L'UNIVERSITE TOULOUSE III - PAUL SABATIER

UFR : Physique Chime Automatique

THESE

en vue de l'obtention du

DOCTORAT DE L'UNIVERSITE DE TOULOUSE

délivré par l'université Toulouse III - Paul Sabatier

Ecole Doctorale de Chimie

Spécialité

CHIMIE BIOLOGIE SANTE

par

Tamara DELAINE

CONCEPTION, SYNTHESE, ETUDE DE L'EQUILIBRE TAUTOMERIQUE ET

EVALUATION BIOLOGIQUE DE NOUVEAUX ANALOGUES DE L'ADDUIT

ISONIAZIDE-NAD(H) COMME INHIBITEURS D'InhA

DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Présentée et soutenue le 18 octobre 2007

Jury :

Alain BAULARD, Chargé de Recherche, INSERM, Lille Rapporteur

Jean BERNADOU, Professeur, Université Paul Sabatier, Toulouse

Vania BERNARDES-GENISSON, Maître de conférence, Directeur de thèse

Université Paul Sabatier, Toulouse

Armand LATTES, Professeur Emérite, Université Paul Sabatier,

Toulouse Président

Christian MARAZANO, Directeur de Recherche, CNRS, Gif-sur-Yvette Rapporteur

Bernard MEUNIER, Président de la société PALUMED, Labège

Annaïk QUÉMARD, Chargée de Recherche au CNRS, Toulouse

Stéphane QUIDEAU, Professeur, Université de Bordeaux I Examinateur

Recherches effectuées au Laboratoire de Chimie de Coordination du CNRS 205, route de Narbonne, 31077 Toulouse cedex 4

A ma famille

A Romain

Le travail présenté dans ce mémoire a été réalisé au Laboratoire de Chimie de Coordination du CNRS de Toulouse dirigé par Monsieur Jean-Jacques Bonnet puis par Monsieur Bruno Chaudet. Je les remercie de m'avoir accueillie au sein de cet établissement.

Je tiens tout particulièrement à remercier Monsieur Alain Baulard, Chargé de Recherche à l'INSERM à Lille et Monsieur Christian Marazano, Directeur de Recherche au CNRS à Gif-sur-Yvette pour avoir accepter de juger ce travail en tant que rapporteurs. Leur présence à ce jury est pour moi un grand honneur.

Monsieur Stéphane Quideau, Professeur à l'Université de Bordeaux I, m'a également fait

l'honneur de participer à ce jury de thèse. Je tiens à lui adresser mes remerciements pour son implication dans l'évaluation de ce travail.

J'adresse ma plus profonde gratitude à Monsieur Armand Lattes, Professeur émérite à

l'Université Paul Sabatier de Toulouse, pour avoir présidé ce jury de thèse, mais aussi pour l'ensemble de ces enseignements depuis la licence. La chimie sans lui n'aurait pas été tout à fait la même.

Monsieur Bernard Meunier, PDG de la société Palumed, m'a accueilli au sein de son

équipe. Je lui suis très reconnaissante de m'avoir accordée sa confiance en me proposant ce sujet captivant à l'interface de la chimie et de la biologie. Ses compétences, sa grande motivation et ses conseils ont été précieux.

Je tiens à exprimer ma profonde gratitude à Vania Bernardes-Génisson, Maître de

Conférence à l'université Paul Sabatier de Toulouse, qui a assuré la direction scientifique de ce travail. Sa détermination, sa rigueur scientifique et son optimisme ont été indispensable au bon déroulement de cette thèse. Je souhaite également la remercier pour sa gentillesse, sa disponibilité et pour tout ce qu'elle m'a appris au cours de ces trois années.

Je tiens à remercier Monsieur Jean Bernadou, Professeur à l'Université Paul Sabatier de

Toulouse. Sa grande culture, son optimisme, sa gentillesse et ces encouragements ont permis l'avancement de mes recherches dans la bonne humeur.

Mes chaleureux remerciements à Annaïk Quémard, Chargée de Recherche au CNRS pour

m'avoir fait partager ses larges connaissances scientifiques et m'avoir initié à l'enzymologie et à la bactériologie. Sa fructueuse contribution m'a permis d'évoluer avec aisance à l'interface entre la chimie et la biologie. Je remercie également Patricia Constant pour l'ensemble de ces conseils en bactériologie et pour la réalisation des tests sur M. tuberculosis et sur les cellules eucariotes.

Je remercie Monsieur Jean-Luc Stigliani et Monsieur Philippe Arnaud pour l'ensemble des calculs de modélisation moléculaires. Merci pour votre disponibilité et votre patiente pour m'expliquer les ficelles du monde des théoriciens.

J'adresse aussi mes remerciements les plus chaleureux aux divers services grâce

auxquelles ce travail a pu être réalisé dans d'excellentes conditions : le service RMN et tout spécialement Yannick Coppel, le service de diffractions aux rayons X et notament Heinz Goritzka, le service de spectrométrie de masse et le service HPLC et plus particulièrement Chantal Zedde.

Ces trois années de travail ont été facilitées par les encouragements de toutes les

personnes cotoyées quotidiennement au laboratoire et que je n'oublierais pas de remercier : Geneviève, Marguerite, Catherine, Christophe, Anne, Françoise, Isabelle et Peter merci

pour vos conseils avisés et votre gentillesse. Un grand merci à Fatima et à Maryse pour m'avoir aidé dans ce travail (et pour tout le

reste biensûr) et aux thésards, post-doc et stagières avec qui la vie au laboratoire comme à l'extérieur aura été pleine de moments inoubliables : les anciens Sophie M., Céline et Sophie S. (nos dicussions interminables m'ont manqué en cette dernière années), Joel, Ludivine, Alexandrine, Guillaume, Luc, Chritophe B., Ana, Guilio, Adeline, François JBBD (vive la guiness!!!) et Charline, Christine, Vanessa (et Séb et Mathilde, courage c'est bientôt fini), François B., Jérome, Vanessa F. et la petite dernière Carmen.

Christelle et Stéphane depuis maintenant 6 ans nous avons partagé les bons moments

comme les périodes difficles, merci pour votre amitiés. Merci au groupe CIES : Fanny, Flavie, Sophie, Camille et Lillian d'avoir accepté a vos repas une non monitrice, Myriam et Benoit, vous m'avez permis de décompresser dans les moment de stress.

Enfin et surtout, mes remerciements les plus forts reviennent à mes parents qui m'ont

toujours encouragée et soutenue et sans qui je n'aurais pu aller au bout de mes projets. J'y associe également mon frère Hans, mes grands parents et l'ensemble de ma famille.

Pour terminer, merci à Romain qui a été à mes côtés pour partager les meilleurs comme les plus durs moments de ces trois années de thèse.

7

ABREVIATIONS.............................................................................................................. 11 INTRODUCTION GENERALE....................................................................................... 13 INTRODUCTION ............................................................................................................. 17 I. La tuberculose............................................................................................................... 19

I.1. Situation de la tuberculose dans le monde et perspectives d'évolution ................. 19 I.1.1. Les causes de la recrudescence ....................................................................... 20 I.1.2. Les programmes de lutte contre la tuberculose............................................... 21

I.2. Agent pathogène et transmission de la tuberculose ............................................... 22 I.3. Prévention et traitement ......................................................................................... 23

I.3.1. La vaccination................................................................................................. 23 I.3.2. Les antibiotiques antituberculeux et les traitements ....................................... 24

II. Cibles thérapeutiques................................................................................................... 28 II.1. La paroi mycobactérienne .................................................................................... 28 II.2. Structure de l'enveloppe mycobactérienne ........................................................... 29

II.2.1. Architecture de la paroi mycobactérienne ..................................................... 29 II.2.2. Les acides mycoliques ................................................................................... 30

II.3. Biosynthèse des acides mycoliques...................................................................... 32 III. L'isoniazide ................................................................................................................ 33

III.1. Activation de l'INH et formation des adduits INH-NAD.................................... 35 III.1.1. Activation enzymatique de l'INH par la catalase-peroxydase KatG ............ 35 III.1.2. Activation chimique de l'INH par le pyrophosphate de MnIII ...................... 42

III.2. Cibles moléculaires de l'INH activé .................................................................... 45 III.2.1. Inhibition de l'enzyme InhA......................................................................... 45 III.2.2. Inhibition de l'enzyme MabA....................................................................... 49 III.2.3. Autres cibles (KasA et DHFR) et effets pléiotropiques ............................... 50

IV. Résistance à l'INH...................................................................................................... 53 IV.1. Mutation dans katG ............................................................................................. 54 IV.2. Mutation dans inhA ............................................................................................. 55

V. Autres énoyl-ACP-réductases et leurs inhibiteurs....................................................... 58 V.1. Inhibiteurs formant une liaison covalente avec le cofacteur NAD ...................... 59 V.2. Inhibiteurs formant une liaison non covalente avec le cofacteur NAD ............... 62

V.2.1. Le triclosan, ses analogues et leurs dérivés................................................... 62 V.2.2. Différentes structures aromatiques découvertes par criblage à haut débit .... 64

V.3. Inhibiteur n'interagissant pas avec le cofacteur NAD .......................................... 65 OBJECTIFS....................................................................................................................... 67 RESULTATS ET DISCUSSION ...................................................................................... 73

CHAPITRE I : SYNTHESE D'ANALOGUES DES ADDUITS INH(BH)-NAD.............. 75 I. Introduction................................................................................................................... 77 II. Analogues des adduits BH-NAD portant le motif adénosine...................................... 78

II.1. Analyse rétrosynthétique ...................................................................................... 78 II.2. Première stratégie de synthèse (voie a) ................................................................ 80

II.2.1. Préparation du sel de pyridinium avec une chaîne hydroxylée (Synthon 20)80

8

II.2.2. Préparation du sel de pyridinium phosphotriester 19 (Schéma 10) .............. 82 II.2.3. Préparation des dihydropyridines .................................................................. 86 II.2.4. Réduction du sel 20 suivie de la formation des phosphotriesters 44 et 45 .... 87

II.3. Seconde stratégie (voie b)..................................................................................... 88 II.3.1. Préparation de la chaîne phosphotriester (Synthon 23) ................................. 88 II.3.2. Synthèse one-pot............................................................................................ 88

II.4. Analogue de l'adduit BH-NAD avec un lien diphosphate. ................................... 90 II.5. Conclusion ............................................................................................................ 92 II.6. Perspectives .......................................................................................................... 92

III. Analogues simplifiés avec le motif isonicotinoyle .................................................... 94 III.1. Préparation du motif hémiamidal ........................................................................ 95 III.2. Préparation des sels de pyridinium...................................................................... 97 III.3. Préparation des dihydropyridines........................................................................ 98 III.4. Article................................................................................................................ 100 III.5. Conclusion......................................................................................................... 105

IV. Evaluation biologique .............................................................................................. 105 IV.1. Inhibition de l'enzyme InhA.............................................................................. 105 IV.2. Inhibition de la croissance de Mycobacterium smegmatis mc2155................... 106

V. Conclusion................................................................................................................. 107 CHAPITRE II : SYNTHESE DES INHIBITEURS DE TYPE BISUBSTRAT................ 109

I. Introduction................................................................................................................. 111 II. Analyse rétrosynthétique ........................................................................................... 111 III. Intermédiaires fonctionnalisés.................................................................................. 112

III.1. Synthèse de l'hémiamidal 103 ........................................................................... 112 III.2. Synthèse de l'hémiamidal 107 ........................................................................... 113

IV. Molécules de type bisubstrat en série pyridine ........................................................ 113 IV.1. Famille 1 en série pyridine................................................................................ 113 IV.2. Famille 2 en série pyridine................................................................................ 114

IV.2.1. Tentatives de préparation des hémiamidals 115 et 116 ............................. 114 IV.2.2. Synthèse de l'hémaiamidal 119 .................................................................. 114

V. Molécules de type bisubstrat en série pyridinium..................................................... 115 VI. Molécules de type bisubstrat en série 1,4-dihydropyridine ..................................... 116 VII. Inhibition de l'enzyme InhA ................................................................................... 116 VIII. Article.................................................................................................................... 119 IX. Inhibition de la croissance de mycobactéries........................................................... 119 X. Conclusion................................................................................................................. 125

CHAPITRE III : ETUDE DE L'EQUILIBRE TAUTOMERIQUE CHAINE-CYCLE SUR DES MODELES SIMPLIFIES DES ADDUITS INH-NAD............................................. 127

I. Introduction................................................................................................................. 129 II. Etude expérimentale .................................................................................................. 129 III. Etude théorique ........................................................................................................ 132 IV. Article....................................................................................................................... 133

9

V. Conclusion................................................................................................................. 141 CHAPITRE IV : ETUDE THEORIQUE DE L'INTERACTION DES DIFFERENTES FORMES TAUTOMERIQUES DE L'ADDUIT INH-NAD AVEC LE SITE ACTIF D' InhA.................................................................................................................................... 143

I. Introduction................................................................................................................. 145 II. Validation du modèle................................................................................................. 145 III. Energies d'interaction des adduits INH-NAD avec InhA......................................... 146

III.1. Adduits ouverts 4S et 4R ................................................................................... 147 III.2. Adduit BH-NAD ............................................................................................... 147 III.3. Adduits cycliques 4S7R et 4R7S ....................................................................... 147 III.4. Adduits oxydés.................................................................................................. 148

IV. Hypothèse d'ouverture des adduits cycliques .......................................................... 148 V. Article........................................................................................................................ 149 VI. Conclusion ............................................................................................................... 159

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ............................................................................ 161 PARTIE EXPERIMENTALE COMPLEMENTAIRE ................................................... 167

SYNTHESE ....................................................................................................................... 169 CHAPITRE I : SYNTHESE D'ANALOGUE DES ADDUITS INH(BH)-NAD .......... 172

EVALUATION BIOLOGIQUE ........................................................................................ 179 I. Evaluation de l'activité inhibitrice sur InhA ............................................................... 181

I.1. Le Principe de la cinétique enzymatique sur InhA .............................................. 181 I.2. Préparation d'InhA ............................................................................................... 181 I.3. Préparation et purification du substrat 2-trans-décénoyl-CoA d'InhA................ 181 I.4. Synthèse et purification des adduits INH-NAD (inhibiteurs d'InhA).................. 183 I.5. Tests d'inhibition d'InhA...................................................................................... 184

II. Evaluation de l'activité anti-bactérienne.................................................................... 189 II.1. Principe du test. .................................................................................................. 189 II.1. Inhibition de croissance de M. smegmatis. ......................................................... 189 II.2. Test de la spécificité des composés .................................................................... 192 II.3. Détermination des CI50 des différents composés sur M. smegmatis, E. coli et C. glutamicum. ................................................................................................................ 195

BIBLIOGRAPHIE........................................................................................................... 197

10

11

ABREVIATIONS Ac : acétyle

ACP : acyl carrier protein

ADN : acide désoxyribonucléique

ADP : adénosine diphosphate

AIBN : 2,2'-azabis-isobutyronitrile

ARN : acide ribonucléique

BCG : Bacille de Calmette et Guérin

BHI : brain heart infusion

C. : Corynebacterium

C10CoA : 2-trans-décénoyl-CoA

CcP : cytochrome c peroxydase

CI50 : concentration inhibitrice 50, concentration nécessaire à 50% d'inhibition de l'enzyme

CMI : concentration minimale inhibitrice

CoA-SH : coenzyme A

DCC : dicyclohexylcarbodiimide

DHFR : dihydrofolate réductase

DHP : dihydropyridine

DL50 : dose létale 50, dose nécessaire pour tuer 50% des animaux soumis à l'expérimentation

DMF : diméthylformamide

DMSO : diméthylsulfoxyde

DO : densité optique

DOTS : directly observed therapy strategy

dppf : diphénylphosphinoferrocène

E : Escherichia

ETH : éthionamide

Eq : équivalent molaire

FAS : fatty acid synthase

Hepes : acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique

HOMO : orbitale moléculaire la plus haute occupée

HPLC : chromatographie liquide haute performance (high pressure liquid chromatography)

HPLC-SM : chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse

HRP : horseradish peroxydase ou peroxydase de Raifort

12

INH : isoniazide

INH-NAD : adduits covalents formés entre l'INH et le cofacteur

IPTG : isopropyl β-D-thiogalactoside

IR : infra-rouge

LAM : lipoarabinomannane

LB : Luria Browth Base

LDA : Diisopropylamidure de lithium

LUMO : orbitale moléculaire la plus basse inoccupée

M. : Mycobacterium

mAGP : complexe petidoglycane-arabinogalactane-acide mycolique

MDR : multi-drug resistances

MTT : bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-2H-tétrazolium

NAD+ : nicotinamide adénine dinucléotide (forme oxydée)

NADH : nicotinamide adénine dinucléotide (forme réduite)

NADPH : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate

OMS : organisation mondiale de la santé

PBS : phosphate buffer saline

Pipes : acide pipérazine-1,4-bis(éthane-2-sulfonique)

RMN : résonance magnétique nucléaire

ROE : rotating-frame overhauser effect

SDS : dodécylsulfate de sodium

SIDA : sydrome d'immunodéficience acquise

SM : spectrométrie de masse

TB : tuberculose

Tf : triflate

Tr : temps de rétention

THF : tétrahydrofurane

UV : ultraviolet

VIH : virus d'immunodéficience humaine

WT : wild type

INTRODUCTION GENERALE

Introduction générale

15

Les traces les plus anciennes de la tuberculose ont été retrouvées sur des gisements

osseux humains datant de la préhistoire, témoignant des ravages qu'elle causait déjà entre

3000 et 5000 ans avant JC.1 Resurgissant sporadiquement au cours de l'histoire, la tuberculose

fut décrite sous diverses formes et emprunta différents noms (peste blanche, phtisie). A la fin

du 18ème et au début du 19ème siècle, l'épidémie atteint son apogée en Europe et en Amérique

du Nord, où la surpopulation urbaine et la dégradation des conditions d'hygiène, favorisent la

contagion et donc la propagation de la maladie. A cette époque, la cure "hygiéno-diététique"

et le repos dans des établissements spécialisés (sanatoriums) étaient la seule chance de

récupération pour les tuberculeux. Le premier sanatorium fut ouvert en 1854 en Allemagne.2

L'épidémie de tuberculose n'a sérieusement régressé qu'à la fin des années 1960 avec

l'amélioration générale du niveau de vie et des conditions d'hygiène et surtout suite à

l'introduction de la vaccination par le BCG (Bacille de Calmette et Guérin) et à la mise au

point de médicaments antibiotiques efficaces. C'est ainsi que l'incidence de la maladie dans le

monde depuis cette date a considérablement diminué au point de considérer la tuberculose en

voie d'éradication.

Cependant, la tuberculose connait aujourd'hui une recrudescence inquiétante aussi bien

dans les pays en voie de développement que dans les pays industrialisés. Ceci est dû d'une

part à la synergie prononcée entre le virus d'immunodéficience humaine (VIH) et la

tuberculose et d'autre part à l'apparition de souches résistantes aux antibiotiques spécifiques

de la mycobactérie (comme par exemple l'isoniazide). Ainsi, la résurgence de la tuberculose

est considérée aujourd'hui par l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) comme un

problème majeur de santé publique. En effet, le nombre de décès est de plus de 2 millions par

an dans le monde.

La recrudescence de la maladie est associée pour une part importante à l'accroissement

des résistances des microorganismes à de nombreux antibiotiques, en effet aucun nouveau

médicament de première ligne n'a été introduit en thérapeutique depuis près de quarante ans.

Ceci rend nécessaire le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, basées

notamment sur une meilleure connaissance du mécanisme d'action des médicaments existants.

Une meilleure compréhension du mécanisme d'action moléculaire de l'isoniazide (un des

médicaments le plus utilisé dans le traitement de la tuberculose) permettrait de concevoir de

nouvelles molécules capables d'agir comme antituberculeux. Depuis plusieurs années, le

Introduction générale

16

groupe du Professeur J. Bernadou collabore pour la meilleure compréhension de ce

mécanisme d'action.

Ainsi, nous proposons d'approfondir la compréhension du mécanisme d'action de

l'isoniazide et de synthétiser de nouveaux composés à activité antimycobactérienne potentielle

basés sur les connaissances de ce mécanisme.

INTRODUCTION

Introduction

19

I. La tuberculose La tuberculose, première cause de mortalité mondiale due à un agent infectieux unique,

tue plus de 2 millions de personnes chaque année. Depuis une vingtaine d'années, en dépit des

traitements antibiotiques et du vaccin existant, on assiste à une recrudescence mondiale de

cette maladie qui semble avoir été un peu trop vite considérée comme éradiquée dans les pays

industrialisés.

I.1. Situation de la tuberculose dans le monde et perspectives d'évolution Aujourd'hui, la tuberculose reste un problème majeur de santé publique : chaque année, 8

à 10 millions de personnes contractent la maladie et plus de 2 millions en meurent, soit un

décès toute les quinze secondes.3 Selon l'OMS, la tuberculose est l'une des principales causes

de mortalité d'origine infectieuse avec le SIDA (syndrome d'immunodéficience acquise) et le

paludisme. Elle touche essentiellement les pays en voie de développement qui totalisent 95%

des cas et 98% des décès, mais aussi les régions industrialisées comme les Etats-Unis ou

l'Europe. Trois continents sont principalement concernés : l'Afrique, l'Asie et l'Amérique

Latine (Figure 1) où la surpopulation, les conditions de vie insalubres, l'alimentation

déficiente et le manque de moyens des autorités sanitaires sont propices à la propagation de

l'infection.4

<1010 - 2425 - 50

<1010 - 2425 - 50

<1010 - 2425 - 50

50 - 99100 - 299>300

50 - 99100 - 299>300

50 - 99100 - 299>300

Nombre de nouveaux cas pour 100 000 habitants

Figure 1 : Estimation de l'incidence de la tuberculose dans le monde en 2005.

(Source : The Global Plan to Stop TB http://www.stoptb.org/globalplan/)

A la fin des années 1970, avec la mise en place d'un traitement basé sur une

polychimiothérapie obligatoire d'une durée de six mois, l'éradication était envisagée pour les

années 2005-2010 dans les pays développés. Cependant, la tuberculose est aujourd'hui en

recrudescence. En effet, ces dix dernières années, le nombre de tuberculeux dans le monde a

augmenté de 20% et l'OMS estime que le nombre de morts imputé à la tuberculose va croître

Introduction

20

pour atteindre 5 millions en l'an 2050.5 De problème majeur de santé publique, la tuberculose

est maintenant devenue une urgence mondiale.

I.1.1. Les causes de la recrudescence

Plusieurs facteurs peuvent être évoqués pour expliquer cette recrudescence :5

Les changements démographiques

Les régions du globe les plus touchées sont également celles où la population croît le plus

rapidement. Ces changements démographiques compteront pour 75% dans l'augmentation du

nombre de cas dans la décennie à venir.

La co-infection VIH / Mycobacterium tuberculosis

Le VIH et l'agent pathogène de la tuberculose, qui accélèrent mutuellement leur

progression, forment une association meurtrière. La tuberculose est responsable de 13% des

décès chez les malades atteints du SIDA dans le monde. En particulier en Afrique, le VIH est

la principale raison de la hausse de l'incidence de la tuberculose ces dix dernières années.

L'appauvrissement de certaines populations

L'association entre pauvreté et tuberculose est bien établie. La plus grande majorité des

personnes souffrant de tuberculose disposent des services médicaux les plus pauvres. Il en

résulte un mauvais suivi des traitements par les malades, donc des risques de rechute et

d'émergence de bacilles résistants. Même dans les pays industrialisés, les taux les plus élevés

de malades se retrouvent dans les couches les plus pauvres de la population.

Les mouvements de population

Dans les pays développés où l'incidence de la tuberculose est faible, l'immigration est le

facteur qui contribue le plus à l'augmentation du nombre de cas. Ceci est dû à l'importation de

la maladie depuis des pays fortement touchés.

La résistance multi-drogues

L'une des causes majeures de cette nouvelle avancée de l'épidémie de tuberculose est

l'émergence de souches multirésistantes de Mycobacterium tuberculosis. L'acquisition d'une

souche résistante peut s'effectuer de deux manières :

Multirésistance primaire : à la suite d'une infection par un bacille de Koch d'emblée

multirésistant chez un patient n'ayant jamais reçu d'antibiotique auparavant.

Introduction

21

Multirésistance acquise ou secondaire : lorsqu'un traitement inadéquat ou mal pris,

entraîne chez un patient initialement infecté par une souche sensible, une sélection de

mutants résistants.

La multirésistance secondaire résulte souvent d'un traitement suivi de façon irrégulière ou

partielle, les malades omettant de prendre régulièrement tous leurs médicaments jusqu'à la fin

de la période prescrite parce qu'ils commencent à se sentir mieux, ou encore lorsque

l'approvisionnement en médicaments n'est pas fiable. La résistance acquise, induite par un

traitement inadéquat, est la marque d'une déficience des programmes de lutte contre la

tuberculose.

I.1.2. Les programmes de lutte contre la tuberculose

C'est dans ce contexte que l'OMS a développé de nouvelles stratégies ainsi que des

programmes nationaux et internationaux de recherche visant à améliorer les outils pour

combattre avec plus d'efficacité la recrudescence de cette pandémie mondiale.

Le programme DOTS (Directly Observed Therapy Strategy) mis en place par l'OMS depuis

1995 a fourni des lignes directrices afin de lutter contre la tuberculose. Cette stratégie repose

sur cinq points essentiels :6

l'engagement des gouvernements apportant un support financier durable,

la détection rapide des cas de tuberculose reposant sur le renforcement des

équipements (radiographie) dans les laboratoires et sur un personnel formé,

un traitement standardisé sous surveillance directe (aider les patients à prendre leurs

médicaments régulièrement et à achever leur traitement) et l'amélioration de l'accès au

traitement dans les populations les plus pauvres et les plus vulnérables,

un système d'approvisionnement en médicament efficace et régulier,

un système d'analyse de l'efficacité de ce programme.

Le programme DOTS a récemment été étendu.7,8 Il s'inscrit dans une stratégie globale

appelée "Halte à la tuberculose" qui prend en compte de nouveaux objectifs :

la lutte contre la co-infection VIH/M. tuberculosis,

le renforcement des systèmes de santé,

la coopération de toutes les personnes soignantes,

Introduction

22

donner aux personnes atteintes de tuberculose et aux communautés les capacités

d'agir,

favoriser et promouvoir la recherche.

Les objectifs de ces programmes étaient de parvenir à dépister 70% des nouveaux cas de

tuberculose infectieuse et en guérir au moins 85% en 2005, le but final étant de maîtriser la

tuberculose d'ici 2015 et d'observer une inversion de la tendance actuelle. Les résultats sont en

dessous des objectifs concernant le dépistage avec une estimation de 53% en 2004. Mais les

taux de succès thérapeutiques étaient de 82% la même année, soit très proches de l'objectif

des 85%.7 La poursuite des efforts est encore indispensable et dépendra en grande partie du

soutien financier des gouvernements.

I.2. Agent pathogène et transmission de la tuberculose Peu de temps après la mise en évidence du caractère infectieux et contagieux de la

tuberculose par le médecin français Jean-Antoine Villepain, le microbiologiste allemand

Robert Koch, en 1882, observa et décrivit pour la première fois le germe pathogène

responsable de la tuberculose : Mycobacterium tuberculosis également appelé bacille de

Koch. En 1905, il est récompensé par le Prix Nobel de médecine et de physiologie pour cette

découverte.

La tuberculose est donc due à une bactérie acido-alcoolo-résistante, aérobie stricte,

communément appelé bacille (bactérie en forme de bâtonnet) tuberculeux. L'espèce la plus

répandue est représentée par le bacille de type humain, Mycobacterium tuberculosis (M.

tuberculosis) (99% des cas). Dans les régions d'élevage, les bovidés peuvent être infectés par

une autre espèce du bacille, M. bovis qui est transmissible à l'homme par le lait non pasteurisé

(1% des cas). En Afrique, un autre bacille a été identifié chez l'homme, M. africanum, dont la

pathogénicité est la même que celle de M. tuberculosis. Ces trois espèces de mycobactérie

ainsi que M. microti font partie du complexe M. tuberculosis. Les trois premières bactéries

sont les plus dangereuses en ce qui concerne l'infection des sujets humains. Parmi les espèces

non pathogènes, M. smegmatis et M. aurum sont particulièrement étudiées en laboratoire.

La transmission de la maladie se fait essentiellement par voie aérienne (toux,

éternuement, expectoration). L'homme constitue à la fois le réservoir et l'agent de

Introduction

23

transmission (ou vecteur) de la maladie.9 Bien que 2 milliards de personnes soient infectées

par le bacille tuberculeux, seulement 10% d'entre elles développent la maladie. En effet, un

porteur de bacilles peut rester en bonne santé toute sa vie (la maladie est dite latente) ou bien

développer une tuberculose active lorsque son équilibre immunitaire est bouleversé, par

exemple s'il est affaibli à la suite de malnutrition ou s'il est infecté par d'autres

microorganismes comme le VIH. De ce fait, la tuberculose est connue comme étant une

"maladie des pauvres" ou "maladie opportuniste".

Lorsque la tuberculose est déclarée, elle affecte le plus souvent les poumons (80% des

cas, tuberculose pulmonaire). Les symptômes sont des toux persistantes, des douleurs

thoraciques, du sang dans les expectorations et de la fièvre. La tuberculose se caractérise aussi

par une perte de poids et d'appétit et de la fatigue. Si elle n'est pas traitée, une tuberculose

active tue plus de la moitié de ses victimes. L'infection peut également toucher n'importe quel

autre organe (tuberculose extra-pulmonaire). Mais seule la tuberculose pulmonaire est

responsable de la transmission du bacille.

I.3. Prévention et traitement I.3.1. La vaccination

Ce sont les bactériologistes français Albert Calmette et Camille Guérin qui mirent au

point un vaccin, connu sous le nom de BCG, préparé à partir d'une souche atténuée de

Mycobacterium bovis. Ce vaccin fut utilisé pour la première fois chez l'homme en 1921 en

France, mais ce n'est qu'à partir de la seconde guerre mondiale que la vaccination au BCG

s'est répandue à travers le monde.

Le BCG est toujours le seul vaccin utilisé de nos jours. Environ 115 millions de vaccins

sont distribués chaque année et on estime que 80% des enfants le reçoivent à travers le

monde. Plusieurs études montrent que l'efficacité de ce vaccin est de 80% chez les enfants,

uniquement pour les formes les plus dangereuses de la maladie (par exemple la tuberculose

méningée).10 Cependant, une étude réalisée à grande échelle en Inde a montré que son

efficacité pour prévenir les tuberculoses pulmonaires est très variable surtout chez les adultes

qui ne seraient protégés que dans un cas sur deux.11 Ce vaccin ne permet donc pas d'empêcher

la transmission de la maladie ni d'enrayer l'épidémie mondiale. De nouveaux vaccins sont

actuellement en cours de développement.12

Introduction

24

I.3.2. Les antibiotiques antituberculeux et les traitements

Les antibiotiques13,14

C'est en 1944, que le microbiologiste américain Selman A. Walksman, découvrit le

premier antibiotique actif contre la tuberculose : la streptomycine. Les résultats furent tout de

suite impressionnants : arrêt immédiat de la progression de la maladie et rétablissement

complet des malades. Dans les années qui ont suivi, de nombreux antituberculeux ont été

développés.

La plupart des médicaments utilisés de nos jours sont encore d'anciennes molécules,

découvertes il y a plus de 30 ans, grâce a un effort de recherche clinique entrepris entre 1945

et 1970. Le succès de l'antibiothérapie a ainsi conduit à un abandon quasi-total des recherches.

En effet, aucun autre antituberculeux de première ligne n'a été introduit en thérapeutique

durant ces quarante dernières années. C'est ainsi que l'isoniazide (INH) est et demeure depuis

1952, l'antituberculeux le plus puissant de l'arsenal actuel d'antibiotiques, tout en étant le

moins cher. Aujourd'hui, il reste le médicament le plus utilisé dans le traitement de la

tuberculose mais aussi dans sa prophylaxie.

D'une façon générale, les médicaments antituberculeux sont divisés en deux catégories :

Les composés à large spectre (non spécifiques) qui possèdent une activité contre

plusieurs espèces de bactéries, y compris les mycobactéries. Ils agissent sur des cibles

moléculaires présentes dans une grande variété de bactéries. Ils bloquent la

transcription (rifampicine, fluoroquinolone), la réplication de l'ADN

(fluoroquinolone), la traduction (streptomycine) ou la synthèse d'autres

macromolécules (acide gras : thiolactomycine ; peptidoglycane : D-cyclosérine).

Les composés dont l'activité est spécifique des mycobactéries, voire une seule espèce

de mycobactérie. Ce sont les antibiotiques les plus sélectifs et ils interfèrent en général

avec la biosynthèse de la paroi mycobactérienne, une structure propre des

mycobactéries. C'est le cas de l'isoniazide, le pyrazinamide, l'éthionamide et

l'ethambutol. Les trois premiers sont des prodrogues nécessitant une étape d'activation

à l'intérieur de la mycobactérie. Ceci contribue à la sélectivité de ces médicaments.

Au niveau clinique, les molécules utilisées dans le traitement contre la tuberculose

peuvent également être classées en deux catégories :

Les antibiotiques de "première ligne"

Les antibiotiques de "première ligne" sont des médicaments utilisés durant la phase

initiale de traitement de la tuberculose. Il s'agit d'une période de traitement intensif, durant

Introduction

25

laquelle une combinaison de quatre antituberculeux, parmi les cinq que nous allons présenter

ici (Figure 2), est prescrite au malade.

