dégradation du substrat QS
Qs correspond à la vitesse de dégradation du substrat par unité de biomasse. Partant de
l’équation de Rs, Qs s’exprime comme suit :
Qs = 1
𝑋𝑅𝑠
Qs = 1
𝑋
|𝑑𝑠|
𝑑𝑡
X : concentration en biomasse (UFC/g)
ds : concentration en substrat (g/g)
dt : variation de temps en jour (j)
III-2.3.3 Vitesse de production de biomasse RX
Rx correspond à la quantité de biomasse formée par unité de temps. Elle s’exprime comme
suit :
Rs= |𝑑𝑆|
𝑑𝑡 (g/g/j)
Matériels et méthodes
28
Rx = 𝑑𝑋
𝑑𝑡 (UFC/g/j)
dx : variation de la concentration en biomasse (UFC/g)
dt : variation du temps en jour (j)
III-2.3.4 Vitesse spécifique de croissance µx
Elle correspond à la vitesse de production de biomasse rapportée à l'unité de biomasse.
µx = 𝑅𝑥
𝑥 (h-1)
Taux de croissance
Le taux de croissance correspond à la vitesse de croissance maximale µmax.
III-2.3.5 Temps de génération G
C’est le temps de doublement de la population bactérienne :
G = 𝑙𝑛2
µ𝑚𝑎𝑥 (h)
µmax : vitesse de croissance maximale (h-1)
µx = 1
𝑋
𝑑𝑋
𝑑𝑡 (h-1)
RESULTATS ET
INTERPRETATIONS
Résultats et interprétations
29
1. Isolement
La culture de la suspension mère sur gélose au cétrimide à partir de l’échantillon de sol, a permis
d’obtenir 6 types de colonie différents. La figure 5 affiche les colonies obtenues issues de
l’échantillon de sol n°1.
Figure 5 : Colonies obtenues sur gélose au cétrimide après incubation
2. Purification et conservation
Après l’isolement des six types de souches, celles-ci sont purifiées puis conservées. Chaque
souche pure est codée comme suit : M-SO suivie du numéro de souche correspondante. M et
SO représentent respectivement l’initial du nom du manipulateur et celui de l’échantillon
étudié.
3. Identification des souches
3.1 Caractères culturaux
Après observation macroscopique, les caractères culturaux des souches bactériennes sont
résumés dans le tableau 2.
Résultats et interprétations
30
Tableau 2 : Caractères culturaux des souches bactériennes isolées
M : initial de l’auteur SO : sol Chiffre : numéro de l’échantillon Source : auteur, 2017
D’après ces résultats, 66% des souches ont une similarité entre elles. Notamment les
souches M-SO5 et M-SO2 possèdent les mêmes caractères culturaux et il en est de même pour
les souches M-SO1 et M-SO6. Selon l’aspect de la surface, seule la souche M-SO4 présente
une surface rugueuse et elle est la seule à avoir une petite taille. La souche M-SO3 possède des
points communs avec la souche M-SO2 à l’exception de sa consistance qui est crémeuse et son
contour irrégulier.
3.2 Caractères morphologiques
L’examen à l’état frais a permis d’observer sous microscope les cellules constitutives
des 6 souches pures isolées. Cette observation s’est basée sur la forme de la cellule, le mode de
regroupement et la mobilité. La coloration Gram par contre a permis de déterminer la nature de
la paroi des cellules .Le tableau 3 résume les caractères morphologiques et les résultats de la
coloration Gram des souches isolées.
Caractères M-SO1 M-SO2 M-SO3 M-SO4 M-SO5 M-SO6
Taille Grande Grande Grande Petite Grande Grande
Couleur Bleu-vert Vert
fluorescent
Vert
fluorescent Blanche
Vert
fluorescent Bleu-vert
Odeur florale Inodore Inodore Inodore Inodore florale
Aspect de
la surface Lisse Lisse Lisse Rugueuse Lisse Lisse
Aspect du
contour Régulier Régulier Irrégulier Régulier Régulier Régulier
Forme du
relief Bombée
Semi-
bombée
Semi-
bombée Plate
Semi-
bombée Bombée
Opacité Translucide Translucide Translucide Transparente Translucide Translucide
Consistance Pâteuse Pâteuse Crémeuse Crémeuse Pâteuse Pâteuse
Résultats et interprétations
31
Tableau 3 : Caractères morphologiques des souches bactériennes isolées
Souches Forme de
la cellule
Mode de
regroupement Mobilité
Mode de
déplacement Gram
M-SO1 Bacille Chaînette Mobile Frétillement Négatif
M-SO2 Bacille Amas Mobile Frétillement Négatif
M-SO3 Bacille Amas Mobile Frétillement Négatif
M-SO4 Bacille isolé Immobile Négatif
M-SO5 Bacille Amas Mobile Frétillement Négatif
M-SO6 Bacille Chaînette Mobile Frétillement Négatif
Référence Bacille Amas Mobile Frétillement Négatif
Source : auteur, 2017
D’après ces résultats, les colonies des 6 souches pures bactériennes présentent des
similarités mais aussi des différences dont :
Le mode de regroupement : 2 souches sont regroupées en chaînette, 3 souches en amas
et seule la souche M-SO4 à un regroupement isolé.
La mobilité : toutes les souches sont mobiles mise à part la souche M-SO4.
La coloration Gram : toutes les souches bactériennes sont à Gram négatif.
