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En vue de l'obtention du

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Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier

Discipline ou spécialité : Sciences et génie des matériaux

Présentée et soutenue par Hélène AUTEFAGE Le 20 Juillet 2009

Titre : RÔLE OSTEOINDUCTEUR D’UN REVÊTEMENT D’APATITE CARBONATÉE

NANOCRISTALLINE SUR DES CÉRAMIQUES DE PHOSPHATE DE CALCIUM BIPHASIQUE

JURY

Dr. J. AMÉDÉE Rapporteur Pr. M. P. GINEBRA Rapporteur Pr. M. GOLDBERG Examinateur Pr. P. BONNEVIALLE Examinateur Pr. C. REY Directeur de thèse Pr. P. SWIDER Co-directeur de thèse Dr. S. GONÇALVÈS Membre invité Dr. F. BRIAND-MÉSANGE Membre invité

Ecole doctorale : Sciences de la Matière Unité de recherche : CIRIMAT, INP-UPS-UMR CNRS 5085

Laboratoire de Biomécanique EA3697 Directeur(s) de Thèse : Pr. Christian Rey et Pr. Pascal Swider

Rapporteurs : Dr. Joëlle Amédée et Pr. Maria Pau Ginebra

« L’esprit d’équipe ? C’est des mecs

qui sont une équipe, ils ont un esprit !

Alors, ils partagent ! »

Michel Colucci, dit Coluche

A ma famille,

A mon amour,

A mes amis…

Remerciements

Cette thèse est le fruit d’une collaboration entre cinq laboratoires académiques, membres du groupe de travail « Biomatériaux, os et dents » de l’Université Paul Sabatier créé en 2004 :

• Le laboratoire « Phosphates, Pharmacotechnie et Biomatériaux », anciennement « laboratoire de physico-chimie des phosphates », du Centre Interuniversitaire de Recherche et d’Ingénierie des Matériaux à l’Université de Toulouse, dirigé par le Pr Christian Rey puis le Dr Christèle Combes.

• Le laboratoire de Biomécanique, EA 3697, de l’Université de Toulouse, dirigé par le Pr

Pascal Swider.

• L’équipe du Pr Jean-Pierre Salles et du Dr Patrick Raynal du département « Lipoprotéines et Médiateurs Lipidiques » de l’unité U563 de l’Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM), au Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, dirigé par le Pr Bertrand Perret.

• Le service de chirurgie des animaux de compagnie de l’Ecole Nationale Vétérinaire de

Toulouse, dirigé par le Pr André Autefage.

• Le département d’anatomie et cytologie pathologique de l’hôpital de Rangueil à Toulouse, dirigé par le Pr Marie-Bernadette Delisle.

J’ai donc à cette occasion eu le plaisir de travailler aux côtés de nombreuses personnes. Mais avant de m’engager dans le vif du sujet et de vous remercier, vous qui m’avez aidée tout au long de ce projet, je voudrais commencer par exprimer ma reconnaissance aux membres de mon jury de thèse qui ont accepté d’évaluer mon travail : - le Professeur Michel Goldberg, du laboratoire sur la réparation et les remodelages

orofaciaux de l’Université René Descartes - Paris V, qui m’a fait l’honneur de présider mon jury de thèse.

- Mes deux rapporteurs : le Docteur Joëlle Amédée, directrice de l’unité 577

« Biomatériaux et réparation tissulaire » de l’INSERM de Bordeaux et le Professeur Maria-Pau Ginebra, du département « Materials Science and Metallurgical Engineering » de l’Universitat Politècnica de Catalunya de Barcelone, pour l’intérêt qu’elles ont porté à ce travail et les suggestions apportées.

- le Pr Paul Bonnevialle, du service de chirurgie orthopédique et traumatologique de

l’hôpital Purpan à Toulouse, qui sait ponctuer ses questions d’une touche d’humour très agréable.

Vous avez rendu ma soutenance très intéressante par vos questions et remarques pertinentes et je suis ravie de vous avoir rencontrés à cette occasion. Je tiens ensuite à exprimer ma gratitude à ceux qui ont fait que ce projet a pu voir le jour en s’engageant dans cette collaboration, c'est-à-dire les directeurs des équipes impliquées, le Pr Christian Rey, le Pr Pascal Swider, le Pr Jean-Pierre Salles, le Pr André Autefage et le Pr Marie-Bernadette Delisle. Je vous remercie pour votre accueil chaleureux dans vos

laboratoires et je souhaite que cette expérience vous ait été profitable et que cela vous encourage à entretenir de tels partenariats dans le futur. J’adresse ensuite mes plus sincères compliments à ceux qui ont fait vivre ce projet et m’ont encadrée tout au long de ce travail : mes directeurs de thèse bien sûr, le Pr Christian Rey et le Pr Pascal Swider mais aussi le Dr Fabienne Briand-Mésange, le Dr Didier Mathon et le Dr Anne Gomez-Brouchet. Vous avez été au cœur de ce projet, travaillant ensemble à son développement et sa réalisation, vous investissant pleinement aussi bien dans les tâches administratives que scientifiques. Vous m’avez guidée, soutenue, transmis une part de vos connaissances et vous m’avez fait confiance pour mener ce projet à bien. Ce fût un réel plaisir de travailler à vos côtés et d’apprendre à votre contact. Pour tout cela, MERCI. Plus spécifiquement,… Christian, vous êtes un puits (sans fond) de connaissances, un grand « maître » des phosphates de calcium. Merci pour tout le temps que vous m’avez accordé, votre gentillesse et nos discussions toujours passionnantes. Pascal, vous avez été un moteur dans la réalisation de ce projet. Vous m’avez aidé à avancer étape par étape, en gardant le cap pour atteindre les objectifs fixés. J’admire l’énergie et la détermination dont vous avez fait preuve pour que ce travail puisse aboutir et je souhaite qu’il s’agisse d’un investissement à long terme qui continuera à porter ses fruits. Fabienne, tu as vraiment été là pour moi à tous les niveaux. Ton écoute et tes conseils ont été des atouts précieux. Je reste encore maintenant impressionnée par tes compétences scientifiques et tes qualités humaines. Je te souhaite beaucoup de bonheur et de réussite aussi bien dans tes projets professionnels que dans ta vie personnelle. Anne, ton regard de lynx a été déterminant dans ce projet. Je te remercie d’avoir partagé avec moi ton expertise et ton temps souvent compté. Didier, aux doigts de fée, aussi à l’aise avec une perceuse qu’avec du fil et une aiguille. J’ai vraiment apprécié de pouvoir participer (de loin) aux expérimentations et te voir à l’œuvre. Du grand art ! Merci pour ton implication. Ce projet a, en outre, été réalisé en partenariat avec l’entreprise Teknimed S.A. à l’Union, dirigée par Mr Léonard. Je remercie donc Mr Léonard, le Dr Benoît Donazon et le Dr Stéphane Gonçalvès pour l’intérêt qu’ils ont porté à notre projet ainsi que pour les moyens financiers et techniques qu’ils ont mis à notre disposition. Merci en particulier à Stéphane qui a géré la collaboration avec entrain et réactivité et a accepté de participer à mon jury de thèse en tant qu’invité. Je remercie, d’autre part, la présidence de l’Université Paul Sabatier pour nous avoir octroyé une bourse ministérielle et la région Midi-Pyrénées pour le financement qu’elle nous a accordé. C’est la combinaison de ces différents facteurs qui a permis la réalisation de ce projet ambitieux.

Mais comme même bien encadrée, on ne peut tout faire seul, il reste encore beaucoup de personnes qui ont joué un rôle majeur dans ce travail : - Le Dr Christèle Combes, avec son rire sincère et chaleureux, le Dr Sophie Cazalbou,

toujours pleine d’énergie, et le Dr Christophe Drouet et sa gourmandise légendaire. Merci d’avoir été présents à mes côtés tout au long de mon parcours et encore maintenant.

- Sandrine Cavalié, pour accomplir tes missions parfois périlleuses (comme l’achat d’un équipement commun, par exemple), tu as à ta disposition ta bonne humeur, ta vitalité et ta patience. Accompagnée de Mme Chamayou, tu as été mon fil d’Ariane dans ces méandres administratifs. Pour cela et pour le reste, nous te devons tous un GRAND MERCI.

- Cédric Charvillat et Olivier Marsan, qui m’ont si spontanément proposé leur aide. Cédric, merci pour ces moments passés dans et en dehors du labo, j’espère que nous pourrons continuer à mieux nous connaître, avec ou sans Mona… Olivier reste passionné et enthousiaste, c’est un vrai bonheur !

- Dominique Bonsirven, la resplendissante Domi. S’il te plaît, fais-nous partager ton secret. - Le Dr Jérôme Briot, le maître incontesté de MATLAB® et un allié de poids pour le labo.

Merci pour ton aide, tes conseils et nos longues discussions politico-scientifiques ou scientifiques tout court.

- Le Pr Jean-Jacques Railhac et le Pr Nicolas Sans du service de radiologie et imagerie médicale de l’hôpital Purpan à Toulouse pour le prêt de la tablette graphique, qui fût fort utile, et les radiographies effectuées.

- Le Dr Nicolas Bonnevialle, parfois pressé mais toujours souriant. Ravie d’avoir pu collaborer un temps avec toi.

- Le Dr Jean-Michel Lafosse, Monsieur Efficacité. Ce fût bref mais tu m’as rendu un très grand service. Pour cela et pour tes encouragements, je te remercie.

- Le Dr Sophie Palièrne, avec son dynamisme hors-norme. Nul doute que nos petites brebis ont été bien chouchoutées grâce à toi.

- Joëlle Ribaut, qui répond toujours rapidement. Désolée pour les appels réguliers qui ne te sont pas destinés.

- Gisèle Viguier et Marie Cortèse. Un grand MERCI à vous, d’abord pour ne pas avoir fuit en me voyant arriver les bras chargés de « cadeaux » et ensuite bien sûr pour tout le travail que vous avez accompli en gardant le sourire.

Beaucoup d’autres personnes ont croisé ma route, partagé mon chemin. Je pense à mes amis et collègues qui ont été là pour moi et avec lesquels j’ai passé une multitude de bons moments : Mona, mon amie, ton enthousiasme, ta générosité, ta « folie », nous rendent tous meilleurs. Tu me manques, Pup you et Te iubesc ! Solène, qui associe bonne humeur et prévenance avec un soupçon de coups de gueule pour l’obtention d’un mélange détonnant ; Jean-Phi, mon sauveur, toujours plein de bonnes idées ; Françoise, merci pour ta bienveillance, je te souhaite toute la réussite du monde dans tes projets, tu le mérites ; la Belle Imane et le très convivial Farid, plein de réussite et de bonheur à vous deux ; Amhed, no stress, tu gères ; Sabrina, toutes mes félicitation pour ta petite Annabelle ; David, le nouveau gourmand de l’équipe ; Gérard et son calme impressionnant ; Stéphanie, en temps partiel sur Toulouse ; Hélène et Sophie qui ont toujours le sourire ; Caroline, avec qui je peux parler « bio » ; Albert, avec ses idées parfois étonnantes ; Jean-Louis que l’on entend de loin et Michèle pleine de tendresse ; mais aussi, Patricia, Fabien, Audrey, Anne-Marie, Véronique, Fernand, Hakim, Ingrid, Fred, Amal, Laeticia, Christos, Jaime, Djar, Yann….

…. Mes copines du vaisseau U563. Et les filles, vous savez pas quoi ?... J’ai « adoooré » passer du temps en votre compagnie ! Anne, petite padawan, (petite mais solide). Merci pour ton écoute et ton soutien, qui m’ont très souvent été utiles. J’espère que nous pourrons continuer nos interminables discussions (en direct ou de loin) encore très longtemps. Marianne, avec ta fraicheur et ta joie communicative, tu es une personne exceptionnelle à connaître absolument. Armelle, scientifique, conseillère perso, bricoleuse, pro de la retouche de photos et des gâteaux, je me demande vraiment ce que tu ne sais pas faire. A toi aussi merci et bon courage. La douce et glamour Audrey, je te souhaite plein de larmes de joies pour cette année et toutes celles à venir. L’attachante et plutôt bavarde Marie, j’aurais vraiment aimé mieux te connaître ; Véro, si tu montes un club « gourmandise », j’adhère tout de suite ; Camille, ta joyeuse excentricité nous manque ; Pierre, tu n’es pas une fille, mais admets-le, sur un malentendu, on peut se tromper…Je pense aussi bien sûr à Dénis, avec qui on se comprend trop bien sur certains points, bon courage ; la « timide » Aurélie ; Claudia avec son rythme et son accent délicieux ; Sara et son emploi du temps millimétré ; l’avenante Alex ; la toujours superbe Stéphanie ; Thomas et sa bobo attitude ; Emmanuelle qui m’autorise à piquer des bonbons ; Françoise qui déborde d’énergie et de gaité ; Greg, le ventre sans fond ; Guillaume, le blagueur ; Jean-Philippe avec son maxi pot de Nutell…, (« chut chut pas de marque ») ; Clo et Christine P qui savent se faire entendre mais n’oublient jamais d’être attentives aux autres ; Nicole et son organisation hors-pair ; Yvette, toujours prête à rendre service, surtout entre midi et deux ; Christine C à qui je souhaite plein de bonnes choses pour la suite ; Isabelle, discrète et attentionnée ; sans oublier bien entendu, Patrick, Muriel, Valérie, Nathalia, Justine, Véro, Séverine, Sophie, Ronan, Coco, Xénia, Stéphane, Gérald, Bertrand, Xavier, Elvire, Emmanuel, Laurent, Michel, François, Jean-Luc, Michel… je vous souhaite à vous tous bonne chance pour le futur…. … Eric, Gaëtan, Georges, Fabien… qui sont toujours très accueillants bien qu’ils parlent une

autre langue ( )),(),(.(),( trrDt

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∂∂ )….

…Les vétos, dont notamment Eric avec son sens de l’humour et ses spécialités niçoises, Patricia qui m’a évité les points à vifs, Iban le spécialiste du plaquage de brebis… Je voudrais, d’autre part, exprimer ma reconnaissance à mes anciens mentors qui m’ont encouragée dans cette voie, Claude, Thierry et Nathalie ; à mes yeux ce sont vos qualités humaines qui font la différence. Je souhaite enfin faire de gros bisous à ceux que j’aime… A ma maman et mon papa, qui m’ont tant soutenue tout au long de ces années. Pour les efforts que vous avez faits pour nous et l’amour que vous nous témoignez tous les jours, les mots que j’écrirai ne pourront pas suffire pour vous exprimer ma gratitude. Alors ma douce maman et mon gentil papa, que j’ai embêté plus d’une fois le we, je vous dis simplement, je vous aime ! A Julien, mon âme-sœur. Nul besoin de mots pour se comprendre et heureusement, car il n’en existe pas d’assez fort... T’aim. A mon grand frère, Xavier, toujours là pour moi, plein de prévenance et d’humour. Je te souhaite un bel avenir avec Véro sur Toulouse (de préférence) ou ailleurs.

A Fabien et Ciloune, qui occupent depuis toujours une grande place dans mon cœur. A Chantal, Josie, Jojo, Daniel, Francis, Martine, Francette, Christian, Christiane, Vaness, Philippe, Olive et Delphine, Mélanie, Patrice, Olivier et tous les petits bouts de choux qui vous ressemblent et font notre bonheur. A Maïté, Michel, Billy, Seb, Adi et Lilou qui m’ont accueillie avec amour dès le début et qui continuent à m’encourager. A celles et ceux qui ne sont plus là, mais que je garde très profondément dans mon cœur. Et pour finir à mes amis IRL, de longue date ou en devenir : Marine, Sarah, Marina, ma Jojo, Alex, Micka, Yaya, Christophe, Constance, Stéphanie, Claudine, Hyo Young, Chach, Sandra, Audrey, Axel, Cindy, Agnes, Greg, Yoann, Trévor, Ailyc, Sylvain,… …. Non, je vous le répète une dernière fois : « Je ne fais pas de schtroumpf-moutons » ! Je pense aussi à toi qui as lu mes remerciements dans leur ensemble. Tu me sembles être quelqu’un de courageux ; tu peux donc, dès à présent, t’attaquer à la lecture du reste de mon manuscrit….

RÔLE OSTEOINDUCTEUR D’UN REVÊTEMENT D’APATITE

CARBONATÉE NANOCRISTALLINE SUR DES CÉRAMIQUES

DE PHOSPHATE DE CALCIUM BIPHASIQUE

Résumé

Les céramiques commerciales à base de phosphate de calcium frittées à haute température

présentent une très faible surface spécifique et sont peu réactives. Bien qu'elles possèdent une

excellente ostéoconductivité, leur capacité d'ostéoinduction est très limitée.

L'hypothèse centrale de ce travail a consisté à supposer qu'un revêtement d'apatite carbonatée

nanocristalline pouvait améliorer les propriétés de surface et biologiques de ces céramiques.

Les analyses physico-chimiques ont montré qu'un revêtement composé de nanocristaux

présentant des caractéristiques proches de celles du minéral osseux conduisait à une

augmentation sensible de la surface spécifique et à la formation de nanopores, à priori

favorables à une amélioration de l'activité biologique. Cette amélioration a été établie par

l’étude de l’adsorption d’un facteur de croissance ostéogénique, la rhBMP-2. La quantité de

BMP-2 adsorbée a été sensiblement augmentée et le revêtement a de plus permis une

libération temporellement soutenue. La biocompatibilité des échantillons revêtus a été ensuite

évaluée in vitro par l’étude du comportement de deux types cellulaires. Une étude in vivo a été

menée sur modèle animal ovin en site intramusculaire afin d'évaluer le potentiel

ostéoinducteur des céramiques phosphocalciques. La proportion d’os néoformé dans ce site

ectopique, est apparue significativement augmenté par l’association avec la BMP-2 pour des

quantités de protéines réduites, mais également, plus étonnamment, par la seule présence du

revêtement nanocristallin. Ce dernier résultat, particulièrement original, ouvre la voie à des

applications cliniques à court terme dans le domaine des substituts osseux.

Mots clés

Ostéoinduction – Phosphate de calcium – Apatite nanocristalline – Activation de surface –

Bone Morphogenetic Protein

OSTEOINDUCTIVE POTENTIAL OF NANOCRYSTALLINE CARBONATED

APATITE - COATED BIPHASIC CALCIUM PHOSPHATE CERAMICS

Abstract

Commercial calcium phosphate ceramics sintered at high temperature exhibit a very low

specific surface area and a poor surface reactivity. Although they are excellent

osteoconductive materials, their osteoinductive properties appear rather weak. In this work,

we hypothesised that a nanocrystalline carbonated apatite coating could improve the surface

and biological properties of these ceramics. The physico-chemical analyses showed that a

coating made of bone mineral-like nanocrystals increased the specific surface area of the

ceramics and induced the formation of nanopores, which could favor the biological activity.

The adsorption study of an osteogenic growth factor, the rhBMP-2, confirmed the

improvement of surface reactivity. An increased amount of protein was adsorbed and its

release was sustained. The biocompatibility of the coated ceramics was demonstrated in vitro.

The in vivo osteoinductive property of the modified ceramic was studied in intramuscular sites

of an ovine animal model. The modified ceramic, associated with BMP-2 promoted the

formation of bone. Furthermore, interestingly, the nanocrystalline coating itself, without any

addition of BMP-2, was found to be osteoinductive. This last result, particularly innovating,

could lead to clinical applications in the field of bone substitutes.

Key words

Osteoinduction – Calcium phosphate – Nanocrystalline apatite – Surface activation –

Bone Morphogenetic Protein

Abréviations ALP Phosphatase alcaline BCP Phosphate de calcium biphasique BET Brunauer-Emmet-Teller BMP Bone Morphogenetic Protein (rhBMP : BMP humaine recombinante) BSA Albumine de sérum bovin CKO Conditional Knock-out mouse DBM Demineralized bone matrix DCPA Phosphate dicalcique anhydre (CaHPO4) DCPD Phosphate dicalcique dihydraté (CaHPO4, 2H2O) DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium DMSO Diméthylsulfoxide DO Densité optique DRX Diffraction des rayons X FGF Fibroblast Growth Factor FTIR Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier HA Hydroxyapatite (Ca10(PO4)6(OH)2) ICP-MS Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometer JCPDS Fiche Joint committee on powder diffraction standard KO Knock-out mouse µCT Microcomputed tomography MEB Microscopie Electronique à Balayage MET Microscopie Electronique à Transmission MSC Cellules Souches Mésenchymateuses (hMSC : MSC humaines) MTT Bromure de 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5(-diphényltétrazolium) NanoAp Revêtement d’apatite nanocristalline 1 NanoAp-EtOH Revêtement d’apatite nanocristalline 2 (Etape additionnelle) OCP Phosphate octacalcique (Ca8(PO4)4(HPO4), 5H2O) PBS Phosphate Buffer Saline PDLLA Poly(D,L-lactide) PGE2 Prostaglandine E2 PLGA Poly D,L(lactide-co-glycolide) pI Point Isoélectrique qRT-PCR Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction RANK Receptor Activator of Nuclear factor κB Rapport S/L Rapport Solide/Liquide RMN Résonance magnétique nucléaire SBF Simulated body fluid SD Ecart-type à la moyenne SEM Erreur standard à la moyenne SVF Sérum de veau fœtal TCP Phosphate tricalcique (Ca3(PO4)2) TGF-β Transforming growth Factor-β TRAP Tartrate-resistant acid phosphatase VEGF Vascular Endothelial Growth Factor

1

Table des matières Table des matières __________________________________________________________ 1

Chapitre 1 Introduction bibliographique générale __________________________________________ 5

1. L’os ________________________________________________________________________ 6 1.1. La matrice extracellulaire ____________________________________________________________ 6

1.1.1. La matrice organique ____________________________________________________________ 6 1.1.2. Le minéral osseux _______________________________________________________________ 7

1.2. Les cellules de l’os et le remodelage osseux______________________________________________ 8 2. Les matériaux de comblement osseux ___________________________________________ 10

2.1. Les céramiques phosphocalciques_____________________________________________________ 11 2.1.1. L’hydroxyapatite (HA) __________________________________________________________ 11 2.1.2. Le phosphate tricalcique-β (β-TCP) ________________________________________________ 11 2.1.3. Les phosphates de calcium biphasiques (BCP)________________________________________ 12 2.1.4. Les apatites analogues au minéral osseux____________________________________________ 12

3. Caractéristiques des substituts osseux ___________________________________________ 12 3.1. Biocompatibilité __________________________________________________________________ 12 3.2. Résistance mécanique ______________________________________________________________ 13 3.3. La porosité_______________________________________________________________________ 13 3.4. Biorésorbabilité___________________________________________________________________ 15 3.5. Bioactivité _______________________________________________________________________ 15 3.6. Ostéoconduction __________________________________________________________________ 17

4. L’ostéoinduction_____________________________________________________________ 18 4.1. L’ostéoinduction par les BMPs _______________________________________________________ 19

4.1.1. Les BMPs ____________________________________________________________________ 20 4.1.1.1. Structure __________________________________________________________________ 20 4.1.1.2. Production par génie génétique ________________________________________________ 21 4.1.1.3. Rôle des BMPs dans l’ostéogenèse _____________________________________________ 21

4.1.2. Association BMPs-matériaux : Efficacité in vivo ______________________________________ 23 4.1.2.1. Influence de la quantité administrée sur la réponse _________________________________ 24 4.1.2.2. Influence du temps de libération _______________________________________________ 25

4.2. L’ostéoinduction induite par les matériaux ______________________________________________ 26 4.2.1. Caractéristiques des matériaux ostéoinducteurs _______________________________________ 26 4.2.2. L’ostéoinduction par les céramiques phosphocalciques _________________________________ 27 4.2.3. Les mécanismes d’action envisagés ________________________________________________ 28

5. Les interactions cellules/biomatériaux ___________________________________________ 29 5.1. Matériaux et ostéoprogéniteurs ou ostéoblastes __________________________________________ 30

5.1.1. Influence de la composition chimique ______________________________________________ 30 5.1.2. Influence de la topographie de surface ______________________________________________ 31 5.1.3. Influence de la taille des cristallites ________________________________________________ 32 5.1.4. Influence de l’énergie de surface __________________________________________________ 33 5.1.5. Les mécanismes d’action possibles ________________________________________________ 33

5.2. Matériaux et ostéoclastes ___________________________________________________________ 34 5.3. Matériaux et cellules immunitaires ____________________________________________________ 34

6. Objectifs de notre étude_______________________________________________________ 35

Chapitre 2 Etude d’un procédé de revêtement de céramiques poreuses par une apatite carbonatée nanocristalline ____________________________________________________________ 38

1. Introduction bibliographique __________________________________________________ 38

2

1.1. Les caractéristiques du minéral osseux _________________________________________________ 38 1.2. Les analogues de synthèse du minéral osseux____________________________________________ 41

1.2.1. Propriétés des apatites biologiques et de leurs analogues de synthèse : Influence de la couche hydratée ___________________________________________________________________________41

1.3. Exemples de procédés de revêtements d’apatites à faible température_________________________ 42 2. Objectifs ___________________________________________________________________ 45 3. Matériel et méthodes _________________________________________________________ 46

3.1. Matériaux _______________________________________________________________________ 46 3.2. Caractérisation des nanocristaux______________________________________________________ 47

3.2.1. Diffraction des Rayons X ______________________________________________________ 47 3.2.2. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier __________________________________ 47 3.2.3. Dosage du calcium, du phosphore et du sodium_______________________________________ 48 3.2.4. Dosage des carbonates __________________________________________________________ 49 3.2.5. Microscopie Electronique à Transmission ___________________________________________ 49

3.3. Caractérisation des granulés _________________________________________________________ 50 3.3.1. Microscopie Electronique à Balayage_______________________________________________ 50 3.3.2. Mesure de la surface spécifique ___________________________________________________ 50 3.3.3. Mesure de la porosité ___________________________________________________________ 51 3.3.4. Echange ionique : Strontium______________________________________________________ 51

4. Résultats ___________________________________________________________________ 51 4.1. Caractérisation des nanocristaux______________________________________________________ 52 4.2. Caractérisation des granulés _________________________________________________________ 56

4.2.1. Morphologie des granulés revêtus _________________________________________________ 56 4.2.2. Surface spécifique______________________________________________________________ 57 4.2.3. Porosité ______________________________________________________________________ 58 4.2.4. Echange ionique avec le strontium _________________________________________________ 59

5. Discussion __________________________________________________________________ 60 5.1. Procédé de revêtement _____________________________________________________________ 60 5.2. Morphologie du revêtement _________________________________________________________ 61 5.3. Caractéristiques des nanocristaux _____________________________________________________ 62 5.4. Comparaison des granulés revêtus ____________________________________________________ 63

5.4.1. Surface spécifique______________________________________________________________ 63 5.4.2. Porosité ______________________________________________________________________ 64 5.4.3. Echange avec le strontium _______________________________________________________ 65

6. Conclusion et perspectives_____________________________________________________ 66

Chapitre 3 Etude de l’adsorption et de la libération de la rhBMP-2 sur les céramiques de BCP revêtues d’un dépôt d’apatite carbonatée nanocristalline__________________________________ 68

1. Introduction bibliographique __________________________________________________ 68 1.1. Adsorption de protéines sur l’hydroxyapatite ____________________________________________ 68 1.2. Adsorption de protéines acides _______________________________________________________ 69 1.3. Adsorption de la BMP-2 ____________________________________________________________ 69 1.4. Paramètres influençant l’adsorption de protéines sur les Ca-P _______________________________ 70

1.4.1. Conditions d’adsorption _________________________________________________________ 71 1.4.2. Influence des caractéristiques de l’adsorbant _________________________________________ 72

1.5. La libération _____________________________________________________________________ 74 2. Objectifs de l’étude __________________________________________________________ 75 3. Matériel et méthodes _________________________________________________________ 76

3.1. Réactifs _________________________________________________________________________ 76 3.1.1. Adsorbant ____________________________________________________________________ 76 3.1.2. Adsorbat : La rhBMP-2 non-glycosylée _____________________________________________ 76

3.2. Adsorption de la rhBMP-2 __________________________________________________________ 76 3.2.1. Marquage de la BMP-2__________________________________________________________ 77

3

3.2.2. Protocoles d’adsorption de la BMP-2 par les granulés __________________________________ 77 3.3. Libération de la rhBMP-2 ___________________________________________________________ 79

3.3.1. Echantillons utilisés ____________________________________________________________ 79 3.3.2. Protocole de suivi de la libération__________________________________________________ 79

4. Résultats ___________________________________________________________________ 80 4.1. Comparaison de l’efficacité des différents revêtements ____________________________________ 80 4.2. Etude comparative entre les granulés témoins et NanoAp-EtOHx1 ___________________________ 82

4.2.1. Cinétiques d’adsorption de la rhBMP-2 _____________________________________________ 82 4.2.2. Isothermes d’adsorption de la rhBMP-2 _____________________________________________ 83

4.3. Suivi de la libération de la rhBMP-2___________________________________________________ 84 5. Discussion __________________________________________________________________ 86

5.1. Vitesse d’adsorption _______________________________________________________________ 87 5.2. Comparaison des capacités d’adsorption des différents échantillons __________________________ 88

5.2.1. Comparaison des granulés témoins et revêtus ________________________________________ 88 5.2.2. Comparaison des revêtements_____________________________________________________ 90

5.3. Libération de la rhBMP-2 ___________________________________________________________ 91 6. Conclusions et perspectives ____________________________________________________ 94

Chapitre 4 Etude du comportement cellulaire vis-à-vis des céramiques de BCP revêtues ou non avec le procédé NanoAp-EtOH _____________________________________________________ 95

1. Introduction bibliographique __________________________________________________ 95 1.1. Les modèles cellulaires pour l’étude de l’interaction matériaux/ostéoprogéniteurs ou ostéoblastes___ 95 1.2. Les modèles cellulaires pour l’étude de la différenciation ostéoblastique induite par la BMP-2 _____ 97

2. Objectifs ___________________________________________________________________ 98 3. Matériels et méthodes ________________________________________________________ 99

3.1. Modèles cellulaires ________________________________________________________________ 99 3.2. Culture cellulaire sur les granulés ____________________________________________________ 100 3.3. Etudes de l’adhésion et de la prolifération _____________________________________________ 101

3.3.1. Conditions de cultures _________________________________________________________ 101 3.3.2. Test au MTT _________________________________________________________________ 102

3.4. Morphologie des cellules __________________________________________________________ 102 3.4.1. Conditions de culture __________________________________________________________ 102 3.4.2. Microscopie Electronique à Balayage (MEB) _______________________________________ 103

3.5. Etude de la différenciation ostéoblastique______________________________________________ 103 3.5.1. Conditions de culture __________________________________________________________ 103 3.5.2. Récupération des cellules incubées sur les granulés ___________________________________ 103 3.5.3. Dosage de l’activité ALP _______________________________________________________ 104 3.5.4. Dosage de l’ADN _____________________________________________________________ 105

4. Résultats __________________________________________________________________ 105 4.1. Etude des réponses cellulaires vis-vis des matériaux _____________________________________ 105

4.1.1. Adhésion et prolifération _______________________________________________________ 105 4.1.1.1. C2C12___________________________________________________________________ 105 4.1.1.2. C3H10T1/2_______________________________________________________________ 107

4.1.2. Morphologie des cellules ensemencées sur les granulés________________________________ 108 4.1.3. Différenciation des cellules en contact avec les matériaux______________________________ 109

4.2. Différenciation en réponse à la BMP-2 adsorbée ________________________________________ 110 5. Discussion _________________________________________________________________ 112

5.1. Biocompatibilité générale des céramiques étudiées ______________________________________ 112 5.2. Adhésion et prolifération cellulaires __________________________________________________ 114 5.3. La différenciation intrinsèque _______________________________________________________ 116 5.4. Différenciation en réponse à la rhBMP-2 adsorbée ______________________________________ 117

6. Conclusions et perspectives ___________________________________________________ 118

4

Chapitre 5 Etude du potentiel ostéoinducteur des céramiques de BCP revêtues avec un dépôt d’apatite carbonatée nanocristalline avec ou sans rhBMP-2 chez l’animal___________________ 121

1. Introduction bibliographique _________________________________________________ 121 1.1. Les modèles animaux _____________________________________________________________ 121

1.1.1. Les modèles d’ostéoinduction par les BMPs ________________________________________ 121 1.1.2. Les modèles d’ostéoinduction par les matériaux _____________________________________ 122

1.2. Le site d’implantation _____________________________________________________________ 123 1.3. La taille de l’implant ______________________________________________________________ 124 1.4. Le temps d’implantation ___________________________________________________________ 124

2. Objectifs __________________________________________________________________ 125 3. Matériel et méthodes ________________________________________________________ 126

3.1. Implants________________________________________________________________________ 126 3.1.1. Les céramiques _______________________________________________________________ 126 3.1.2. Association avec la rhBMP-2 ____________________________________________________ 126

3.2. Implantations intramusculaires ______________________________________________________ 127 3.3. Etude histologique________________________________________________________________ 129 3.4. Etude statistique _________________________________________________________________ 134

4. Résultats __________________________________________________________________ 135 4.1. Observations générales ____________________________________________________________ 135 4.2. Inflammation et fibrose____________________________________________________________ 135 4.3. Comparaison de l’efficacité des échantillons – quantification de l’os néoformé (ostéoinduction) ___ 135

4.3.1. Implants intramusculaires 1 mois _________________________________________________ 135 4.3.1.1. Echantillons avec rhBMP-2 déposée ___________________________________________ 135 4.3.1.2. Echantillons sans rhBMP-2 __________________________________________________ 137 4.3.1.3. Evaluation quantitative______________________________________________________ 137

4.3.2. Implants intramusculaires 3 mois _________________________________________________ 138 4.3.2.1. Echantillons avec rhBMP-2 déposée ou adsorbée_________________________________ 138 4.3.2.2. Echantillons sans rhBMP-2 __________________________________________________ 139 4.3.2.3. Evaluation quantitative______________________________________________________ 140

5. Discussion _________________________________________________________________ 141 5.1. Effet ostéoinducteur de la rhBMP-2 __________________________________________________ 142 5.2. Effet ostéoinducteur du revêtement___________________________________________________ 143

6. Conclusions et perspectives ___________________________________________________ 146

Conclusions et perspectives générales_________________________________________ 148 1. Evaluation de la capacité de reconstruction osseuse en site orthotopique _____________ 149 2. Transfert industriel _________________________________________________________ 151 3. Etude des mécanismes d’ostéoinduction ________________________________________ 151

3.1. Etudes chez l’animal ______________________________________________________________ 152 3.2. Etudes in vitro ___________________________________________________________________ 153

Liste des publications et communications issues de ce projet ______________________ 156

Références_______________________________________________________________ 158

Chapitre 1

Introduction bibliographique générale

5

L’os est une structure dynamique qui possède la propriété de se renouveler et de se

reconstruire. Les capacités de régénération sont cependant limitées et il arrive dans certaines

circonstances qu’un comblement osseux soit nécessaire pour obtenir une reconstruction

complète de la zone lésée. C’est le cas notamment lorsque la taille de la zone à reconstruire

est importante (pseudarthrose, résection de tumeurs ou de kystes osseux, forte perte de

substance lors d’un traumatisme, …) ou lorsque la reconstruction est lente (union retardée,

maladie, patient agé…).

Pour faciliter la réparation de grandes pertes de substances, une greffe osseuse peut être

réalisée. L’autogreffe est considérée comme la référence du matériau de comblement. Sa

réalisation comporte cependant plusieurs inconvénients : le prélèvement du greffon

s’accompagne d’une augmentation de la douleur pour le patient, consécutive à l’opération, et

d’un fort risque de morbidité du site de prélèvement. La quantité et la qualité du tissu osseux

prélevé sont, d’autre part, variables et peuvent être insuffisantes chez les patients d’un âge

avancé ou malades (Dawson et al. 2008).

Des allogreffes, c'est-à-dire des greffes osseuses provenant d’un donneur différent, sont aussi

disponibles. Afin de limiter les problèmes d’histocompatiblité entre le donneur et le receveur

et les risques de transmissions virales, ces greffons sont classiquement stérilisés par radiations

gamma. Après stérilisation, les propriétés mécaniques et biologiques de ces greffons peuvent

cependant être altérées et leur potentiel de reconstruction, plus limité que celui des autogreffes

en raison de l’absence de cellules vivantes, ne permet pas en général un remplacement total

du substitut par de l’os néoformé (Nguyen et al. 2007).

Avec le prolongement de la durée de vie notamment, la demande de substituts osseux est en

constante augmentation et ce domaine représente donc un marché économique important. En

raison des difficultés rencontrées par l’utilisation de greffes osseuses, les orthopédistes et

dentistes se tournent de plus en plus vers l’utilisation de matériaux de comblement

synthétiques ou d’origine naturelle contrôlée. Plusieurs types de matériaux sont, en effet,

disponibles : éponges de collagène, polymères synthétiques ou naturels, bioverres, composés

phosphocalciques, matériaux composites (Rezwan et al. 2006, Kokubo 2008).

Mais les matériaux commercialisés à l’heure actuelle présentent au mieux des propriétés

ostéoconductrices, c'est-à-dire qu’ils possèdent la capacité de favoriser la croissance osseuse

lorsqu'ils sont au contact d'un os (Jarcho 1981). Ces propriétés ostéoconductrices sont

cependant insuffisantes pour soutenir la reconstruction complète de larges pertes de substance

dans lesquelles le contact os-matériau ne se fait qu’aux extrémités de la zone à reconstruire.

6

Il apparaît donc essentiel d’élaborer de nouvelles catégories de matériaux possédant des

capacités de reconstruction du tissu osseux sans contact direct avec l’os ; les matériaux

ostéoinducteurs ont ce potentiel. L’ostéoinduction, contrairement à l’ostéoconduction, est un

processus biologique qui induit une différenciation de cellules progénitrices en ostéoblastes.

Dans ce cas, la croissance osseuse pourra avoir lieu dans l’ensemble du matériau, ce qui

augmente l'efficacité de la reconstruction. Plusieurs stratégies envisagées s’inspirent des

processus d'ossification et visent à les reproduire en partie (De Bruijn et al. 2008).

1. L’os

L’os est un tissu conjonctif dynamique soumis à un renouvellement régulier, appelé

remodelage, et qui possède la capacité de se régénérer lorsqu’il est endommagé. Il est

composé d’une matrice extracellulaire minéralisée et de cellules qui participent à son

remodelage et à sa réparation.

1.1. La matrice extracellulaire

La matrice extracellulaire osseuse est composée d’une matrice organique, de minéral et d’eau

qui représentent respectivement 30, 60 et 10% de la masse osseuse.

1.1.1. La matrice organique

La matrice organique est composée essentiellement de fibres de collagènes (90%) qui sont

associées entre elles et constituent l’architecture du tissu osseux. Le collagène de type I est

largement majoritaire mais d’autres types de collagènes ont été détectés (les collagènes de

type V et III) et participent à l’organisation de cette matrice (Niyibizi et al. 1994). Cette

structure collagénique assure la visco-élasticité de l’os alors que le minéral qui se dépose à la

surface et entre les fibres de collagène (parallèlement à celles-ci) est responsable de la rigidité

du tissu. L’orientation et la composition de ces fibres, qui régulent la quantité et l’orientation

du minéral déposé, conditionnent donc la résistance mécanique du tissu osseux (Viguet-Carrin

et al. 2006).

Des protéines non-collagéniques sont, par ailleurs, incluses dans la matrice et peuvent

participer à la formation d’os et à sa régulation. Ces protéines sont nombreuses et assurent des

fonctions variées. Plusieurs d’entre elles jouent un rôle sur l’organisation de la matrice et sa

minéralisation (protéoglycanes, sialoprotéine osseuse, ostéocalcine, ostéopontine,

7

ostéonectine, phosphatase alcaline (ALP)…). D’autres peuvent avoir une action - directe ou

indirecte - sur l’activité des ostéoblastes et/ou des ostéoclastes (protéoglycanes, Bone

Morphogenetic Proteins (BMPs), osteoprotégérine…). Des protéines caractéristiques du

remodelage osseux (Tartrate-resistant acid phosphatase : TRAP) et de la vascularisation

(Vascular Endothelial Growth Factor : VEGF) sont aussi présentes (Schmidmaier et al. 2006,

Lamoureux et al. 2007, Schreiweis et al. 2007).

1.1.2. Le minéral osseux

Comme nous l’avons indiqué, la matrice extracellulaire osseuse est minéralisée. Cette

minéralisation assure la rigidité du tissu osseux et participe activement à l’homéostasie du

calcium de l’organisme. Le minéral osseux sert en effet de réservoir d’ions.

Le minéral osseux est composé de fines plaquettes d’apatite de taille nanométrique qui se

déposent parallèlement aux fibres de collagène (Kuhn et al. 2008). Longtemps considéré

comme de l’hydroxyapatite substituée, le minéral osseux correspond en fait à une apatite

carbonatée déficiente en ions calcium et hydroxyde. La composition moyenne du minéral

osseux peut être représentée par la formule chimique suivante (Legros et al. 1986) :

Ca8,3�1,7(PO4)4,3(HPO4 et CO3)1,7(OH et/ou 1/2 CO3)0,3�1,7

Une caractéristique majeure des apatites biologique est la présence d'environnements ioniques

qui n'existent pas dans les apatites bien cristallisées. Ces environnements ont été attribués à la

présence en surface des cristaux d’une couche hydratée bien organisée, mais labile, contenant

des ions minéraux (environnements des ions CO32-, HPO4

2- et PO43- notamment) (Rey et al.

1989, Eichert et al. 2002). Cette couche hydratée, qui évolue au cours du temps, serait

responsable de la très grande réactivité de surface des apatites biologiques. Ces apatites

présentent de très fortes capacités d’échanges ioniques et d’adsorption de protéines, ce qui

leur permet d’interagir facilement avec les fluides biologiques. Ces propriétés pourraient être

liées à la présence de cette couche hydratée, qui contient des espèces ioniques relativement

mobiles et facilement échangeables (Figure I.1) (Ouizat et al. 1999, Cazalbou 2000). Une

description plus complète des caractéristiques du minéral est faite dans la partie

bibliographique du chapitre 2.

8

Figure I.1 : Schéma de la couche hydratée en surface des nanocristaux. Les ions présents dans la couche hydratée peuvent être facilement échangés avec les ions présents en solution et participer à l’adsorption de protéines (Pr) à la surface des cristaux.

1.2. Les cellules de l’os et le remodelage osseux

Le maintien du capital osseux est assuré par deux types cellulaires, les ostéoblastes qui sont

les cellules formatrices de l’os et les ostéoclastes qui le dégradent. Deux autres types

cellulaires qui correspondent à des ostéoblastes différenciés, les ostéocytes et les cellules

bordantes de l’os, sont présents dans l’os et ont un rôle majeur dans la régulation de ces

phénomènes. Toutes ces cellules agissent de manière coordonnée lors du remodelage osseux

(Matsuo et al. 2008).

• Les ostéoblastes

Les ostéoblastes sont issus de cellules souches mésenchymateuses, situées notamment dans la

moelle osseuse, et sont responsables de la formation de l’os. Lors de leur différenciation, les

pré-ostéoblastes, qui deviennent progressivement des ostéoblastes matures, expriment

différents facteurs (phosphatase alcaline, collagène de type I, ostéopontine, ostéocalcine,

sialoprotéine osseuse) qui participent à la formation du tissu ostéoïde (la matrice organique de

l’os) puis à sa minéralisation. Les ostéoblastes matures peuvent se différencier en ostéocytes,

en cellules bordantes de l’os ou être éliminés par apoptose (mort cellulaire programmée).

• Les ostéocytes Les ostéocytes sont des ostéoblastes qui sont totalement différenciés et sont entourés de

matrice minéralisée. Ils sont incapables de proliférer mais participent activement à l’initiation

et à la régulation du remodelage osseux, notamment par leur action de mécanosenseurs.

9

• Les cellules bordantes de l’os Les cellules borbantes de l’os sont des ostéoblastes différenciés, aplatis, qui recouvrent la

surface de l’os. Leur fonction consiste à protéger la matrice osseuse contre l’action des

ostéoclastes. Lors du remodelage osseux, ces cellules sécrètent des collagénases qui dégradent

le tissu ostéoïde, découvrant donc la matrice minéralisée et participent à l’activation des

ostéoclastes.

• Les ostéoclastes Les ostéoclastes sont des cellules multinucléées issues de progéniteurs hématopoïétiques aussi

présents dans la moelle osseuse. Les précurseurs hématopoïétiques expriment le récepteur

RANK (Receptor Activator of Nuclear factor κB) à leur surface puis fusionnent sous

l’activation du ligand (RANKL), ce qui conduit à la formation de cellules multinucléées

actives. Les ostéoclastes matures sont des cellules polarisées capables de dégrader la matrice

osseuse minéralisée par la libération d’enzymes (cathepsine K) et d’acide chlorhydrique.

Le remodelage osseux peut être divisé en trois phases : initiation, transition, terminaison

(Figure I.2)

Figure I.2 : Le remodelage osseux. Les ostéoclastes sont en rouge et les ostéoblastes en bleu. Lors de la phase d’initiation, les précurseurs hématopoïétiques sont recrutés au niveau du site à remodeler. La différenciation des ostéoclastes est induite par les cellules bordantes de l’os qui expriment des ligands des ostéoclastes tels que RANKL. Ceci entraine la fusion des précurseurs ostéoclastiques qui deviennent multinucléés et entament la résorption de l’os. La phase de transition correspond au passage de la résorption vers la formation osseuse. Celle–ci comprend le recrutement de cellules progénitrices et leur différenciation ostéoblastique alors que les ostéoclastes partent en apoptose. Ces évènements sont susceptibles d’être régulés par différents facteurs sécrétés, des liaisons directes entre ostéoclastes et ostéoblastes ou la libération de facteurs contenus dans la matrice lors de sa dégradation. Lors de la phase de terminaison, l’os est reformé, minéralisé puis protégé par les cellules bordantes de l’os (Matsuo et al. 2008).

10

2. Les matériaux de comblement osseux

De nombreux types de matériaux peuvent être utilisés comme substituts osseux. Leur nature,

leur composition, leur formulation et leurs propriétés sont diverses. Différents types de

matériaux de comblement sont déjà commercialisés et utilisés en orthopédie ou chirurgie

dentaire. Quelques exemples de substituts osseux commercialisés sont mentionnés dans le

tableau I.1.