La streptomycine a été isolée de Streptomyces griseus et fut le premier antibiotique

réellement efficace contre la tuberculose. Elle possède une concentration minimale

d'inhibition (CMI) de 1 µg/mL. Elle pénètre dans la membrane interne de M. tuberculosis et

inhibe la biosynthèse des protéines en se liant de manière irréversible à la petite sous unité des

ribosomes.

L'isoniazide (INH) est très actif vis-à-vis de plusieurs agents pathogènes du genre

mycobactérien en particulier sur les bacilles en multiplication et possède des CMI allant de

0,02 à 0,2 µg/mL. Cette molécule est une prodrogue nécessitant une activation in vivo (à

l'intérieur de la bactérie) pour former le véritable principe actif. Il inhibe la biosynthèse des

acides mycoliques qui sont des constituants essentiels de la paroi mycobactérienne. Nous

reviendrons en détail sur le mécanisme d'action de l'INH par la suite.

N

OHN NH2

Isoniazide

HO

HN

O

HO

O

HO

CH3

OHH3C

OOHC

OHOH

NHHO

NHHN

H2N

NH

H2N

Streptomycine

N

NNH2

O

NH

HNMe

Me

HO

OHEthambutol

Pyrazinamide

ON

NN

NHOHOH

O

OOH

HO

O

OO

Rifampicine Figure 2 : Antituberculeux de première ligne.

Le pyrazinamide est un analogue de l'isoniazide. Il s'agit également d'une prodrogue dont

l'activité dépendrait d'une amidase bactérienne. L'acide pyrazinoïque serait en fait la molécule

active. Son activité est très spécifique de M. tuberculosis et agit principalement sur les

bacilles quiescents ("dormants"). Ce composé présente un fort effet de synergie avec l'INH et

le pyrazinamide et a permis le raccourcissement du traitement de 12 à 6 mois.

La rifampicine est un composé naturel isolé de Streptomyces mediterranei, introduit

comme antituberculeux au début des années 1970. Elle inhibe la biosynthèse de l'ARN en

Introduction

26

agissant sur l'ARN polymérase ADN-dépendante et n'a aucun effet sur les enzymes présentes

chez les mammifères. La CMI de cet antibiotique est de 0,2 µg/mL. Avec l'INH, la

rifampicine constitue la base de la chimiothérapie antituberculeuse.

L'éthambutol est un aminoalcool synthétique décrit en 1961. Il agit comme agent

bactériostatique avec une CMI de 8 µg/mL et il est actif contre la plupart des espèces du genre

Mycobacterium. Il inhibe la biosynthèse des arabinanes qui entrent dans la composition de la

membrane mycobactérienne.

Les antibiotiques de "seconde ligne"

D'autres composés sont occasionnellement utilisés pour traiter la tuberculose (Figure 3),

tels l'éthionamide, la cyclosérine, l'acide para-aminosalicylique ou des fluoroquinolones

comme la lévofloxacine et l'ofloxacine, dans le cas de tuberculoses résistantes à plusieurs

antituberculeux de première ligne.

N

NH2S

Ethionamide

OHCOOH

H2N

Acide para-aminosalicilique(PAS)

O NH

O

NH2

Cyclosérine

NO

OCOOH

N

F

N

Ofloxacine

N

OCOOHF

N

NH

Moxifloxacine Figure 3 : Quelques antibiotiques de seconde ligne.

Cependant, la faible disponibilité et le coût élevé de certaines de ces molécules les

rendent inabordables pour la majeure partie des malades. De plus, à l'exception des

fluoroquinolones, l'utilisation de ces composés est délicate à cause de leur faible activité par

rapport aux antituberculeux de première ligne et à cause de plus grands risques d'effets

secondaires. Les fluoroquinolones sont extrêmement actives contre M. tuberculosis et sont

souvent choisies pour traiter les cas de tuberculose multirésistante, malgrès les effets

secondaires.

Introduction

27

Les traitements13,14

Sans traitement la tuberculose est souvent fatale, environ un tiers des patients atteint de la

maladie décèdent au cours de la première année suivant l'inoculation et la moitié dans les cinq

ans.

Il fut évident, dès le début de l'utilisation des antituberculeux, qu'une monothérapie serait

responsable d'échecs et de sélection de mutants résistants. Le phénomène de résistance fut à

l'origine de la recommandation d'une polychimiothérapie obligatoire de 6 mois. Elle permet

d'augmenter et de diversifier le nombre de cibles biologiques en additionnant les effets

propres à chaque antibiotique. La polychimiothérapie, lorsqu'elle est convenablement

appliquée permet un taux de guérison de 95%. Ce traitement est nécessairement long (6 à 18

mois selon le régime thérapeutique) à cause de la lente croissance des bacilles tuberculeux

(une division toutes les 20 heures, contre 20 minutes à 1 heure pour la majorité des autres

bactéries) et de la présence de bacilles quiescents ("dormants") à métabolisme réduit et donc

moins sensibles aux antibiotiques.

A l'heure actuelle, la thérapie standard pour les tuberculoses actives se fait en deux

phases : une période de traitement intensif de deux mois avec quatre antibiotiques : l'INH, la

rifampicine, la pyrazinamide et l'éthambutol ou la streptomycine, suivie d'une seconde

période de quatre mois durant laquelle le malade continue à prendre deux d'entre eux : l'INH

et la rifampicine. Bien que la plupart des patients n'aient plus de germe pathogène dans leurs

crachats après les deux premiers mois de traitement, la prolongation du traitement est requise

pour empêcher les rechutes et l'apparition de bacilles résistants.

Dans le cas d'infections par des bacilles de Koch résistants à l'INH, des traitements plus

longs arrivent généralement à bout de l'infection. Les personnes atteintes de tuberculose

multirésistante (la résistance multi-"drogue" étant définie comme une résistance à l'INH et à la

rifampicine) peuvent également être soignées, cependant la chimiothérapie requise est encore

plus longue (jusqu'à deux ans) et plus toxique pour les patients. Pour les cas les plus délicats,

les antituberculeux sont administrés aux doses maximales tolérées et les traitements peuvent

faire appel à des antituberculeux encore en cours de développement.

L'ensemble de ces faits accentue le besoin de stratégies alternatives dans le traitement de

la tuberculose, basées notamment sur une meilleure connaissance du mécanisme d'action des

médicaments existants.

Introduction

28

II. Cibles thérapeutiques Généralement les composés antituberculeux ciblent la biosynthèse de macromolécules

(protéines, acides nucléiques, polysaccharides ou lipides de l'enveloppe cellulaire) essentielles

à la survie de la mycobactérie. Il est important d'une part que ces cibles n'aient pas

d'équivalents chez le mammifère pour limiter les effets secondaires et d'autre part qu'elles

soient spécifiques à M. tuberculosis pour éviter l'apparition de résistances communes à

plusieurs types de bactéries.

Dans le cadre de cette thèse, consacrée à l'étude du mécanisme d'action et à la synthèse

d'analogues de l'INH, nous allons décrire plus particulièrement la paroi mycobactérienne qui

est la cible privilégiée de cet antibiotique.

II.1. La paroi mycobactérienne L'enveloppe cellulaire des mycobactéries est essentielle pour la croissance et leur survie

chez l'hôte. Elle permet à la mycobactérie de résister, lors de la contamination, à un

environnement très agressif, comme par exemple l'intérieur des macrophages. En effet, dès

leur entrée dans les bronches et les alvéoles pulmonaires, les bacilles sont confrontés aux

défenses immunitaires de l'hôte. Il arrive que le système immunitaire parvienne à éliminer

complètement l'infection. Mais il est également possible que les mycobactéries résistent à la

dégradation macrophagique. Dans ce cas, ils peuvent rester dans un état de latence, ou se

multiplier en entraînant la lyse des macrophages ce qui conduit au développement de

l'infection.14

L'enveloppe mycobactérienne possède une structure unique qui la distingue des autres

bactéries : sa forte teneur en lipides la rend particulièrement imperméable et lui confère une

résistance à la plupart des antibiotiques et agents thérapeutiques courants. Ces caractéristiques

font de l'enveloppe mycobactérienne une excellente cible pour le développement de nouveaux

antituberculeux. Il est donc indispensable d'avoir une bonne connaissance de la structure de

cette enveloppe et d'identifier les enzymes responsables de sa biosynthèse.

Dans ce paragraphe, nous décrirons l'architecture de l'enveloppe mycobactérienne ainsi

que la structure et la biosynthèse des acides mycoliques qui la constitue (en relation avec le

mécanisme d'action proposé pour l'INH, objet de ce travail).

Introduction

29

II.2. Structure de l'enveloppe mycobactérienne La structure de cette enveloppe est aujourd'hui bien connue, notamment grâce aux travaux

des équipes de P.J. Brennan,15 M. Daffé et P. Draper16 et de D.E. Minnikin.17

II.2.1. Architecture de la paroi mycobactérienne

L'enveloppe mycobactérienne est constituée de trois éléments majeurs : la membrane

plasmique (assemblage de lipides associés à des protéines pour former une bicouche lipidique

asymétrique) entourée d'une paroi cellulaire riche en lipides et en sucres, elle-même encerclée

d'une capsule de polysaccharides, de protéines et d'une faible quantité de lipides (Figure 4).

Acide mycoliquePeptidoglycane

ArabinogalactanePhospholipide

Protéine

Glycolipides

LipoarabinomannanePorine

Capsule

Paroi cellulaire

Membrane plasmique

Acide mycoliqueAcide mycoliquePeptidoglycane

Arabinogalactane

Peptidoglycane

ArabinogalactanePhospholipidePhospholipide

ProtéineProtéine

GlycolipidesGlycolipides

LipoarabinomannaneLipoarabinomannanePorinePorine

Capsule

Paroi cellulaire

Membrane plasmique

Capsule

Paroi cellulaire

Membrane plasmique

Figure 4 : Représentation schématique de l'enveloppe des mycobactéries.

(Adapté des travaux de Daffé et Draper16)

La paroi cellulaire est constituée de l'association de trois polymères (peptidoglycanes,

arabinogalactanes et acides mycoliques) liés entre eux de façon covalente pour former le

complexe mAGP (complexe peptidoglycane-arabinogalactane-acide mycolique).

Introduction

30

Du cytoplasme vers l'extérieur de la bactérie, on distingue :

La couche de peptidoglycane constituée par des chaînes linéaires de polysaccharides

(N-acétylglucosamine et acide muramique) reliées entre elles par de courts

tétrapeptides.

Le peptidoglycane est relié à l'arabinogalactane (arabinose et galactose) par un pont

diglycosyl-phosphodiester.

Les acides mycoliques, branchés sur un motif penta-arabinose, sont les molécules les

plus abondantes (en poids) de la paroi mycobactérienne et leur structure varie en

fonction de l'espèce bactérienne considérée.

Les acides mycoliques forment en surface une seconde bicouche par interaction

hydrophobe avec la partie cireuse de glycolipides et glycopeptidolipides.

Une autre macromolécule est présente dans la paroi des mycobactéries : le

lipoarabinomannane (LAM). Sa localisation et la façon dont il est associé à la paroi ne sont

pas encore bien établies mais il semblerait qu'il traverse la paroi sur toute son épaisseur.

II.2.2. Les acides mycoliques

Fonctions

Les fonctions des acides mycoliques sont variées et peuvent se classer en cinq catégories.

Structurale

Les acides mycoliques sont impliqués dans le maintien de la forme et de la rigidité du

bacille. La stabilité exceptionnelle de ces acides est illustrée par la possibilité de l'étude de la

tuberculose en paléo-épidémiologie dans l'antiquité.

Protection

Les acides mycoliques contribuent à la formation d'un bouclier hydrophobe imperméable

à de nombreux composés tels que les antibiotiques classiques ou les radicaux exogènes.

Taxonomie

La nature et la variété des acides mycoliques synthétisés par les différentes espèces

bactériennes revêtent une grande importance, dans la mesure où ils constituent des éléments

spécifiques et donc des critères majeurs de différenciation et de classement.

Introduction

31

Immunitaire

Les acides mycoliques constituent antigènes susceptibles d'être reconnus par les cellules

immunitaires (lymphocytes T) de l'organisme.18,19

Cible

Une des voies d'investigation pour la recherche actuelle est le ciblage de la paroi

cellulaire qui constitue un élément hautement spécifique des mycobactéries. En effet, les

enzymes impliquées dans cette synthèse représentent des cibles idéales pour des médicaments

potentiels et ainsi plusieurs médicaments fonctionnent par interruption de cette biosynthèse.20

C'est ainsi que l'INH et l'éthionamide inhibent la biosynthèse des acides mycoliques.

Structure

Les acides mycoliques sont des acides gras complexes, à longue chaîne de 60 à 90 atomes

de carbone, α-ramifiés et β-hydroxylés. La structure générale de ces acides gras de haut poids

moléculaire a été élucidée en 1950 par Asselineau (Figure 5).21

Le degré de complexité et la diversité des structures des acides mycoliques sont surtout

liés à la chaîne principale R ou chaîne méromycolique et, dans une moindre mesure, à la

longueur de la chaîne en α.15 La chaîne méromycolique peut comporter des groupes

fonctionnels variés tels qu'une double liaison, un cyclopropane ou une ramification méthyle,

ainsi que des motifs carbonyle, époxyde, méthoxy ou alkoxy carbonyle. Trois types d'acides

mycoliques ont été caractérisés chez M. tuberculosis : les acides α-mycoliques, les acides

méthoxymycoliques et les acides cétomycoliques (Figure 5).

OHR

COOH21, 23

α

β

COOH

OHcis

cis

COOH

OHcisOCH3

COOH

OHO trans

Structure générale

α-mycolique

méthoxymycolique

cétomycolique

Figure 5 : Structure des acides mycoliques majoritaires de M. tuberculosis.

Introduction

32

II.3. Biosynthèse des acides mycoliques Plusieurs étapes de la voie de biosynthèse des acides mycoliques sont connues,

cependant, le schéma de biosynthèse aboutissant à la formation des acides mycoliques reste

encore incomplet. La biosynthèse de ces molécules complexes comprend 4 étapes :15

La synthèse des acides gras saturés de C24-C26 (chaîne α).

La synthèse de la chaîne méromycolique (C40-C60).

La modification de cette chaîne par l'introduction des groupements fonctionnels.

La condensation de type Claisen de la chaîne α et de la chaîne méromycolique.

La biosynthèse des acides mycoliques fait intervenir plusieurs systèmes de synthèse

d'acide gras. Un complexe enzymatique multifonctionnel appelé "Fatty Acid Synthase" FAS-

II est chargé de produire les chaînes méromycoliques par élongation des acyl-CoA C16-C18

produits par le système FAS-I (enzyme multifonctionnelle de sept domaines).22,23

Le cycle d'élongation comprend quatre activités enzymatiques indépendantes (Schéma

1) : deux activités réductases, l'une spécifique d'une double liaison en β ou 2-trans-énoyl-ACP

(InhA), l'autre spécifique d'une fonction cétone en β ou β-cétoacyl-ACP réductase (MabA),

une activité β-cétoacyl synthase (KasA) qui introduit 2 atomes de carbone supplémentaires et

enfin une activité β-hydroxyacyl-ACP déshydratase qui permet d'éliminer une molécule

d'eau.24

Système FAS-I

S

O

nCoA

acyl-CoA

O S

O O

AcpMmalonyl-ACP

S

O O

AcpMn

Kas AKasB

S

O

AcpMn

S

OH O

AcpMn

3-cétoacyl-ACP

acyl-ACP

3-hydroxyacyl-ACP

2-trans-énoyl-ACPS

O

AcpMn

MabA

Dehydratase

InhA

SystèmeFAS II

NADPH, H+ NADP+

NADH, H+NAD+

KasIII

H2O

Système FAS-I

S

O

nCoA

acyl-CoA

O S

O O

AcpMmalonyl-ACP

S

O O

AcpMn

Kas AKasB

S

O

AcpMn

S

OH O

AcpMn

3-cétoacyl-ACP

acyl-ACP

3-hydroxyacyl-ACP

2-trans-énoyl-ACPS

O

AcpMn

MabA

Dehydratase

InhA

SystèmeFAS II

NADPH, H+ NADP+

NADH, H+NAD+

KasIII

H2O

Schéma 1 : Les étapes du système FAS-II d'après Rawat et al.24

Introduction

33

Le mécanisme d'introduction des groupements fonctionnels sur la chaîne méromycolique

n'est pas encore parfaitement élucidé, mais la première étape correspondrait à l'introduction

d'une double liaison cis.25

L'étape finale de la biosynthèse des acides mycoliques est la condensation de type Claisen

entre la chaîne méromycolique et la chaîne α. L'enzyme impliquée dans cette étape de

condensation correspond à la protéine Pks13, protéine multifonctionnelle contenant cinq

domaines catalytiques, qui est un membre des polykétides synthases (Pks) de type I.26,27

Après la condensation, l'intermédiaire β-céto-ester-3-oxomycolique devra être réduit par

une réductase CmrA, conduisant à l'acide mycolique (Schéma 2).

FAS-II FAS-I

R1S

R2OO

X CoA

Acyl-CoA(C16-C18)

activation carboxylation

R1O

AMP SR2

O

CoACOOH

R1X

R2

O ORéductase

Condensase Pks13

R1X

R2

OH O

Mycolateβ-céto-ester mycolique

R2 : C22-C26

R1 : C40-C60

X : transporteur

CmrA

Schéma 2 : Modèle proposé pour l'étape finale de la biosynthèse des acides mycoliques.

(Adapté de Portevin et al).28

III. L'isoniazide La découverte en 1945 par Chorine29 de l'effet antibactérien du nicotinamide sur M.

tuberculosis stimula la recherche de nouveaux médicaments contre la tuberculose, parmi les

dérivés de la pyridine. Ainsi, en 1952, Fox entrepris la synthèse de la thiosemicarbazone du

pyridyl-4-carboxaldéhyde (Schéma 3). L'étude fortuite des intermédiaires de cette synthèse

mit en évidence l'activité antituberculeuse de l'hydrazide de l'acide isonicotinique ou

isoniazide,30,31 bien supérieure à celle des substances jusqu'alors utilisées. Ceci conduisit

rapidement à des applications thérapeutiques. L'INH est une vieille molécule, synthétisée dès

1912 par Meyer et Mally, mais qui n'avait jamais été testée comme antituberculeux.

Introduction

34

N

O O R

N

OHN NH2

N

OHN

HN SO2

Ph

N

H NNH

S

NH2

Ester d'acideisonicotinique

Isoniazide Benzènesulfonyl-isonicotinoylhydrazine

Thiosemicarbazone dupyridyl-4-carboxaldéhyde

Schéma 3.

In vivo, l'expérimentation entreprise sur les animaux a entièrement confirmé les

remarquables propriétés antituberculeuses de l'INH.30 Les premiers résultats sur l'homme ont

été publiés par Elmendorf et al32 en 1952 et les propriétés préventives et curatives de l'INH

ont rapidement été démontrées.

L'INH est un antibiotique à spectre d'action étroit, hautement spécifique des

mycobactéries et plus particulièrement de celles du complexe M. tuberculosis. Ces dernières

sont extrêmement sensibles à l'INH dans une gamme de CMI (concentration minimale

inhibitrice) de 0,02-0,20 µg/mL (soit 0,15-1,50 µM), alors que les autres espèces de

mycobactéries sont moins sensibles et requièrent des concentrations de l'ordre de 1-10 µg/mL

pour M. kansaii et 100 µg/mL pour M. phlei. L'INH possède une activité antibactérienne très

faible voire nulle en dehors du genre Mycobacterium : les autres bactéries telles que

Escherichia coli sont capables de croître en présence de concentrations en INH supérieures à

1 µg/mL. Même administré de façon prolongée (6-18 mois), le traitement des patients

n'occasionne qu'un faible risque d'effets secondaires nocifs. En effet, l'INH est

remarquablement peu toxique et la dose létale chez l'animal (DL50 ~ 160 mg/kg chez la souris)

est très supérieure à la dose active (0,25 à 5 mg/kg/jour).33,34

On a longtemps cru que l'INH était rapidement intégré dans les bacilles par un processus

oxygène-dépendant de transport actif inhibé par addition de cyanure ou par compétition avec

d'autres dérivés hydrazides.35 Cependant des études plus récentes contestent ce processus

d'internalisation et suggèrent une diffusion passive de l'INH.36 Son action bactéricide est

extrêmement efficace sur les bacilles tuberculeux à multiplication rapide et poussant dans des

conditions de cultures optimales. Par contre, elle est moins efficace dans des conditions qui

ralentissent la croissance des bacilles telles que l'absence de nutriments préférentiels ou la

sous-oxygénation.35 L'effet de l'INH devient irréversible au bout de quelques heures, mais la

croissance même des bacilles n'est définitivement arrêtée qu'une génération après le début du

traitement.

Introduction

35

Des auteurs continuent à l'heure actuelle de travailler sur divers hydrazides analogues de

l'INH, dans le but de trouver de nouvelles molécules plus efficaces (notamment sur les

souches résistantes à l'INH).37 Cependant, aucun médicament n'est arrivé en clinique.

Depuis sa découverte, la compréhension du mode de fonctionnement de l'INH a fait

l'objet de nombreux travaux. Ainsi au fur et à mesure de l'avancement des connaissances en

particulier sur la génétique et la biochimie des mycobactéries, plusieurs hypothèses ou

modèles ont été proposés pour tenter d'expliquer le mode d'action de cette molécule. Au-delà

des effets pleiotropiques de l'INH chez le bacille, l'hypothèse la plus fréquemment avancée

pour expliquer son effet bactéricide est son action sur l'intégrité de la paroi bactérienne en

inhibant la biosynthèse des acides mycoliques. Ces derniers étant confinés essentiellement à la

paroi des mycobactéries, ils représentent donc des cibles spécifiques.

Bien que son mécanisme d'action au niveau moléculaire ne soit pas encore complètement

élucidé, il est maintenant largement admis que l'INH agit principalement par un processus

impliquant deux étapes intracellulaires, chacune d'elles faisant intervenir une ou plusieurs

enzymes de M. tuberculosis :

Une première étape d'activation de l'INH par la catalase peroxydase KatG, cette étape

sera détaillée dans le paragraphe III.1. de cette introduction.

Une seconde étape d'inhibition cellulaire constituée par l'interférence de la forme

activée de l'INH avec la biosynthèse des acides mycoliques. Cette étape sera décrite

dans le paragraphe III.2. de cette introduction.

III.1. Activation de l'INH et formation des adduits INH-NAD III.1.1. Activation enzymatique de l'INH par la catalase-peroxydase KatG

La protéine KatG

Le rôle essentiel de la protéine KatG dans l'action de l'INH contre M. tuberculosis a été

partiellement révélé peu de temps après l'introduction de l'INH dans les thérapies

antituberculeuses, lors des phénomènes de résistance. Lorsque que Middlebrook a isolé les

premiers mutants de M. tuberculosis résistants à l'INH à partir de patients traités avec de

l'INH en monothérapie, il a observé que la plupart des mutants hautement résistants avaient

perdu leur activité catalase-peroxydase.38

Ce n'est que 40 ans plus tard, en 1992, que la base moléculaire de ces observations a été

comprise. La découverte du gène katG qui code l'enzyme KatG de M. tuberculosis a permis à

Zang et al39 d'expliquer la relation entre résistance à l'INH et perte de l'activité catalase-

Introduction

36

peroxydase. Ils ont démontré que la sensibilité à l'INH pouvait être restaurée par introduction

du gène katG sauvage dans une souche INH-résistante, catalase-peroxydase-déficiente. Ainsi

la protéine KatG est indispensable à la sensibilité à l'INH qu'elle permet d'activer, cette étape

d'activation étant obligatoire pour provoquer la mort bactérienne.

Structure

Dans sa forme native, la protéine KatG de M. tuberculosis est, en solution aqueuse, sous

forme d'un dimère constitué de deux sous-unités identiques de 82 kDa chacune, soit un

enchaînement de 744 acides aminés. Elle appartient à la classe des hydroperoxydases I ou

catalase-peroxydase40 qui possède au sein de la même enzyme les activités catalase et

peroxydase. Ce type d'enzyme est distinct des catalases et peroxydases dites typiques qui ne

possèdent qu'une seule activité catalytique par enzyme.

La catalase-peroxydase n'est pas spécifique aux mycobactéries et existe dans de

nombreux microorganismes procaryotes sans qu'ils soient spécialement sensibles à l'INH.

Les propriétés catalytiques de ces enzymes sont liées à la présence du motif hème dans le

site actif : un ion fer(III) est complexé par un macrocycle tétrapyrrolique, la protoporphyrine

IX. Cette hémoprotéine fait intervenir une espèce fer-oxo de haut degré d'oxydation dans son

cycle catalytique. De plus, il a été montré que l'hème est à cheval sur les deux sous-unités

protéiques et que le fer possède une histidine comme ligand axial.41

Fonction

Cette enzyme joue un rôle déterminant dans la réponse au stress oxydatif. Ce stress peut

résulter de la génération continue d'espèces réactives de l'oxygène et/ou de l'azote par la

bactérie elle-même et/ou par l'environnement dans lequel vit la bactérie. Chez M. tuberculosis

la protéine KatG revêt une importance particulière car elle protège le bacille contre les effets

délétères des espèces réactives produites par l'hôte. Elle permet alors la survie du bacille

parasite en dégradant ces espèces nocives. Il a en effet été montré que KatG protège M.

tuberculosis aussi bien contre H2O2 que contre les peroxydes organiques.41

KatG peut fonctionner selon les deux modes catalase et peroxydase qui sont détaillés dans

le Schéma 4. Nous utiliserons les notations classiques de composés I et II pour décrire les

états successifs de l'enzyme.

Dans le mode catalase (Schéma 4 : voie 1 (R = H) et 2), KatG possède une forte activité

catalytique41 et joue un rôle classique mais néanmoins clé dans le contrôle de la concentration

de l'eau oxygénée dans les compartiments cellulaires. Son action permet d'éliminer H2O2 par

Introduction

37

réaction de dismutation en O2 et en H2O, là où elle n'est pas nécessaire ou bien est en excès.

M. tuberculosis est une bactérie aérobie stricte et a besoin de H2O2 comme cofacteur des

réactions catalysées par les peroxydases.

L'eau oxygénée est obtenue par réduction d'oxygène moléculaire prélevé dans le milieu

environnant. Le transfert d'un électron vers l'oxygène moléculaire forme l'anion superoxyde

O2•- qui est rapidement dismuté en O2 et H2O2. La réduction à un électron de H2O2 peut

conduire à la formation du radical hydroxyle HO• extrêmement réactif et très toxique

(Réaction de Fenton). Ces espèces radicalaires peuvent s'additionner sur des biomolécules

comme l'ADN ou les protéines et entraîner des dégâts irréversibles sur le métabolisme de la

mycobactérie. De plus c'est aussi par ce mécanisme via H2O2 que les bacilles phagocytés à

l'intérieur des macrophages sont détruits. Le contrôle de la quantité de H2O2 est donc

nécessaire pour la survie du bacille dans les macrophages.

N N

N NFeIII

HisKatG au repos

N N

N NFeIV

His

O

N N

N NFeIV

His

O

+

Composé I

Composé II

KatG au repos

KatG au repos

ROOH ROH

12

4

3

H2O2 H2O + O2

AH

H+ + A

H2O + AAH + H+

Schéma 4 : Cycle catalytique physiologique de KatG avec AH comme substrat ; mode

catalase 1 et 2 avec R = H ; mode peroxydase 1, 3 et 4.

Dans le mode peroxydase (Schéma 4 : voie 1, 3 et 4), KatG fonctionne comme une

peroxydase à large spécificité,41 capable d'accepter les électrons d'une grande variété de

donneurs tels que l'o-diasinidine ou le NAD(P)H et les utilise pour réduire H2O2 en H2O.42 Par

ce biais, la catalase-peroxydase joue un rôle de régulateur métabolique dans de nombreux

systèmes enzymatiques NAD(P)H-dépendants en contrôlant le rapport du cofacteur

réduit/oxydé.43 Enfin l'activité peroxydase de KatG est nécessaire pour activer l'INH,

probablement en radical isonicotinoyle et par conséquent pour inhiber la synthèse de la paroi

bactérienne (comme nous le verrons plus tard).

KatG est donc une enzyme bifonctionnelle avec un seul site actif, capable de catalyser de

manière sélective deux réactions très différentes (effet catalase ou oxydation peroxydasique).

Introduction

38

Les mécanismes d'oxydations de l'INH

Il est maintenant bien établi que l'INH est une prodrogue et requiert une activation

intracellulaire pour former une espèce active avant d'exercer un effet toxique sur les bacilles

tuberculeux. C'est la catalase peroxydase KatG qui est responsable de cette oxydation. Cette

particularité permet un ciblage spécifique des microorganismes à détruire, car eux seuls

possèdent le matériel enzymatique nécessaire à l'activation de l'INH. Ceci permet de

minimiser les effets secondaires potentiels dus aux dommages engendrés sur les cellules de

l'hôte.

Le mécanisme de l'activation oxydante de l'INH par KatG demeure encore un sujet à

débat du fait de la multiplicité des activités catalytiques de l'enzyme.

KatG est une enzyme multifonctionnelle et polyvalente capable, en plus de sa fonction

primaire de détoxification, d'activer l'INH selon plusieurs modes. Toutefois, malgré de

nombreux travaux, les données actuelles de la littérature ne permettent pas de désigner avec

certitude la voie d'activation préférentielle suivie par M. tuberculosis pour oxyder l'INH. En

effet, selon les conditions expérimentales in vitro, KatG semble adapter son activité et les

résultats obtenus ne sont pas toujours comparables. Le point sur lequel tout le monde

s'accorde est qu'in vivo, la bactérie est placée dans un environnement complexe, comportant

différentes variables (pH, présence de métaux, …), susceptible d'influencer directement le

mode de fonctionnement de KatG.

Les différentes voies proposées pour décrire l'oxydation de l'INH par KatG sont les

suivantes :

La voie catalase-peroxydase.41,44

La voie cytochrome "P450 like".43,45

La voie superoxyde-dépendante.46,47

La voie manganèse-peroxydase.48-50

Il faut noter que de nombreux système enzymatiques ont été utilisés comme modèle

d'étude du mécanisme d'oxydation de l'INH pour suppléer à la disponibilité problématique de

la protéine KatG : le cytochrome P450,51 la prostaglandine synthase,52 la myéloperoxydase,53

la peroxydase de raifort (HRP).52 Enfin, des systèmes non enzymatiques basés sur l'oxydation

de l'INH catalysée par des métaux (MnII le plus souvent) en présence d'oxygène moléculaire

ont également été utilisés,45,48,49 ainsi que, au laboratoire, l'oxydation par un complexe de

MnIII mimant l'activité manganèse-peroxydase de KatG (cf. paragraphe III.1.2.)

Introduction

39

Les produits d'oxydation de l'INH

Les espèces intermédiaires réactives

L'activation de l'INH conduit à la formation d'espèces activées responsables des effets

bactéricides.

Lors de son activation, l'INH passe par des intermédiaires réactionnels radicalaires et

ioniques avant de conduire à des produits d'oxydation stables. Ces produits, bien identifiés

(acide isonicotinique, isonicotinamide, isonicotynaldéhyde (Schéma 5) et 4-pyridylméthanol),

ne présentent pas, à concentration physiologique, de toxicité pour M. tuberculosis ni d'activité

inhibitrice de la synthèse des acides mycoliques (cible majeur de l'INH). Par contre les

espèces intermédiaires radicalaires et ioniques sont toxiques et non spécifiques dans la mesure

ou elles sont capables d'alkyler des macromolécules (protéines, saccharides, lipides ou acides

nucléiques).35,44

La formation d'un radical isonicotinoyle a été mise en évidence comme espèce réactive

dans l'action bactéricide de l'INH (Schéma 5).44 Ce radical apparaît comme l'intermédiaire

principal de l'oxydation de l'INH et est très probablement impliqué dans la formation de(s)

l'espèce(s) responsable(s) des effets bactéricides ou bactériostatiques.54

N

OHN NH2

Isoniazide

N

O

Radicalisonicotinoyle

+

N

O X-OH ac. isonocontinoique-NH2 isonicotinamide-H isonicotinaldéhyde

X =Oxydationpar KatG

Espèces non bactéricides

N

OHN NH

Schéma 5 : Produits et intermédiaires clés de l'oxydation de l'INH.

Formation des adduits INH-NAD

La proposition de mécanisme par lequel l'INH inhibe probablement InhA est "indirecte".

Après activation par KatG, la forme activée de l'INH se lie de façon covalente au NAD(H) et

un composé d'addition l'adduit INH-NAD est formé (Schéma 6).

Introduction

40

OO

N

NN

N

NH2

O P O P O N

O

NH2

ON

OHOHOH OH

OO

OH OHN

OHN NH2

Isoniazide

Espèce active de l'INH

Oxydationpar KatG

Adduit INH-NAD

NAD(H)

Schéma 6.

La prodrogue n'interagit pas directement avec l'enzyme, mais seulement à travers cet

adduit covalent qui serait le véritable responsable de l'inhibition compétitive d'InhA. La

démonstration de l'existence d'un complexe InhA-adduit INH-NAD a été obtenue par

résolution de la structure cristalline aux rayons X et études en spectrométrie de masse d'un tel

complexe (Figure 6).55

Figure 6 : Contacts moléculaires entre le site actif d'InhA et l'adduit INH-NAD(H) d'après

Sacchettini.55 Les chiffres représentent la distance (en angströms) entre les atomes sélectionnés (Ph = atome de phosphore).