3.3 Caractères physiologiques
L’étude des caractères physiologiques font partie des paramètres fondamentaux pour
identifier les souches bactériennes. Cette étude consiste à déterminer le type respiratoire et les
enzymes impliquées dans la respiration de la souche. Le tableau 4 résume les caractères
physiologiques de toutes les souches isolées.
Tableau 4 : Caractères physiologiques des souches bactériennes isolées
Souches Oxydase Type respiratoire
M-SO1 Positive Aérobie stricte
M-SO2 Positive Aérobie stricte
M-SO3 Positive Aérobie stricte
Résultats et interprétations
32
Souches Oxydase Type respiratoire
M-SO4 Positive Aéro-anaérobie facultative
M-SO5 Positive Aérobie stricte
M-SO6 Positive Aérobie stricte
Référence Positive Aérobie stricte
Source : auteur, 2017
Ces résultats montrent que toutes les souches isolées possèdent de l’oxydase, ce qui va
intervenir dans les différents processus du métabolisme bactérien. Du point de vue respiratoire,
5 souches sont aérobies strictes et une seule souche (M-SO4) est aéro-anaérobie facultative.
3.4 Caractères biochimiques
Après l’étude des caractères macroscopiques, microscopiques et physiologiques s’ensuivent les
caractères biochimiques. Cette dernière étape permet de confirmer l’identité de la souche.
Plusieurs tests sont alors réalisés sur la souche afin de déterminer les voies métaboliques .Le
tableau 5 résume les caractères biochimiques de toutes les souches bactériennes isolées.
Tableau 5 : Caractères biochimiques des souches bactériennes isolées
Sou
ches
HAJNA-
KLIGLER
MANNITOL
-MOBILITE
LYSINE-
FER
CIT
RA
TE
DE
MM
ON
S
TE
ST
A L
A G
EL
AT
INE
AUXANOGRAMME
Glu
Lac
H2S
CO
2
MA
NN
ITO
L
MO
BIL
ITE
LD
C
LD
A
SA
CC
HA
RO
SE
XY
LO
SE
TR
EH
AL
OS
E
M-SO1 - - - - + + - + + + + + -
M-SO2 - - - - - + - + + - + - +
M-SO3 - - - - - + - + + + + + +
M-SO4 - - - + - - - + + + + + -
M-SO5 - - - - - + - + + - + - +
M-SO6 - - - - + + - + + + + + -
Référence - - - - - + - + + + + + +
LDC : Lysine DéCarboxylase LDA : Lysine DésAminase Source : auteur, 2017
Résultats et interprétations
33
D’après le tableau 5 :
La culture des souches bactériennes sur milieu Hajna-Kligler permet de dire que : toutes
les souches ne sont pas capables de fermenter ni le glucose ni le lactose.
La culture des souches sur le milieu Mannitol a permis de déterminer que les souches
sont capables d’utiliser le mannitol comme source de carbone. Cela a permis aussi de
confirmer que toutes les souches mise à part M-SO4 sont des souches mobiles.
Les résultats sur le milieu Lysine fer a montré que toutes les souches ne possèdent pas
de lysine décarboxylase (LDC). Par contre la lysine désaminase (LDA) est produite par
toutes les souches isolées.
Pour la culture sur Citrate de Simmons, toutes les souches utilisent le citrate comme
source de carbone.
3.5 Classification des souches
Le rapport des résultats de l’étude des caractères culturaux, morphologiques,
physiologiques et biochimiques aboutit à l’identification des 6 souches pures bactériennes
isolées. Le tableau 6 donne l’identité respective des souches bactériennes.
Tableau 6 : Identité des souches pures bactériennes isolées
SOUCHES NOM DE LA SOUCHE
M-SO1
Pseudomonas aeruginosa M-SO6
M-SO2 Pseudomonas putida
M-SO5
M-SO4 Pseudomonas fluorescens
M-SO3 Pseudomonas chlororaphis
Source : Ben et al., 1999
4. Essai biologique
La souche M-SO2, identifiée comme Pseudomonas putida a fait l’objet de l’expérimentation et
l’huile de vidange constitue la source d’hydrocarbure.
4.1 Teneurs en hydrocarbures résiduels
L’extraction au Soxhlet a permis de déterminer la quantité en hydrocarbure totale dans le sol et
d’en déduire ainsi la concentration en hydrocarbure résiduel après inoculation de la souche M-
Résultats et interprétations
34
SO2. Le tableau 7 affiche la variation de la concentration en hydrocarbure résiduel durant les 3
mois d’expérimentation.
Tableau 7 : Variation de la concentration en hydrocarbures résiduels
Jours de
prélèvement 1 21 42 63 84
Concentrations
en
hydrocarbure
(mg/kg)
18000 17000 14000 9800 4500
Source : auteur, 2017
Cette concentration varie de 18000mg/kg à 4500mg/kg, ces valeurs montrent que la
bioremédiation a bien eu lieu.
La figure 6 montre l’évolution du taux de dégradation de l’hydrocarbure par
Pseudomonas putida. L’efficacité de la bioremédiation au cours de notre étude est confirmée
par l’augmentation du pourcentage de dégradation de 0% à 30% en fin de culture.
Source : auteur, 2017
Figure 6 : Evolution du taux de dégradation durant l’expérimentation
Le taux de dégradation est faible durant les premières semaines (0 à 20 jours) car une période
d’adaptation au milieu de culture est indispensable avant la croissance. C’est seulement à partir
du 21ème jour que la dégradation devient très importante. Elle ralentie par contre à partir du
63ème jour, la variation du pH ou l’épuisement de la source d’azote pourrait être la cause.