Tableau I.1 : Types de matériaux de comblement commercialisés (LeGeros 2002, Ge et al. 2008, Kokubo 2008).

Catégorie Exemples Noms commerciaux

Polymères naturels Collagène Healost® (Orquest) Apcoll® (Devro Medical Corp.)

Polymères synthétiques

Poly(α-hydroxy acids) (Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA))

Trugraft® (osteobiologics) Peek-Classix® (Invibio)

Bioverres Bioglass® (US Biomaterials Corp.)

Biocéramique d’alumine Biolox® (CeramTec) Biocéramiques diverses

Zircone Prozyr® (St-Gobain Advanced ceramics Desmarquest)

Hydroxyapatite (HA) naturelle ou synthétique

Interpore® et Pro-Osteon® (InterPore Int) Endobon® (Merk) Calcitite® (Calcitek) Osteograf® (Ceramed)

Phosphate tricalcique-β (β-TCP) TRIHA+® (Teknimed) Vitoss® (Orthovita, Inc)

Céramiques phosphocalciques

Phosphate de calcium biphasique (BCP) (HA/β-TCP)

CERAFORM® (Teknimed) Triosite® (Zimmer, Ind.) MBCP® (Biomatlande)

Phosphocalciques

CEMENTEK® (Teknimed) BoneSource® (Stryker, Inc.) Biobon® (ETEX, Inc.) Norian SRS® (Synthes) Ciments

Polymères (Polyméthyl-méthacrylate)

Cortoss® (Orthovita, Inc.) CEMFIX® (Teknimed)

Collagène d’origine naturelle + HA ou BCP

Collapat II® (BioMet, Inc) Collagraft® (Zimmer, Inc)

Fibrine Glue + BCP Tricos® (Baxter BioSciences BioSurgery)

Matériaux composites

Polymère synthétique + BCP MBCP Gel® (Biomatlande France)

11

2.1. Les céramiques phosphocalciques

De par leur composition ionique proche de celle du minéral osseux et leurs bonnes propriétés

ostéoconductrices, les céramiques phosphocalciques constituent une catégorie de matériaux

très souvent utilisée pour le comblement de perte de substance osseuse. Ces céramiques sont

en général à base d’hydroxyapatite et/ou de phosphate tricalcique-β. Ces céramiques peuvent

comporter une phase unique de l’un de ces deux composés ou un mélange des deux (BCP)

avec des rapports variables. Elles peuvent se présenter sous différentes formes (pastilles

denses, blocs ou granulés poreux).

2.1.1. L’hydroxyapatite (HA)

L’hydroxyapatite (HA) fait partie de la famille des apatites qui sont des composés minéraux

dont la principale caractéristique est leur capacité à admettre un grand nombre de substitutions

et de lacunes ioniques. Les apatites stoechiométriques sont en général représentées par la

formule chimique :

Me10(XO4)6Y2

Où Me est un métal bivalent, XO4 un anion trivalent et Y un anion monovalent.

L’hydroxyapatite stoechiométrique est donc représentée par la formule Ca10(PO4)6(OH)2.

La synthèse de l’hydroxyapatite est en général effectuée par précipitation en conditions

basiques puis frittage à une température excédant les 1000°C.

L’HA stoechiométrique est caractérisée par son rapport Ca/P de 1,67. Son analyse par

spectroscopie infrarouge montre des bandes caractéristiques attribuées aux ions OH- et au

groupement phosphate ; et son diagramme de diffraction des rayons X correspond à une

structure hexagonale (groupe P63/m) avec les paramètres de maille : a = 0,9422 nm et c =

0,688 nm (LeGeros 2002).

2.1.2. Le phosphate tricalcique-β (β-TCP)

Le phosphate tricalcique-β a pour formule chimique : Ca3(PO4)2. Il est caractérisé par un

rapport Ca/P de 1,5. Il est de structure rhomboédrique (groupe R3c) et a pour paramètres de

mailles : a = b = 1,0439 nm et c = 3,7375 (pour la maille multiple hexagonale).

Sa préparation se fait par frittage à haute température d’apatite déficiente en calcium de

rapport Ca/P de 1,5 ou par réaction solide-solide à haute température. Les températures de

frittage sont en général comprises entre 1000 et 1250°C (Rey et al. 2008).

12

2.1.3. Les phosphates de calcium biphasiques (BCP)

Des céramiques biphasiques contenant un rapport HA/β-TCP variable sont également

synthétisées. Pour cela, une apatite déficiente en calcium précipitée avec un rapport compris

entre 1,5 et 1,67 est frittée à haute température. En fonction du rapport Ca/P du composé

initial, la céramique obtenue aura un rapport HA/β-TCP défini. La deuxième technique de

fabrication consiste à mélanger des poudres d’hydroxyapatite et de β-TCP dans le rapport

souhaité avant frittage.

Les céramiques de BCP les plus couramment utilisées ont un rapport HA/β-TCP de l’ordre de

60/40 ou 80/20.

2.1.4. Les apatites analogues au minéral osseux

Ces céramiques frittées à haute température ne sont pas parfaitement comparables au minéral

osseux, notamment en ce qui concerne leur réactivité de surface (Gautier et al. 1998). Il est

cependant possible de synthétiser de vrais analogues du minéral osseux. Ces composés

possèdent les caractéristiques des apatites biologiques au niveau de la taille des cristallites, de

la composition et de la présence d’une couche hydratée à leur surface. Ces analogues du

minéral osseux sont par conséquent très réactifs (Cazalbou 2000). Le développement de

substituts osseux biomimétiques à partir de ces apatites est envisagé mais plusieurs problèmes

techniques devraient d’abord être surmontés, notamment en ce qui concerne la mise en forme

et la résistance mécanique de tels matériaux.

3. Caractéristiques des substituts osseux

En vue de leur utilisation en clinique, les substituts osseux doivent répondre à certains

critères. Ces caractéristiques définissent l’efficacité du matériau de comblement.

3.1. Biocompatibilité

La biocompatibilité des substituts employés est primordiale. Ces matériaux ainsi que leurs

produits de dégradation ne doivent pas, en effet, présenter de cytotoxicité ni s’accompagner

d’une forte réaction inflammatoire.

De par leur nature, les matériaux phosphocalciques et leurs produits de dégradation (calcium,

phosphate) sont parfaitement assimilables par l’organisme et participent même à la

13

régénération osseuse. Que ce soit in vitro ou in vivo, la majorité de ces matériaux présentent

une très bonne biocompatibilité. L’implantation de céramiques d’HA, de β-TCP ou de BCP

chez l’animal s’accompagne d’une bonne apposition d’os à la surface des matériaux, sans

présence de réaction inflammatoire (Jarcho 1981). Dans de rares cas, une dissolution trop

importante des matériaux s’accompagne d’une cytotoxicité et par suite, d’un manque

d’efficacité. De telles observations ont pu être faites pour des céramiques d’α-TCP (Yuan et

al. 2001a).

3.2. Résistance mécanique

Les substituts osseux peuvent être soumis à des efforts mécaniques importants similaires à

ceux que l’os doit supporter. Il est donc important que ces matériaux présentent de bonnes

propriétés mécaniques afin d’éviter leur effritement ou leur fracture lors de la mise en place

durant l'opération chirurgicale ou au moment de la mise en charge.

La résistance mécanique des substituts osseux est dépendante principalement de leur

composition, de leur mode de fabrication et de leur morphologie.

L’hydroxyapatite dense possède une forte résistance à la traction ou à la compression avec des

valeurs supérieures ou comparables à celle de l’os cortical. Sa résistance à la traction est

comprise entre 79 et 106 MPa contre 69 à 110 MPa pour l’os cortical (LeGeros 2002) et sa

résistance à la compression peut atteindre 400 MPa contre 100 à 200 MPa pour l’os cortical

(Rezwan et al. 2006).

Cependant, la présence nécessaire de pores interconnectés dans les matériaux employés

diminue de manière drastique leurs propriétés mécaniques. Les valeurs obtenues, très

variables en fonction du type de céramique phosphocalcique étudié, sont de l’ordre de 50

MPa pour la résistance à la traction et inférieures à 10 MPa pour la résistance à la

compression (LeGeros 2002, Dellinger et al. 2006).

3.3. La porosité

La morphologie des substituts osseux est un paramètre majeur qui conditionne leur efficacité.

Il est en effet nécessaire que le matériau contienne des pores interconnectés. Il a été montré

que deux gammes de porosités doivent être présentes pour assurer une bonne reconstruction

osseuse :

14

• Une macroporosité La macroporosité correspond en général à des pores de diamètre supérieur à 100 µm, et

classiquement compris entre 300 et 600 µm. La présence de ces macropores assure

l’envahissement du matériau par les cellules ainsi que la mise en place de la vascularisation

permettant un apport des fluides biologiques nécessaires à la survie et à la différenciation

cellulaire. Une porosité minimale de 40-70 µm est indispensable pour l’envahissement de

vaisseaux et la formation d’os. Klenke et al. ont montré que la taille des macropores était

directement corrélée à la quantité d’os et au nombre de vaisseaux formés après implantation

de céramiques de BCP sur des crânes de rats. Les valeurs obtenues sont significativement plus

importantes pour des gammes de porosités supérieures à 140 µm et augmentent avec la taille

des pores (Klenke et al. 2008).

• Une microporosité La présence de mésopores de diamètre inférieur à 10 µm – communément appelées

micropores dans le domaine des biomatériaux – joue par ailleurs un rôle important dans

l’efficacité de reconstruction de ces matériaux, notamment sur leurs propriétés

ostéoconductrices et/ou ostéoinductrices. Il a été évoqué que ces micropores étaient

susceptibles de jouer un rôle à plusieurs niveaux : augmentation de la surface spécifique des

matériaux, création d’un microenvironnement à l’intérieur de ces pores, augmentation de la

rugosité, augmentation de la résorbabilité. Ces différents paramètres, associés à la réactivité

du matériau, pourraient donc avoir une influence sur la bioactivité du matériau ou ses

capacités d’adsorption (Habibovic et al. 2008, Zhu et al. 2008).

La porosité des matériaux est contrôlée par leur mode de fabrication. En général, la

macroporosité et la microporosité peuvent être assurées par l’utilisation de moules poreux ou

l’intégration d'agents porogènes qui vont être dégradés à haute température (frittage de

céramiques par exemple). Les porosités peuvent aussi être obtenues simplement par le frittage

de billes calibrées ou encore par dissolution de l'agent porogène ajouté (pour la préparation de

polymères poreux par exemple). Dans le cas des céramiques phosphocalciques, la

microporosité est aussi corrélée à la température de frittage : plus la température de frittage est

faible, plus la microporosité sera importante (Wilson et al. 2006).

15

3.4. Biorésorbabilité

La biorésorbabilité est un facteur important : Elle va déterminer la vitesse à laquelle le

matériau va être dégradé in vivo par les phénomènes de dissolution spontanés et par l’action

des ostéoclastes. Celle-ci doit être contrôlée pour obtenir une dégradation directement

corrélée dans le temps à la formation d’os : Le matériau doit, en effet, être en mesure de se

dégrader pour permettre le remplacement progressif de la céramique par l’os néoformé mais

une dégradation trop rapide peut être responsable de la perte de l’intégrité de la structure de la

céramique qui ne pourra donc plus soutenir la croissance osseuse.

La biorésorbabilité est dépendante des caractéristiques physico-chimiques des matériaux.

La composition chimique du matériau conditionne son degré de solubilité et donc sa vitesse

de dégradation. Il est généralement considéré que la biodégradabilité est liée au produit de

solubilité du matériau. L’HA stœchiométrique est définie par de nombreux auteurs comme un

matériau non résorbable. Son produit de solubilité est, en effet, très faible. Au contraire, le

β-TCP a un produit de solubilité beaucoup plus grand que celui de l’hydroxyapatite (si on le

rapporte au même nombre d'ions phosphate dans de l’eau à 25°C) et peut être plus facilement

dissout à pH acide. La combinaison d’HA et de β-TCP pour former les céramiques mixtes de

BCP a pour objectif principal de contrôler leur vitesse de résorption. Ces céramiques mixtes

ont une résorbabilité intermédiaire et sont capables d’être dégradées entièrement pour être

remplacées par la matrice osseuse.

La vitesse de dissolution des céramiques peut être modifiée par différents facteurs dont la

taille des cristallites et la porosité du matériau (LeGeros 2002). La présence de micropores

permet d’augmenter la surface spécifique des matériaux et donc leur vitesse de dissolution et

leur dégradation à composition chimique et produit de solubilité identiques (Dellinger et al.

2006, Wilson et al. 2006).

3.5. Bioactivité

Les matériaux bioactifs possèdent la propriété unique de créer un contact direct avec l’os sans

formation de chape fibreuse augmentant de ce fait leur potentiel d’intégration. Cette capacité

réside dans la possibilité pour ces biomatériaux de précipiter à leur surface une apatite

nanocristalline, similaire au minéral osseux, au contact des fluides biologiques (Takadama et

al. 2008).

16

La formation de cette phase apatitique se fait en plusieurs étapes : 1) existence d’un

environnement sursaturé en ions calcium et phosphate ; 2) précipitation à la surface du

matériau d’une apatite nanocristalline carbonatée ; 3) association puis incorporation de cette

phase avec la matrice organique de l’os nouvellement formé. La première étape est réalisée

naturellement et les fluides biologiques au contact d'un implant sont sursaturés par rapport

aux apatites nanocrystallines susceptibles de se former. On considère que le produit ionique

du sérum est proche du produit de solubilité du phosphate Octacalcique (OCP) (Eidelman et

al. 1987). La deuxième étape dépend des propriétés de nucléation de la surface, elle est

particulièrement importante pour l'hydroxyapatite et d'autres phosphates de calcium

susceptibles de favoriser la croissance epitactique de cristaux d'apatite. Cependant, cette

capacité d'une surface à favoriser la germination d'une phase apatitique peut être exaltée par la

libération d'ions minéraux du biomatériau lui-même. Ainsi, la bioactivité des bioverres est

attribuée à leur capacité à libérer du calcium dans leur environnement immédiat et favoriser

ainsi localement la précipitation de phosphate de calcium. Deux autres ions peuvent

contribuer à cet effet, les phosphates et les ions OH- par leur effet sur le pH local, et certains

biomatériaux utilisent aussi ces propriétés. La troisième étape est plus complexe et elle

implique de nombreux paramètres physico-chimiques et biologiques. Parmi les paramètres

physico-chimiques, il faut mentionner la vitesse de croissance des cristaux, l’inhibition de la

croissance et de la germination par des protéines ou des ions (Mg, carbonates,

pyrophosphates, citrates ...), la diffusion de ces groupements vers le front de minéralisation.

Les paramètres biologiques concernent, notamment l'adhésion, la prolifération, la

différenciation et la minéralisation des ostéoblastes, qui dépendent fortement de la surface du

biomatériau et de certains ions minéraux en solution (notamment calcium et phosphate) (cf.

paragraphe I.5.1). Tout comme le minéral osseux, la phase apatitique nanocristalline

néoformée est très réactive et elle possède des capacités importantes d’échange ionique et

d’adsorption de protéines. Il a, par ailleurs, été suggéré que des protéines issues des fluides

environnants pourraient être co-précipitées et donc incluses dans cette couche apatitique lors

de sa formation.

La bioactivité de matériaux a été montrée pour la première fois par Hench et al. qui ont

remarqué la formation de cette couche apatitique sur leur bioverre (Hench et al. 1972).

Kokubo et al. ont ensuite montré que la bioactivité d’un matériau pouvait être évaluée in vitro

par immersion à 37°C du matériau dans une solution de SBF (simulated body fluid) qui

reproduit la composition ionique du plasma sanguin. Dans ces conditions, seuls les matériaux

17

bioactifs ont la capacité d’induire la nucléation-croissance de cette phase apatitique à leur

surface (Kokubo 1991).

La présence de sites de nucléation et un accroissement de la sursaturation en ions calcium

et/ou phosphate à la surface du matériau sont deux mécanismes permettant d'induire la

formation de cette apatite similaire au minéral osseux (Duan et al. 2004).

La plupart des céramiques à base de phosphates de calcium sont bioactives à des degrés

variables. La microporosité de ces matériaux semble jouer un rôle important dans ce

phénomène : cette microporosité augmente la surface spécifique des échantillons et donc le

nombre de sites de nucléation. Il a, d’autre part, été suggéré qu'elle pourrait permettre

d’obtenir un micro-environnement favorable pour une sursaturation en ions calcium et

phosphate (Duan et al. 2004).

3.6. Ostéoconduction

L’ostéoconduction est définie actuellement comme la capacité d’un matériau à permettre une

croissance osseuse lorsqu'il est au contact ou à proximité d'un os (Jarcho 1981). Le matériau

doit être en mesure d’accueillir les précurseurs ostéoblastiques qui migrent de la moelle

osseuse et d’assurer leur prolifération puis leur différenciation en ostéoblastes. D’un point de

vue pratique, l’ostéoconduction est mesurée après implantation d’un matériau dans un site

osseux. Il s’agit, en général, d’études comparatives qui mettent en évidence le potentiel

ostéoconducteur d’un matériau par rapport à un autre. Les évaluations effectuées peuvent être

histologiques, avec la mesure de la formation d’os formé et de la vascularisation, ou

mécaniques, avec des mesures de la force de la liaison os-matériau (Nakamura et al. 2008).

La composition chimique et la topographie de surface des échantillons ont une forte influence

sur l’ostéoconduction. Le contact os-implant et la résistance aux tests mécaniques d’implants

en titane apparaissent, en effet, significativement accrues en présence d’un revêtement d’HA,

bioactif, à leur surface ou d’une rugosité importante, susceptible de stimuler la différenciation

et la minéralisation des ostéoblastes (Goldberg et al. 1995, Moroni et al. 2008). En outre, bien

qu’elle n’apparaisse pas indispensable dans l’initiation du phénomène, la présence d’une

macroporosité favorise l’ostéointégration des matériaux (Takemoto et al. 2005).

Les céramiques phosphocalciques présentent de très bonnes propriétés ostéoconductrices et

leur capacité est déterminée par leurs caractéristiques et notamment leur composition

chimique et leur microporosité. L’implantation dans des fémurs de chien de céramiques de

BCP (HA/β-TCP : 62/38) montre une ostéointégration plus précoce et une quantité d’os

18

néoformé supérieure à tous les temps de l’étude par rapport à des échantillons d’HA (de

porosité similaire) (Yuan et al. 2006a).

Wilson et al. ont, par ailleurs, étudié de manière combinée les effets de la composition et de la

microporosité sur le potentiel ostéoconducteur des céramiques phosphocalciques. Ils ont

comparé la formation d’os après implantation dans le rachis lombaire de chèvres

d’échantillons de β-TCP, d’HA et BCP (HA/β-TCP : 80/20) qui ont été frittés à des

températures variables, et donc qui présentent des microporosités différentes. Ils ont ensuite

classé les échantillons par rapport à leur potentiel ostéoconducteur : BCP frittées à faible et

moyenne température (rugueuses et lisses) = β-TCP > HA frittée à faible température > BCP

frittée à haute température (rugueuses et lisses) > HA frittée à haute température. Au vue des

résultats obtenus, ils indiquent que le paramètre qui déterminerait le potentiel ostéoconducteur

serait la bioactivité des céramiques reliée à leur vitesse de dissolution (Wilson et al. 2006).

Dans une de leur étude, Habibovic et al. ont obtenus des résultats comparables après

implantation en site orthotopique de différents phosphates de calcium : L’HA, l’apatite

carbonatée et des céramiques de BCP dépourvues de micropores induisent peu de formation

osseuse alors que celle-ci est très importante pour des échantillons de BCP microporeux

(Habibovic et al. 2008).

Habibovic et al. confirment par ailleurs dans ce travail que les matériaux phosphocalciques

ont non seulement des propriétés ostéoconductrices mais aussi, dans certains cas, des

propriétés ostéoinductrices (Habibovic et al. 2008). Les propriétés ostéoinductrices des

matériaux phosphocalciques seront détaillées dans le paragraphe suivant.

4. L’ostéoinduction

Les matériaux ostéoconducteurs ont de bonnes capacités de reconstruction lorsque qu’un

contact direct entre l’os et le matériau est possible et que la zone à reconstruire est petite. Ils

sont en revanche peu efficaces pour la régénération de larges pertes de substance osseuse

(Johnson et al. 1996). Dans ces situations, il est nécessaire d’utiliser des substituts osseux qui

permettent la différenciation ostéoblastique de cellules progénitrices (endogènes ou exogènes)

et assure donc l’ostéogenèse dans l’ensemble du matériau. Deux grands domaines d’études

concernent la recherche et le développement de tels matériaux. L’ingénierie tissulaire, d’une

part, s’intéresse à l’élaboration de stratégies et méthodes efficaces pour associer des cellules

progénitrices issues du patient sur des matériaux qui permettent leur différenciation

19

ostéoblastique. L’implantation de ces cellules a pour but d’initier et soutenir la formation

osseuse et la vascularisation au sein de l’implant (Dawson et al. 2008, Grellier et al. 2009).

Le second domaine d’investigation concerne le développement de matériaux ostéoinducteurs :

il s’agit de matériaux qui sont capables d’accueillir les cellules progénitrices de l’hôte et

d’induire leur différenciation ostéoblastique.

L’ostéoinduction reproduit les mécanismes classiques de l’ostéogenèse : 1) migration de

cellules souches progénitrices, 2) différenciation de ces cellules et ossification endochondrale

ou intramembranaire avec la formation de vaisseaux, 3) production de la moelle osseuse et 4)

mise en place du remodelage osseux (De Bruijn et al. 2008).

Les méthodes les plus étudiées à l’heure actuelle pour élaborer des matériaux ostéoinducteurs

sont les suivantes :

- Association d’un matériau avec des facteurs de croissances ou leur séquence

d’ADN codante. La combinaison de protéines de la famille des BMPs – la BMP-2

et la BMP-7 notamment – avec des substituts osseux est particulièrement étudiée en

raison de son efficacité (Saito et al. 2003).

- Développement de matériaux capables à eux seuls d’assurer ces processus

d’ostéoinduction (Habibovic et al. 2007).

4.1. L’ostéoinduction par les BMPs

En 1965, Urist a mis en évidence que l’implantation intramusculaire de matrice osseuse

déminéralisée (Demineralized Bone Matrix, DBM) s’accompagnait d’une formation d’os chez

la souris, le rat, le lapin et cochon. Il a montré que cette ostéogenèse se produisait à l’intérieur

des cavités de l’implant et que les nouveaux ostéoblastes provenaient de cellules pluripotentes

de l’hôte (Urist 1965). Avec ses collaborateurs, Urist a ensuite pu associer ce phénomène

d’ostéoinduction à la présence de Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) dans la matrice

déminéralisée (Urist et al. 1967).

Depuis, l’ostéoinduction médiée par les BMPs a largement été étudiée. Ces facteurs de

croissance, seuls ou associés à des matériaux, sont capables d’initier la formation d’os dans

des sites ectopiques, c'est-à-dire après implantation sous-cutanée ou intramusculaire, dans

différents modèles animaux : souris, rat, lapin, chien, chèvre, singe, babouin (Miyamoto et al.

1993, Yuan et al. 1998, Boyan et al. 1999, Ripamonti et al. 2001, Yuan et al. 2001c, Liu et al.

2005, Kempen et al. 2009).

20

4.1.1. Les BMPs

4.1.1.1. Structure

Les BMPs font partie de la superfamille du TGF-β (Transforming-Growth factor-β) et plus

d’une vingtaine de BMPs ont déjà été répertoriées. Les BMPs sont des dimères – homo- ou

hétéro-dimères – d’environ 30 à 40 KDa. Elles sont synthétisées sous la forme de deux grands

précurseurs qui subissent un clivage protéolytique avant de se dimériser. La dimérisation et la

conformation finale de la protéine sont assurées par la présence de 7 résidus cystéines dans

chaque momonère.

Sebald et al. ont caractérisé la structure de la BMP-2 recombinante humaine homodimérique

(Scheufler et al. 1999). Après glycosylation et clivage protéolytique des pro-protéines de 453

acides aminés, les deux résidus C-terminaux de 114 acides aminés s’homodimérisent. Le

dimère obtenu a une structure globulaire et symétrique de dimension 70 Å x 35 Å x 30 Å

(Figure I.3). La structure de chaque monomère est stabilisée par les trois ponts disulfures

intrachaines formés entre 6 résidus cystéines (Cys43, Cys47, Cys111, Cys 113, Cys14 et Cys

79). Une stabilisation supplémentaire de la structure de la BMP-2 est obtenue par sa

dimérisation via un pont disulfure entre les résidus Cys78 de chaque monomère. La protéine

contient une large zone hydrophobe qui pourrait expliquer son profil de solubilité particulier :

son degré de solubilité est faible dans les conditions physiologiques mais peut être largement

augmenté par une force ionique importante. La région positive dans la cavité I, liées à un

cluster d’acides aminés basiques au niveau de la queue N-Terminale est particulière à la

BMP-2 et pourrait correspondre au site de liaison de la protéine avec l’héparine (Ruppert et

al. 1996).

Figure I.3 : Représentation de la surface de la rhBMP-2 accessible aux solvants. Les régions hydrophobes sont en blanc, les régions chargées négativement en rouge et les zones chargées positivement en bleu (Scheufler et al. 1999).

21

4.1.1.2. Production par génie génétique

Les BMPs les plus utilisées comme agent ostéoinducteur dans le domaine des biomatériaux

sont les BMP-2 et BMP-7 (ou osteogenic Protein-1 : OP-1) recombinantes humaines (rhBMP-

2 ou -7). Il est, en effet, possible d’utiliser le génie génétique pour produire en grande

quantités des protéines qui ont la même séquence d’acides aminés que celle de la protéine

humaine. Cette protéine recombinante peut être produite dans un modèle eucaryote tel que les

CHO (chinese hamster ovarian) conduisant à la protéine BMP-2 glycosylée. Elle peut, en

outre, être produite dans un modèle procaryote (E.coli) sans modification post-traductionnelle

(obtention de BMP-2 non-glycosylée). Dans les deux cas, la BMP-2 produite possède de

fortes capacités ostéoinductrices, même si la forme glycosylée reste plus efficace in vitro.

4.1.1.3. Rôle des BMPs dans l’ostéogenèse

Les BMPs sont des facteurs clé dans l’ostéogenèse que ce soit lors du développement

embryonnaire ou chez l’adulte, du remodelage osseux ou de la réparation de fractures. Parmi

les BMPs connues, l’importance des BMP -2, -4 et -7, plus précisement, dans ces phénomènes

a pu être mis en évidence par le développement de souris invalidées (knock-out (KO) ou

Conditional-knock-out (CKO)) (Tableau II.2) et par des études effectuées in vitro (Cao et al.

2005).

Tableau II.2 : Phénotypes des souris invalidées ou mutées pour les BMP -2, -4 et -7 (Cao et

al. 2005).

Gènes Mutations Promoteurs Phénotypes

Bmp4 CKO Collα1 Développement osseux imparfait

Bmp2/4 KO Souris non viables

Bmp2/4 CKO Prx-1 Développement osseux imparfait

Bmp7 KO Imperfections mineures dans l’os

Ces BMPs peuvent avoir des influences variées sur les différents types cellulaires impliqués

dans les processus d’ostéogenèse. Leur rôle apparaît majeur tant dans l’initiation du

phénomène que dans sa régulation :

• Effet sur la migration cellulaire Les BMPs ont, à des concentrations de l’ordre du fentomolaire, un effet chimioattractant sur

différents types cellulaires potentiellement impliqués dans l’ostéogenèse.

22

Il a été montré que la BMP-2 bovine induisait la migration de monocytes et initiait

l’expression de TGF-β, facteur qui intervient à son tour dans la migration de cellules souches

mésenchymateuses et d’ostéoblastes, et qui participe à leur prolifération et différenciation

ostéoblastique (Cunningham et al. 1992). Les BMP-2, -4, et -7 peuvent, par ailleurs, avoir un

effet direct sur la migration de cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSCs) et

d’ostéoblastes plus matures ; cet effet chimio-attractant apparaît inversement corrélé à l’état

de différenciation de ces cellules (Fiedler et al. 2002, Lee et al. 2006).

• Engagement des cellules souches vers la voie chondro/ostéoblastisque et stimulation de la différenciation ostéoblastique.

Les BMP-2, -4 et -7 sont impliquées dans l’engagement vers la voie ostéoblastique de cellules

souches non différenciées telles que les C3H10T1/2 ou des MSCs de rat ou de souris (Abe et

al. 2000, Rawadi et al. 2003, Osyczka et al. 2004, Luu et al. 2007). Concernant les cellules

souches mésenchymateuses humaines (hMSC), le rôle des BMPs sur l’engagement vers la

voie ostéoblastique apparaît cependant plus limité. La présence d’agents différenciants dans le

milieu semble, en effet, requise pour observer un effet des BMPs sur la différenciation

ostéoblastique de ces cellules (Osyczka et al. 2004, Schwartz et al. 2008).

Ces protéines ont, d’autre part, un effet sur la chondrogenèse : l’engagement vers la voie

chondroblastique en réponse aux BMP-2 ou -7 a été visualisée sur des cellules souches -

C3H10T1/2 et cellules issues de moelle osseuse de rat (ST-2) - ou pré-ostéoblastes issues

d’explants de crânes de rat (Asahina et al. 1993, Lou et al. 2000, Tominaga et al. 2009).

Les BMPs ne sont pas uniquement impliquées dans l’engagement cellulaire vers les voies

chondro/ostéoblastiques, leur action est soutenue tout au long de la différenciation : elles

stimulent la différenciation et la minéralisation de cellules plus différenciées (pré-ostéoblastes

ou ostéoblastes murins et humains) (Lai et al. 2005).

• Apoptose des ostéoblastes Il est, d’autre part, envisagé que les BMPs puissent aussi participer au processus apoptotique

normal d’une partie des ostéoblastes qui survient pour contrôler le remodelage osseux.

Gautschi et al. ont montré, en effet, que le traitement d’ostéoblastes humains primaires et

immortalisés (hFOB1.19) avec de la BMP-2, de la BMP-4 et de la BMP-7 (à des

concentrations inférieures à 1ng/ml) induisait une inhibition de la prolifération et une

augmentation de l’apoptose de ces cellules de manière dose-dépendante (Gautschi et al.

2009).

23

• Action sur la vascularisation Plusieurs études, dans des modèles murins in vitro et in vivo, ont mis en évidence que

l’activation de la voie des BMPs s’accompagnait d’une forte augmentation de l’angiogenèse

osseuse. Ce phénomène apparaît directement relié à la production de membres de la famille

du VEGF par les ostéoblastes (Deckers et al. 2002, Zhang et al. 2009).

• Action sur les ostéoclastes Les BMPs sont enfin capables de jouer un rôle dans la formation et la survie des ostéoclastes.

Il a été montré dans des modèles murins (in vivo ou in vitro) que les BMPs-2/4 pouvaient

stimuler la formation d’ostéoclastes et qu’elles étaient indispensables à cette formation (Abe

et al. 2000, Okamoto et al. 2006).

4.1.2. Association BMPs-matériaux : Efficacité in vivo

L’efficacité des BMPs, en site ectopique comme orthotopique, est dépendante de la quantité

administrée et de son mode d’association. Son potentiel ostéoinducteur est largement

augmenté par son association avec un matériau. Ce matériau a pour but, d’une part,

d’accueillir la formation d’os à sa surface, et doit donc posséder des caractéristiques

identiques à celles des substituts osseux classiques (biocompatiblité, biorésorbabilité,

porosité…). Il doit, d’autre part, être en mesure d’assurer la rétention de la BMP au niveau du

site chirurgical.

Différentes sortes de matériaux peuvent être utilisées en association avec les BMPs. Les

polymères naturels ou synthétiques, les phosphates de calcium et les matériaux composites

sont parmi les plus étudiés (Seeherman et al. 2005).

Deux matériaux associés avec des BMP recombinantes humaines glycosylées ont déjà reçu

l’agrément de la FDA pour leur utilisation en orthopédie (fusion vertébrale, fractures ouvertes

de tibia et reconstructions maxillofaciales). Il s’agit d’éponges de collagènes absorbables

(ACS) associées avec de la rhBMP-2 (INFUSE Bone Graft, Medtronic Sofamor Danek) ou de

particules de collagène de type I bovin contenant de la rhBMP-7 (OP-1 Device, Stryker

Biotech). L’association se fait directement dans la salle d’opération par immersion de

l’éponge dans la solution protéique pendant 15 minutes. Ces matériaux ont fait l’objet de

premiers tests cliniques concluants, en chirurgie maxillofaciale notamment. Cependant,

quelques études cliniques réalisées avec l’INFUSE Bone Graft pour la fusion intervertébrale

24

montrent dans plusieurs cas, la présence de zones de résorption et une diminution de la

densité osseuse, comme l’indiquent Toth et al. (Toth et al. 2009).

Par ailleurs, ces éponges de collagène absorbables ne sont pas en mesure d’assurer une

libération progressive : la totalité de la BMP est libérée entre 1 et 2 semaines d’implantation

(Uludag et al. 2001).

4.1.2.1. Influence de la quantité administrée sur la réponse

La capacité de la BMP à induire la formation d’os en site ectopique est directement corrélée à

la quantité de protéine implantée. Chez la souris, l’adsorption de rhBMP-2 sur des céramiques

phosphocalciques (HA, BCP, β-TCP) conduit à une formation d’os dose-dépendante, avec

une quantité minimale requise pour assurer l’initiation du phénomène (Alam et al. 2001).

Les doses nécessaires à l’efficacité des BMPs, en site ectopique comme orthotopique, sont

largement dépendantes de l’espèce envisagée. En effet, plus l’espèce est évoluée d’un point de

vue phylogénique, plus la quantité de BMP requise sera importante. Alors que chez les

rongeurs cette quantité est l’ordre du microgramme à la dizaine de microgrammes, chez

l’homme la quantité préconisée en combinaison avec les éponges de collagène absorbables est

particulièrement importante (1,5 mg de rhBMP-2/ml de zone à combler). Chez le mouton par

exemple, qui a une masse corporelle similaire à celle de l’homme, les quantités efficaces sont

plus faibles. Elles sont en général de l’ordre de la centaine de microgrammes (à partir de 100

µg/implant) et la quantité 430 µg/ml de comblement peut correspondre à une valeur moyenne

conseillée d’après Toth et al. (Kessler et al. 2004, Toth et al. 2009).

Mais en parallèle de cette quantité minimale requise, quelques études ont mis en évidence des

effets adverses après implantation en site orthotopique d’une forte quantité de BMP. Sumner

et al. ont montré, par exemple, que la croissance osseuse sur des cylindres de titane revêtus

avec du BCP chez le chien était inversement reliée à la quantité de BMP-2 déposée sur les

échantillons avant lyophilisation (Sumner et al. 2004). Pour connaître l’influence de la

quantité de rhBMP-2 administrée sur la résorption osseuse, Toth et al. ont étudié l’influence

de la quantité de rhBMP-2 ajoutée à des éponges de collagène adsorbable sur la résorption

osseuse après implantation dans des condyles fémoraux de moutons. Ils ont observé que la

quantité de BMP-2 était directement corrélée à l’importance de la résorption mise en place

lors des premières semaines. Bien que l’ostéogenèse soit clairement visible, après 8 semaines

d’implantation, la zone à reconstruire reste encore à ce temps-là plus importante que la zone

de comblement initialement crée (Toth et al. 2009).

25

Ces études, cependant, ont un point commun : les méthodes d’association du facteur de

croissance avec le matériau ne permettent pas une libération soutenue de la protéine et

conduisent à une forte concentration locale de protéine dans les premiers jours d’implantation.

4.1.2.2. Influence du temps de libération

Comme l’indiquent Seeherman et al., il est maintenant acquis qu’une libération soutenue dans

le temps constitue un élément majeur dans la capacité de reconstruction des systèmes

d’association biomatériaux-protéines. Il est donc nécessaire de développer des matériaux qui

permettent une libération progressive et contrôlée du facteur de croissance pour permettre la

migration de cellules progénitrices et leur différenciation ostéoblastique (Seeherman et al.

2005). Un tel profil de libération permet par ailleurs de diminuer la quantité de protéine

associée pour une efficacité équivalente (Liu et al. 2004).

Plusieurs méthodes d’association de la protéine avec le matériau peuvent être envisagées.

Comme nous l’avons indiqué, l’imprégnation simple de la protéine sur le matériau par

immersion de courte durée conduit à une libération très rapide du facteur de croissance. Le

dépôt d’une goutte de protéine sur le matériau puis séchage successif avant implantation ne

permet pas non plus une libération contrôlée et la protéine sera entièrement relarguée lors des

premiers jours d’implantation. Il a été mentionné que dans le cas où la protéine est

simplement précipitée ou séchée sur un matériau, la libération sera principalement reliée à son

degré de solubilité (Uludag et al. 2001, Schmoekel et al. 2004).

L’incorporation de protéine dans des revêtements phosphocalciques, des ciments

phosphocalciques ou certains polymères permet, au contraire, une libération contrôlée dans le

temps (Uludag et al. 2001, Liu et al. 2005, Ginebra et al. 2006). Cette libération soutenue peut

être attribuée à la diffusion de la protéine à travers le matériau, dans le cas de certains ciments

notamment, ou reliée à la dégradation de l’échantillon et donc sous le contrôle des

ostéoclastes (Seeherman et al. 2005). L’ostéoinduction après implantation sous-cutanée chez

le rat de cylindres de titane revêtus d’apatite avec de la rhBMP-2 est largement supérieure

lorsque la rhBMP-2 est incorporée dans le revêtement que lorsqu’elle est simplement déposée

à sa surface et séchée. Après 5 semaines d’implantation, 60% seulement du revêtement a été

détruit par les ostéoclastes et il reste donc encore 40% de la protéine introduite disponible

(Liu et al. 2005).

L’adsorption de protéines sur des matériaux phosphocalcique peut permettre aussi une

libération soutenue dans le temps. L’adsorption sur ces composés est un phénomène qui

26

implique des liaisons fortes entre le substrat et la protéine et la désorption est faible en

absence d’une forte concentration en phosphate. Des céramiques phosphocalciques sur

lesquelles ont été adsorbées de la rhBMP-2 présentent de bonnes capacité d’ostéoinduction.

Des différences de réponses sont obtenues en fonction du rapport HA/β-TCP. La formation

osseuse induite par la BMP apparaît supérieure pour les échantillons de BCP de rapport

HA/β-TCP de 75/25 par rapport aux céramiques (HA, β-TCP ou BCP) (Alam et al. 2001).

Yuan et al. ont montré que les céramiques de BCP avaient une bonne capacité d’adsorption de

BMP bovine et que l’implantation intramusculaire chez le chien de ces échantillons

(HA/β-TCP : 70/30) s’accompagnait d’une formation osseuse importante à 50 et 100 jours

(Yuan et al. 1998).

4.2. L’ostéoinduction induite par les matériaux

Différents types de matériaux présentent des propriétés d’ostéoinduction intrinsèques. Les

matériaux décrits comme ostéoinducteurs sont principalement des céramiques

phosphocalciques (Habibovic et al. 2008).

Il a été mis en évidence que plusieurs paramètres étaient indispensables au phénomène

d’ostéoinduction directement médié par les matériaux. Ces caractéristiques sont comparables

à celles nécessaires pour l’ostéoconduction.

4.2.1. Caractéristiques des matériaux ostéoinducteurs

Les caractéristiques des matériaux qui semblent importantes pour l’ostéoinduction sont les

suivantes :

• Macroporosité : Ripamonti a mis en évidence que la présence de macropores au sein des matériaux

apparaissait comme un pré-requis pour l’ostéoinduction. La formation d’os après implantation

dans un site ectopique d’hydroxyapatite n’est observée qu’à l’intérieur des macropores. Dans

toutes les études effectuées, concernant l’ostéoinduction par les matériaux, aucune présence

d’os néo-formé en surface des matériaux n’est décrite (Ripamonti 1996).

• Microporosité Il a aussi été montré que la microporosité était un élément essentiel pour l’ostéoinduction.

Le groupe de De Groot s’est particulièrement penché sur l’importance de la microporosité

dans le phénomène d’ostéoinduction. Habibovic et al. ont montré que la température de

27

frittage des céramiques d’HA ou de BCP (HA/β-TCP : 88/12) avait une forte influence sur les

propriétés ostéoinductrices des matériaux phosphocalciques. La plus grande quantité d’os

néo-formé est observée pour les échantillons avec une microporosité et une surface spécifique

plus importantes (Habibovic et al. 2005). Des observations similaires ont pu être effectuées

par comparaison d’échantillons de BCP (70/30) poreux ou lisses (Habibovic et al. 2008).

• La bioactivité En parallèle des matériaux phosphocalciques, qui comme nous l’avons présenté sont bioactifs,

d’autres types de matériaux peuvent avoir des propriétés ostéoinductrices. La formation d’os

ectopique a pu être observée dans des céramiques d’alumine (Yuan et al. 2001d), du titane

(Fujibayashi et al. 2004) et des verres céramiques (Yuan et al. 2001b). Ces différents types de

matériaux ont aussi la caractéristique d’être bioactifs et la formation d’os ectopique est

précédée de la précipitation d’apatite nanocristalline dans leurs cavités.

4.2.2. L’ostéoinduction par les céramiques phosphocalciques

Parmi les céramiques phosphocalciques étudiées, des différences peuvent être observées en

fonction de la composition chimique. Dans plusieurs de leurs études, Habibovic et al., ont

comparé le potentiel ostéoinducteur de céramiques phosphocalciques de compositions et

structures variées après implantation intramusculaire chez la chèvre. Ils ont constaté que les

céramiques de BCP (HA/β-TCP : 70/30 et 80/20) présentant une macroporosité et une

microporosité étaient ostéoinductrices alors que des échantillons d’HA et d’apatite

carbonatée, de porosités équivalentes, étaient incapables d’initier la formation d’os dans ce

site ectopique. Les auteurs, qui ont associé ces effets à la surface spécifique des échantillons,

indiquent qu’une surface spécifique minimale serait requise pour observer un phénomène

d’ostéoinduction. Ils suggèrent qu’il serait essentiel d’avoir des échantillons avec des surfaces

spécifiques « élevées » mais adaptées car une surface spécifique trop élevée, comme celle de

l’apatite carbonatée, ne permettrait pas d’initier la formation d’os en site ectopique.

(Habibovic et al. 2006a, Habibovic et al. 2008).

Yuan et al. ont montré, par ailleurs, que l’implantation intramusculaire chez le chien de

céramiques de BCP (HA/β-TCP : 62/38) conduisait à une formation ectopique d’os plus

précoce que pour des échantillons d’HA (30 jours contre 45 jours respectivement). La

quantité d’os formé apparaissait aussi plus importante à tous les temps de l’étude sur les

céramiques de BCP par rapport aux échantillons d’HA (Yuan et al. 2006a). Dans une autre

étude, Yuan et al. ont comparé le potentiel ostéoinducteur de céramiques d’α-TCP et de

28

β-TCP qui diffèrent notamment par leur produit de solubilité. Après implantation

intramusculaire chez le chien, la présence d’os néoformé a été détectée sur les céramiques de

β-TCP à 45 et 150 jours alors que les échantillons d’α-TCP, qui subissent une plus grande

dissolution, apparaissaient incapables d’induire la formation osseuse. D’après ces études, ce

sont les céramiques de BCP, frittées à faible température ou de β-TCP qui semblent avoir les

meilleures propriétés ostéoinductrices (Yuan et al. 2001a).

Par l’implantation de mêmes échantillons dans le muscle et en site orthotopique, Yuan et al. et

Habibovic et al. ont montré, en outre, qu’il existait une corrélation directe entre

ostéoinduction et ostéoconduction : plus le matériaux a une forte capacité à induire la

formation d’os en site ectopique, plus son potentiel ostéoconducteur est important (Yuan et al.

2006a, Habibovic et al. 2008).

4.2.3. Les mécanismes d’action envisagés

Ces différentes études s’appuient sur des comparaisons entre différents types de matériaux.

Elles ont déjà permis de mettre en évidence l’importance de plusieurs paramètres dans le

phénomène d’ostéoinduction développé par les matériaux (macro- et micro-porosités, capacité

de précipitation d’une apatite carbonatée nanocristalline à leur surface). En revanche, les

mécanismes d’actions n’ont pu être déterminés pour l’instant.

Plusieurs hypothèses ont été avancées pour expliquer ces phénomènes. Ripamonti suggère

que l’ostéoinduction par les matériaux pourrait être liée à leur capacité de fixation de

protéines ostéoinductrices telles que les BMPs. Selon lui, une accumulation de ces facteurs de

croissance pourrait avoir lieu à l’intérieur des pores des matériaux et ainsi induire la

différenciation ostéoblastique des cellules progénitrices environnantes (Ripamonti 1996).

Cette hypothèse a aussi été reprise par Habibovic et al. qui mentionnent que la formation

d’apatite carbonatée nanocristalline à la surface des matériaux ostéoinducteurs pourrait être

asociée à une co-précipitation de facteurs de croissances favorables à l’initiation du

phénomène (Habibovic et al. 2005). Ces auteurs indiquent, par ailleurs, qu’il pourrait y avoir

une influence directe de la composition ionique du milieu à l’intérieur des pores des

céramiques. Ils suggèrent que des phénomènes de dissolution/reprécipitation des composés

phosphocalciques, et notamment des céramiques des BCP, pourraient permettre la formation

de micro-environnements favorables à la migration et à la différenciation ostéoblastique des

cellules progénitrices. Il est à noter toutefois que, d’un point de vue physico-chimiste, la

29

dissolution de céramiques d’HA, β-TCP ou BCP, qui serait responsable d’une libération

importante d’ions calcium et phosphate, est peu problable en raison de la sursaturation des

fluides biologiques par rapport à ces composés phosphocalciques. En revanche, ceci n’exclut

pas l’influence potentielle de micro-environnements spécifiques formés au sein des

micropores des implants dans l’initiation du phénomène d’ostéoinduction. Il a enfin été

suggéré que la réaction inflammatoire pourrait avoir une influence sur l’ostéoinduction (Le

Nihouannen et al. 2005). Quelques expériences in vitro semblent étayer cette hypothèse (cf.

paragraphe 5.3) par contre, celle-ci n’a, pour l’instant, pas été validée in vivo.