En raison de sa localisation et de son orientation le motif isonicotinoyle interagit bien

avec les chaînes latérales des acides aminés du site actif. En effet, la chaîne latérale de la

Phe149, par une rotation de 90°, forme un stacking de type π-π avec le cycle pyridine de

l'adduit INH-NAD. Ce nouvel arrangement structural du site actif augmente l'affinité d'InhA

pour l'adduit INH-NAD (estimée à 100 nM56 ou 0,5 nM57 selon les auteurs; cet écart a été

Introduction

41

expliqué par un mécanisme de type slow tight binding,24 comme nous le verrons dans le

paragraphe III.2.1) par rapport au NADH (KmNADH = 8 µM58 ou 66 µM24).

Les données de la spectrométrie de masse de cet adduit sont en accord avec les résultats

cristallographiques puisqu'ils font état d'un incrément supplémentaire de masse de 106

(m/zadduit = 770 et m/zNADH = 664) correspondant au motif isonicotinoyle ajouté.55-57

Le complexe stœchiométrique InhA-adduit INH-NAD montre un pic d'absorption à 278

nm et un épaulement vers 326 nm, avec un rapport caractéristique A326/A278 de 0,16.57

Dans l'adduit INH-NAD, la configuration du carbone en position C4 du motif

nicotinamide est 4S ; c'est-à-dire que le motif isonicotinoyle occupe la même face que

l'hydrure transféré lors la réduction du substrat (trans-énoyl-ACP) par le NADH.22,55,56

L'inhibiteur INH-NAD libre possède un pic d'absorption à 260 nm (ε260 = 27 000 M-1.

cm-1) caractéristique des groupements aromatiques (adénine, pyridine) et un pic compris entre

326 et 333 nm (ε326 = 9600 M-1. cm-1) caractéristique du motif dihydropyridine.56,57

Mécanisme de formation des adduits INH-NAD

Il y a quelques années, trois hypothèses ont été envisagées dans la littérature pour

expliquer la formation de ces adduits INH-NAD : la première voie impliquait une réaction

d'addition de type ionique entre le dérivé NAD+ et le carbanion acyle de l'INH, la deuxième

supposait une réaction d'addition radicalaire entre le NAD• et le radical isonicotinoyle alors

que la troisième mettait en jeu une réaction d'addition "hybride" entre le cation NAD+ et le

radical isonicotinoyle suivie d'une étape de réduction à un électron pour conduire aux adduits

INH-NAD.

Parmi les trois scénarios proposés, pour la formation de ces adduits, ce sont les voies

impliquant le radical isonicotinoyle qui sont les plus admises aujourd'hui.

En 1998, Sacchettini est le premier à soutenir la deuxième voie.55 Pour cela, il se base sur

des études montrant que l'inhibition INH-dépendante d'InhA est plus rapide en présence de

NADH que de NAD+.59,60 De plus, il avance l'hypothèse que la formation du radical NAD•

peut être catalysée par la protéine InhA ou par le MnII/O2, ce dernier étant capable d'effectuer

une telle réaction avec l'INH.

Un an plus tard, Wilming et Johnsson56 proposent que l'addition du radical isonicotinoyle

se fasse directement sur la forme oxydée du cofacteur (NAD+) et soit suivie d'une réduction

du radical cation pour donner les adduits INH-NAD (Schéma 7). Des expériences de

formation des adduits INH-NAD en absence d'InhA ont conduit à l'observation de quatre

Introduction

42

isomères de même masse 770 par chromatographie liquide de haute performance couplée à la

spectrométrie de masse (HPLC-SM). Deux isomères peuvent être logiquement attendus

correspondant à l'attaque du radical isonicotinoyle sur l'atome C4 du NAD+ en solution sur les

faces re et si du noyau nicotinamide. Pour expliquer la formation des autres produits,

Wilming et Johnsson ont proposé l'hypothèse d'un stacking entre la purine et la partie

isonicotinoyle ou d'une hydratation de la fonction cétone. Nous verrons dans le paragraphe

suivant une explication proposée dans notre équipe mettant en jeu une cyclisation

intramoléculaire.

OO

N

NN

N

NH2

O P O P O N

O

NH2

ON

OHOHOH OH

OO

OH OHN

OHN NH2

Isoniazide

N

O

Radicalisonicotinoyl

Oxydationpar KatG

ou MnII / O2

1) NAD+

2) +1e-

Adduits INH-NAD

H4

Schéma 7 : Mécanisme de formation des adduits INH-NAD proposé par Wilming et

Johnsson.56

III.1.2. Activation chimique de l'INH par le pyrophosphate de MnIII

Oxydation biomimétique de l'INH par le pyrophosphate de MnIII

Les travaux effectués au laboratoire par Michel Nguyen au cours de sa thèse ont permis

de mettre au point un système d'oxydation in vitro de l'INH biomimétique de la catalase-

peroxydase KatG. Celui-ci utilise un complexe de MnIII pour mimer l'activité manganèse-

peroxydase de KatG. La réaction de l'INH avec le pyrophosphate de MnIII en présence de

cofacteur NAD+ ou NADH permet d'obtenir des adduits INH-NAD présentant les mêmes

données spectroscopiques (masse, UV)61,62 que ceux obtenus par réaction avec KatG.55-57 De

plus ces adduits sont aussi des inhibiteurs compétitifs de l'enzyme InhA.61,63

Le rendement de la réaction de formation de ces adduits est bien meilleur avec ce système

d'oxydation biomimétique qu'avec le système MnII/O2 et est comparable à celui obtenu avec

l'enzyme KatG (41%).56,57 Le pyrophosphate de MnIII présente deux intérêts par rapport au

système enzymatique : la réaction est considérablement accélérée (15 minutes au lieu de

plusieurs heures) et il permet d'éviter d'utiliser KatG dont la disponibilité est fluctuante. Ce

système chimique simple permet donc d'obtenir des adduits INH-NAD rapidement et avec un

bon rendement.

Introduction

43

Formation des adduits INH-NAD

Des études HPLC-SM61,62 ont permis une caractérisation plus précise des adduits formés

au cours de l'oxydation de l'INH par le pyrophosphate de MnIII en présence de NAD+ ou de

NADH. Les chromatogrammes ont en fait montré la présence de six produits (dont deux très

minoritaires) ayant une masse de 770 Da, quatre d'entre eux ayant la capacité de se

déshydrater dans le spectromètre de masse. La déshydratation se produit entre le OH en

position 7 et le NH, prouvé par des expériences de marquages isotopiques.62 Ces observations

ont permis de proposer l'existence en solution d'un pool d'adduit isomères : en plus des deux

composés de type céto-amides attendus 1 et 2, quatre autres composés de type hémiamidal

cycliques 3-6 sont obtenus, issus d'une cyclisation intramoléculaire (Figure 7).

N

O

NH2

ON

H

ADP-ribose

N

H

ADP-ribose

NH

NOH

O

N

H

ADP-ribose

NHHO

O

N

N

ADP-ribose

NH

N OH

O

N

ADP-ribose

NH

N

O

H

N

ADP-ribose

NH

N

O

H

1, 24S et 4R

3, 44S7R et 4R7S

5, 64S7S et 4R7R

7, 87S et 7R

9

4

7

4 4 4 4 4

7

7 7 7 7

Figure 7 : Structure des adduits INH-NAD 1-9 (seul les diastéréoisomères 4S7R et 4S7S des

composés 3, 4, 5 et 6 sont représentés).

La synthèse et la purification d'une quantité significative d'adduits INH-NAD par Sylvain

Broussy au cours de sa thèse ont permis la caractérisation par RMN 1H et 13C des adduits les

plus abondants : 1 et 2 céto-amides et 3 et 4 sous forme hémiamidal cycliques.64 La

stéréochimie relative des carbones 4 et 7 des molécules 3 et 4 a aussi pu être déterminée par

des expériences de ROE différence : les stéréoisomères 3 et 4 ont les deux noyaux

volumineux pyridine et dihydropyridine en trans du cycle pyrrolidinone. La stéréochimie

absolue a été déterminée par extrapolation des résultats enzymatiques (3 plus actif que 4) et

par référence à l'adduit cristallisé avec InhA (le 4S), il a donc été proposé que 3 ait également

une configuration 4S.

Dans le pool d'adduits INH-NAD analysé après purification, il est important de noter que

la paire d'isomères majoritaires en solution est de nature cyclique trans (les produits 3 et 4).

Deux produits d'évolution des adduits INH-NAD ont également pu être identifiés et

caractérisés par HPLC, HPLC-SM et RMN 1H et 13C.65 Il s'agit de produits d'oxydation 7/8 de

type hémiamidal (2 épimères) et du produit de déshydratation 9 qui se forment spontanément.

Les composés 7/8 avaient déjà été étudiés par Wilming et Johnsson,56 qui les avait décrits

Introduction

44

comme étant un produit unique de type céto-amide. En fait, le dédoublement des signaux

observé en RMN 1H par Wilming et Johnsson pour 7/8 a été expliqué par Broussy et al65

comme étant du à la présence de deux épimères formés par cyclisation intramoléculaire

menant à une structure de type hémiamidal cyclique et non à la formation de l'hydrate

correspondant ou encore d'une possible intéraction de type π-π stacking. Finalement, le

composé 9 provient d'une déshydratation des adduits cycliques 3-4 suivie d'une protonation.

Ces travaux montrent donc l'existence d'adduits INH-NAD cycliques majoritaires au sein

du pool d'adduits. Ce pool composé majoritairement de forme cyclique a été capable d'inhiber

efficacement l'enzyme InhA, alors qu'une structure ouverte a été proposée par Sacchettini

pour l'inhibiteur sur la base d'une étude de cristallographie par diffraction des rayons X.55 En

tenant compte de ces constatations, il serait légitime de s'interroger sur l'espèce responsable de

l'activité inhibitrice : espèce cyclique majoritaire en solution ou espèce ouverte observée dans

le cristal?

Formation des adduits INH-NADP

L'oxydation de l'INH par le pyrophosphate de MnIII permet la synthèse d'adduits avec

d'autres cofacteurs, notamment avec le NADP. Le pool d'adduits est constitué d'une famille

d'adduits presque identiques aux adduits INH-NAD (Figure 8) avec l'ADP(P)-ribose à la

place de l'ADP-ribose, ils seront notés 10 à 17. Ducasse-Cabanot et al66 ont montré que ces

adduits INH-NADP étaient des inhibiteurs de l'enzyme MabA de M. tuberculosis (cf. III.2.2.).

Récemment, Vilchèse et al ont montré que l'adduit INH-NADP ouvert 4R (11) inhibait la

dihydrofolate réductase (DHFR) de M. tuberculosis, une enzyme essentielle à la synthèse des

acides nucléiques (cf. III.2.3).67

N

O

NH2

ON

H

ADPP-ribose

N

H

ADPP-ribose

NH

NOH

O

N

H

ADPP-ribose

NHHO

O

N

N

ADPP-ribose

NH

N OH

O

10, 114S et 4R

12, 134S7R et 4R7S

14, 154S7S et 4R7R

16, 177S et 7R

4 44

4

7 77

7

Figure 8 : Structures des adduits INH-NADP 10-17 (seuls les diastéréoisomères 4S7R et 4S7S

des composés 12, 13, 14 et 15 sont représentés).

Introduction

45

Très récemment, Argyrou et al ont montré que le pool d'adduits INH-NADP était aussi un

inhibiteur compétitif d'InhA avec une constante d'inhibition apparente Ki = 265 nM

(supérieure à celle observé pour le pool d'adduit INH-NAD).68

III.2. Cibles moléculaires de l'INH activé III.2.1. Inhibition de l'enzyme InhA

Takayama et al69 ont été les premiers à montrer l'existence d'une corrélation directe entre

l'action de l'INH et la perturbation du métabolisme des acides mycoliques.70

Plus tard, la cible enzymatique de l'INH a été identifiée par des études génétiques en

utilisant un mutant de M. smegmatis INH-résistant et co-résistant à un antituberculeux

structurellement voisin : l'éthionamide (ETH).71 L'approche était basée sur l'idée que l'INH et

l'ETH inhibent une cible commune et que la résistance aux deux molécules impliquait

obligatoirement une altération de cette cible. Le mutant M. smegmatis INH- et ETH-résistant

isolé possède une mutation dans le gène inhA responsable de la substitution Ser94Ala dans

l'enzyme InhA. De plus, la surexpression du gène sauvage inhA confère aussi la co-résistance.

Ces découvertes ont conduit Banerjee et al à conclure que la résistance à l'INH peut se

produire soit en augmentant la concentration de la cible InhA, soit en altérant la cible, qui

n'est plus inhibée par l'INH activé. Dans les deux cas, la biosynthèse des acides mycoliques se

déroule normalement.

Cette étude, ainsi que la mise en évidence biochimique du rôle d'InhA dans l'élongation

des acides gras et/ou la synthèse des acides mycoliques22 concourt à lier "inhibition de la

synthèse des acides mycoliques" avec "inhibition d'InhA".

Des études récentes67 utilisant une méthode de "transduction linkage" spécialisée ont

permis de transférer, dans M. tuberculosis, l'allèle Ser94Ala d'InhA avec un seul point de

mutation à l'intérieur du gène inhA. Cet allèle InhA Ser94Ala est suffisant pour conférer un

niveau significatif de résistance à l'INH aussi bien en empêchant la mort des mycobactéries

que l'inhibition de la biosynthèse des acides mycoliques. Cette résistance corrélée à la

diminution de l'inhibition d'InhA par les adduits INH-NAD et les analyses cristallographiques

montrant la perte d'un réseau de liaisons hydrogènes (Figure 6) diminuant l'affinité, leur a

permis d'établir qu'InhA était une cible primaire pour l'action de l'INH dans M. tuberculosis.

Introduction

46

La protéine InhA

La protéine InhA est en solution sous forme d'un tétramère, constitué de quatre sous-

unités identiques de 28,5 kDa chacune (plus précisément 28368 Da) avec un coefficient

d'extinction molaire ε280 = 37,3 ± 0,2 mM-1. cm-1. La protéine est douée d'une activité énoyl-

ACP réductase NADH-dépendante, c'est-à-dire que chaque sous-unité peptidique possède un

site actif capable de fixer une molécule de NADH et une molécule de substrat énoyl-acyl

carrier protein (ACP). De plus, il existe un ordre de fixation préférentiel : le NADH se fixe en

premier suivi par le substrat à réduire.22

La cible de l'INH, comme mentionnée ci-dessus, est une énoyl-ACP réductase NADH-

dépendante qui est codée par le gène inhA. Dans son mode de fonctionnement physiologique,

l'enzyme InhA catalyse spécifiquement la réduction de la double liaison trans en position 2

des substrats à longue chaînes (C16 ou plus) énoyl thioester (Schéma 8).22,58

N

NH2

ADP-ribose

OHs Hr

S

O

C8C16

HNH2

Lys165

NADH

N

NH2

ADP-ribose

O

S

O

C8C16

NH2

Lys165

H

H

AH

NAD+

N

NH2

ADP-ribose

O

S

O

C8C16

NH2

Lys165

H

H

InhA

C8-C16 énoyl-ACP

4

3

ACPACPACP

Schéma 8 : Mécanisme de réduction du substrat catalysée par l'énoyl-ACP réductase

NADH-dépendante InhA d'après Quémard et al.22

Ce mécanisme chimique implique le transfert stéréospécifique de l'hydrure 4S du NADH

sur la position C3 (en β du carbonyle) du substrat 2-trans-énoyl-ACP, suivi de la protonation

en C2 de l'intermédiaire énol. Les produits issus de cette catalyse sont alors utilisés par la

bactérie pour former des acides mycoliques à très longues chaînes (C40 à C60), qui sont des

éléments indispensables à l'édification de la paroi mycobactérienne.15,20

Etude de l'inhibition

Comme nous l'avons observé précédemment, la protéine InhA constitue une cible de

l'INH car elle est inhibée par les adduits INH-NAD. La disponibilité de cette enzyme obtenue

par génie génétique a permis de nombreuses études mécanistiques.

Introduction

47

La réaction d'inhibition d'InhA par l'INH (en réalité par les adduits INH-NAD formés

secondairement) peut être réalisée in vitro en utilisant l'enzyme purifiée.41,59,60

Principe

InhA est une réductase NADH-dépendante des substrats énoyl-ACP et consomme donc

du NADH pour leur réduction. Cette dernière est aisément suivie par spectroscopie UV-

visible, par décroissance de l'absorption à 340 nm de la forme réduite du cofacteur (NADH).

Si un inhibiteur compétitif est présent, il se lie au site actif d'InhA et empêche le

fonctionnement normal de l'enzyme. La consommation de NADH est suspendue et

l'absorbance à 340 nm ne décroit pas.

Des tests d'inhibition ont été réalisés dans lesquels l'INH est activé par MnII/O2 en

présence de NADH et d'InhA. Cette inhibition a la particularité d'être lente, il faut en effet

cinq heures de préincubation pour observer une perte d'activité d'environ 80%. L'addition de

KatG accélère l'inhibition d'InhA (environ 2 h pour 80% d'inhibition) éventuellement via un

processus d'oxydation du MnII en MnIII de type manganèse peroxydase.49

D'autres tests ont été réalisés en préformant les adduits, afin de vérifier qu'ils se forment

en absence d'InhA.56 Des tests ont aussi été réalisés au sein du laboratoire, sur un pool

d'adduits préformé via l'activation de l'INH par du pyrophosphate de MnIII et purifié avant

utilisation.63 Certains adduits ont même pu être testés séparément, comme les adduits

cycliques majoritaires 3 et 4 qui ont été testés indépendamment.

Affinité des adduits INH-NAD pour InhA

Les constantes d'affinités mesurées diffèrent selon les auteurs : Kd < 0,4 nM pour Lei et

al57 et KI = 100 ± 50 nM pour Wilming et Johnsson.56 Tonge propose une inhibition de type

"slow-binding",24 c'est-à-dire un premier complexe EI (Enzyme-Inhibiteur) se forme

rapidement et se transforme lentement en un second complexe EI* (Enzyme-Inhibiteur*) ou

l'inhibiteur est beaucoup plus fortement lié à l'enzyme. Il détermine ainsi une première

constante K -1 = 13 nM qui représente la fixation initiale faible et une deuxième constante

globale qui prend en compte la fixation plus lente et plus forte de l'inhibiteur : Ki = 0,75 nM.

La CI50 du pool d'adduits déterminée au laboratoire est de 1 à 2 µM,63 ce qui est cohérent avec

les résultats précédents. Les adduits séparés ont des pouvoirs inhibiteurs différents. En effet,

les deux adduits cycliques majoritaires 3 et 4 ont pu être séparés et testés individuellement. Le

composé 3 est plus actif que le 4, il a donc été proposé une configuration 4S pour le 3 et 4R

Introduction

48

pour le 4, sur la base des données cristallographiques.55 Par contre les adduits oxydés 7/8 sont

dépourvus d'activité inhibitrice sur InhA.56

Il est intéressant de signaler que récemment Rawat et al ont publié que l'adduit BH-NAD

(Figure 9), dérivé de l'hydrazide de l'acide benzoïque et non de l'INH, est aussi un bon

inhibiteur d'InhA.24 Le remplacement du motif pyridine par un phényle ne semble pas affecter

l'activité de l'adduit.

OO

N

NN

N

NH2

O P O P O N

O

NH2

O

OHOHOH OH

OO

OH OH

H

Figure 9 : Structure de l'adduit BH-NAD

Lieu de formation des adduits INH-NAD

Le lieu de formation des adduits INH-NAD fait encore l'objet de débat : au sein du site

actif de l'enzyme InhA, au sein du site actif de l'enzyme KatG ou en dehors?

Sacchettini55 propose que la préfixation du NADH dans le site actif d'InhA précède et

oriente l'addition de la forme activée de l'INH. Son argumentation repose sur les constatations

suivantes :

- Le phénotype de résistance à l'INH peut être causé par une mutation dans le gène inhA,

réduisant l'affinité de l'enzyme pour le NADH, principalement par la substitution d'un acide

aminé situé dans le site de fixation du NADH. C'est par exemple le cas du mutant Ser94Ala58

qui se distingue du sauvage par une différence d'affinité pour le NADH (8 µM pour WT

contre 32 µM pour Ser94Ala), alors que les autres paramètres enzymatiques ne sont pas

altérés de manière significative (Vmax par exemple).

- Dans la situation d'un phénotype sauvage, la plupart des enzymes InhA comportent

statistiquement une molécule de NADH liée au site actif.

- L'inhibition du mutant InhA Ser94Ala se produit uniquement si la concentration en NADH

est augmentée,72 ce qui implique une corrélation entre la capacité de l'enzyme à fixer le

NADH et à être inhibée par l'INH activé.

Cependant, la diminution d'affinité d'InhA pour le NADH implique probablement une

diminution d'affinité pour l'adduit INH-NAD, ce qui expliquerait plus simplement les

observations ci-dessus.

Introduction

49

En 1999, Wilming et Johnsson56 proposent que la formation des adduits INH-NAD se

déroule à l'extérieur du site actif d'InhA et par réaction avec NAD+ au lieu de NADH. Ils

observent en effet une inhibition d'InhA par des adduits préformés en absence de l'enzyme.

De plus, dans des conditions physiologiques, NAD+ est le plus souvent à l'extérieur du site

actif de InhA ( +NAD mK = 4 mM),22 facilitant l'attaque de l'INH activé. Les adduits INH-NAD

résultants, du fait de leur forte affinité pour InhA (Ki INH-NAD < Km NADH < Km substrat énoyl-ACP <

+NAD mK )58 entraînent l'inhibition compétitive de l'enzyme. Par contre, pour les mutants inhA à

phénotype INH-résistant, la résistance n'est pas liée intrinsèquement à la mutation elle-même,

puisque l'adduit est formé à l'extérieur, mais à la diminution de la quantité de NAD+

intracellulaire. Il a en effet été observé que certains de ces mutants possédaient aussi une

défaillance dans le fonctionnement des NADH-déhydrogénases73 et conduisant à la

surexpression de la protéine fixant le NAD+.74 La chute de la quantité de cofacteur oxydé

NAD+ disponible conduirait donc à une raréfaction des adduits menant à la co-résistance à

l'INH et à l'éthionamide.

La possibilité de préformer le (ou les) inhibiteur(s) en absence d'InhA ainsi que la faible

durée de vie du radical isonicotinoyle semblent être des arguments décisifs pour invalider

l'hypothèse de formation des adduits à l'intérieur du site actif d'InhA. Une étude récente vient

accentuer l'invalidation de cette théorie. Singh et al ont démontré que KatG a une activité

NADH-oxydase et que KatG a en plus de son activité d'hydrazinolyse de l'INH, un rôle direct

dans la formation des adduis INH-NAD.75 En effet, l'analyse des produits formés lors de son

fonctionnement en présence d'INH et NADH, a montré que se sont les adduits INH-NAD et le

NAD+ qui sont majoritairement retrouvés.

III.2.2. Inhibition de l'enzyme MabA

La protéine MabA

La séquence du gène mabA (ou fabG1) codant pour la protéine MabA (ou FabG1) a été

identifiée pour la première fois en 1994 par Banerjee et al.71 Cette séquence est organisée en

opéron avec le gène inhA sur le chromosome de M. tuberculosis. Des études réalisées à

Toulouse ont permis de montrer que MabA possède une masse apparente de 27729 Da et est

présente sous deux formes en solution, dimérique minoritaire et tétramérique majoritaire.76

La protéine MabA appartient au système FAS-II (Schéma 1) mycobactérien et catalyse la

réduction NADPH-dépendante des dérivés β-cétoacyls (Schéma 9). L'activité catalytique est

meilleure avec des substrats à chaînes longues mais observable même avec des substrats à

Introduction

50

chaînes courtes : Km est d'environ 1530 µM pour l'acétoacyl-CoA (C4) et de 8 µM pour le β-

cétododécanoyl-CoA (C12).

N

NH2

ADPP-ribose

OHs Hr

NADPH

N

NH2

ADPP-ribose

OH

NADP+

MabA

β-cétoacyl-CoA

R S

O O

CoA

AH

R S

OH O

CoA

R = CH3-(CH2)n-n = 0, 4, 8, 12, 16

β-hydroxyacyl-CoA

Schéma 9 : Mécanisme proposé de la réduction des substrats β-cétoacyl-CoA par MabA.76

Etude de l'inhibition66

Le suivi de l'inhibition de l'activité de l'enzyme est réalisé de la même manière que pour

InhA : par spectrométrie UV à 340 nm, longueur d'onde à laquelle absorbe le NADPH

transformé au cours de la réaction en NADP+. Les adduits INH-NADP (cf. III.1.2.) possèdent

une activité inhibitrice vis-à-vis de MabA, avec une CI50 ~ 2 µM pour le pool d'adduit. Les

adduits séparés ont des pouvoirs inhibiteurs différents et l'adduit oxydé 7' possède l'activité

inhibitrice la plus grande. Il est intéressant de noter que les adduits INH-NAD ont aussi une

activité inhibitrice, bien que plus faible (CI50 ~ 13 µM pour MabA alors que pour InhA CI50 ~

1 à 2 µM).

Enfin, l'inhibition est obtenue par des milieux réactionnels préparés en présence de MabA

et par des adduits préformés sans MabA, ce qui montre que la (ou les) molécule(s)

inhibitrice(s) peut(vent) être formée(s) à l'extérieur du site actif de MabA.

III.2.3. Autres cibles (KasA et DHFR) et effets pléiotropiques

Cibles spécifiques :

La protéine KasA

Une autre cible potentielle de l'INH, impliquée dans la biosynthèse des acides mycoliques

a été révélée en 1998 par Mdluli et al77. Il s'agit de la β-cétoacyl-ACP synthase KasA, qui tout

comme InhA et MabA fait partie du système FAS-II (Schéma 1). Ces chercheurs ont mis en

évidence la formation d'un complexe tri-moléculaire constitué d'INH, de KasA et d'AcpM

(petite protéine chargée du transport des chaînes d'acide gras en élongation, on parle alors

"d'acyl carrier protein" ou ACP). Il a été proposé que l'INH activé sous forme isonicotinoyle

soit lié de façon covalente à l'AcpM.

Introduction

51

Ces travaux permettent d'expliquer en partie certains points expérimentaux restés sans

réponse, comme l'accumulation d'acides gras saturés lorsqu'InhA est inhibée ou le fait que les

mutations dans les gènes de katG et inhA, ne sont pas à elles seules suffisantes pour justifier

toutes les résistances observées.

Cependant, si d'une part il semble bien que l'INH activé se lie au complexe KasA, d'autre

part il n'y a pas actuellement de démonstration expérimentale d'une activité inhibitrice sur

cette protéine ni d'une induction de la mort de la bactérie par un tel mécanisme.78

L'enzyme dihydrofolate réductase (DHFR)

Il a récemment été montré que l'adduit ouvert INH-NADP 11 (4R) (Figure 10) était

capable d'inhiber la dihydrofolate réductase DHFR de M. tuberculosis.79

OO

N

NN

N

NH2

O P O P O N

O

NH2

ON

OHOHO OH

OO

OH OH

H

P OHOOH

11

4

Figure 10 : Adduit INH-NADP 11 (4R).

La DHFR est une enzyme indispensable à la biosynthèse des acides nucléiques. En effet,

son rôle physiologique premier est le maintien du niveau intracellulaire en tétrahydrofolate,

un des précurseurs des cofacteurs requis pour la biosynthèse des purines, pyrimidines et

divers aminos acides.80

L'adduit INH-NADP 11 (4R) est un inhibiteur subnanomolaire de la DHFR de M.

tuberculosis. La structure cristalline de la DHRF de M. tuberculosis complexée avec cet

adduit révèle les bases structurales de cette inhibition.79

Cibles non spécifiques : effets pleiotropiques

En plus de l'inhibition spécifique de la synthèse des acides mycoliques qui constitue la

composante majeure de l'action de l'INH, il existe d'autres évènements, directement ou non

liés à la présence de la prodrogue, étant pour la plupart postérieurs à la perte de l'intégrité

membranaire et dont les effets additifs accélèrent la lyse bactérienne.

Bien que l'INH soit une prodrogue, il est cependant parfois capable d'inhiber certaines

métallo-enzymes. Cette action directe de l'INH est due à sa capacité à complexer certains

métaux comme le fer ou le cuivre et donc par extension à chélater le métal de certaines

Introduction

52

métallo-enzyme avec pour conséquence une limitation ou une disparition de leur activité. Ce

phénomène a été observé pour le cytochrome P450,51 enzyme essentielle dans les phénomènes

de détoxification. L'analyse de composés structurellement voisins de l'INH indique que la

partie hydrazine et le noyau aromatique sont tous deux nécessaires à la complexation et donc

à l'inhibition.

Cependant, les métallo-enzymes d'autres espèces de bactéries ou d'origine animale sont

susceptibles de subir le même phénomène : il n'est donc pas spécifique aux mycobactéries. De

plus, d'autres hydrazides comme l'hydrazide de l'acide nicotinique sont d'aussi bons chélateurs

que l'INH sans en posséder l'activité antituberculeuse.

Une fois formées, les espèces intermédiaires radicalaires, issues du métabolisme oxydatif

de l'INH comprenant à la fois les dérivés transitoires de la prodrogue et les radicaux libres

(tels que OH•, H•, O2•-), constituent des composés potentiellement actifs contre les diverses et

multiples cibles intrabacillaires. Leurs interactions engendrent des dommages irréversibles sur

les macromolécules et contribuent alors à la mort de la bactérie. Ainsi, des effets variés

résultant de l'interaction avec des protéines ou des acides nucléiques ont été décrits.35 Ce

phénomène est bien admis pour les dérivés de l'hydrazine, connus pour être des substances

mutagènes et cancérigènes via leur métabolisation oxydative in vivo.52

De plus, les radicaux générés au cours de l'oxydation de l'INH peuvent dégrader l'hème de

la peroxydase, indiqué par la disparition de la bande de Soret et des bandes mineures dans la

région visible du spectre UV-visible.81 Ceci induit la perte de l'activité catalase de la catalase-

peroxydase, traduit par une surconcentration de H2O2 intracellulaire. En présence de plusieurs

catalases (catalase et catalase-peroxydase, par exemple), comme c'est le cas chez les bactéries

saprophytes et atypiques,82 l'inhibition de l'une d'entre elles n'est pas suffisante pour conduire

au même phénomène que chez M. tuberculosis, n'en possédant qu'un seul type. La molécule

H2O2 n'étant que peu toxique, les dommages qu'elle crée sont imputables pour l'essentiel à sa

réduction en présence de FeII pour donner des radicaux hydroxyles HO• (réaction de Fenton).

Ce constat peut en partie expliquer la spécificité d'action de l'INH vis-à-vis des mycobactéries

qui ne possèdent qu'un seul type de catalase.

D'autres évènements indirects, comme la formation de pigments colorés (jaune), ont été

révélés par Youatt.35 Ces pigments, dont la nature chimique exacte n'a pas encore été

élucidée, résulteraient de l'oxydation de l'INH, uniquement en présence de NAD(H). Ces

pigments ne sont pas observés lorsque le gène katG est muté (phénotype INH-résistants) ou

lorsque d'autres hydrazides ou antibiotiques sont utilisés.

Introduction

53

Cependant, l'implication de ces pigments en tant qu'agents responsables de l'activité

bactéricide de l'INH semble peu probable. En effet, ils ne sont observés que pour des

concentrations en INH bien supérieures à la CMI (de 100 à 1000 fois) et uniquement pour des

bacilles poussant sur certains milieux nutritifs.

Certains des produits d'oxydation stables de l'INH, comme l'acide isonicotinique,83

peuvent altérer le métabolisme normal des bactéries. L'acide isonicotinique est très similaire

structurellement à l'acide nicotinique, un précurseur important du NAD(H). A pH

intrabacillaire (pH ~ 6,5), il est presque complètement ionisé (pKa = 4,8) et ne peut donc plus

quitter la cellule. Son accumulation peut conduire à la production d'iso-NAD(H), comme

cofacteur non-fonctionnel de multiples systèmes enzymatiques. Un tel phénomène d'inhibition

n'a été détecté que tardivement après le traitement par l'INH.

Bien sûr, d'autres évènements ont été décrits, mais en l'absence d'éléments expérimentaux

décisifs permettant une vision générale du rôle de l'INH, ils ne seront pas discutés ici.

IV. Résistance à l'INH Une meilleure compréhension des mécanismes de résistances à l'INH dans M.

tuberculosis pourrait donner des informations capitales pour le développement de nouveaux

agents antituberculeux capables de contourner et contrôler ces résistances. C'est dans cet

objectif que de nombreuses équipes identifient et caractérisent les bases moléculaires des

résistances sur des isolats cliniques de M. tuberculosis.

La résistance à l'INH serait contrôlée par un système génétique complexe impliquant

plusieurs gènes : katG, inhA, ahpC et ndh. De 40 à 95% des isolats cliniques de M.

tuberculosis INH-résistants présentent des mutations sur le gène katG codant pour la catalase

peroxydase KatG, alors que seul 5 à 20% ont des mutations sur le gène inhA codant pour

l'énoyl-ACP réductase InhA. M. tuberculosis peut compenser la perte d'activité de KatG,

causée par des mutations sur katG, en sur-exprimant le gène ahpC (codant pour une alkyle

hydroperoxyde réductase). Les mutations dans ndh, un gène codant pour une NADH-

déshydratase, altèrent la proportion NADH/NAD et permettent une protection contre la

toxicité de l'INH. Des mutations de 16 autres gènes ont été rapportées et associées à la

résistance à l'INH dans les isolats cliniques. Cependant, le rôle de ces gènes n'est pas encore

bien défini. De plus, il y a approximativement 10 à 25% de souches résistantes à l'INH qui ne

contiennent aucune mutation dans les gènes connus pour conduire à une résistance à l'INH.84

Introduction

54

Dans ce paragraphe, nous nous intéresserons uniquement aux mutations bien connues et

bien étudiées qui sont les plus nombreuses, c'est-à-dire sur les gènes katG et inhA. Seules les

mutations dont le lien avec la résistance à l'INH a été étudié seront décrites dans ce

paragraphe.