Résultats et interprétations
35
4.2 Evolution de la population bactérienne
L’augmentation de la population bactérienne signifie une consommation du substrat qui
est l’hydrocarbure. La figure 7 démontre la proportionnalité de la croissance bactérienne par
rapport à la dégradation de l’hydrocarbure.
Source : auteur, 2017
Figure 7 : Evolution de la concentration en biomasse en fonction de la concentration en
hydrocarbure lors de la culture sur un sol pollué de Pseudomonas putida
Les premières semaines correspondent à la phase d’accélération durant laquelle une
partie de la masse microbienne se multiplie. Par la suite, la concentration en biomasse augmente
considérablement, c’est la phase exponentielle. La population bactérienne est passée de 4.107
UFC/g à 3.1013 UFC/g avec un temps de génération de 2,16h.
4.3 Traitement des résultats obtenus
L’évolution de la concentration en hydrocarbure et en biomasse permet d’en déduire la
vitesse de consommation du substrat et la vitesse de production de biomasse.
Le tableau n°8 et la figure n°8 représentent les vitesses spécifiques correspondant à la formation
de biomasse et à la dégradation du substrat.
Résultats et interprétations
36
Tableau 8 : Vitesses spécifiques correspondant à la formation de biomasse et à la
dégradation du substrat
Temps (jours) Biomasse Substrat (hydrocarbure)
RX (UFC/g/j) µX (h-1) RS (g/g/j) QS (g/UFC/j)
21 5.106 2,2.10-3 4,76.10-5 1,19.10-12
42 1,64.108 0,048 1,42.10-4 1,02.10-12
63 8,73.109 0,101 2.10-4 5,55.10-14
84 1,45.1012 0,323 2,52.10-4 1,34.10-15
Source : auteur, 2017
Source : auteur, 2017
Figure 8 : Courbes des vitesses spécifiques correspondant à la biomasse μ, au substrat QS lors
de la culture en batch de Pseudomonas putida sur sol pollué par l’huile de vidange
D’après cette courbe, la vitesse de dégradation du substrat augmente
proportionnellement avec la vitesse de production de biomasse. Ce qui signifie que pendant les
premiers jours d’expérimentation, la capacité de dégradation des bactéries n’est pas
satisfaisante puisque la quantité de biomasse est encore très faible. Cependant,
l’expérimentation s’avère être effective durant sa phase exponentielle puisque la bactérie est
capable de dégrader jusqu’à 2,52.10-4 g d’hydrocarbure par g de sol par jour.
DISCUSSIONS
Discussions
37
Discussions
Les résultats de l’isolement et de l’identification bactérienne ont permis de déduire
la présence de 4 espèces de Pseudomonas dans la zone rhizosphérique de Pinus radiata, à
savoir : Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas chlororaphis
et Peudomonas putida, cette dernière a fait l’objet de cette étude. L’identification
bactérienne s’est basée surtout sur les caractères culturaux et biochimiques de la souche. En
effet, la souche Pseudomonas putida se différencie des autres souches par sa capacité à
produire des pigments verts fluorescents dans un milieu gélosé. Concernant les caractères
biochimiques, la souche en question est la seule qui ne liquéfie pas la gélatine.
A travers ces résultats, la souche étudiée présente une similarité avec celle qui a été
isolée par Sutter en 1968, ce qui permettrait de confirmer l’identité de la souche. Cependant,
l’identification de la souche ne se limite pas à l’étude des caractères biochimiques et
culturaux, mais une identification moléculaire de la souche est indispensable vue la
multiplicité du nombre de biovar que possède l’espèce bactérienne (Lemanceau et al.,
2000).
Pour nos expérimentations, la souche Pseudomonas putida a été choisie en raison de sa
capacité à dégrader un large panel de composé carboné y compris les composés à forte
potentialité toxique. Selon Ferro et ses collaborateurs en 2005, la souche forme un biofilm
pour résister aux conditions environnementales les plus hostiles.
Leahy et Cowell (1991) ont démontré que les microorganismes sont les principaux
acteurs dans la dégradation des hydrocarbures pétroliers dans les écosystèmes contaminés.
Les bactéries sont capables d’utiliser le pétrole brut comme seule source de carbone et
d'énergie dans les sols contaminés (Jirasripongpun, 2002).
Nombreux sont les espèces de Pseudomonas qui sont capables de bioremédier les sols
pollués (Annexe 5). D’après les recherches effectuées par Rahman et ses collaborateurs en
2002, la présence d’une activité bioremédiatrice chez Pseudomonas putida dans un sol
pollué par les hydrocarbures a été notée. Cette observation est en accord avec celle de
Soltani en 2004, qui explique les différentes voies métaboliques de dégradation des
hydrocarbures pour fournir à la souche de l’énergie et du carbone.
Discussions
38
En ce qui concerne l’expérimentation menée sur cette souche, la bioremédiation
s’avère être efficace. Toutefois, durant les premières semaines d’expérimentation, le taux
de dégradation n’a pas été considérable (5,5%) vue que la souche a dû s’adapter à son nouvel
environnement et substrat. Il serait donc préférable d’effectuer une préculture dans un
milieu contenant de l’hydrocarbure avant l’inoculation.