A l’heure actuelle, aucune de ces hypothèses n’a pu être confirmée et il n’est pas possible de

déterminer précisément les facteurs clés responsables du phénomène d’ostéoinduction. En

effet, bon nombre de matériaux ostéoconducteurs présentent toutes les caractéristiques citées

précédemment sans pour autant posséder des propriétés ostéoinductrices.

La réponse de chacun des types cellulaires impliqués dans la formation osseuse vis-à-vis des

matériaux implantés est susceptible d’avoir une influence majeure sur ce phénomène. Les

études cellulaires permettent en partie d’apporter des informations sur les caractéristiques

importantes dans les phénomènes d’interaction cellules/matériaux.

5. Les interactions cellules/biomatériaux

Différents types cellulaires sont susceptibles d’interagir avec les matériaux lors de leur

implantation in vivo en site orthotopique ou ectopique et, comme nous l’avons indiqué, les

caractéristiques des matériaux influent de manière importante sur la réponse obtenue.

L’influence de ces caractéristiques sur le comportement de ces cellules peut être évaluée in

vitro. Ces études permettent tout d’abord de recueillir des données préliminaires concernant la

biocompatibilité et les propriétés ostéoconductrices et ostéoinductrices éventuelles des

matériaux synthétisés. Elles permettent, par ailleurs, d’évaluer de manière compartimentée

l’influence de certains paramètres sur les interactions cellules/matériaux et apportent par

conséquent des informations sur les phénomènes observés après implantation de ces substituts

osseux chez l’animal. Trois grandes classes de cellules vont interagir avec les matériaux in

vivo et, d’après les études effectuées in vitro, plusieurs paramètres principaux sont

susceptibles de modifier le comportement de ces cellules vis-à-vis des biomatériaux.

30

5.1. Matériaux et ostéoprogéniteurs ou ostéoblastes

Les ostéoblastes et les cellules souches progénitrices sont responsables de la formation

osseuse in vivo respectivement dans un contexte orthotopique et ectopique. Après colonisation

du matériau, ces cellules vont migrer, adhérer à la surface du matériau puis proliférer avant

d’entamer leur phase de différenciation ostéoblastique puis leur minéralisation. Une bonne

interaction de ces cellules avec les matériaux est, par conséquent, primordiale et de

nombreuses études s’intéressent aux paramètres susceptibles de favoriser la réponse de ces

cellules vis-à-vis des biomatériaux. Il a été montré que plusieurs de ces facteurs pouvaient

avoir une forte influence sur l’adhésion, la prolifération et la différenciation ostéoblastique de

ces cellules.

5.1.1. Influence de la composition chimique

Nous avons déjà indiqué que les composés phosphocalciques présentaient de bonnes capacités

de reconstruction osseuse et possédaient dans certains cas des propriétés ostéoinductrices in

vivo. Ces composés semblent, de même, apporter un avantage significatif sur les réponses

cellulaires observées in vitro. D’une manière générale, en effet, la présence de phosphate de

calcium dans les matériaux favorise à la fois l’adhésion, la prolifération et la différenciation

ostéoblastique de cellules souches mésenchymateuses ou d’ostéoblastes (Midy et al. 2001,

Zhao et al. 2006). La présence de phosphates de calcium dans les matériaux semble être

particulièrement importante dans les phénomènes d’initiation de la différenciation

ostéoblastique. En effet, plusieurs études ont montré que des composés apatitiques pouvaient

induire la différenciation de cellules progénitrices ou d’ostéoblastes sans autre agent de

différenciation. Müller et al., par exemple, ont montré que la différenciation de hMSCs en

ostéoblastes, en absence de milieu ostéogénique, était importante sur des composés

phosphocalciques (gel contenant de l’HA et du β-TCP) et ont indiqué une forte influence de la

présence de phosphate de calcium sur la différenciation (Muller et al. 2008). Ces observations

ont été confirmées par le travail de Lin et al., qui ont mis en évidence une induction de la

différenciation ostéoblastique de MSCs murines (C3H10T1/2) après culture sur des pastilles

d’HA (Lin et al. 2008). De même, Sun et al. ont observé une très forte expression génique des

marqueurs de la différenciation ostéoblastique après croissance de cellules mésenchymateuses

humaines sur les pastilles de BCP (HA/β-TCP : 70/30) (Sun et al. 2008). Chou et al. ont

montré, d’autre part, que le revêtement de puits de culture par des phosphates de calcium

31

biomimétiques induisait une différenciation des MC3T3-E1 en absence de milieu

ostéogénique (Chou et al. 2005).

Par ailleurs, comme pour d’autres types de matériaux (titanes, bioverres…), la réponse

cellulaire observée est particulièrement dépendante de la composition chimique des

céramiques phosphocalciques. En effet, la présence d’ions étrangers, tels que des ions

carbonates, strontium, magnésium, joue par exemple un rôle important sur l’interaction

cellules/matériaux (Redey et al. 2000, Capuccini et al. 2008, Sader et al. 2008). Parmi les

composés phosphocalciques purs, des différences de réponse sont aussi observées en fonction

du rapport Ca/P (Suzuki et al. 2000, Ergun et al. 2008). Des modifications de l’adhésion, la

prolifération et la différenciation ostéoblastique entre des échantillons d’HA, β-TCP ou BCP

(avec différents rapports HA/β-TCP) sont en effet souvent détectées (Suzuki et al. 2000,

Arinzeh et al. 2005, dos Santos et al. 2009). Ces effets peuvent être reliés d’une part à leur

composition chimique - et notamment leur capacité d’échange ionique avec le milieu - mais

aussi à leur propriétés physiques, comme par exemple leur énergie de surface ou leur

topographie comme l’ont montré Dos Santos et al. après revêtement d’échantillons d’HA ou

β-TCP avec un film d’or (dos Santos et al. 2008, 2009).

5.1.2. Influence de la topographie de surface

En effet, de nombreuses études ont mis en évidence une influence de la topographie de

surface des matériaux sur les réponses cellulaires. La topographie et la rugosité sont

susceptibles d’induire des modifications de l’orientation, la morphologie, l’adhésion, la

prolifération et la différenciation des cellules.

L’influence de la microtopographie sur la réponse cellulaire est dépendante de la taille et de la

morphologie du motif créé. D’après l’étude de Zinger et al., une microtopographie avec des

pores de diamètre équivalent ou légèrement supérieur à la taille des cellules affecterait

l’adhésion et la morphologie d’ostéoblastes humains (MG63), alors qu’elle serait sans effet

lorsque les pores ont une taille inférieure (de l’ordre de 10 µm) (Zinger et al. 2004). La

microtopographie peut, par ailleurs, conduire à une orientation particulière des cellules

ostéoblastiques. Ricci et al. ont montré que des colonies issues de moelle osseuse de rat,

s’allongeaient et se positionnait parallèlement aux rainures tracées à la surface des matériaux

(Ricci et al. 2008).

32

La micro-topographie ou la rugosité engendrée par celle-ci ont aussi une influence sur la

différenciation ostéoblastique. Il a été mis en évidence, pour des ostéoblastes (primaires issus

de crânes de rat ou MC3T3), que la présence d’une rugosité en surface des matériaux

favorisait la différenciation ostéoblastique et était nécessaire pour l’obtention d’une

minéralisation physiologique in vitro (Boyan et al. 2002, Park et al. 2008).

Plus récemment, il été montré que la nanotopographie avait une forte influence sur la

morphologie et l’adhésion de différents types cellulaires dont des ostéoblastes (MG63 ou

ostéoblastes primaires humains) ou des cellules souches mésenchymateuses. Des différences

du pourcentage d’adhésion et de l’étalement des cellules ainsi que du nombre et de la

répartition des points focaux ont été observées en réponse à des nanotopographies variables

(Lim et al. 2007, Biggs et al. 2008). La nanotopographie semble, par ailleurs, avoir un effet

majeur sur l’expression génique et l’activation de voies de signalisation des ostéoblastes. Lim

et al. ont constaté que la présence de creux de tailles nanométrique s’accompagnait de

l’expression sélective de certaines protéines impliquées dans les phénomènes d’adhésion

(sous-unité αv des intégrines, paxiline et Focal Adhesion Kinase (FAK)) et de l’activation de

voies de signalisations médiées par les intégrines (autophosphorylation de FAK) (Lim et al.

2007). Biggs et al. ont de même montré une modulation des voies de différenciation

ostéoblastique (Wnt/β-cathenine, voie du TGF-β) en réponse à des nanotopographies, avec

une influence particulière de la forme du motif synthétisé sur la réponse (Biggs et al. 2008).

5.1.3. Influence de la taille des cristallites

La taille des cristallites apparaît aussi être un élément important dans l’interaction

ostéoblastes/matériaux avec une réponse inversement proportionnelle à la taille des cristallites

(Webster et al. 2000a, 2000b). Webster et al. ont montré que l’adhésion, la prolifération et la

différenciation d’ostéoblastes primaires de rats, étaient supérieures sur des « nanophases »

(matériaux composés de grains inférieurs à 100 nm) par rapport à des échantillons présentant

des grains de taille plus importante. Dans ces études, la réponse obtenue est indépendante de

la composition chimique du substrat, et apparaît principalement associée à l’augmentation des

capacités d’adsorption protéique des cristaux relative à la diminution de leur taille (Webster et

al. 2000a, 2000b).

33

5.1.4. Influence de l’énergie de surface

Plusieurs études ont, par ailleurs, indiqué que l’énergie de surface des matériaux pouvaient

avoir un effet sur l’adhésion et la prolifération et la différenciation ostéoblastique

d’ostéoblastes humains (hFOB 1.19 ou MG63). Ils ont montré que ces réponses cellulaires

étaient fortement corrélées à la mouillabilité des échantillons et que d’une manière générale

l’adhésion, la prolifération et la différenciation ostéoblastique seraient favorisées par des

surfaces plutôt hydrophiles (Liu et al. 2007, Navarro et al. 2008). La morphologie des cellules

et notamment leur étalement semble aussi très dépendants de l’énergie de surface du matériau

(dos Santos et al. 2008).

5.1.5. Les mécanismes d’action possibles

Ces différentes études montrent que les réponses cellulaires peuvent être très variables en

fonction du type d’échantillon étudié et de ses caractéristiques. Il est très difficile d’étudier un

facteur indépendamment des autres et donc d’identifier de manière claire l’influence de

chaque paramètre sur l’interaction cellule-matériau. Les mécanismes par lesquels les

matériaux pourraient influencer la réponse cellulaire ne sont pas connus. Alors que beaucoup

d’études apparentent les différences d’adhésion, de prolifération et de différenciation

cellulaires à la capacité du substrat à adsorber des protéines d’adhésion comme la fibronectine

ou la vibronectine (Webster et al. 2000b, Chou et al. 2005, Rouahi et al. 2006b), certains

auteurs, en revanche, ne trouvent pas de corrélation directe entre l’adsorption de telles

protéines sur le matériau et la réponse cellulaire (Murphy et al. 2005, Pellenc et al. 2006). Lin

et al. proposent que la différenciation induite par l’HA soit liée à une augmentation de la

sécrétion ou même de la synthèse de facteurs de différenciation par les cellules

indépendamment du recrutement par le matériau de facteurs environnants (Lin et al. 2008).

D’autre part, Lim et al. indiquent que la nanotopographie pourrait avoir un effet direct sur

l’adhésion cellulaire médiée par l’augmentation de l’expression de gènes spécifiques et

l’activation de voies de signalisation. Ils pensent à un mécanisme par lequel les surfaces

nanostructurées influenceraient physiquement les voies intracellulaires (Lim et al. 2007). Des

observations similaires ont été effectuées par Biggs et al. qui ont montré des différences de la

régulation des voies ostéoblastiques pour des cellules souches mésenchymateuses en réponse

à des nanotopographies de forme particulières (Biggs et al. 2008).

34

5.2. Matériaux et ostéoclastes

Un substitut osseux, dans certaines applications, doit avoir la capacité d’être progressivement

éliminé et remplacé par l’os néoformé. La dégradation des matériaux phosphocalciques peut

être la résultante de la dissolution du matériau dans les fluides biologiques d’une part et de

l’action des ostéoclastes d’autre part. Comme pour les ostéoblastes ou les cellules

ostéoprogénitrices, les caractéristiques des matériaux ont une forte influence sur l’action des

ostéoclastes. L’activité de résorption des ostéoclastes peut être modulée par la composition

chimique, la solubilité des matériaux et leur topographie (Yamada et al. 1997, Webster et al.

2001, Monchau et al. 2002). Kim et al. ont montré que la dissolution par les ostéoclastes

d’apatite nanocristalline similaire au minéral osseux était inversement corrélée à l’état de

maturation de l’apatite et pouvait être largement augmentée par un léger pH acide du milieu

(Kim et al. 2001). L’énergie de surface des échantillons joue par ailleurs un rôle sur

l’adhésion des ostéoclastes alors que l’étalement des cellules serait plutôt lié à la composition

chimique (Redey et al. 1999).

5.3. Matériaux et cellules immunitaires

Lors de la phase d’implantation, une réaction inflammatoire précoce apparaît en réponse au

geste chirurgical et à l’introduction d’un matériau étranger. Lors de cette réaction, des cellules

du système immunitaire vont être en contact avec l’implant. Il a récemment été suggéré que

les interactions entre ces cellules et le matériau implanté pourraient avoir une influence sur les

propriétés d’ostéoinduction des matériaux (Le Nihouannen et al. 2005). Cette hypothèse

pourrait en partie être étayée par des observations effectuées in vitro. Quelques études ont

montré que la rugosité de surface d’échantillons induisait une forte augmentation de la

production de la prostaglandine E2 (PGE2) par des macrophages. Cette PGE2 sécrétée est,

par ailleurs, capable d’induire la migration et la différenciation des cellules

mésenchymateuses humaines (De Bruijn et al. 2008). Il a, par ailleurs, été mis en évidence

que la co-culture de monocytes avec des particules d’HA s’accompagnait d’une production de

cytokines pro-inflammatoires par les cellules (Grandjean-Laquerriere et al. 2005). Ces travaux

suggèrent que de telles interactions cellules inflammatoires/matériaux pourraient participer à

la mise en place des phénomènes d’ostéoinduction par les matériaux.

35

6. Objectifs de notre étude

L’objectif principal de notre étude était de développer un matériau qui présente une forte

réactivité de surface dans le but de lui donner des propriétés ostéoinductrices par association

avec de la rhBMP-2. Nous avons basé notre projet sur plusieurs hypothèses :

Hypothèse 1 : L’ajout d’un revêtement d’apatite biomimétique à la surface de céramiques

phosphocalciques frittées ostéoconductrices est susceptible d’augmenter la surface spécifique

et la réactivité des échantillons.

Hypothèse 2 : Augmenter la réactivité de surface des échantillons devrait permettre

d’adsorber une grande quantité de protéine, et notamment de rhBMP-2, et une libération

progressive dans le temps.

Hypothèse 3 : La combinaison (céramiques phosphocalciques + revêtement + rhBMP-2)

serait plus ostéoinductrice que les échantillons sans revêtement biomimétique.

Hypothèse 4 : Etant donné sa forte réactivité, le revêtement à lui seul – sans ajout de facteurs

de croissance – pourrait avoir un certain potentiel ostéoinducteur.

Pour valider ou infirmer ces hypothèses, nous avons réalisé un projet en différentes étapes.

La première phase du projet comprenait le développement d’un revêtement d’apatite

nanocristalline carbonatée analogue au minéral osseux sur des céramiques phosphocalciques.

Des céramiques poreuses de phosphate de calcium biphasique (HA/β-TCP : 65/35) nous ont

été fournies par la société Teknimed. Le choix de cette composition a été réalisé en raison des

bonnes propriétés ostéoconductrices et la résorbabilité progressive de telles céramiques.

La méthode de revêtement était basée sur des expériences préliminaires réalisées au sein du

laboratoire du CIRIMAT. Dans un premier temps, il a été nécessaire de mettre au point les

conditions expérimentales en vue d’obtenir un revêtement assez homogène et réactif.

Plusieurs expériences ont été réalisées et différents types de revêtements ont été obtenus. Une

sélection de ces revêtements par l’étude de l’adsorption d’une protéine modèle, l’albumine de

sérum bovin a été effectuée. Ces différentes études, ne seront cependant pas présentées ici. A

l’issue de ces expériences, deux revêtements, basés sur un même type de protocole, ont été

choisis. Une caractérisation physico-chimique poussée a été réalisée sur ces échantillons.

La réactivité de ces échantillons a ensuite été évaluée. Pour cela, nous avons comparé, d’une

part, les capacités d’échanges ioniques et, d’autre part, les capacités d’adsorption de la

rhBMP-2 sur les céramiques témoins et revêtues avec les deux types de revêtements

36

précédemment choisis. Nous avons étudié l’adsorption et la libération de la rhBMP-2 sur nos

céramiques par suivi d’un traceur radiomarqué dans le laboratoire de D. Fourmy (INSERM

U858). Cette étude avait, d’une part, pour but de comparer nos échantillons vis-à-vis de leur

propriétés d’adsorption et de retention protéique et, d’autre part, constituait un pré-requis pour

les études animales effectuées par la suite. Nous avons donc choisi les conditions

expérimentales (quantité de protéine/échantillon, type de milieu de libération) en fonction de

ces études futures. A l’issue de ces expériences d’adsorption protéique, un seul des deux

revêtements étudiés a été conservé pour la suite du projet.

La troisième partie de notre travail a consisté à évaluer le comportement cellulaire vis-à-vis de

nos matériaux in vitro. Cette partie avait deux buts principaux : 1) comparer la

biocompatiblité et le potentiel de différenciation ostéoblastique de nos céramiques témoins et

revêtues en utilisant des cellules progénitrices des ostéoblastes et 2) évaluer la différenciation

ostéoblastique en réponse à la rhBMP-2 adsorbée sur les échantillons.

Enfin, nous avons voulu déterminer le potentiel ostéoinducteur de nos différents échantillons

dans un modèle animal. Des implantations intramusculaires des céramiques témoins et

revêtues en présence ou absence de rhBMP-2 ont été effectuées chez le mouton. La rhBMP-2

a été associée aux échantillons soit par la méthode de dépôt d’une solution concentrée puis

séchage soit par adsorption réelle de la protéine sur les échantillons.

L’ensemble du projet a été pensé de manière à pouvoir effectuer un transfert industriel du

procédé et utiliser le matériau développé pour des applications cliniques à court ou moyen

terme, si les résultats obtenus le permettaient. Les expériences ont donc été réalisées dans

cette optique, depuis la prise en considération des contraintes liées au transfert industriel du

procédé jusqu’au choix du modèle animal et des quantités de protéines associées.

La réalisation de ce projet global a nécessité la collaboration de cinq laboratoires académiques

ou cliniques et d’un partenaire industriel. La conduite du projet a été principalement réalisée

par les Professeurs Pascal Swider et Christian Rey, qui ont co-dirigés cette thèse.

Les différentes équipes et leurs responsables scientifiques impliqués dans ce projet sont les

suivants :

Institut Carnot-CIRIMAT-INPT-ENSIACET

Pr. Christian Rey, Dr. Christèle Combes, Dr. Sophie Cazalbou

Mise au point et caractérisation du procédé de revêtement et adsorption protéique

37

Laboratoire de biomécanique EA3697 (UPS)

Pr. Pascal Swider, Dr. Jérôme Briot, Dr. Nicolas Bonneviale, Dr. Jean-Michel Lafosse

Etude de la perméabilité, traitement d’image pour l’histomorphométrie et acquisition

d’images par µCT

INSERM U563, Département Lipoprotéines et Médiateurs Lipidiques

Dr. Fabienne Briand-Mésange, Pr. Jean-Pierre Salles

Etude de l’adsorption protéique et expériences en culture cellulaire

Service de Chrirurgie des animaux de compagnie, Ecole Nationale Vétérinaire de

Toulouse

Dr. Didier Mathon, Dr. Sophie Palierne, Pr. André Autefage

Implantation chez l’animal et étude des résultats

Département de cytologie et anatomie pathologique, CHR Rangueil

Dr. Anne Brouchet-Gomez, Pr. Marie-Bernadette Delisle

Préparation et études histologiques des explants

Teknimed S.A., L’union, France

Dr. Stéphane Gonçalvès, Mr. Léonard

Soutien matériel et financier du projet et transfert industriel

En parallèle de leur contribution dans leurs domaines spécifiques de compétences, ces

différents acteurs se sont impliqués dans la conception et la réalisation du projet dans son

ensemble.

Ce projet a été soutenu financièrement par la région Midi-Pyrénée (dossier n°06001852) et

par l’entreprise Teknimed.

Chapitre 2

Etude d’un procédé de revêtement de céramiques poreuses par une apatite carbonatée

nanocristalline

38

Dans ce chapitre, nous présenterons les caractéristiques de revêtements d’apatite analogue au

minéral osseux réalisés sur des granulés de BCP. L’étude bibliographique de ce chapitre

résume les caractéristiques du minéral osseux et de ses analogues de synthèses utilisés comme

base dans notre procédé de recouvrement et fait un point rapide sur quelques procédés de

revêtements à basse température déjà utilisés. Dans la partie « Résultats », nous comparerons

les caractéristiques de deux types de dépôts réalisés.

1. Introduction bibliographique

1.1. Les caractéristiques du minéral osseux

Les apatites biologiques sont souvent décrites comme de l’hydroxyapatite (Ca10(PO4)6(OH)2)

substituée. Plusieurs études ont cependant montré que l’apatite du minéral osseux était

significativement différente de l’hydroxyapatite. Les caractéristiques principales de ces

apatites biologiques sont mentionnées ci-après.

Le minéral osseux est constitué de fines plaquettes d’apatite allongées selon l’axe c présentant

une surface spécifique importante. Les dimensions des cristallites évoluent en fonction de la

maturation du minéral. Elles sont de l’ordre de 15-20 nm x 5-8 nm (Cazalbou 2000, Kuhn et

al. 2008).

Il est désormais admis que le minéral osseux est constitué d’apatite carbonatée

nanocristalline, sans autres phases phosphocalciques détectées, et contient des substitutions

ioniques telles que HPO4, Na et Mg (Kokubo 2008). La structure apatitique du minéral osseux

permet des substitutions partielles ou totales sans que celle-ci ne soit notablement modifiée.

L’intégration d’ions CO32- et HPO4

2- dans la structure apatitique du minéral osseux a été mise

en évidence. La substitution d’ions PO43- par les ions HPO4

2- entraine la formation d’une

lacune en ions Ca2+ et d’une lacune en ions OH-. Les ions carbonates peuvent eux se

substituer soit aux ions PO43- soit aux ions OH- soit aux deux à la fois. Il se forme alors des

apatites carbonatées en site de type B, de type A ou de type AB, respectivement. Les

substitutions de type B entrainent l’apparition de lacunes en calcium et OH-, alors que seules

des lacunes en ions OH- sont présentes pour les substitutions de type A (Combes et al. 2003).

Ce sont les carbonates substitués en site de type B qui sont majoritaires dans l’émail, l’os et la

dentine (Rey et al. 1991). La proportion de carbonates de type A augmente cependant au

cours du temps dans l’os (Kuhn et al. 2008).

39

Les rapports atomiques Ca/P et Ca/(P+C) - avec Ca = calcium, P = phosphate et C =

carbonate - sont souvent utilisés pour caractériser la composition chimique des apatites

biologiques. Une hydroxyapatite stœchiométrique possède un rapport Ca/P de 1,67. Ces

rapports donnent en général des indications sur l’écart à la stœchiométrie relatif aux ions

calcium. Le rapport Ca/P ne peut pas être relié directement à la stœchiométrie de l’apatite en

raison de la présence, dans les apatites biologiques, de différentes substitutions carbonate qui

remplacent essentiellement les groupements phosphate. Les rapports Ca/(P+C) ou

(Ca+Na)/(P+C) donnent donc des informations sur la stœchiométrie plus proches de la réalité

en considérant que des lacunes n'ont jamais pu être mise en évidence sur les sites phosphate

des apatites. Pour le minéral osseux, ce rapport est toujours très inférieur à 1,67 et témoigne

que le minéral osseux est une apatite fortement déficiente en calcium (Tableau II.1). Au cours

de la maturation de l’os, les rapports Ca/P et Ca/(P+C) de même que la teneur en ions

carbonate augmentent légèrement (Kuhn et al. 2008). Ces données indiquent que les cristaux

qui composent l’os tendent vers une apatite plus stable. Le taux de carbonate peut être assez

variable et est compris entre 4 et 7 %.

Tableau II.1 : Rapports atomiques et pourcentages de carbonates de quelques apatites biologiques. Echantillons Ca/P Ca/(P+C) Taux CO3

2- (%) Référence

Os spongieux bovin 1,51 – 1,58 1,31 – 1,33 4,8 – 5,3

Os cortical bovin 1,61 – 1,64 1,39 – 1,41 5,0 – 5,3 (Kuhn et al. 2008)

Os de poulet 1,51 – 1,88 1,27 – 1,45

Os de maccaques 1,72 – 1,74 (Cazalbou 2000)

Une différence importante entre le minéral osseux et l’hydroxyapatite vient de la faible teneur

en ions OH- du minéral osseux. Plusieurs études ont montré l’absence totale d’ions hydroxyle

dans la structure apatite de l’os (de rat ou de bovins notamment) (Rey et al. 1995, Loong et al.

2000). La détection de ces ions est cependant très sensible aux conditions de préparation des

échantillons et une étude récente par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) solide a

montré la présence d’ions OH- dans le minéral osseux de rat, de chat et d’homme. La quantité

d’ions OH- reste cependant très faible et représenterait pour un os cortical humain environ

20% du taux présent dans l’hydroxyapatite, d'après cette seule étude (Cho et al. 2003).

D'autres travaux du Laboratoire, non encore publiés, concernant l’étude d’os frais de

différents mammifères par spectroscopie Raman suggèrent des taux d'hydroxylation beaucoup

40

plus faibles compris entre 0 et 5%. Notons qu'une des difficultés de ces études est liée à

l'hydrolyse interne des ions PO43- de l'apatite par des molécules d'eau :

PO43- + H2O → HPO4

2- + OH-

qui peut modifier sensiblement la teneur en ions OH- au cours du temps.

D’autre part, une caractéristique importante des apatites biologiques est la présence d’un

environnement ionique non apatitique à la surface des nanocristaux. Cet environnement a été

attribué à la présence en surface des cristaux d’une couche hydratée relativement bien

structurée contenant des ions labiles (CO32-,HPO4

2- et PO43- labiles) (Eichert et al. 2002).

Eichert et al. ont montré que, lors du séchage d’analogues de synthèse, cette couche perdait

son organisation initiale et donnait des environnement non-apatitiques de nature différente,

proches d'un phosphate amorphe. Cependant une réhydratation permet une réorganisation

partielle de cette couche. Il a été suggéré que cette couche hydratée permettait la réduction de

l’énergie de surface des nanocristaux d’apatite (Eichert et al. 2002). Ces environnements non

apatitiques peuvent être détecté par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR).

Cette couche plus ou moins hydratée, existant à la fois sur les apatites biologiques et leurs

analogues de synthèse, a fait l’objet de nombreuses études (Cazalbou 2000, Rey et al. 2007).

Elle est pourrait être en partie responsable de la forte réactivité de ces cristaux, puisqu’elle

contient des ions relativement mobiles et facilement échangeables.

La composition chimique et la structure du minéral osseux ne sont pas figées dans le temps.

De nombreux facteurs évoluent au cours de la maturation du minéral. La maturation

correspond à une évolution des apatites en solution conduisant à un développement des

domaines apatitiques stables aux dépens des ions de la couche hydratée moins stable. La

maturation conduit à des cristallites de taille plus grande dans certains organes, l'émail

dentaire par exemple, et se traduit par une nette augmentation du rapport Ca/(P+C) et une

évolution vers l'hydroxyapatite stœchiométrique. Dans les os, cependant, on observe une

augmentation du taux de carbonates et l'évolution vers une stœchiométrie beaucoup plus

limitée. Dans tous les cas cependant, on note une nette diminution de la couche hydratée

(Cazalbou et al. 2005, Kuhn et al. 2008), avec une intégration de certains ions présents dans

cette couche dans la structure apatitique.

41

1.2. Les analogues de synthèse du minéral osseux

L’équipe du CIRIMAT s’intéresse depuis plusieurs années à la réalisation et la caractérisation

d’apatites nanocristallines analogues au minéral osseux dans le but de mieux connaître les

propriétés des apatites biologiques et expliquer leur forte réactivité. Elle est parvenue à

réaliser des analogues de synthèse présentant des caractéristiques très intéressantes,

semblables à celles de l’os :

- Cristallites de forme et de taille similaires à celles de l’os

- Surface spécifique importante (supérieure ou égale à 100 m2/g)

- Obtention d’une apatite carbonatée déficiente en calcium contenant des ions

HPO42- dans la structure apatitique. La substitution des carbonates est

majoritairement de type B et le taux de carbonate peut être ajusté.

- Faible quantité d’ions OH- dans la structure apatitique.

- Présence d’une couche hydratée à la surface des nanocristaux (présence d’ions

CO32-, HPO4

2- et PO43- labiles).

- Evolution importante des cristaux au cours du temps caractérisée par des

modifications semblables à celles qui parviennent lors de la maturation du minéral

osseux.

Ces apatites se comportent de manière similaire au minéral osseux et constituent donc un bon

modèle des apatites biologiques. Elles peuvent être considérées comme des matériaux

biomimétiques et sont très réactives.

1.2.1. Propriétés des apatites biologiques et de leurs analogues de

synthèse : Influence de la couche hydratée

La réactivité des apatites biologiques dépend de plusieurs facteurs : la présence

d’environnements non apatitiques (couche hydratée) mais aussi la composition, la taille et la

morphologie des cristallites. Ces apatites évoluent de manière significative au cours du temps

et cette maturation influence leurs propriétés d’échange ionique et d’adsorption de protéines.

La quantité d’ions labiles (HPO42-, PO4

3- et CO32-) diminue au cours de la maturation des

analogues de synthèse et avec l’âge pour les apatites biologiques. La présence de carbonates

dans cette couche participe à sa stabilisation (Rey et al. 1995). Au cours de la maturation, il a

été montré, par spectrométrie infrarouge, en utilisant des substitutions isotopiques, que ces

ions s’intègraient progressivement dans la structure apatitique et que la couche hydratée se

42

réduisait. D’autre part, il a été suggéré que la diminution de cette couche hydratée pouvait

s’accompagner de l’intégration d’ions OH- dans la structure apatitique des analogues de

synthèse (Eichert et al. 2002, Cazalbou et al. 2005).

La couche hydratée semble essentielle dans les mécanismes d’échanges ioniques. En effet

qu’il s’agisse d’échanges anionique (HPO42- et CO3

2-) ou cationique (Sr2+ ou Mg2+ et Ca2+),

l’échange est très rapide et très facile. La réversibilité de l’échange est aussi très élevée

(presque totale). La diminution de la taille de la couche hydratée, observée lors de la

maturation, s’accompagne d’une réduction significative des capacités d’échanges ioniques de

ces apatites. Cet environnement ionique non-apatitique apparaît donc essentiel dans la

réactivité du minéral osseux (Cazalbou et al. 2004, Cazalbou et al. 2005).

L’échange ionique se fait initialement par l’intermédiaire de cette couche hydratée (échange

rapide avec les ions labiles). Selon le type d’ion échangé, il est ensuite possible qu’il y ait

incorporation de cet ion dans la structure apatitique au cours de la maturation, de manière

identique à l’intégration des ions CO32-, PO4

3- et HPO42- initialement contenus dans la couche

hydratée. Ceci a été montré pour l’échange avec le strontium. Après un échange rapide, cet

ion est progressivement incorporé dans la structure de l’apatite et ne peut plus être échangé.

Le magnésium au contraire ne s’intègre pas dans les domaines apatitiques et la réversibilité de

l’échange reste quasi-totale même après des temps de maturation très longs (Cazalbou et al.

2004).

Les analogues de synthèses présentent des capacités d’adsorption de protéines supérieures à

celle de l’hydroxyapatite (Ouizat et al. 1999) et des travaux de l’équipe suggèrent une

influence de la couche hydratée dans ces phénomènes (Cazalbou et al. 2004, Cazalbou et al.

2005).

1.3. Exemples de procédés de revêtements d’apatites à faible température

La réalisation de revêtements de composés apatitiques sur des supports de différentes

compositions a été étudiée. Le revêtement de prothèses en titane par de l’hydroxyapatite, par

exemple, devient courante car il a été montré que cela permettait une intégration plus rapide

de la prothèse dans le tissu et conduisait à une résistance mécanique accrue dans les tests

d'extraction en torsion (Moroni et al. 2008). Différentes techniques de revêtement existent

(Leeuwenburgh et al. 2008). La plupart des procédés industriels utilisent des températures

43

élevées incompatibles avec la préservation d’apatites non-stoechiométriques nanocristallines.

La surface spécifique de ces composés est souvent faible tout comme leur réactivité de

surface (pas de couche hydratée à leur surface).

D’autres méthodes de revêtement à faible température existent et présentent l’avantage

d’aboutir à un dépôt de composés phosphocalciques divers avec des tailles de cristallites

faibles et des caractéristiques plus ou moins proche de celles du minéral osseux. D’autre part,

ces techniques sont compatibles avec l’association de molécules ostéoinductrices, telles que

des protéines, à l’intérieur du revêtement.

L’utilisation de SBF, solution ionique de composition (plus ou moins) proche de la

composition des fluides biologiques, permet l’obtention de revêtements réactifs. La croissance

d’apatite nanocristalline par immersion d’implants dans du SBF à 37°C pendant plusieurs

jours a été décrite pour la première fois par Kokubo (Kokubo 1991). D’autres méthodes

faisant appel à l’utilisation de solutions de SBF ont ensuite été décrites : Barrère et al., par

exemple, ont mis en place un procédé nécessitant l’utilisation successive de deux solutions de

type SBF différentes. Dans un premier temps, l’immersion de pastilles en titane dans une

première solution de SBF classique pendant 24h, permet d’obtenir un fin précipité de

phosphate de calcium carbonaté amorphe. Ces premiers cristaux agissent comme des sites de

nucléation pour la croissance d’autres cristaux phosphocalciques lors de l’immersion, dans un

deuxième temps, des échantillons dans une autre solution de SBF beaucoup plus concentrée

(jusqu'à cinq fois plus). La composition ionique de cette dernière solution peut être ajustée

pour obtenir des revêtements phosphocalciques de différentes nature (OCP, apatite déficiente

en calcium, apatite carbonatée de type B…) (Barrere et al. 1999).

Le mécanisme de nucléation-croissance de cristaux de phosphate de calcium est aussi utilisé

dans d’autres procédés. Dans l’étude de Kim et al., la croissance d’un film fin d’apatite peu

cristallisée sur différents types d’implants est réalisée à partir d’une solution métastable de

phosphate de calcium : ils utilisent une solution sursaturée d’apatite dissoute en milieu acide

et induisent la précipitation de cristaux phosphocalcique par augmentation du pH. Après

filtration, les solutions métastables contenant des ions calcium et phosphate sont mises en

contact avec les échantillons à revêtir pendant 24h à 8°C. Cette phase permet la nucléation

hétérogène à la surface des matériaux de cristaux de phosphate de calcium amorphe. Les

échantillons sont maintenus dans la solution à une température inférieure à 60°C pour

permettre la croissance des cristaux. L’épaisseur du dépôt obtenu est dépendante du temps

44

d’incubation. Cette technique à faible température permet la croissance de nanocristaux

d’apatite sur différents types de surface, incluant des surfaces hydrophobes (Kim et al. 2000).

Zhang et al., par ailleurs, obtiennent la croissance d’OCP sur des implants poreux en titane

par immersion dans des solutions sursaturées à 37°C pendant 6 jours. Ils montrent, en utilisant

des échantillons ayant subi différentes sortes de prétraitement, que l’homogénéité du

revêtement est fortement dépendante de la nature du substrat (Zhang et al. 2005). Cette

méthode de revêtement a été envisagée dans notre étude : les résultats obtenus montrent que

l’utilisation de solutions sursaturées est peu compatible avec le caractère biphasique et la

morphologie complexe de nos échantillons. Par ailleurs l'utilisation de telles solutions,

métastables voire instables, est peu pratique sur le plan industriel. Nous n’avons donc pas

retenu ce procédé pour le revêtement de granulés de BCP dans cette étude.

Layrolle et al. induisent la précipitation de phosphate de calcium par l’utilisation de CO2.

Dans ce procédé, les échantillons sont immergés dans une solution sursaturée en phosphate et

calcium sous pression partielle de CO2 élevée qui provoque une diminution du pH de la

solution, la stabilise et permet une manipulation aisée. Lorsque la pression partielle de CO2

est brutalement réduite à température physiologique, le pH augmente progressivement avec la

libération du CO2 en surtension et un fin précipité de phosphate de calcium carbonaté se

forme à la surface des échantillons. Le transfert de ce procédé semble possible par l’utilisation

d’un réacteur qui permet d’effectuer le revêtement, en présence de molécules biologiques, en

conditions stériles (Layrolle et al. 2004).

La croissance cristalline à composition constante peut enfin être utilisée comme procédé de

revêtement. Cette autre technique permet la nucléation-croissance de composés apatitiques sur

différents supports par l’utilisation de solutions métastables. Dans ce cas-ci, les

concentrations ioniques et le pH sont maintenus à leur valeur initiale évitant une évolution de

la solution et donc une modification de la nature des cristaux de revêtements au cours du

traitement (Royer 1993).

D’autres méthodes, réservées au revêtement de matériaux conducteurs, utilisent les méthodes

de synthèse électrochimiques. Il est possible de réaliser des dépôts apatitiques par électrolyse

d'une solution aqueuse. L'électrolyse d'une solution aqueuse saturée induit une libération de

dihydrogène à la cathode et conduit à une augmentation locale du pH, qui produit une

sursaturation et une précipitation à la surface de la cathode. Ces techniques sont intéressantes

car elles permettent d’obtenir un dépôt à faible température en un temps réduit mais le

potentiel est différent selon la zone de l’implant considérée (en surface et à l’intérieur des

pores) conduisant ainsi à des revêtements d’épaisseurs différentes (Zhang et al. 2005)

45

Une autre méthode, l'électrodéposition, consiste à provoquer le déplacement de particules

d'apatites chargées en solution vers une surface métallique au moyen d'un champ électrique.

Cette technique permet d’obtenir un dépôt de même composition sur l’ensemble de la surface

mais l’adhérence est assez faible et peut nécessiter un frittage à haute température

(Leeuwenburgh et al. 2008).

Ces différentes techniques permettent le revêtement d’implants par des composés

phosphocalciques réactifs mais sont parfois difficilement transposables à l’échelle industrielle

(temps d’incubation longs, croissance de cristaux sur les parois du réacteur…) et ne sont pas

toujours adaptées aux matériaux de morphologie complexe : La nature des cristaux ou

l’épaisseur du revêtement peuvent être variables selon la zone de l’implant envisagée (des

différences peuvent notamment être observées en surface ou à l’intérieur de pores. Par ailleurs

les procédés électrochimiques ne peuvent être appliqués qu'au recouvrement de métaux.

2. Objectifs

L’objectif de cette partie était d’élaborer un substitut osseux présentant une forte réactivité de

surface. Pour y parvenir, nous avons décidé d’utiliser des céramiques de phosphate de

calcium biphasiques (HA/β-TCP) déjà commercialisées et d’améliorer leurs propriétés de

surface par l’ajout d’un revêtement apatitique nanocristallin. Ces céramiques initiales

présentent déjà une bonne efficacité de reconstruction mais leur fabrication nécessite un

frittage à haute température indispensable pour obtenir une bonne résistance mécanique. Un

tel traitement conduit à une diminution importante de leur surface spécifique et de leur

réactivité de surface (Gautier et al. 1998). Effectuer un revêtement d’un composé apatitique

nanocristallin à la surface de ces céramiques permettrait de conserver leurs avantages

(biocompatibilité, biorésorbabilité, bioactivité, bonne résistance mécanique, présence

nécessaire de macro- et micro-porosités) tout en augmentant leur réactivité de surface.

Plusieurs méthodes de revêtements, basées sur des travaux issus de publications ou provenant

d'essais antérieurs réalisés au CIRIMAT, ont été envisagées. Le dépôt d’apatite carbonatée

nanocristalline analogue au minéral osseux a été préférée en raison de sa forte réactivité de

surface. A l’instar du minéral osseux, ces apatites présentent un état de maturation faible

(susceptible d’évoluer de manière similaire à l’os dans les milieux biologiques), une surface

spécifique élevée et une couche hydratée à leur surface, probablement responsable de leur

forte réactivité. La méthode envisagée s’appuie sur des études préliminaires effectuées au sein

du laboratoire du CIRIMAT. Elle permet d’associer les caractéristiques initiales des

46

céramiques de BCP et la forte réactivité de surface de ces analogues de synthèse. Une mise au

point du procédé de revêtement a été effectuée mais ne sera pas décrite ici pour des raisons de

confidentialité. A l’issue de ces expériences, deux types de revêtements ont été choisis et

caractérisés. Une comparaison des propriétés des céramiques initiales et revêtues a finalement

été effectuée (surface spécifique, porosité et capacité d’échange avec les ions strontium).

3. Matériel et méthodes

3.1. Matériaux

La société TEKNIMED nous a fourni plusieurs lots de céramiques poreuses (65% de

porosité) correspondant aux produits commercialisés CERAFORM de type phosphates de

calcium biphasiques (BCP) constitués de 65% d'hydroxyapatite stœchiométrique et de 35% de

phosphate tricalcique-β :

- des granulés poreux de forme irrégulière de dimension voisine de 1 mm (Figure II.1a),

- des granulés de forme cubique de 3 mm de coté (Figure II.1b),

- des barres frittées parallélépipédiques de 20 mm x 5 mm x 5 mm (Figure II.1c)

- des cylindres frittés de Ø 6 mm x L 20 mm (Figure II.1d)

Figure II.1: Photographies des céramiques CERAFORM utilisées.

Notre étude concernant les procédés de recouvrement de ces céramiques biphasiques a portée

sur les deux premiers types de granulés, les autres céramiques étant réservées aux

implantations chez l’animal.

Nous avons réalisé des revêtements de ces échantillons avec des analogues de synthèse du

minéral osseux. Le procédé de revêtement et les mises au point effectuées au cours de ce

travail ne seront pas décrits. Seuls deux types de revêtements issus de nos investigations

seront comparés.

47

3.2. Caractérisation des nanocristaux

3.2.1. Diffraction des Rayons X

La diffraction des rayons X (DRX) est un outil de caractérisation qui permet l’identification

de matières bien ou très bien cristallisées. Sur des composés de faible cristallinité comme le

minéral osseux ou les apatites carbonatées de notre étude, cette technique donne des

informations concernant la nature des phases mais la largeur des raies et leur dissymétrie ne

permet pas une détermination précise des dimensions de la maille cristalline. La mesure des

largeurs de raies à partir des diagrammes obtenus permet toutefois de déduire la dimension

moyenne des cristallites par la formule de Scherrer :

22cos94,0

or

hklLΔ−Δ

=θ

λ

Avec

0,94 : Constante de Scherrer

L (Å) : Taille apparente dans la direction perpendiculaire au plan de diffraction hkl

λ (Å):Longueur d’onde du rayonnement X

θ : Angle de diffraction correspondant à la raie hkl considérée

Δr (radians) : Largeur à mi-hauteur de la raie hkl de diffraction

Δo (radians) : Largeur à mi-hauteur de la raie hkl de diffraction d’une hydroxyapatite bien

cristallisée.

Dans cette étude, l’analyse des échantillons est réalisée au moyen d’un diffractomètre INEL

CPS 120 par exposition au rayonnement Kα émis par une anticathode au Cobalt

(λCoKα=1,78892 Å). Le temps d’acquisition des apatites mal cristallisées a été fixé à 15h.

3.2.2. La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier

La spectrométrie infrarouge consiste à irradier l'échantillon dans le domaine 4000 - 400 cm-1

et à détecter les fréquences absorbées par ce dernier. Lors de l’irradiation, certaines vibrations

moléculaires sont activées au sein de l'échantillon. L’énergie (ou la fréquence) absorbée est

caractéristique d'une molécule ou d'un ion moléculaire et elle est affectée par sa position au

sein du réseau cristallin ou plus généralement par son environnement immédiat.

Les apatites carbonatées mal cristallisées comme le minéral osseux ou les apatites de notre

étude analysées par FTIR se caractérisent par des bandes d’adsorption relatives aux

48

groupements PO43-, HPO4

2-, CO32- et OH- présents dans la phase apatite ou non apatitique

(Tableau II.1).

Tableau II.1 : Bandes d’adsorption caractéristiques des apatites carbonatées.

Domaine Position des bandes (cm-1) Attribution

615 PO43- non-apatitique

600, 575, 560 PO43- apatitique

550 HPO42- apatitique

534 HPO42- non-apatitique

635 OH- apatitique

ν4PO4

ν1PO4 960 PO43- apatitique

ν3PO4 1040-1100 PO43- apatitique

1545 CO32- apatitique de type A

1412 CO32- apatitique de type B ν3CO3

1452 CO32- apatitique de type AB

879 CO32- apatitique de type A

872 CO32- apatitique de type B ν2CO3

886 CO32- non-apatitique

L'appareillage utilisé dans cette étude est un spectromètre infrarouge à transformée de Fourier

Nicolet 5700. Le domaine spectral étudié s'étend de 4000 cm-1 à 400 cm-1. Les mesures sont

réalisées sur des pastilles de bromure de potassium dans lesquelles les poudres à analyser sont

dispersées après broyage. Après correction de la ligne de base, la décomposition des spectres

est réalisée à l'aide du logiciel Grams (Galactic Ind. Corp.).

3.2.3. Dosage du calcium, du phosphore et du sodium

Le dosage des ions calcium, phosphate et sodium a été effectué sur des poudres de cristaux,

préparées dans des conditions similaires aux revêtements, après dissolution en milieu acide

(HClO4, 6N). Il est, en effet, quasiment impossible de dissoudre sélectivement le revêtement

en milieu acide sans attaquer la céramique sous-jacente.