IV.1. Mutation dans katG La majorité des isolats cliniques de M. tuberculosis résistants à l'INH ont montré des

mutations sur le gène de katG.

Les études structurales comparatives de la cytochrome c peroxydase (CcP) de levure et de

KatG sur la base d'une identité de 30% entre les deux protéines85 ont montré que le site de

fixation du coenzyme héminique est localisé dans la région N-terminale de la protéine

mycobactérienne.

Les mutations ou délétions partielles ou totales du gène katG peuvent entraîner un

phénotype de résistance à l'INH. En effet, KatG est essentielle dans l'activation du

bioprécurseur INH et donc indispensable à son action bactéricide. Les délétions, bien que

rares, sont en général responsables de l'émergence de souches de bacilles très hautement

résistantes à l'INH. Cependant, ce sont les mutations qui constituent la plus grosse partie des

altérations rencontrées sur ce gène. Le site actif de la catalase péroxydase étant localisé dans

la partie N-terminale de la protéine, toute modification génétique de cette région entraîne

inévitablement une importante décroissance ou annihilation de l'activité enzymatique, et par

conséquent une résistance à l'INH.85

Les deux mutants les plus fréquemment rencontrés dans les isolats cliniques de patients

résistants à l'INH sont ceux portant la substitution Ser315Thr (environ 50% des cas) et la

substitution Arg463Leu (environ 30% des cas). Les premiers mutants sont caractérisés par

une enzyme incapable d'activer l'INH tout en conservant une activité catalase peroxydase

affaiblie.86-88 Ainsi, l'enzyme permet une haute résistance à l'INH tout en maintenant un

niveau de protection suffisant contre le stress oxydatif. L'explication de ces propriétés pourrait

résider dans les différences stériques et électroniques au niveau de l'hème,89 ou plus

vraisemblablement résulter d'une diminution de l'affinité de l'enzyme pour l'INH.87,88,90,91 La

mutation résultant de la substitution de l'Arg463 par la Leu n'affecte pas l'activité

enzymatique de KatG.86 Comme la modification se situe dans la partie C-terminale de la

protéine, elle n'affecte pas la partie catalytique de l'enzyme. Elle se traduit par une faible

Introduction

55

résistance à l'INH92 et est même retrouvée sur des souches sensibles,93 elle est donc assimilée

à un polymorphisme naturel plus qu'à une mutation responsable du phénotype INH-résistant.

De nombreuses autres mutations sont connues. Par exemple, Wei et al94 ont produit et

purifié six nouvelles variantes de KatG identifiées dans des isolats cliniques de M.

tuberculosis (Ala110Val, Ala139Pro, Ser315Asn, Leu619Pro, Leu334Phe, Asp735Ala). Mis à

part Ala110Val, tous ces mutants présentent des activités catalase et peroxydase faiblement

réduites par rapport à KatG natif mais ont une capacité beaucoup plus faible à oxyder l'INH

pour produire les adduits INH-NAD (capacité qui est même complètement annulée dans le cas

de Ser315Asn et Leu619Pro).

Un mutant Tyr229Phe a été préparé par Magliozzo95 dans le but d'étudier le rôle de la

tyrosine 229 de KatG. L'activité catalase de ce mutant est extrêmement réduite alors que son

activité peroxydase est augmentée.

De nombreuses autres mutations ont été identifiées, cependant leurs expressions,

productions et purifications pour leurs études n'ont pas encore été réalisées. Elles ne seront

donc pas présentées ici par manque d'information sur leur association à la résistance à l'INH.

Finalement, une majorité des résistances à l'INH observées dans les isolats cliniques résulte

d'une mutation de KatG96 et donc de l'absence d'activation du médicament. En effet, la

prodrogue n'étant plus activée, les adduits INH-NAD ne se forment pas et il n'y a donc plus

d'inhibition des cibles qui entrainait la mort des mycobactéries. Des molécules capables

d'inhiber ces cibles, en particulier InhA, sans nécessiter d'étape d'activation par KatG,

représenteraient un grand intérêt dans la lutte contre la tuberculose MDR (multi-drug

resistant).

IV.2. Mutation dans inhA Outre les mutations dans le gène katG, les mutations dans le gène inhA peuvent elles aussi

rendre compte de la résistance à l'INH.

Des mutations ont été retrouvées soit dans la région codante du gène inhA, soit dans son

promoteur (le plus couramment identifié).

Une mutation dans la région de sur-régulation de inhA va entraîner une surexpression de

l'enzyme InhA et induire une résistance à l'INH par un mécanisme de titration.97 La mutation

la plus commune sur le promoteur d'inhA est la -15C→T. Cependant, cette mutation seule,

sans mutations dans katG, n'est associée qu'à une faible résistance à l'INH.98,99 Les trois autres

Introduction

56

mutations au niveau du promoteur d'inhA les plus souvent identifiées sont les -8T→A/C,

-17→T et -22G→C.84,99

Plusieurs substitutions d'acides aminés ont aussi été identifiées à partir d'isolat cliniques

de patients infectés par des bactéries résistantes (Tableau 1).

Substitution d'acides aminés Paires de base changées

Ile16Thr

Ile21Val

Ile47Thr

Val78Ala

Ser94Ala

Ile95Pro

Ile194Thr

ATC→ACC

ATC→GTC

ATT→ACT

GTG→GCG

TCG→GCG

ATT→CCT

ATC→ACC

Tableau 1 : Mutations et acides aminés modifiés sur InhA.84,100

Bien sûr, aucune de ces mutations dans le gène inhA n'a été rencontrée sur des souches

sensibles à l'INH. L'ensemble de ces mutations résulte d'une simple substitution d'acides

aminés localisés à l'intérieur ou proche du site de fixation du NADH. Les acides aminés Ile16

et Ile47 sont du coté du motif adénosine mais ne sont pas en interaction directe avec le

NADH. L'Ile21 est en interaction, par liaison hydrogène, avec un atome d'oxygène du pont

diphosphate. La Ser94 intervient par un réseau de liaisons hydrogènes ordonnées bien

organisées avec une molécule d'eau (eau 501) qui interagit elle aussi avec un atome d'oxygène

du pont diphosphate. L'Ile95 interagit avec l'hydroxyle en 3' du ribose du nicotinamide alors

que l'Ile194 forme des liaisons hydrogènes avec la fonction amide du nicotinamide (Figure

11).

Les enzymes mutantes Ile16Thr, Ile21Val, Ile47Thr, Ser94Ala, Ile95Pro et Ile194Thr ont

été produites et purifiées pour réaliser des études cinétiques. Toutes ont montré des

caractéristiques communes :100,101

- La diminution de l'affinité de InhA pour le NADH (augmentation du Km NADH de 2 à 12 fois ;

le Km (µM) est égal à 56 ± 4 ; 149 ± 10 ; 104 ± 7 ; 243 ± 25 ; 662 ± 11 pour InhA WT ;

Ile16Thr ; Ile21Val ; Ile47Thr et Ile95Pro respectivement).

- Par contre, la vitesse de réduction du substrat énoyl-ACP n'est pas affectée. Vmax est

inchangée, sauf pour le mutant Ile95Pro où 85% de réduction est observée.

- L'enzyme possède toujours une activité catalytique mais celle-ci est réduite.

Introduction

57

ILE 47ILE 16

GLY 14

ILE 21

ILE 95

SER 94

ILE 194

H2O 501

NAD

3,2 Å

ILE 47ILE 16

GLY 14

ILE 21

ILE 95

SER 94

ILE 194

H2O 501

NAD

3,2 Å

Figure 11 : Structure du complexe InhA-NAD, 58 sont représentés les acides aminés retrouvés

dans des isolats cliniques de patients atteints par une tuberculose INH-résistante.

De plus, l'étude de la cinétique d'inactivation d'InhA WT (Wild Type, natif), Ile21Val et

Ile95Pro par l'INH activé par KatG a montré une diminution de la vitesse d'inactivation pour

les mutants par rapport à l'enzyme native.

Dans le mutant Ser94Ala, un réseau de liaison hydrogène entre l'enzyme et le NADH

disparaît, ce qui a pour conséquence d'augmenter le Km pour le NADH (Km InhA WT = 8 ± 1 µM

et Km InhA Ser94Ala = 38 ± 2 µM). De plus, l'inhibition du mutant ne peut avoir lieu qu'en

augmentant la concentration en NADH.22,55,58

Afin de comparer les mécanismes moléculaires soulignant l'affinité du ligand (NADH)

pour InhA WT, Ile21Val et Ile16Thr et d'identifier les aspects moléculaires rendant compte

des résistances, des simulations de dynamique moléculaire ont été réalisées.102 Bien que très

flexible, au sein du complexe InhA WT-NADH, la molécule de NADH garde une

conformation étendue solidement liée au site de fixation du NADH. Par contre, dans les

complexes avec les mutants, le motif pyrophosphate subit un changement conformationnel

important, réduisant les interactions avec le site de liaison et indiquant probablement la phase

initiale d'expulsion du ligand de la cavité.

Des études cristallographiques et cinétiques sur les mutants Ser94Ala, Ile47Thr et

Ile21Val, réalisées par Oliveira et al103 ont montré elles aussi, que la différence structurale la

plus importante était localisée dans le site de liaison du NADH. De plus, les constantes de

vitesse de dissociation du NADH sont entre 5 et 11 fois plus grandes pour les mutants que

pour l'enzyme native (kWT = 6,1 ± 0,4 s-1 ; kIle21Val = 68 ± 1 s-1 ; kIle47Thr = 30 ± 2 s-1 et kSer94Ala

= 62 ± 1 s-1).

Introduction

58

Cependant, Rawat et al avait montré en 2003, que bien que la constante de dissociation

pour l'interaction entre le NADH et InhA augmente beaucoup pour les mutant Ile21Val,

Ile47Thr et Ser94Ala par rapport à l'enzyme WT, il n'y a pas d'altération significative

d'affinité entre les adduits INH-NAD et les enzymes.24

Dans l'étude du mécanisme catalytique d'InhA, le mutant Tyr158Phe a montré une

diminution importante de l'activité catalytique de l'enzyme.104,105 Mais surtout, cette mutation

engendre une diminution importante de la sensibilité à l'INH et l'augmentation de la

concentration en NADH ne permet pas de récupérer l'inactivation de l'enzyme. De plus, le

mutant Tyr158Phe lie le NADH plus fortement que l'enzyme WT. Dans ce mutant, qui n'a

jamais été observé sur des isolats cliniques, la résistance à l'INH ne vient probablement pas de

la diminution de la liaison du NADH.

Les mutants Ala124Val et Met161Val d'InhA, corrélés à la résistance de M. smegmatis au

triclosan (inhibiteur d'énoyl-ACP réductase, largement employé comme antibactérien dans de

nombreux produits d'utilisation quotidienne cf. V.2.1.), ont aussi été étudiés par Parikh et

al.104,105 Dans une étude in vitro d'inactivation par les adduits INH-NAD, il a été montré que

ces mutants sont moins sensibles à l'INH que l'enzyme WT. Ceci laisse envisager que les

mutations résultant de la surexposition au triclosan pourraient compromettre l'efficacité in

vivo de l'INH comme antituberculeux.

Comme nous l'avons vu, une grande partie des mutations d'InhA liées à une résistance à

l'INH sont localisées dans le site de fixation du cofacteur. Des molécules capables d'inhiber

InhA mutée, c'est-à-dire ayant moins d'interaction avec le fond de la poche de fixation du

NADH (vers l'adénosine diphosphate) mais d'autres affinités, seraient de bons candidats pour

de nouveaux antituberculeux.

V. Autres énoyl-ACP-réductases et leurs inhibiteurs La majorité des bactéries possède un système FAS-II (Schéma 1) et donc une énoyl-ACP

réductase (FabI) pour synthétiser des acides gras.

Bien qu'il ait été démontré à plusieurs reprises que les énoyl-ACP réductases (FabI),

appartenant au système FAS-II, étaient des cibles intéressantes pour de nouveaux agents

antibactériens, seules quelques équipes ont étudié leurs inhibiteurs.106 En effet, ces enzymes

Introduction

59

sont essentielles pour la croissance de nombreuses espèces pathogènes (par exemple :

Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis) ou encore du parasite Plasmodium

falciparum, et n'ont pas d'homologues significatifs chez les mammifères. Elles participent à la

biosynthèse des acides gras indispensables à la paroi bactérienne et catalysent l'étape finale

d'élongation de ces acides gras qui est la réduction de la double liaison du 2-trans-énoyl-ACP

comme le fait InhA (Schéma 6).

On compte environ une dizaine de familles d'inhibiteurs d'énoyl-ACP réductases qui ont

une activité sur un plus ou moins grand nombre de bactéries. Deux sont utilisés fréquemment,

d'une part l'INH et d'autre part le triclosan qui est un agent antibactérien et antifongique à

large spectre. D'un point de vue structural, ces différentes familles d'inhibteur ne présentent

pas beaucoup de points communs entre elles si ce n'est d'être généralement pourvues de

structures aromatiques. Cependant, ces composés peuvent être classés dans trois catégories

différentes au niveau de leur mécanisme d'action : les inhibiteurs associés de façon covalente

au cofacteur pour inhiber plutôt le site du cofacteur, les inhibiteurs occupant

préférentiellement le site du substrat et s'associant de manière non covalente au cofacteur et

enfin les inhibiteurs n'ayant pas besoin du cofacteur pour inhiber l'enzyme.

V.1. Inhibiteurs formant une liaison covalente avec le cofacteur NAD En plus de l'INH, seule la famille des diazaborines a été décrite pour

inhiber différentes énoyl-ACP réductases en établissant une liaison

covalente avec le cofacteur NAD.

Bien que l'activité antibactérienne des diazaborines ait été décrite

pour la première fois à la fin des années 1960, leurs cibles biologiques sont restées obscures

jusqu'aux années 1980.107 La première preuve qu'elles interfèrent avec la biosynthèse

membranaire a été obtenue par Hogenauer et Woisetschlager.108 En utilisant des souches

mutantes spécifiques d'Escherichia coli et de Salmonella typhimurium, ils ont montré que la

diazaborine inhibait l'incorporation de galactose radioactif dans les lipopolysaccharides de ces

bactéries, un composé essentiel de la paroi bactérienne. C'est finalement la structure cristalline

de la diazaborine liée de façon covalente au cofacteur NAD+ dans le site actif de FabI (énoyl-

ACP réductase) qui confirme que leur cible est bien FabI et donc la biosynthèse des acides

gras.107,109

Les diazaborines représentent un groupe de composés antibactériens dont l'élément

structural important est l'hétérocycle 1,2-diazine contenant un atome de bore et sont

NN

BS

OHS

O

O

Thiénodiazaborine

Introduction

60

généralement séparées en 5 classes représentées sur la Figure 12. Les thiéno-diazaborines

sont les plus actives (concentration minimale inhibitrice (CMI) sur E. coli de 1,25 µM pour le

plus actif), alors que les pyrrolo-diazaborines n'ont pas montré d'activité inhibitrice (CMI sur

E. coli > 50 mg/mL).

NN

BOH

R4

SO2R2

XR

Arène

Hétérocycle1,2-diazine

Chaîneorganosulfonyl

S

S

N

O

R

Benzo-diazaborine

Thiéno-[2,3-d]-diazaborine

Thiéno-[3,2-d]-diazaborine

Furo-[3,2-d]-diazaborine

Pyrrolo-[3,2-d]-diazaborine

X =

Figure 12 : Structures des différentes classes de diazaborines.

Des études enzymatiques ont montré que la présence de NAD+ comme cofacteur était

indispensable à la fois à l'inhibition et à la liaison des diazaborines a l'énoyl-ACP réductase.110

Par la suite, des études cristallographiques ont été réalisées dans le but de comprendre le

mécanisme moléculaire permettant aux diazaborines d'inhiber l'énoyl-ACP réductase d'E. coli.

Des cristaux de différents complexes E. coli FabI-NAD+-diazaborine ont été préparés et leurs

structures ont été résolues.109 En comparaison avec la structure du complexe E. coli FabI-

NAD+, il apparaît que contrairement au complexe sans diazaborine, la boucle entre la Leu195

et la Met206 est bien ordonnée et organisée et que les résidus Ile200 et Phe203 ont leurs

chaînes latérales en interaction de van der Waals avec le cycle X (Figure 12 et Figure 13).

De plus cette boucle est connue pour être la boucle de liaison du substrat des énoyl-ACP

réductases.

Figure 13 : Représentation de la sous-unité B de FabI de E. coli. En jaune est symbolisée la

boucle d'acides aminés de la Leu195 à la Met206, a) dans sa conformation ouverte, b) dans sa conformation fermée organisée.111

Introduction

61

L'analyse des sites de liaisons des diazaborines montre qu'elles sont adjacentes au cycle

nicotinamide du cofacteur dans une poche formée par les chaînes latérales des Tyr146, Tyr

156, Met159, Ile220, Phe203, Leu100 et Lys163 et les chaînes principales des peptides entre

la Gly93 et l'Ala95. Les bicycles des diazaborines sont en face du cycle nicotinamide

permettant la formation d'interaction de type π−π stacking avec en plus des interactions de

van der Waals avec les Tyr146, Tyr156, Ile220 et Phe203 (Figure 14a). Une interaction

supplémentaire est observée : ce sont des liaisons hydrogènes entre l'hydroxyle porté par le

bore et l'hydroxyle phénolique de la Tyr 156 et entre un azote de l'hétérocycle 1,2-diazine et

une molécule d'H2O. De plus, la distance entre l'atome de bore de la diazaborine et le OH 2'

du ribose du nicotinamide est de 1,7 Å, comparable à la longueur d'une liaison covalente B-O.

Cette liaison covalente est confirmée par la densité électronique continue entre le OH 2' du

ribose du nicotinamide et le bore (Figure 14b), ainsi que l'identification de la position de

l'oxygène de l'hydroxyle porté par le bore qui présente une forme tétrahédrique plutôt que

trigonale, ce qui est nécessaire si le bore forme quatre liaisons covalentes.

a b

Figure 14 : a) Structure du site actif de FabI inhibée par une thiénodiazaborine en présence de NAD+. b) Carte de densité électronique du complexe diazaborine-NAD+ avec une résolution

de 2,2 Å.107,112

Ce complexe a même été appelé "bisubstrat", car il occupe à la fois le site du cofacteur et

celui du substrat. Il se dissocie très lentement de l'enzyme et cette dernière est inhibée de

façon quasi irréversible. Bien que cette famille de composés conduise à la formation d'un

complexe covalent avec le cofacteur très efficace en tant qu'inhibiteur d'énoyl-ACP-réductase,

leur utilisation est exclusivement expérimentale à cause de la toxicité inhérente à l'atome de

bore qui est indispensable à l'activité. Cependant, le principe d'une association covalente

permettant d'occuper à la fois les sites du substrat et du cofacteur et d'augmenter ainsi

Introduction

62

l'efficacité des inhibiteurs, pourrait être mis à profit pour la synthèse de nouveaux composés

inhibiteurs d'énoyl-ACP réductases comme InhA.

V.2. Inhibiteurs formant une liaison non covalente avec le cofacteur NAD Les inhibiteurs ne s'associant pas de façon covalente au cofacteur NAD sont tout de

même plus nombreux. En effet, toute une série de composés s'est révélée active sur des énoyl-

ACP réductases. La première molécule ayant montré cet activité est le triclosan, qui a

engendré toute une famille d'analogues et de dérivés lors d'études de relations structures

activités et par rationalisation des interactions dans le site actif. Ensuite, plusieurs composés

ont aussi été découverts par un criblage à haut débit de grandes chimiothèques.

V.2.1. Le triclosan, ses analogues et leurs dérivés

Le triclosan ou 5-chloro-2-(2,4-dichlorophénoxy) phénol est un

agent antibactérien à large spectre, actif sur une grande variété de

micro-organismes : les bactéries à Gram positif, les bactéries à Gram

négatif, les levures et les champignons. Il a longtemps été utilisé comme agent antimicrobien

et antifongique dans les produits de nettoyage hospitalier. Plus récemment son utilisation s'est

développée en tant qu'additif antibactérien, il est retrouvé dans de nombreux produits de

consommation quotidienne comme le dentifrice, les cosmétiques, les plastiques ou encore les

jouets.

Tout d'abord considéré comme un "biocide" non-spécifique, l'analyse de souches d'E. coli

résistantes au triclosan par McMurry et al en 1998, a suggéré que ce composé inhibait la

biosynthèse lipidique en inhibant spécifiquement l'enzyme énoyl-ACP réductase (FabI).113

Cette découverte a relancé le débat sur l'utilisation trop étendue du triclosan et du risque

potentiel d'accélération de l'apparition de bactéries résistantes à cause de son application non-

appropriée. La preuve directe que la cible biochimique du triclosan est FabI viendra de

l'isolement d'un mutant spontané de FabI le Gly93Val et de la démonstration que la protéine

mutée purifiée est résistante au triclosan alors que la protéine native est sensible.114

Les structures cristallines de FabI et de NAD+ complexé au triclosan ont été déterminées

par différents laboratoires et confirment toutes l'existence d'un complexe ternaire "tight

binding".115-120 Le cycle chlorohydroxyphényle du triclosan est coplanaire avec celui du

nicotinamide du NAD+ à une distance d'environ 3,4 Å, favorisant les interactions de type π-π

stacking, et interagit avec les chaînes principales des Tyr156 et Tyr146. Le OH 2' du ribose du

OOH Cl

ClClTriclosan

A B

Introduction

63

nicotinamide et l'hydroxyle de la Tyr156 forment une liaison hydrogène avec l'hydroxyle du

triclosan. Le chlore en position para du cycle phényle B forme une liaison hydrogène avec

l'amide de l'Ala95 et des interactions hydrophobes avec la chaîne principale de la Met159. La

boucle de liaison du substrat renforce l'association avec des interactions de van der Waals

supplémentaires identiques à celle vue pour les diazaborines (Figure 15).

Figure 15 : Structure du site actif de FabI inhibé par le triclosan en présence de NAD+.112

C'est grâce à l'ensemble de ces interactions que le triclosan peut être un excellent

inhibiteur de FabI. Comme les adduits INH-NAD, le triclosan est décrit comme un inhibiteur

de type "slow-binding" (pour FabI de E. coli : Ki = 7 ± 1 pM et CMI(E. coli) = 0,3 µg/mL). De

plus, le triclosan occupe le site du substrat de FabI en se positionnant de la même façon que le

substrat. Plusieurs études121-125 de développement de nouveaux inhibiteurs (Figure 16)

d'énoyl-ACP réductases, basées sur la structure du triclosan, ont été menées sur différentes

souches de bactéries ou de parasites mais les plus étudiées restent E. coli, Plasmodium

falciparum et M. tuberculosis.

OOH

n

OOH Cl

ClNH2

O4'

OOH Cl

NH

ClAc

4'

2'OOH

HCl

NCH2CH2Ph

H

OHOH

P. falciparum FabICI50 = 120 nM

P. falciparum FabICI50 = 57 nM

P. falciparum FabICI50 = 57 nM

InhAn = 8 CI50 = 5 nM

E. coli FabIKI = 53 µM

5

Figure 16 : Exemples de dérivés du triclosan étudiés dans la littérature

En 2006, l'équipe de Tonge P. J., s'est particulièrement intéressée, aux analogues du

triclosan comme inhibiteurs de FabI et d'InhA. Avec une conception de molécules basées sur

Introduction

64

les données cristallographiques, ils ont développé une série d'alkyl diphényl éther avec une

très bonne activité inhibitrice d'InhA et de la croissance de M. tuberculosis (souches sensibles

et résistantes). En rajoutant des chaînes alkyles de longueurs différentes en positions 5 du

cycle phénoxy, ils ont réussi à mieux occuper le site du substrat d'InhA et donc à améliorer

leurs constantes d'affinités.124

Deux pro-drogues du triclosan ont aussi été étudiées par Stone et al : les NB2001 et

NB2030 (Figure 17). Ces composés exploitent les β-lactamases pour relarguer le triclosan par

hydrolyse du cycle β-lactame, cependant, leurs activités sont diminuées par rapport au

triclosan libre (sur FabI de E. coli : CI50 = 30 µM et 130 µM pour NB2001 et NB2030

respectivement alors que pour le triclosan CI50 = 1,9 µM).126

OO

Cl

S

N

Cl Cl

HO O

O

HHN

OSO

O

Cl

S

N

Cl Cl

HO O

O

HHN

ONN

NN

NB2001 NB2030 Figure 17 : Pro-drogues du triclosan

V.2.2. Différentes structures aromatiques découvertes par criblage à haut débit

C'est par criblage à haut débit de chimiothèques de plus de 300 000 composés par

GlaxoSmithKline et Genome Therapeutics Corp. que le plus grand nombre de nouvelles

structures inhibant des énoyl-ACP réductases ont pu être identifiées. A partir de molécules

têtes de série, des optimisations chimiques et des études de relations structures-activités ont

laissé apparaître plusieurs nouvelles séries de molécules : des aminopyridines, des imidazoles,

des indoles, des thiopyridines, des pyrazoles, des pyrrolidines carboxamides et récemment des

4-pyridones (Figure 18).127-135

La plupart de ces composés ont été co-cristallisés avec une énoyl-ACP réductase et le

cofacteur NAD. Malgré les différences évidentes de structure de ces différents composés, ils

occupent tous le site du substrat et sont en interaction directe avec le cofacteur NAD par des

liaisons hydrogènes, des interactions de van der Waals et de type π-π stacking entre un noyau

aromatique et le cycle nicotinamide du cofacteur.

Introduction

65

N

N

O NH

Genz-10850

NH

N

O N

NH

O

et analogues

HNN

O

OH

et analogues

N

CN

S

S

S O

OH

et analogues

NO2

O2N

NN

N

N

CF3Genz-9575

N

N

S

et analogues

NN

O2N

CF3

et analoguesNAS-39

N

OCl

Cl

et analogues

NH

O

N

O

H

et analogues

InhA CI50 = 0,16 µM

S. aureus FabI

CI50 = 0,047 µMS. aureus FabI

CI50 = 3,0 µM

S.aureus FabI

CI50 = 1,4 µMS. aureus FabI

CI50 = 1,2 µMInhA CI50 < 40 µM

P. falciparum FabI

CI50 = 50 µM

E. coli FabI

CI50 = 4,2 µMInhA CI50 = 3,1 µM

Figures 18 : Exemples d'inhibiteurs d'énoyl-ACP réductase

Une association par interaction faible d'un inhibiteur occupant le site du substrat avec le

cofacteur permet d'obtenir des composés très efficaces vis-à-vis de différentes énoyl

réductases. L'occupation du site du substrat ainsi que celui du cofacteur par une seule et même

molécule semble être une idée prometteuse pour la synthèse de nouveaux inhibiteurs d'InhA.

V.3. Inhibiteur n'interagissant pas avec le cofacteur NAD Enfin, une autre molécule, inspiré de la structure de l'INH, a elle aussi montré une activité

inhibitrice de l'énoyl-ACP réductase InhA native et résistante à l'INH (InhA Ile21Val). En

essayant de contourner les problèmes de résistance à l'INH liés aux mutations de KatG,

Oliveira et al,136,137 ont étudié un analogue de l'INH contenant le motif cyanoferrate (Figure

19), avec l'objectif qu'il soit capable de s'oxyder sans KatG.

Ce composé a été testé sur InhA natif et le mutant Ile21Val INH-résistant. Comme espéré,

ce composé ne nécessite pas d'activation par KatG pour inhiber InhA. La présence de NADH

n'est pas nécessaire pour l'activité du complexe métallique. Ce complexe inorganique de fer

est un inhibiteur de type "slow binding" d'InhA, comme les adduits INH-NAD (cf III.2.1.).

Dans un premier temps, il avait été suggéré que ce FeII(CN)5(INH)3- ait le même site

Introduction

66

d'interaction que le cofacteur NADH, car les fortes concentrations en NADH protègent InhA

de l'inhibition par FeII(CN)5(INH)3- et que la constante de vitesse d'inhibition de premier ordre

apparente est dépendante de la concentration en NADH. En effet, l'inhibition d'InhA par le

complexe de fer apparaît être compétitive avec NADH. Cependant, des études plus récentes

ont montré qu'il en était de même avec le substrat 2-trans-décénoyl-CoA, ce qui laisse

envisager un mécanisme d'inhibition impliquant des interactions avec à la fois le site du

substrat et du cofacteur. Les études de modélisations moléculaires n'ont pas permis de décrire

avec précision le site de fixation de ce complexe, mais des études pour déterminer la structure

tridimensionnelle du complexe binaire InhA-FeII(CN)5(INH)3- sont en cours.

OHN

NH2

Fe

CN

CNNCCNNC

3-

Figure 19 : Complexe inorganique de FeII inhibiteur de InhA

OBJECTIFS

Objectifs

69

Face à la résurgence actuelle de la tuberculose, le développement de nouvelles molécules

à activité antimycobactérienne est indispensable.

Parmi les cibles potentielles, le complexe enzymatique FAS-II est un système modèle

pour la conception de nouveaux antibactériens. En effet, ce complexe enzymatique, présent

chez la mycobactérie, est absent chez l'homme. Ainsi, un médicament inhibant l'une des

enzymes du cycle FAS-II (InhA, MabA, KasA, Dehydratase) serait sélectif vis-à-vis de M.

tuberculosis et par conséquent moins toxique pour l'hôte.

Depuis plusieurs années, la recherche réalisée au sein de l'équipe contribue à une

meilleure compréhension, au niveau moléculaire, du mécanisme d'action de l'INH, dans le but

de concevoir de nouvelles molécules capables d'agir comme antituberculeux.

Dans l'optique de rechercher de nouveaux composés actifs apparentés à l'INH, trois

stratégies peuvent être envisagées :

La première stratégie, la plus étudiée, est la synthèse d'analogues de l'INH où le noyau

pyridine est remplacé par différents noyaux aromatiques. Bien que de nombreux

travaux aient été réalisés dans ce sens et que de très nombreuses molécules aient été

synthétisées, aucun nouveau médicament n'est né de cette approche.138-144

La deuxième stratégie est basée sur l'idée que le radical isonicotinoyle est la forme

active de l'INH. Ainsi, la préparation de molécules capables de générer le radical

isonicotinoyle plus facilement au cœur de la mycobactérie pourrait être

intéressante.136,137 Contrairement à la première stratégie, cette approche est très peu

exploitée.

La troisième stratégie, celle que nous avons choisie et mise en application, consiste à

élaborer des molécules apparentées à l'adduit INH-NAD (inhibiteur direct d'InhA),

plutôt qu'à l'INH lui-même.

Ainsi, nous nous sommes tout d'abord particulièrement intéressés à la synthèse

d'analogues des adduits INH-NAD en tant qu'inhibiteur direct d'InhA. Ce travail se place dans

la suite de la thèse de Sylvain Broussy qui avait commencé à développer des analogues

simplifiés benzoylés de l'adduit INH-NAD. Cependant tous ces composés ont été inactifs.

Notre objectif est donc de récupérer l'activité en augmentant la complexité de la chaîne

liée à l'azote du nicotinamide, ou encore par l'introduction du motif isonicotinoyle, pour se

rapprocher d'avantage des adduits INH-NAD.

Objectifs

70

Cette stratégie permettrait le contournement du problème de résistance lié à l'étape

d'activation de l'INH par l'enzyme KatG. De plus, afin de contourner les résistances dues à des

mutations du gène inhA, la synthèse d'adduits INH-NAD simplifiés au niveau de la chaîne lié

à l'azote du nicotinamide (absence du motif ADP) permettrait d'éliminer les interactions au

niveau du motif adénosine diphosphate (ADP) (Figure 20).

La synthèse ainsi que l'évaluation biologique de ces dérivés sont rapportées dans le

chapitre I.

INH

KatGMutationsKatG

Analogues adduit INH-NAD

MutationsInhA

NAD(H) Inhibition InhAINH activé Adduit

INH-NAD

Analogues simplifiés

adduits INH-NAD

NAD(H) Inhibition InhAINH activé Adduit

INH-NADNAD(H)NAD(H) Inhibition

InhAINH activéINH activé AdduitINH-NADAdduit

INH-NAD

Analogues simplifiés

adduits INH-NAD

Analogues INH-NAD

Contournementrésistances KatG

Analogues simplifiés

Contournementrésistances InhA

Analogues INH-NAD

Contournementrésistances KatG

Analogues INH-NAD

Contournementrésistances KatG

Analogues simplifiés

Contournementrésistances InhA

Analogues simplifiés

Contournementrésistances InhA

Figure 20 : Stratégie mise en place au laboratoire pour la synthèse de nouveaux composés à activité antituberculeuse potentielle, contournement des résistances liées à KatG et à InhA.

Dans un deuxième temps, une stratégie appelée bisubstrat a été mise au point dans le but

de développer de nouvelles molécules plus affines pour InhA. Cette stratégie consiste à réunir

au sein d'une même molécule des caractéristiques structurales du cofacteur et du substrat de

l'enzyme InhA. Nous envisageons de greffer sur le nicotinamide-hémiamidal un résidu

lipophile qui mimerait la chaîne alkyle hydrophobe du substrat alors que le noyau

nicotinamide représenterait le cofacteur.

La synthèse de ces composés et l'évaluation de leurs activités inhibitrices de l'enzyme

InhA et de la croissance bactérienne sont décrites dans le chapitre II.

Parallèlement nous nous sommes intéressés à l'étude de l'équilibre tautomérique existant

entre les formes cycliques et ouvertes des adduits INH-NAD. En effet, les adduits en solution,

existent majoritairement sous formes cyclisées alors que les données des Rayons-X de l'adduit

INH-NAD cristallisé au sein d'InhA montre une structure ouverte de type céto-amide.