C’est à partir du deuxième mois que l’activité microbienne se montre satisfaisante, la
concentration en hydrocarbure est passée de 18000 à 4500 mg/kg. D’après ces valeurs, la
souche est donc capable de dégrader jusqu’à 0,25 mg d’hydrocarbure par jour, ce qui n’est
vraiment pas négligeable comparé aux résultats obtenus par Bidaud en 1998 avec 0,3 mg
d’hydrocarbure par jour. Cette vitesse de dégradation est proportionnelle à la quantité de
biomasse présente dans le sol, cette valeur augmente donc avec l’accroissement de la
population bactérienne d’après les résultats obtenus. La seul contrainte est que les
hydrocarbures pétroliers contribuent à limiter la capacité productive des souches
bactériennes (Wyszkowskwa et al., 1987).
Les travaux effectués par Leahy et Cowell (1994) sur Pseudomonas putida, ont affiché
un taux de dégradation allant jusqu’à 85,8% en 1 mois. Pour ce qui est de notre cas, le taux
de dégradation n’a atteint que les 30% en 3 mois et la concentration en hydrocarbure vers
la fin de l’expérimentation est encore au-dessus de la valeur seuil qui est de 100 mg/kg de
matière sèche selon la norme américaine de l’EPA. Cette valeur seuil varie d’un pays à un
autre et en fonction de la nature chimique de l’hydrocarbure (annexe 3). Ce taux semble
être causé non seulement par l’adaptation de la souche à son nouveau substrat mais aussi à
la complexité de la composition chimique et le poids moléculaire élevé de l’huile moteur.
Selon Catilina et ses collaborateurs en 2002, les huiles moteurs sont des composés visqueux,
non volatiles contenant des alcanes aliphatiques et des hydrocarbures aromatiques à un ou
plusieurs cycles qui sont difficilement dégradés par les bactéries.
Selon Ghazali et ses collaborateurs, en 2004, le taux de dégradation est plus satisfaisant
avec l’utilisation d’un consortium parce que chaque microorganisme possède différentes
enzymes catabolisantes. L’association de Pseudomonas putida et Pseudomonas fluorescens
semble être plus efficace que le traitement par Pseudomonas putida seul (Ferro et al., 2005).
La combinaison de la phytoremédiation avec la bioremédiation a aussi montré son
efficacité, cependant, cette combinaison peut s’avérer être une méthode très lente (Ghazali
et al., 2004).
Discussions
39
D’autres facteurs affectent aussi la dégradation des hydrocarbures, à savoir l’humidité
du sol et l’apport en oxygène par l’intermédiaire d’un ajout de texturant (Rahman et al.,
2002). D’après les résultats obtenus par Bidaud en 1998, l’ajout de sciure de bois dans le
sol favorise l’apport en oxygène faisant office d’accepteur d’électron durant les réactions
métaboliques. La température et l’humidité jouent également un rôle dans la croissance des
microorganismes, dans les traitements in-situ, la bioremédiation semble être plus lente
durant les saisons froides (Thwaites et al., 2007).
Les sols contaminés sont généralement pauvres en éléments nutritifs dus à la diminution
considérable du nombre de bactéries fertilisant le sol. L’apport en élément azoté est donc
requis pour assurer non seulement la croissance des bactéries mais peut aussi servir
d’accepteur d’électron durant les réactions cataboliques.
L’usage de bio-surfactants dans les méthodes biologiques est assez récent. Toutefois, la
présence de ces surfactants contribue à l’augmentation de la solubilité et à la
biodisponibilité des composés organiques hydrophobes. De ce fait, la biodégradation
semble être moins lente et plus efficace. Nombreux sont les microorganismes qui sont
capables de les produire, parmi eux Pseudomonas putida.
La bioremédiation semble être une méthode bien efficace et écologique dans la
dépollution des sols contaminés par les hydrocarbures.
CONCLUSION ET
PERSPECTIVES
Conclusion et perspectives
40
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Notre étude s’est portée sur la bioremédiation des sols pollués par des hydrocarbures
par Pseudomonas putida. Ce travail nous a permis de nous familiariser avec les matériels de
laboratoire, acquérir et maîtriser les techniques de manipulations microbiologiques et physico-
chimiques notamment celles relatives à l’isolement, l’identification et les traitements
biologiques réalisés sur la souche étudiée.
L’étude a également permis de mettre en évidence la présence dans un sol, d’une souche
capable de dépolluer un sol contaminé par les hydrocarbures pétroliers. Les résultats obtenus
reflètent la capacité de Pseudomonas putida à diminuer jusqu’à 30% en une durée de 3 mois,
la concentration en hydrocarbure dans un sol pollué. En dépit de la complexité de la
composition chimique de l’huile moteur, la souche s’avère être capable de dégrader ce polluant
et résister à son pouvoir toxique.
L’efficacité de la bioremédiation dépend non seulement de l’agent biologique utilisé
mais aussi des caractères physico-chimiques du sol à traiter. L’apport en élément azoté,
l’humidité et l’aération du sol affectent considérablement cette activité bactérienne. Le système
biologique utilisé implique aussi l’efficacité du traitement, l’association bioaugmentation et
biostimulation s’est montrée satisfaisante.