49

La quantité d’ions calcium présents dans les différents échantillons a été déterminée par

dosage complexométrique en retour en raison de la présence d'ions phosphate. Les ions

calcium présents dans la solution acide sont complexés par l’ajout, en excès, d’acide éthylène

diaminetetraacétique (EDTA). L’excès d’EDTA est ensuite dosé par ajout progressif d’une

solution de zinc à 0,05 M à pH basique et en présence d’un indicateur coloré, le noir

d’ériochrome T (Charlot 1974).

Les ions phosphate sont dosés par spectrophotométrie. La solution est mélangée à une

solution de vanadate d'ammonium et de molybdate d'ammonium en milieu acide. Les ions

phosphates réagissent dans ces conditions pour former un acide complexe

phosphovanadomolybdique de couleur jaune. L’absorbance est mesurée à 460 nm (Hitachi,

U-1100 spectomophometer). Une gamme étalon permet de déterminer la quantité de

phosphore présente en solution (Charlot 1974).

Le dosage du sodium est réalisé par adsorption atomique sur un spectrophotomètre muni

d’une lampe à cathode creuse à 589 nm (AAS 300 Perkin Elmer). Une gamme étalon

comprise entre 0,25 et 1 ppm permet de déterminer la quantité de sodium dans la solution.

3.2.4. Dosage des carbonates

La quantité de ions carbonate présents dans les apatites similaires à celles du revêtement peut

être déterminée à partir d’un coulomètre (UIC Inc. CM5014). La poudre est placée dans un

récipient parcouru par courant d'air exempt de CO2. Elle est ensuite dissoute par ajout d’acide

perchlorique 6N. Le CO2 libéré par l'attaque acide des carbonates réagit avec une solution

d’éthanolamine pour former un acide titrable (par la génération d'une base par électrolyse). La

mesure du taux de CO2 émis permet de déterminer le pourcentage massique d’ions carbonate

présents dans l’échantillon.

3.2.5. Microscopie Electronique à Transmission

La microscopie électronique à transmission (MET) est un outil de caractérisation des

matériaux solides à l’échelle (sub-)nanométrique. Le MET offre la possibilité de réaliser des

50

images de hautes résolution et de recueillir des diagrammes de diffraction pour des petits

grains ou cristaux.

Pour nos expériences, les cristaux sont dispersés dans une solution d’éthanol dans un bain à

ultrasons. Une goutte de cette suspension est ensuite déposée sur une grille de cuivre

surmontée d’un film de colodium contenant du carbone pour rendre les échantillons

conducteurs. L’appareil utilisé est un Jeol Jem 2100F. La tension d’accélération des électrons

appliquée est comprise entre 480 et 3200 kV.

Les espacements (d-spacing) entre les franges d’interférences sont déterminés à partir des

micrographies obtenues grâce à un logiciel d’imagerie.

3.3. Caractérisation des granulés

3.3.1. Microscopie Electronique à Balayage

La microscopie électronique à balayage (MEB) est un outil de caractérisation en haute

résolution de la surface d’objets dont la taille est comprise entre une dizaine de nanomètres et

quelques millimètres. Son principe repose principalement sur la détection d'électrons

rétrodiffusés par l'échantillon.

Pour notre étude, les granulés phosphocalciques, entiers ou coupés en deux de manière à

visualiser l’intérieur de la céramique, ont été métallisés à l’argent puis placés dans un

microscope Leo 435 VP monté avec un détecteur à scintillation (détection des électrons

secondaires). Des images de la topographie de la surface (ou de l’intérieur des granulés) ont

ainsi été obtenues.

3.3.2. Mesure de la surface spécifique

La surface spécifique des échantillons a été mesurée par la méthode de Brunauer-Emmet-

Teller (BET) avec un Quantachrome Nova 1000. Cette méthode est basée sur l’adsorption

d’un gaz, dans notre cas, l’azote, à la surface d’un solide. Un dégazage d’au moins 12h à

température ambiante a été réalisé avant les mesures. Celles-ci ont été effectuées en un ou

plusieurs points suivant les nécessités. La mesure de plusieurs points d’obtenir des résultats

plus précis. De même des courbes d’adsorption et de désorption peuvent être réalisées afin

d’évaluer les faibles porosités.

51

3.3.3. Mesure de la porosité

La porosité de nos échantillons témoins et revêtus a été déterminée par porosimétrie à

mercure entre 8 et 60000 psi (Micromeretics Autopore III). Le volume de mercure ayant

pénétré en fonction de la pression appliquée (correspondant à un diamètre de pores) est

mesuré. Ces mesures donnent le profil et le pourcentage de porosité des échantillons.

3.3.4. Echange ionique : Strontium

Les granulés revêtus sont immergés dans une solution de chlorure de strontium à 1M (SrCl2,

VWR Normapur) pendant 30 minutes à température ambiante avec un rapport solide sur

liquide de 20 mg/ml. Les échantillons sont ensuite lavés à trois reprises dans de l’eau

désionisée puis séchés. La quantité de Strontium contenue dans les échantillons est ensuite

déterminée par ICP-MS (Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometer).

4. Résultats

Les expériences effectuées lors de la phase de mise au point du procédé de revêtement ne

seront pas décrites dans cette étude. Seule une comparaison entre deux types de revêtements

obtenus dans des conditions différentes est réalisée.

A l’issue des essais de mise au point du procédé, deux types de revêtements ont, en effet, été

choisis et une caractérisation globale de leur propriétés a été effectuée.

Les études ont été faites sur le revêtement NanoAp et le revêtement NanoAp-EtOH. La

technique et les conditions de revêtement sont identiques entre les deux revêtements à

l’exception d’une étape. Une étape supplémentaire, faisant appel à l’utilisation d’un solvant

alcoolique, a été ajoutée au procédé initial et les échantillons obtenus sont notés NanoAp-

EtOH. Cette étude permet donc d’évaluer les modifications induites par l’ajout de cette

nouvelle étape et de comparer la réactivité de ces deux types de revêtements.

Il est, d’autre part, possible de réaliser le procédé de revêtement à plusieurs reprises sur un

même granulé, ce qui conduit à une multiplication des dépôts sur la surface de la céramique.

L’influence de cette répétition sur les propriétés des matériaux a donc été étudiée : une

comparaison des granulés NanoAp et NanoAp-EtOH après 1 ou 2 revêtements (notés x1 ou

x2) a été effectuée.

52

4.1. Caractérisation des nanocristaux

Les analyses des cristaux n’ont pu être effectuées directement sur les granulés revêtus ni sur

les revêtements issus de ces céramiques en raison de la morphologie complexe des

échantillons et de la faible quantité de cristaux déposés à leur surface. La caractérisation a

donc été réalisée sur des nanocristaux qui sont synthétisées et traitées de manière identique

aux cristaux des revêtements.

Les diagrammes de DRX des échantillons NanoAp et NanoAp-EtOH présentent des pics

assez larges caractéristiques d’une apatite mal cristallisée (Figure II.2).

Figure II.2 : Diagrammes XRD des cristaux NanoAp et NanoAp-EtOH.

Les pics de diffraction observés correspondent à ceux de l’hydroxyapatite (fiche Joint

committee on powder diffraction standard (JCPDS) n°9-432) et les largeurs des raies de

diffraction indiquent que les domaines apatitiques correspondant sont de taille nanométrique.

Nous pouvons constater un rétrécissement de la largeur et une élongation des raies de

diffraction pour le dépôt NanoAp-EtOH. Ceci traduit une augmentation de la taille des

domaines apatitiques associée à une maturation plus importante du revêtement (Tableau II.2).

Tableau II.2 : Taille des cristallites déterminées par la méthode de Scherrer.

Cristaux Raie 002 (longueur)

Raie 310 (largeur-épaisseur)

NanoAp 178 ± 9 Å 64 ± 3 Å

NanoAp-EtOH 245 ± 5 Å 102 ± 3 Å

53

Ces données indiquent que les domaines apatitiques sont allongés selon l’axe c (raie 002).

Les observations par MET permettent de confirmer ces résultats (Figure II.3 a et c).

Figure II.3 : Micrographies MET des cristaux NanoAp et NanoAp-EtOH à 480kV (a et c – barres d’échelle = 50 nm) et 3200 kV (b et d – barres d’échelle = 5 nm). Les échantillons sont composés de fines plaquettes de formes irrégulières et souvent

agglomérées (en particulier pour les cristaux NanoAp). Leurs dimensions paraissent

correspondre à celles déterminées ci-dessus.

Les échantillons présentent une structure apatitique caractérisée par les espacements mesurés

entre les franges d’interférences (Figure II.3 b et d). Un espacement de 3,4 Å, qui correspond

au plan cristallographique 002 de l’HA, a été mesuré à plusieurs reprises. Des espacements de

2,7 et 2,8 Å (correspondant respectivement aux plans cristallographiques 300 et 112 ou 211

de l’HA) ont aussi été observés.

Les analyses chimiques des cristaux montrent qu’il s’agit d’apatites carbonatées déficitaires

en calcium (Tableau II.3).

Tableau II.3 : Résultats des analyses chimiques

Echantillon Ca/P (Ca+Na)/(P+C) % Sodium % carbonates

NanoAp 1,49 ± 0,01 1,40 ± 0,01 0,37 ± 0,04 2,60 ± 0,1

NanoAp-EtOH 1,51 ± 0,01 1,47 ± 0,01 0,38 ± 0,06 1,5 ± 0,1

54

Les valeurs des rapports Ca/P et (Ca+Na)/(P+C) sont plus élevées pour les échantillons

NanoAp-EtOH, traduisant une maturation plus importante. D’autre part, la quantité d’ions

carbonate présents dans les cristaux NanoAp-EtOH est plus faible, indiquant une perte d’ions

carbonate (sans doute sous forme de CO2) au cours de l’étape additionnelle. Le pourcentage

de sodium, contre-ion des anions phosphate et carbonate dans les solutions utilisées pour le

revêtement, est faible et comparable entre les deux types d’échantillons.

Les spectres FTIR indiquent qu’il existe des différences sensibles entre les deux types

d’apatites traduisant la réactivité de ces nanocristaux (Figure II. 4).

Figure II.4 : Spectres FTIR et domaines ν4PO4 et ν3CO3 des cristaux NanoAp et NanoAp-EtOH. Comme précédemment, nous constatons une diminution de la quantité d’ions carbonate. La

comparaison du domaine ν3CO3 (entre 1350 et 1700 cm-1) montre des intensités de bandes

plus faibles dans les cristaux NanoAp-EtOH. D’autre part, pour ces cristaux, une grande

partie des ions carbonate est substituée aux ions OH- (substitution de type A). Ce type de

substitution est très faible dans le cas des apatites NanoAp. L’étude du domaine ν4PO4 nous

indique par ailleurs, la présence d’ion OH- dans la structure apatitique des cristaux NanoAp-

EtOH alors que nous n’en distinguons pas pour les échantillons Nano-Ap. Nous pouvons

aussi constater la présence d’un environnement ionique non apatitique pour les deux types

d’apatites. La présence d’ions CO32- et HPO4

2- et PO43- labiles est notée. Ceci indique la

présence à la surface des cristaux d’une couche hydratée, déjà décrite et susceptible de

conférer aux cristaux une très grande réactivité. Cette couche hydratée, très sensible à l’état de

maturation des apatites nanocristalline, est cependant nettement réduite pour les échantillons

NanoAp-EtOH, en conformité avec les observations obtenues par diffraction des rayons X,

montrant une augmentation de la taille des domaines apatitiques corrélativement à la

diminution globale du taux de carbonates. Une décomposition des spectres (curve fitting) a

55

été réalisée. La décomposition du domaine ν4PO4 des cristaux NanoAp-EtOH est montrée à

titre d’exemple (Figure II.5).

Figure II.5 : Décomposition du domaine ν4PO4 des cristaux NanoAp-EtOH.

La décomposition des domaines ν4PO4, ν2CO3 et ν3CO3, qui donne une idée plus précise des

intensités des bandes relatives à chaque groupement, nous a permis de confirmer ces

observations (Tableau II.4). Cette analyse montre, en effet, une diminution des aires relatives

attribuées ions PO43-, HPO4

2- et CO32- non-apatitiques à la surface des cristaux NanoAp-EtOH

par rapport aux échantillons NanoAp. Comme nous l’avons indiqué d’autre part, la quantité

d’ions carbonate substitués en position A et d’ions OH- apparaît bien supérieure pour les

cristaux NanoAp-EtOH.

Tableau II.4: Aires relatives des bandes attribuées à différentes espèces ioniques par rapport à la somme des aires attribuées aux groupements phosphate du domaine ν4PO4.

Domaines Espèces NanoAp NanoAp-EtOH

PO43- non apatitique 0,11 ± 0,01 0,03 ± 0,01

HPO42- non apatitique 0,19 ± 0,01 0,14 ± 0,05 ν4 PO4

OH- Non détecté 0,17 ± 0,01

CO32- type A 0,020 ± 0,001 0,028 ± 0,001

ν3 CO3 CO3

2- labiles 0,08 ± 0,02 0,03 ± 0,01

56

4.2. Caractérisation des granulés

4.2.1. Morphologie des granulés revêtus

La morphologie des différents granulés revêtus a été évaluée par MEB (Figure II.6).

Figure II.6 : Micrographies MEB des granulés revêtus NanoAp et NanoAp-EtOH après 1 ou 2 revêtements (grossissement x100, barre d’échelle = 100 µm). Premièrement nous avons pu constater que l’ensemble du granulé était revêtu, aussi bien à

l’extérieur qu’à l’intérieur des pores. Le revêtement est bien présent au cœur de la céramique

avec une morphologie similaire à celle observée sur la surface extérieure des échantillons.

Cependant, sa structure très poreuse ne permet pas d’obtenir un dépôt homogène. En effet,

nous pouvons observer sur les échantillons NanoAp que le dépôt présente des craquelures

importantes, notamment au fond des pores où l’épaisseur de la couche nanocristalline est

grande. Contrairement aux granulés NanoAp, les granulés NanoAp-EtOH apparaissent plus

homogènes (moins de craquelures visibles). Les craquelures sont toujours visibles mais fines

et le dépôt recouvre donc l’ensemble de la céramique.

La multiplication du revêtement NanoAp accroît de manière importante l’homogénéité du

dépôt en raison de la superposition des couches de cristaux. La superposition est visible aussi

pour le procédé NanoAp-EtOH, mais le gain apparait plus limité.

Il est difficile de déterminer de manière précise l’épaisseur des revêtements. L’ordre de

grandeur peut cependant être évalué en mesurant la tranche des craquelures. Les deux types

57

de procédé conduisent à l’obtention d’un dépôt de quelques micromètres (de 2 à 8 µm en

général avec une moyenne à environ 5 µm d’après nos observations) (Figure II.7).

Figure II.7 : Micrographie par MEB des tranches des craquelures des dépôts NanoAp et NanoAp-EtOH (grossissement x1000, barre d’échelle = 10 µm).

4.2.2. Surface spécifique

Nous avons ensuite mesuré la surface spécifique des granulés en fonction du revêtement

appliqué. Ce paramètre constitue, en effet, une information indispensable dans le choix de nos

échantillons, puisqu’il est susceptible de jouer un rôle dans la réactivité des granulés revêtus.

Nous pouvons constater que l’ajout d’un revêtement induit une augmentation de la surface

spécifique des céramiques et que la multiplication du nombre de couches participe à cette

augmentation (Figure II.8). Cependant, pour des quantités de cristaux déposés équivalentes

(pourcentage massique du dépôt), les granulés revêtus par le procédé NanoAp-EtOH ont une

surface spécifique plus élevée. Ceci semble indiquer que d’autres paramètres participeraient à

cette augmentation.

Figure II.8 : Surface spécifique et pourcentage massique de revêtement présent à la surface des granulés.

58

Il faut noter que les valeurs de surface spécifique mesurées sont très faibles et présentent une

forte variabilité liée à l'incertitude instrumentale mais aussi à la reproductibilité des dépôts. La

variabilité due à la répétabilité du revêtement a été évaluée à environ 15%. L'incertitude

instrumentale peut quant à elle être diminuée par l’utilisation du mode multi-point du BET.

Les valeurs des surfaces spécifiques mesurées pour les granulés témoins et revêtus avec le

procédé NanoAp-EtOH, utilisés lors des expériences d’adsorption de la BMP-2, sont notées

dans le tableau II.5.

Tableau II.5 : Surface spécifique des granulés (p12/10) Témoins et NanoAp-EtOH et de la poudre NanoAp-EtOH lyophilisée.

Granulés Témoins 0,44 ± 0,09 m2/g

Granulés NanoAp-EtOH x1 2,03 ± 0,09 m2/g

Granulés NanoAp-EtOH x2 3,05 ± 0,15 m2/g

Poudre lyophilisée NanoAp-EtOH 84 ± 10 m2/g

Le revêtement NanoAp-EtOH induit une augmentation de la surface spécifique des granulés

d’un facteur 4,7. Ces valeurs semblent correspondre dans ce cas à la quantité de cristaux

déposés.

4.2.3. Porosité

Comme nous l’avons mentionné dans la partie introductive, la porosité des substituts osseux

semble particulièrement importante et détermine leurs capacités de reconstruction et leur

réactivité. La porosité des échantillons a été étudiée par porosimétrie à mercure (Figure II.9).

Les céramiques témoins présentent trois distributions de porosités : une macroporosité

(comprise entre 150 et 300 µm de diamètre, non visible sur ces graphes) et deux sortes de

distributions de pores de taille micrométrique d’environ 10 µm et 100 nm de diamètres.

Sur les granulés revêtus, nous ne notons pas de modifications majeures de la porosité initiale

du matériau. Les trois sortes de porosités peuvent être observées. De plus, une porosité

additionnelle à l’échelle nanométrique est observée.

59

Figure II.9 : Profil de porosité des granulés témoins et revêtus NanoAp-EtOH (mesures entre 8 et 60000 psi) (a) et micrographies MEB des pores (grossissement x10000, barre d’échelle = 1 µm) (b).

Pour les échantillons NanoAp-EtOHx1, la distribution des nouveaux pores est comprise entre

9 et 21 nm avec un maximum à environ 15 nm. Cette porosité de taille nanométrique a été

retrouvée sur les poudres nanocristallines obtenues dans des conditions similaires aux

revêtements. De même, une mesure des granulés NanoAp-EtOH par BET (adsorption et

désorption de gaz) confirme la présence d’une nano-porosité avec un diamètre moyen de 18

nm. Cette porosité additionnelle à l’échelle nanométrique pourrait donc être attribuée aux

espacements inter-nanocristaux.

La multiplication des revêtements entraine une augmentation du pourcentage de cette porosité

nanométrique et nous observons une augmentation de la largeur de la distribution. Un système

de pores additionnel semble exister, sur les échantillons revêtus en multicouche, à environ 20

nm de diamètre. Cette porosité pourrait être liée à l’espace entre couches de revêtements.

Des résultats similaires ont été obtenus pour les échantillons revêtus par le procédé NanoAp.

4.2.4. Echange ionique avec le strontium

Une des caractéristiques des apatites nanocristallines est une forte capacité d’échange ionique.

L’échange ionique avec le strontium qui est un ion d’intérêt biologique (action sur les

ostéoblastes et les ostéoclastes) a été étudié sur les différents granulés témoins et revêtus.

60

Tableau II.6 : Quantité de strontium échangé par les échantillons témoins et revêtus (Immersion dans une solution de SrCl2 à 1M pendant 30 minutes, lavages et séchages).

Granulés Sr en mg/g granulés Sr en mg/m2

Témoin 0,36 ± 0,01 0,53 ± 0,01

NanoApx1 1,14 ± 0,04 1,34 ± 0,05

NanoApx2 2,30 ± 0,05 1,42 ± 0,03

NanoAp-EtOHx1 1,05 ± 0,06 0,62 ± 0,04

Le taux de strontium échangé par gramme de granulés est largement supérieur (environ 3 fois

plus grand) sur les granulés revêtus en comparaison avec les granulés témoins (Tableau II.6).

Concernant les revêtements, la quantité totale de strontium échangée est peu différente entre

les échantillons NanoAp et NanoAp-EtOH. La multiplication du revêtement NanoAp induit

une nette augmentation de la quantité échangée.

L’expression de la quantité de strontium échangé par unité de surface montre que les

échantillons NanoAp présentent une capacité d’échange supérieure aux granulés NanoAp-

EtOH. En effet, pour les échantillons NanoAp, la quantité échangée/m2 est similaire qu’il y ait

un ou deux revêtements, par contre, la quantité échangée par les granulés NanoAp-EtOH est

beaucoup plus faible, et à peine supérieure à la quantité échangée par les granulés témoins.

5. Discussion

Dans cette partie, nous avons cherché à activer la surface de céramiques de BCP par la

réalisation d’un revêtement de phosphate de calcium réactif. Nous avons montré qu’il était

possible de réaliser un revêtement d’apatite carbonatée nanocristalline très réactive sur ces

céramiques malgré leur morphologie complexe.

5.1. Procédé de revêtement

Comme nous l’avons indiqué dans la partie introductive, différentes techniques de

revêtements existent et sont efficaces pour le dépôt d’hydroxyapatite par exemple sur des

matériaux de forme simple (Kokubo 2008). Afin de conférer au matériau une forte réactivité

de surface, il est préférable d’utiliser des méthodes de revêtements à faible température. Un

revêtement de composés phosphocalciques réactifs par nucléation-croissance a été envisagé

dans cette étude. En utilisant un protocole adapté du travail de Zhang et al., à partir de

solutions sursaturées, nous sommes parvenus à faire croître des cristaux à la surface des

61

céramiques de BCP (Zhang et al. 2005). Ces cristaux possédaient la morphologie

caractéristique du phosphate octacalcique (OCP) (croissance de fines plaquettes en rose des

sables). Cette méthode est, cependant, difficilement transposable à l’échelle industrielle et

s’adapte mal aux morphologies complexes (macro- et micro- porosités) nécessaires pour

l’efficacité biologique des matériaux de comblement osseux, d'après différents auteurs. Nous

avons constaté que la porosité importante des matériaux associée à leur caractère biphasique

conduisait à l’obtention d’un revêtement hétérogène (Figure II.10). Cet exemple est

représentatif des difficultés rencontrées pour le revêtement de matériaux de morphologie et de

composition complexes.

Figure II.10 : Dépôt de cristaux de morphologie caractéristique de l’OCP par l’utilisation de solutions sursaturées. Micrographies par MEB de la surface ou de l’intérieur des granulés (grossissement x5000, barre d’échelle = 1 µm).

Le procédé de revêtement choisi dans notre étude permet de recouvrir l’ensemble de la

surface de céramiques poreuses avec un dépôt très réactif dont les caractéristiques sont

identiques quelle que soit sa localisation dans le matériau (en surface ou à l’intérieur des

pores). D’autre part, il peut être facilement transposé à l’échelle industrielle et largement

modifié en fonction des caractéristiques recherchées. De plus, ce procédé offre la possibilité

d’ajouter des ions ou des molécules biologiquement actives à différentes étapes de la

réalisation.

5.2. Morphologie du revêtement

Une grande partie du travail réalisé a consisté à mettre au point un procédé permettant

d’obtenir un revêtement présentant une surface homogène, dépourvu de craquelures.

Il a été montré une influence de la micro-topographie de différents matériaux sur les réponses

cellulaires. En effet, la topographie de surface est susceptible de jouer un rôle tant au niveau

de l’adhésion, de la prolifération, de l’orientation que de la différenciation ostéoblastique des

62

cellules (Zinger et al. 2004, Ricci et al. 2008). Les réponses obtenues varient cependant de

manière importante en fonction de la taille et de la morphologie des pores et dans notre

situation, il semble donc difficile de prédire les conséquences de la présence de craquelures

allongées d’une largeur de l’ordre de 10 µm à la surface de nos céramiques sur la réponse

cellulaire.

D’un point de vue plus pratique, il nous a semblé plus intéressant d’obtenir un dépôt

homogène recouvrant l’ensemble de la céramique. Cela permet d’avoir un seul type de

composé (apatite nanocristalline) accessible aux fluides biologiques et aux cellules et une

surface de contact augmentée. D’autre part, bien que des tests d’adhérence classiques des

dépôts n’aient pu être réalisés sur les granulés en raison de leur morphologie complexes,

certaines observations tendent à montrer que l’adhérence des gros blocs de nanocristaux est

faible. Par exemple, des tests effectués sur les granulés NanoAp dans de l’eau désionisée ou

de l’éthanol dans un bain à ultrasons montrent que les gros blocs ont tendance à se détacher

de la surface plus facilement que les zones de dépôts fines et peu craquelées. Des observations

similaires ont été faites sur les échantillons après la réalisation de tests de perméabilité

(Bonnevialle et al. 2009).

5.3. Caractéristiques des nanocristaux

Les revêtements obtenus sont composés d’apatite carbonatée nanocristalline présentant des

caractéristiques proches de celles du minéral osseux. Les cristaux NanoAp, en particulier,

semblent similaires au minéral osseux : La taille et la forme des cristallites correspondent à

celle d’un os cortical jeune ou d’un os spongieux plus âgé (Kuhn et al. 2008). Les rapports

Ca/P, Ca/(P+C) et (Ca+Na)/(P+C) faibles sont comparables aussi aux rapports trouvés dans le

minéral osseux (Cazalbou et al. 2005, Kuhn et al. 2008). La quantité d’ions carbonate est

cependant plus faible, de l’ordre de 2,5% contre au moins 4% dans le minéral osseux. Il

semble qu’il y ait une perte de carbonates sous forme de CO2 lors des différentes étapes du

procédé de revêtement. Les intensités relatives des bandes des groupements OH-, PO43-,

HPO42- et CO3

2- sont aussi en correspondance avec les profils observés dans le minéral

osseux. La couche hydratée est présente et importante, suggérant une forte réactivité de ces

cristaux (Rey 2007).

Le procédé NanoAp-EtOH, en revanche, conduit à l’obtention de cristaux d’apatite

carbonatée dont les caractéristiques sont légèrement différentes de celles du minéral osseux

(même âgé). Ces cristaux présentent des altérations exacerbées mais semblables à celles

63

notées lors la maturation des apatites biologiques : augmentation de la taille des cristallites,

rapports Ca/P et (Ca+Na)/(P+C) augmentés, diminution importante de la couche hydratée,

augmentation relative de la quantité d’ions carbonate substitués en site de type A dans la

structure apatitique. Nous constatons, par ailleurs, une augmentation de la quantité d’ions OH-

dans l’apatite. Cette augmentation semble en accord avec la maturation des analogues de

synthèse mais diffère cependant de celle du minéral osseux. Cette observation est

nécessairement corrélée à la diminution des ions carbonate et au dégagement supposé de CO2:

CO32- → CO2 + O2-

puis en raison de l'instabilité des ions oxyde en présence d'eau :

O2- + H2O → 2 OH-

Cependant, ces résultats ne signifient pas que ce sont des carbonates de type A qui sont

affectés. En effet les résultats de diffraction des rayons X montrent nettement une

augmentation de la taille des domaines apatitiques dont la croissance pourrait être favorisée

par la diminution de la teneur en ions carbonate dans la couche hydratée, et sa déstabilisation.

La réaction suivante peut aussi intervenir dans la diminution des groupements carbonate et

hydrogénophosphate :

2HPO42- + CO3

2- → 2PO43- + CO2 + H2O

D’autre part, la réaction d’hydrolyse des ions phosphate peut aussi participer à l’augmentation

de la quantité des ions OH- et HPO42- dans la structure apatitique.

PO43- + H2O → HPO4

2- + OH-

Cette maturation des nanocristaux NanoAp-EtOH est liée à l’étape additionnelle dans notre

procédé de revêtement mais des expériences complémentaires indiquent que cette évolution

dépend principalement des conditions appliquées lors de cette étape supplémentaire et non de

l’utilisation d’un solvant alcoolique (résultats non montrés).

5.4. Comparaison des granulés revêtus

5.4.1. Surface spécifique

La surface spécifique et la microporosité, qui sont souvent des paramètres associés, sont

susceptibles de jouer un rôle important dans l’adsorption de protéines ou l’ostéoinduction des

matériaux (Gautier et al. 1998, Habibovic et al. 2005, Zhu et al. 2008).

Les revêtements induisent une forte augmentation de la surface spécifique, initialement faible,

des céramiques de BCP. Celle-ci est corrélée pour chaque type de revêtements à la quantité de

64

nanocristaux déposés : le rapport surface spécifique sur pourcentage massique est équivalent

pour les échantillons revêtus 1 ou 2 fois. Toutefois, ce rapport apparaît différent pour les deux

types d’échantillons (NanoAp ou NanoAp-EtOH). La surface spécifique des échantillons

NanoAp-EtOH semble correspondre aux résultats attendus (en raison de la surface spécifique

de la poudre de revêtement et de la quantité de dépôt). Ceci semble indiquer que la majeure

partie de la surface des nanocristaux du revêtement est accessible pour l’adsorption des

molécules d’azote. En revanche, la surface spécifique est plus faible pour les granulés revêtus

par le procédé NanoAp que pour les échantillons NanoAp-EtOH. Ce phénomène ne peut pas

s'expliquer par les caractéristiques intrinsèques des nanocristaux, puisque c'est l'inverse qui

serait alors observé : d'après les résultats de DRX, les domaines apatitiques sont plus grands

dans NanoAp-EtOH que dans NanoAp. Il faut tout d’abord prendre en compte le fait que le

revêtement NanoAp, plus craquelé présente une adhérence plus faible. Des morceaux de

revêtements pourraient alors se détacher lors de la manipulation des échantillons et conduire à

des surfaces spécifiques mesurées plus faibles. Le procédé NanoAp semble aussi conduire à

un retrait plus important suggérant une densité plus grande et des interactions intercristallines

plus importantes pouvant soustraire une partie de la surface à l'adsorption d'azote. Le

revêtement apparaît cependant poreux et les dimensions de ces pores (entre 10 et 20 nm de

diamètre) semblent compatibles avec la pénétration des molécules d’azote de petites tailles à

l’intérieur du dépôt. Nous pouvons enfin envisager que la présence de la couche hydratée,

importante pour les échantillons NanoAp puisse interférer avec l’adsorption des molécules

d’azote à la surface des cristaux.

5.4.2. Porosité

Comme nous l’avons mentionné à plusieurs reprises, la porosité des matériaux semble un

élément essentiel, d'après différents auteurs, pouvant déterminer l'efficacité de la

reconstruction osseuse : La macroporosité (avec des pores supérieurs à 100 µm) permet

l’invasion cellulaire alors que la microporosité (pores inférieurs à 10 µm) augmente la surface

spécifique des échantillons et peut être responsable de la formation de micro-environnements

(Habibovic et al. 2005). Ces deux types de porosités sont présents dans les céramiques

initiales et revêtues. En raison de l’épaisseur des revêtements (2 à 5 µm environ), la

conservation des micro-porosités sans changement majeur à la surface des échantillons

revêtus apparaît cependant étonnante. On peut envisager qu’une partie du dépôt soit arraché

lors de l'intrusion du mercure et permette l'accès aux pores de la céramique sous-jacente.

65

Il a été suggéré dans l'étude de matériaux céramiques ostéoinducteurs que la micro-porosité

pouvait accroitre les capacités d’adsorption des protéines (Zhu et al. 2008). L’addition d’une

nouvelle porosité à l’échelle nanométrique (environ 15 nm de diamètre) par le revêtement

paraît donc très intéressante et pourrait éventuellement contribuer à une amélioration

significative des propriétés des céramiques. La porosimétrie à mercure n’est cependant pas la

méthode la plus adaptée pour l’étude des mésopores car elle peut entrainer une destruction de

l’échantillon. Cela dit, cette porosité a aussi été observée par la méthode BET. De plus, des

pores de diamètre équivalent ont été mesurés sur les poudres cristallines obtenues dans des

conditions identiques aux revêtements ; ce qui semble confirmer que cette nouvelle porosité

peut bien être attribuée à l’espacement entre les cristaux.

Des analyses complémentaires faisant appel à des techniques différentes, telles que la mesure

de la porosité par calorimétrie sont envisagées (Hartmann et al. 2008). Cela permettrait

notamment d’aboutir à une mesure plus précise du diamètre des nanopores.

5.4.3. Echange avec le strontium

L’échange ionique avec le strontium est bien supérieur en présence des revêtements. Il a déjà

été montré que les apatites nanocristallines possédaient des capacités d’échange ionique très

importantes. Le strontium notamment s’échange rapidement avec les ions calcium des apatites

analogues au minéral osseux (Cazalbou 2000). Cazalbou et al. ont montré que cet échange

rapide faisait intervenir en premier lieu les ions labiles présents à la surface des cristaux et

était réversible. Lors de la maturation des cristaux cependant, le strontium initialement présent

dans la couche hydratée s’intègre progressivement aux domaines apatitiques en croissance et

ne peut alors plus être échangé (Cazalbou 2000, Cazalbou et al. 2004, Cazalbou et al. 2005).

Dans notre étude, nous avons effectué un échange sur les échantillons revêtus pendant

seulement 30 minutes. Nous sommes donc en droit de penser que cet échange s’est fait

essentiellement par l’intermédiaire des ions présents dans la couche hydratée des nanocristaux

et que celui-ci est donc réversible. Il a été montré que la réduction de la couche hydratée au

cours de la maturation s’accompagnait d’une diminution des capacités d’échange ionique et

d’adsorption protéique des apatites biologiques et de leurs analogues de synthèse (Ouizat et

al. 1999, Cazalbou et al. 2005). Dans notre étude, la quantité de strontium échangée par unité

de surface est assez faible pour les granulés NanoAp-EtOH. Cette observation semble bien

indiquer que la couche hydratée est impliquée dans ces processus d’échange. En effet, celle-ci

est très faible dans le cas des échantillons NanoAp-EtOH. Mais cette faible capacité

66

d’échange est compensée par une surface accessible, mesurée par BET, accrue, permettant

aux granulés NanoAp-EtOH d’échanger une quantité globale de strontium finalement

équivalente à celle présente sur les granulés NanoAp.

6. Conclusion et perspectives

Dans ce travail, nous avons choisi d’utiliser des matériaux déjà commercialisés ayant prouvé

leur efficacité en tant que substituts osseux et d’améliorer leur réactivité de surface,

initialement faible. Nous avons montré qu’il était possible d’effectuer un revêtement d’apatite

nanocristalline à leur surface même à l'intérieur des granulés poreux. Deux types de

revêtements ont été choisis pour être caractérisés. Le premier, NanoAp, possède des

caractéristiques similaires au minéral osseux, dont la présence d’une importante couche

hydratée à la surface des nanocristaux, mais il ne recouvre pas la céramique de manière

homogène. Le second, NanoAp-EtOH, comporte une étape supplémentaire avec un solvant

alcoolique qui permet d’obtenir un revêtement plus homogène mais conduit à une maturation

accrue des cristaux, ce qui suppose une diminution de leur réactivité de surface. Quoi qu’il en

soit, nous avons pu montrer que l’ajout de ces deux types de revêtements permet d'accroitre

de manière significative la surface spécifique accessible des céramiques de BCP notamment

pour les granulés revêtus avec NanoAp-EtOH. Les macro- et micro-porosités de la céramique

initiale semblent conservées et une porosité additionnelle d’une quinzaine de nanomètres de

diamètre est observée. Cette nouvelle porosité pourrait apporter un avantage substantiel aux

échantillons. Enfin, les capacités d’échange avec l’ion strontium sont bien supérieures en

présence des revêtements NanoAp ou NanoAp-EtOH.

Les capacités d’adsorption protéiques de ces deux types de granulés revêtus seront comparées

dans le chapitre suivant. Le choix du type de revêtement conservé pour la suite des études

sera effectué à l’issue de ces expériences d’adsorption.

Comme nous l’avons mentionné dans ce paragraphe le procédé peut permettre la réalisation

de dépôts nanocristallins de caractéristiques très différentes. Nous avons étudié l’influence de

différents facteurs sur la morphologie ou la surface spécifique des échantillons revêtus.

D’autres paramètres susceptibles d’avoir une influence notable sur les caractéristiques du

dépôt pourraient faire l’objet de nouvelles études : la quantité d’ions carbonate, par exemple,

peut être modifiée pour se rapprocher de celle du minéral osseux. D’autre part, l’ajout d’ions

magnésium (présents dans les apatites biologiques) pourrait à la fois influer sur les

67

caractéristiques biologiques du revêtement (Sader et al. 2008, Xue et al. 2008) mais aussi sur

la morphologie du revêtement, en réduisant les craquelures (Sarda et al. 2000).

D’autre part, une caractérisation poussée des deux types de revêtements a été effectuée ;

cependant certains paramètres physiques comme l’énergie ou le potentiel de surface ou la

vitesse de dissolution de ces cristaux n’ont pas pu être déterminés. Ceci pourrait faire l’objet

d’études ultérieures. Une évaluation des effets de la stérilisation par rayonnement gamma sur

les caractéristiques des matériaux est, par ailleurs, en cours de réalisation.

En outre, nous avons réalisé au sein du laboratoire de biomécanique une étude préliminaire

concernant la perméabilité hydraulique des échantillons témoins et revêtus soit par le procédé

NanoAp soit par de l’OCP (Bonnevialle et al. 2009). Cette étude a montré que le revêtement

NanoAp modifiait significativement la perméabilité des échantillons. Ce paramètre est

susceptible de jouer un rôle important in vivo : La circulation des fluides biologiques,

directement liée à la perméabilité des substituts osseux, permet d’une part l’acheminement

des molécules nécessaires à la survie, prolifération et différenciation cellulaire à l’intérieur de

l’implant et, d’autre part, induit des contraintes mécaniques susceptibles de participer

notamment à la différenciation cellulaire (mécanotransduction) (Riddle et al. 2009). Il serait

donc intéressant de poursuivre ces études de perméabilité en effectuant, par exemple, des

comparaisons entre différents types de revêtement. Enfin, effectuer des tests de perméabilité

en appliquant des contraintes de cisaillement liée à la circulation de fluides pourrait aussi être

un moyen d’étude de l’adhérence des dépôts et de leur évolution physico-chimique en

conditions dynamiques, par exemple.

Chapitre 3

Etude de l’adsorption et de la libération de la rhBMP-2 sur les céramiques de BCP revêtues

d’un dépôt d’apatite carbonatée nanocristalline

68

Dans ce chapitre, nous avons étudié les propriétés d’adsorption et de désorption de granulés

de BCP non révêtus ou revêtus par des procédés décrits précédemment vis-à-vis d’une

protéine, la rhBMP-2. Une partie bibliographique, ciblée sur les paramètres majeurs

susceptibles d’influer sur les propriétés d’adsorption et de désorption de la BMP-2 sur nos

granulés de BCP, précède la description des objectifs de ce chapitre.

1. Introduction bibliographique

1.1. Adsorption de protéines sur l’hydroxyapatite

L’hydroxyapatite présente une grande capacité d’adsorption des protéines et est couramment

utilisée en chromatographie pour la rétention et la séparation de protéines, d’acides

nucléiques, de virus et autres molécules biologiques. De nombreuses études relatent les

propriétés d’adsorption de l’hydroxyapatite vis-à-vis de différentes protéines (Barroug et al.

1998, Ohta et al. 2002, Kandori et al. 2005) et s’intéressent aux mécanismes mis en jeu lors

de l’adsorption. Il a été montré que l’HA présentait deux types de sites d’adsorption : les sites

C, correspondant aux ions calcium chargés positivement et les sites P, associés aux ions

phosphate de la structure, qui sont chargés négativement.

Les interactions physiques impliquant les forces coulombiennes entre l’adsorbat et l’adsorbant

sont considérées par beaucoup comme le facteur principal d’adsorption. La protéine est en

général caractérisée par son point isoélectrique et l’adsorbant par son potentiel zéta. Ces deux

paramètres définissent les charges globales de surface des composés dans des conditions

expérimentales données. Le potentiel de surface de l’adsorbant varie en fonction des ions

présents en solution (H+, OH-, Ca2+, PO43-, Mg2+, CO3

2-…) qui vont pouvoir s’adsorber sur les

échantillons. La présence d’ions HPO42- en surface devrait, par exemple, conduire à une

adsorption préférentielle d’ions calcium, modifiant ainsi la charge de surface de l’adsorbant.

Les protéines dites « acides » (pI<7) qui possèdent des groupements carboxyliques ou

phosphate sont susceptibles de s’adsorber sur les sites calcium de l’HA et sont éluées par

l’augmentation de la concentration en ions phosphate. Alors que les protéines « basiques »

(pI>7) qui possèdent des groupements chargés positivement, vont s’adsorber au niveau des

sites P de l’HA et sont éluées par des solutions cationiques d’ions calcium.

Dans le cas de l’adsorption du lysosyme par l’HA, il a été montré que les interactions

préférentielles sont liées à l’attraction entre le lysosyme chargé positivement à pH neutre et

l’HA chargée négativement (Kandori et al. 2005). Dans ce cas, les interactions mises en jeu

sont faibles et l’adsorption est réversible.

69

Ohta et al. ont étudiés l’adsorption de protéines sur plusieurs composés phosphocalciques

(HA, phosphate dicalcique dihydraté (DCPD), phosphate dicalcique anhydre (DCPA) et

β-TCP) (Ohta et al., 2001, Ohta et al. 2002). Dans ces études, ils suggèrent que l’adsorption

dépend du nombre de sites C et P disponibles et du potentiel zéta de l’adsorbant, d’une part, et

du pI de la protéine d’autre part. Pourtant, ils n’ont pu démontrer de corrélation directe simple

entre le point isoélectrique des protéines et l’adsorption de celles-ci sur les composés

phosphocalciques.

1.2. Adsorption de protéines acides

Les mécanismes d’adsorption de la BSA, ou d’autres protéines acides, sur l’HA semblent

complexes et ne sont pas clairement définis : Yin et al. montrent que l’adsorption de BSA est

un phénomène rapide qui fait intervenir essentiellement des interactions physiques liées aux

charges électrostatiques (Yin et al. 2002). De même Barroug et al. discutent leurs résultats

concernant l’adsorption du lysozyme succinylé et de la catalase par rapport aux forces de

répulsions de charges mises en jeu lors de l’adsorption (Barroug et al. 1997, Barroug et al.

1998). Ils indiquent cependant que d’autres mécanismes impliquant des interactions

hydrophobes et des altérations de la conformation de la protéine sont susceptibles de jouer un

rôle. De tels mécanismes sont aussi envisagés par Zhu et al. dans l’adsorption de la BSA sur

différentes céramiques phosphocalciques (HA, β-TCP, BCP) (Zhu et al. 2007). Kandori et al.

indiquent, d’autre part, que l’adsorption de la BSA sur l’HA serait essentiellement gouvernée

par un effet des contre-ions en solution (Kandori et al. 2005). Quels que soient les

mécanismes mis en jeu, après adsorption de BSA sur l’HA, sa désorption, quasiment

irréversible, nécessite de très grandes concentrations en ions phosphate, indiquant des liaisons

fortes entre l’HA et la BSA (Ohta et al. 2002, Kandori et al. 2005).

1.3. Adsorption de la BMP-2

L’adsorption de BMP-2 par l’hydroxyapatite n’a fait l’objet que trois études. La modélisation

des mécanismes d’adsorption de la rhBMP-2 sur la face 001 de l’hydroxyapatite menée par

Dong et al. suggère l’implication de 3 groupements dans ce processus : D’une part, les

groupements COO- qui vont interagir avec les sites calcium de l’HA et d’autre part, les

fonctions NH2 et OH de la BMP qui vont former des ponts hydrogènes entre eux et avec les

sites phosphate de l’adsorbant (Dong et al. 2007). Boix et al., dans une étude expérimentale

70

de l'adsorption de BMP-2 sur de la poudre d’HA, montrent que l’ajout d’ions calcium en

solution conduit à une augmentation importante de la quantité maximale de BMP-2

adsorbable, et qu’à l’inverse l’ajout d’ions phosphate inhibe l’adsorption de la protéine. Cette

étude suggère là aussi que l’adsorption de la BMP-2 sur l’HA se produit essentiellement via

une interaction entre les groupements COO- de la protéine et les ions calcium de l’HA (Boix

et al. 2005). Une troisième étude compare l’adsorption de BMP-2 bovine sur des céramiques

de HA ou de BCP de différentes compositions. Ils montrent que la désorption de cette

protéine est quasiment irréversible et ne se produit qu’en présence d’ions phosphates,

indiquant une forte interaction entre la protéine et les ions calcium de l’apatite (Yuan et al.

1998).

1.4. Paramètres influençant l’adsorption de protéines sur les Ca-P

Dans la majorité des cas, l’adsorption de différentes protéines sur l’HA se fait en une

monocouche : Les isothermes d’adsorption sont, en effet, caractéristiques du modèle de

Langmuir et sont parfaitement décrits par l’équation de Langmuir suivante:

KCCKNQ+

=1

Avec :

Q : Quantité de protéine adsorbée par unité d’adsorbant

C : concentration à l’équilibre de la protéine en solution

N : Nombre maximum de sites d’adsorption par unité d’adsorbant

K : Constante d’affinité de la protéine pour l’adsorbant

Différents types de protéines sont absorbées par ce modèle : lysozyme natif et succinylé,

catalase, BSA, BMP-2 (Hughes Wassel et al. 1995, Barroug et al. 1997, Barroug et al. 1998,

Ouizat et al. 1999, Yin et al. 2002, Boix et al. 2005, Kandori et al. 2005). Les paramètres

d’adsorption N et K peuvent être définis à partir de cette équation. Le tableau III.1 mentionne

les valeurs de ces paramètres déterminés dans quelques études concernant l’adsorption de

protéines sur l’HA.

71

Tableau III.1 : Valeurs des paramètres d’adsorption de différentes protéines sur l’hydroxyapatite décrits dans la littérature. Protéine N x 108 (mol/m2) K x 10-6 (M-1) Références

BMP-2 3,8-11,5 0,24-23 (Boix et al. 2005)

BSA 2,3-4,2 0,03-16 (Ouizat et al. 1999)

Lysozyme succinylé 1,2-8,2 0,01-116 (Barroug et al. 1997)

BSA 0,6 - 1,8* mg/m2 100-1685* L/g (Hughes Wassel et al. 1995)

Dans ces différentes études, impliquant des protéines acides ou la BMP-2, les auteurs

montrent une forte influence des conditions expérimentales sur les valeurs des paramètres

d’adsorption N et K. Il y a une influence, d’une part, des conditions physico-chimiques de

l’adsorption des protéines et, d’autre part, des caractéristiques intrinsèques du matériau utilisé

en tant qu’adsorbant. Nous indiquons ici quelques paramètres susceptibles de modifier la

quantité de protéine adsorbée à saturation.