Nous avons donc étudié cet équilibre sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD

avec des données expérimentales soutenues par des études de modélisation moléculaire (en

collaboration avec Jean-Luc Stigliani). Les résultats obtenus sont exposés dans le chapitre III.

Objectifs

71

Enfin pour essayer de mieux comprendre ce phénomène (équilibre tautomérique), le

chapitre IV présente des études de docking et de dynamique moléculaire réalisées sur

l'enzyme InhA avec les différents adduits décrits en solution (en collaboration avec Jean-Luc

Stigliani et Philippe Arnaud).

Objectifs

72

RESULTATS ET DISCUSSION

CHAPITRE I : SYNTHESE D'ANALOGUES DES

ADDUITS INH(BH)-NAD

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

77

I. Introduction Ce chapitre s'inscrit dans la continuité de la thèse de S. Broussy. Une partie de cette

dernière a été consacrée à la synthèse d'analogues simplifiés des adduits BH-NAD (Figure

21) c'est-à-dire d'analogues tronqués au niveau de la partie adénosine diphosphate pour limiter

les problèmes d'instabilité métabolique et faciliter la pénétration cellulaire. La conception des

différentes molécules préparées était basée sur l'observation suivante : la valeur de Kd de

NADH pour InhA est de 2 µM alors que le Ki pour l'adduit INH-NAD varie de 0,5 nM57 à

100 nM.56 Ceci suggère que l'introduction du motif isonicotinoyle est responsable d'une

augmentation d'un facteur 20 à 2000 de l'affinité de l'adduit pour InhA par rapport à celle de

NADH. De plus, Rawat et al ont décrit l'adduit BH-NAD comme étant aussi efficace et de

même comportement que l'adduit INH-NAD.24 La même suggestion peut donc être faite pour

l'addition du motif benzoyle. Ainsi la synthèse d'analogues simplifiés des adduits INH-NAD

et BH-NAD pourrait avoir un intérêt en tant qu'inhibiteur potentiel d'InhA. Dans le cas des

molécules simplifiées, l'espoir est que le gain d'affinité apporté par le fragment aroyle pourrait

compenser la simplification de la chaîne liée à l'azote du cycle dihydropyridine (DHP)

(Figure 21).

Cependant, l'ensemble des composés préparés au cours de la thèse de S. Broussy

(analogues BH-NAD) (Figure 21) se sont malheureusement révélés dépourvus d'activité

inhibitrice vis-à-vis d'InhA.145

NO

O

NH2

OO

N

NH2

OO

NO

O

N

OO

O

O

HOOH

HON

NH2

OO

O

AcOOAc

AcO

NH2

OO

NH2

OO

Figure 21 : Dihydropyridines testées vis-à-vis d'InhA.

Ainsi, afin de préparer des adduits INH-NAD simplifiés plus affins pour InhA, deux

approches ont été envisagées. D'une part, nous avons proposé afin de récupérer l'activité

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

78

perdue, d'augmenter la complexité de la chaîne liée à l'azote du nicotinamide (Figure 21) par

la ré-introduction du motif adénosine. D'autre part nous avons proposé de remplacer le

groupement benzoyle par le groupement isonicotinoyle pour parvenir à une nouvelle famille

de molécules. Le remplacement de la pyridine par un phényle pourrait expliquer la diminution

d'activité observée pour les composés synthétisés par S. Broussy.

Dans ce chapitre, sera donc décrite la synthèse d'une part des analogues des adduits BH-

NAD portant le motif adénosine et d'autre part des analogues simplifiés des adduits INH-

NAD avec un motif isonicotinoyle comme groupement aroyle.

II. Analogues des adduits BH-NAD portant le motif adénosine Les analogues simplifiés de l'adduit BH-NAD précédemment synthétisé par S. Broussy

n'ayant pas montré d'activité biologique intéressante, nous proposons de réaliser la synthèse

d'analogues conservant le motif adénosine. Nous souhaitons introduire ce motif pour nous

rapprocher au plus de la structure des adduits. Bien que difficilement exploitables directement

en tant que médicaments (instabilité chimique, présence de charge, hydrophilie prononcée),

ces molécules pourraient donner des informations cruciales sur les relations structures-

activités.

N

NN

N

NH2

O

OHOH

ON

O

O

O POH

O

NH2

OO

18 Figure 22 : Molécule cible portant le motif adénosine 18.

La molécule cible 18 (Figure 22) que nous avons choisie de synthétiser est relativement

proche de l'adduit BH-NAD. Le ribose diphosphate du nicotinamide est remplacé par une

chaîne "acétate de propyle". Le nombre de liaisons séparant le nicotinamide de l'adénosine est

conservé.

II.1. Analyse rétrosynthétique Les DHP146-148 étant peu stables il est préférable de les obtenir lors de la dernière étape de

la voie de synthèse ou le plus tard possible. La 1,4-DHP 18 de type céto-amide ou sous sa

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

79

forme tautomère de type hémiamidal cyclique, que nous proposons de synthétiser, pourrait

être obtenue par réduction régiosélective du sel de pyridinium correspondant de type

hémiamidal 19 (forme tautomère unique) (Schéma 10). En effet, la réduction du sel de

pyridinium peut conduire à l'ouverture partielle ou totale du cycle hémiamidal (voir Chapitre

III), faisant ainsi apparaître le motif céto-amide. L'hémiamidal cyclique peut donc être

considéré comme une forme masquée du motif γ-céto-carboxamide.

N

N N

N

NH2

O

OHOH

ON

O

O

O POH

O

N

N N

N

NH2

O

OO

ON

NHO

PhHO

O

O

OBr POMe

O

NH2

O

5'

1'

1

N

NHO

PhHO

N

N N

N

NH2

O

OO

OPOO

OMeO

OBr

+

BrO OH

ON

N N

N

NH2

O

OO

OPN

MeO

N

N N

N

NH2

O

OO

HO

N

NHO

PhHO

+

+

18

19

20

21

22

21

24 25

Voie bVoie a

N

N N

N

NH2

O

OO

OPN

MeO

N

NHO

PhHO

O

O

OHBr

+22

23

25N

NHO

O

N

OH

O

26 27

Voie c Voie d

4

7

3

N

N N

N

NH2

O

OHOH

ON

O

O

O POH

O

Ph ONH

O

PhHO

BrO OH

O 243

Schéma 10

Une analyse rétrosynthétique du sel de pyridinium 19 permet d'envisager les deux

déconnexions suivantes : la liaison N1-C1' et la liaison O5'-P (Schéma 10). La déconnexion

N1-C1' met en jeu l'alkylation de la pyridine de type hémiamidal correspondante. En effet, des

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

80

travaux précédents du laboratoire ont montré que la forme tautomère ouverte*, 4-aroyle

nicotinamide, n'existe pas dans les conditions de solvants et de températures utilisées. La

déconnexion O5'-P fait intervenir une substitution nucléophile sur l'atome de phosphore (III).

Les deux voies rétrosynthétiques proposées se distinguent par l'ordre de réalisation de ces

deux déconnexions et par conséquent conduisent à l'utilisation des synthons communs :

l'hémiamidal 22, 24 obtenu en une seule étape et 25 commercial.

Le sel de pyridinium phosphotriester 19 pourrait donc être formé soit par un couplage

entre le phosphoramidite 21 et le sel de pyridinium 20 suivie d'une oxydation (voie a) soit par

l'alkylation de l'hémiamidal 22 par le phosphotriester avec une chaîne bromée 23 (voie b). Ce

dernier pourrait être obtenu par l'addition de l'alcool 24 sur le phosphoramidite 21.

Pour synthétiser l'hémiamidal intermédiaire 22 deux voies de synthèse ont été

envisagées.145,149 La première voie implique une déconnexion de la liaison C4-C7. Cette

synthèse utilise l'acide nicotinique 26 comme produit de départ et met en jeu une réaction

d'orthométallation dirigée du nicotinamide accompagnée d'une addition électrophile (voie c).

La seconde voie de synthèse implique une addition nucléophile du groupement aryle sur la

3,4-pyridinedicarboximide 27 commerciale (voie d).

II.2. Première stratégie de synthèse (voie a) II.2.1. Préparation du sel de pyridinium avec une chaîne hydroxylée (Synthon 20)

La première étape est la synthèse de l'hémiamidal 22. Elle met en jeu une réaction

d'addition nucléophile du phényllithium sur la 3,4-pyridinedicarboximide 27. La réaction

conduit à deux régioisomères : le produit d'addition sur le carbonyle lié au carbone situé en

position para du noyau pyridine (le produit "para") et le produit dit "méta" obtenu par

l'addition sur l'autre carbonyle dans un rapport 4/1 respectivement, mesuré par RMN 1H (dans

le MeOD d4, H2 para à 8,92 ppm et H2 méta à 8,60 ppm). Après recristallisation dans

l'acétone, le composé "para" 22 a été obtenu avec un rendement de 60% (Schéma 11).145

N

NHO

HOPhLi

THFN

NHO

O

N

NHO

OH+

27 22 28

Produit "para" Produit "méta"

89%(4 : 1)

60% après recristallisation

2

2

Schéma 11

* Dans la suite de cette thèse, le terme chaîne sera utilisé comme équivalent du terme ouvert.

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

81

L'hémiamidal 22 a ensuite été alkylé par le 2-bromoacétate de 3-hydroxypropyle 24 pour

donner le sel de pyridinium 20, avec un rendement de 80% (Schéma 12). Le 2-bromoacétate

de 3-hydroxypropyle 24 a été préalablement préparé par substitution nucléophile du propane-

1,3-diol 29 sur le bromure de 2-bromoacétyle 30. Afin d'éviter l'addition-élimination du

propane-1,3-diol (un par chaque hydroxyle) sur de 2 équivalents de 2-bromoacétyle, qui a

conduit à la formation du dérivé 31 (Schéma 13), un large excès de diol ainsi qu'une addition

très lente du dérivé bromé en condition diluée ont été nécessaires.

BrO OH

ON

NHO

HO

20

O

O

OHBrTHF

80%

HO OH

BrBr

O

CH3CN

95%

+ N

NHO

HO

2229

30

24

Schéma 12

Lors de l'étape d'alkylation, une impureté conduisant à un dédoublement des pics en RMN

1H a été observée. La masse de cette impureté est de 401 et nous l'avons attribuée au produit

32 (Schéma 13).

N

NHO

HO

22

N

NHO

HO

32

O

O

OBr

OOH

BrO O

O+ m/z = 401

34

N

NHO

HO

O

O

OBr

OBr

33

N

NHO

HO

O

O

OBr

O

N

HNO

OH

Br

ou

OBr

31

HO OHBrBr

O+2

7'7'

2930

Schéma 13

Nous supposons que la formation du composé 32 pourrait provenir d'une attaque

nucléophile d'une molécule d'eau sur le méthylène électrophile en position 7' des composés 33

ou 34 issus de la mono ou de la disubstitution de l'impureté 31 par l'hémiamidal 22. Aucune

trace des composés 33 et 34 n'a pu être détectée par spectrométrie de masse. Pour éviter la

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

82

formation de 16, le 2-bromoacétate de 3-hydroxypropyle a été ajouté très lentement avec un

reflux doux de la solution, en prenant garde à ne pas la concentrer. Dans ces conditions, le

produit 20 a été obtenu efficacement avec un rendement de 80%.

II.2.2. Préparation du sel de pyridinium phosphotriester 19 (Schéma 10)

La formation des phosphotriesters est bien décrite dans la littérature,150-153 et il existe de

nombreuses méthodes de préparation. Elles peuvent impliquer des intermédiaires

phosphorylés pentavalents (PV), dans le cas des méthodes faisant intervenir des précurseurs

phosphorochlorydates et phosphomonoesters, ou trivalents (PIII), dans le cas des méthodes

mettant en jeu des précurseurs hydrogénophosphonates et phosphoramidites.

L'approche phosphoramidites, introduite par Caruthers,151 implique la préparation d'un

phosphoramidite relativement stable. Le phosphoramidite peut être activé ultérieurement par

protonation pour être condensé avec un composé hydroxylé. Le rapport stabilité-réactivité des

phosphoramidites varie selon la nature de l'amine. Les dérivés diisopropylamino sont

suffisamment stables pour être purifiés sur gel de silice en présence de triéthylamine,154 tout

en conservant une réactivité suffisante pour l'étape de condensation. Cette dernière consiste à

activer le phosphoramidite par protonation de l'amino phosphine au moyen de divers

agents,155 tels que le 1H-tétrazole. L'amine devient alors un excellent groupement partant. Ce

mécanisme fait intervenir un intermédiaire tétrazolylphosphoramidite dont la formation

constitue l'étape limitante156 (Schéma 14). Le phosphite triester obtenu n'est généralement pas

isolé mais oxydé in situ. Cette étape d'oxydation peut être réalisée au moyen du couple I2/H2O

dans la pyridine, d'un peroxyde ou encore d'un peracide.

PN

R2O OR1

R' R'

Phosphoramidite

R3OH

NNN NH

NNN NH

NNN N

PN

R2O OR1

R' R'H

NNN N N

R'H

R'

PN

R2O OR1

NN N

R3OH

NNN NH

POR3

R2O OR1Oxydation

Phosphite triester Phosphotriester

POR3

R2O OR1O

Tétrazolylphosphoramidite Schéma 14

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

83

Préparation du phosphoramidite (Synthon 21)

Le diisopropyl 2',3'-isopropylidèneadénosine méthyl phosphoramidite 21 a été obtenu par

substitution nucléophile de la 2',3'-isopropylidène adénosine 25 sur le tétraisopropylidène

phosphoramidite 35, activé par le 1H-tétrazole (Schéma 15).157 Le 1H-tétrazole substitue le

groupement diisopropylamine protoné, l'intermédiaire tétrazolylphosphoramidite ainsi formé

se protone à son tour et devient beaucoup plus réactif vis-à-vis de l'attaque nucléophile de

l'hydroxyle en 5' de l'adénosine. Il faut noter que le groupement amino de l'adénosine n'est pas

réactif dans ces conditions et qu'une protection n'est donc pas nécessaire. Le produit a été

obtenu sous forme d'un mélange des deux diastéréoisomères dans un rapport 1/1, mesuré par

l'intégration des différents pics en RMN 1H, avec un rendement de 85%. Le phosphoramidite

21 a montré deux pics à 152,8 et 152,9 ppm en RMN du 31P (un pour chaque

diastéréoisomère), ce qui est caractéristique de la zone de déplacement chimique des PIII lié à

un atome d'azote et deux atomes d'oxygène. Ce composé est sensible à l'humidité, une simple

vérification en RMN du 31P permet de connaître sa qualité.

N

NN

N

NH2

O

OO

HO

N

N N

N

NH2

O

OO

OPN

MeON

NNHN

POMe

NN

Pyridine

NH

+

85%21

5'

2535

Schéma 15

Formation du phosphotriester 19

Le couplage entre le diisopropyl 2',3'-isopropylidèneadénosine méthyl phosphoramidite

21 et le sel de pyridinium 20 par le biais de la fonction alcool primaire (Schéma 16) a été

réalisé. Pour favoriser au maximum la formation du tétrazolylphosphoramidite un tétrazole

activé a été utilisé, le 5-(3,5-dinitrophényl)-1H-tétrazole 37. Ce dernier a été obtenu à partir

du 3,5-dinitrobenzène 36 en présence d'azide de sodium et de chlorure d'ammonium dans le

DMF avec un très bon rendement.158

La réaction de couplage a conduit, après oxydation par l'iode, au phosphotriester 19 mais

le rendement ne dépasse pas les 12%, et d'importants problèmes de reproductibilité et de

purification du composé formé ont été observés lors de cette étape.

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

84

N

N N

N

NH2

O

OO

OPN

MeO

21N

NHO

HO

20

O

O

OHBr

NNN

NHO2N

O2N

NO2O2N

CN

+N

N N

N

NH2

O

OO

ON

NHO

HO

O

O

OBr POMe

O

NaN3NH4Cl / DMF

95%

1)

DMF

2) Collidine, I2 THF / H2O

19

36

37

Schéma 16

L'utilisation du tert-butylhydroperoxyde comme oxydant, n'a pas permis d'améliorer la

réaction, elle conduit même à une décomposition du phosphite triester intermédiaire.

En raison des difficultés rencontrées, un suivi en RMN du 31P de l'ensemble de la réaction

de formation du phosphotriester a été réalisé lors de utilisation de l'iode comme agent

oxydant. Ce suivi a permis de mettre en évidence le passage par différentes espèces (Figure

23). Tout d'abord, le mélange réactionnel avant l'addition du tétrazole a présenté un seul pic à

148 ppm, caractéristique d'un phosphore trivalent PIII. Il s'agit du déplacement chimique du

phosphoramidite de départ 21. L'addition de 0,5 équivalents de tétrazole a conduit à 3 pics à

148, 138 et 10 ppm. Le pic à 138 ppm correspond à une espèce PIII qui est sûrement le

phosphite triester 39 attendu alors que le pic à 10 ppm correspond à un phosphore tétravalent,

probablement issu d'une protonation. Il peut s'agir du phosphoramidite de départ protoné 38,

du tétrazolylphosphoramidite intermédiaire protoné 42 ou du phosphite triester protoné 40. En

rajoutant un équivalent supplémentaire de tétrazole le pic à 148 ppm a complètement disparu,

mais un mélange entre le pic à 138 ppm (toujours majoritaire) et celui à 10 ppm a toujours été

observé. Après oxydation, un seul pic à -1 ppm a été observé, il correspond à un phosphore

pentavalent attribuable au phosphotriester attendu 19. Un contrôle comprenant le

phosphoramidite de départ 21 en présence de tétrazole a présenté deux pics un à 130 ppm

correspondant au tétrazolylphosphoramidite 43 et un à 10 ppm du à 42.

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

85

N

N N

N

NH2

O

OO

ON

NHO

HO

O

O

O POMe

O19

N

N N

N

NH2

O

OO

OPN

MeO

21

N

N N

N

NH2

O

OO

ON

NHO

HO

O

O

O POMe

39

148 ppm

130 ppm

138 ppm

10 ppm

-1 ppm

N

N N

N

NH2

O

OO

OPN

MeO

41N NN

O2N

O2N

N

N N

N

NH2

O

OO

OPNOMe

42

NN

N

NO2

O2N

N

N N

N

NH2

O

OO

ON

NHO

HO

O

O

O POMe

40

N

N N

N

NH2

O

OO

OPNOMe

38

H

H

H

N

N N

N

NH2

O

OO

OPOMe

43

OHO

M+ = 726 M - H+ = 401 Figure 23 : Les différentes espèces observées en RMN du 31P.

Lors des nombreux essais effectués, une différence d'intégration lors de l'analyse du

composé 19 a été observée en RMN 1H entre les protons de la partie sel de pyridinium et les

protons de la partie adénosine phosphorylée. De plus les résultats de spectrométrie de masse

ont toujours montré les trois mêmes espèces de m/z : 726 (19) et 343 (20) en mode positif et

401 (43) en mode négatif. En s'appuyant sur les données expérimentales, on en a déduit que la

réaction a en fait dû conduire à un mélange de trois composés : le phosphotriester attendu 19,

le sel de pyridinium de départ 20 (m/z = 343) et l'adénosine monophosphate 43 qui aurait un

déplacement chimique de -1 ppm en RMN du 31P. Ces trois produits ont été retrouvés en

proportions différentes suivant les expériences et il a été difficile de faire une quantification.

Par ailleurs, les déplacements chimiques en RMN 1H et 13C des composés 20 et 43 sont

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

86

superposables à ceux du dérivé 19. Les difficultés de purification (uniquement par

précipitation et lavage) de ces trois dérivés et le faible rendement de cette réaction n'ont pas

laissé d'alternative pour continuer dans cette voie. Avant de changer de stratégie de synthèse,

nous avons tout de même voulu étudier l'étape de réduction du sel 19, dans l'espoir d'une

meilleure purification au niveau de cette étape.

II.2.3. Préparation des dihydropyridines

La réduction en 1,2-DHP a été essayée avec du tétraborohydrure de sodium159 dans

l'éthanol alors que la réduction en 1,4-DHP le triacétoxyborohydrure de sodium dans un

mélange acide acétique / éthanol (1 : 3) a été employé avec le sel de pyridinium

phosphotriester 19 comme substrat. Il a été montré sur les modèles simplifiés, que la

réduction par le dithionite de sodium, habituellement utilisée pour synthétiser des 1,4-DHP,146

ne conduit pas au composé désiré mais à la formation d'une lactone après une étape de

déshydratation.145

N

NHO

PhHO

19

O

O

OBr

N

NHO

PhHO

O

O

O

NO

O

O

NH2

OPh O

1,2-DHP

1,4-DHP

NaBH4EtOH

NaBH(OAc)3

CH3COOH / EtOH

P AdénosineO

OMe

PO

AdénosineOMe

PO

AdénosineOMe

44

45 Schéma 17

Dans les conditions décrites ci-dessus, les produits réduits 44 et 45 n'ont pas pu être

obtenus (Schéma 17) bien qu'il y ait eu disparition du produit de départ. Dans les deux cas, la

décomposition du produit désiré a été observée.

Face à cette difficulté, nous avons donc envisagé de faire la réduction du sel de

pyridinium 20 portant un hydroxyle en bout de chaîne avant l'étape de couplage, bien qu'il n'y

ait que peu d'espoir que les DHP supportent les conditions de l'étape d'oxydation lors du

couplage.

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

87

II.2.4. Réduction du sel 20 suivie de la formation des phosphotriesters 44 et 45

Préparation des DHP

La 1,2-DHP (46) et la 1,4-DHP (47) ont été synthétisées par réduction du sel de

pyridinium 20 par action du NaBH4 et du NaBH(OAc)3 respectivement avec des rendements

de 90% et 62% (Schéma 18). La 1,2-DHP n'a été observée que sous forme cyclique de type

hémiamidal alors que la 1,4-DHP n'a été observée que sous sa forme ouverte de type céto-

amide.

N

NHO

HO

20

O

O

OHBr

N

NHO

PhHO

46

O

O

OH

N

47

O

O

OH

NH2

OPh O

1,2-DHP

1,4-DHP

NaBH4EtOH

NaBH(OAc)3

CH3COOH / EtOH

90%

62%

Schéma 18

Préparation du phosphotriester

Les différentes tentatives de couplage entre les DHP 46 ou 47 et le phosphoramidite 21

n'ont pas permis d'obtenir les phosphotriesters désirés 44 et 45. Une incompatibilité entre la

fonction dihydropyridine et l'étape d'oxydation a en effet été constatée. Au cours de celle-ci,

une oxydation des DHP en sel de pyridinium a été observée.

Cette voie de synthèse a abouti à la formation de l'analogue oxydé de l'adduit BH-NAD à

motif adénosine 19 avec un faible rendement ce qui nous a obligé à chercher une nouvelle

alternative. Une deuxième stratégie (voie b Schéma 10 paragraphe II.1.) de synthèse du

dérivé 18 a alors été envisagée.

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

88

II.3. Seconde stratégie (voie b) II.3.1. Préparation de la chaîne phosphotriester (Synthon 23)

N

N N

N

NH2

O

OO

OPOO

OMeO

OBr

23

Figure 24 : Synthon 23

Au cours des précédentes tentatives, les synthons 21, 22 et 24 ont déjà été synthétisés. La

première étape a donc consisté à réaliser le couplage entre le phosphoramidite 21 et le 2-

bromoacétate de 3-hydroxypropyle 24 suivi d'une étape d'oxydation pour former le

phosphotriester 23 (Schéma 19).

N

N N

N

NH2

O

OO

OPN

MeO

21

BrOHO

ODMF

1)

2) Collidine I2 (THF / H2O : 2/1)

N

N N

N

NH2

O

OO

OP

23

O

OOO

OBr

N

N N

N

NH2

O

OO

OP

48

O

OO

OO

5-(3,5-dinitropnényl)-1H-tétrazole

18

Me 11

2

145'

37

24

Schéma 19

Cependant, le produit désiré n'a pas été obtenu, seul un produit montrant un pic

moléculaire en spectrométrie de masse de m/z = 485 attribué au composé 48 a été observé. Sa

formation pourrait provenir d'une attaque nucléophile intramoléculaire de l'oxygène lié au

phosphore sur le méthylène électrophile en position 18 libérant du bromure de méthyle. Afin

de contourner cet obstacle, une stratégie complémentaire moins conventionnelle faisant

intervenir l'étape d'alkylation avant celle d'oxydation a été envisagée.

II.3.2. Synthèse one-pot

Cette nouvelle voie de synthèse passe dans un premier temps par la formation du

phosphite triester 49, issu du couplage entre le phosphoramidite 21 et le 2-bromoacétate de 3-

hydroxypropyle 24. L'intermédiaire 49 n'a pas été oxydé directement pour éviter la formation

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

89

de l'impureté 48 mais a été utilisé pour l'alkylation de l'hémiamidal 22 qui devrait conduire

transitoirement à la formation du sel de pyridinium phosphite triester 39. L'oxydation

terminale conduirait au sel de pyridinium phosphotriester 19 (Schéma 20).

N

N N

N

NH2

O

OO

ON

NHO

HO

O

O

OBr POMe

O19

N

N N

N

NH2

O

OO

OPN

MeO

21

N

N N

N

NH2

O

OO

OO

O

O POMe

49

N

N N

N

NH2

O

OO

ON

NHO

HO

O

O

O POMe

39

Br

5-(3,5-dinitropnényl)-1H-tétrazole

BrOHO

ODMF

N

NHHOO

22

Collidine, I2

THF / H2O

24

37

Schéma 20

Toutefois, le phosphotriester 19 n'a pas été observé et c'est seulement un mélange

d'hémiamidal 22 et d'adénosine monophosphate 43 qui a été récupéré après précipitation,

laissant penser que la réaction d'alkylation n'a pas eu lieu. Cette voie a donc dû elle aussi être

abandonnée.

En dépit des différentes voies suivies, le sel de pyridinium phosphotriester 19 n'a pas pu

être synthétisé de façon satisfaisante. L'étape limitante s'est révélée être la réaction de

formation du phosphotriester pourtant bien décrite dans la littérature pour d'autres

composés.150-152 Il semble que le problème soit lié à l'instabilité de la molécule 19 présentant

différentes positions très réactives. En effet, l'atome de phosphore est sensible aux attaques

nucléophiles tout comme l'ester et le méthylène en α de l'atome d'azote du sel de pyridinium.

Le phosphite 39 intermédiaire est bien observé en RMN 31P, même si la conversion n'est pas

totale. Le faible rendement observé pour le composé 19 (inférieur à 12%) ne peut pas être

entièrement attribué à la conversion incomplète en phophite triester 39. Ce dernier est

probablement dégradé dans les conditions d'oxydation.

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

90

Pour l'instant il semble difficile de pouvoir parvenir à achever la synthèse de l'analogue de

l'adduit BH-NAD portant le motif adénosine 18. Cependant, d'autres analogues peuvent être

envisagés avec des liens différents du lien monophosphate, qui est apparu difficile à obtenir.

Nous nous sommes particulièrement intéressés à la synthèse d'un analogue de l'adduit BH-

NAD portant le motif adénosine mais avec un lien diphosphate.

II.4. Analogue de l'adduit BH-NAD avec un lien diphosphate. La nouvelle molécule cible 50 sur laquelle nous nous sommes penchés est très proche

structuralement de la première, mais diffère par la présence d'un lien diphosphate pour

remplacer le phosphotriester qui n'a pas pu être synthétisé. Cette molécule présente donc deux

liaisons supplémentaires (Schéma 21) séparant le motif nicotinamide de l'adénosine par

rapport à l'adduit BH-NAD. Le maintien de cette longueur de chaîne permet d'envisager

l'utilisation de la molécule 20 synthétisée précédemment pour valider la méthode. De plus des

variations de la longueur de cette chaîne pourront être envisagées ultérieurement.

La 1,4-DHP 50 pourrait, comme précédemment, être obtenue directement par réduction

régiosélective du sel de pyridinium 51. Par analogie avec la synthèse chimique du cofacteur

NAD+,160 le dérivé 51 pourrait être obtenu par le couplage entre le sel de pyridinium 52

possédant un groupement phosphate en bout de chaîne et le phosphoromorpholidate 53

(Schéma 21).

N

N N

N

NH2

O

OHOH

OP

50

N

N N

N

NH2

O

OHOH

OP

53

OO

OPO

OHOO

O

N

OO

NH2 N

N N

N

NH2

O

OHOH

OPO

OO

PO

OHOO

O

N

NHHOO

N

NHO

HO

52

O

O

O

O

ONO

PO

OOH

51

N

N N

N

NH2

O

OHOH

OP

50

N

N N

N

NH2

O

OHOH

OP

53

OO

OPO

OHOO

O

N

OO

NH2 N

N N

N

NH2

O

OHOH

OPO

OO

PO

OHOO

O

N

NHHOO

N

NHO

HO

52

O

O

O

O

ONO

PO

OOH

51

Schéma 21

La synthèse du NAD+, est un exemple de la littérature couplant un

phosphoromorpholidate et un phosphotriester pour faire un lien diphosphate.160 De plus, une

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

91

forte ressemblance entre la molécule 50 et le cofacteur NAD+ existe, le ribose du

nicotinamide a été remplacé par une chaîne acétate de 3-hydroxypropyle et le motif benzoyle

a été rajouté. Ainsi, une extrapolation de la synthèse totale du NAD+ (Schéma 22) vers la

synthèse de l'analogue 50 devrait être favorable.

NO

N

NN

NO

OHOH

NH2

POP

OH OHO

OOH O

OO

O

NH2

N OP

OH OHO

OOH

O

O

NH2N

N N

N

NH2

O

OHOH

OP

53

O

ONO

NAD+

+

54 Schéma 22.

L'adénosine 5'-phosphoromorpholidate 53 a été obtenue par substitution nucléophile de la

morpholine sur l'adénosine 5'-monophosphate 55 (Schéma 23), activée par le

dicyclohexylcarboxamide (DCC), avec un excellent rendement comme décrit dans la

littérature.161

N

N N

N

NH2

O

OHOH

OP

53

O

ONO

N

N N

N

NH2

O

OHOH

OP

55

O

OH

NHO / DCC

t-BuOH

98%

HO

Schéma 23

L'étape consistant à former le dérivé phosphate 52 (Schéma 24) par action du trichlorure

de phosphoryle en présence de triméthyl phosphate sur le sel de pyridinium 20162 a conduit à

la perte de chaîne ester (composé 56), comme indiquée par la RMN 1H. Une hydrolyse de

l'ester a eu lieu lors du traitement de la réaction. Les tentatives pour obtenir le dérivé 52 par

d'autres méthodes décrites dans la littérature (m-crésol/POCl3)163 n'ont pas donné de résultats

encourageants. Le lien diphosphate n'a pas pu être formé en présence d'une fonction ester.

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

92

N

NHO

PhHO

52

O

O

O PO

OOH

N

NHO

PhHO

20

O

O

OH

POCl3PO(OMe)3

N

NHO

PhHO

OH

O

56

Schéma 24

II.5. Conclusion Bien que la synthèse d'un analogue de l'adduit BH-NAD n'ait pas abouti, cette stratégie

nous a permis d'obtenir une nouvelle série de composés portant une chaîne acétate de 3-

hydroxypropyle. Cette chaîne plus longue que celles précédemment utilisées dans les

composés synthétisés par S. Broussy et présentant un groupement hydroxyle (augmentation

de la polarité et possibilité d'interaction par pont hydrogène) pourrait avoir un impact sur

l'activité. De plus, ces dérivés facilement obtenus, pourraient être des intermédiaires de

synthèse pour la formation d'adduit BH-NAD portant le motif adénosine avec un lien

différent, comme par exemple un lien phosphothiolate diester.

II.6. Perspectives Dernièrement, une collaboration a débuté avec le professeur W. Stec en Pologne, qui a

développé au sein de son équipe, une méthode basée sur l'utilisation des intermédiaires de

type oxathiaphospholane au cours de la synthèse de polynucléotides modifiés pour former un

lien phosphothiolate diester.164,165 L'objectif est donc de synthétiser un analogue de l'adduit

BH-NAD portant un motif adénosine, par le biais d'un lien phosphothiolate diester. Pour

conserver le nombre de liaison séparant le motif nicotinamide de l'adénosine, la chaîne acétate

de 3-hydroxypropyle pourrait être maintenue. C'est donc la synthèse du dérivé 57 (Schéma

25) qui est proposée. Une fois de plus la 1,4-DHP pourrait venir de la réduction du sel de

pyridinium 58. Ce dernier pourrait être obtenu par la formation du lien phosphothiolate diester

à partir de l'oxathiaphospholane adénosine 59 sur lequel serait additionné le sel de pyridinium

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

93

20 avec un groupe hydroxyle en présence d'une base. L'oxathiaphospholane 59 pourrait alors

être synthétisé simplement à partir de l'adénosine protégé 60.164

N

N N

N

NH2

O

OHOH

ON

O

O

O PS

O57

NH2

OO

N

N N

N

NH2

O

OPOP

OP

59

SS

ON

NHO

HO

20

O

O

OHBr

N

N N

N

NH2

O

OPOP

HO

60

PS

ON

N

N N

N

NH2

O

OPOP

ON

O

O

O PS

O

NHO

HO

58

61

Schéma 25

Ce travail est actuellement en cours de réalisation.

D'autres alternatives peuvent aussi être envisagées en se basant sur les données de la

littérature. Rejman et al166 et Chen et al167 ont récement étudié et synthétisé des analogues du

NAD. Le lien diphosphate a été remplacé par un lien méthylènebis(sulfonamide) 63, ou par

un méthylènephosphophosphonate 62 (Figure 25). Très récement Bonnac et al168 ont aussi

décrit la synthèse de la 4-phénoxybenzamide adénine dinucléotide 64 (Figure 25) comme

analogue du NAD en tant qu'inhibiteur d'InhA. L'échange de l'atome d'azote de la DHP

permet d'éliminer de nombreux problèmes de stabilité que nous avons rencontré.