Cependant, un certain nombre de contraintes sont à considérer lors de l'utilisation
de ces procédés biologiques. En premier lieu, la durée des traitements reste encore assez longue
face à la quantité de polluant déversée dans le sol. D’autre part, la bioremédiation s’arrête à une
certaine valeur seuil en raison de la non biodisponibilité du substrat par la souche. Ainsi, dans
l’avenir, nous envisageons de poursuivre l’étude par :
- La confirmation de l’identification des souches étudiées par des méthodes moléculaires,
à savoir le séquençage de l’ARNr 16S et la quantification de la taille du génome
(Weisburg et al, 1991) ;
- L’amélioration des méthodes d’extraction et de quantification des hydrocarbures dans
le sol ;
- L’amélioration de la capacité de dégradation des souches en étudiant les autres
paramètres tels que la température, l’ajout d’un agent biologique produisant du
biosurfactant (solubilisant) ;
- L’étude du mécanisme de dégradation utilisé par la bactérie ;
- L’utilisation d’un consortium dans la dépollution des sols contaminés
REFERENCES
BIBLIOGRAPHIQUES
Références bibliographiques
41
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Ballerini D., Vandecasteele J. P. La restauration par voie microbiologique des sols
contaminés par les polluants organiques. Biotechnologie : Edition Tech et Doc. 1999 ; 865p.
Beilen, J. B., Z. Li, W. A. Duetz, T. H. M. Smits, B. Witholt. Diversity of alkane
hydroxylase systems in the environment. Oil Gas Sci. Technol. Rev. IFP. 2003, 58 : 427-
440.
Ben J. J. Lugtenberg, Linda C. Dekkers. What makes Pseudomonas bacteria rhizosphere
competent ?. Environmental Microbiology. 1999, 1(1) : 9-13.
Bidaud C. BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES AROMATIQUES
POLYCYCLIQUES. Thèse de doctorat : Génie des Procédés.: Institut National
Polytechnique de Grenoble et de L'Ecole Nationale Superieure des Mines de Saint-Etienne,
1998 ; 250p.
Bocard C. Marées noires et sols pollués par des hydrocarbures : Enjeux environnementaux
et traitement des pollutions. Editions Technip, 2006 ; 295p.
Bouchez-Naitali M., Blanchet D., Bardin V., Vandecasteele J.P. Evidence for interfacial
uptake in hexadecane degradation by Rhodococcus equi : the importance of cell
flocculation. Microbiology. 2001, 147: 2537-2543.
Bouwer E. J., Zehnder A.J.B. Bioremediation of organic compounds. Putting Microbial
Metabolism to work. Trends Biotechnol, 1993, 11 (33) : 707-714.
Catilina P., Roure M. C. Médecine et risque au travail : guide du médecin en milieu de
travail. Elsevier Masson. 2002, 693p.
Chassin P., Baize D., Cambier P., Stecheman T. Les éléments traces métalliques et la
qualité des sols. Impacts à moyen et à long terme. Etude et Gestion des sols. 1996,3 : 297-
306.
Chin-A-Woeng T.F. "Root colonization by phenazine-1-carboxamide-producing bacterium
Pseudomonas chlororaphis PCL1391 is essential for biocontrol of tomato foot and root
rot." Mol. Plant Microbe Interact. 2000, 13 (12): 1340–5.
Références bibliographiques
42
Christian M., Veronique C., Paul G. Le traitement biologique des sols pollués par des
composés organiques l'intérêt des champignons filamenteux. Courrier de l'Environnement
de l'INRA. 1996, 28 : 52.
Cooper D.G., Zajic J. Surface-active compounds from microorganisms. Adv Appl
Microbiol. 1980, 26 : 229–253.
EL Fantroussi S., Agathos S. N. Is bioaugmentation a feasible strategy for polluant
removal and site remediation ?. Current Opinion in microbiology. 2005, 8(3), 268-275.
Ewa K., Teofil J., Anna G. Cell surface properties of Pseudomonas stutzeri in the process
of diesel oil biodegradation. Biotechnology Lett. 2021 ; 34(5) : 857-862.
Ferro K., Sudhakar S., Ravikuma R. Biofilm formation of Pseudomonas putida isolated
from Hospital Environment an Human Sources. The role of quorum sensing as assessed by
proteomics. Applied microbiology. 2005, 28(2) : 87-114p.
Fingas M., Fieldhouse B. «Studies on crude oil and petroleum product emulsions: Water
resolution and rheology». Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering
Aspects. 2009, 333(1-3) : 67-81.
Ghazali F. M., Rahman R. N. Z. A., Salleh A. B., Basri M. Biodegradation of
hydrocarbons in soil by microbial consortium. Biodeterior. Biodegradation. 2004, 54 : 61–
67.
Gibson D.T., Mahadevan V., Jerina D.M., Yagi H., Yeh H.J.C. Oxidation of the
carcinogens benzo(a)pyrene and benzo(a)anthracene to dihydrodiols by a bacterium.
Science. 1975, 189 : 295-297.
Gibson, D.T., Koch, J.R., Callio, R.E. Oxidative degradation of aromatic hydrocarbons
by microorganisms. I. Enzymatic formation of catechol from benzene. Biochemistry 1.
1968, 2653-2662.
Golovleva L. A., Maltseva O.V., Solyanikova I. P. Metabolism of foreign compounds in
Pseudomonasspp. Am Soc Microbiol, Washington DC. 1992 ; 231-238p.
Gonçalves R., André A., Porto L.M., Pinheiro L., Cagnon José R., Manfio Gilson P.,
Marsaioli Anita J. Multibioreaction Methodology for Baeyer-Villiger Monooxygenase
Monitoring. Food Technol. Biotechnol. 2004, 42 (4) : 355–361.