1.4.1. Conditions d’adsorption

• Ajout d’ions calcium ou phosphate Ce paramètre semble très influent sur la quantité de protéine fixée. Dans le cas des protéines

se fixant préférentiellement par leurs groupements COO-, l’ajout de calcium conduit à une

augmentation de la quantité de protéine adsorbée (Hughes Wassel et al. 1995, Barroug et al.

1998, Ouizat et al. 1999, Boix et al. 2005). Les ions calcium en solution vont se fixer sur les

sites phosphate de l’apatite ; la présence de calcium en solution peut conduire à un

changement de polarité de la surface de l’HA, facilitant les interactions électrostatiques avec

les groupements chargés négativement (Yin et al. 2002). Les ions calcium sont, par ailleurs,

capables de se fixer directement sur les protéines comme la BSA et des ponts calcium peuvent

donc se former entre la protéine et l’HA (Hughes Wassel et al. 1995).

A l’inverse la présence d’ions phosphate inhibe partiellement ou totalement l’adsorption de

telles protéines, en rentrant en compétition avec les sites C de l’HA.

• Le pH et la force ionique D’une manière générale, il a été montré que la quantité maximale de molécules adsorbées

augmente lorsque le pH se rapproche du pI de la protéine (Hughes Wassel et al. 1995,

Barroug et al. 1997, Barroug et al. 1998, Boix et al. 2005). Par ailleurs, l’augmentation de la

force ionique jusqu’à un certain seuil (différent selon les études), conduit à une augmentation

72

de la quantité de protéines « acides » adsorbée (Hughes Wassel et al. 1995, Barroug et al.

1997, Barroug et al. 1998, Boix et al. 2005).

• La température d’incubation La température peut avoir une influence sur la quantité de protéine adsorbée mais cet effet

peut être différent d’une étude à l’autre, selon les protéines envisagées. Yin et al. ont montré,

par exemple, que la quantité de BSA adsorbée à saturation augmentait de presque 20%

lorsqu’on passait d’une température de 18,5°C à 30°C (N = 41,5 et 49 mg/g, respectivement)

(Yin et al. 2002), alors qu’une autre étude concernant l’adsorption de statherine, une protéine

de la salive, sur l’HA montre que celle-ci est quasiment indépendante de la température de

l’étude, avec peut-être même une légère diminution de la quantité adsorbée quand la

température augmente (Goobes et al. 2006).

1.4.2. Influence des caractéristiques de l’adsorbant

• La présence de β-TCP dans les échantillons

Comme nous l’avons indiqué, de nombreux travaux relatent des propriétés d’adsorption de

l’hydroxyapatite mais, en revanche, peu d’études ont été effectuées sur le β-TCP ou des

céramiques de BCP. Yuan et al. (Yuan et al. 1998) ont montré que l’adsorption d’une BMP-2

bovine diminuait lorsque le pourcentage de β-TCP dans des céramiques de BCP augmentait.

De même, Pellenc et al. ont observé une adsorption de fibronectine très faible sur des disques

de BCP alors que celle-ci était très importante sur l’HA ou le β-TCP seul, et ont indiqué que

la présence de deux composés pouvait diminuer l’adsorption (Pellenc et al. 2006). Zhu et al.

ont comparé l’adsorption du lysozyme et de la BSA sur l’HA, le β-TCP ou des céramiques de

BCP. Alors que l’adsorption du lysozyme est peu différente sur les trois types d’échantillons,

l’adsorption de la BSA est très largement supérieure sur les granulés de BCP en comparaison

avec les produits purs. Le caractère biphasique de ces composés semblerait donc intervenir

dans l’adsorption de la BSA, en modifiant, d’après ces auteurs, l’hydrophobicité modérée

observée pour l’HA ou le β-TCP (Zhu et al. 2007). Ohta et al. ont montré, en outre, qu’il

existait des différences d’adsorption et d’élution de la BSA sur le β-TCP, par rapport aux

autres composés phosphocalciques. L’adsorption de la BSA sur l’HA, le DCPA ou le DCPD

est quasiment irréversible et son élution ne se produit qu’en présence de fortes concentrations

en ions phosphate ; les molécules de BSA adsorbées sur du β-TCP sont, en revanche, éluées

très facilement à une très faible concentration en ions phosphate (Ohta et al. 2001).

73

• La surface spécifique et la porosité des échantillons Gautier et al. ont souligné l’influence de la surface spécifique d’échantillons

phosphocalciques (apatite déficiente en calcium et phosphates de calcium biphasiques

(HA/β-TCP : 56/44) sur l’adsorption d’une hormone de croissance et sur sa cinétique de

libération in vitro, dans du PBS. Ils démontrent qu’au-delà d’un certain seuil, la surface

spécifique est fortement corrélée à la quantité de protéine adsorbée, alors que cette influence

ne semble pas primordiale pour les échantillons présentant une faible surface spécifique

(Gautier et al. 1998). Matsumoto et al. aussi ont montré que l’adsorption de cytochrome c sur

des échantillons d’HA était directement reliée à leur surface spécifique (Matsumoto et al.

2004).

Quelques auteurs discutent de l’influence de la porosité sur l’adsorption des protéines :

Habibovic et al. indiquent que l’ostéoinduction due aux matériaux pourrait être liée à leur

microporosité et que, dans ce cas, l’adsorption de protéines des fluides biologiques pourrait

être facilitée (Habibovic et al. 2005). Rouahi et al. ont, d’autre part, montré que l’adsorption

de protéines contenues dans du sérum est favorisée par l’existence de pores sur les matériaux

phosphocalciques (Rouahi et al. 2006b). Les mêmes observations ont été faites par Zhu et al.

qui ont étudié l’adsorption de TGF-β1 sur des pastilles denses ou poreuses de BCP. A l’instar

de leur résultats in vitro, l’implantation intramusculaire de ces céramiques placées dans des

chambres de diffusion chez la souris pendant 3 et 7 jours montre que la microporosité

augmente très fortement la quantité de TGF-β1 adsorbée sur les échantillons (Zhu et al.

2008).

• La présence d’une couche hydratée à la surface des échantillons Ouizat et al. ont montré que le taux d’adsorption de la BSA sur les apatites mal cristallisée

était dépendante de l’état de maturation de celles-ci. En effet, les apatites présentant le plus

faible temps de maturation présentaient une capacité d’adsorption supérieure à celle des

autres. Cet effet avait été relié à la présence d’ions labiles dans la couche hydratée, donnant

aux apatites nanocritallines leur réactivité (Ouizat et al. 1999). De même, Midy et al. ont

comparé l’adsorption de deux protéines, le VEGF et le FGF, sur des poudres d’hydroxyapatite

ou d’apatites carbonatées présentant des surfaces spécifiques élevées et une forte quantité

d’ions labiles. Ils ont montré que l’adsorption de ces protéines était largement accrue sur les

échantillons d’apatite carbonatée. Ce phénomène a été relié à la présence à leur surface de

cette couche hydratée très réactive, capable d’échanger facilement les ions non contenus dans

la maille de l’apatite (Midy et al. 1998, Midy et al. 2001).

74

1.5. La libération

En général, dans les études effectuées chez l’animal, les protéines d’intérêt, susceptibles

d’avoir un effet ostéoinducteur, sont associées directement sur les biomatériaux par simple

dépôt d’une goutte concentrée et séchage de celle-ci. La libération de ces protéines associées

est par ailleurs rarement étudiée. Cependant, il est maintenant acquis qu’une libération

soutenue dans le temps constitue un élément majeur dans la capacité de reconstruction des

systèmes d’association biomatériaux-protéines (Seeherman et al. 2005).

La désorption de protéines, adsorbées sur l’HA ou d’autres composés phosphocalciques a été

régulièrement étudiée, notamment en chromatographie. Il est, par exemple, clairement définit

que l’adsorption de la BSA sur l’HA est quasiment irréversible et que son élution ne peut se

produire qu’en présence de fortes concentrations en ions phosphate (Ohta et al. 2001, Ohta et

al. 2002, Kandori et al. 2005). Les propriétés de désorption sont différentes selon les protéines

étudiées et le type de phosphate de calcium considéré comme l’on montré Ohta et al. (Ohta et

al. 2001, Ohta et al. 2002). Selon le mode fixation de la protéine, essentiellement sur les sites

C ou P, la désorption sera différente. La papaïne, par exemple, qui présente un pI entre 8,8 et

9,5 peut être désorbée très facilement dans du milieu SBF, alors que ce n’est pas le cas, des

protéines « acides ». D’autre part, l’élution de la BSA est différente selon qu’elle ait été

adsorbée sur du β-TCP ou d’autres composés phosphocalciques. Sur le β-TCP, l’élution se

fait facilement en présence d’une faible quantité d’ions phosphate.

La désorption de la BMP-2 n’a fait l’objet que d’une seule étude : Yuan et al. ont montré que

la BMP-2 bovine adsorbée sur des disques de HA ou BCP était uniquement désorbée en

présence d’ions phosphate (Yuan et al. 1998). De même, considérant l’adsorption de FGF ou

de VEGF sur l’HA ou des apatites carbonatées, seule un faible pourcentage de protéine est

libérée dans du TBS (Midy et al. 1998, Midy et al. 2001). Le pourcentage de libération du

cytochrome c adsorbé sur l’HA est très faible à pH 7 (Matsumoto et al. 2004).

Il est à noter, enfin, que la surface spécifique des adsorbats semble aussi jouer un rôle dans le

temps de libération des protéines. Le temps nécessaire pour que la moitié de la protéine

(hormone de croissance) soit désorbée dans du PBS contenant du sérum est largement

supérieur pour des échantillons présentant des surface spécifiques élevées (Gautier et al.

1998).

75

En résumé, ces différentes études concernant l’adsorption et la désorption de protéines sur des

composés phosphocalciques montrent que les mécanismes d’adsorption envisagés sont variés,

et diffèrent d’une étude à l’autre. Différents modèles d’adsorption sont proposés :

- Des modèles physiques faisant appel à des interactions dirigées par la charge de

surface des échantillons et le pI des protéines d’une part, ou à des interactions

hydrophobes, reliées à l’énergie interfaciale des échantillons, d’autre part.

- Des modèles chimiques impliquant des liaisons fortes entre l’adsorbant et

l’adsorbat. Dans ce cas, deux types de mécanismes peuvent être considérés :

L’association de la protéine sur des sites d’adsorption spécifiques sans réaction

chimique ou bien l’adsorption sur l’adsorbant par réaction d’échange ionique. Ce

dernier mécanisme a été proposé notamment comme mécanisme d’adsorption du

biphosphonate ou de l’héparine sur l’HA (Errassifi et al. 2009).

Beaucoup de questions sont donc encore en suspens et la compréhension des mécanismes

d’adsorption nécessitent des études plus approfondies. Etant donné le caractère appliqué de

notre projet, nous n’avons pas effectué de recherche des mécanismes mis en place lors de

l’adsorption de protéines sur nos échantillons, mais nous avons utilisé les données

expérimentales de la littérature.

2. Objectifs de l’étude

Les différents éléments décrits ci-dessus nous ont permis de penser que l’association de

céramiques de BCP avec des revêtements nanocristallins, très réactifs, pourrait favoriser

l’adsorption de protéines et une désorption de celles-ci soutenue dans le temps. Dans ce

chapitre, nous avons évalué la capacité de différents échantillons à adsorber la rhBMP-2 qui

est la protéine d’intérêt de notre étude. C’est l’adsorption de cette protéine sur nos

échantillons qui constituait à notre avis le facteur limitant concernant le choix final du type de

revêtement à utiliser pour la suite de l’étude. Nous avons donc comparé les capacités

d’adsorption de granulés de BCP non revêtus et revêtus avec deux types de procédés décrits

dans le chapitre précédent : les procédés NanoAp et NanoAp-EtOH. Les résultats obtenus

nous ont permis de déterminer le type de revêtement qui semblait présenter le plus fort

avantage.

Une fois ce choix effectué, nous avons poursuivit la caractérisation des échantillons témoins

et revêtus vis-à-vis de leur propriétés d’adsorption et de désorption de la rhBMP-2. Il était, en

effet, important de connaître les caractéristiques de ces échantillons en vue des études

76

réalisées par la suite, c'est-à-dire des expériences en culture cellulaire et des implantations

chez l’animal.

3. Matériel et méthodes

3.1. Réactifs

3.1.1. Adsorbant

L’adsorption des protéines est réalisée sur les micro-granulés de BCP (CERAFORM, poudre

12/10) revêtus ou non avec les différents dépôts décrits dans le chapitre précédent. Les

granulés non revêtus, notés granulés témoins, ont été calcinés et conservés à -20°C comme les

granulés revêtus. Les résultats obtenus ont par ailleurs été validés pour des granulés de forme

différente (granulés cubiques de 3 mm de côté).

3.1.2. Adsorbat : La rhBMP-2 non-glycosylée

La BMP-2 nous a été fournie par le Professeur W. Sebald de l’université de Würtsburg. Il

s’agit d’une BMP-2 recombinante humaine (rhBMP-2) exprimée chez E.coli. Cette protéine

n’a donc pas subit les modifications post-traductionnelles de glycosylation. Elle est

caractérisée par une masse molaire de 25,8 kDa, un point isoélectrique d’environ 8,2 et une

faible solubilité dans les conditions physiologiques (environ 2 µM) (Ruppert et al. 1996,

Abbatiello et al. 1997).

3.2. Adsorption de la rhBMP-2

L’adsorption de la rhBMP-2 par les céramiques est déterminée par l’utilisation d’un traceur,

rhBMP-2 radiomarquée, ajouté à une solution de BMP-2 froide. Cette méthode permet de

déduire avec une bonne précision la quantité de protéine adsorbée à partir des mesures de la

BMP-2 restante en solution. Il est par ailleurs possible de mesurer l’adsorption de la protéine

directement sur les granulés et de suivre sa désorption dans du milieu de culture en présence

d’autres protéines.

77

3.2.1. Marquage de la BMP-2

Le marquage radioactif de la BMP-2 a été réalisé par une méthode modifiée de la

chloramine T (Frolik et al. 1984). Il s’agit d’une méthode d’oxydation du groupement phénol

des tyrosines ou de la chaîne latérale de résidus histidines constituant la protéine par la

chloramine T en présence de Na125I. Ces composés oxydés vont réagir avec le Na125I ce qui

donne une protéine marquée à l’iode radioactif. Le marquage s’effectue selon le protocole

suivant :

10 µg de BMP-2 sont dissouts dans 50 µl d’un tampon phosphate (0,25M, pH 7,5) et

mélangés à 10 µl de Na125I (1 mCi). La réaction est initiée par l’ajout de l’agent oxydant à

température ambiante (solution de chloramine T à 0,1 mg/ml dans du tampon phosphate).

Trois ajouts successifs sont effectués : 5 µl pendant 2 minutes, 5 µl pendant 1,5 minutes, et 5

µl pendant 1 minute. La réaction est stoppée par l’addition de 20 µl de L-tyrosine (50mM),

200 µl d’iodure de potassium (60 mM) and 200 µl d’urée ultrapure (1,2 mg/ml d’acide

acétique 1M). La séparation de la BMP-2 radiomarquée, 125I-rhBMP-2, est ensuite effectuée

avec une colonne de chromatographie Sephadex G25 préalablement équilibrée. La 125I-rhBMP-2 est éluée avec la solution suivante : 4 mM HCl, 75 mM chlorure de sodium,

0,1% BSA.

3.2.2. Protocoles d’adsorption de la BMP-2 par les granulés

Les protocoles d’adsorption sont basés sur des expériences précédentes qui avaient

montré une augmentation de la quantité maximale adsorbée de plusieurs protéines, dont la

BMP-2, en présence d’ions calcium (Hughes Wassel et al. 1995, Barroug et al. 1998, Boix et

al. 2005). Les solutions d’adsorption sont réalisées par dilution d’une solution mère de

rhBMP-2 froide (à 5 mg/ml) dans une solution tamponnée à pH 7,4 en présence de CaCl2 et

différentes concentrations de NaCl, selon les expériences. La 125I-rhBMP-2 est ensuite ajoutée

en faible quantité à la solution et sert de traceur pour évaluer la quantité de BMP-2 adsorbée

sur les échantillons.

Les conditions exactes des cinétiques d’adsorption ont été définies par rapport à la quantité de

rhBMP-2/implant nécessaire pour les implantations et des études préliminaires avec de la

albumine de sérum bovin.

78

• Expérience 1 : comparaison des différents substrats Une solution d’adsorption à 300 µg/ml de rhBMP-2 est préparée dans un tampon NaCl

150 mM, CaCl2 10 mM, TRIS 25 mM, pH 7,4. La 125I-rhBMP-2 est ajoutée à cette solution

pour obtenir un rapport protéine marquée/protéine non marquée de 1 : 2000. 150 mg de

granulés sont immergés dans 300 µl de solution (Rapport S/L = 0,5 mg/µl). L’adsorption est

réalisée à 4°C et des prélèvements de 5 µl sont effectués aux temps 0, 15 minutes, 30 minutes,

1 h, 2 h, 4 h et 24 h. La radioactivité restante en solution est comptée à l’aide d’un compteur

de radiations gamma. Un tube ne contenant que la solution radioactive sert de référence. Les

mesures sont effectuées sur des échantillons en deux exemplaires sur deux expériences

indépendantes et exprimées en tant que moyenne ± écart-type.

• Expérience 2 : Cinétiques d’adsorption pour deux types de granulés Dans cette cinétique, les conditions expérimentales ont été modifiées pour obtenir de

meilleurs résultats et se placer dans des conditions optimales pour une utilisation industrielle

potentielle. Plusieurs paramètres ont été changés : l’utilisation d’un tampon de force ionique

élevée permet d’augmenter la quantité maximale de protéine adsorbée (Boix et al. 2005) et la

solubilité de la BMP-2 (Abbatiello et al. 1997). D’autre part, la température d’adsorption a été

augmentée et des tubes indépendants de forme conique permettant un meilleur contact entre

les échantillons et la solution d’adsorption ont été utilisés. Des mélanges plus réguliers des

échantillons ont enfin été réalisés afin de mettre tout en œuvre pour faciliter la diffusion des

protéines et le contact avec les granulés.

La BMP-2 froide est dissoute dans un tampon NaCl 1 M, CaCl2 10 mM, TRIS 25 mM, pH

7,4, à une concentration de 300 µg/ml et la 125I-rhBMP-2 est ajoutée à la solution avec un

rapport 1 : 4000. Des échantillons indépendants sont réalisés pour chaque temps

d’incubation : 30 mg de granulés sont incubés dans 60 µl de solution d’adsorption dans des

tubes fermés mélangés régulièrement et placés à 37°C pendant un temps variable (15 minutes,

30 minutes, 1h, 2h, 4h, 8h ou 24h). Aux temps donnés, la radioactivité présente dans le

surnageant est comptée (2 prélèvements de 5 µl). Les mesures sont effectuées sur au

minimum 3 échantillons distincts par type de granulés et par temps d’incubation (Moyenne ±

Erreur standard à la moyenne (SEM)).

• Expérience 3 : Isothermes d’adsorption La BMP-2 froide est dissoute dans un tampon NaCl 1 M, CaCl2 10 mM, TRIS 25 mM, pH

7,4, à des concentrations variables comprises entre 150 µg/ml (6 µM) et 1000 µg/ml (39.9

µM). La 125I-rhBMP-2 est ajoutée aux solutions avec un rapport 1 : 2000. 20 µg de granulés

79

revêtus ou témoins sont incubés dans 40 µl de solution d’adsorption pendant 24h à 37°C dans

un batch fermé mélangé régulièrement. A l’issue de ce temps, les surnageants sont prélevés et

comptés (2 prélèvements de 5 µl). Afin de vérifier les paramètres d’adsorption obtenus par

cette technique, les granulés sont lavés à trois reprise avec 1 ml de solution saturée en β-TCP

pour éliminer la 125I-rhBMP-2 non adsorbée tout en évitant la dissolution des granulés. Après

séchage à température ambiante pendant 72h, les échantillons sont dissouts dans 300µl

d’acide perchlorique 6N. Les solutions de dissolution sont comptées et les paramètres

d’adsorption sont évalués.

3.3. Libération de la rhBMP-2

Nous avons comparé la libération dans du milieu de culture de la rhBMP-2 associée, par deux

méthodes distinctes, aux granulés témoins ou revêtus présentant la plus grande capacité

d’adsorption. Cette libération a été suivie en mesurant le taux de radioactivité dans les

solutions mises en contact avec les différents échantillons.

3.3.1. Echantillons utilisés

• Granulés contenant la rhBMP-2 adsorbée Les échantillons utilisés dans cette étude sont issus de la cinétique d’adsorption n°2. Les

échantillons ayant servis pour les points 24h, ont été lavés à trois reprises avec 1 ml de

solution saturée en β-TCP puis séchés à température ambiante pendant 72h.

• Granulés contenant de la rhBMP-2 déposée par goutte

La préparation des échantillons est réalisée de la manière suivante : 6 µl de solution de

rhBMP-2 à 3 mg/ml contenant de la 125I-rhBMP-2 (rapport 1 : 680) sont déposés sur 30 mg de

granulés. Les granulés sont ensuite séchés à température ambiante pendant 72 heures. Ces

échantillons sont notés témoins ou revêtus « - rhBMP-2 déposée ».

3.3.2. Protocole de suivi de la libération

La désorption de la rhBMP-2 est suivie dans du milieu de culture DMEM (Dulbecco’s

modified Eagle’s medium), complémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (Gibco, Invitrogen)

et des antibiotiques (1% pénicilline et streptomycine (Invitrogen)). Pour chaque type

d’association BMP-granulé, deux des cinq échantillons disponibles sont dissouts dans 300µl

d’acide perchlorique et les molécules radioactives présentes dans ces solutions sont comptées

80

afin de déterminer la valeur initiale de radioactivité présente sur les granulés (100%). Les trois

autres échantillons sont utilisés pour la cinétique de désorption. Ces échantillons sont incubés

avec 1 ml de milieu de désorption. Après 2 minutes d’incubation et à des intervalles de temps

irréguliers jusqu’à 22 jours, le milieu est prélevé et remplacé par 1 ml de milieu frais. Les

molécules radioactives libérées dans le milieu prélevé sont comptées. Après avoir pris en

considération la perte de radioactivité relative au temps de demi-vie de l’iode125, une courbe

de libération cumulée en fonction du temps a été tracée.

4. Résultats

4.1. Comparaison de l’efficacité des différents revêtements

Nous avons comparé les capacités d’adsorption des différents revêtements vis-à-vis de la

rhBMP-2.

Figure III.1 : Cinétique d’adsorption de la rhBMP-2 pour les différents échantillons. Quantité de protéine adsorbée par gramme de granulés (a) et par unité de surface des échantillons (b) en fonction du temps. Conditions expérimentales : rhBMP-2 à 300 µg/ml dans tampon NaCl 150 mM, CaCl2 10mM, TRIS 25 mM, pH 7,4, rapport S/L=0,5mg/µl, incubation à 4°C.

81

Nous pouvons observer sur la Figure III.1a que les profils d’adsorption de la BMP-2 en

fonction du temps sont similaires pour les différents échantillons : la quantité de BMP-2

adsorbée augmente rapidement au cours des premières heures puis l’adsorption se poursuit

progressivement jusqu’à 24h.

Quel que soit le procédé de recouvrement utilisé, les granulés revêtus présentent une quantité

de BMP-2 absorbée supérieure à celle des granulés témoins, non revêtus, dès 15 minutes et

jusqu’à 24 heures. Cela indique que les modifications de surface effectuées permettent

d’augmenter de manière significative (p < 0,05) la capacité d’adsorption des granulés ainsi

que la vitesse d’adsorption. Parmi les différents revêtements étudiés, le dépôt

NanoAp-EtOHx1 donne les résultats les plus prometteurs. En effet, à 24h, les granulés

NanoAp-EtOHx1 adsorbent 2,3 fois plus de BMP-2 que les granulés témoins (p = 0,0002) et

1,6 fois plus que les granulés NanoApx1 (p = 0,006).

La multiplication du nombre de revêtements est corrélée à la quantité de rhBMP-2 adsorbée

pour les granulés NanoAp. Par contre, cet effet n’est pas observé pour les échantillons revêtus

par le procédé NanoAp-EtOH. En effet, la quantité adsorbée apparaît même légèrement plus

faible pour les granulés NanoAp-EtOHx2 que pour les granulés NanoAp-EtOHx1.

L’expression de la quantité de BMP-2 adsorbée par aire de surface d’échantillon permet

d’évaluer l’influence de la surface spécifique sur les propriétés d’adsorption des céramiques

(Figure III.1b). Dans ce cas, les courbes d’adsorption de la BMP-2 par les granulés

NanoApx1, NanoApx2 et NanoAp-EtOHx1 se superposent parfaitement. Ces résultats

semblent indiquer une influence de la surface spécifique sur l’adsorption des protéines par les

granulés revêtus. Cependant, nous pouvons observer que la quantité de protéine adsorbée par

m2 d’échantillon NanoAp-EtOHx2 est beaucoup plus faible et qu’à l’inverse les céramiques

témoins sont capables d’adsorber une quantité plus importante de BMP-2 (en µg/m2) que les

échantillons revêtus. D’autres paramètres apparaissent donc impliqués dans les capacités

d’adsorption de nos échantillons vis-à-vis de la BMP-2.

Ces premières expériences nous ont permis d’effectuer une comparaison entre les différents

échantillons concernant l’adsorption de la rhBMP-2. Les résultats obtenus indiquent que les

modifications de surface effectuées sur les céramiques apportent un avantage significatif pour

l’adsorption de cette protéine.

Le revêtement qui semble présenter le plus d’intérêt est le NanoAp-EtOHx1. D’autre part, la

multiplication des revêtements par le procédé NanoAp-EtOH ne semble pas apporter

82

d’avantage substantiel. Cette technique n’a donc pas été retenue, étant donné les contraintes

supplémentaires qu’elle engendrerait d’un point de vue industriel.

Nous avons donc choisi de retenir le revêtement NanoAp-EtOHx1 pour la suite du projet et

nous avons poursuivi la caractérisation de ses propriétés d’adsorption et de désorption.

D’autre part, le pourcentage d’adsorption de la BMP-2 par rapport à la quantité présente en

solution apparait assez faible dans les conditions expérimentales étudiées : ce pourcentage est

seulement de 42% pour les échantillons NanoAp-EtOHx1. Nous avons donc modifié les

conditions expérimentales d’adsorption de la rhBMP-2 afin d’obtenir un meilleur rendement.

4.2. Etude comparative entre les granulés témoins et NanoAp-EtOHx1

Dans cette partie, nous avons comparé de manière plus poussée les propriétés d’adsorption

des céramiques témoins, non revêtues, et des céramiques revêtues par le dépôt NanoAp-

EtOHx1.

Les expériences concernant l’adsorption de la rhBMP-2 ont été réalisées dans des conditions

différentes, susceptibles d’améliorer le taux d’adsorption.

4.2.1. Cinétiques d’adsorption de la rhBMP-2

La cinétique d’adsorption de la BMP-2 sur les granulés témoins et les granulés revêtus,

NanoAp-EtOHx1, dans ces nouvelles conditions est décrite par la figure III.2.

Figure III.2 : Cinétiques d’adsorption de la rhBMP-2 sur les granulés témoins et NanoAp-EtOHx1. Conditions expérimentales : rhBMP-2 à 300 µg/ml dans tampon NaCl 1 M, CaCl2 10mM, TRIS 25 mM, pH 7,4, rapport S/L=0,5mg/µl, incubation à 37°C.

83

Nous pouvons constater que comme précédemment, pour chacun des temps d’incubation, le

revêtement augmente de manière significative (p<0,005) la quantité de facteur de croissance

adsorbée. Après 24h, les granulés NanoAp-EtOHx1 adsorbent 517 ± 9 µg de rhBMP-2 par

gramme de granulés alors que les granulés témoins n’adsorbent que 397 ± 19 µg/g. Cette fois-

ci la quantité de BMP-2 adsorbée est plus importante et atteint 87% ± 3% pour les céramiques

revêtues et 66% ± 4% pour les témoins.

La cinétique d’adsorption peut être décrite de la manière suivante : la quantité de BMP-2

adsorbée augmente rapidement jusqu’à l’obtention d’un palier pour les granulés NanoAp-

EtOHx1 à partir de 4h et continue d’augmenter progressivement pour les granulés témoins

jusqu’à 24h. Les vitesses initiales d’adsorption ont pu être calculées à partir de la pente sur les

premiers points de la courbe et correspondent à 444 µg/(g.h) contre 185 µg/(g.h) pour les

granulés revêtus et témoins respectivement.

4.2.2. Isothermes d’adsorption de la rhBMP-2

Les isothermes d’adsorption sont représentés par la figure III.3.

Figure III.3 : Isothermes d’adsorption de la BMP-2 sur les échantillons témoins et revêtus par le procédé NanoAp-EtOH. Conditions expérimentales : rhBMP-2 entre 150 et 1000 µg/ml dans un tampon NaCl 1 M, CaCl2 10mM, TRIS 25 mM, pH 7,4, rapport S/L=0,5mg/µl, incubation à 37°C pendant 24h.

Pour des concentrations supérieures à 150 µg/ml, les granulés revêtus adsorbent une plus

grande quantité de rhBMP-2 que les granulés témoins. Ces isothermes sont caractéristiques du

modèle de Langmuir. Le calcul des paramètres N et K, représentant respectivement, la

84

quantité théorique maximale de molécules adsorbée et l’affinité de la protéine pour le

substrat, peut être effectué à partir du modèle linéarisé de Langmuir :

KNNC

QC

.1

+=

Avec :

Q : Quantité de protéine adsorbée par unité d’adsorbant (en µg/g ou µmol/m2)

C : concentration à l’équilibre de la protéine en solution (en µg/ml ou µM)

N : Nombre maximum de sites d’adsorption par unité d’adsorbant (en µg/g ou µmol/m2)

K : Constante d’affinité de la protéine pour l’adsorbant (en ml/µg ou litre/µmol)

La quantité maximale théorique de BMP-2 adsorbée est égale à 1608 ± 170 µg/g pour les

granulés revêtus et 758 ± 68 µg/g pour les granulés témoins.

Tableau III.2 : Valeurs des paramètres N et K pour l’adsorption de la BMP-2.

Adsorbant N ± ∆N x108 (mol/m2) K ± ∆K x10-6 (M-1) Référence

Granulés témoins 6.9 ± 0.6 0.28 ± 0.15 Ce travail

Granulés NanoAp-EtOH 3.2 ± 0.3 0.17 ± 0.05 Ce travail

Poudre Hydroxyapatite 3.8 – 11.5 0.24 – 23 (Boix et al. 2005)

Exprimée par unité de surface des échantillons (Tableau III.2), la quantité maximale de

BMP-2 adsorbée est plus faible pour les granulés revêtus que pour les granulés témoins, ce

qui rejoint les résultats précédents. En comparant nos résultats avec ceux obtenus par Boix et

al. dans l’étude de l’adsorption de rhBMP-2 sur de la poudre d’HA, nous constatons que la

quantité maximale de protéine adsorbée est du même ordre de grandeur pour les échantillons

témoins mais apparaît légèrement plus faible pour les granulés NanoAp-EtOH. De même,

l’affinité de la BMP-2 pour les échantillons est faible, notamment pour les granulés revêtus.

4.3. Suivi de la libération de la rhBMP-2

Dans cette partie, nous avons cherché à déterminer le profil de libération de la BMP-2 suite à

son association avec nos échantillons témoins et NanoAp-EtOH par deux méthodes

différentes qui ont été utilisée dans la suite du projet pour les implantations chez l’animal.

85

La figure III.4 représente la cinétique de libération cumulée de la BMP-2 associée à nos

granulés dans du milieu complet, présentant une composition proche de celle des fluides

biologiques.

Figure III.4 : Libération cumulée de la rhBMP-2 dans du milieu de culture complet. La BMP-2 a été préalablement adsorbée ou déposée sur les échantillons témoins et NanoAp-EtOHx1.

Les différents profils de libération de la BMP-2 sont similaires : nous pouvons observer tout

d’abord une libération assez rapide puis un ralentissement de celle-ci après 48 heures. La

libération se poursuit progressivement de manière linéaire.

Considérant les granulés contenant la BMP-2 adsorbée, la libération cumulée est plus lente

pour les granulés revêtus que pour les granulés témoins. La différence de libération entre ces

échantillons est faible mais significative après seulement 4h d’incubation. A 21 jours, la

quantité de BMP-2 désorbée est de 139 ± 4 µg/g pour les granulés témoins et 100 ± 5 µg/g

pour les échantillons NanoAp-EtOH. Si l’on considère à la fois qu’une quantité plus grande

de BMP-2 est adsorbée sur les granulés revêtus et que la libération est plus lente, après 21

jours, le pourcentage de libération est bien plus faible pour les granulés revêtus (23%) que

pour les céramiques témoins (46%).

Lorsque la BMP-2 est associée aux céramiques par simple dépôt d’une goutte concentrée et

séchage, la libération est au contraire supérieure pour les granulés revêtus par rapport aux

granulés témoins : 268 ± 13 µg/g de BMP-2 est relarguée dans le milieu après 21 jours par les

86

échantillons revêtus contre et 225 ±12 µg/g par les céramiques témoins. Nous pouvons

constater que ces valeurs sont très supérieures à celles obtenues pour les échantillons

contenant la protéine adsorbée.

Nous observons que la libération de la BMP-2 est plus rapide pour les échantillons

« BMP-2déposée » dès les premières minutes et que l’écart s’amplifie au cours de la cinétique.

En effet, la détermination de la pente entre des temps tardifs (entre 7 et 22 jours) permet de

calculer la quantité de BMP-2 libérée par heure à partir de 7 jours d’incubation dans le milieu.

Tableau III.3 : Vitesse de libération après 7 jours d’incubation dans du milieu de culture complet et pourcentage de libération à J21 pour les différents échantillons.

Echantillons Vitesse de libération entre J7 et J22

Pourcentage de BMP-2 libérée à J21

Témoin-BMP-2adsorbée 0,10 µg/g/h 45 ± 1 %

Revêtu-BMP-2adsorbée 0,04 µg/g/h 23 ± 2 %

Témoin-BMP-2déposée 0,18 µg/g/h 37 ± 2 %

Revêtu-BMP-2déposée 0,21 µg/g/h 45 ± 2 %

Les résultats, mentionnés dans le tableau III.3, montrent que l’adsorption de la BMP-2

conduit à une désorption lente pour les échantillons témoins et revêtus et permet aux granulés

revêtus d’assurer une libération soutenue dans le temps, si on l’a compare à la fois aux

échantillons témoins et à la méthode d’association par simple dépôt d’une goutte de solution

protéique.

5. Discussion

Dans cette étude, nous avons étudié les propriétés d’adsorption et de désorption de granulés

de BCP revêtus par différentes sortes de dépôts d’apatite nanocrystalline présentant une forte

réactivité de surface. De par leurs propriétés, les céramiques revêtues étaient susceptible de

présenter une capacité d’adsorption protéique importante et une libération soutenue dans le

temps. Les différents revêtements permettent, en effet, d’augmenter la surface spécifique des

échantillons et présentent à leur surface une couche hydratée qui rentre en jeu dans la

réactivité des apatites nanocrystallines (Ouizat et al. 1999, Cazalbou 2000) et possèdent, en

plus des macro- et micro- porosités initiales, une nano-porosité susceptible d’augmenter la

quantité de protéines adsorbée. L’étude de l’adsorption de la rhBMP-2 a montré effectivement

que les granulés revêtus présentaient une capacité d’adsorption plus importante que celle des

87

granulés non revêtus : la quantité d’adsorption et la vitesse d’adsorption sont plus importantes

en présence des revêtements. La cinétique d’adsorption apparaît relativement lente par rapport

aux études concernant l’adsorption de protéines sur HA.

5.1. Vitesse d’adsorption

L’adsorption de différentes protéines, incluant la BSA et la BMP-2, par HA est généralement

très rapide et l’équilibre est atteint en moins de 30 minutes (Hughes Wassel et al. 1995,

Ouizat et al. 1999, Boix et al. 2005). Dans d’autres études, cependant, le temps d’incubation

nécessaire pour que l’équilibre soit atteint est de l’ordre de plusieurs heures. C’est le cas, par

exemple, de l’adsorption du lysozyme succinylé (Barroug et al. 1997) et de la catalase

(Barroug et al. 1998). Dans ces études, Barroug et al. ont suggéré que l’adsorption pouvait

être ralentie par les forces de répulsions existantes entre l’adsorbat et l’adsorbant, tous deux

chargés négativement, ou par la nécessité pour la protéine de subir des modifications

conformationnelles pour s’adsorber (Barroug et al. 1997, Barroug et al. 1998). D’autre part,

dans l’étude des mécanismes d’adsorption de la BSA sur l’hydroxyapatite menée par Kandori

et al., l’équilibre d’adsorption est atteint entre 6 et 24 heures (Kandori et al. 2005). Ce résultat

est différent de ceux publiés par ailleurs (Hughes Wassel et al. 1995, Ouizat et al. 1999) alors

que les conditions expérimentales ne semblent pas présenter de différences notables. La

vitesse d’adsorption pourrait donc être soumise à d’autres conditions. Dans leur étude

concernant l’adsorption de la catalase sur l’HA, Barroug et al. ont en effet suggéré que des

problèmes liés à la diffusion de la protéine à l’intérieur de leur hydroxyapatite poreuse

pouvait intervenir dans le ralentissement de l’adsorption protéique (Barroug et al. 1998). Etant

donné la morphologie de nos échantillons, ce paramètre mérite d’être pris en considération.

Nous avons observé aussi bien pour la BMP-2 que pour la BSA (Figure III.5a) que l’équilibre

n’était atteint qu’après plusieurs heures d’incubation. Or, Ouizat et al. ont montré que

l’adsorption de la BSA sur des apatites mal cristallisées, présentant des caractéristiques

similaires aux cristaux composant nos revêtements, était très rapide (Ouizat et al. 1999). Un

des paramètres majeurs qui diffère entre ces deux études est la morphologie de l’adsorbant :

alors que dans le travail de Ouizat et al., les apatites étaient sous forme de poudre, dans notre

cas, nous utilisons des granulés très poreux, présentant à la fois une macro- et une micro-

porosités et parfois une nano-porosité. Des problèmes liés à la diffusion de la solution à

l’intérieur des pores ont donc été envisagés et une expérience réalisée dans ce projet nous

fournit quelques renseignements à ce sujet : nous avons comparé l’adsorption de la BSA après

88

2h d’incubation à température ambiante avec des granulés NanoAp avant et après séchage du

revêtement. Les pourcentages de BSA adsorbée sont de 85% pour les échantillons non séchés

contre 29% pour les granulés séchés (Figure III.5b). Ceci indique qu’une diffusion facilitée

par un revêtement encore humide conduit à une augmentation nette de la vitesse d’adsorption.

La diffusion des protéines à l’intérieur des macro- micro- et nano-pores des échantillons

semblent donc constituer le principal facteur limitant de la vitesse d’adsorption dans notre

étude. Le projet initial prévoyait d’associer la protéine d’intérêt aux céramiques directement

en salle d’opération avant leur implantation. Au vue des résultats obtenus ici, une association

préalable de la protéine a été préférée pour les expériences d’implantation chez l’animal.

Figure III. 5: Adsorption de la BSA sur les échantillons revêtus. Pourcentage d’adsorption de la BSA après 30 minutes ou 24h d’incubation avec les granulés témoins ou revêtus selon différents procédés (a). Conditions expérimentales : BSA à 250 µg/ml dans solution NaCl 150 mM à 4°C, rapport S/L=0,25mg/µl. Pourcentage d’adsorption après 2h d’incubation avec les granulés NanoAp avant ou après séchage du revêtement (b). Conditions expérimentales : Conditions expérimentales : BSA à 250 µg/ml dans de l’eau désionisée à température ambiante, rapport S/L=0,25mg/µl.

5.2. Comparaison des capacités d’adsorption des différents échantillons

5.2.1. Comparaison des granulés témoins et revêtus

L’augmentation de la quantité de protéine adsorbée constitue le principal avantage de notre

procédé de revêtement. Les résultats obtenus indiquent que la surface spécifique joue un rôle

important dans la capacité d’adsorption des échantillons, comme cela a déjà été décrit

(Gautier et al. 1998, Matsumoto et al. 2004). Cependant, les différences d’adsorption

89

observées ne peuvent pas être uniquement expliquées par une modification de la surface

spécifique des granulés : il apparaît que ce sont les granulés témoins, non revêtus, qui

possèdent la plus grande capacité d’adsorption par unité de surface. Des comportements

similaires ont été observés lors de nos études préliminaires de l’adsorption de la BSA sur nos

échantillons. Ces résultats pourraient provenir soit d’une différence des propriétés

d’adsorption des granulés de BCP et des nanocristaux d’apatite, soit d’une diffusion limitée

de la protéine à l’intérieur du revêtement.

Plusieurs études ont montré que l’adsorption de protéines pouvait être différente sur des

échantillons de BCP et sur l’HA (ou le β-TCP). Gautier et al., en particulier, ont mesuré

l’adsorption d’une hormone de croissance sur des céramiques de BCP (56/44) et sur l’apatite

déficiente en calcium ayant servie à leur fabrication ; il semble qu’ils obtiennent des profils

similaires aux nôtres. La forte surface spécifique des apatites déficientes en calcium

permettrait d’adsorber une quantité de protéine très supérieure à celle mesurée sur les

céramiques de BCP frittées, présentant une surface spécifique faible. Pourtant, comparée à la

surface spécifique des échantillons, la quantité de protéine fixée semble plus importante pour

les granulés de BCP, frittés à haute température (Gautier et al. 1998). Zhu et al. ont montré

que des granulés de BCP possédaient des capacités d’adsorption de la BSA très supérieures à

l’HA ou le β-TCP (Zhu et al. 2007). Dans notre étude, il n’est donc pas exclu que les effets

observés soient en partie dus à des capacités d’adsorption différentes entre les céramiques de

BCP et les nanocristaux d’apatite carbonatée déficiente en calcium. Cependant, la présence de

β-TCP dans nos échantillons ne semble pas influencer de manière significative l’adsorption

des protéines étudiées. En effet, les quantités maximales de protéines adsorbées sur les

granulés témoins déterminées ici sont du même ordre de grandeur que celles obtenues

précédemment, par Boix et al. pour la BMP-2 (Boix et al. 2005) et Ouizat et al. par exemple

pour la BSA (Ouizat et al. 1999).

Ce sont, en fait, les résultats obtenus pour les granulés revêtus (quantité adsorbée de rhBMP-2

ou BSA par unité de surface) qui apparaissent particulièrement faibles. Ceci semble indiquer

que l’accessibilité de la protéine aux nanocristaux est limitée par des phénomènes de diffusion

de la solution d’adsorption au travers des nanopores de nos revêtements. La comparaison des

capacités d’adsorption des différents revêtements tend à étayer cette hypothèse.

L’affinité de la BMP-2 est plus faible pour les granulés revêtus que pour les granulés témoins.

Ces valeurs sont par ailleurs inférieures à celles précédemment décrites dans des conditions

similaires (Boix et al. 2005). Ce paramètre, cependant, est particulièrement sensible aux

90

conditions expérimentales et aux caractéristiques du substrat, comme le montrent les écarts

obtenus dans des études précédentes selon les paramètres étudiés. Ce paramètre varie

considérablement (d’un facteur 100) dans l’étude de Ouizat et al. sur l’adsorption de BSA sur

des apatites nanocristallines en fonction de leur état de maturation (Ouizat et al. 1999).

5.2.2. Comparaison des revêtements

Les propriétés d’adsorption les plus avantageuses ont été observées pour les échantillons

revêtus par le procédé NanoAp-EtOH. Ouizat et al. ont montré que le taux d’adsorption de la

BSA sur les apatites mal cristallisée était dépendante de leur état de maturation et cet effet a

été relié à la quantité d’ions labiles présents dans la couche hydratée (Ouizat et al. 1999).

Dans notre étude, l’influence de cette couche hydratée sur les capacités d’adsorption de la

BMP-2 n’est pas mise en évidence : les cristaux NanoAp-EtOH ont une quantité d’ions labiles

en surface plus faible que les cristaux NanoAp ; pourtant, leurs capacités d’adsorption par

unité de surface apparaissent similaires. Dans cette étude, l’épaisseur de la couche hydratée ne

semble donc pas être un élément critique pour l’adsorption de la BMP-2 sur nos échantillons,

alors que nous avons constaté qu’elle jouait un rôle important dans les mécanismes d’échange

ionique avec le strontium.

Ces résultats semblent indiquer que les protéines ont des difficultés à pénétrer à l’intérieur des

pores du revêtement. Ces pores présentent, en effet, un diamètre inférieur à 15 nm et

pourraient être rapidement obstrués par la BMP-2 de dimension 7 nm x 3,5 nm x 3 nm

(Scheufler et al. 1999). L’accessibilité des protéines à la surface serait donc plus faible que

celle des molécules d’azote, utilisées pour déterminer la surface spécifique, ou des ions

strontium, de taille plus petite. De plus, la formation de ponts hydrogènes entre les cristaux et

les molécules d’eau – de la solution ou de la couche hydratée – pourrait aussi limiter les

phénomènes de diffusion de la protéine à l’intérieur du revêtement.