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

94

OO

N

NN

N

NH2

O P O P O

O O

NH2

OHOHOH OH

OO

OH OH

O

N

NN

N

NH2

O P O P O

OH OH

OO

OH OHCH2 O

O

N

NN

N

NH2

HN S S

HN

OHOHOH OH

OO

OH OHCH2

OHO

MeO Me

O

Méthylènephosphophosphonate62

NS

ONH2

Méthylènebis(sulfonamide)63

4-phenoxybenzamide adenine dinucleotide64

Figure 25 : Analogues de NAD décrits dans la littérature.166-168

III. Analogues simplifiés avec le motif isonicotinoyle Dans l'objectif de développer de nouveaux adduits INH-NAD simplifiés, nous nous

sommes également intéressés à la synthèse d'analogues portant le motif isonicotinoyle à la

place du motif benzoyle. Cette modification pourrait avoir une influence sur l'activité

recherchée.

Résumé et complément des publications J. Org. Chem. 2007, 72, 675-678 et Eur. J. Org.

Chem. 2007, 1624-1630 (Chapitre 3).

Bien que de nombreux adduits simplifiés aient déjà été synthétisés, aucun ne possède le

noyau isonicotinoyle comme groupement aroyle. Ainsi, il a semblé essentiel de synthétiser

des analogues simplifiés des adduits INH-NAD pour pouvoir conclure sur cette stratégie.

L'addition du motif isonicotinoyle est elle suffisante pour compenser la suppression du motif

ADP ainsi que la modification du ribose du nicotinamide ?

L'obtention du motif 4-isonicotinoyl-1,4-dihydronicotinamide 65 qui a fait l'objet d'une

publication ainsi que la synthèse d'analogues seront présentées ici.

La 1,4-DHP cible 65/66 pourrait théoriquement être obtenue par la même stratégie que le

composé 47 : une alkylation chimiosélective de l'atome d'azote pyridinique du nicotinamide

68 suivie par la réduction du sel de pyridinium intermédiaire 67 (Schéma 26).

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

95

N

NHO

HO

N

68N

NHO

HO

N

67

O

OBr

N

NHO

HO

N

66

O

O

N

O

O

OO

NH2

N

65

Schéma 26

III.1. Préparation du motif hémiamidal Différentes méthodes ont été examinées pour synthétiser l'hémiamidal 68. La première

approche a été l'addition nucléophile du 4-pyridinyllithium, généré par le n-butyllithium et la

4-bromopyridine, sur la 3,4-pyridinedicarboximide 27. L'échec de cette méthode a pu être

expliqué par la difficulté à former le 4-pyridinyllithium ou par son instabilité.

Comme alternative, l'addition du 3-bromo-4-pyridinyllithium sur le composé 27 a conduit

à l'hémiamidal 69 avec un faible rendement (Schéma 27), expliqué par la formation en

quantités importantes de deux impuretés, la 4-N,N-diisopropylaminopyridine et la 4-(3-

bromopyridinyl)-3-bromopyridine. La réaction d'échange métal-halogène (BuLi) sur le

composé 70 a conduit pour la première fois à la formation du composé 68 désiré. Cette

molécule, a toujours été observé sous forme hémiamidal cyclique, comme pour le composé

benzoyle 22. Cependant cette voie n'a pas pu être utilisée pour aller jusqu'au motif final

(DHP) en raison de son trop faible rendement. Afin d'augmenter l'efficacité d'obtention du

composé 68 une extension d'une méthodologie, déjà utilisée lors de la synthèse d'analogues de

l'adduit BH-NAD,149 a été développée. Cette méthodologie est basée sur l'orthométallation

dirigée de la N,N-diisopropylnicotinamide169 71 suivie de l'addition d'un composé

électrophile. En raison des difficultés à obtenir le N,N-diméthylisonicotinamide comme agent

électrophile, d'autres composés (le N,N-diéthylisonicotinamide, l'isonicotinaldéhyde, le 4-

cyanopyridine et le chlorure d'isonicotynoyle) ont donc été essayés mais sans succès.

Finalement, l'utilisation de l'amide de Weinreb 72 comme agent d'aroylation a conduit au

produit de condensation cétoamide 73 avec un rendement de 39%. Après une séquence

d'étapes170,171 de réduction, cyclisation, ouverture de la lactone, oxydation, acidification puis

conversion de l'acide en amide via le chlorure d'acide, le composé 68 a alors été obtenu. Le

rendement global de cette voie de synthèse a été de 29% pour 7 étapes (Schéma 27).

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

96

N

NHO

HO

N

68

N

N

ON

O N OMe

Me

39%

LDAEther

N

NHO

27

O

N

NHO

HO

N

70

Br

LDAEther

3-bromopyridine

5%74%

77%

n-BuLiTHF

N

N

OO

N

N

N

OOH

N

NaBH4

EtOH1) HCOOH2) NH3/MeOH3) Oxydation à l'air4) HCl5) SOCl2/NH3, acétone7473

71

72

96%

69

Schéma 27

Cette séquence réactionnelle a été nécessaire face à l'impossibilité constatée d'hydrolyser

directement la fonction amide tertiaire du produit 73.

Nous avons donc pensé substituer aux groupements isopropyles un autre groupement plus

facile à enlever.

Dans la littérature, il a été décrit une orthométallation dirigée sur le benzamide 75, où le

groupement protecteur est un allyle.172 Celui-ci présente l'avantage d'une part d'être

orthodirecteur et d'autre part de permettre la déprotection de la fonction amide en milieu acide

(Schéma 28).

NH

O

N

OLi -

Li+

LDA 2éq

-70°C

N

OLi

0°C

sec-BuLi N

OLiLi

1) CH3I

CH3 O

NH2

75

762) AcOH

Schéma 28

Nous avons essayé d'expérimenter cette réaction avec le dérivé pyridinique 77 et l'amide

de Weinreb 72 comme agent électrophile (Schéma 29). Cette réaction d'orthométallation

dirigée du dérivé 77 a été réalisée avec 2 équivalents de LDA et a été suivie de l'addition de

sec-BuLi. L'amide de Weinreb a ensuite été ajouté pour conduire au composé 78. Cependant,

cette tentative a échoué et le composé 78 n'a pas pu être obtenu. La présence de l'atome

d'azote de la pyridine a peut être été à l'origine d'une désactivation de la formation de

l'organolithien.

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

97

N

NH

O

N

N

OLi -

Li+

LDA 2éq-70°C

N

N

OLi

0°C

sec-BuLi

N

N

OLiLi

N

O N OMe

Me1)

N 78

77

72

OO

NH

N

Schéma 29

Une autre alternative pour la synthèse d'analogues de l'adduit INH-NAD avec un motif

pyridine, a été l'addition du 3-chloro-4-pyridinyllithium sur le composé 27 pour former

l'hémiamidal 80 avec un rendement de 15% après une recristallisation qui a permis de séparer

les isomères para (majoritaire) et méta (Schéma 30). L'échange du brome par le chlore a

permis de désactiver en partie le carbanion intermédiaire, ralentissant la formation du produit

secondaire 81. La molécule 80 a été utilisée pour l'étude de l'équilibre tautomérique dans la

publication résumée dans le chapitre 3.

N

NHO

O

N

NHO

HO

NCl

N

Cl LDATHF+

80

15%

27

N

N

ClCl

impureté

8179

Schéma 30

III.2. Préparation des sels de pyridinium L'étape suivante a été la synthèse du sel de pyridinium par N-alkylation chimiosélective

de l'atome d'azote du nicotinamide (Schéma 31).

Br

THF

R

N

NHO

HO

NX

X = Cl 80X = H 68

N

NHO

HO

NX

X = Cl 82X = H 67

RBr

B

A

N

NHO

HO

NX

X = Cl 83X = H 84

RBr

B

A

R

Br

N

NHO

HO

NX

X = Cl 85X = H 86

B

A

R

Br

R =O

O

Schéma 31

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

98

Cependant l'alkylation de l'hémiamidal 68 (X = H) par le bromoacétate d'éthyle a conduit

à la formation d'un mélange du dérivé monoalkylé sur le noyau pyridine (B) 84 majoritaire

(70%) et du produit de dialkylation à la fois sur l'azote du nicotinamide (A) et sur celui de la

pyridine (B) 86 minoritaire (30%). Le produit envisagé 67 issu de l'alkylation de l'atome

d'azote du nicotinamide (A) n'a pas été observé.

Par contre, l'alkylation de l'hémiamidal 3-chloropyridin-4-yl 80 a conduit majoritairement

(75%) à la formation du composé désiré 82 alkylé sur l'azote du nicotinamide (A) avec un

rendement de 33% après purification par HPLC semi-préparative. En effet l'atome de chlore a

permis de désactiver le noyau pyridine (B) vis-à-vis de l'alkylation. Toutefois, les produits de

monoalkylation de l'azote de la pyridine 85 et de dialkylation 83 ont aussi été observés

comme impuretés minoritaires.

Les différentes approches développées pour réduire la liaison C-Cl n'ont pas abouti à la

formation du sel de pyridinium 67. L'utilisation du Bu3SnH en présence d'AIBN comme

initiateur de radicaux a conduit à un mélange complexe de produits. L'hydrodéchloration sous

l'action du complexe Zn(Cu)-DMF-H2O173 a amené à la perte de la chaîne et seul

l'hémiamidal 68 a été récupéré. Finalement la dernière méthode utilisée a été la réduction du

chlorure d'aryle par le polyméthylhydrosiloxane en présence d'un catalyseur de palladium.174

Malheureusement cette méthode a elle aussi échoué, une réduction du sel de pyridinium a été

observée dans ces conditions.

La synthèse du sel de pyridinium 67 n'a donc pas pu être réalisée dans ces conditions. Le

schéma de synthèse habituellement utilisé pour la préparation de DHP n'a pas pu être appliqué

dans ce cas. La synthèse des adduits INH-NAD qui portent le motif 4-isonicotinoyl-1,4-

dihydronicotinamide est pourtant bien maîtrisée via une approche biomimétique.64 Elle est

basée sur une oxydation de l'INH par du pyrophosphate de MnIII en présence de NAD+. La

préparation des dérivés 1,4-DHP 65/66 pourrait donc être envisagée par cette même approche

biomimétique mettant en jeu le sel de pyridinium 88 comme équivalent simplifié du NAD+.

Pour cela, la synthèse du sel de pyridinium 88 a été réalisée par N-alkylation du

nicotinamide par le bromoacétate d'éthyle avec un rendement de 87% (Schéma 32). Ce sel de

pyridinium remplacera le NAD+ dans la réaction avec l'INH activé.

III.3. Préparation des dihydropyridines L'approche biomimétique pour synthétiser le motif 4-isonicotinoyl-1,4-

dihydronicotinamide a été basée sur une activation chimique de l'INH par le pyrophosphate de

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

99

MnIII en présence du sel de pyridinium 88 et a conduit pour la première fois à la formation des

1,4-DHP 65/66 cible avec un rendement de 57% (Schéma 32). Ces 1,4-DHP 65/66 ont été

retrouvées, en solution, en équilibre entre la forme cycle 66 (65-85%) et la forme chaîne 65

(15-35%) selon la polarité du solvant. Comme pour les adduits INH-NAD, la forme cyclique

est majoritaire contrairement à ce qui a été observé pour les dérivés BH-NAD (forme ouverte

majoritaire).

N

NH2

O

N

NH2

O

O

O

N

NHO

HO

N

O

O

NO

O

OO

NH2

N

+N

NHNH2O

Mn(H2P2O7)Tampon

phosphate

57%

87%

BrCH2COOEt

8866 67

87

INH

Schéma 32.

D'autres analogues du motif 4-isonicotinoyl-1,4-dihydronicotinamide ont été synthétisés

avec comme objectif leurs évaluations biologiques en vue d'études des relations structures-

activités. Les 1,2- et 1,4-DHP 89 et 91/92 ont été préparées à partir du sel de pyridinium 82

portant le motif 4-(3-chloropyridyl) (Schéma 33). La 1,2-DHP 89 a été obtenue par réduction

par NaBH4 dans l'éthanol avec un rendement de 31%. Comme attendu, seule la forme

hémiamidal cyclique a été observée. La 1,4-DHP 91/92 a été synthétisée par réduction

stéréoselective en utilisant NaBH(OAc)3 comme source d'hydrure, avec un rendement de

42%. L'attaque de l'hydrure a lieu sur la face occupée par l'alcool tertiaire, pour conduire à la

1,4-DHP cyclique cis† 90. Après ouverture spontanée, cette 1,4-DHP a elle aussi été retrouvée

sous forme d'équilibre entre la forme hémiamidal cyclique 92 trans (85%) et la forme céto-

amide ouverte 91 (15%).

† Cis et trans désignent les positions relatives de C4-H et C7-OH.

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

100

N N

NH

NH2

OO

OHO

OEt

O

OEt

O

N

NHO

HO

OEt

O

N

NHO

HO

OEt

O

N

N

N

NaBH4EtOH

31%

NaBH(OAc)3CH3COOH

EtOH

N

Cl

ClCl

Cl

42%82

89

91 92

N

NHO

HO

OEt

O

NCl

90

H H

cis+ énantiomère trans

+ énantiomère Schéma 33.

III.4. Article "Synthesis of the Isonicotinoylnicotinamide Scaffolds of the Naturrally Occurring

Isoniazid-NAD(P) Adduct". Tamara Delaine, Vania Bernardes-Génisson, Bernard Meunier,

and Jean Bernadou. J. Org. Chem., 2007, 72, 675-678.

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

101

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

102

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

103

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

104

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

105

III.5. Conclusion Nous avons développé deux stratégies pour obtenir l'hémiamidal avec le motif

isonicotinoyle 68. La plus efficace a été basée sur une orthométallation dirigée suivie d'une

substitution électrophile de l'amide de Weinreb 72. Comme la N-alkylation chimiosélective de

l'azote du nicotinamide n'a pas pu être réalisée, le motif 1,4-dihydronicotinamide n'a donc pas

pu être obtenu par la réduction du sel de pyridinium parent. En revanche, l'approche

biomimétique, développée pour la synthèse des adduits INH-NAD, a pu être étendue à la

préparation du 4-isonicotinoyl-1,4-dihydronicotinamide avec des rendements satisfaisants.

Des analogues de ce motif ont également pu être préparés par la voie classique non-

biomimétique. La 1,2-DHP 89 et la 1,4-DHP 91/92 ont pu être obtenues par réduction du sel

de pyridinium 82 provenant de l'alkylation chimiosélective de l'hémiamidal 80. Ce dernier a

été synthétisé en une seule étape par addition nucléophile d'un organolithien sur la 3,4-

pyridinedicarboximide.

L'ensemble de ces composés a donc pu être testé sur l'inhibition de l'activité réductase de

l'enzyme InhA et sur l'inhibition de croissance de mycobactéries. Les tests de molécules

portant le motif isonicotinoyle comme groupement aroyle vont permettre de déterminer

l'importance du motif adénosine diphosphate dans l'affinité des inhibiteurs potentiels d'InhA.

IV. Evaluation biologique IV.1. Inhibition de l'enzyme InhA

Une famille représentative de molécules de type hémiamidal (pyridine), pyridinium et

1,4-DHP décrite dans la Figure 26 a été testée vis-à-vis de l'inhibition de l'enzyme InhA. Le

composé 93, disponible au laboratoire, a été rajouté à cette étude.

Tous les composés testés à une concentration de 100 µM n'ont montré aucune activité

inhibitrice vis-à-vis de l'enzyme InhA.

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

106

N

NHO

HO

X

68

Y

Z

X = NZ = H

22 X = CY = HZ = H

93 X = CY = OPhZ = H

80 X = NZ = Cl

70 X = NZ = Br

N

NHO

OH

28

N

NHO

HO

20

O

O

OHBr

N

47

O

O

OH

NH2

OO

N

NHO

HO

N

66

O

O

N

65

O

O

NH2

OO

N

Hémiamidal

Sel de pyridinium 1,4 DHP

Figure 25 : Molécules testées vis-à-vis de l'inhibition d'InhA.

Paradoxalement la molécule 93 se comporte comme un activateur de l'enzyme. En effet

lors de sa présence, InhA a montré un gain d'activité de 126% qui est difficile à interpréter. Le

même phénomène avait été observé pour l'hémiamidal portant le 4-butylphényl 94 (Figure

27).145 Pour le moment nous n'avons pas d'explication précise à proposer pour justifier ce

phénomène, sinon l'évoquation d' effets non-spécifiques.

Il semble que la perte du motif ADP entraine une trop forte diminution de l'affinité pour

InhA qui ne peut pas être tout simplement compensée par l'addition d'un motif aroyle.

Même si nous n'avons pas réussi à synthétiser de nouveaux inhibiteurs d'InhA, ces adduits

INH-NAD simplifiés de première génération pourraient quand même avoir une activité

antimycobactérienne par un autre mécanisme d'action. Leur activité inhibitrice a donc été

testée sur la croissance de Mycobacterium smegmatis.

IV.2. Inhibition de la croissance de Mycobacterium smegmatis mc2155 Toutes les molécules testées sur InhA (Figure 26) ainsi que les molécules synthétisées au

cours de ce chapitre 46, 82 et 89 et certaines déjà disponibles au laboratoire 94, 95, 96, 97 et

98 (Figure 26), ont été testées sur l'inhibition de croissance de mycobactéries. La souche non

pathogène la plus fréquemment utilisée est la souche mc2155 de Mycobacterium smegmatis.‡

‡ Une description plus précise du test sera faite dans le chapitre II.

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

107

N

NHO

HO

N

NHO

HO

N

NHO

HO

OO

N

NHO

HO

R

X

Y

X = CHY = HR = CH2COOEt

X = CHY = HR = ribose(OAc)3

X = NY = ClR = CH2COOEt

N

NHO

HO

R

X

YX = CHY = HR = CH2COO(CH2)3OH

x = NY = ClX = CH2COOEt

94

9695

89

46

82

98

97

Hémiamidal

Sel de pyridinium 1,2 DHP

Figure 26 : Molécules testées sur l'inhibition de la croissance des mycobactéries

Tous les composés sont testés sur une gamme de concentration allant de 5 mM à 78 µM.

Seuls les hémiamidals 95 et 98, le sel de pyridinium 20 et la 1,2 DHP 89 ont montré une

faible inhibition de croissance. Une inhibition d'environ 50% de la croissance des

mycobactéries est observée pour une concentration d'environ 2,5 mM en inhibiteur, et cela

pour les quatre molécules. Tous les autres composés n'ont montré aucune inhibition même à 5

mM. Pour comparaison, la CI50 de l'INH est de 7,8 ± 0,6 µM, soit environ 300 fois inférieur.

Bien que faible, pour la première fois des analogues simplifiés de l'adduit INH-NAD ont

montré une activité antimycobactérienne. Il est important de noter que toutes les familles de

molécules (pyridine, sel de pyridinium et 1,2-DHP) sont représentées dans ces nouveaux

inhibiteurs sauf les 1,4-DHP.

V. Conclusion Malgré les efforts consacrés à la synthèse d'analogues de l'adduit BH-NAD portant le

motif adénosine, nous n'avons pas réussi à obtenir un tel composé. Cependant une nouvelle

série de composés avec une chaîne acétate de 3-hydroxypropyle est née de cette approche.

Le second volet de ce chapitre visait à synthétiser des analogues simplifiés de l'adduit

INH-NAD. Nous avons obtenu le motif 4-isonicotinoyl-1,4-dihydronicotinamide en utilisant

une voie biomimétique pour activer l'INH. Un dérivé chloré a aussi été synthétisé.

Chapitre I : Synthèse d'analogues des adduits INH(BH)-NAD

108

Les évaluations biologiques n'ont révélé aucun inhibiteur de l'enzyme InhA alors que les

molécules 20, 89, 95 et 98, à une concentration de 2,5 mM, ont induit une inhibition de 50%

de la croissance de Mycobacterium smegmatis. Il semble donc que d'autres cibles qu'InhA

doivent être envisagées pour ces composés.

Bien que ces résultats soient encourageants, un changement de stratégie est nécessaire

pour espérer obtenir des molécules inhibitrices dans les mêmes gammes de concentration que

l'INH. En effet l'addition d'un motif isonicotinoyle ou benzoyle n'a pas été suffisant à lui tout

seul pour compenser la perte du motif ADP.

Cette nouvelle stratégie sera développée dans le chapitre II.

CHAPITRE II : SYNTHESE DES INHIBITEURS DE

TYPE BISUBSTRAT CONFIDENTIEL : En attente d'un brevet

Résumé et complément (introduction des résultats non publiés) de la publication à soumettre 1.

Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat

111

I. Introduction Afin d'augmenter l'affinité des analogues simplifiés de l'adduit INH-NAD vis-à-vis

d'InhA une stratégie dite bisubstrat a été envisagée. Bien que de nombreux médicaments

soient inspirés de la structure du substrat de l'enzyme, il est bien connu que les enzymes ont

souvent besoin en plus du substrat, d'un cofacteur pour fonctionner. Ainsi, InhA catalyse la

réduction de la double liaison conjuguée au carbonyle des substrats acides gras, via le

cofacteur NADH. La conception d'inhibiteurs basée sur une association covalente des motifs

chimiques analogues à la fois du substrat et du cofacteur (stratégie bisubstrat) pourrait

conduire à de nouvelles structures avec de meilleures affinités et sélectivités pour le site actif

de l'enzyme cible.

Schéma 34

Argyrou et al ont décrit que les adduits INH-NAD agissent comme des molécules

prototypes de bisubstrats.175 A partir de ces considérations, nous proposons de synthétiser des

analogues simplifiés des adduits BH-NAD de seconde génération. Dans la suite de ce

chapitre, sera présentée la synthèse de composés de type pyridine, sel de pyridinium et 1,4-

dihydropyridine inspirés de ce concept ainsi que leurs évaluations biologiques aussi bien sur

l'enzyme InhA que sur les bactéries.

II. Analyse rétrosynthétique Nous souhaitons donc synthétiser trois séries de molécules de type bisubstrat, la première

avec le motif 1,4 dihydropyridine, la seconde avec le motif sel de pyridinium et enfin la

dernière avec le motif pyridine. Les 1,4-DHP pourraient être obtenues directement par

réduction régiosélective des sels de pyridinium, eux-mêmes synthétisés par alkylation des

pyridines hémiamidal correspondantes de type bisubstrat. Ces dernières pourraient provenir

d'intermédiaires clés de type hémiamidal fonctionnalisés (Schéma 35).

Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat

112

Schéma 35

Comme nous l'avons vu dans le chapitre I, les intermédiaires fonctionnalisés pourraient

être obtenus à partir de l'acide nicotinique 26 soit à partir de la 3,4 pyridinedicarboximide 27.

III. Intermédiaires fonctionnalisés III.1. Synthèse de l'hémiamidal 103

Nous avons débuté par la synthèse de l'hémiamidal fonctionnalisé 103.

Les deux voies de synthèse décrites dans le chapitre I ont été mises en œuvre. Tout

d'abord à partir de la N,N-diisopropylnicotinamide, préparé comme décrit dans la

littérature,176 qui par orthométallation dirigée suivie de l'addition de 99 a conduit à 100

(Schéma 36). Après réduction en 101, puis lactonisation en milieu acide, ouverture en milieu

basique, oxydation à l'air et acidification, le 102 est obtenu. La formation de l'hémiamidal 103

a été réalisée via le chlorure d'acide avec un rendement global de 16%. La deuxième voie de

synthèse n'a présenté qu'une seule étape et a résulté d'une addition nucléophile sur la 3,4-

pyridinedicarboximide 27. L'hémiamidal 103 a été obtenu après recristallisation avec un

rendement de 32%.

N

O

N 1) LDA, Ether

2)

Br

NO O

N

O

N

O

Br

NaBH4

EtOH

N

O

N

OH

Br

N

OO

Br

OH

1) HCOOH2) NH3 / MeOH3) Oxydation à l'air4) HCl

N

NHON

NHO

HO

OBr

1) SOCl2

2) NH4OH aq

Br

Br

+

1) nBuLiTHF

32%

28% 92%

85%

80%

103

99100 101

10227

2)recristallisation

71

Schéma 36

Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat

113

III.2. Synthèse de l'hémiamidal 107 Le deuxième intermédiaire fonctionnalisé que nous avons synthétisé est l'hémiamidal 107

(Schéma 37). L'addition de l'anion de 105 sur la 3,4-pyridinedicarboximide 27, a conduit à

l'hémiamidal 106 avec un rendement de 21% mais environ 50% de 105 a été récupéré intact.

La dernière étape a conduit à l'hémiamidal attendu 107 avec un rendement global de 16%.

N

NHO

N

NHO

HOO

O

O

Br

1) t-BuLiTHF21%

N

NHO

HO

OH

MeOH80%

2)

OH

BrCH2Cl2 / H2O

n-Bu4NOH

Br

93%

K2CO3

Pd(PPh3)4105 106 107104

37

Schéma 37

IV. Molécules de type bisubstrat en série pyridine IV.1. Famille 1 en série pyridine

N

NHO

HO

Br

RB(OH)2Pd(dppf).Cl2

K2CO3

THF N

NHO

HO

R

R =

8

11

7

108

109

110 26%

24%

15%

O

OH

0%

0%

Ag2O

112

111

103

Schéma 38

L'hémiamidal 103 a conduit aux hémiamidals de type bisubstrat attendus 108, 109 et 110

avec des rendements de 15%, 24% et 26% respectivement (Schéma 38). Par contre les

hémiamidals 111 et 112 n'ont jamais été obtenus.

Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat

114

IV.2. Famille 2 en série pyridine IV.2.1. Tentatives de préparation des hémiamidals 115 et 116

Les tentatives préliminaires pour fonctionaliser l'hémaiamidal 103 ont été infructueuses

(Schéma 39). En effet, le couplage de l'hémiamidal 103 avec 113 et 114 n'a pas conduit aux

produits désirés 115 et 116, les seuls produits qui ont été isolés après trois jours à 150 °C sont

les composés 117 et 118. Le massif isotopique de ces deux produits (m/z = 523 et 532

respectivement) étant très caractéristiques nous avons pu les identifier par spectrométrie de

masse.

N

NH

O

HO

Br

OHX

Cl

DMF150 °C

Cs2CO3CuCl2

N

NHO

HO

O

X

Cl

N

NHO

O

O

X

Cl

X

Cl

+

X = OMe Cl

103114

113

X = OMe Cl

116

115

X = OMe Cl118

117

ou

ou

ou

Schéma 39

L'explication que nous proposons pour la formation de ces composés 117 et 118 est la

possibilité à cette température d'une déshydratation pour former un iminium du composé 103

(Schéma 40). Le nucléophile pourrait alors attaquer l'iminium.

Schéma 40

Des conditions plus douces124,177 ont été essayées mais aucune réaction n'a eu lieu et seul

l'hémiamidal de départ a été retrouvé.

IV.2.2. Synthèse de l'hémaiamidal 119

Suite à cet échec, la synthèse du composé 119 (Schéma 41) à partir de l'hémiamidal 107 a

été envisagée. La substitution nuclophile du composé formé en milieu basique (CsCO3) sur

l'électrophile E à température ambiante a conduit au produit désiré 119. Une impureté, le

Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat

115

composé 120, a été formée au cours de cette réaction avec un rendement de 35% (Schéma

41). Pour optimiser cette réaction, le carbonate de césium a été remplacé par du carbonate de

potassium, ce qui a limité la formation de l'impureté 120 à 10% et a conduit au composé 119

désiré avec un rendement de 61%

N

NHO

HO

OH

I11

K2CO3

DMF61%

N

NHO

HO

11

N

NHO

O

11

11

Impureté

OH

Br

I11

K2CO3

DMF98%

O

Br

11

N

NHO

O1) t-BuLiTHF 10%

107 119 120

27

121104

E

E

Schéma 41

Pour contourner cet obstacle, nous avons envisagé de modifier la voie de synthèse. La

substitution nucléophile de 104 sur E a ainsi été réalisée dans un premier temps pour conduire

à la formation du composé 121 (Schéma 41). L'addition de l'anion de 121 sur la

pyridinedicarboximide 27 a conduit à la formation de l'hémiamidal désiré 119 avec un

rendement sur deux étapes de 10%. Cette nouvelle voie de synthèse ne permet pas

d'augmenter le rendement le renement global de 119, cependant elle évite deux étapes.

Nous avons ainsi pu obtenir quatre nouvelles molécules de type bisubstrat (108, 109, 110,

119) en série pyridine.

V. Molécules de type bisubstrat en série pyridinium L'étape suivante a été la N-alkylation de la pyridine par différents dérivés bromés. Les

hémiamidals 109 et 119 ont été alkylés pour conduire aux sels de pyridinium correspondant

122, 123 et 124 avec des rendements de 78%, 54% et 35% respectivement (Schéma 42).

Trois molécules de types bisubstrats 122, 123 et 124 ont pu être obtenues en série

pyridinium.

Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat

116

VI. Molécules de type bisubstrat en série 1,4-dihydropyridine Les sels de pyridinium ont ensuite été réduits régiosélectivement en 1,4-DHP par le

triacétoxyborohydrure de sodium dans un mélange acide acétique / éthanol (1 : 3). Les 1,4-

DHP obtenues initialement sous forme hémiamidal cyclique s'ouvrent spontanément pour

donner les formes céto-amides 125, 126 et 127 avec des rendements de 33%, 72% et 44%

respectivement (Schéma 42).

N

NHO

HO

R

R =11

O11

THF N

NHO

HO

R

BrO

R2

O

R2 = Et

CH2CH2CH2OHO

11

Et

R =11

O11

O

OR2

NaBH(OAc)3

CH3COOH

EtOH

R =11

O11

R2 = Et

CH2CH2CH2OHO

11

Et

NO

OR2

O

NH2

O

R

109

119

122

123

124

125

126

127

Schéma 42

Une nouvelle famille de molécules de type bisubstrat a ainsi été obtenue en la série 1,4-

DHP. Les composés 125, 126 et 127 appartiennent à cette série.

VII. Inhibition de l'enzyme InhA Tous les composés bisubstrats ainsi que les intermédiaires fonctionnalisés (103, 106, 107,

108, 109, 110, 119, 122, 123, 124, 125, 126 et 127) ont été testés vis-à-vis de l'inhibition

d'InhA. Ces tests ont été réalisés avec un temps de préincubation de 5 min à des

concentrations en composé de 100 µM excepté le pool d'adduit INH-NAD (10 µM, 1 µM et

500 nM), le triclosan (10 µM) et le 125 (10 µM) pour contourner des problèmes de

précipitation. Le pool d'adduit et le triclosan ont été introduits dans cette étude comme

contrôle positif. Ces deux composés inhibent InhA en occupant des sites d'interaction

différents. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition et sont rapportés dans les

tableaux suivants. Le triclosan présente une inhibition de 40% de l'activité enzymatique

d'InhA pour une concentration de 10 µM.

Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat

117

Série pyridine

InhA InhA InhA

N

NHO

HO

Br

103

20%

N

NHO

HO

OH

107

17%

N

NHO

HO

O

106

23%

6

N

NHO

HO

108

9%

10

N

NHO

HO

109

4%

7

N

NHO

HO

110

17%

N

NHO

HO

O11

119

41%

Tableau 2 : Pourcentage d'inhibition de l'enzyme InhA par les différentes molécules de type bisubstrat en série pyridine.

Parmi les composés en série pyridine, seul l'hémiamidal 119 a présenté une activité

inhibitrice significative. Ce dérivé a donc également été testé avec un temps de préincubation

de 2 h et l'activité du composé est augmentée, 80% de l'activité d'InhA est alors inhibée pour

une concentration de 100 µM. Il se comporte de la même manière que les adduits INH-NAD

qui présentent une meilleure activité avec un temps d'incubation plus long. Cependant, la

concentration nécessaire pour observer une telle inhibition est plus élevée pour ce composé

(100 µM) que pour le triclosan (10 µM) et les adduits INH-NAD (500 nM).

Série pyridinium

InhA InhA InhA

N

NHO

HO

O

O Br

11

122

91% (100 µM)

40%

(20 µM) N

NHO

HO

O

O Br

11

O

123

35%

11

N

NHO

HO

O

O

OBr

HO

124

30%

Tableau 3 : Pourcentage d'inhibition de l'enzyme InhA par les différentes molécules de type bisubstrat en série pyridinium.

Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat

118

Les trois sels de pyridinium de type bisubstrat se comportent comme des inhibiteurs de

l'enzyme InhA. Le composé 122 a présenté la meilleure activité, il a inhibé 40% de l'activité

enzymatique d'InhA à 20 µM. Ce composé se rapproche de l'activité inhibitrice du triclosan

(40% d'inhibition à 10 µM). Les deux autres composés ont montré une moins bonne activité

inhibitrice, elle est de l'ordre de celle retrouvée pour le composé 119. De plus aucune

amélioration de l'activité inhibitrice n'a été observée après une préincubation de 2 h.

Série dihydropyridine

InhA InhA InhA

N

O

O

NH2

OO

11

125

25% (10 µM)

N

O

O

NH2

OO

O11

126

6%

N

N

O

O

NH2

OO

O 10

HO

127

3%

Pool d'adduits INH-NAD

92% (10 µM)

67% (1 µM)

53% (0,5 µM)

Tableau 4 : Pourcentage d'inhibition de l'enzyme InhA par les différentes molécules de type bisubstrat en série 1,4-DHP.