Références bibliographiques
43
Hayo M.G. Evaluer l’impact des pesticides sur l’environnement. Courrier de
l’environnement de l’INRA. 1997, 31 : 22p.
Hegde S.V. Liquid bio-fertilizers in Indian agriculture. Bio-fertilizer news letter. 2008 ;
17-22.
Institut National de l’Environnement Industriel et des
Risques. Fiches de données toxicologiques et environnementales. 2014
Institut National de la Recherche Scientifique. Fiche toxicologique.Hexane. 2008,113p.
Jammet H. et Dousset M. Principes généraux de la protection contre les rayonnements
ionisants.In.Génie atomique. Paris.1968, 2 : 211-247.
Jirasripongpun K. The characterization of oil-degrading microorganisms from lubricating
oil contaminated (scale) soil, 2002
Kanaly Robert A., Harayama S. Biodegradation of High-Molecular-Weight Polycyclic
Aromatic Hydrocarbons by Bacteria. Journal of Bacteriology. 2000, 182 (8) : 2059-2067.
Larpent G., Sanglier J. « Biotechnologies ». Principes et méthodes. 1992, 574-581.
Latour X., Lemanceau P. Métabolisme carboné et énergétique des Pseudomonas spp
fluorescents saprophytes à oxydase positive. Agronomie. EDP Sciences. 1997, 17 (9-10) :
427-443.
Leahy P., Cowell L. Monitoring the efficacy of bioremediation. Tibtech., 1994, 11 : 334-
343.
Lemanceau P., Banat M., Perraud R. The taxonomy of Pseudomonas fluorescens and
Pseudomonas putida : current status ans need for revision. Applied microbiology.2000, 20 :
51-63p.
Lemanceau P., Heulin T. In Sol. La rhizosphère. Interface fragile. Inra. Paris, 1998, 93-
106.
Lemière B., Seguin J.J., Le Guern C., Guyonnet D., Baranger Ph. Guide sur le
comportement des polluants dans les sols et les nappes. Application dans un contexte
d’évaluation détaillée des risques pour les ressources en eau. BRGM/RP-50662-FR, 2001 ;
177p.
Références bibliographiques
44
Lens P., Grotenhuis T., Malina G., Tabak H. Soil and sediment remediation :
Mechanisms, technologies and applications. IXA Publishing, 2005 ; 523p.
Lucas P., Sarniguet A., Collet J.M., Lucas M. Réceptivité des sols au piétinéchaudage
(Gaeumannomyces graminis var. tritici) : influence de certaines techniques culturales. Soil
Biol Biochem. 1989, 21 : 1073-1078.
Madsen E.L. Determining in situ biodegradation: facts and challenges. Environ. Sci.
technol. 1991, 25(1) : 1663–1673.
Mazzeo D.E.C, Levy C.E, Angelis D., Marin-Morales M.A. BTEX biodegradation by
bacteria from effluents of petroleum refinery. Science of the Total Environment. 2010,
4334-4340.
Mousel M.L., Picot A. Les solvants : des toxiques banalisés. Les risques du travail. Pour
ne pas perdre sa vie à la gagner. La découverte. 1985, 336-348.
Mukerji K. G., Manoharachary C.; Jagjit S. Microbial activity in the rhizosphere Sol
biologie. New York : Springer. 2006, 7 : 349.
Nelson K.E., Weinel C., Paulsen I.T., Dodson R.J., Hilbert H., Martins dos Santos V.A.
Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile
Pseudomonas putida KT2440. Environ Microbiol. 2002, 4: 799–808.
Rahman K.S.M., Rahman T.J., Kourkoutas Y., Marchant R., Banat I.M. Enhanced
bioremediation of n-akane in petroleum sludge using bacterial consortium amended with
rhamnolipid and micronutrients. Bioresource Technology. 2003, 90(2) : 159-168.
Rahman M., Stotzky G., Norman A.G. Factors limiting bacterial activities in soil. Part ID
: Supplementary substrate addition. Cano J. Microbiol. 2002, 10 : 143-149.
Rajaona R. A. Contribution au traitement des boues et des sols pollués par des
hydrocarbures : Optimisation et approche de modélisation du procédé. Thèse de doctorat :
Chimie minerale et Chimie appliquée. Faculté des Sciences : Université d’Antananarivo,
2015 ; 144p.
Raoul C. Pédologie. Le sol. Propriété et fonction. Paris : Dunod. 2003 ; 455p.
Rehm, H.J., Fritsche W., Hofrichter M. Aerobic degradation by microorganisms, in
Biotechnology. Environmental Processes II. 2008, 146-164 .
Références bibliographiques
45
Robert M. Le sol. Interface dans l’environnement. Ressources pour le développement.
Paris. 1996 ; 146p.
Saada A., Nowak C., Mossmann J.R. Etat des connaissances sur l'atténuation naturelle :
mécanismes et mise en œuvre. Rapport BRGM. 2003
Soltani M. Distribution lipidique et voies métaboliques chez quatre bactéries Gram-
négatives hydrocarbonoclactes. Variation en fonction de lasource de carbone. Thèse de
doctorat. Chimie analytique. Paris. Université Pierre Marie Curie, 2004 ; 284p.
Surridge A.K.J., Wehner F.C., Cloete T.E. Bioremediation of polluted soil, Advances in
applied bioremediation. Sol biologie. 2009, 17 : 103-121.