Dans les études d’adsorption de la BMP-2, la répétition du procédé de revêtement NanoAp

induit une augmentation significative de la quantité de protéine adsorbée mais les capacités

d’adsorption par unité de surface sont similaires pour les échantillons NanoApx1 et

NanoApx2. La répétition du procédé NanoAp-EtOH, par contre, n’engendre pas de

modifications significatives de la quantité de protéine adsorbée. La quantité de protéine

adsorbée apparaît légèrement supérieure pour la BSA (Figure III.5a) et légèrement inférieure

pour la BMP-2. Ce dernier résultat est étonnant et pourrait être la résultante de modifications

91

du dépôt liées au procédé de fabrication (perte d’adhérence du dépôt, changement des

propriétés de surface dont la mouillabilité ou la charge de surface). Ce résultat devrait

cependant être confirmé avant d’entreprendre une étude plus approfondie. La répétition du

procédé NanoAp-EtOH ne conduit donc pas à un avantage substantiel concernant l’adsorption

protéique et la quantité de protéine adsorbée par unité de surface est très faible pour les

échantillons NanoAp-EtOHx2. Cette observation pourrait être reliée aux difficultés de

diffusion de la solution protéique à l’intérieur du revêtement, citées précédemment. Comme

nous l’avons vu dans le chapitre précédent, pour le procédé NanoAp, la multiplication du

revêtement s’accompagne, en parallèle de l’augmentation de la surface spécifique, d’une

augmentation de la surface extérieure de contact : les blocs cristaux de superposent,

augmentant ainsi le taux de recouvrement de la céramique par le dépôt. Par contre, le dépôt

NanoAp-EtOH recouvre initialement la quasi-totalité de la surface de la céramique et la

multiplication du procédé de revêtement induit majoritairement une augmentation de

l’épaisseur du dépôt. Les résultats d’adsorption obtenus pour les différents revêtements

suggèrent donc que la protéine ne pénètre que partiellement dans le dépôt nanocristallin :

l’augmentation de la surface de contact s’accompagne d’une capacité d’adsorption protéique

accrue alors que l’augmentation de l’épaisseur de revêtement n’a qu’un effet très limité sur la

quantité de protéine adsorbée.

5.3. Libération de la rhBMP-2

Il a été montré dans de nombreuses études que le temps de rétention de la protéine d’intérêt au

niveau du site chirurgical était un facteur primordial pour la réussite de la reconstruction

osseuse (Seeherman et al. 2005, Liu et al. 2007b). En fonction du matériau et du type

d’association impliqués, plusieurs modes d’action du facteur de croissance peuvent être

envisagés : (i) la libération spontanée de la protéine et son interaction consécutive avec les

récepteurs cellulaires ; (ii) la libération de la protéine par contrôle cellulaire, avec notamment

l’implication des ostéoclastes ; et (iii) l’interaction directe entre la protéine adsorbée dont le

domaine de liaison avec les récepteurs serait accessible.

Dans le premier cas, la protéine peut intervenir à une certaine distance de l’implant, mais

sa libération ne peut être contrôlée. Lorsque l’association de la protéine est effectuée par

simple imprégnation et séchage (méthode d’association la plus couramment utilisée), seuls

des mécanismes liés à la diffusion de la molécule sont susceptibles d’intervenir. Dans ce type

d’association, il est probable que la protéine précipite ou cristallise à la surface du matériau en

92

formant des agrégats. La libération serait donc uniquement liée aux phénomènes de diffusion

et de dissolution et dans ces conditions, le degré de solubilité de ces agrégats constitueraient

donc un paramètre important dans la cinétique de libération de la protéine. Deux études ont

montré, en effet, que la BMP-2 non glycosylée, présentant une solubilité faible en milieux

physiologiques, avait un temps de rétention plus long que des BMP-2, dont la solubilité avait

été augmentée, après leur association simple sur des fibres de collagène (Uludag et al. 2001)

ou sur des gels de fibrine (Schmoekel et al. 2004). Dans notre étude de libération (lors de

laquelle la limite de solubilité n’est jamais atteinte), nous avons pu déterminer que la quantité

libérée de BMP-2, préalablement adsorbée, était très faible. Les granulés revêtus présentent

un temps de rétention largement supérieur aux autres échantillons. La comparaison des

cinétiques de libération selon le mode d’association de la protéine (adsorption ou dépôt d’une

goutte et séchage) nous a permis d’exclure la faible solubilité de la rhBMP-2 non-glycosylée

comme paramètre principal de cette libération soutenue.

Dans le cas de la BMP-2 adsorbée, nous pouvons constater que la libération spontanée dans

du milieu de culture est assez faible mais non négligeable, alors que, par exemple, la

libération de BSA dans du SBF est quasi-nulle. Une dissolution spontanée des échantillons ne

semble pas être responsable de cette libération étant donné que le milieu de culture doit être

sursaturé par rapport au revêtement nanocristallin ou au β-TCP. Par contre, le milieu de

désorption contient à la fois des ions phosphate et de nombreuses molécules susceptibles de

déplacer la BMP-2. En général, cependant, la libération par les ions phosphate est rapide et

dépend essentiellement de leur concentration. Nous avons indiqué que les sites d’association

entre la BSA et la BMP-2 pourraient être identiques et que par contre l’affinité de la BSA

pour les granulés serait supérieure à celle de la BMP-2. De telles protéines pourraient donc

participer à la désorption de la BMP-2, donnant lieu à une libération moins rapide. De même,

il n’est pas exclu que des changements dans les caractéristiques de surface des échantillons

puissent intervenir.

D’autre part, Ohta et al. ont montré que l’élution de protéines acides telles que la BSA était

différente sur le β-TCP que sur l’HA et s’effectuait en présence d’une concentration en

phosphate très faible (Ohta et al. 2001). Nous pouvons donc envisager que la présence de

β-TCP dans nos échantillons puisse en partie être responsable de la libération de la BMP-2

dans le milieu. Enfin, la différence de désorption observée par Gautier et al. en fonction de la

surface spécifique des échantillons (Gautier et al. 1998) est aussi valable dans notre étude

93

puisque la désorption est significativement plus faible après adsorption de la rhBMP-2 sur les

granulés revêtus par rapport aux granulés témoins.

Il faut noter, cependant, que la libération n’a pas été effectuée dans les conditions standards,

régies par les normes de la pharmacopée européenne. Celles-ci prévoient que la libération du

principe actif doit être réalisée dans un grand volume de milieu sous agitation controlée. Ces

normes n’ont pas pu être appliquées dans nos expériences (détection de la proteines libérée

trop faible, risque de dégradation du revêtement…), mais un renouvellement régulier du

milieu a été effectué afin de limiter une diminution potentielle de la libération liée à la

présence de concentrations locales en protéine importantes. Il est par ailleurs possible que le

taux de libération ne soit pas identique in vivo, mais les mécanismes décrits précédemment

sont susceptibles de se produire et nous pouvons penser que la libération de la BMP-2

adsorbée sera de la même manière soutenue dans le temps dans de telles circonstances.

Dans le deuxième cas, la libération du facteur de croissance est contrôlée par les cellules

présentes au niveau du site chirurgical et plusieurs études ont montré une efficacité supérieure

d’un tel mode de libération (Seeherman et al. 2005, Liu et al. 2007b). Nous pouvons penser

que dans le cas de la BMP-2 adsorbée sur nos céramiques, à la fois une libération spontanée et

un contrôle cellulaire seront mis en jeu dans le mode d’action de la protéine. En effet, la

libération spontanée observée est assez faible, spécialement pour les granulés revêtus. Celle-ci

pourrait cependant apporter un avantage pour la reconstruction par la mise en place d’un

gradient de BMP-2 autour de l’implant, favorisant la migration d’ostéoclastes et de cellules

progénitrices vers le site de reconstruction. Une fois les cellules présentes au niveau de

l’implant, les ostéoclastes peuvent participer à la libération de la protéine par destruction de la

céramique. La libération de la BMP-2 adsorbée devrait donc être contrôlée par ces cellules en

particulier pour les échantillons revêtus. Etant donné que l’activité des ostéoclastes est

souvent couplée à celle des ostéoblastes, d’une part, et que la protéine libérée sous le contrôle

cellulaire devrait favoriser la différenciation des cellules progénitrices d’autre part, ce type de

matériau pourrait en conséquence apporter un avantage significatif dans les phénomènes de

reconstruction osseuse.

Le troisième mode d’action pourrait être la reconnaissance directe entre la BMP-2 adsorbée et

les récepteurs cellulaires, présents à la surface des ostéoclastes et des ostéoblastes. Certains

exemples d’enzymes liées à des matériaux montrant une activité cellulaire identique ou accrue

ont été décrits (Zisch et al. 2001, Tsujigiwa et al. 2005). Une telle situation implique

cependant que le site de reconnaissance de la protéine pour son récepteur soit parfaitement

accessible et dans la bonne conformation. Lors de l’adsorption de la BMP-2 sur l’HA, les

94

sites de liaisons sont répartis en plusieurs points de la séquence protéique, et il n’est pas exclu

que les modifications conformationnelles aient lieu. Il semble donc difficile de penser, à

priori, qu’une telle interaction protéine adsorbée-récepteur se produise.

6. Conclusions et perspectives

Dans ce chapitre, nous avons étudié les propriétés d’adsorption de nos céramiques témoins et

revêtues par deux types de procédés vis-à-vis de la rhBMP-2. Nous avons montré que la

présence de tels revêtements apportait un avantage significatif pour l’adsorption protéique.

Cette étude nous a, par ailleurs, permis d’effectuer notre choix final parmi les deux procédés

pré-sélectionnés dans le chapitre précédent, en raison de leur morphologie et leur réactivité

supposée. Les résultats obtenus nous indiquent que le revêtement NanoAp-EtOH semble être

le plus prometteur. Ce revêtement a donc été caractérisé de manière plus poussée vis-à-vis de

ses propriétés d’adsorption et de désorption en vue de son utilisation ultérieure pour des

expériences en culture cellulaire et chez l’animal. La désorption de la BMP-2 à partir des

échantillons revêtus est soutenue dans le temps et pourrait être majoritairement régulée in vivo

par un contrôle cellulaire. Ces résultats, très encourageants, nous laissent espérer que les

échantillons revêtus par le procédé NanoAp-EtOH apporteront un avantage significatif dans

l’ostéoinduction induite par la BMP-2. D’autre part, plusieurs études ont suggéré que

l’ostéoinduction intrinsèque de composés phosphocalciques pouvait être liée à leur capacité

d’adsorption de protéines impliquées dans l’ostéogénèse. Nous pouvons donc envisager le fait

que de tels matériaux très réactifs pourraient aussi avoir une influence positive sur la

reconstruction osseuse sans ajout de facteurs de croissance.

Ces hypothèses ont été évaluées dans le reste de l’étude, comprenant à la fois des études des

matériaux en culture cellulaires et des implantations chez l’animal.

D’un point de vue plus théorique, il serait intéressant d’effectuer de nouvelles mesures

d’adsorption sur les poudres cristallines obtenues dans des conditions identiques aux

revêtements NanoAp et NanoAp-EtOH. Cette étude pourrait nous donner de plus amples

informations sur l’importance de la surface spécifique de ces nanocristaux très réactifs par

rapport aux autres facteurs susceptibles d’influencer l’adsorption protéine, dont la présence

d’une couche hydratée à leur surface. Les facteurs influençant la désorption pourraient aussi

être évalués par une étude chromatographique sur de tels composés (mise en place de ces

nanocristaux dans des colonnes de chromatographie). Cette étude pourrait être menée pour la

BMP-2 ainsi que pour d’autres protéines.

Chapitre 4

Etude du comportement cellulaire vis-à-vis des céramiques de BCP revêtues ou non avec le

procédé NanoAp-EtOH

95

Dans ce chapitre, nous effectuons une comparaison du comportement général de différents

types cellulaires après leur ensemencement sur nos échantillons témoins et revêtus par le

procédé NanoAp-EtOH. Les expériences effectuées nous ont permis d’évaluer la

biocompatibilité des matériaux et leur capacité à initier la différenciation ostéoblastique de

cellules progénitrices ou d’ostéoblastes d’une part. L’activité biologique de la BMP-2 pré-

adsorbée sur nos céramiques a d’autre part été étudiée. Les facteurs principaux impliqués dans

l’interaction entre les cellules ostéoprogénitrices ou ostéoblastes et les matériaux ayant été

décrits dans le chapitre 1 de ce manuscrit, l’étude bibliographique de cette partie mentionne

uniquement les différents modèles cellulaires qui peuvent être utilisés dans de telles études.

1. Introduction bibliographique

Il est important de connaître les caractéristiques d’un matériau, et notamment sa

biocompatibilité, avant son implantation chez l’animal ou l’homme. L’adhésion et la

prolifération cellulaires sont considérées comme des facteurs de cytocompatibilité précoce et

à moyen terme des matériaux (Liu et al. 2007a). Ces réponses, associées au potentiel de

différenciation des matériaux, peuvent fournir des indications sur les propriétés

ostéoconductrices et ostéoinductrices des matériaux et participent à la compréhension de ces

phénomènes. De ce fait, beaucoup d’études s’intéressent à l’adhésion, la prolifération et la

différenciation de cellules – pré-ostéoblastes ou cellules souches mésenchymateuses – sur des

matériaux de composition ou topographie diverses, comme nous l’avons déjà indiqué. Les

réponses obtenues dans ces études dépendent des caractéristiques des matériaux mais aussi

des modèles cellulaires utilisés.

1.1. Les modèles cellulaires pour l’étude de l’interaction matériaux/ostéoprogéniteurs ou ostéoblastes

Différents modèles cellulaires d’ostéoblastes peuvent être utilisés dans l’étude de l’interaction

cellules/matériaux. Ces cellules peuvent être plus ou moins différenciées et issues d’espèces

animales différentes. Leur comportement vis-à-vis d’un matériau peut s’avérer cependant

différent et il est donc important de déterminer quel type cellulaire utiliser par rapport à

l’information recherchée.

L’état de différenciation des cellules et les conditions de culture (présence ou absence

d’agents différenciants) constituent les premiers critères. Ces paramètres influent en effet sur

la réponse obtenue et les indications fournies par ces études pourront être reliées soit aux

96

phénomènes d’ostéoinduction (pour des cellules non différenciées cultivées en absence de

milieu ostéogénique) soit aux propriétés ostéoconductrices des matériaux (pour des cellules

déjà engagées vers la voie ostéoblastique).

D’autre part, plusieurs types cellulaires (cultures primaires ou lignées établies) peuvent être

utilisés dans l’étude des interactions cellules/matériaux. Les cellules primaires présentent

l’avantage d’approcher la population ostéoblastique (ou ostéoprogénitrice) avec laquelle le

matériau sera en contact in vivo. En revanche, leurs conditions de culture sont souvent assez

délicates (sensibilité accrue au lot de sérum, nombre de passages limité…) et la variabilité

inter-individu est importante. L’utilisation de lignées établies bien caractérisées ou de cellules

immortalisées permet de palier ces inconvénients mais leur comportement peut s’avérer

parfois différent de celui des cellules primaires (Oreffo et al. 1999).

Quelques exemples de cellules de la lignée ostéoblastique couramment utilisées en co-culture

avec des biomatériaux sont présentés ci-dessous.

• Les cellules souches mésenchymateuses (MSC) Les cellules souches mésenchymateuses humaines constituent un modèle de choix pour

étudier la différenciation ostéoblastique intrinsèque en réponse à un biomatériau. Il s’agit de

cellules primaires issues de patients et sélectionnées pour être positives à STRO-1, facteur

caractéristique de leur multipotence. Dans la majorité des études en association avec des

biomatériaux, elles sont cultivées en présence de milieu ostéogénique pour faciliter leur

différenciation ostéoblastique. Quelques études ont cependant montré que ces cellules étaient

capables d’exprimer des marqueurs de différenciation ostéoblastique en absence de ce milieu

après croissance sur des matériaux phosphocalciques (Muller et al. 2008). La réponse obtenue

dans ce cas, peut apporter des informations sur le comportement ostéoinducteur des

matériaux.

Les C3H10T1/2 sont des cellules embryonnaires murines. Plus facile d’utilisation que les

MSCs humaines, elles sont aussi pluripotentes et sont capables d’exprimer les marqueurs

caractéristiques de la différenciation ostéoblastique (collagène de type I, ostéocalcine,

ALP…) en réponse à des agents ostéogéniques ou à des matériaux phosphocalciques (Lin et

al. 2008).

• Les pré-ostéoblastes murins ou humains issus d’explants

Des pré-ostéoblastes d’origine animale ou humaine peuvent être obtenus à partir d’explants

osseux. Après culture des explants d’os spongieux, l’échantillon cellulaire isolé est composé

d’un mélange de cellules plus ou moins engagées vers la voie ostéoblastique, ce qui

97

correspond globalement à la population cellulaire rencontrée lors d’une implantation en site

osseux (Oreffo et al. 1999). Les études effectuées à partir de ces cellules, en présence ou

absence de milieu de différenciation, apportent par conséquent des informations sur la

biocompatibilité des matériaux ainsi que sur leurs propriétés ostéoconductives.

• Cellules immortalisées ou issues d’ostéosarcomes. Des cellules immortalisées ou issues d’ostéosarcomes peuvent par ailleurs être utilisées.

Parmi les lignées établies utilisées, les MC3T3 sont des pré-ostéoblastes murins. Elles sont

très souvent utilisées dans les études d’interaction ostéoblastes/matériaux en raison de leur

facilité d’entretien et leur forte capacité de différenciation en réponse aux matériaux, en

présence ou absence de milieu de différenciation (Chou et al. 2005).

Les MG63 et SaOS-2 issues d’ostéosarcomes humains sont particulièrement utilisées dans

l’étude des interactions ostéoblastes/matériaux. Elles permettent d’évaluer la biocompatibilité

des matériaux et leur potentiel de différenciation ostéoblastique. Toutefois, les réponses

obtenues doivent être prises avec précaution. En effet, quelques études ont montré que leurs

réponses vis-à-vis des matériaux pouvaient être différentes de celles obtenues avec des

cellules souches mésenchymateuses. Vohra et al. ont, par exemple, mis en évidence que ces

cellules interagissaient avec des protéines d’adhésion différentes des MSCs humaines et

qu’elles exprimaient des sous-unités d’intégrines particulières (Vohra et al. 2008).

1.2. Les modèles cellulaires pour l’étude de la différenciation ostéoblastique induite par la BMP-2

Le choix de la lignée cellulaire, et plus précisément de l’espèce animale dont elle est issue, est

important pour l’étude de la différenciation ostéoblastique en réponse aux BMPs.

En effet, alors que les cellules de rongeurs présentent une grande capacité de réponse à la

rhBMP-2, les cellules humaines sont moins réceptives. Quelques ostéoblastes humains sont

capables d’exprimer des facteurs de différenciation ostéoblastique en réponse à la BMP-2 (Lai

et al. 2005). Ce facteur de croissance est, en revanche, en général incapable d’initier la

différenciation ostéoblastique de cellules souches mésenchymateuses humaines, en absence

de milieu ostéogénique. Osyczka et al. ont montré que sur 26 cultures primaires de MSC

humaines issues de donneurs différents seulement 4 étaient en mesure d’exprimer des

marqueurs de l’ostéogenèse en réponse à la rhBMP-2 (Osyczka et al. 2004). Cette étude

corrobore les travaux issus du laboratoire lors desquels aucune augmentation de l’activité de

98

la phosphatase alcaline en réponse à la rhBMP-2 (300 ng/ml) n’a pu être observée sur des

hMSCs issues de trois donneurs différents. Il a, par ailleurs, été montré que la BMP-2 pourrait

même inhiber la différenciation ostéoblastique des cellules d’ostéosarcomes MG63 (Murphy

et al. 2001). Les cellules humaines ne semblent donc pas être un bon modèle pour l’étude de

la différenciation ostéoblastique induite par la BMP-2.

Ces observations pourraient, en outre, être élargies à des cellules issues d’autres espèces

animales. Des résultats issus du laboratoire ont, en effet, montré une influence sporadique de

la BMP-2 sur la différenciation ostéoblastique de pré-ostéoblastes issus d’explants d’os

spongieux ovins. Une augmentation de l’activité phosphatase alcaline en réponse à la

rhBMP-2 n’a pu être observée que sur une des trois cultures primaires étudiées.

Le modèle le plus utilisé pour étudier les voies de signalisation de la différenciation

ostéoblastique en réponse à la BMP-2 est une lignée de pré-myoblastes murins, les C2C12.

Ces cellules sont en effet capables de trans-différencier vers la voie ostéoblastique en réponse

au facteur de croissance et expriment tous les marqueurs de différenciation classiques

(augmentation de l’activité ALP, expression de collagène de type I, d’ostéocalcine,

d’ostéopontine…)(Abe et al. 2000, Ozeki et al. 2007). Les C2C12 peuvent donc être utilisées

pour évaluer l’activité de la BMP-2 libérée dans le milieu de culture à partir de matériaux

(Schliephake et al. 2007). Dans quelques études, elles sont aussi utilisées comme modèle pour

évaluer la différenciation ostéoblastique en réponse à la BMP-2 après culture sur des

matériaux phosphocalciques (Habibovic et al. 2006b, Okuda et al. 2008).

2. Objectifs

Dans ce chapitre, nous avons cherché à effectuer une comparaison générale de nos matériaux

témoins et revêtus par le procédé NanoAp-EtOH vis-à-vis de la réponse cellulaire. Nous

avons évalué l’adhésion, la prolifération, la morphologie et la différenciation de différents

types cellulaires, capables de se différencier en ostéoblastes, après leur ensemencement sur

nos matériaux. Les données recueillies avaient pour but d’évaluer la biocompatibilité et la

capacité de différenciation des matériaux avant leur implantation chez l’animal.

Le deuxième objectif de cette étude cellulaire in vitro était d’évaluer la capacité de la BMP-2

adsorbée sur nos deux types d’échantillons à induire la différenciation ostéoblastique. Cette

99

étude avait pour but de vérifier que l’adsorption sur les matériaux n’entrainait pas de forte

altération de la protéine, susceptible de limiter son action sur la différenciation.

Dans cette étude, différents types cellulaires ont été utilisés. Les cellules ont été ensemencées

directement au cœur des céramiques poreuses. En raison de leur forte sensibilité à la

rhBMP-2, les C2C12 nous ont servi de modèles pour évaluer l’activité de la BMP-2 adsorbée.

Afin d’évaluer leur comportement lors de leur croissance sur les matériaux, l’adhésion et la

prolifération de ces cellules en absence de BMP-2 ont dans un premier temps été déterminées.

Ces expériences nous ont permis d’obtenir une première évaluation de la biocompatibilité des

matériaux. La mesure de l’activité biologique de la BMP-2 adsorbée sur les échantillons a

ensuite été effectuée par dosage de l’activité spécifique de la phosphatase alcaline, marqueur

classique de la différenciation ostéoblastique.

Une fois les conditions expérimentales mises au point sur ce modèle, nous avons cherché à

confirmer la biocompatibilité de nos échantillons vis-à-vis de cellules souches

mésenchymateuses, modèles cellulaires plus révélateurs des populations ostéoprogénitrices

rencontrées dans un contexte d’implantation en site ectopique. En raison des contraintes liées

à l’utilisation de cellules mésenchymateuses humaines, et notamment la faible quantité à notre

disposition, seules quelques expériences préliminaires ont été effectuées avec ces cellules. A

ce stade de l’étude, l’utilisation de cellules mésenchymateuses embryonnaires murines, les

C3H10T1/2, a été préférée. L’utilisation de ce modèle cellulaire semble approprié : comme

les cellules mésenchymateuses humaines, il s’agit de cellules pluripotentes susceptibles de se

différencier vers l’ostéoblaste lorsqu’elles sont cultivées sur de l’HA (Lin et al. 2008).

L’étude du potentiel de différenciation intrinsèque de nos échantillons a enfin été effectuée

après croissance des cellules sur les matériaux en absence d’agent de différenciation. Cette

étude a été réalisée avec des C3H10T1/2 et des MG63, pour déterminer la capacité des

échantillons à induire ou à stimuler, respectivement pour chaque type cellulaire, la

différenciation ostéoblastique.

3. Matériels et méthodes

3.1. Modèles cellulaires

- Les C2C12 sont cultivées dans du milieu DMEM complémenté avec 10% de SVF

et 1% de pénicilline et streptomycine (P/S).

100

- Les cellules souches mésenchymateuses humaines nous ont été fournies par

l’Etablissement Français du Sang (EFS). Elles sont entretenues dans du milieu

MEM-alpha contenant 10% de SVF et 1% P/S et sont utilisées jusqu’au passage 6.

- Les MG63 sont des ostéoblastes issus d’ostéosarcomes humains (ATCC : CRL-

1427). Ces ostéoblastes, peu différenciés, peuvent être utilisés même à des passages

tardifs. Ils sont cultivées dans du milieu MEM complémenté avec 10% de SVF, 1%

de P/S et 1% d’acides aminés non essentiels.

- Les C3H10T1/2 sont des cellules souches mésenchymateuses embryonnaires

murines capables de se différencier en ostéoblastes (ATCC : CCL-226). Elles sont

cultivées dans du milieu DMEM à 10% de SVF et 1% P/S. Les cellules sont maintenues dans leur milieu de culture respectif dans un incubateur à 37°C

en atmosphère humide sous 5% de CO2. Le milieu est changé tous les 2 jours et les cellules

sont passées lorsqu’elles atteignent 80% de confluence pour limiter leur différenciation

spontanée.

Les réactifs de culture cellulaire (milieu de culture, trypsine-EDTA, pénicilline et

streptomycine, acides aminés non essentiels et sérum de veau fœtal) ont été fournis par Gibco

Invitrogen.

3.2. Culture cellulaire sur les granulés

Pour nos expériences, les cellules sont ensemencées directement sur les granulés et leur

croissance se fait au sein du matériau.

Les matériaux utilisés sont les granulés cubiques poreux (3x3x3mm3) de BCP non revêtus et

revêtus par le procédé NanoAp-EtOH. Avant leur utilisation, ces granulés ont été stérilisés par

rayonnement gamma.

L’ensemencement des cellules sur les céramiques s’effectue en plusieurs étapes :

• Equilibrage des granulés dans le milieu de culture Les granulés sont pré-incubés pendant 30 minutes à température ambiante dans du milieu

complet. Le milieu est ensuite retiré et les granulés sont disposés dans des puits de culture

(plaques 24 puits, 1 granulé par puits) et placés dans un incubateur à 37°C pendant 45 minutes

pour y être pré-séchés.

101

• Préparation de la suspension cellulaire Les cellules sont décollées par une solution de trypsine-EDTA, comptées et centrifugées à

1500 RPM pendant 10 minutes. Le culot cellulaire est repris dans du milieu complet. La

concentration de la suspension cellulaire, déterminée en fonction des conditions de l’étude, est

comprise entre 10000 et 60000 cellules / 5 µl.

• Ensemencement des cellules A l’issue des 45 minutes de pré-séchage, 5 µl de suspension cellulaire sont déposés sur les

granulés poreux. La suspension pénètre à l’intérieur du granulé. Le volume de 5 µl est le

volume maximal que ces granulés peuvent contenir sans que la suspension ne traverse les

pores et ne se dépose au fond des puits.

• Pré-adhésion des cellules et ajout du milieu Les granulés sont incubés à 37°C pendant 45 min, pour permettre une pré-adhésion des

cellules. Enfin, on ajoute doucement 600 µl de milieu complet dans les puits et les granulés

sont à nouveau placés dans l’incubateur pour permettre l’adhésion totale des cellules.

Le milieu est remplacé le lendemain par le milieu adéquat pour l’étude.

3.3. Etudes de l’adhésion et de la prolifération

3.3.1. Conditions de cultures

Les cellules sont cultivées dans des puits de culture (plaque 24 puits) ou sur les granulés (1

granulé par puits) avec 600 µl de milieu complet (10% SVF, 1% P/S) pendant 4h à 14 jours.

Le milieu est renouvelé tous les 2 jours.

Les C2C12 sont ensemencés à 10000, 20000, 40000 ou 60000 cellules/granulé pour

l’adhésion et 20000 cellules/granulé pour la cinétique de prolifération. L’ensemencement des

cellules à différentes concentrations (entre 5000 et 180000 cellules) dans les puits de culture

d’une plaque 24 puits est réalisé en même temps afin d’obtenir une gamme étalon.

Les C3H10T1/2 ont été ensemencées à 20000 ou 40000 cellules/granulés pour les expériences

d’adhésion et prolifération.

102

3.3.2. Test au MTT

L’adhésion et la prolifération des cellules ont été suivies par coloration au MTT. Le MTT

(bromure de 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5(-diphényltétrazolium)) (Sigma-aldrich) est un

sel de tétrazolium (jaune, soluble) qui se transforme en cristaux de formazan (bleu-violet,

insoluble) après réduction par une enzyme cellulaire (la succinate déshydrogénase

mitochondriale). Les cristaux de formazan formés peuvent être dissouts dans du

Diméthylsulfoxide (DMSO) et l’intensité de la coloration est proportionnelle au nombre de

cellules viables.

Dans ces expériences, la réaction se fait directement sur les granulés. Les cellules présentes

sur les granulés (ou dans les puits de culture) sont lavées avec du PBS à deux reprises. On

ajoute ensuite dans les puits 600 µl de DMEM sans rouge de phénol contenant le réactif MTT

à une concentration finale de 0,5 mg/ml. Après une incubation de 2 heures à 37°C, le milieu

est enlevé. Les granulés sont déplacés dans des tubes eppendorfs (1 granulé par tube) afin de

ne prendre en compte que les cellules présentes sur le granulé et non pas celles qui ont migré

et proliféré sur le puits de culture. Les cristaux de formazan sont ensuite dissouts dans 300 µl

de DMSO après broyage des granulés par sonde à ultra-sons. Les solutions sont centrifugées 1

minute à 7500 RPM et 200 µl de surnageant sont déposés dans une plaque 96 puits. Une

dilution dans du DMSO peut être réalisée si nécessaire. L’absorbance est mesurée en

microplaque par spectrométrie (Varioskan flash, Thermo Electron Corporation). La différence

des densités optiques (DO) mesurées à 570 mn et 650 nm est proportionnelle à la quantité de

cellules viables. La conversion DO-nombre de cellules peut être réalisée par l’intermédiaire

d’une gamme étalon de cellules.

3.4. Morphologie des cellules

3.4.1. Conditions de culture

Les cellules souches mésenchymateuses humaines sont ensemencées sur les granulés à une

concentration de 3000 cellules /granulé. Après 3 jours de culture dans du milieu MEM-alpha

complet, les granulés sont lavés à deux reprises dans du PBS et conservés dans une solution

de glutaraldéhyde à 0,2% et de Cacodylate de sodium à 0,1M à 4°C pour fixer les cellules.

103

3.4.2. Microscopie Electronique à Balayage (MEB)

La préparation et la visualisation par MEB des échantillons ont été effectuées par le Centre de

Microscopie Electronique Appliqué à la Biologie (CMEAB) (Faculté de médecine de

Rangueil, Toulouse). Après dessication par point critique au CO2, les granulés sont métallisés

avec une couche conductrice d’or-palladium. La visualisation est réalisée avec un microscope

électronique à balayage Hitashi S450.

3.5. Etude de la différenciation ostéoblastique

3.5.1. Conditions de culture

• Différenciation induite par l’interaction cellules-matériaux Les MG63 ou C3H10T1/2 sont ensemencées sur les granulés à une concentration de 40000

cellules par granulé et incubées dans leur milieu de culture respectif de 24h (J0) à 21 jours.

• Différenciation en réponse à la BMP-2 adsorbée sur les granulés Les granulés sont immergés dans une solution de rhBMP-2 à 150 µg/ml (tampon NaCl 1M,

CaCl2 10 mM et TRIS 25 mM, pH 7,4 ; rapport S/L = 0,5 mg/µl) pendant 24h à 37°C. Les

granulés sont ensuite lavés dans de l’eau désionisée à deux reprises et séchés à 37°C pendant

24h. A cette concentration, les granulés témoins et revêtus absorbent une quantité proche de

BMP-2 correspondant à environ 7 µg/granulé.

Les C2C12 sont ensuite ensemencées sur les granulés comme indiqué dans le paragraphe 3.2

à une concentration de 40000 cellules/granulé pour la cinétique de différenciation. Pour

l’étude de l’influence de la confluence cellulaire, les cellules sont ensemencées à 10000,

20000 ou 40000 cellules/granulé. Après 24h d’incubation (correspondant au point J0), le

milieu est remplacé par du milieu DMEM avec 1% SVF et 1% P/S. Le milieu est renouvelé

tous les 2 ou 3 jours. Les cellules sont cultivées dans ces conditions pendant 24h à 21 jours.

Pour chaque temps et chaque échantillon, les mesures sont effectuées sur 3 granulés

indépendants.

3.5.2. Récupération des cellules incubées sur les granulés

Les mesures de l’activité de la phosphatase alcaline et le dosage de l’ADN sont effectués sur

les cellules préalablement décrochées de la surface des matériaux. La méthode de

récupération des cellules est décrite ci-dessous.

104

Après incubation dans les conditions souhaitées dans des plaques 24 puits, les granulés

contenant les cellules sont lavés dans du PBS et déplacés dans des tubes eppendorfs (1

granulé par tube). 300µl de trypsine-EDTA sont ajoutés dans les tubes et ceux-ci sont incubés

10 minutes à 37°C. L’action de la trypsine-EDTA (permettant de décoller les cellules de la

surface des matériaux) est ensuite neutralisée par l’ajout de 700 µl de milieu de culture

complet. A l’aide d’une micropipette, les cellules sont récupérées en injectant le milieu à

l’intérieur du granulé : 10 cycles d’aller-retour du milieu dans le granulé sont effectués. Ce

milieu est ensuite récupéré pour être collecté dans un autre tube (Tube B). A nouveau, 500µl

de milieu complet sont ajoutés sur le granulé et l’opération est répétée afin de récupérer le

plus grand nombre de cellules. Ces 500µl de milieu sont prélevés et ajoutés au tube de

récupération (Tube B). La suspension cellulaire est ensuite centrifugée 45 secondes à 7500

RPM, le culot est lavé dans 500 µl de PBS, centrifugé à nouveau puis repris dans 200 µl de

solution de Triton X100 à 0,1%. Les solutions sont ensuite soniquées pendant 20 secondes

avant les dosages.

L’activité spécifique de l’ALP, c'est-à-dire l’activité ALP exprimée par unité cellulaire,

définie dans notre cas par la quantité d’ADN, est un marqueur de la différenciation vers

l’ostéoblaste.

3.5.3. Dosage de l’activité ALP

L’activité enzymatique de la phosphatase alcaline est déterminée par transformation du

paranitrophenol-phosphate incolore en para-nitrophénol de couleur jaune. La transformation

enzymatique de ce composé est quantifiée par mesure de la DO par spectrophotométrie.

Pour le dosage, on mélange, dans une plaque 96 puits, 10 µl de d’échantillons avec 90 µl de

substrat (paranitrophénol-phosphate à 1,3 mg/ml dans une solution de 2-amino-2-methyl-1-

propanol hydrochloride à 1,5 M pH 10,3). La plaque est incubée à 37°C pendant un temps

donné (entre 5 et 45 minutes) et la réaction est stoppée par ajout de NaOH 1N. La mesure est

ensuite effectuée par spectrophotométrie à 410 nm (varioskan flash, Thermo Electron

Corporation). Une gamme étalon de paranitrophénol permet de déterminer la quantité de

produit formé.

105

3.5.4. Dosage de l’ADN

La quantité d’ADN qui est proportionnelle au nombre de cellules dans les échantillons est

dosée avec le kit PicoGreen (Molecular Probes) selon les conditions standard d’utilisation. On

dépose 10 µl d’échantillon dans un puits d’une plaque 96 puits, on ajoute 90 µl de tampon

puis 100 µl de réactif (dilué dans du tampon). La fluorescence émise par le réactif qui se lie à

l’ADN double brin est mesurée par spectrofluorimétrie (λexcitation = 485 nm et λémission = 535

nm). Une gamme étalon d’ADN permet de déterminer la quantité présente dans les

échantillons.

4. Résultats

4.1. Etude des réponses cellulaires vis-vis des matériaux

Dans un premier temps, nous avons voulu évaluer le comportement de différents types

cellulaires capables de se différencier en ostéoblastes vis-à-vis de nos deux matériaux

(témoins et revêtus par le procédé NanoAp-EtOH).

4.1.1. Adhésion et prolifération

L’adhésion et la prolifération sont les premières réponses cellulaires que nous avons étudiées.

Deux types cellulaires ont été utilisés : une lignée de pré-myoblastes murins qui servent de

modèle à la différenciation ostéoblastique en réponse à la BMP-2 et des cellules souches

mésenchymateuses embryonnaires murines, les C3H10T1/2.

4.1.1.1. C2C12

L’adhésion et la prolifération des C2C12 sur les granulés témoins et revêtus NanoAp-EtOH

sont représentés sur la Figure IV.1.

L’adhésion des C2C12, 4 heures après leur ensemencement sur les granulés, apparaît

significativement plus faible (p<0,05) en présence du revêtement pour chacune des

concentrations cellulaires étudiées (Figure IV.1a). Cela dit, sur les deux matériaux, le

pourcentage d’adhésion par rapport aux puits contrôles (TCPS) est supérieur à 50%, indiquant

une bonne biocompatibilité des matériaux.

106

Figure IV.1 : Adhésion et prolifération des C2C12 sur les granulés témoins et revêtus. Adhésion après 4h d’incubation (a) : Les cellules ont été ensemencées à 10000, 20000, 40000 ou 60000 cellules/granulé. Les résultats sont exprimés en moyenne ± écart SEM sur 5 échantillons. Cinétique de prolifération des C2C12 (b) : Les cellules ont été ensemencées à 20000 cellules par granulé et maintenues dans du DMEM complet. Le nombre de cellules a été déterminé par test MTT. Les résultats correspondent à la moyenne ± écart-type de 4 expériences indépendantes (n=2 pour chaque expérience).

Les courbes de prolifération des C2C12 ont été réalisées par test au MTT avec une

concentration initiale de 20000 cellules/granulé. Des concentrations plutôt faibles sont

souvent utilisées pour observer la prolifération cellulaire sur plusieurs jours (entre 3000 et

10000 cellules/cm2) (Webster et al. 2000a). La sensibilité de la méthode apparaît cependant

assez faible dans les conditions de notre étude. La concentration choisie ici permet de

visualiser la prolifération cellulaire sur plusieurs jours, tout en conservant une sensibilité

suffisante pour effectuer une bonne comparaison entre les matériaux.

Les courbes de prolifération obtenues montrent que pour chaque temps (de J0 à J7), le nombre

de cellules est significativement plus faible en présence du revêtement. Les profils de

prolifération apparaissent toutefois comparables entre les deux sortes de granulés. Des temps

de doublements approximatifs calculés entre J1 et J3 sont du même ordre de grandeur pour les

granulés témoins et revêtus (25 ± 3 h et 27 ± 5 h respectivement).

Ceci semble indiquer que la prolifération des C2C12 serait peu différente en présence ou non

du revêtement et que les différences observées concernant le nombre de cellules sur les

granulés seraient majoritairement liées à l’adhésion plus faible sur les échantillons revêtus.

107

4.1.1.2. C3H10T1/2

Pour ce deuxième type cellulaire, les profils d’adhésion et de prolifération apparaissent

différents de ceux observés pour les C2C12 (Figure IV.2).

Figure IV.2 : Adhésion et prolifération des C3H10T1/2 sur les granulés témoins et revêtus. Les cellules ont été ensemencées à 20000 cellules/granulé (a) ou 40000 cellules/granulé (b) et maintenues dans du DMEM complet. Les valeurs de DO obtenues par test MTT sont proportionnelles au nombre de cellules viables. Les résultats sont représentés en moyenne ± écart-type (n=2 pour chaque point). Dans ce cas, deux concentrations cellulaires ont été étudiées. La concentration de 20000

cellules/granulé permet d’étudier le profil de prolifération comme nous l’avons indiqué

précédemment pour les C2C12, alors que la concentration initiale de 40000 cellules/granulé

nous a aidés à déterminer le nombre de cellules en fonction du temps dans les conditions

choisies pour l’étude de la différenciation ostéoblastique. Dans ces études, en effet, il est

préférable de travailler avec une confluence cellulaire plus importante pour favoriser la

différenciation ostéoblastique. La concentration choisie est en concordance avec celles

utilisées dans d’autres études impliquant des matériaux phosphocalciques (Muller et al. 2008,

dos Santos et al. 2009).

Pour les C3H10T1/2, nous n’observons pas de différences d’adhésion entre les échantillons

témoins et revêtus après 24h d’incubation. D’autre part, la prolifération des cellules présente

un profil similaire pour les deux types d’échantillons : pendant les premiers jours, la

prolifération est assez lente puis nous constatons une accélération de celle-ci (Figure IV.2a).

108

Nous pouvons remarquer, cependant, que le nombre de cellules est plus faible en présence du

revêtement après 72h de croissance sur les granulés. Ceci semble indiquer que la présence du

revêtement est responsable d’un ralentissement de la prolifération des C3H10T1/2 au cours

des premiers jours d’incubation. La prolifération s’accélère ensuite et le nombre de cellules

atteint progressivement celui des granulés témoins. Ces remarques sont valables pour les deux

concentrations d’ensemencement initial (Figure IV.2a et b). Par contre, à J7, le nombre de

cellule est équivalent sur les deux sortes de granulés pour un ensemencement initial de 40000

cellules/granulé, alors qu’il apparaît encore plus faible pour la concentration initiale de 20000

cellules/granulé.

4.1.2. Morphologie des cellules ensemencées sur les granulés

Nous avons observé la morphologie de cellules souches mésenchymateuses humaines après 3

jours de croissance sur les granulés témoins et revêtus (Figure IV.3).

Figure IV.3 : Micrographies MEB de cellules souches mésenchymateuses humaines après 3 jours de prolifération sur les granulés témoins et revêtus.

109

En raison de la morphologie très poreuse des granulés et du mode d’ensemencement, la

répartition des cellules n’apparaît pas homogène sur la surface des matériaux. Nous pouvons

observer des zones pour lesquelles les cellules sont agglomérées et enchevêtrées, alors que

d’autres pores ne sont recouverts que de quelques cellules isolées.

Ces cellules ne semblent avoir aucune difficulté à adhérer sur les échantillons en présence ou

non du revêtement. Nous ne constatons pas de différence notable de morphologie des MSCs

entre les deux types d’échantillons : les cellules sont étalées et de nombreux filopodes

assurent l’ancrage des cellules sur les céramiques. Nous pouvons constater deux types de

morphologie (pour les deux types de matériaux) : des cellules allongées qui semblent

accrochées à la surface au niveau de leurs extrémités essentiellement par l’intermédiaire de

ces longs filopodes, d’une part ; et des cellules plus étalées en contact étroit avec la céramique

avec semble-t-il la présence de lamellipodes, d’autre part.

Ces observations sont compatibles avec une bonne adhésion et une bonne interaction cellule-

matériau. La présence du revêtement ne semble donc pas modifier de manière significative le

comportement des MSCs après 3 jours d’incubation.

4.1.3. Différenciation des cellules en contact avec les matériaux

Plusieurs études ont montré que des matériaux pouvaient induire directement une

différenciation cellulaire sans ajout d’autre facteur. Dans cette étude, nous avons évalué

l’activité phosphatase alcaline de deux types cellulaires (C3H10T1/2 et MG63) après

croissance sur nos matériaux (Figure IV.4).

Pour les deux types cellulaires, nous n’observons pas d’augmentation significative de

l’activité de l’ALP, qui pourrait laisser suggérer une différenciation ostéoblastique induite par

l’interaction cellules-matériau.

110

Figure IV.4 : Activité spécifique de la phosphatase alcaline des C3H10T1/2 (a) et MG63 (b) après croissance sur les granulés témoins et revêtus. Les cellules ont été ensemencées à 40000 cellules/granulés et incubées pendant 7 à 14 jours dans du milieu complet. Les résultats correspondent à la moyenne de 3 granulés ± écart-type.

4.2. Différenciation en réponse à la BMP-2 adsorbée

Le processus d’adsorption de la BMP-2 sur les granulés phosphocalciques est susceptible

d’engendrer des modifications de la structure protéique et donc une perte d’activité de celle-

ci. La capacité de différenciation de la BMP-2 adsorbée sur les différents types de céramiques

a donc été évaluée.

Figure IV.5 : Activité spécifique de l’ALP en fonction du temps d’incubation des C2C12 sur les granulés, témoins et revêtus, contenant la rhBMP-2 adsorbée. Les cellules ont été ensemencées à 40000 cellules par granulé et maintenues dans du milieu DMEM avec 1% de SVF et 1%P/S. Les résultats correspondent à la moyenne ± écart-type de 3 échantillons pour chaque point).

111

Sur la figure IV.5, nous pouvons remarquer une très forte augmentation de l’activité

spécifique de la phosphatase alcaline des C2C12 après leur incubation sur les granulés

contenant la BMP-2 adsorbée. Le profil en cloche, observé pour les deux types de granulés,

est caractéristique de la différenciation ostéoblastique : l’activité spécifique de l’ALP

augmente après initiation de la différenciation, puis diminue, traduisant le passage des cellules

à un état de différenciation plus avancé. Les taux d’activité de l’ALP mesurés sont du même

ordre de grandeur pour les échantillons témoins et revêtus ; le profil de différenciation

apparaît cependant décalé dans le temps pour les échantillons NanoAp-EtOH avec un

maximum d’activité après environ 14 jours d’incubation contre 7 jours pour les céramiques

non revêtues.

Ces résultats indiquent que la BMP-2 adsorbée sur les granulés témoins et revêtus conserve

une forte capacité de différenciation.

Nous avons mis en évidence dans le paragraphe précédent que, lors des premiers jours

d’incubation, la quantité de cellules présentes à la surface des granulés était plus faible en

présence du revêtement. Nous avons donc cherché à évaluer l’influence de l’état de

confluence des cellules à l’intérieur des matériaux sur la trans-différenciation des C2C12

induite par la BMP-2 adsorbée.

Figure IV.6 : Résultats du test MTT (correspondant à la quantité de cellules sur les échantillons) (a) et mesure de l’activité spécifique ALP (b) des C2C12 cultivées sur les granulés contenant la rhBMP-2 pré-adsorbée en fonction de la confluence cellulaire. Les cellules ont été ensemencées à 10000, 20000 ou 40000 cellules/granulé et entretenues dans du milieu DMEM 1% SVF, 1%P/S pendant 7 jours. Les résultats correspondent à la moyenne ± écart-type de 3 échantillons pour chaque point.

112

Tout d’abord, la présence de BMP-2 adsorbée sur les granulés ne modifie pas les différences

observées entre les deux types d’échantillons concernant l’adhésion et la prolifération

cellulaires : la quantité de cellules est plus faible sur les granulés revêtus après 24h

d’incubation, ce qui se traduit par une confluence plus faible sur ces échantillons lors des

premiers jours de croissance. Nous pouvons observer sur la figure IV.6a que pour les

ensemencements initiaux les plus faibles (10000 et 20000 cellules par granulé), le nombre de

cellules à J7 est inférieur sur les granulés revêtus. Pour un ensemencement de 40000

cellules/granulé, le nombre de cellules apparaît équivalent à J7 mais il semble probable qu’il

ait été plus faible lors des premiers jours d’incubation sur ces granulés. La figure IV.6b

montre, par ailleurs, que l’augmentation de l’activité ALP des C2C12 en réponse à la BMP-2

adsorbée est corrélée à l’état de confluence des cellules. En effet, l’activité ALP augmente

lorsque la quantité initiale de cellules ensemencées augmente. La réponse apparaît d’autre part

toujours plus faible sur les granulés revêtus.