Seule le 125 a été responsable d'une inhibition de l'enzyme InhA (25% d'inhibition à 10

µM), par contre, les 126 et 127 n'ont montré aucune activité inhibitrice à 100 µM. De plus,

contrairement aux adduits INH-NAD, nous n'avons pas observé de meilleure inhibition avec

deux heures de préincubation pour le 125.

Bien que plus faiblement actif que le triclosan ou les adduits INH-NAD, l'activité

inhibitrice d'InhA des composés de type bisubstrat synthétisés a permis de valider la stratégie

élaborée dans ce chapitre. En effet, toutes les séries, pyridines, sels de pyridinium et DHP de

type bisubstrat sont représentées dans les inhibiteurs d'InhA développés. L'association

covalente des motifs chimiques analogues du substrat et du cofacteur au sein de la même

Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat

119

molécule a permis de compenser en partie la perte d'affinité due à la suppression du motif

adénosine diphosphate.

VIII. Article Publication à soumettre 1 : Bi-substrate Inhibitor Concept for the Development of Potential

Antitubercular Agents with InhA Inhibitory Activity. Tamara Delaine, Vania Bernardes-

Génisson, Annaïk Quémard, Jean Bernadou.

CONFIDENTIEL : en attente d'un brevet.

IX. Inhibition de la croissance de mycobactéries Mycobacterium smegmatis mc2155

Après des tests encourageants sur l'enzyme InhA, la capacité des composés 103, 106, 107,

108, 109, 110, 119, 122 et 125 (Figure 28) à inhiber la croissance mycobactérienne a été

évaluée sur la souche mc2155 de M. smegmatis, espèce non pathogène, en utilisant un test

colorimétrique de réduction du MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-

2H-tétrazolium). Ce colorant jaune est réduit par une réductase de la mycobactérie en cristaux

de formazan de couleur violette, qui peuvent être dosés par spectrophotométrie (570 nm)

après solubilisation. La quantité de formazan formée est proportionnelle à la quantité de

bactéries vivantes dans les échantillons.

N

NHO

HO

Br

N

NHO

HO

OH

N

NHO

HO

O

N

NHO

HO

O11 10

N

NHO

HO

7

N

NHO

HO

6

N

NHO

HO

10

N

NHO

HO

O

OBr N

O

O

NH2

OO

9

N

O NHNH2

OCl

Cl

OH

Cl

103 107 106 119 109 110

INH

108 122 125

Triclosan

Figure 28 : Molécules testées sur l'inhibition de croissance de M. smegmatis.

Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat

120

Les résultats (variation de l'absorbance en fonction de la concentration en inhibiteur) sont

représentés sur la Figure 29.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

0,01 0,1 1 10

Concentration (mM)

DO 5

70nm

Sans bactériesDMSO103109110107106119

0

0,2

0,4

0,6

0,8

0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10

Concentration (mM)

DO 5

70nm

Sans BactériesDMSOINH108122125Triclosan

Figure 29 : Evaluation de l'activité antimycobactérienne des composés de type bisubstrats.

Le triclosan et l'INH ont été testés comme témoins, les concentrations trouvées de 1,4 µM

et de 8 µM, respectivement, pour inhiber 50% de la croissance de M. smegmatis sont en

accord avec les données décrites dans la littérature.

Les expériences ont montré que tous les composés ont inhibé la croissance

mycobactérienne sauf l'hémiamidal 103, qui est le composé le plus proche de la famille de

composés de première génération (analogues simplifiés de l'adduit INH(BH)-NAD), qui

n'avait pas montré d'activité. Il ne montre aucune activité jusqu'à 5 mM.

Les hémiamidals 106, 107 et 110 ont en effet montré une activité inhibitrice mais à des

concentrations assez élevées. Une inhibition de 50% de la croissance mycobactérienne a été

observée pour une concentration de l'ordre de 1,3 mM pour le 106, de 1,8 mM pour le 110 et

Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat

121

de 300 µM pour le 107. Ces concentrations sont tout de même beaucoup plus élevées que la

CI50 de l'INH qui est de 7,8 ± 0,6 µM.

L'ensemble des composés restants ont tous été actifs et ont pu être séparés en deux

catégories. La première comporte les hémiamidals 109 et 119 qui ont montré 50% d'inhibition

de croissance pour des concentrations de 50 µM et 68 µM respectivement, ces valeurs restent

tout de même assez éloignées de la CI50 de l'INH (un facteur 10). La deuxième catégorie,

l'hémiamidal 108, le sel 122 et le DHP 125 ont tous présenté des activités comparables à celle

de l'INH (7,8 µM) avec des concentrations pour inhiber 50% de la croissance bactérienne

égales à 4,5 µM, 3,2 µM et 5,4 µM respectivement.

Ces résultats montrent que seuls les composés de types bisubstrats ont une activité

antimycobactérienne. Ils pourraient être classés comme des analogues simplifiés des adduits

INH-NAD. Il est important de noter que dans la famille de dérivés de type bisubstrat, seul

l'hémiamidal 110 n'a pas présenté d'activité intéressante. Très probablement, la rigidité de la

structure a fait chuter l'activité.

Cependant une différence importante d'activité subsiste entre les hémiamidals 109 et 119

(activité moyenne) d'un côté et les composés 108, 122 et 125 de l'autre (excellente activité).

Une fois de plus le sel et la DHP, molécules les plus proches des adduits INH-NAD, ont

présenté une très bonne activité inhibitrice de la croissance bactérienne, comme pour

l'inhibition d'InhA. Par contre, l'hémiamidal 108 n'a présenté aucune activité vis-à-vis d'InhA

mais s'est comporté comme un très bon antibactérien. La cible moléculaire de cette molécule

est certainement différente. Il en est de même pour l'hémiamidal 109. Cependant, dans tous

les cas, ces composés sont plus actifs sur la croissance des mycobactéries que sur InhA isolé,

InhA ne semble pas être la seule cible moléculaire de ces composés.

Pour essayer de comprendre un peu mieux le mécanisme d'action de ces différents

inhibiteurs nous avons réalisé des tests de sélectivité en les utilisant sur différentes souches de

bactéries.

Sélectivité

Les composés qui ont montré une activité à moins de 100 µM sur M. smegmatis, c'est-à-

dire les composés 109, 119, 108, 122 et 125, ont ensuite été testés sur d'autres souches de

bactéries. Les deux témoins INH et triclosan ont eux aussi été gardés pour ces tests

approfondis.

La première souche qui a été testée est Escherichia coli DH5α. Elle va permettre de

déterminer la sélectivité de nos composés. Sont-ils sélectifs vis-à-vis des mycobactéries ou

Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat

122

bien inhibent-ils aussi la croissance de bactéries plus communes comme E. coli. Il faut aussi

noter que E. coli possède une énoyl-ACP réductase.

La souche suivante est Corynebacterium glutamicum. En plus de donner des

renseignements sur la sélectivité, elle peut donner des indications sur la cible moléculaire des

composés. En effet, les bactéries appartenant à cette souche présentent la particularité de ne

pas posséder de cycle d'élongation FAS-II dans la biosynthèse des acides gras. Il n'y a donc

pas d'homologue d'InhA dans C. glutamicum. Les composés actifs principalement sur InhA ne

devraient pas inhiber la croissance de C. glutamicum. Les composés actifs sur cette souche de

bactéries auront obligatoirement une autre cible que le système FAS-II. Comme nous l'avons

vu, probablement d'autres cibles qu'InhA sont visées, mais font elles ou non partie du système

FAS-II?

Nous avons déterminé la CI50 des composés suivants sur les trois souches bactériennes M.

smegmatis, E. coli et C. glutamicum : 109, 119, 108, 122 et 125 ainsi que pour les deux

témoins l'INH et le triclosan. Les CI50 de tous ces composés sur les trois souches sont

représentées sur la Figure 30.

1

10

100

1000

10000

CI 50

µM

M. smegmatisC. glutamicumE. coli

INH

Concentrationmaximale testée

108 109 119 122 125

1

10

100

1000

10000

CI 50

µM

M. smegmatisC. glutamicumE. coli

INH

Concentrationmaximale testée

108 109 119 122 125 Figure 30 : Diagramme des CI50 des composés INH, 108, 109, 119, 122, 125 sur M.

smegmatis, E. coli et C. glutamicum.

Les CI50 du triclosan sont volontairement absentes de ce diagramme pour éviter un

problème d'échelle. Les valeurs pour le triclosan sont donc 1,0 ± 0,1 µM, 2,4 ± 0,2 µM et 35 ±

4 nM pour M. smegmatis, C. glutamicum et E. coli respectivement. Ces valeurs confirment

Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat

123

que le triclosan est un bon agent antibactérien. Il est actif sur toutes les bactéries que nous

avons étudiées mais ne présente aucune sélectivité.

Ces résultats confirment ceux obtenus précédemment sur M. smegmatis en les affinant.

Trois composés ont une meilleure CI50 que l'INH alors que les deux autres ont des valeurs une

décade au dessus.

Comme attendu, l'INH ne présente aucune activité sur C. glutamicum ni sur E. coli à 5

mM.

D'une manière générale, les inhibiteurs de type bisubstrat ont été beaucoup moins actifs

sur E. coli que sur M. smegmatis et C. glutamicum, les hémiamidals 109 et 119 ne présentent

même aucune activité inhibitrice à 5 mM. La sélectivité est très bonne avec ces trois souches

bactérienne. La CI50 pour le dérivé 108 a elle aussi été très élevée, 3,5 mM, alors que la CI50

sur M. smegmatis a été de 4,6 µM. Dans ce cas, la sélectivité a aussi été excellente. Par contre,

les composés 122 et 125 ont été moins sélectifs, mais la différence de CI50 entre les deux

souches est tout de même restée d'une et de deux décades respectivement. Bien que pour le sel

la sélectivité semble assez faible, elle reste très correcte pour la DHP.

De la famille des inhibiteurs de type bisubstrat, seule l'hémiamidal 119 n'a présenté

aucune activité inhibitrice de la croissance de C. glutamicum. Tous les autres composés,

présentent une CI50 ≤ 10 µM. Il semble donc évident que pour tous ces composés, la cible

moléculaire ne peut pas être seulement InhA. Ces inhibiteurs, ne touchent pas exclusivement

le cycle d'élongation FAS-II de la biosynthèse des acides mycoliques lors de l'inhibition de

croissance de mycobactéries. D'ailleurs, il est aussi connu que les adduits INH-NAD inhibent

d'autres cibles qu'InhA.

Par contre la molécule hémiamidal 119 paraît très intéressante, dans la mesure, où elle est

la seule à présenter à la fois une activité inhibitrice d'InhA et de M. smegmatis sans inhiber la

croissance des autres bactéries. Les résultats obtenus semblent indiquer que la cible de

l'hémiamidal 119 soit bien InhA. En effet, cette molécule n'a pas été capable d'inhiber C.

glutamicum qui ne possède pas d'équivalent d'InhA. Cette incapacité à inhiber la croissance de

cette souche, pourrait venir de la non pénétration de la paroi, nous avons donc comparé la

lipophilie relative (paramètre important dans l'activité antimycobactérienne) des différents

composés testés. Des valeurs théoriques de logP (P : coefficient de partage entre l'octanol et

l'eau) ont été calculées selon la méthode de fragmentation (de Crippen178 et de

Viswanadhan179) (Tableau 5). Le logP du 122 n'a pas pu être déterminé par ces techniques.

Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat

124

Les valeurs sont comprises entre 5 et 6 pour les quatre molécules de type bisubstrat. Le

composé 119 est le seul à ne pas inhiber la croissance de C. glutamicum, cependant cela ne

peut pas venir d'une mauvaise pénétration (si elle se fait par une diffusion passive) car tous les

autres composés de type bisubstrat ont une activité inhibitrice avec des coefficients de partage

supérieur et inférieur selon les molécules.

Produits

logP (Crippen)

logP (Viswanadhan)

INH

108

109

119

125

Triclosan

-0,64

4,88

6,55

5,93

5,69

4,86

-0,44

5,04

6,62

5,92

5,26

4,75

Tableau 5 : logP théorique de l'INH, des composés 108, 109, 119, 125 et du triclosan.

Un autre aspect intéressant de cette molécule 119 est sa sélectivité. En effet, elle a été

capable d'inhiber la croissance de M. smegmatis qui présente InhA mais pas d'inhiber la

croissance d'E. coli qui pourtant possède une énoyl-ACP réductase FabI différente d'InhA.

Ces résultats sont contraires à ceux du triclosan qui lui a une bien meilleure activité sur E.

coli, ce qui est cohérent avec la littérature.180 Le composé 119 est beaucoup plus sélectif que

le triclosan.

Mycobacterium tuberculosis H37rv

L'ensemble de ces composés 108, 109, 119, 122 et 125, a également été testé sur

l'inhibition de croissance de M. tuberculosis (espèce pathogène) par Patricia Constant à

l'Institut de Pharmacologie et Biologie Structurale à Toulouse.

Les résultats présentés ici sont préliminaires et doivent encore être confirmés. La

concentration nécessaire pour inhibiber 50% de la croissance de M. tuberculosis ainsi que la

CMI sont représentées dans le Tableau 6.

Le triclosan et l'INH ont été testés comme témoins. La CMI du triclosan trouvée est de 2

µg/mL, sur M. tuberculosis est en accord avec les données décrites dans la littérature.124 La

CMI de 0,08 µg/mL pour l'INH est elle aussi en accord avec les données de la littérature.124

Cependant, les expériences réalisées jusqu'à présent n'ont pas permis de déterminer la

concentration nécessaire pour inhiber 50% de la croissance mycobactérienne.

Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat

125

Composés

Inhibition 50%

croissance (µM)

CMI (µg/mL) [µM]

INH

108

109

119

122

125

Triclosan

ND

4

4

20

6

5

2

0,08 [0,6]

6,8 [20]

5,9 [15]

32,8 [80]

11,2 [20]

4,8 [10]

2,0 [7]

Tableau 6 : Concentration pour inhiber 50% de la croissance de M. tuberculosis et CMI pour les composés 108, 109, 119, 122, 125, INH et triclosan. (ND : non déterminé).

L'ensemble de ces composés bisubstrats testés semble avoir une bonne activité inhibitrice

de la croissance de M. tuberculosis. Les concentrations pour inhiber 50% de la croissance

mycobactérienne des composés 108, 109, 122 et 125 sont relativement proches de celle du

triclosan. Comme sur M. smegmatis, le 119 présente une concentration pour inhiber 50% de la

croissance mycobactérienne un peu plus élevée mais tout de même assez faible. Toutes les

activités observées sur M. smegmatis ont été retrouvées sur M. tuberculosis. Cependant ces

résultats doivent encore être confirmés.

X. Conclusion Nous avons réussi à synthétiser trois nouvelles séries de molécules basées sur le principe

d'inhibiteurs de type bisubstrat. Une série pyridine, une série sel de pyridinium et une série

1,4-DHP ont été obtenues dans cette approche. Nous avons associé de façon covalente les

motifs chimiques du substrat et du cofacteur au sein de la même molécule.

Cette approche s'est révélée fructueuse. En effet, pour la première fois, nous avons réussi

à obtenir des molécules présentant une activité inhibitrice d'InhA. Des inhibiteurs ont été

identifiés dans les trois séries types étudiées.

De plus une grande partie des molécules de type bisubstrat ont aussi présenté une activité

antimycobactérienne. Bien qu'un lien entre ces deux activités n'ait pas pu être montré, ces

molécules présentent un intérêt dans le développement de nouveaux médicaments

antituberculeux. En particulier le composé 119 qui est le seul à présenter une bonne activité

inhibitrice à la fois d'InhA et sur la croissance des mycobactéries tout en faisant preuve d'une

bonne sélectivité.

Chapitre II : Synthèse des inhibiteurs de type bisubstrat

126

L'évaluation de l'inhibition de la croissance de M. tuberculosis par les molécules 108,

109, 119, 122 et 125 doit être confirmée mais les premiers résultats montrent une bonne

inhibition, les expériences sont en cours de réalisation. Actuellement l'étude de la toxicité de

ces composés est également testée (prévue) sur des cellules eucaryotes (cellules monocitaires

humaines THP-1). Des tests sur une souche mycobactérienne résistante à l'isoniazide sont

également envisagés.

La conception de nouvelles molécules de type bisubstrat pourrait permettre de parfaire les

relations structure-affinité. L'étude du mécanisme d'action et la détermination des cibles

moléculaires pourraient donner des renseignements capitaux pour le développement de

nouveaux antituberculeux.

CHAPITRE III : ETUDE DE L'EQUILIBRE

TAUTOMERIQUE CHAINE-CYCLE SUR DES

MODELES SIMPLIFIES DES ADDUITS INH-NAD

Résumé de la publication : Eur. J. Org. Chem, 2007, 10, 1624-1630.

Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD

129

I. Introduction Comme nous l'avons vu dans l'introduction, la structure chimique exacte des adduits INH-

NAD reste un sujet à débat dans la littérature. Bien que les adduits INH-NAD soient retrouvés

sous forme ouverte (chaîne) céto-amide au sein de l'enzyme lors d'étude cristallographique,55

des études réalisées au laboratoire, montrent que l'adduit oxydé (sel de pyridinium) n'existe

que sous forme cyclique65 alors que les adduits INH-NAD réduits (DHP) sont

préférentiellement sous forme cyclique trans (60%), avec 40% de forme chaîne et seulement

des traces de forme cyclique cis.64

Cependant, aucune preuve expérimentale n'a été rapportée à ce jour en faveur de

l'existence d'un équilibre tautomérique entre les formes chaînes et cycles en solution. Nous

nous sommes donc intéressés à l'équilibre tautomérique chaîne-cycle d'analogues simplifiés

des adduits INH-NAD où l'enchaînement de type γ-cétocarboxamides peut potentiellement se

cycliser en solution.

Ce phénomène a un intérêt majeur dans la mesure où il peut contrôler le comportement

chimique et biologique, comme par exemple la solubilité, la lipophilie et la capacité des

analogues de l'INH à se lier fortement et sélectivement au site actif de l'enzyme cible.

II. Etude expérimentale La synthèse de l'ensemble des composés a déjà été décrite, soit dans le chapitre I soit par

Broussy et al.145,149

En solution dans le DMSO, les intermédiaires clés 22, 68, et 80 (Figure 31) ont été

retrouvés exclusivement sous forme hémiamidal cyclique, comme le montre la spectroscopie

RMN du 1H (δ(NH2) = 9,48-9,65 et δ(OH) = 7,18-7,65 ppm) et RMN du 13C (δ(C7

tétrahédrique) = 84,7-88,1 ppm). En effet, la forme chaîne céto-amide n'a pas pu être

observée. De plus les structures cristallines des composés 22 et 80 confirment leurs existences

sous forme hémiamidal cyclique.

Un comportement identique a été observé pour les analogues oxydés, sels de pyridinium

128 et 82, et les analogues réduits 1,2-DHP 129 et 89 (Figure 31), avec un cycle aryle ou

pyridinyle. Ces composés présentent tous en RMN du 13C un pic dans la région 84-90 ppm

cohérent avec un Csp3. Pour les sels, ce résultat est en accord avec les résultats précédemment

décrits par l'équipe démontrant que l'adduit oxydé INH-NAD n'existe que sous forme

cyclique.65

Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD

130

Ces résultats impliquent que la préférence pour la forme cyclique des composés 22, 80,

68, 82, 89, 128 et 129 est probablement associée à l'hybridation sp2 des atomes C3 et C4 qui

correspondent aux C α et β par rapport au groupe carboxamide.

NN N

NH NH

NH2

OAr O

OAr

O

ArHO H HH

HO

4

7

ChaîneCycle cis(+ énantiomère)

Cycle trans(+ énantiomère)

131 Ar = Ph 91 Ar = 3Cl-Py 65 Ar = Py

130 Ar = Ph 90 Ar = 3Cl-Py133 Ar = Py

132 Ar = Ph 92 Ar = 3Cl-Py 66 Ar = Py

OEt

O

OEt

O

OEt

O

5%15%65%

95%85%35%

N

NHO

ArHO

OEt

O

4

7

N

NHO

ArHO

4

7

128 Ar = Ph 82 Ar = 3Cl-Py

22 Ar = Ph80 Ar = 3Cl-Py68 Ar = Py

N

NHO

ArHO

OEt

O

4

7

129 Ar = Ph 89 Ar = 3Cl-Py

3 33

Figure 31 : Structures des différents analogues simplifiés des adduits INH-NAD étudiés.

Par contre, lors de la réduction régiosélective et stéréosélective du composé 128 (Ar =

Ph), la 1,4-DHP 130 cyclique cis (hydrure entrant du même coté que l'hydroxyle en C7)

(Figure 31) est initialement formée pour s'ouvrir spontanément et conduire à l'isomère céto-

amide chaîne 131 comme produit majoritaire (95%), alors que la structure cyclique trans 132

n'a été observée que sous forme de trace.

La 1,4-DHP (Ar = 3Cl-Py) (Figure 31) a également été retrouvée majoritairement sous

forme chaîne 91 (85%) en présence de la forme hémiamidal trans 92 minoritaire (15%).

L'hémiamidal cyclique cis 90 formé initialement a été détecté uniquement sous forme de

trace, impliquant une isomérisation de 90 vers 91 très rapide.

La 1,4-DHP (Ar = Py) (Figure 31) l'analogue le plus proche de l'adduit INH-NAD, a été

retrouvée sous la forme hémiamidal cyclique trans 66 majoritairement (65%) et sous forme

chaîne minoritaire 65 (35%). Ce résultat est en accord avec les données de spectroscopie

RMN obtenues précédemment par l'équipe pour les adduits INH-NAD, suggérant une

proportion 60/40 des formes cycliques/chaînes des adduits.64

Les formes tautomèriques chaînes et cycliques des 1,4-DHP en solution ont pu être

identifiées et quantifiées par spectroscopie RMN 1H (DMSO et température ambiante). C'est

Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD

131

la résonance des H4 qui est le signal le plus à même de discriminer les différents tautomères

(H4 cyclique trans est situé à 3,5 ppm alors que H4 chaîne est à 5,1 ppm).

Seule la 1,4-DHP (Ar = Py) 66 a été observée majoritairement sous forme cyclique, c'est

la seule des analogues simplifiés à avoir été préparée par la voie biomimétique identique à

celle utilisée pour la synthèse des adduits INH-NAD. Le rôle du pyrophosphate de MnIII dans

la cyclisation s'est alors posé. Pour s'assurer que la différence de comportement entre 66 et

131 était bien due à la nature du substituant aromatique, l'obtention du composé 131 a été

tentée par la voie biomimétique. Cependant, l'oxydation de l'hydrazide de l'acide benzoïque

en présence de pyrophosphate de MnIII a conduit exclusivement à l'acide benzoïque. Pour

vérifier que le pyrophosphate de MnIII n'est pas la cause de la cyclisation, nous avons incubé

les 1,4-DHP 131 et 91 dans les conditions de la réaction biomimétique, mais aucune évolution

vers la forme cyclique n'a été observée. L'hypothèse de l'éventuelle cyclisation dans les

conditions biomimétiques a pu être écartée.

Nous avons ensuite voulu savoir si ce tautomérisme chaîne-cycle existait sous forme d'un

équilibre dynamique. Pour cela nous avons dans un premier temps réalisé une étude par

HPLC dans laquelle, après avoir injecté le mélange des composés 1,4-DHP (Ar = Py) 65 et 66

issu de la purification du mélange réactionnel, nous avons collecté séparément le pic du

produit 66 majoritaire (temps de rétention : tr = 37,19 min) et celui du produit 65 minoritaire

(tr = 39,40 min). Chaque produit a été réinjecté séparément et dans les deux cas, le même

profil chromatographique a été observé et il est identique au profil initial, suggérant

l'existence d'un équilibre tautomérique entre ces deux composés. L'équilibre dynamique entre

les deux tautoméres 65 et 66 a aussi pu être mis en évidence par un effet de solvant sur la

proportion des formes chaînes-cycles. Cette proportion a été déterminée par le rapport des

aires des signaux du H4 dans le DMSO ou dans le CDCl3 (35:65), ainsi que dans un mélange

DMSO/H2O, 1/1 (15:85) par RMN 1H. Il a été observé que lorsque la polarité du solvant

augmente, l'équilibre tautomérique se déplace vers la structure cyclique.

L'ensemble de ces résultats a montré qu'en dehors de l'hybridation sp2 des atomes C3 et

C4, la nature du substituant aromatique et la polarité du milieu ont une influence importante

sur l'équilibre tautomérique chaîne-cycle des structures de type 4-aroyl nicotinamide. Pour

parfaire ces études expérimentales, des études théoriques complémentaires ont été réalisées.

Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD

132

III. Etude théorique L'ensemble des calculs théoriques a été réalisé par Jean-Luc Stigliani au sein de notre

équipe.

Pour faciliter les calculs, nous avons utilisé des modèles simplifiés des 1,4-DHP (Figure

31) où les résidus CH2COOCH2CH3 ont été remplacés par des CH3 (les composés 134 à 142

Figure 32).

N N N

NH NH

NH2

OAr O

CH3 CH3 CH3

OAr

O

ArHOH

HH

HO

4

7

Chaîne Cycle cis(+ énantiomère)

Cycle trans(+ énantiomère)

134 Ar = Ph137 Ar = 3Cl-Py140 Ar = Py

135 Ar = Ph138 Ar = 3Cl-Py141 Ar = Py

136 Ar = Ph139 Ar = 3Cl-Py142 Ar = Py

Figure 32 : Analogues simplifiés pour l'étude théorique.

La structure tautomérique chaîne de ces composés peut exister dans différentes

conformations, dépendant de l'orientation du carbonyle cétonique. L'analyse

conformationnelle faisant varier les angles des liaisons H-C4-C7-O a montré deux

conformations énergétiquement favorables (Figure 3 de l'article). La première est une

conformation "repliée", où le groupement aromatique est orienté vers le cycle

dihydropyridine, la seconde est une conformation "étendue" où ces deux groupements sont

orientés à l'opposé l'un de l'autre. Pour chaque tautomère chaîne, ces deux conformations ont

été étudiées.

En phase gaz, ce sont les composés chaînes dans une conformation "repliée" qui ont été

prédits les plus stables. Entre les deux formes cycliques, le diastéréoisomère issu de l'étape de

réduction du sel de pyridinium c'est-à-dire la forme cis est toujours la moins stable. La

différence d'énergie entre les tautomères cycliques trans et les tautomères chaînes "repliés"

pour les composés avec un benzoyle (134) et un m-chloroisonicotinoyle (135) comme

groupement aromatique, a indiqué qu'ils n'ont pas tendance à se cycliser, c'est ce qui a été

observé expérimentalement. Pour le composé 140 (Ar = Py), qui devrait être majoritairement

sous forme cyclique 142, la différence d'énergie entre la forme cyclique et la forme chaîne est

plus faible mais reste positive (E forme cyclique > E forme chaîne), ce qui ne permet pas d'expliquer la

préférence pour la forme cyclique.

Dans le DMSO, ce sont les composés chaînes dans une conformation "étendue" qui ont

été préférentiels. La stabilisation relative des formes "étendues" par le DMSO peut être

Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD

133

expliquée par leur plus grande surface accessible pour le milieu polaire de solvatation. Les

différences d'énergie entre les formes cycliques trans et chaîne ont été moins marquées pour

le benzoyle 134 et le m-chloroisonicotinoyle 137 que dans le vide. En ce basant sur ces

différences d'énergie, les abondances de chaque tautomère ont pu être déterminées

théoriquement en utilisant l'équation de Boltzman à 298K. Les populations calculées pour les

formes chaînes (les plus stables) des composés 134 et 137 sont de 99,8% et 93%

respectivement. Ces valeurs sont en accord avec les données expérimentales (voir article).

Cependant, les différences d'énergie calculées pour les analogues pyridines 142/140 n'ont pas

reflété les résultats obtenus expérimentalement.

Pour compléter cette approche thermodynamique, nous nous sommes intéressés à

l'analyse des orbitales frontières. Le processus de cyclisation peut être décrit comme une

attaque nucléophile de l'atome d'azote de l'amide sur l'atome de carbone du carbonyle, suivie

par un transfert de l'hydrogène de l'amide sur l'atome d'oxygène. Ceci peut se réaliser si un

fort coefficient de la HOMO (orbitale moléculaire la plus haute occupée) est retrouvé sur

l'azote et si un fort coefficient de la LUMO (orbitale moléculaire la plus basse inoccupée) est

trouvé sur le carbone du carbonyle. Plus la différence entre ces deux orbitales sera faible, plus

la cyclisation sera facile. La LUMO a présenté, en effet, un fort coefficient sur le carbone du

carbonyle. Par contre la HOMO n'a pas présenté de coefficient significatif ni sur l'azote ni sur

l'oxygène. Cependant, ces coefficients sont plus importants sur la deuxième et encore plus sur

la troisième orbitale moléculaire occupée. Il faut tout de même noter que ces trois HOMO ont

des énergies très proches. La différence d'énergie entre la LUMO et les trois premières

HOMO est plus importante pour le dérivé 134 puis 137, cette différence est notablement plus

faible pour le composé 140 ce qui suggère qu'il soit plus propice à une cyclisation

intramoléculaire. Ces résultats sont en accord avec les observations expérimentales obtenues

pour les dérivés correspondants 131, 91 et 65.

IV. Article "Ring-Chain Tautomerism of Simplified Analogues of Isoniazid-NAD(P) Adducts: an

Experimental and Theoretical Study." Tamara Delaine, Vania Bernardes-Génisson, Jean-Luc

Stigliani, Heinz Gornitzka, Bernard Meunier and Jean Bernadou, Eur. J. Org. Chem, 2007,

10, 1624-1630.

Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD

134

Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD

135

Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD

136

Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD

137

Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD

138

Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD

139

Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD

140

Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD

141

V. Conclusion L'étude de l'isomérie tautomérique chaîne-cycle existant en solution a été réalisée sur une

série d'analogues simplifiés des adduits INH-NAD.

Dans le DMSO, il a été montré que cet équilibre n'est pas observé pour les 1,2-DHP et les

analogues sels de pyridinium possédant les carbones α et β de l'enchaînement γ-céto-amide

avec une hybridation sp2. Ils sont retrouvés exclusivement sous forme cyclique.

Au contraire, les analogues réduits 1,4-DHP sont présents sous forme chaîne et/ou

cyclique en fonction de la nature du groupement aromatique. Ceci a été montré aussi bien par

les données expérimentales que par les résultats théoriques. Les 1,4-DHP benzoyle et m-

chloroisonicotinoyle sont préférentiellement sous forme chaîne céto-amide en solution. Par

contre, l'analogue isonicotinoyle, le plus proche de l'adduit INH-NAD, est en équilibre

tautomérique entre la forme cyclique majoritaire et la forme ouverte, dans les solvants

polaires et apolaires, la proportion de la forme cyclique augmentant avec la polarité du

solvant.

Comme c'est la forme chaîne des adduits INH-NAD qui est retrouvée au sein du site actif

d'InhA, la synthèse de composés majoritairement sous forme chaîne semble donc favorable

pour de nouveaux inhibiteurs d'InhA. Mais les dérivés sous formes cycliques peuvent aussi

être considérés comme des prodrogues capables de s'ouvrir in vivo pour donner la forme

active par un équilibre tautomérique chaîne-cycle.

Chapitre III : Etude de l'équilibre tautomérique chaîne-cycle sur des modèles simplifiés des adduits INH-NAD

142

CHAPITRE IV : ETUDE THEORIQUE DE

L'INTERACTION DES DIFFERENTES FORMES

TAUTOMERIQUES DE L'ADDUIT INH-NAD AVEC LE

SITE ACTIF D' InhA

Résumé de la publication à soumettre 2.

Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA

145

I. Introduction Comme nous l'avons vu, la structure exacte des adduits reste un sujet à débat dans la

littérature. En effet, la structure 1 (Figure 33), céto-amide chaîne, est celle qui a été retrouvée

cristallisée au sein du site actif d'InhA. Par contre, notre équipe a montré que les formes

hémiamidals cycliques 3 et 4 étaient majoritaires en solution, par rapport aux structures

ouvertes céto-amides 1 et 2 (deux épimères 4S et 4R). L'analogue BH-NAD 143 a aussi été

décrit comme un bon inhibiteur d'InhA.24 Alors que les dérivés oxydés (type pyridinium) ont

été décrits dans un premier temps sous forme céto-amide 144, mais existent en fait seulement

sous deux structures cycliques épimères 7 et 8 et n'ont pas d'activité inhibitrice.

N

CO

N

HCONH2

N

CONH

OHH

N

2

45

7

9 86

1,4-DHP tautomères chaines 1,4-DHP tautomèrescycliques hemiamidals

4

7

H

N

CONH2

N

CO

(4S ) (4R) (4S) (4S,7R) (4R,7S) (7S & 7R)

N

CONHH

HO

4

7

N

1 2 143 3 4 7 & 8 144

N

CONH

OH

N

Tautomères oxidés

4 7

N

CONH2

CO

N

N

CONH2

CO

4

H

O

OHOH

OADP

Figure 33 : Structures des composés 1, 2, 3, 4, 7, 8, 143 et 144, stéréochimie proposée pour les nouveaux centres chiraux. Les tautomères 1,4-DHP hémiamidal cycliques 4S,7S et 4R,7R

sont détectés uniquement sous forme de traces.

Afin d'avoir un aperçu général de la façon dont l'adduit INH-NAD, inhibiteur compétitif

tight-binding d'InhA, se lie au site actif de cette enzyme, une évaluation de l'affinité des

adduits INH-NAD ouverts et cyclisés pour la cible InhA a été effectuée par différentes

méthodes de calculs théoriques (docking et énergie d'interaction).

II. Validation du modèle Bien qu'Autodock soit le programme de docking le plus fréquemment utilisé et qu'il ait

été validé pour de nombreux cas,181-185 la fiabilité de ce modèle pour la cible InhA doit tout de

même être vérifiée.