Sutter V. Identification of Species Isolated from Hospital Environment an Human Sources,
Applied Microbiology. 1968, 16(10) : 1532-1538.
Tarayre C. Bioremédiation des sols pollués aux hydrocarbures. Amélioration de la bio-
augmentation et biostimulation. Allemagne : Edition universitaires européennes. 2012 ;
101p.
Técher D. Réhabilitation de sols pollues par des HAP grâce aux bactéries associées à la
rhizosphère de Miscanthus x giganteus. Université Paul Verlaine de Metz. 2011 ; 307p
Thomas R.L., Jacquet J.M., Mudroch A. Sedimentation processes and associated
changes in surface sediment trace metal concentrations in lake St. Clair. Proceedings of the
International Conference on heavy metals in the environment, Toronto. 1991 ; 691-708.
Thwaites J.M., Farrell R.L., Duncan S.D., Lamar R.T., White R.B., Microbiology of
extreme environments. New-York : In C. Edwards. 2007, 147-177.
Timmis K.N. Pseudomonas putida: a cosmopolitan opportunist. Environement
Microbiology. 2002, 4 : 779–781.
Van Beilen, Duetz, Smits M., Witholt B. Diversity of alkane hydroxylase systems in the
environment. Oil Gas Sci. Technol. IFP. 2003, 58 : 427-440.
Vidali M. Bioremediation. Pure and Applied Chemistry. 2001,73(11) : 1163-1172.
Vollhardt K.P.C., Schore N.E. Traité de chimie organique. De Boeck, 2004 ; 1334p.
Weisburg, W.G.,. Barns, S.M., Pelletier, D.A., Lane, D.J. 16S ribosomal DNA
amplification for phylogenetic study. J. Bacteriol, (1991) 173 : 697–703.
Références bibliographiques
46
Weller D.M. Biological control of soilborne plant pathogens in the rhizosphere with
bacteria. Annu. Rev. Phyto.pathol.1988, 26 : 379–407.
Wiedemeier T. H., Hanadi S. R., Charles J. N., John T. W. Natural attenuation of fuels
and chlorinated solvents in the subsurface. Environ. Sci. Technol. 1999, 29 : 807-817.
Wyszkowskwa, Swindoll C.M., Pfaender K. Adaptation to and biodegradation of
xenobiotic compounds by microbial communities from a pristine aquifer. Appl. Environ.
MicrobioI. 1987, 53 (09) : 212-217.
ANNEXES
Annexes
i
Annexe 1 : Milieux de culture
Gélose au cétrimide :
Composition pour 1000ml :
Peptone……………………………5g
Extrait de viande…………………..1g
Chlorure de sodium………………..5g
Extrait de levure…………………...2g
Cétrimide…………………………..0.3g
Agar………………………………..13g
pH………………………………….7,2
Hajna-Kligler :
Composition pour 1000 ml:
Peptone .......................................... 15 g
Extrait de viande ............................. 3 g
Extrait de levure ..............................3 g
Peptone pepsique de viande .......... .5 g
Glucose............................................ 1 g
Lactose............................................ 10 g
Rouge de phénol........................... ..25 mg
Chlorure de sodium...................... ...5 g
Sulfate ferreux................................. 0,2 g
Thiosulfate de sodium..................... 0,3 g
Agar-agar......................................... 11 g
pH……………..…………….……..7,5
Préparation : 53.5 g par litre. Stérilisation classique et conditionnement en tubes avec une
pente et un culot.
Citrate Simmons
Composition pour 1000 ml:
Citrate de sodium………………………… 1,0 g
Bleu de bromothymol……………………. 0,08 g
Annexes
ii
Chlorure de sodium……………………… 5,0 g
Sulfate de magnésium…………………… 0,2 g
Hydrogéno-phosphate de potassium……... 1,0 g
Dihydrogéno-phosphate d’ammonium…... 1,0 g
Agar……………………………………... 15,0 g
pH ……………………………………….. 7,1
Préparation : 21 g par litre. Stérilisation classique par autoclavage. Conditionnement en tubes
inclinés.
Lysine-fer
Composition pour 1000 ml:
Peptone de gélatine……………………… 5,0 g
Extrait de levure………………………... 3,0 g
L-lysine………………………………….. 10.0 g
Glucose………………………………….. 1,0 g
Citrate de fer III ammoniacal…………… 0,5 g
Bromocrésol pourpre……………………. 20,0 mg
Thiosulfate de sodium………………….. 40,0 mg
Agar……………………………………... 13,5 g
pH ………………………………………...6,7
Préparation : 33 g par litre, stérilisation classique et conditionnement en tubes
inclinés comme dans le cas du milieu de Hajna-Kligler.
Mannitol-Mobilité-Nitrate
Composition pour 1000 ml :
Hydrolysat trypsique de caséine:..................10,0 g
Mannitol:......................................................7,5 g
Rouge de phénol:..........................................0,4 mg
Nitrate de potassium:....................................1,0 g
Agar:.............................................................3,5 g
pH ……………………………………………7,6
Annexes
iii
Préparation : 22 g par litre. Stérilisation classique et conditionnement en tubes.