5. Discussion

5.1. Biocompatibilité générale des céramiques étudiées

Dans la première partie de cette étude, nous avons cherché à déterminer si les granulés revêtus

présentaient une biocompatibilité suffisante pour leur utilisation ultérieure in vivo. Cette

évaluation a été réalisée par comparaison des réponses cellulaires obtenues sur les matériaux

revêtus avec celle des céramiques de BCP, témoins, déjà commercialisées. Dans la littérature,

la biocompatibilité d’un matériau est souvent évaluée par l’étude de l’adhésion, la

prolifération et la morphologie des cellules au contact de l’échantillon. Rosa et al., par

exemple, indiquent que des céramiques phosphocalciques peuvent être décrites comme

biocompatibles à partir du moment où celles-ci permettent l’adhésion, la prolifération et la

différenciation ostéoblastique de cellules (Rosa et al. 2003).

Dans notre étude, les pourcentages d’adhésion cellulaire sont peu différents entre les

matériaux témoins et revêtus et sont d’au minimum 41 % pour les C3H10T1/2 et 55 % pour

les C2C12, ce qui correspond aux valeurs classiquement obtenues sur des céramiques

phosphocalciques (compris en général entre 30 et 60 % au cours des premières heures

d’incubation) (Sous et al. 1998, Rosa et al. 2003, Pellenc et al. 2006). Les différents types

cellulaires sont par ailleurs capables de proliférer à l’intérieur des pores des céramiques

témoins et revêtues, jusqu’à la colonisation quasi-complète du matériau. La différenciation

113

ostéoblastique en réponse à la rhBMP-2 ou au milieu ostéogénique respectivement pour les

C2C12 et cellules souches mésenchymateuses humaines a aussi été observée après leur

croissance sur les deux matériaux (résultats qualitatifs non montrés).

D’autre part, nous n’avons pas constaté de différences de morphologie des hMSCs après 3

jours de croissance sur les matériaux témoins et revêtus : les cellules apparaissent bien étalées

et bien accrochées à la surface des matériaux, ce qui confirmerait une bonne biocompatibilité

des céramiques étudiées.

Des expériences préliminaires visant à évaluer directement le pourcentage de mortalité

cellulaire au cours des premiers jours d’incubation sur nos matériaux ont par ailleurs été

effectuées (Figure IV.7).

Figure IV.7 : Pourcentage de viabilité des C2C12 (a) et C3H10T1/2 (b) ensemencées sur les granulés témoins et revêtus. Les cellules ont été ensemencées à 20000 cellules par granulé et maintenues dans du DMEM complet. Les expériences ont été effectuées par test d’exclusion au bleu trypan sur les cellules préalablement décrochées des matériaux. Les résultats sont représentés sous forme de moyenne ± écart-type sur trois expériences indépendantes (avec n = 3 pour chaque expérience) pour les C2C12 (a) et sur une expérience avec n = 3 échantillons pour les C3H10T1/2 (b).

Dans ces expériences, nous n’avons pas constaté de différence significative de la viabilité

cellulaire entre les deux types d’échantillons. Celle-ci est supérieure à 50% après 24h

d’incubation et augmente significativement au cours du temps pour atteindre un taux

d’environ 90% à partir de J3 pour les deux types de matériaux. Il faut toutefois noter que ces

résultats ne concernent que les cellules entières décrochées du matériau (ce qui ne représente

pas la totalité des cellules ensemencées) et la présence de débris issus des matériaux rend le

dénombrement cellulaire délicat. Dans les conditions de l’étude, la sensibilité de cette

114

méthode est par conséquent assez faible et ne permet pas d’effectuer une comparaison fine de

la cytotoxicité des matériaux témoins et revêtus.

En conclusion, tous ces résultats indiquent que les deux types de matériaux présentent une

bonne biocompatibilité, suffisante pour leur utilisation in vivo.

5.2. Adhésion et prolifération cellulaires

Des modifications de l’adhésion et la prolifération des cellules ont cependant été observées

sur les échantillons en présence du revêtement. Liu et al. expriment un principe selon lequel la

compatibilité cellule-matériau peut être évaluée par le temps nécessaire à l’adhésion,

l’étalement et la prolifération des cellules sur l’échantillon : plus le temps requis est long,

moins le matériau est compatible (Liu et al. 2007a). En ce basant sur ce principe, il semblerait

donc que les matériaux revêtus présentent une compatibilité plus faible que les céramiques de

BCP.

Comme nous l’avons mentionné dans la partie introductive, beaucoup de paramètres peuvent

être reliés à l’adhésion et la prolifération des cellules sur des biomatériaux : la composition

chimique, l’énergie de surface, la rugosité, les micro- et nano-topographie, la taille des

cristallites, le pourcentage de porosité, notamment, sont susceptibles d’induire des

modifications de la réponse cellulaire à l’égard d’un biomatériau. Dans notre étude, tous ces

paramètres sont modifiés en présence du revêtement et plusieurs hypothèses peuvent être

formulées pour expliquer les différences observées.

La présence de micro-environnements particuliers à l’intérieur des pores des céramiques

pourrait fournir une première explication. En effet, dans notre étude, les cellules sont

ensemencées directement à l’intérieur des pores des matériaux et sont cultivées dans des

conditions statiques. Le renouvellement du milieu est par conséquent assez limité et les

conditions locales de culture (à l’intérieur des pores) peuvent s’avérer très différentes en

présence ou absence du revêtement. Quelques auteurs ont suggéré que les concentrations

ioniques en calcium et phosphate pouvaient être modifiées à l’intérieur des pores de

céramiques phosphocalciques (Duan et al. 2004, Habibovic et al. 2005). Or, les ions calcium

et phosphate sont connus pour avoir une action sur la prolifération, la différenciation

ostéoblastique et la mortalité cellulaires. Dans une gamme donnée, l’addition de calcium dans

le milieu s’accompagne d’une augmentation de la prolifération et de la différenciation

ostéoblastique (Yamaguchi et al. 1998, Chang et al. 2000). Par contre, une diminution de la

115

concentration en calcium dans le milieu tout comme un excès d’ions calcium et phosphate

peuvent limiter la prolifération cellulaire et même s’avérer toxique pour les cellules aussi bien

in vitro qu’in vivo (Midy et al. 2001, Le Nihouannen et al 2007, Yuan et al. 2001a.). De par

leur nature, il est possible que les nanocristaux de notre revêtement puissent se dissoudre plus

facilement dans le milieu de culture ou induire des échanges ioniques importants, modifiant

ainsi de manière significative la composition ionique locale du milieu de culture et ayant un

effet délétère sur l’adhésion et la prolifération cellulaires.

De même, les pH locaux pourraient être différents entre les deux types de matériaux. Nous

avons, en effet, constaté que les nanocristaux présentaient à leur surface un pH plutôt acide

après immersion dans le milieu de culture. Une pré-incubation des échantillons dans du milieu

avant l’ensemencement des cellules a été effectuée afin d’équilibrer la surface des

échantillons. Toutefois, et bien que nous n’ayons pas distingué de différence globale de pH

dans le milieu de culture, il est possible que lors des premiers temps d’incubation, celui-ci soit

différent à l’intérieur des pores des céramiques témoins ou revêtues.

D’autre part, un des principaux enjeux de l’ingénierie tissulaire concerne l’apport en

nutriments et oxygène nécessaires à la survie, prolifération et différenciation ostéoblastique

des cellules progénitrices cultivées au sein d’un matériau. Dans notre cas, la forte réactivité de

surface des céramiques revêtues peut s’accompagner d’une adsorption importante des

protéines sériques, nécessaires à la survie et à la prolifération cellulaires et donc contribuer à

un appauvrissement du milieu de culture, notamment lors de la phase d’ensemencement au

cours de laquelle le volume de milieu ajouté est faible.

De telles modifications du milieu de culture pourraient donc être responsables d’une

cytotoxicité apparente des matériaux.

Une autre hypothèse concerne l’adsorption de protéines impliquées dans l’adhésion cellulaire

à la surface des céramiques. Dans leurs études, la majorité des auteurs attribuent, en effet, les

différences d’adhésions, de prolifération et même de différenciation observées entre plusieurs

types d’échantillons à des modifications de l’adsorption de certaines protéines du sérum dont

la fibronectine ou la vibronectine. Les différents facteurs cités précédemment (topographie,

énergie de surface, composition…) sont, en effet, susceptibles d’influencer l’adsorption de

protéines par les matériaux. Dans notre étude, nous avons mis en évidence que la présence du

revêtement augmentait de manière significative l’adsorption de BSA ou de BMP-2 ; nous

n’avons cependant pas étudié l’adsorption de protéines contenues dans le milieu de culture sur

les échantillons revêtus. Il est probable qu’évaluée de manière globale, l’adsorption des

116

protéines du sérum soit favorisée en présence du revêtement ; une adsorption sélective

différente entre les deux types de matériaux ne peut cependant pas être exclue. Quelques

études ont montré que la composition chimique ainsi que la taille des cristallites pouvaient en

effet conduire une adsorption préférentielle de certaines protéines du sérum au détriment

d’autres, et modifier ainsi la réponse cellulaire obtenue (Webster et al. 2000b, Zhu et al.

2007). D’autre part, il peut être suggéré que, bien que présentes en plus grandes quantités, les

protéines d’adhésion s’associent plus difficilement aux intégrines sur les granulés revêtus en

raison de leur pénétration dans les pores de dimension nanométrique ou de modifications

conformationnelles, consécutives à leur adsorption, limitant leur interaction avec les

récepteurs (Garcia et al. 1999).

D’autres auteurs ont montré toutefois que l’adsorption de protéines telles que la fibronectine à

la surface des échantillons ne semblait pas être l’élément discriminant des différences

d’adhésion observées entre différents échantillons. Dos Santos et al. n’ont pas trouvé de

corrélation directe entre l’adsorption de fibronectine sur des échantillons d’HA ou β-TCP,

revêtus ou non d’un film d’or, et l’adhésion ou l’étalement de cellules d’ostéosarcomes

humains (dos Santos et al. 2008). De même, dans leur étude sur des échantillons de titane

présentant différentes échelles de nanoporosités, Lim et al. suggèrent que l’adsorption de

protéines influencerait peu l’adhésion cellulaire pour des surfaces de même composition

chimique et qu’un effet direct de la topographie de surface sur les cellules jouerait un rôle

plus important (Lim et al. 2007). Une influence de la topographie de surface sur les réponses

cellulaires (adhésion, prolifération et différenciation) est maintenant clairement admise et ce

paramètre, différent pour nos échantillons témoins et revêtus, pourrait par conséquent

intervenir dans les différences d’adhésion et de prolifération cellulaires observées.

5.3. La différenciation intrinsèque

Plusieurs études ont montré que des matériaux étaient capables d’induire la différenciation

ostéoblastique de cellules progénitrices et la maturation d’ostéoblastes sans ajout d’agents

différenciants. La croissance d’ostéoblastes ou de cellules souches mésenchymateuses sur des

matériaux phosphocalciques s’accompagne souvent d’une différenciation accrue, caractérisée

par une augmentation de l’expression des marqueurs de différenciation (Collagène de type I,

ostéocalcine, ostéopontine) et de l’activité ALP (Chou et al. 2005, Lin et al. 2008, Muller et

al. 2008). Dans cette étude, nous avons cherché à évaluer le potentiel de différenciation

ostéoblastique intrinsèque de nos échantillons. Nous n’avons pas pu mettre en évidence

117

d’augmentation significative de l’activité ALP après croissance de cellules souches

mésenchymateuses (C3H10T1/2) ou ostéoblastes (MG63) sur nos deux types de granulés.

La mesure de l’activité ALP est une méthode simple et très couramment utilisée pour évaluer

la différenciation ostéoblastique de cellules en réponse à des matériaux ou agents de

différenciation. Cependant, la détection de cette activité enzymatique n’apparaît pas assez

sensible dans nos conditions expérimentales pour évaluer de manière précise la différenciation

ostéoblastique en réponse à nos matériaux. Pour palier ce manque de sensibilité, une étude de

l’expression d’autres marqueurs de différenciation ostéoblastique a été entreprise. Une

première expérience a été effectuée par qRT-PCR (Quantitative Reverse Transcription-

Polymerase Chain Reaction). Cette technique permet d’évaluer de manière semi-quantitative

la quantité d’un ARN messager donné - codant pour une protéine donnée - qui a été

synthétisée par les cellules. Cette technique, de sensibilité supérieure à celle de la mesure de

l’activité ALP, permet d’étudier l’expression de différents marqueurs ostéoblastiques, et donc

d’évaluer l’état de différenciation des cellules. Les résultats préliminaires, issus de ces

expériences, indiquent une augmentation de l’expression génique des trois marqueurs étudiés

(ALP, collagène de type I et ostéocalcine) après 3 ou 7 jours d’incubation des C3H10T1/2 sur

nos matériaux témoins et revêtus, par rapport aux puits contrôle. Quelques différences

d’expression peuvent aussi être détectées en fonction du type de matériau sur lequel les

cellules ont été cultivées : nous avons observé une augmentation de la quantité d’ARNm

codant pour le collagène de type I et l’ALP sur les granulés revêtus après 3 jours d’incubation

et une augmentation de l’expression de l’ostéocalcine sur les granulés témoins à 7 jours. Ces

résultats, certes préliminaires, sont encourageants et suggèrent une initiation de la

différenciation ostéoblastique en réponse aux deux types de matériaux et indiquent des profils

différents en présence ou absence du revêtement.

5.4. Différenciation en réponse à la rhBMP-2 adsorbée

Peu d’études s’intéressent à la réponse cellulaire in vitro induite par l’association de BMP-2

sur des matériaux. Ces études concernent en général la réponse des cellules à la BMP-2

libérée dans le milieu de culture (Schliephake et al. 2007, Ziegler et al. 2008). Nous avons

aussi, dans notre étude, évalué la réponse des C2C12 - cultivées dans des puits de culture

TCPS - à la BMP-2 libérée des échantillons (résultats non montrés). Dans ces expériences, la

BMP-2 libérée à partir des échantillons induit une augmentation de l’activité ALP, mais cette

augmentation reste faible et nous n’avons pas constaté de différence entre les deux types

118

d’échantillons. Ceci peut facilement s’expliquer par la cinétique de libération de la BMP-2 qui

n’est pas linéaire. A partir de J4, pour les échantillons revêtus comme pour les témoins, la

concentration en BMP-2 dans le milieu est inférieure aux concentrations couramment utilisées

pour induire la différenciation des C2C12 (300 ng/ml). Ceci ne permet donc pas d’avoir une

différenciation soutenue dans le temps et peut expliquer le peu de différences observées entre

les deux échantillons. La différenciation de cellules directement ensemencées sur les

échantillons est susceptible d’apporter une réponse plus proche de celle observée in vivo. La

BMP-2 libérée des échantillons devrait, en effet, agir essentiellement sur les cellules qui

auront migré à l’intérieur des pores du matériau. Nous constatons, dans cette situation, que la

différenciation des C2C12 en réponse à la BMP-2 adsorbée est importante sur les deux types

d’échantillons, ce qui montre que l’activité de la protéine n’est pas altérée par l’adsorption sur

les substrats. Même si les capacités de différenciation de la BMP-2 apparaissent équivalentes

pour les deux échantillons, nous constatons cependant, un retard de la réponse sur les

échantillons revêtus. La libération plus lente de la BMP-2 adsorbée sur les échantillons

revêtus peut expliquer en partie le décalage de différenciation observé. Mais comme nous

l’avons montré, par ailleurs, la confluence cellulaire joue un rôle non négligeable dans la

réponse des C2C12 à la BMP-2 adsorbée. La confluence des cellules, plus faible sur les

granulés revêtus, pourrait donc aussi participer à ce retard de différenciation.

6. Conclusions et perspectives

Les expériences de culture cellulaires effectuées ici nous ont permis de comparer

macroscopiquement la réponse des cellules incubées sur nos échantillons témoins et revêtus.

Nous avons pu, tout d’abord, mettre en évidence une bonne biocompatibilité des matériaux

revêtus vis-à-vis des différents types cellulaires étudiés. Ce résultat est particulièrement

important puisqu’il constitue un pré-requis indispensable aux expérimentations chez l’animal

prévues à la suite de cette étude cellulaire in vitro.

Quelques différences d’adhésion et de prolifération cellulaires ont toutefois été observées en

présence du revêtement. Les raisons de ces différences pourraient faire l’objet d’études plus

approfondies. Il n’est, tout d’abord, pas exclu que le revêtement induise une légere

cytotoxicité au cours des premiers jours d’incubation avec les cellules. Des mesures de

l’activité de la LDH (lactate déshydrogénase) libérée dans le milieu ou présente dans les

cellules ainsi que l’utilisation de kits permettant de visualiser les cellules viables et les

cellules mortes in situ par marquage fluorescent (kit live/dead®, Invitrogen) pourraient donc

119

être envisagées. Dans un autre registre, il pourrait être intéressant d’effectuer une

caractérisation plus précise de l’adhésion cellulaire sur nos matériaux. Une cinétique à des

temps précoces de l’interaction cellules/matériaux pourrait être réalisée. Ainsi l’étude de

l’étalement des cellules ainsi que la quantité et la répartition des points focaux pourraient nous

fournir des informations sur l’affinité des cellules pour le revêtement nanocristallin. De telles

expériences font appel à des techniques d’imagerie (par immunoflurorescence ou MEB)

suivies d’une analyse comparative. L’utilisation de matériaux ayant une surface plane est par

conséquent nécessaire. L’équipe du CIRIMAT travaille actuellement sur le développement du

procédé permettant d’obtenir des pastilles denses à partir de cristaux d’apatite nanocristalline

similaires à ceux qui constituent notre revêtement. Une fois le procédé mis au point, il sera

possible de synthétiser des pastilles denses ou poreuses d’apatites nanocristallines présentant

des caractéristiques données parfaitement contrôlées et modifiables (différence de rapport

Ca/P, taux de carbonate modifié, taille des cristallites….) et donc d’effectuer des corrélations

entre la réponse obtenue et les propriétés des matériaux.

Nous avons d’autre part cherché à déterminer si les céramiques de notre étude étaient

capables d’induire une différenciation ostéoblastique de cellules souches mésenchymateuses

ou d’ostéoblastes sans addition d’agent différenciant. L’étude de l’activité de la phosphatase

alcaline exprimée par les cellules cultivées sur les matériaux n’a pas permis de mettre en

évidence une éventuelle capacité de différenciation de l’un ou l’autre de nos matériaux. Les

études préliminaires, impliquant la détection d’autres marqueurs de la différenciation

ostéoblastique (collagène de type I, ALP, ostéocalcine) par RT-PCR sont cependant très

encourageantes. Des cinétiques de différenciation doivent maintenant être effectuées, et les

marqueurs de différenciation ostéoblastique seront évalués par RT-PCR quantitative pour plus

de précision. Si, comme les résultats préliminaires le suggèrent, nous observons des

différences de profil entre les deux matériaux, nous pourrons évaluer l’expression d’autres

marqueurs (bone sialoproteine, osteopontine…) et de facteurs de transcription (runx-2,

osterix, msx-2, dlx-3 ou -5) classiquement impliqués dans la différenciation ostéoblastique.

Dans cette étude, nous avons enfin pu mettre en évidence que la BMP-2 adsorbée sur nos

échantillons conservait son potentiel de différenciation, et ce, quelque soit le type

d’échantillon. Les résultats obtenus pourraient être confirmés sur d’autres types cellulaires et

plus particulièrement sur des cellules mésenchymateuses (C3H10T1/2) ou des pré-

ostéoblastes (MC3T3). Nous avons, par ailleurs, suggéré que l’adsorption de la BMP-2 sur les

120

échantillons revêtus pouvait permettre à une libération de la protéine plus progressive et

soutenue dans le temps. Afin de déterminer si la présence du revêtement apporte un avantage

de cet ordre, nous pourrions envisager d’évaluer la différenciation cellulaire consécutive à une

pré-libération de la BMP-2 avant l’ensemencement des cellules sur les échantillons.

Chapitre 5

Etude du potentiel ostéoinducteur des céramiques de BCP revêtues avec un dépôt

d’apatite carbonatée nanocristalline avec ou sans rhBMP-2 chez l’animal

121

Dans ce chapitre, nous avons comparé le potentiel ostéoinducteur des céramiques de BCP

témoins et revêtues par le procédé NanoAp-EtOH, en présence ou absence de rhBMP-2 lors

d'implantation d'échantillons en site ectopique chez le mouton. Dans la partie bibliographique

de ce chapitre, nous ne reviendrons pas sur les paramètres majeurs qui influencent le potentiel

ostéoinducteur des biomatériaux (déjà décrits dans le chapitre 1). Nous indiquons ici des

éléments plus pratiques qui ont influencé nos choix lors de la préparation de cette étude

animale.

1. Introduction bibliographique

Comme nous l’avons déjà mentionné, le phénomène d’ostéoinduction est décrit comme la

capacité d’un matériau à induire la différenciation de cellules souches progénitrices en

ostéoblastes. En pratique, le potentiel ostéoinducteur d’un matériau est déterminé par sa

capacité à initier une formation d’os dans un site ectopique chez l’animal.

Les caractéristiques des matériaux, associés ou non avec des facteurs de croissances

ostéogéniques, sont déterminantes dans la réponse obtenue. Mais celle-ci est aussi dépendante

d’autres facteurs, à savoir, le site d’implantation, la taille de l’implant, le modèle animal

choisi ou encore la durée d’implantation.

1.1. Les modèles animaux

Différents modèles animaux sont utilisés pour évaluer le potentiel ostéoinducteur des

matériaux. Les réponses obtenues sont cependant très variables en fonction de l’espèce

étudiée et les modèles animaux préférentiellement utilisés sont différents en fonction du type

de substitut osseux étudié.

1.1.1. Les modèles d’ostéoinduction par les BMPs

Comme nous l’avons indiqué dans la partie introductive, la BMP-2 est capable d’initier la

formation d’os dans des sites ectopiques dans différents modèles animaux. L’ostéoinduction

par les BMPs est couramment étudiée chez les rongeurs (souris, rat, lapin) (Boyan et al. 1999,

Yuan et al. 2001c, Liu et al. 2005). Ces animaux constituent en effet un modèle de choix pour

comparer l’efficacité d’un matériau à induire une croissance osseuse ectopique en réponse aux

BMPs. Cela permet notamment d’évaluer l’influence des caractéristiques du matériau ou de la

méthode d’association du facteur de croissance sur la réponse obtenue. La stimulation de la

122

formation osseuse est en effet très importante chez ces animaux : l’implantation de quelques

microgrammes de BMP-2 suffit à initier un phénomène d’ostéoinduction (Alam et al. 2001).

Ces modèles présentent donc un grand intérêt pour effectuer une première comparaison de

l’efficacité des matériaux associés aux protéines avec des temps d’implantation courts et à

faible coût.

Toutefois, ces animaux apparaissent beaucoup plus sensibles aux BMP-2 que les grands

animaux (moutons, chèvres, chiens , primates, …), et que l’homme en particulier. Les

quantités nécessaires pour obtenir une réponse sont supérieures à 1 mg chez l’homme et sont

de plusieurs centaines de microgrammes chez les grands animaux. Les modèles de grands

animaux peuvent alors être préférés pour évaluer la capacité des matériaux à incorporer et

conserver une grande quantité de facteur de croissance et ainsi avoir une réponse plus proche

de celle espérée en application clinique chez l’homme. Quelques études ont mis en évidence

le potentiel ostéoinducteur des BMP-2 (ou -7) chez le singe ou le babouin (Miyamoto et al.

1993, Ripamonti et al. 2001), chez la chèvre (Kempen et al. 2009) ou le chien (Yuan et al.

1998). Chez le mouton, la seule étude décrite, à notre connaissance, concerne le revêtement

de pastilles de titane avec un polymère (poly (D,L-lactide)) (PDLLA)) dans lequel est

incorporé de la rhBMP-2. Dans cette étude, les auteurs n’ont pas observé de formation d’os à

la suite d’une implantation intramusculaire de 3 mois. Ils indiquent cependant que la faible

dose de BMP-2 utilisée (50 µg) et sa libération trop rapide (50% en seulement 48h) seraient

responsables du manque d’efficacité du facteur de croissance (Wildemann et al. 2004). La

capacité de la BMP-2 à induire une différenciation ostéoblastique chez le mouton est toutefois

suggérée par d’autres études.

Kirker-Head et al. ont montré, en effet, qu’une perte de substance importante responsable

d'une pseudarthrose pouvait être reconstruite par l’association de BMP-2 recombinante avec

du poly[D,L(lactide-co-glycolide)] (PLGA) (Kirker-Head et al. 1998). Plusieurs études ont

montré, en outre, un effet de la BMP-2 sur la reconstruction osseuse en site orthotopique. Les

quantités de protéines utilisées dans ces études sont variables mais sont en général supérieures

à 100 µg/implant et plus couramment d’environ 400 µg/ml de zone de comblement (Kessler

et al. 2004, Sachse et al. 2005, Toth et al. 2009).

1.1.2. Les modèles d’ostéoinduction par les matériaux

De même que pour l’ostéoinduction en réponse aux BMPs, des phénomènes d’ostéoinduction

par les matériaux ont pu être mis en évidence dans plusieurs modèles animaux. Mais dans ce

123

cas-ci, ce sont les grands animaux qui constituent les modèles de choix pour ces études. La

capacité intrinsèque d’un matériau à initier une formation osseuse dans un site ectopique est,

en effet, très dépendante de l’espèce considérée et s’avère être particulièrement faible chez les

rongeurs. Ripamonti a implanté des échantillons d’hydroxyapatite dérivée de coraux dans

l’abdomen (rectus abdominis = muscle droit de l’abdomen) de lapin, de chien ou de babouin

(papio ursinus). Après 3 mois d’implantation, la croissance osseuse à l’intérieur des pores des

céramiques était particulièrement faible chez le lapin et le chien mais apparaissait très

importante chez le babouin (environ 10 fois supérieure) (Ripamonti 1996). Yuan et al. ont

d’autre part évalué le potentiel ostéoinducteur de céramiques d’HA ou de BCP après

implantation sous-cutanée chez la souris, et intramusculaire chez le rat, le lapin et le chien

pendant 90 jours. L’ostéoinduction en réponse à l’HA n’a pu être observée que chez le chien

alors que les échantillons de BCP induisaient une formation osseuse dans plusieurs des

espèces étudiées. La réponse restait toutefois supérieure chez le chien où la présence d’os

néoformé était visible dans tous les échantillons alors que 6 échantillons sur 8 contenaient de

l’os chez le lapin et seulement 3 sur 16 chez la souris. Aucune ostéoinduction n’a d’autre part

été observée chez le rat dans cette étude (Yuan et al. 2006b).

Les modèles les plus couramment utilisés sont le chien, la chèvre et le babouin (Ripamonti

1996, Yuan et al. 2006a, Habibovic et al. 2008). Des expériences chez le cochon ou le mouton

ont aussi montré que ces animaux avaient la capacité d’induire une croissance osseuse

importante après implantation intramusculaire de céramiques de BCP pendant 3 ou 6 mois

(Yuan et al. 1998, Le Nihouannen et al. 2005).

1.2. Le site d’implantation

Pour évaluer le potentiel ostéoinducteur des substituts osseux, leur implantation dans un site

ectopique est nécessaire. Ces implantations sont faites généralement dans le tissu sous-cutané

ou dans le muscle des animaux mais des différences de réponses peuvent être observées en

fonction du site choisi. Okubo et al. ont montré, par exemple, que le site d’implantation avait

une influence sur l’ampleur de la réponse obtenue après implantation d’éponges de collagène

avec de la BMP-2 (5µg) chez le rat. Ils ont observé que la quantité d’os néoformé était plus

importante pour les échantillons après implantation intramusculaire puis intermusculaire.

L’implantation dans le tissu sous-cutané ou dans les tissus adipeux s’accompagnait d’une

formation d’os plus faible (Okubo et al. 2000). Des observations similaires ont été faites pour

la formation d’os ectopique par des céramiques de BCP. Habibovic et al. ont montré que le

124

site d’implantation était d’une importance capitale dans les résultats obtenus dans leurs étude

chez la chèvre. Alors que l’implantation intramusculaire de céramiques de BCP (HA/β-TCP :

70/30) induisait une formation osseuse dans 7 des 10 animaux, chez aucun de ces animaux, la

présence d’os n’a pu être visualisée après implantation sous-cutanée de ces mêmes

échantillons (Habibovic et al. 2006a).

1.3. La taille de l’implant

La taille de l’implant semble, par ailleurs, avoir une influence sur la formation d’os ectopique

induite par les matériaux. Habibovic et al. ont étudié l’implantation intramusculaire chez la

chèvre de cylindre macro- et micro-poreux de BCP (HA/β-TCP : 80/20) de 6,5 mm de

diamètre et de longueur variable : 10 mm ou 5 mm. Dans cette étude, 9 animaux sur 10

présentaient une formation d’os à l’intérieur des pores des substituts de grande taille alors que

la présence d’os néoformé n’était visible que dans 7 animaux sur 10 pour les « demi-

cylindres » après 3 mois d’implantation. Le pourcentage d’os par pore et la vitesse de

formation osseuse étaient par ailleurs plus importants pour les implants de grande taille

(Habibovic et al. 2006a).

1.4. Le temps d’implantation

Le temps d’implantation a aussi une forte influence sur la réponse obtenue. Après une phase

d’initiation plus ou moins longue, une croissance osseuse est observée au sein du matériau

lors de son implantation en site ectopique. S’en suit un ralentissement de la formation osseuse

puis à terme une résorption de l’os néoformé en raison de l’absence de contraintes

mécaniques qui assurent le remodelage et le maintien du capital osseux. Pour comparer le

potentiel ostéoinducteur d’un matériau, il est donc conseillé d’étudier la quantité d’os formé à

l’issue de temps d’implantation différents. Chez les grands animaux, les durées

d’implantations classiquement étudiées sont 6 et 12 semaines. La durée de 6 semaines

correspond à un temps précoce qui donne des informations sur la cinétique de croissance,

alors que le temps de 12 semaines, pour lequel la formation osseuse est bien établie, permet

d’effectuer une comparaison fiable du potentiel ostéoinducteur des échantillons. Une

comparaison à plus long terme est aussi parfois effectuée.

Yuan et al. ont réalisé une cinétique détaillée des phénomènes reliés à l’ostéoinduction par

des céramiques de BCP (HA/β-TCP : 62/38) après implantation intramusculaire chez le chien.

125

Après 7 jours d’implantation, ils ont observé une infiltration de fibres et de cellules sanguines

dans les pores du matériau ; après 14 jours, des cellules ont adhéré à la surface des pores et la

présence de vaisseaux sanguins est détectée. La prolifération et la différenciation

ostéoblastique débutent à J21 et à J30. La matrice osseuse (tissu ostéoïde et ostéoblastes)

apparaît se minéraliser après 45 jours d’implantation. A J60, un début de remodelage osseux

est visible mais la maturation de l’os formé se poursuit : après 6 mois d’implantation, la

présence de moelle osseuse est clairement distinguée au centre des pores et après 1 an, l’os

apparaît mature avec présence de canaux haversiens (Yuan et al. 2006a).

2. Objectifs

L’objectif de cette étude était de confirmer la biocompatibilité et d’évaluer le potentiel

ostéoinducteur des biomatériaux réalisés et caractérisés au cours de ce travail. Pour cela, des

implantations intramusculaires de nos céramiques ont été effectuées chez des brebis. Le

modèle animal ovin apparaissait parfaitement adapté pour cette étude étant donné que cettre

dernière avait deux finalités : 1) comparer l’effet de notre revêtement sur l’ostéoinduction

induite par la rhBMP-2 associée au matériau par deux méthodes distinctes et 2) évaluer le

potentiel ostéoinducteur intrinsèque du revêtement nanocristallin. Afin tout d’abord

d’effectuer une comparaison des différents échantillons contenant la protéine et de leur

efficacité potentielle en application clinique, il semblait nécessaire d’utiliser un modèle

animal dont les capacités d’ostéogénèse en réponse à la BMP-2 apparaissaient proches de

celles de l’homme. C’est le cas du modèle animal ovin : celui-ci est sensible à l’action de la

rhBMP-2 (Kirker-Head et al. 1998) mais la protéine doit être administrée en quantité

importante pour être efficace (Toth et al. 2009). Le modèle animal ovin posséde, en outre, la

capacité d’induire une formation d’os dans un site ectopique en réponse à certains matériaux

phosphocalciques (Le Nihouannen et al. 2005), ce qui nous a permis d’évaluer le potentiel

ostéoinducteur intrinsèque de notre revêtement.

Différents types d’échantillons ont été implantés : des céramiques de BCP témoins et revêtues

seules ou en présence de rhBMP-2. La BMP-2 a été associée aux matériaux par deux

méthodes distinctes : la méthode de dépôt d’une goutte concentrée de solution protéique puis

séchage, ou la méthode d’adsorption. Après 1 et 3 mois d’implantation, des observations

histologiques ont été réalisées sur des coupes non-minéralisées des prélèvements et une

analyse quantitative de l’os néoformé a été effectuée.

126

3. Matériel et méthodes

3.1. Implants

3.1.1. Les céramiques

Les implants de BCP (CERAFORM - HA/β-TCP : 65/35) fournis par la société Teknimed

sont des parallélépipèdes de 5 mm x 5 mm x 20 mm (implantation A) ou des cylindres de 6

mm de diamètre et 20 mm de long (implantation B). Ces implants ont été coupés en deux dans

la largeur pour obtenir des échantillons longs de 9 à 10 mm (Figure V.1). Après la découpe,

les échantillons ont été calcinés à 900°C pendant 5 minutes puis une partie a été revêtue avec

le procédé NanoAp-EtOH. Les céramiques ont ensuite été stérilisées par rayonnement gamma

avant utilisation.

Figure V.1 : Photographie des échantillons placés dans les muscles paravertébraux des brebis lors de l’implantation A (a) et de l’implantation B (b).

3.1.2. Association avec la rhBMP-2

Une partie de ces échantillons a été utilisée en association avec la rhBMP-2. L’association de

la protéine a été réalisée par dépôt de solution concentrée ou par adsorption sur les implants

en conditions stériles (utilisation de solutions et matériels stériles sous hôte à flux laminaire).

• Dépôt d’une solution de rhBMP-2 sur les échantillons (implantation A) Une solution de rhBMP-2 à 3 mg/ml dans de l’eau milliQ est préparée. 50 µl de cette solution

sont déposés à l’aide d’une micropipette sur l’échantillon parallélépipédique en effectuant 5

dépôts de 10 µl en différents points le long de la céramique. De ce fait, la solution pénètre à

l’intérieur de la majorité des pores de la céramique sans traverser cette dernière. La quantité

de protéine déposée est alors parfaitement contrôlée. La solution protéique sèche pendant 24h

127

à température ambiante sous une hôte à flux laminaire et les échantillons sont ensuite

conservés à 4°C pendant 48h avant leur implantation.

La quantité de BMP-2 déposée est de 150 µg/ échantillon (600µg/cm3) quel que soit le type

de céramiques considérées (témoins ou revêtues).

• Adsorption de rhBMP-2 sur les échantillons (implantation B) Les cylindres sont immergés dans 550 µl de solution à 300 µg/ml de protéines dans un

tampon NaCl 1M, TRIS 25 mM, CaCl2 10mM, pH 7,4 pendant 24h à 37°C. La quantité

initiale de protéine mise en contact correspond à 600 µg/cm3 d’échantillon. La solution

d’adsorption est ensuite retirée et les échantillons sont lavés à deux reprises pendant une

minute dans de l’eau ultrapure (Gibco). Les échantillons sont séchés pendant 24h à

température ambiante, conservés à 4°C pendant 48h puis implantés. La quantité de protéine

restant en solution est déterminée par la méthode de Bradford (Biorad assay) dans des

microplaques.

La quantité de BMP-2 adsorbée est respectivement de 68 ± 14 µg/échantillon et

138 ± 10 µg/échantillon pour les cylindres témoins et revêtus.

3.2. Implantations intramusculaires

Les implantations ont été réalisées par le service de chirurgie de l’Ecole Nationale Vétérinaire

de Toulouse sur 9 brebis tarasconnaises calibrées et agées de 4 à 5 ans (GAC L’isle-en-

Dodon).

Les brebis ont été anesthésiées par une injection de 15 à 20 mg/kg de Thiopental

(NesdonalND, Merial) par voie veineuse. Après intubation endotrachéale et connexion à une

machine d’anesthésie par inhalation, l’anesthésie est entretenue avec de l’isoflurane à une

concentration moyenne de 2,5% dans du dioxygène pur.

Après désinfection et préparation de la zone chirurgicale, les

échantillons sont implantés le long du rachis de la brebis dans les

muscles paravertébraux. Deux exemplaires de chaque type

d’échantillon (CERAFORM ou CERAFORM revêtu ± rhBMP-2) sont

implantés par brebis (un de chaque côté du rachis). Les implants sont

espacés d’au moins 5 cm les uns des autres pour éviter des interactions

potentielles entre les échantillons (Figure V.2).

Figure V.2 : Photographie de

l’emplacement des implants

128

Au total, pour chaque type et durée d’implantation, 6 échantillons ont été utilisés et répartis

sur 3 brebis. Deux séries d’implantations ont été réalisées (Tableau V.1).

Tableau V.1 : Description des échantillons implantés.

Implantation A (parallélépipèdes)

nombre d'échantillons

Implantation B (cylindres)

nombre d'échantillons

1 mois 3 mois 3 mois Implants

Moutons 1,2,3 Moutons 4,5,6 Moutons 7,8,9

Témoins 6 6

Revêtus 6 6

Témoins+BMP-2déposée (150 µg) 6 6

Revêtus +BMP-2déposée (150 µg) 6 6

Témoins+BMP-2adsorbée (68 ± 14 µg) 6

Revêtus+BMP-2adsorbée (138 ± 10 µg) 6

Les différentes brebis ont reçu d’autres types d’échantillons en plus de

ceux décrits ici. Au maximum, 16 céramiques ont été implantées dans

le muscle du rachis d’une même brebis. Les autres échantillons ne

seront pas analysés dans ce manuscrit.

Pour l’implantation intramusculaire, la peau, le fascia lombaire et le

muscle long du dos sont incisés au bistouri dans le sens des fibres

(Figure V.3a). Les échantillons sont alors placés au sein du tissu

musculaire (Figure V.3b). L’aponévrose lombaire et le tissu conjonctif

sous-cutané sont suturés avec un fil irrrésorbable (Ethilon déc. 3,

Ethicon) afin de faciliter le repérage des sites d’implantation lors de

l’extraction des échantillons ex vivo (Figure V.3c). La peau est aussi

suturée avec un fil irrésorbable (Ethilon déc. 3, Ethicon) (Figure V.3d).

La zone opératoire est ensuite recouverte d’un pansement collé

surveillé quotidiennement pendant 10 jours puis retiré définitivement.

Figure V.3 : Etapes de l’implantation

chirurgicale

129

A la fin du temps d'implantation choisi (1 mois ou 3 mois), les brebis ont été sacrifiées par

overdose de thiopental (DoléthalND, Merial) et les échantillons récupérés immédiatement ont

été conservés dans une solution de formol à 10% avant les études d’histologie.

3.3. Etude histologique

L’inclusion des implants et la découpe des blocs obtenus ont été effectués en collaboration

avec le laboratoire d’anatomie et cytologie pathologique de l’hôpital de Rangueil.

• Inclusion des échantillons L’étude histologique a été réalisée sur coupes non-déminéralisées. Pour cela, les échantillons,

conservés dans la solution de formol, sont déshydratés puis inclus dans une résine de méthyl-

méthacrylate. Deux techniques d’inclusion ont été réalisées. Les échantillons extraits après 1

mois d’implantation ont été inclus par la méthode utilisée classiquement au laboratoire. Cette

méthode comporte la fixation des échantillons dans de l’alcool à 80°C pendant 24h puis leur

déshydratation par immersion dans des bains successif d’alcool de concentration croissante

pendant 24h puis dans du xylène pur pendant 4h. Les prélèvements sont ensuite placés dans

différents bains de méthyl-méthacrylate à température ambiante puis la dernière solution est

placée à 35°C jusqu’à polymérisation complète de la résine.

En raison de la forte toxicité des solutions employées et du nombre important d’échantillons à

traiter, un kit d’inclusion (Kit historésine Leica) a ensuite été utilisé pour l’inclusion des

autres échantillons. L’inclusion a été réalisée selon les instructions du fabricant : après

déshydration des échantillons par immersion dans des bains successifs d’alcool, les

prélèvements sont inclus dans une résine de méthyl-méthacrylate et placés dans une étuve à

30°C pendant 2 heures.

• Réalisation des coupes Des coupes d’environ 5 µm ont ensuite été effectuées sur ces blocs à l’aide d’un microtome

Leica. Une technique particulière à été utilisée pour éviter que l’implant ne s’effrite lors de la

coupe. Celle-ci a été réalisée en appliquant sur la surface à découper un morceau de scotch qui

assure l’intégrité de la céramique (Figure V.4). Les coupes des implants, collées sur ces

morceaux de scotch, sont ensuite colorées pour l’analyse histologique.

130

Figure V. 4: Photographie de la préparation d’une coupe à partir d’un bloc de résine.

• Coloration des échantillons Les coupes ont été traitées par la coloration Trichrome de Masson. Brièvement, pour réaliser

la coloration, les morceaux de scotch sur lesquels sont collées les coupes sont d’abord placés

dans une solution Hémalun de Mayer pendant 5 minutes. Après lavage dans de l’eau

désionisée, les coupes sont trempées quelques secondes dans une solution saturée en

carbonate de lithium, lavées à nouveau et trempées pendant quelques secondes dans une

solution de Morrel et Bassal diluée au tiers. Après lavage, les échantillons sont placés dans

une solution de rouge ponceau de xylidine pendant 5 minutes. Les coupes sont lavées puis

placées dans de l’acide phosphomolybdique à 1% pendant 5 minutes. Les échantillons sont

ensuite récupérés et directement placés dans une solution de bleu d’aniline ou de vert lumière,

qui colorent la matrice collagénique en bleu ou vert foncés respectivement. Une fois ces

colorations effectuées, l’analyse histologique des coupes peut être réalisée. Le noyau des

cellules est coloré en rose foncé ou violet, le cytoplasme, le muscle et les érythrocytes sont

colorés en rouge vif et les fibres de collagène apparaissent en bleu ou vert, selon le dernier

colorant utilisé.

• Analyse quantitative de l’os néoformé L’évaluation de la quantité d’os néoformé a été effectuée par histomorphométrie sur les

coupes histologiques. Il s’agit d’une méthode de quantification semi-automatique développée

sous le langage de programmation MATLAB® au laboratoire de biomécanique.

La réalisation de ce travail a été effectuée en plusieurs étapes (Figure V.5).

131

Figure V.5 : Méthodologie pour la quantification de l’os néoformé.

132

Cette analyse a été effectuée informatiquement à partir des photographies des coupes

histologiques prises au microscope. Après assemblage des photographies pour obtenir une

image globale de l’implant, des zones d’intérêt ont été déterminées manuellement. Ces zones

correspondent aux pores de la céramique dans lesquelles la présence d’os sera quantifiée. Un

nettoyage de l’image (manuel et semi-automatique) a ensuite été réalisé à l’intérieur de ces

zones d’intérêt. Un programme de quantification des pixels colorés est ensuite mis en place et

le résultat obtenu correspond au pourcentage d’os formé par rapport à l’aire globale de la

céramique.

• Constitution de l’image Nous avons cherché à obtenir des images de la céramique complète pour lesquelles les détails

pouvaient être visualisés. Pour cela, à l’aide d’une caméra montée sur un microscope (Nikon,

microscopie 80i ; logiciel elipse net), des photographies au grossissement x 40 ont été

réalisées successivement pour toutes les zones de l’implant (Figure V.6a).

L’image de la céramique complète a ensuite été reconstituée par assemblage en utilisant

l’extension Photomerge du logiciel Adobe Photoshop® 09. Cet outil permet de fusionner

plusieurs images possédant des parties communes. L’image finale est constituée d’environ

2400x1700 pixels et est enregistrée en format jpeg (Figure V.6b).

Figure V.6 : Constitution de l’image.

• Détermination des zones d’intérêt Différents contours ont été tracés manuellement sur chaque image à l’aide du logiciel The

Gimp® et d’une tablette graphique Cintiq 21UX (Wacom Co.Ltd.). Un premier contour de

couleur bleue délimite le bord de l’implant. Des contours rouges correspondant aux pores de

la céramique ont ensuite été tracés afin de délimiter les zones d’intérêt dans lesquelles l’os

sera quantifié (Figure V.7).

133

Figure V.7 : Détermination des zones d’intérêt.

• Nettoyage de l’image Le programme de quantification réalisé mesure le nombre de pixels colorés (c'est-à-dire, les

pixels qui ne sont pas blancs). Il est donc nécessaire d’effectuer un nettoyage du fond ou des

colorations non spécifiques pour obtenir un résultat fiable.

Dans un premier temps, un seuillage dans l’espace de couleur TSV (Teinte-Valeur-Saturation)

a été effectué. Tous les pixels ayant des valeurs de Teinte ou de Valeur inférieures à 0,3 sont

alors transformés en pixels blancs. Une fois ce seuillage réalisé, la majorité des pixels non

spécifiques sont éliminés sans modification des pixels présentant les couleurs d’intérêt.

Un nettoyage manuel a ensuite été réalisé pour éliminer les colorations non spécifiques

(fibrose, céramique…) qui possèdent des caractéristiques trop proches de la couleur d’intérêt

et qui sont donc toujours présentes après la mise en place des seuils. C’est cette image

nettoyée qui correspond au fond utilisé pour la quantification finale (Figure V.8).