Auxanogramme du carbone
Glucose à étudier………………………………………5 g
Eau distillée …………………………………………..160 ml
Annexe 2 : Produits chimiques et réactifs
Réactif : réactif de Greiss
Solvant : hexane
Annexe 3 : Valeurs seuils de la concentration en hydrocarbure selon la loi canadienne
Hydrocarbures Aromatiques
Polycycliques
Valeurs seuils
en mg/kg de sol (matière sèche)
Acénaphtène 10
Acénaphtylène 10
Anthracène 10
Benzo anthracène 1
Benzo pyrène 1
Chrysène 1
Fluoranthène 10
Fluorène 10
Méthyl-3 cholanthrène 1
Naphtalène 5
Méthyl-1 naphtalène 1
Méthyl-2 naphtalène 1
Diméthyl-1,3 naphtalène 1
Triméthyl-2,3,5 naphtalène 1
Phénanthrène 5
Pyrène 10
Annexes
iv
Annexe 4 : Constituants du pétrole selon les domaines d’ébullition (Bocard, 2006)
Annexe 5 : Espèces de Pseudomonas
Domaine d’ébullition (C°) Nombre d’atomes de carbone Produits
<30 C1-C4 Gaz naturel, méthane, éthane,
propane, butane
30-200 C4-C12 Ether de pétrole (C5-C6),
ligroïne, essence
200-300 C12-C15 Kérosène, mazout
300-400 C15-C25 Gazole, diesel, huile lubrifiante,
cires
>400 >C25 Résidu de distillation, asphalte,
goudron
Espèces Habitat Pathogénicité Utilisation Référence
P. fluorescens Sol, eau Pathogène
opportuniste
-Bioremédiation sol
-PGPR (Plant Growth-
Promoting Rhizobacteria)
Weller, 1988
P. chlororaphis Sol, eau Non pathogène Antifongique Woeng, 2000
P. aeruginosa Sol, eau Pathogène
opportuniste Bioremédiation sol Madsen, 1991
P. stutzeri Sol, eau Pathogène
opportuniste Bioremédiation sol
Ewa et al.,
2012
P. striata SOL, eau Non pathogène Biofertilisant Egde, 2008
Name : RAKOTOARISOA
First name : Mialy Tsiory
E-mail : [email protected]
Title : Bioremediation of soils polluted by hydrocarbons by Pseudomonas putida
ABSTRACT
Petroleum hydrocarbons are ubiquitous compounds, potentially toxic to both humans and
the environment. Therefore, remediation of soils contaminated with these compounds has
become a necessity.
The objective of this work is to isolate from a healthy soil Pseudomonas putida and to evaluate
the degradation efficiency of the hydrocarbons of this strain.
Samples of healthy soil are analyzed microbiologically for the isolation of the strain
Pseudomonas putida. The isolated strain is then inoculated into soil contaminated with drain
oil. The kinetics of bacterial growth and the amount of degraded hydrocarbon are monitored
throughout the process.
The results showed a 30% decrease in the hydrocarbon concentration in 3 months of biological
treatment. The Pseudomonas putida strain was capable of degrading up to 0.2 mg of
hydrocarbon per gram of soil per day. The amount of degraded hydrocarbon increases
proportionally with the bacterial population. The bacterial concentration increased from 4.107
to 3.1013 CFU / g towards the end of the experiment. This increased growth of the bacterial
culture corresponds to a growth rate of 0,32h-1 and a generation time of 2,16 h.
Thus, the Pseudomonas putida strain isolated from a healthy soil is effectively capable of
depolluting soil contaminated by petroleum hydrocarbons.
Key words: petroleum hydrocarbons, bioremediation, Pseudomonas putida, soil,
motor oil
Advisors : Professor ANDRIANARISOA Blandine
Doctor RAHARIJAONA Tovo Robin
Nom : RAKOTOARISOA
Prénoms : Mialy Tsiory
E-mail : [email protected]
Titre : Bioremédiation des sols pollués par des hydrocarbures par Pseudomonas putida
RESUME
Les hydrocarbures pétroliers sont des composés ubiquitaires, potentiellement toxiques
aussi bien pour l’homme que pour l‘environnement. C’est pourquoi la dépollution des sols
contaminés par ces composés est devenue une nécessité.
L’objectif de ce travail est d’isoler à partir d’un sol Pseudomonas putida et d’évaluer l’efficacité
de dégradation des hydrocarbures par cette souche.
Des échantillons de sol sont analysés microbiologiquement pour l’isolement de la souche
Pseudomonas putida. La souche isolée est ensuite inoculée dans un sol contaminé par de l’huile
de vidange. La cinétique de croissance bactérienne ainsi que la quantité d’hydrocarbure dégradé
sont suivies tout au long du processus.
Les résultats ont montré une diminution de 30% de la concentration en hydrocarbure en 3 mois
de traitement biologique. La souche Pseudomonas putida a été capable de dégrader jusqu’à 0,2
mg d’hydrocarbure par gramme de sol par jour. La quantité d’hydrocarbure dégradée augmente
proportionnellement avec la population bactérienne. La concentration bactérienne est passée de
4.107 à 3.1013 UFC /g à la fin de l’expérimentation. Cette croissance accrue de la culture
bactérienne correspond à un taux de croissance de 0,32h-1 et un temps de génération de 2,16
heures.
Ainsi, la souche Pseudomonas putida isolée à partir d’un sol sain est effectivement capable de
dépolluer un sol contaminé par les hydrocarbures pétroliers.
Mots clés : hydrocarbures pétroliers, bioremédiation, Pseudomonas putida, sol, huile
de vidange
Encadreurs : Professeur ANDRIANARISOA Blandine
Docteur RAHARIJAONA Tovo Robin