Figure V.8 : Photographie de l’image nettoyée utilisée comme image de fond pour la quantification

134

• Quantification du pourcentage d’os néoformé Une fois ces différentes étapes effectuées, la quantification peut être réalisée de manière

automatique. Le programme informatique crée des masques binaires à partir des contours

précédemment définis et effectue des opérations booléennes pour transformer tous les pixels

qui ne sont pas contenus dans les zones d’intérêts en pixels blancs (Figure V.9).

La quantification de l’os néoformé se fait alors par dénombrement du nombre de pixels

colorés. Cette valeur est enfin rapportée au nombre de pixels contenus dans la zone bleue, qui

caractérise la surface de l’implant. Le résultat obtenu correspond au pourcentage d’os

néoformé par rapport à l’aire de la céramique pour chaque coupe histologique.

Les résultats sont ensuite transférés dans un fichier excel où ils peuvent être récupérés puis

traités.

Figure V. 9 : Application des masques et transformation de l’image pour la quantification.

3.4. Etude statistique

La comparaison de la quantité d'os néoformé a été réalisée par analyse de variances globale

(ANOVA). La comparaison a porté, pour un temps d'implantation donné, sur les différents

échantillons et sur les moutons. Lorsque les résultats étaient significatifs (p<0,05), un test de

comparaison des moyennes (test de Bonferoni) a été utilisé pour déterminer la hiérarchisation

des implants et éventuellement des moutons.

135

4. Résultats

4.1. Observations générales

Aucun problème majeur n’est survenu lors de l’anesthésie, du réveil ou du suivi

postopératoire. Les brebis se portaient bien dès leur réveil après l’opération et sur toute la

durée de l’implantation. Seuls deux sites d’infections ont été constatés lors de l’extraction des

échantillons : il s’agissait d’abcès superficiels sous-cutanés sans communication apparente

avec les implants (pas de contact entre le site de réaction inflammatoire et la céramique).

Les implants semblaient par ailleurs parfaitement intégrés dans les tissus musculaires.

4.2. Inflammation et fibrose

L’étude histologique confirme la bonne intégration des implants dans le muscle : quelle que

soit la durée d’implantation et le type d’échantillon, nous observons un contact direct entre la

céramique et le tissu musculaire, avec peu d’inflammation et de fibrose. La présence d’une

fibrose limitée ou de fibro-œdèmes inflammatoires est parfois constatée au niveau de certains

pores. Cependant, nous n’observons pas de réaction cellulaire importante et la présence de

zones de résorption ou de macrophages n’est pas détectée. Ceci témoigne d’une bonne

tolérance de l’organisme vis-à-vis des différents types de matériaux étudiés.

4.3. Comparaison de l’efficacité des échantillons – quantification de l’os néoformé (ostéoinduction)

4.3.1. Implants intramusculaires 1 mois

Pour la série d’expérimentation A, les échantillons ont été implantés pendant 1 ou 3 mois. Le

temps précoce de 1 mois a été choisi afin d’évaluer la cinétique de formation de l’os dans ce

site ectopique en fonction des échantillons.

4.3.1.1. Echantillons avec rhBMP-2 déposée

L’ajout de la BMP-2 déposée et séchée sur les échantillons s’accompagne d’une formation

d’os après leur implantation en site intramusculaire pendant 1 mois (Figure V.10).

A l’intérieur des pores des échantillons - témoins et revêtus – contenant la BMP-2 déposée,

nous constatons la présence d’os néoformé. Nous observons distinctement une coloration de

136

la matrice collagénique en bleu surmontée d’un liserai rose (vers l’intérieur des pores) qui

peut être attribué à la présence d’une barrière ostéoblastique. Ces observations sont

caractéristiques d’une formation d’os normale avec une matrice collagénique minéralisée

entourée de tissu ostéoïde.

En plus de la formation d’os au contact des pores du matériau, nous pouvons aussi constater

une formation d’os dans les tissus fibreux bordant l’implant sans contact direct avec la

céramique.

Figure V.10 : Photographies de l’os néoformé après 1 mois d’implantation intramusculaire des céramiques contenant la rhBMP-2 déposée. Photographie des échantillons témoins (a, c, d) et revêtus (b). Les coupes non-déminéralisées ont été colorées avec la méthode trichrome de masson et les photographies ont été prises au grossissements x 40 (a,b), x10 (c) et x100 (d).

137

4.3.1.2. Echantillons sans rhBMP-2

Après 1 mois d’implantation, nous ne détectons pas d’os néoformé en l’absence d’agent

ostéogénique (de BMP-2) sur les échantillons témoins dépourvus de BMP-2.

Figure V.11 : Photographies des pores des implants revêtus après 1 mois d’implantation intramusculaire. Les coupes non-déminéralisées ont été colorées avec la méthode trichrome de masson avec le vert lumière et les photographies ont été prises au grossissements x 40 (a), x200 (b). Pour les échantillons revêtus, une légère coloration bleutée ou verte (selon la méthode de

coloration) est observée au niveau de la surface des pores de la céramique (Figure V.11). Ces

zones apparaissent cependant pour la plupart craquelées et semblent correspondre à des

artefacts liés à une coloration non-spécifique de l’apatite nanocristalline du revêtement (qui

serait donc toujours présent après 1 mois d’implantation). Au niveau de certains pores,

toutefois, nous distinguons la présence de fins liserés bleu ou vert homogènes surmontés

d’une bande rose qui semble correspondre à un tissu fibro-ostéoblastique ce qui pourrait

indiquer une initiation de formation d’os à la surface de la céramique revêtue en certains

points.

4.3.1.3. Evaluation quantitative

L’évaluation quantitative de l’os néoformé sur ces coupes confirme les observations

effectuées (Figure V.12). La présence de BMP-2 déposée sur les échantillons conduit à une

augmentation significative du pourcentage d’os néoformé (p<0,05). Pour les échantillons

contenant la BMP-2, nous n’observons pas de différences significatives entre les céramiques

témoins et revêtues. L’aire occupée par l’os représente, respectivement, 2,1 ± 0,3 % et 1,5 ±

0,3 % de l’aire totale de la céramique.

138

Figure V.12 : Pourcentage d’os formé par rapport à l’aire de l’implant après 1 mois d’implantation intramusculaire des différents échantillons. Les résultats sont représentés par des boîtes à moustache.

4.3.2. Implants intramusculaires 3 mois

Deux séries d’implantations différentes ont été effectuées :

- une étude sur des parallélépipèdes avec les échantillons témoins, revêtus, témoins +

BMP-2 déposée et revêtus + BMP-2 déposée (implantation A).

- une implantation dans laquelle sont utilisés des échantillons cylindriques contenant la

BMP-2 adsorbée (implantation B).

La durée d’implantation de 3 mois a été choisie, en accord avec la littérature, afin de

comparer l’efficacité d’ostéoinduction de nos différents échantillons.

4.3.2.1. Echantillons avec rhBMP-2 déposée ou adsorbée

Quelle que soit la méthode d’association de la protéine, après 3 mois d’implantation, les

échantillons contenant la BMP-2 conduisent à une formation d’os importante (Figure V.13).

Contrairement aux observations précédentes sur les échantillons contenant la BMP-2 déposée

implantés pendant 1 mois, la formation d’os est observée exclusivement à l’intérieur des

pores, en contact direct avec la céramique pour tous les échantillons.

139

Figure V.13 : Photographies de l’os néoformé après 3 mois d’implantation intramusculaire des céramiques témoins et revêtues en présence ou absence de rhBMP-2. Les coupes non-déminéralisées ont été colorées avec la méthode trichrome de masson et les photographies ont été prises au grossissements x 40.

4.3.2.2. Echantillons sans rhBMP-2

Sur les échantillons témoins sans BMP-2, une très faible quantité d’os peut être observée au

niveau de quelques joints de grains (Figure V.13). Cette incapacité à former de l’os après

implantation dans un site intramusculaire est en corrélation avec les résultats classiquement

obtenus pour les céramiques de BCP commercialisées à l’heure actuelle, qui possèdent un bon

potentiel ostéoconducteur mais ne présentent pas de capacité d’ostéoinduction.

140

Par contre et de manière très intéressante, nous pouvons constater, pour cette durée

d’implantation, une très grande quantité d’os formée dans les pores des échantillons revêtus

seuls – ne contenant pas de BMP-2 (Figure V.13). Cette formation d’os apparaît normale :

nous distinguons sur les échantillons revêtus (comme sur les différents échantillons contenant

la BMP-2) l’os néoformé délimité par un front ostéoblastique. La structure est caractéristique

de l’os lamellaire et nous pouvons voir la présence d’ostéocytes à l’intérieur de la matrice

(Figure V.14).

Cette formation d’os ectopique au sein des implants revêtus, est révélatrice d’un fort potentiel

ostéoinducteur de la céramique revêtue avec le procédé NanoAp-EtOH.

Figure V.14 : Photographie de l’os néoformé à l’intérieur d’un pore des céramiques revêtues après implantation intramusculaire pendant 3 mois (Grossissement x200).

4.3.2.3. Evaluation quantitative

La quantification de l’os néoformé sur les coupes histologiques confirme que les différences

observées sont très fortement significatives (p<0,005) entre les témoins et les autres implants.

Par ailleurs, il n’y a pas de différence significative entre les échantillons revêtus seuls et les

échantillons contenant la BMP-2. Le revêtement seul est aussi ostéoinducteur que les

échantillons contenant la BMP-2 et nous n’observons pas d’effet synergique de l’association

du revêtement avec la BMP-2 (R = R+BMP-2) (Figure V.15a).

141

Figure V.15 : Pourcentage d’os formé par rapport à l’aire de l’implant après 3 mois d’implantation intramusculaire des différents échantillons. Les résultats sont représentés par des boîtes à moustache.

Après 3 mois d'implantation, l’analyse statistique indique des différences significatives du

pourcentage d’os néoformé entre les différents animaux de l’étude (p=0,04). Dans ces

conditions, il semble difficile de comparer statistiquement les résultats des deux séries

d’implantation.

Pour la série d’implantation B, le pourcentage d’os néoformé est significativement plus faible

pour les échantillons témoins contenant la BMP-2 adsorbée que pour les céramiques revêtues

traitées dans les mêmes conditions (p<0,05) (Figure V.15b). Dans ce cas-ci, nous ne

distinguons pas de différences significatives entre les animaux. La quantité d’os néoformé sur

les échantillons revêtus avec la BMP-2 adsorbée est du même ordre de grandeur que les

résultats obtenus pour les échantillons ostéoinducteurs de la série d’implantation A

(céramiques contenants la BMP-2 ou/et revêtues).

5. Discussion

Dans ce chapitre, nous avons évalué l’effet ostéoinducteur de notre revêtement associé ou non

avec la rhBMP-2. Les études histologiques montrent que le potentiel ostéoinducteur des

céramiques de BCP utilisées dans notre étude peut être significativement augmenté par

142

association de ces matériaux avec la rhBMP-2 et/ou par revêtement de leur surface par une

couche d’apatite nanocristalline carbonatée.

5.1. Effet ostéoinducteur de la rhBMP-2

Nous avons mis en évidence que l’association de rhBMP-2 - par adsorption ou simple

imprégnation et séchage - sur des céramiques phosphocalciques permettait d’induire une

formation d’os importante après implantation intramusculaire des échantillons chez le

mouton. Dans ce modèle animal, plusieurs études suggéraient un effet ostéogénique de la

BMP-2, puisque la formation d’os est supérieure en sa présence lors d’implantations en sites

orthotopiques ou dans des modèles de comblement de pseudarthrose (Kirker-Head et al. 1998,

Sachse et al. 2005) ; cependant, aucune étude n’avait montré, à notre connaissance, leur

potentiel ostéoinducteur dans une implantation ectopique. Dans la seule étude décrite dans ce

modèle, aucune croissance osseuse n’a pu être obervée après 3 mois d’implantation

intramusculaire d’échantillons de titane revêtus de PDLLA et contenant de la BMP-2

(Wildemann et al. 2004). Cette absence d’effet a été attribuée à une quantité de BMP

administrée et conservée au niveau du site d’implantation insuffisante. Comme nous l’avons

déjà indiqué, il est en effet clairement admis que le temps de rétention du facteur de

croissance est un paramètre clé dans l’efficacité des BMPs.

Dans notre étude, nous avons cherché à augmenter ce temps de rétention par adsorption de la

rhBMP-2 sur les céramiques revêtues. Nous avons pu observer des différences significatives

de la quantité d’os néoformé entre les implants « Témoins + BMP-2 adsorbée » et les

échantillons « Revêtus + BMP-2 adsorbée ». La formation osseuse est largement supérieure

sur les échantillons revêtus qui ont adsorbés une quantité plus grande de BMP-2 et

assureraient une rétention plus soutenue dans le temps que les échantillons témoins. D’après

les résultats obtenus, il semble que la quantité d’os néoformé soit principalement dépendante

de la quantité de BMP-2 adsorbée sur les échantillons. En effet, dans l’expérimentation A qui

concerne l’implantation des échantillons sur lesquels la BMP-2 a été associée par simple

imprégnation et séchage, la quantité de protéine déposée est identique pour les céramiques

témoins et revêtues ; le pourcentage d’os néoformé apparaît, quand à lui, équivalent.

Dans notre étude, cette méthode d’association de la rhBMP-2 avec les céramiques permet une

formation osseuse importante et soutenue dans le temps. Certaines études montrent que le

degré de solubilité joue un rôle important dans la cinétique de libération de la protéine dans le

cas où l’association avec le matériau est effectuée par simple imprégnation et séchage. Dans

143

notre cas, l’imprégnation des céramiques a été réalisée avec la rhBMP-2 non-glycosylée qui

présente un degré de solubilité plus faible que celui de la rhBMP-2 glycosylée et un temps de

rétention plus long au niveau du site chirurgical. Dans nos études effectuées in vitro, les

quantités de BMP-2 libérées apparaissaient significativement différentes en fonction du type

d’échantillon et de la méthode d’association mais les différences observées restaient

cependant faibles et les profils de libérations globalement équivalents : nous n’avons pas

constaté de libération très rapide de la protéine quels que soient les échantillons étudiés. Ceci

pourrait expliquer que la formation d’os en réponse à la BMP-2 déposée sur les échantillons

soit aussi importante et que nous n’observions pas de différences majeures entre la méthode

d’adsorption et d’imprégnation sur les céramiques revêtues (même si les deux séries

d’implantations ne peuvent être directement comparées en raison de la variabilité inter-

animal).

Cette méthode simple d’association par imprégnation peut toutefois comporter quelques

inconvénients : après 1 mois d’implantation, la formation d’os n’est pas distinguée

uniquement au contact des céramiques contenant la BMP-2 déposée mais aussi dans le tissu

fibreux environnant. Ceci suggère que la BMP-2 est libérée de la céramique et qu’elle pourrait

diffuser dans les tissus. Dans notre cas, cet effet adverse est transitoire et localisé mais

démontre, un nouvelle fois, qu’il est important de contrôler la libération du facteur de

croissance associé pour optimiser le facteur efficacité/dose et limiter ainsi les risques

systémiques potentiellement liés à l’utilisation de protéines exogènes.

5.2. Effet ostéoinducteur du revêtement

Le résultat majeur de ce projet concerne la mise en évidence de l’effet ostéoinducteur

intrinsèque de notre revêtement d’apatite nanocristalline. Plusieurs études ont déjà montré que

des matériaux – phosphocalciques en particulier - étaient capables d’induire une formation

d’os dans un site ectopique mais les quantités d’os formé apparaissent plutôt faibles d’après

les images d’histologies présentées dans ces travaux. Dans notre cas, la croissance osseuse

apparaît normale et particulièrement importante : l’étude histomorphométrique nous indique

qu’après 3 mois d’implantation, le pourcentage d’os néoformé est aussi important pour les

échantillons révêtus (sans facteur de croissance) que pour les céramiques contenant la BMP-2.

La formation osseuse en réponse au revêtement semble débuter après 1 mois d’implantation

comme le montrent les images histologiques. L’initiation du phénomène apparaît donc

144

retardée par rapport à la formation d’os induite par la présence de la BMP-2 mais ces résultats

sont en accord avec ceux de la littérature (Yuan et al. 2006a).

Les raisons du fort potentiel ostéoinducteur de notre revêtement ne peuvent pas être

déterminées avec précision. Plusieurs paramètres sont susceptibles d’être impliqués dans

l’initiation de ce phénomène et différentes hypothèses sont proposées.

D’après Ripamonti, l’ostéoinduction par les matériaux serait reliée à leur capacité d’adsorber

des protéines ostéogéniques comme les BMPs à partir des fluides biologiques. Les protéines

endogènes pourraient s’accumuler dans les pores des céramiques et atteindre ainsi une

concentration suffisante pour induire la migration et la différenciation de cellules

progénitrices de l’os (Ripamonti 1996). Cette hypothèse pourrait être corroborée par la forte

influence de la microporosité sur le potentiel ostéoinducteur des matériaux. La présence de

cette microporosité est associée à une augmentation de la surface spécifique et des capacités

d’adsorption de l’implant vis-à-vis des protéines circulantes (Rouahi et al. 2006a, Zhu et al.

2008). Les capacités d’adsorption protéiques accrues observées sur nos matériaux revêtus de

surface spécifique importante pourraient expliquer la formation osseuse en ce site ectopique.

Il a, par ailleurs, été mentionné que la microporosité et la forte surface spécifique des

échantillons, qui lui est associée, permettraient de favoriser la formation d’apatite

nanocristalline carbonatée, souvent représentative de la bioactivité des matériaux. Selon

Habibovic et al., la formation de cette couche apatitique pourrait aussi s’accompagner d’une

co-précipitation de facteurs de croissance circulants, et ces facteurs seraient alors à l’origine

des phénomènes d’ostéoinduction observés (Habibovic et al. 2005). Dans notre étude, la

composition, la taille et la réactivité des cristallites de notre revêtement sont très proches des

caractéristiques du minéral osseux et des apatites formées sur les matériaux bioactifs.

Remarquons, en outre, que ces nanocristaux offrent une source de germes cristallins beaucoup

plus importante que les surfaces frittées et qu’ils pourraient présenter des capacités de

nucléation supérieures. Ceci pourrait expliquer la formation osseuse importante observée sur

ces échantillons après leur implantation intramusculaire chez le mouton, selon certains

auteurs. Remarquons toutefois que les capacités de nucléation ne sont pas le propre des

matériaux ostéoinductueurs et que la plupart des matériaux ostéoconducteurs ont aussi cette

propriété. La quantité de cristaux néoformés ferait-elle la différence? Rien ne permet de

l'assurer.

D’autre part, l’influence d’une libération éventuelle d’ions calcium et phosphate par les

céramiques, lors de la formation de cette phase, a été évoquée par certains auteurs. On

145

pourrait penser qu'un fort échange ionique des échantillons de BCP pourrait permettre la

formation de micro-environnements riches en ions calcium et phosphate dans les pores des

matériaux, comme cela a été écrit. Ces micro-environnements seraient alors susceptibles de

favoriser la prolifération et la différenciation ostéoblastique de cellules souches progénitrices

puis leur minéralisation (Chang et al. 2000, Midy et al. 2001, Muller et al. 2008). Dans notre

étude, la libération d’ions calcium et phosphate dans de milieu à partir des céramiques de

BCP ne paraît pas envisageable compte tenu de la sursaturation des fluides biologiques par

rapport à ces matériaux et de leur faible surface spécifique. Cette hypothèse ne peut, toutefois,

pas être exclue pour nos échantillons revêtus et pourrait expliquer les résultats obtenus. Le

comportement de ces céramiques après immersion dans du SBF ou sérum doit maintenant être

évalué pour répondre à cette question.

Une autre hypothèse est parfois évoquée pour expliquer les mécanismes d’ostéoinduction par

les matériaux. Elle concerne l’implication de la réaction inflammatoire sur l’initiation du

phénomène et s’appuie sur les observations effectuées lors de la réparation de fractures : au

cours des premiers jours, il y a recrutement de macrophage qui éliminent les débris par

phagocytose et expriment des facteurs inflammatoires susceptibles d’induire la migration et la

différenciation ostéoblastique de cellules progénitrices. Lors de l’implantation de matériaux in

vivo, un tel phénomène peut aussi se produire suite à l’intervention chirurgicale et pourrait

expliquer l’ostéoinduction par les matériaux d’après Le Nihouannen et al. (Le Nihouannen et

al. 2005). Les monocytes sont en effet capables de phagocyter de petites particules d’apatite et

d’exprimer de manière importante des cytokines pro-inflammatoires (Grandjean-Laquerriere

et al. 2005). Par ailleurs, quelques études ont montré que des matériaux présentant une forte

rugosité de surface induisaient la production de prostaglandine E2 (PGE2) par des

macrophages cultivés à leur contact, et que la PGE2 avait un effet chimioattractant sur les

cellules souches mésenchymateuses et induisait leur différenciation ostéoblastique (De Bruijn

et al. 2008). Dans notre étude, une augmentation de la production de cytokines par ces

cellules immunitaires en présence du revêtement nanoporeux peut tout à fait être envisagée.

A ce stade de notre étude, ces différentes hypothèses peuvent être envisagées et nous n’avons

pas assez d’éléments pour proposer un mécanisme d’action plutôt qu’un autre.

146

6. Conclusions et perspectives

Dans cette étude, nous avons cherché à évaluer le potentiel ostéoinducteur des différents

échantillons préparés et caractérisés au cours de notre travail. Nous avons pu constater une

très forte ostéoinduction en réponse à la rhBMP-2 chez le mouton. Nous avons montré que

l’adsorption de la protéine sur les échantillons revêtus conduisait à une quantité d’os

néoformé plus importante que pour les échantillons témoins avec la BMP-2 adsorbée. Ces

observations apparaissent directement reliées à la capacité d’adsorption du revêtement et de la

forte quantité de BMP-2 alors implantée. Nous n’avons cependant pas pu mettre en évidence

un avantage potentiel de la méthode d’adsorption par rapport à la technique d’imprégnation et

séchage de la protéine sur nos échantillons revêtus, qui conduit elle aussi à une formation d’os

importante avec la BMP-2 non-glycosylée. L’utilisation de rhBMP-2 glycosylée pourrait

donner lieu à des différences plus marquées (différence accentuée du profil de libération et

par suite de la réponse in vivo) entre les différents échantillons et méthodes d’association. Il

pourrait donc être intéressant de réaliser ces mêmes expériences avec la BMP-2 glycosylée,

mais le coût engendré par de telles expériences serait exorbitant si l’achat de la BMP-2 devait

être autofinancé.

Notre étude a surtout permis de mettre en évidence un potentiel ostéoinducteur très important

de notre revêtement d’apatite carbonatée nanocristalline, similaire au minéral osseux. Il a déjà

été montré que des céramiques phosphocalciques pouvaient posséder un potentiel

ostéoinducteur. Toutefois, ce phénomène nécessite la présence de micropores qui augmente la

surface spécifique des échantillons mais diminue aussi de manière drastique leurs propriétés

mécaniques. Notre méthode de revêtement d’apatite très réactive permet, en revanche,

d’augmenter de manière importante la surface spécifique des échantillons et leur confère un

fort potentiel ostéoinducteur sans pour autant modifier les caractéristiques initiales de la

céramique. Ces résultats sont donc très intéressants et novateurs. Ils se distinguent aussi par la

grande quantité d’os formé à l’intérieur des céramiques revêtues. Cette quantité apparaît

équivalente en présence du revêtement seul qu’en présence de BMP-2, protéine de référence

pour induire l’ostéoinduction.

Plusieurs études ont relié le potentiel ostéoinducteur de matériaux à leur capacité de

reconstruction une fois implantés en site orthotopique (Yuan et al. 2006a, Habibovic et al.

2008). Des études pour évaluer maintenant le potentiel ostéoconducteur de nos échantillons

revêtus sont en cours. Les échantillons ont été implantés dans les condyles fémoraux de

147

moutons pendant 3 mois et la quantification d’os formé doit maintenant être réalisée. Au

cours de l’opération, différents fluorochromes ont par ailleurs été injectés aux animaux pour

évaluer la cinétique de croissance osseuse. Enfin, les échantillons inclus dans la résine ont été

scannés dans un µCT (microcomputed tomography) avant la préparation des coupes pour

l’analyse histologique. La reconstruction des images obtenues devrait permettre d’évaluer la

quantité réelle d’os minéralisé sur la totalité de l’implant par analyse des niveaux de gris.

Il est enfin envisagé d’étudier la composition minérale de l’os néoformé par microscopie

infrarouge sur des coupes très fines. La préparation de ces coupes nécessite toutefois des

mises au point.

Une fois ces expériences finies, le comblement d’une grande perte de substance

mécaniquement chargé par nos matériaux revêtus pourrait être effectué. C’est en effet dans ce

genre d’application que l’ostéoinduction par notre revêtement est susceptible d’avoir le plus

grand intérêt.

Enfin, ces résultats ouvrent la voie pour la mise en place d’études théoriques plus

approfondies de manière à déterminer plus précisément les mécanismes mis en jeu dans ce

phénomène d’ostéoinduction apporté par le revêtement d’apatite nanocristalline. Quelques

propositions d’expérience sont présentées dans le chapitre « Conclusion et perspectives

générales » du manuscrit.

Conclusions et perspectives générales

148

L’objectif principal de ce travail était de développer un matériau phosphocalcique

biorésorbable de forte réactivité de surface lui conférant des propriétés ostéoinductrices.

Pour cela, nous avons choisi d’utiliser des céramiques de phosphate de calcium biphasique

déjà commercialisées, ayant prouvé leur efficacité en tant que substituts osseux, et

d’améliorer leur réactivité de surface, initialement faible. L’activation de la surface de ces

matériaux a été réalisée par l’addition d’un revêtement d’apatite carbonatée nanocristalline.

Un procédé permettant le revêtement de céramiques phosphocalciques poreuses par de

l’apatite carbonatée nanocristalline a donc été développé et une caractérisation des matériaux

a été réalisée. Nous avons montré que les cristaux qui constituent ces revêtements présentaient

des caractéristiques proches de celles du minéral osseux et améliorait les propriétés de surface

des céramiques de BCP. Nous avons observé la présence à la surface des cristaux d’une

couche hydratée, une augmentation significative de la surface spécifique des échantillons et la

présence d’une porosité additionnelle nanométrique en présence du revêtement. Ces différents

facteurs sont susceptibles d’intervenir dans les fortes capacités d’échange ionique et

d’adsorption protéique des matériaux revêtus mises en évidence dans cette étude. La présence

du revêtement d’apatite nanocristalline sur les céramiques de BCP permet d’augmenter

significativement la vitesse d’adsorption et la quantité de rhBMP-2 adsorbée s’accompagnant

d’une libération du facteur de croissance plus progressive dans le milieu de culture.

Après avoir établi la forte réactivité de surface des échantillons revêtus, nous avons voulu

étudier les réponses cellulaires in vitro et in vivo vis-à-vis de ces matériaux.

Nous avons montré in vitro que les deux types d’échantillons, témoins et revêtus, étaient

parfaitement biocompatibles. Ils permettent l’adhésion et la prolifération de différents types

cellulaires (C2C12, cellules souches mésenchymateuses et ostéoblastes) ainsi que leur

différenciation ostéoblastique en réponse à des agents différenciants. La bonne

biocompatibilité des matériaux étudiés a ensuite été confirmée in vivo.

Nous avons, d’autre part, montré que l’adsorption de BMP-2 sur les échantillons témoins et

revêtus induisait une forte différenciation ostéoblastique aussi bien in vitro sur les C2C12

qu’in vivo après implantation intramusculaire chez le mouton. Nous avons constaté que la

forte adsorption de la protéine sur les échantillons revêtus permettait la formation d’une

quantité d’os plus importante que celle obtenue par l’adsorption de la BMP-2 sur les

échantillons témoins dans ce site ectopique. Ces observations apparaissent directement reliées

à la capacité d’adsorption du revêtement et à la forte quantité de BMP-2 alors implantée.

Nous n’avons pas, cependant, pu mettre en évidence un avantage potentiel de la méthode

149

d’adsorption pour cette protéine par rapport à la technique d’imprégnation dans laquelle la

solution de facteur de croissance est simplement déposée à la surface des échantillons.

Enfin cette étude a surtout permis de mettre en évidence un potentiel ostéoinducteur très

important de notre revêtement d’apatite carbonatée nanocristalline, similaire au minéral

osseux. La quantité d’os néoformé à l’intérieur des pores des céramiques revêtues apparaît

particulièrement importante. Le pourcentage d’os formé après 3 mois d’implantation

intramusculaire est, en effet, équivalent sur ces échantillons que sur les implants contenant de

la BMP-2, facteur de croissance de référence pour l’ostéoinduction. Ces résultats, très

intéressants et novateurs, ouvrent la voie à de nouvelles études.

1. Evaluation de la capacité de reconstruction osseuse en site orthotopique

Dans un premiers temps, une évaluation des propriétés des céramiques revêtues développées

dans ce travail devrait être réalisée en site orthotopique dans des conditions qui correspondent

à celles des applications cliniques potentielles. Les substituts osseux sont généralement

utilisés en milieu osseux pour combler de petites ou de grandes pertes de substance osseuses.

Plusieurs études indiquent qu’il existe une corrélation entre le potentiel ostéoinducteur des

matériaux et leur capacité de reconstruction des petites pertes de substance en milieu osseux

(Yuan et al. 2006a, Habibovic et al. 2008). Nous avons donc voulu vérifier cette hypothèse

dans ce travail. Les échantillons ont été implantés dans les condyles fémoraux de moutons

pendant 3 mois, durée classique pour l’étude des propriétés ostéoconductrices des céramiques

phosphocalciques, et l’analyse des résultats est en cours (Habibovic et al. 2008).

Figure VI.1 : Photographies de l’os néoformé au contact des échantillons témoins (a) et revêtus (b) après 3 mois d’implantation dans les condyles fémoraux de moutons. Les photographies ont été effectuées au grossissement x10 sur des coupes non-déminéralisées colorées avec la méthode trichrome de Masson.

150

L’analyse histologique et l’étude des coupes obtenues par µCT confirment la parfaite

biocompatibilité et le potentiel ostéoconducteur des différents échantillons. Les matériaux

apparaissent bien intégrés dans l’os et la présence d’os néoformé minéralisé est observée en

contact direct avec les pores des différents échantillons étudiés (Figure VI.1). Par contre, en

raison du bon potentiel ostéoconducteur des céramiques de BCP seules (échantillons

témoins), nous n’avons pas pu, par ces seules observations macroscopiques, déterminer si la

capacité de reconstruction des matériaux revêtus était supérieure ou non à celle des

échantillons témoins dans ce contexte. Une analyse quantitative de l’os néoformé, similaire à

celle réalisée pour évaluer le potentiel ostéoinducteur des échantillons, doit maintenant être

effectuée pour déterminer avec précision les propriétés ostéoconductrices des matériaux

revêtus.

D’autre part, en application clinique le principal avantage des matériaux ostéoinducteurs

réside dans leur capacité à reconstruire de larges pertes de substances osseuses. Il apparaît

donc important d’évaluer les capacités de reconstruction de notre matériau revêtu dans un

modèle de pseudarthrose, en situation de mise en charge. Dans de tels modèles, une grande

perte de substance dans le tibia ou le métatarse est créée et celle-ci ne peut être reconstruite en

totalité sans la présence de matériaux capables d’induire la différenciation ostéoblastique de

cellules progénitrices. Le modèle ovin est parfaitement adapté à ce genre d’expérience.

L’étude du potentiel de reconstruction de nos céramiques revêtues dans une telle situation a

été envisagée. Dans cette expérience, un défaut osseux de 2 cm de long pourrait être réalisé au

niveau du métatarse du mouton et être comblé par des petits granulés de céramiques de BCP

témoins ou revêtues. Afin de contrôler la zone à reconstruire et favoriser la reconstruction

osseuse, nous avons prévu de contenir les granulés entre deux membranes en poly-lactide

(PLA, PDLLA…) poreuses biorésorbables qui permettent la migration cellulaire (Figure

VI.2) (Meinig 2002).

Les capacités de reconstruction de nos matériaux dans ce contexte devraient alors être

déterminées par l’évaluation de la quantité d’os néoformé (analyse quantitative par

histomorphométrie ou µCT) mais aussi par l’étude de la résistance des échantillons explantés

aux contraintes mécaniques. Des éprouvettes pourraient être réalisées par découpe des

explants d’os néoformé et analysées pour leur résistance mécanique. La perméabilité de ces

échantillons avant et après implantation pourrait enfin être étudiée et rapportée aux réponses

obtenues.

151

Figure VI.2 : Schéma du modèle de reconstruction de pseudarthrose envisagé.

2. Transfert industriel

Il a déjà été montré que certaines céramiques phosphocalciques pouvaient posséder un

potentiel ostéoinducteur. Toutefois, ce phénomène nécessite la présence de micropores

augmentant la surface spécifique des échantillons mais diminuant aussi de manière drastique

leurs propriétés mécaniques, ce qui constitue un frein à l’utilisation clinique. Notre méthode

de revêtement d’apatite très réactive, par contre, présente l’avantage d’augmenter de manière

importante la surface spécifique des échantillons qui acquièrent alors un fort potentiel

ostéoinducteur sans pour autant modifier leurs caractéristiques initiales. D’autre part, le

procédé de revêtement est simple et peu coûteux. Il est donc parfaitement transposable à

l’échelle industrielle. Un brevet concernant la méthode de revêtement vient d’être déposé et

un transfert industriel de ce procédé a été entrepris par la société Teknimed. Une optimisation

du procédé a été réalisée dans le cadre du transfert industriel. Les caractéristiques générales

du revêtement obtenu par le procédé industriel apparaissent comparables à celles présentées

dans ce travail et une commercialisation de ces céramiques revêtues est prévue à court ou

moyen terme.

3. Etude des mécanismes d’ostéoinduction

En parallèle de ces perspectives appliquées, les résultats obtenus incitent à participer à la

recherche des mécanismes d’ostéoinduction par les matériaux. Et en raison de l’ampleur de la

réponse observée sur les échantillons revêtus, ceux-ci pourraient servir de modèle pour ces

études.

152

3.1. Etudes chez l’animal

Une cinétique des évènements liés au phénomène d’ostéoinduction sur les matériaux revêtus

constituerait la première étude à réaliser. Il serait particulièrement intéressant d’étudier les

phénomènes précoces qui permettent d’initier la formation osseuse. Des implantations

intramusculaires des échantillons avec des durées d’implantation rapprochées (1 à 2 jours, 1

semaine, 2 semaines et ainsi jusqu’à 6 semaines ou plus) pourraient être effectuées dans ce

but. Les échantillons prélevés à ces différents temps pourraient d’abord être étudiés par

histologie ou histomorphométrie sur des coupes non-déminéralisées préparées à l’aide de

techniques plus précises (découpe avec une scie diamantée ou préparation de coupes épaisses

puis polissage). Ceci devrait permettre de visualiser les cellules à fort grossissement, et ainsi

de déterminer avec une plus grande précision les phénomènes cellulaires intervenant dans le

processus de l’ostéoinduction. D’autre part, des analyses par immunohistochimie ou

hybridation in situ pourraient aussi être réalisées. L’inclusion classique en méthyl-

méthacrylate effectuées dans ce travail n’étant pas adaptée pour ces études, les analyses

devraient être effectuées sur des coupes non-déminéralisées préparées avec des techniques

d’inclusion particulières qui permettent ces études (Bareille et al. 2000, Knabe et al. 2008). Ce

travail pourrait apporter des informations complémentaires sur les évènements mis en jeu lors

du phénomène d’ostéoinduction en permettant notamment la détection de marqueurs de

l’ostéogenèse produits par les cellules au contact du matériau (ALP, collagène de type I,

ostéocalcine, ostéopontine, bone sialoprotéine, BMPs…). L’expression de différents facteurs

de transcription exprimés au cours de la différenciation ostéoblastique (runx-2, osterix, msx-2,

dlx-3,dlx-5) pourrait aussi être évaluée et les réponses obtenues pourraient apporter des

informations sur les voies de signalisation activées lors de l’ostéoinduction.

Afin de faciliter les études chez l’animal (disponibilité des anti-corps et des sondes…) et

diminuer leur coût, le passage vers un modèle murin peut être envisagé. Toutefois, en raison

de la faible réactivité de ces animaux vis-à-vis des matériaux, des études préliminaires

devraient être réalisées afin de déterminer si nos matériaux revêtus sont capables d’induire la

formation d’os en site ectopique dans le modèle choisi. En outre, les résultats concernant la

cicatrisation des fractures et l’ostéointégration des matériaux de comblement étant différents

entre les rongeurs et les modèles de grands animaux, il n’est pas évident que les mécanismes

d’action des phénomènes d’ostéoinduction soient totalement transposables. Il conviendrait

donc de conforter les résultats préliminaires obtenus chez les souris par des études chez des

grands animaux.

153

De plus en plus d’auteurs estiment que la réaction inflammatoire associée à l’implantation des

matériaux pourrait servir de déclencheur au phénomène d’ostéoinduction (De Bruijn et al.

2008). Nous pourrions donc étudier l’influence de cette réaction sur le potentiel

ostéoinducteur de nos échantillons revêtus. Des expériences comparatives de la quantité d’os

néoformé après implantation intramusculaire des échantillons en présence ou absence de

molécules anti-inflammatoires pourraient être effectuées dans ce but. Des anti-inflammatoires

pourraient être administré de manière générale (injection chez l’animal ou prise orale) ou

locale par dépôt sur les céramiques comme nous l’avons fait pour la BMP-2. Cette deuxième

méthode présenterait l’avantage d’étudier chez un même animal l’influence d’anti-

inflammatoires sur la réponse obtenue. Cette étude in vivo permettrait d’évaluer l’effet des

anti-inflammatoires sur la réponse inflammatoire et ses conséquences sur l’ostéoinduction. Il

faudrait également la corréler au potentiel propre des molécules sur la différenciation

ostéoblastique. En effet, plusieurs études in vitro sur des ostéoblastes ont montré que certains

anti-inflammatoires non-stéroïdiens (indomethacine, parecoxib,…) induisaient directement

une inhibition de la différenciation ostéoblastique et dans ce cas, l’interprétation des résultats

obtenus pourrait être compromise (Kellinsalmi et al. 2007).

La comparaison de l’ostéoinduction chez des souris sauvages et des souris dépourvues de

système immunitaire ou de macrophages pourrait, d’autre part, donner lieu à des résultats

intéressants. Quelques études ont en effet montré que des macrophages cultivés sur des

matériaux rugueux produisait la prostaglandine E2, molécule capable d’induire la migration et

la différenciation ostéoblastique de cellules souches mésenchymateuses humaines (De Bruijn

et al. 2008). L’implication de la production de cette protéine dans les phénomènes

d’ostéoinduction pourrait être évaluée, par immunohistochimie au cours des différentes étapes

de la formation osseuse ectopique.

3.2. Etudes in vitro

En parallèle de ces différentes expérimentations animales proposées, des études en culture

cellulaire plus poussées permettraient aussi de recueillir des données sur la capacité de nos

matériaux à induire la différenciation ostéoblastique et sur les mécanismes mis en jeu.

Comme nous l’avons déjà mentionné, la première partie de ce travail consisterait, par le suivi

des marqueurs par RT-PCR, à évaluer la différenciation ostéoblastique de cellules souches

mésenchymateuses humaines et murines cultivées sur les matériaux témoins et revêtus. Nous

154

pourrons ensuite entreprendre une étude plus précise des voies de signalisation ou au moins

de différents facteurs de transcription nécessaires à cette différenciation (runx2, msx-2,

osterix, dlx-3 et -5). Il serait, par exemple, intéressant d’évaluer l’effet de runx2 sur la

différenciation ostéoblastique liée aux matériaux. En effet, dans la majorité des études, ce

facteur de transcription, ne semble pas être surexprimé en réponse aux matériaux alors que ce

facteur est primordial pour la différenciation ostéoblastique induite par les BMPs.

Lin et al. ont montré d’autre part que la différenciation ostéoblastique de C3H10T1/2 induite

par les matériaux serait liée à la production et la sécrétion de facteurs différenciants par les

cellules au contact de l’échantillon. Dans cette étude, ils n’ont cependant pas déterminé les

facteurs susceptibles d’être responsables de cet effet paracrine (Lin et al. 2008). Ces résultats

mériteraient d’être confirmés et approfondis. La sécrétion de protéines, telles que les BMPs,

la PGE2, le TGFβ,…, favorisant la différenciation ostéoblastique dans le milieu de culture

pourrait être détectée par test ELISA et des antagonistes de leurs récepteurs pourraient être

utilisés. Dans un même registre, l’étude de l’interaction de macrophages avec les matériaux et

de la sécrétion de ces protéines dans le milieu complèterait ce travail.

Enfin, le procédé de revêtement utilisé dans ce travail présente l’avantage de permettre la

réalisation de dépôts ayant des caractéristiques variées. Pour compléter ces études biologiques

à caractère fondamental, il serait intéressant également de travailler sur la nature du

revêtement pour déterminer le rôle de ses caractéristiques physico-chimiques sur l'activité

biologique. Bien des hypothèses ont été émises concernant cette relation mais il est

particulièrement difficile d’observer de manière distincte l’influence des différents paramètres

sur le comportement cellulaire. Concernant l’influence des modifications du milieu par les

matériaux, une étude du comportement cellulaire en présence de milieu préalablement incubé

avec les nanocristaux pourrait être effectuée. Les réponses obtenues devraient alors être

comparées aux caractéristiques physico-chimiques du milieu après immersion des

échantillons (pH, concentrations ionique et protéique).

Dans une approche plus orientée "science des matériaux", nous pourrions aussi étudier le rôle

des caractéristiques physiques et/ou chimiques du dépôt, comme par exemple, la taille des

nanocristaux, leur état d'agglomération, le développement de la couche hydratée, sa

composition chimique, mais également l'évolution de ces caractéristiques in vivo puisqu’un

des aspects essentiels de ces systèmes est leur évolutivité. Cette tâche nécessiterait la mise en

155

œuvre de méthodes physico-chimiques particulières adaptées à l'étude de ces couches très

fines.

Il est indéniable que l'ensemble de ces projets nécessite la collaboration d'équipes

interdisciplinaires de compétences diverses mais aussi et surtout, au delà de visions

parcellaires du problème, une vision d'ensemble, seule apte à reconstituer un scénario complet

et crédible de ces phénomènes.

156

Liste des publications et communications issues de ce projet

Publication Autefage H, Briand-Mesange F, Cazalbou S, Drouet C, Fourmy D, Gonçalvès S, Salles JP, Combes C, Swider P, Rey C Adsorption and Release of BMP-2 on Nanocrystalline Apatite-Coated and Uncoated Hydroxyapatite/β-Tricalcium Phosphate Porous Ceramics Journal of Biomedical Materials Research : Part B - Applied Biomaterials, 2009 July 6. Brevet Autefage H, Cazalbou S, Combes C, Rey C Activation de surface de biomatériaux poreux par dépôt d'apatites nanocristallines. Brevet français déposé et extensions en cours. Proceedings Autefage H, Briand-Mésange F, Gomez Brouchet A, Palierne S, Briot J, Gonçalvès S, Cazalbou S, Combes C, Mathon D, Autefage A, Rey C, Swider P Nanocrystalline Apatite-Coated Biphasic Calcium Phosphate Ceramics for the Delivery of rhBMP. Adsorption and Release, in vitro and in vivo Behaviour. Ceramics, Cells and Tissues, 12th Seminar and meeting proceedings book “surface-reactive biomaterials as scaffolds and coatings : interactions with cells and tissues”, 2009, Faenza, Italie. Errassifi F, Menbaoui A, Autefage H, Santran V, Sarda S, Lebugle A, Combes C, Barroug A, Sfihi H, Rey C Adsorption on apatitic calcium phosphates: applications to drug delivery. 8th pacific rim conference on ceramic and glass technology proceedings book, 2009, Vancouver, Canada. Autefage H, Briand-Mésange F, Combes C, Cazalbou S, Drouet C, Gonçalvès S, Salles JP, Swider P, Rey C Nanocrystalline Apatite-Coated Biphasic Calcium Phosphate Ceramics for the Adsorption and Release of rhBMP-2 Growth Factor Third International Workshop on Advanced Ceramics (IWAC03) proceedings book, 2008, Limoges, France. Pelletier I, Autefage H, Drouet C, Cazalbou S, Combes C, Rey C Activation de surface de biomatériaux poreux tridimensionnels à partir de phosphates de calcium biomimétiques Matériaux, livre de proceedings, 2006, Dijon, France.

157

Communications orales Autefage H, Briand-Mésange F, Gomez Brouchet A, Palierne S, Briot J, Gonçalvès S, Cazalbou S, Combes C, Mathon D, Autefage A, Rey C, Swider P Nanocrystalline Apatite-Coated Biphasic Calcium Phosphate Ceramics for the Delivery of rhBMP. Adsorption and Release, in vitro and in vivo Behaviour. Ceramics, Cells and Tissues, 12th Seminar and meeting, 19-22 Mai 2009, Faenza, Italie Présentation orale récompensée par le premier prix pour les jeunes chercheurs (7th CCT Prize) Autefage H, Briand-Mésange F, Combes C, Cazalbou S, Drouet C, Gonçalvès S, Salles JP, Swider P, Rey C Nanocrystalline Apatite-Coated Biphasic Calcium Phosphate Ceramics for the Adsorption and Release of rhBMP-2 Growth Factor Third International Workshop on Advanced Ceramics (IWAC03), 6-8 Novembre 2008, Limoges, France. Posters: Bonnevialle N, Autefage H, Briot J, Rey C, Swider P Hydraulic permeability of coated macro-porous biphasic phosphate scaffold Orthopaedic Research Society - 55th Annual Meeting, 22-25 Février 2009, Las Vegas, USA. Autefage H, Briand-Mesange F, Combes C, Cazalbou S, Drouet C, Fourmy D, Gonçalvès S, Salles JP, Swider P, Rey C Improvement of rhBMP-2 Adsorption on Calcium Phosphate Ceramics Coated with Nanocrystalline Apatite 8th World Biomaterials Congress 2008, 28 Mai - 1 Juin 2008, Amsterdam, Pays-Bas. Pelletier I, Autefage H, Drouet C, Cazalbou S, Combes C, Rey C Activation de surface de biomatériaux poreux tridimensionnels à partir de phosphates de calcium biomimétiques Matériaux 2006, 13-17 Novembre 2006, Dijon, France.

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