C'est la structure cristalline de l'enzyme InhA avec l'adduit INH-NAD 1 lié au site actif

obtenue par diffraction des rayons-X qui a été utilisée comme point de départ. Un calcul de

l'énergie de docking a été réalisé en laissant la libre rotation des liaisons n'appartenant pas au

motif adénosine-diphosphate-ribose. L'énergie de docking pour 1 est de -24,0 kcal/mol. Les

Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA

146

conformations de cet adduit et de celui cristallisé sont très proches, la principale différence a

été retrouvée au niveau du cycle isonicotinoyle qui a subi une torsion de 40°.

Les énergies de docking pour le NADH et le NAD+ ont été calculées par la même

méthode et les valeurs sont -18,5 et -17,7 kcal/mol respectivement. L'ordre d'affinité pour

InhA est donc : NAD+ < NADH < INH-NAD 1, comme décrit dans la littérature.22,56-58 Ces

résultats ont permis de valider le modèle AutoDock pour étudier les interactions des différents

adduits INH-NAD avec InhA.

III. Energies d'interaction des adduits INH-NAD avec InhA Des études de docking ont été réalisées sur l'ensemble des adduits 1, 2, 3, 4, 7, 8 et 143,

NADH et NAD+. Les résultats des calculs d'énergies d'interaction sont décrits dans le

Tableau 7. Energie d'interaction (kcal/mol) Stéréochimie

du motif

nicotinamide Autodock AM1

ONIOM MM/GBSA

E (total)

%

inhibition

d'InhA

(NAD+) - -17,7 -130,5 -395 NC -

NADH) - -18,5 -150,1 -481 NC -

1 chaine diH 4S -24,0 -159,5 -531 -70,0 ND

2 chaine diH 4R -22,0 -148,4 -508 NC ND

143 chaine diH 4S -23,3 -159,5 -526 NC ND

3 cycle diH 4S,7R -21,3 -154,4 -484 -64,7 71

4 cycle diH 4R,7S -23,2 -153,3 -476 NC 31

7 cycle π⊕ 7S -20,4 -124,8 NC NC

8 cycle π⊕ 7R -20,7 -109,6 NC NC

0

Tableau 7 : Energies d'interaction par les différentes méthodes de calcul. (NC : non calculé, ND : non déterminé)

Les approches de mécaniques moléculaires empiriques sont couramment utilisées pour

simuler des systèmes avec de nombreuses interactions. Cependant, ces méthodes ne sont pas

capables de décrire les interactions électroniques. Nous avons donc réalisé des études

complémentaires, des calculs semi-empiriques avec AM-1 Hamiltonian et une méthode

hybride de mécanique quantique/moléculaire utilisant l'approche ONIOM. Les énergies

d'interaction ont été calculées pour les composés NADH, NAD+, 1, 2, 3, 4, 7, 8 et 143 par ces

deux méthodes et les résultats sont rapportés dans le Tableau 7.

Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA

147

Des études de dynamiques moléculaires ont aussi été réalisées et les énergies d'interaction

ont été calculées pour les adduits 1 et 3 et sont également répertoriées dans le tableau 7.

III.1. Adduits ouverts 4S et 4R Les interactions principales entre l'adduit INH-NAD 1 (4S) et InhA, quelque soit la

méthode de calcul, ont été identiques à celles décrites par Rozwarski et al55. On retrouve, en

particulier, l'interaction de type π-π stacking entre la chaîne latérale de la Phe149 et le cycle

pyridine du fragment isonicotinoyle et la liaison hydrogène de la molécule d'eau 403 avec

l'atome d'azote de la pyridine du nicotinamide et l'atome de souffre de la Met155.

L'adduit 4R est positionné de la même manière, mais avec le carbonyle du nicotinamide

orienté en position opposée par rapport au composé 4S. Par conséquent, l'interaction de type

π-π stacking avec la Phe149 n'est plus présente : les deux cycles aromatiques ne sont plus

parallèles et sont distants de 5 Å.

L'énergie d'interaction de 2 (4R) est dans tous les cas plus élevée que celle de 1 (4S) : le

4S a une meilleure interaction avec la cible InhA.

III.2. Adduit BH-NAD Les résultats ont montré qu'il n'y a pas vraiment de différence entre les adduits INH-NAD

1 et BH-NAD 143, quelque soit la méthode de calcul utilisée.

III.3. Adduits cycliques 4S7R et 4R7S Les adduits cyclisés 3 et 4 ont des énergies d'interactions similaires, mais plus élevées que

celle de l'adduit ouvert 1 (4S). La présence du cycle hémiamidal a engendré une torsion du

groupement bicyclique rigide de 60° tout en respectant la position du motif dihydropyridine

dans l'adduit ouvert. Toutefois l'interaction de type π-π stacking entre la pyridine et la Phe149

a subsisté.

La différence d'énergie entre la forme cyclique 3 et ouverte 1 a aussi été retrouvée par le

calcul de dynamique moléculaire.

La faible différence d'énergie d'interaction entre les deux adduits cycliques n'a pas reflété

les résultats expérimentaux où la différence d'inhibition d'InhA par ces deux adduits est

relativement importante (71% d'inhibition pour le 3 et 31% pour le 4)63 (une explication sera

proposée plus loin).

Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA

148

III.4. Adduits oxydés L'énergie d'interaction des adduits oxydés 7 et 8 a beaucoup augmenté par rapport aux

adduits réduits, ce qui est en accord avec les résultats expérimentaux, où 7 et 8 sont

incapables d'inhiber InhA.

IV. Hypothèse d'ouverture des adduits cycliques Les adduits cyclisés sont majoritaires en solution, les adduits INH-NAD sont des

inhibiteurs de type "slow tight binding" et comme nous venons de le montrer, l'adduit ouvert

4S est le plus affin pour InhA. A partir de l'ensemble de ces considérations, nous avons émis

l'hypothèse suivante : l'interaction d'InhA avec l'inhibiteur INH-NAD pourrait se faire

initialement avec la structure cyclique 3 (majoritaire en solution) qui se tautomériserait au

sein d'InhA pour donner la forme linéaire 1 qui est énergétiquement plus favorable.

Il est intéressant de noter que l'hydroxyle de la tyrosine 158 est en interaction par liaison

hydrogène avec l'hydroxyle tertiaire du motif hémiamidal du composé 3 (4S7R) (ONIOM) et

avec l'atome de souffre de la méthionine 199 (AM1). L'étude de dynamique moléculaire

confirme la proximité de l'hydroxyle de la Tyr158 et celui de l'hémiamidal. Dans plus de 39%

des 5 ns finales de l'étude, ces groupements sont très proches dans l'espace, la distance

moyenne est de 2,8 Å. Par contre pour l'adduit cyclique 4R7S, la liaison hydrogène impliquant

l'hydroxyle de l'hémiamidal et la Tyr158 n'a pas été observée.

Nous proposons donc que la Tyr158 catalyse l'ouverture du cycle hémiamidal de l'adduit

INH-NAD 3 (4S7R) pour donner l'adduit ouvert 1 (4S) (Schéma 43).

Dans ce modèle, la tyrosine joue un rôle critique dans le processus d'ouverture en tant

qu'accepteur d'hydrogène. InhA déprotonnerait l'hydroxyle tertiaire de l'hémiamidal de

l'adduit INH-NAD en utilisant le phénolate activé (par la Met 199) transitoire de la Tyr158.

L'alkoxy formé serait ensuite converti en adduit ouvert 3 reprotoné par l'intermédiaire de la

Met199.

Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA

149

N

H

O

OHOH

OADP

N

NHO

H

N

O

OHOH

OADP

H

O

NO

O

NH

N

H

O

OHOH

OADP

NO

NH2

O

COOH

NH2

O

S

COOH

NH2

H

Tyr158

Met199δ+

δ+

COOH

NH2

O

S

COOH

NH2

Tyr158

Met199

H

H

COOH

NH2

O

S

COOH

NH2

Tyr158

Met199

H

6

3

N

NHO

H

N

O

OHOH

OADP

O

COOH

NH2

O

S

COOH

NH2

Tyr158

Met199

H

H

Schéma 43 : Ouverture de l'hémiamidal en céto-amide catalysée par la Tyr158.

Cette hypothèse d'ouverture catalysée par la Tyr158 a permis de rendre compte de la

différence d'activité d'inhibition enzymatique des adduits 4S7R et 4R7S alors que les énergies

d'interaction calculées étaient comparables. En effet, la Tyr158 ne catalyserait l'ouverture que

du 4S7R pour donner l'adduit 4S le plus favorable énergétiquement.

V. Article Publication à soumettre 2 : Binding of the tautomeric forms of isoniazid-NAD adducts to

the active site of the Mycobacterium tuberculosis enoyl ACP-reductase (InhA): a theoretical

approach. Jean-Luc-Stigliani, Philippe Arnaud, Tamara Delaine, Vania Bernardes-Génisson

and Jean Bernadou.

Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA

150

Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA

151

Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA

152

Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA

153

Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA

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Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA

155

Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA

156

Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA

157

Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA

158

Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA

159

VI. Conclusion Les résultats théoriques que nous avons obtenus sont en accord avec les résultats

expérimentaux63 et ceux de la littérature.22,56-58 L'adduit le plus favorable énergétiquement est

la forme ouverte céto-amide 1 (4S). La seule différence retrouvée est sur l'énergie

d'interaction des deux adduits cycliques 3 et 4 avec InhA, dans les calculs théoriques ils sont

très proches alors qu'ils ont des activités bien différentes vis-à-vis d'InhA. Cette contradiction

a pu être expliquée par une proposition de catalyse d'ouverture du cycle hémiamidal du

composé 6 par la Tyr158 conduisant au dérivé 3 énergétiquement favorable. Ce qui explique

la bonne inhibition d'InhA par 3.

Ce modèle pourra par la suite être utilisé comme outil de prédiction d'inhibition pour de

nouvelles molécules. Il sera très utile dans la conception de nouveaux dérivés antituberculeux

de type bisubstrat, à activité inhibitrice d'InhA.

Chapitre IV : Etude théorique de l'interaction des formes tautomériques de l'adduit INH-NAD avec le site actif d'InhA

160

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Conclusion et perspectives

163

Le travail de recherche qui m’a été confié dans le cadre de cette thèse a été orienté selon

deux axes principaux :

Le premier comprenait la conception de nouvelles molécules à propriétés

potentielles antituberculeuses apparentées à la prodrogue isoniazide, antibiotique

de première ligne utilisé dans le traitement de la tuberculose. L’activité attendue

était basée sur l’inhibition de l'énoyl-ACP réductase InhA et l’espoir était de

contourner les problèmes de résistances liés à la mutation des protéines KatG et

InhA impliquées respectivement dans l’activation et comme cible de l’isoniazide.

Le second axe représentait une contribution à une meilleure compréhension de la

nature et du mode d’interaction des formes activées de l’isoniazide avec l’enzyme

InhA. Une étude approfondie a été développée sur l'équilibre tautomérique entre

les formes cycliques et ouvertes des adduits INH-NAD, responsables de l’activité

biologique de l’isoniazide, ainsi que sur le rôle joué par ces différentes formes

dans l'interaction avec le site actif de l'enzyme InhA.

L’activation oxydante de l’isoniazide en présence du cofacteur NAD conduit à des

adduits INH-NAD où un résidu isonicotinoyle est fixé en position 4 sur le noyau

nicotinamide. Notre travail a consisté à préparer des analogues simplifiés de ces adduits,

notamment par simplification ou suppression de la partie ADP-ribose. La première stratégie a

reposé sur l’hypothèse que l'introduction d'un groupement aroyle en position 4 du

nicotinamide serait suffisante pour compenser la modification de la chaîne liée à l'atome

d'azote du nicotinamide (simplification ou suppression du motif ADP-ribose). Aucun des

composés synthétisés n'a été capable d'inhiber InhA à une concentration de 100 µM. Ceci a

permis de conclure que l'addition d'un motif isonicotinoyle ou benzoyle n'a pas été à lui seul

suffisant pour compenser la perte ou la simplification du motif ADP. Ainsi un changement de

stratégie s'est avéré nécessaire.

La deuxième stratégie nommée bisubstrat, développée pour InhA pour la première fois, a

consisté à réunir au sein de la même molécule des caractéristiques structurales relatives au

substrat et au cofacteur. Plusieurs voies originales de synthèse de tels composés, en série

pyridine, pyridinium et dihydropyridine, ont été mises au point au cours de ce travail.

Plusieurs composés (119, 122, 123, 124 et 125) se sont révélés comme de bons inhibiteurs

d'InhA, ce qui a permis de valider cette approche. De plus, au-delà de cette étude

biochimique, des tests sur mycobactéries ont également montré que les composés 108, 109,

Conclusion et perspectives

164

119, 122 et 125 sont des inhibiteurs efficaces de la croissance de M. smegmatis et de M.

tuberculosis.

Bien que pour la plupart des composés un lien entre l'activité inhibitrice d'InhA et

l'activité inhibitrice de la croissance mycobactérienne n'ait pu être démontré, ces deux

activités semblent être étroitement corrélées pour le composé hémiamidal 119. En effet, ce

composé 119 a été incapable d'inhiber la croissance de bactéries dépourvues de la protéine

InhA ou un équivalent (absence de système FAS-II) et s'est montré sélectif (CI50 M. smegmatis =

68 µM, CI50 E. coli > 5 mM et CI50 C. glutamicum > 5 mM).

Les premiers composés de type bisubstrat décrits dans ce travail présentent donc un grand

intérêt dans le développement de nouveaux médicaments antituberculeux et serviront de base

pour la conception de dérivés bisubstrat de seconde génération.

Le second axe de ce travail a permis d’approfondir nos connaissances sur la structure des

adduits INH-NAD, notamment concernant l'équilibre tautomérique chaîne-cycle qu’ils

présentent en solution, mais également dévoilé par certains de leurs analogues simplifiés.

Il a été montré que cet équilibre n'est pas observé pour les 1,2-dihydropyridines ainsi que

pour les dérivés pyridinium, qui ont comme caractéristique commune de posséder les atomes

de carbones α et β de l'enchaînement γ-céto-amide avec une hybridation sp2. Ces composés

sont retrouvés exclusivement sous forme cyclique.

Au contraire, les analogues de type 1,4-dihydropyridine existent à l’état d’équilibre

tautomérique chaîne-cycle, sensible notamment à la nature du solvant et à la nature du

groupement aroyle fixé en position 4 du nicotinamide. Ceci a été montré aussi bien par les

données expérimentales que par les résultats de calculs théoriques. L'adduit INH-NAD

"biologique", considéré comme responsable de l’activité de l’isoniazide existe en solution en

équilibre tautomérique entre forme cyclique majoritaire et forme ouverte minoritaire.

L'étude par calcul théorique de l'interaction de ces deux formes (et de certains

stéréoisomères) avec le site actif de l'enzyme InhA a montré que la structure chaîne est

énergétiquement la plus favorable, ce qui est cohérent avec le fait que cette forme chaîne ait

pu être cristallisée au sein de l’enzyme InhA. Toutefois l'ensemble des résultats

expérimentaux et théoriques nous a permis de soulever l'hypothèse suivante : la forme

cyclique de l'adduit INH-NAD, majoritaire en solution, pourrait interagir dans un premier

temps avec le site actif d'InhA puis dans un second temps subirait une ouverture du cycle

hémiamidal catalysée par la Tyr158 d'InhA conduisant à la forme chaîne céto-amide,

Conclusion et perspectives

165

énergétiquement plus favorable, qui constituerait donc la forme ultime responsable de

l’inhibition de l’enzyme. Les méthodes et procédés développés dans cette étude pourront par

la suite être utilisés comme outil de prédiction d’activité et seront très utiles dans la

conception de nouveaux dérivés antituberculeux de type bisubstrat.

A la fin de ces trois années de travail, de nombreuses pistes de recherche paraissent

ouvertes.

Le problème des résistances prédomine actuellement dans l’utilisation des agents

antituberculeux et notamment de l’isoniazide. Aussi, il serait naturellement intéressant de

tester les composés bisubstrats inhibiteurs d'InhA sur des enzymes InhA mutantes (par

exemple : Ser94Ala) pour vérifier si ces dérivés simplifiés au niveau du motif lié à l'atome

d'azote du nicotinamide mais possédant un mime du substrat sur le fragment aroyle sont

capables de contourner le problème de résistance lié à InhA. Cette approche va de pair avec

une approche théorique pour laquelle les études de modélisation déjà réalisées ont permis de

dégager des méthodes de calcul adaptées.

D'autre part, il serait également nécessaire de tester les composés inhibiteurs de la

croissance mycobactérienne sur des souches de mycobactéries INH-résistantes.

La majorité des inhibiteurs (ceux sous forme hémiamidal) synthétisés au cours de cette

thèse sont un mélange de deux énantiomères. La synthèse des deux énantiomères séparés

permettrait de déterminer leurs activités propres.

Les différentes voies de synthèse que nous avons développées et le savoir-faire acquis

dans les différentes séries de composés préparés doivent permettre des modulations

structurales importantes et variées telles que le remplacement des liens C-O et C-C par des

liens C-S ou C-N, le changement de la taille et de la position de la chaîne, l’introduction

d'insaturations sur la chaîne ou le choix d’autres groupements hydrophobes.

Ainsi la conception et la synthèse de nouveaux inhibiteurs de type bisubstrat guidées par

le recours à la modélisation moléculaire et avec l’aide précieuse de nos partenaires biologistes

devraient permettre dans l’avenir d'approfondir les relations structure-activités et laissent

espérer l’obtention de dérivés à activité antituberculeuse d’intérêt dans la série originale de

composés que nous avons développée.

Conclusion et perspectives

166

PARTIE EXPERIMENTALE

COMPLEMENTAIRE

SYNTHESE

Partie expérimentale complémentaire : Synthèse

171

Remarques générales

Le diméthylformamide est séché sur tamis moléculaire 4 Å ou sur CaH2. Le

tétrahydrofurane a été distillé sur sodium en présence de benzophénone comme indicateur.

L'acétonitrile est distillé sur hydrure de calcium. La pyridine et la diisopropylamine sont

séchées sur KOH. Les autres réactifs et solvants utilisés proviennent de fournisseurs standards

de produits chimiques et ont été utilisés sans purification supplémentaire.

Chromatographie sur colonne : silice 60 Merck (0,063-0,200 mm). Chromatographie sur

couche mince : feuilles d'aluminium recouvertes d'un gel de silice 60 F254 Merck. Révélation :

fluorescence UV (λ = 254 nm).

Point de fusion : Electrothermal Digital 9100 melting point apparatus (Méthode à

capillaire)

Infra-rouge : Perkin-Elmer modèle Spectrum GX 2000. Les huiles sont enregistrées entre

deux pastilles de NaCl (film de produit pur). Les solides sont enregistrés en pastille de KBr.

Les fréquences (nombre d'onde) principales sont exprimées en cm-1.

Résonance magnétique nucléaire : RMN 1H et 13C : Bruker AM250 et Avance 300 ;

RMN 31P : Bruker AC200. Les déplacements chimiques (δ) sont mesurés par rapport au

triméthylsilane. Les notations sont : s (singulet), d (doublet), t (triplet), q (quadruplet ou

quintuplet), dd (doublet de doublet), ddd (doublet de doublet de doublet), dt (doublet de

triplet), m (massif ou multiplet).

Spectrométrie de masse : TSQ 7000 Thermo Electron (DCI/NH3) ; Nermag R10-10H

(FAB et IE) ; API 365 SCIEX Perkin-Elmer (ESI). Les spectres de masse haute résolution ont

été effectués au Centre d'Etude Structurale et d'Analyse des Molécules Organiques

(CESAMO) à Talence ou à l'Université Paul Sabatier.

La dénomination des produits a été définie en utilisant le logiciel de nomenclature

ACD/Name Nomenclat IUPAC.

La numérotation des structures, qui ne suit pas la règle IUPAC, a pour unique objectif de

faciliter la description des spectres RMN.

Partie expérimentale complémentaire : Synthèse

172

CHAPITRE I : SYNTHESE D'ANALOGUE DES ADDUITS

INH(BH)-NAD Synthèse du 3-hydroxy-3-phényl-2,3-dihydro-1H-pyrrolo[3,4-c]pyridine-1-one (28)

5

6

14

2

9

7

N

NHO

OH

N

NHO

O 1516

1312

2827

A une solution de 3,4-pyridinedicarboximide 27 (4 g, 27 mmol) dans le tétrahydrofurane

(200 mL) est ajouté à -78 °C, sous atmosphère inerte, le phényllithium 2,0 M en solution dans

le dibutyléther (27 mL, 76 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant 1 h à -78 °C puis

laissé revenir à température ambiante. Après 2 h de réaction supplémentaire, 80 mL d'eau sont

ajoutés, le milieu réactionnel est extrait à l'acétate d'éthyle (4 x 100 mL), les phases

organiques sont récupérées, séchées sur sulfate de sodium anhydre et concentrées sous vide.

La poudre jaune obtenue (4,88 g, 80%) est un mélange des composés para/méta 80 : 20. Elle

est purifiée par chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : gradient

dichlorométhane/méthanol : de 100/0 à 90/10) pour donner 300 mg (5%) de l'hémiamidal 28

sous forme d'un poudre blanche. C'est le produit minoritaire de la réaction qui a été récupéré.

Pf : 211 °C IR (KBr, cm-1) : 3157 (O-H, N-H), 3059 (C-H), 1699 (C=O), 1612 (C=C), 1448, 1323, 1066 (C-O). RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 9,64 (s, 1H, H8), 8,75 (d, J = 4,8 Hz, 1H, H6), 8,64 (d, J = 0,9 Hz, 1H, H2), 7,65 (dd, J = 1,2 Hz et J = 4,8 Hz, 1H, H5), 7,52 (dt, J = 2,0 Hz et J = 6,6 Hz, 2H, H12 et H16), 7,41-7,33 (m, 3H, H13, H14 et H15), 7,17 (s, 1H, H10). RMN 13C (75 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 167,2 (C, C9), 150,8 (CH, C6), 145,3 (C, C2), 145,2 (C, C3), 141,4 (C, C4), 138,7 (C, C10), 128,9 (2 x CH, C13 et C15), 128,6 (CH, C14), 125,9 (2 x CH, C12 et C16), 117,3 (CH, C5), 87,9 (C, C7). SM (DCI/NH3) m/z : 244 (M + NH4

+), 227 (M + H+).

Synthèse du 2-bromoacétate de 3-hydroxypropyle (24)

OH BrBr

BrO OH

HOO O

+1

2

3

4

5

6

243029

A une solution de 1,3-propanediol 29 (20 mL, 0,277 mol) dans l'acétonitrile anhydre (20

mL) est ajouté goutte à goutte, sous atmosphère inerte, à -12 °C, le bromure de bromoacétyle

30 (2,4 mL, 0,028 mol). Le mélange réactionnel est agité pendant 10 min. De l'eau est ajoutée

Partie expérimentale complémentaire : Synthèse

173

(40 mL) et le produit est extrait à l'éther (3 x 40 mL). Les phases organiques sont réunies,

lavées avec une solution saturée en bicarbonate de sodium, séchées sur sulfate de sodium

anhydre et concentrées sous vide pour donner 24 sous forme d'un liquide incolore (4,80 g,

88%).

IR (film, cm-1) : 3384 (O-H), 2962 (C-H), 2889 (C-H), 1733 (C=O), 1423, 1404, 1286 (C-C(=O)-O), 1172, 1113, 1050 (C-C-O). RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 4,53 (s, 1H, H6), 4,17 (t, J = 5,5 Hz, 2H, H3), 4,12 (s, 2H, H1), 3,47 (t, J = 5,1 Hz, 2H, H5), 1,74 (q, J = 5,3 Hz, 2H, H4). RMN 13C (63 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 167,3 (C, C2), 63,2 (CH2, C1), 57,3 (CH2, C3), 31,5 (CH2, C5), 27,0 (CH2, C4). SM (IE) m/z : 199-197 (M + H+), 181-179 (M + H+ - H2O), 168-166 (M + H+ - CH2OH).

Synthèse du bromure de 1-hydroxy-5-[(3-hydroxypropoxy)-2-oxoéthyl]-3-oxo-1-phényl-

2,3-dihydro-1H-pyrrolo[3,4,c]pyridin-5-ium (20)

BrO OH

O

1'

2

12

4'

5

6

N

NHO

HO +

N

NHO

HO

O

O

OHBr

16

5'

11

10

6'

13

9

3'

87

15

14

2'

20

2422

A une solution d'hémiamidal 22 (1,00 g, 4,42 mmol) dans le tétrahydrofurane anhydre (60

mL) à reflux, est ajouté goutte à goutte sous atmosphère inerte le 2-bromoacétate de 3-

hydroxypropyle 24 (2,78 g, 14,20 mmol) en 10 fois toutes les 45 minutes. Après 48 h de

réaction, de l'éther (50 mL) est ajouté, le précipité formé est filtré, lavé au dichlorométhane, à

l'acétone et à l'éther puis séché sous vide pour donner 1,49 g (80%) du sel de pyridinium 20

sous forme d'une poudre blanche.

Pf : 162-164 °C. IR (KBr, cm-1) : 3374 (O-H), 3173 (N-H), 3054 (C-H), 2956 (C-H), 1723 (C=O ester), 1656 (C=O hémiamidal), 1209 (C-C(=O)-O), 1052 (C-C-O), 703. RMN 1H (250 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 10,31 (s, 1H, H8), 9,57 (s, 1H, H2), 9,17 (d, J = 6,3 Hz, 1H, H6), 8,31 (d, J = 6,2 Hz, 1H, H5), 7,81 (s, 1H, H10), 7,60-7,56 (m, 2H, H12 et H16), 7,47-7,42 (m, 3H, H13, H14 et H15), 5,71 (s, 2H, H1'), 4,59 (t, J = 5,2 Hz, 1H, H6'), 4,25 (t, J = 6,5 Hz, 2H, H3'), 3,47 (q, J = 6,5 Hz, 2H, H5'), 1,77 (q, J = 6,5 Hz, 2H, H4').

Partie expérimentale complémentaire : Synthèse

174

RMN 13C (63 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 166,2 et 165,6 (2 x C, C2' et C9), 163,0 (C, C3), 150,3 (CH, C6), 142,8 (CH, C2), 137,9 (C, C4), 129,6 (C, C11), 129,2 (CH, C5), 128,8 et 125,8 (4 x CH, C12, C13, C15 et C16), 121,7 (CH, C14), 87,6 (C, C7), 63,7, 60,4 et 56,9 (3 x CH2, C1’, C3’ et C5’), 31,1 (CH2, C4’). SM (ESI) m/z : 343 (M+ - Br), 299 (M+ - Br - CH2CH2O), 285 (M+ - Br - CH2CH2CH2O). SMHR (ESI) pour C18H19N2O5 : obtenue 343,1296, théorique : 343,1294.

Synthèse du diisopropyl-2',3'-isopropylidèneadénosine méthyl phosphoramidite (21)

N

NN

N

NH2

O

OO

HO

N

NN

N

NH2

O

OO

OPN

MeO13

11

12

10

5'

2'4' 3'1'

82

12

14

15

14

1515

15

25 21 A une solution de 2’,3’-isopropylidène adénosine 25 (921 mg, 3,00 mmol), de 1-H

tétrazole (116 mg, 1,65 mmol) et de diisopropylamine sèche (235 µL, 1,65 mmol) dans la

pyridine sèche (33 mL) est ajouté sous atmosphère inerte le méthyl tétraisopropyl

phosphoramidite (1,28 mL, 4,78 mmol). Après 1 h 30 sous agitation le 1-H-tétrazole (54 mg,

0,77 mmol) est rajouté. Le mélange réactionnel est agité pendant 1 h supplémentaire. La

pyridine est évaporée sous pression réduite et l’huile résiduelle est purifiée par

chromatographie sur colonne de gel de silice désactivée par de la triéthylamine (3%) (éluant :

acétone/hexane : 1/1 puis 2/1 contenant 3% de Et3N) pour donner 1,18 g (85%) d’une poudre

blanche correspondant au phosphoramidite 21 sous forme d'un mélange de deux

diastéréoisoméres.

Pf : 45-46 °C IR (KBr, cm-1) : 3335 (N-H), 3178 (C-H), 2967 (C-H), 2934 (C-H), 1654 (C=N), 1648 (C=C), 1599 (C=C), 1209 (C-N), 1077 (C-O), 1026. RMN 1H (250 MHz, CDCl3) δ (ppm) : 8,35 (s, 1H, H2), 8,34 (s, 1H, H2), 8,16 (s, 1H, H8), 8,09 (s, 1H, H8), 6,19 (d, J = 2,8 Hz, 1H, H1’), 6,16 (d, J = 2,7 Hz ,1H, H1’), 5,73 (s, 4H, 2 x H10), 5,31-5,25 (m, 2H, 2 x H2’), 5,02-4,97 (m, 2H, 2 x H3’), 4,52-4,47 (m, 2H, 2 x H4’), 3,80-3,66 (m, 4H, 2 x H5’), 3,58-3,44 (m, 4H, 4 x H14), 3,38 (d, J = 13,4 Hz, 3H, H13), 3,37 (d, J = 13,5 Hz, 3H, H13), 1,62 et 1,38 (2s, 2 x 6H, 4 x H12), 1,14 (d, J = 6,8 Hz, 6H, 2 x H15), 1,13 (d, J = 6,8 Hz, 6H, 2 x H15), 1,07 (d, J = 6,6 Hz, 6H, 2 x H15), 1,05 (d, J = 6,6 Hz, 6H, 2 x H15).

Partie expérimentale complémentaire : Synthèse

175

RMN 13C (63 MHz, CDCl3) δ (ppm) : 162,5, 155,6, 149,5, 149,4, 119,9, 119,8, 114,1 et 114,0 (8 x C, 2 x C4, 2 x C5, 2 x C6 et 2 x C11), 153,1, 153,0, 139,4 et 139,3 (4 x CH, 2 x C2 et 2 x C8), 91,2, 91,1, 86,3, 86,2, 84,8, 84,7, 81,8 et 81,7 (8 x CH, 2 x C1', 2 x C2', 2 x C3' et 2 x C4'), 63,6, 63,4, 63,3 et 63,0 (4 x CH, 4 x C14), 50,8 et 50,5 (2 x CH2, 2 x C5'), 42,7 et 42,6 (2 x CH3, 2 x C13), 27,0 et 25,3 (4 x CH3, 4 x C12), 24.6 et 24,4 (4 x CH3, 8 x C15). RMN 31P (81 MHz, CDCl3) δ (ppm) : 152,9 et 152,8 (PIII). SM (DCI/NH3) m/z : 469 (M + H+), 368 (M + H+ - ((CH3)2CH)2NH), 290 (M + H+ -((CH3)2CH)2NPOHOCH3).

Synthèse de 19

N

NN

N

NH2

O

OO

OPN

MeO N

NN

N

NH2

O

OO

O

11

12

10

5'

2'4' 3'1'

82

12

13+

N

NHO

HO

O

O

OHBr1'

2

12

4'

5

6N

NHO

HO

O

O

OBr

16

5'

11

10

13

9

3'

87

15

14

2' POMe

O

20 1921

A une solution de sel de pyridinium 20 (100 mg, 0,24 mmol) dans le diméthylformamide

sec (4,2 mL) en présence de tamis moléculaire activé (4 Å), est ajouté sous atmosphère inerte

le phosphoramidite 21 (121 mg, 0,26 mmol). Le 5-(3,5-dinitrophényl)-1H-tétrazole est

additionné toutes les 30 minutes (3 x 26 mg, 0,33 mmol). Après 2 h sous agitation (réaction

suivie par RMN 31P), sont introduites dans le milieu réactionnel la collidine (0,188 mL, 1,43

mmol) et une solution d’iode 0,24 M dans un mélange THF/H2O : 2/1 (2 mL, 0,47 mmol).

Après 1 h de réaction, de l'éther est rajouté au mélange réactionnel. Le précipité est filtré, lavé

à l’acétone, au dichlorométhane et à l’éther pour donner 23 mg (12%) de sel de pyridinium 19

sous forme d'une poudre orange.

Remarque : pour la description des spectres, les signaux pour les motifs du coté du

nicotinamide seront notés "nic" et ceux du coté de l'adénosine seront notés "ad".

IR (KBr, cm-1) : 3421 (O-H et N-H), 2924 (C-H), 1735(C=O), 1723 (C=O), 1654 (C=N), 1636 (C=C), 1211 (C-O), 1068. RMN 1H (250 MHz,DMSO-d6) δ (ppm) : 10,32 (s, 1H, H8nic), 9,56 (s, 1H, H2nic), 9,14 (d, J = 6,5 Hz, 1H, H6nic), 8,41 et 8,16 (2 x s, 2 x 1H, H2ad et H8ad), 8,30 (d, J = 6,3 Hz, 1H, H5nic), 7,88 (s, 1H, H10nic), 7,60-7,56 (m, 2H, H12nic et H16nic), 7,45-7,42 (m, 3H, H13nic, H14nic et H15nic), 7,35 (s, 2H, H10ad), 6,16 (d, J = 2,9 Hz, 1H, H1'ad), 5,68 (s, 2H, H1'nic), 5,41-5,37 (m, 1H, H2'ad), 5,05-5,02 (m, 1H, H3'ad), 4,33-4,31 (m, 1H, H4'ad), 4,25

Partie expérimentale complémentaire : Synthèse

176

(t, J = 6,5 Hz, 2H, H3'nic), 4,13-4,08 (m, 2H, H5'ad), 3,82-3,78 (m, 2H, H5'nic), 3,16 (s, 3H, H13ad), 1,77 (q, J = 6,4 Hz, 2H, H4'nic), 1,54 (s, 3H, H12ad), 1,33 (s, 3H, H12ad). RMN 13C (63 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 171,5 et 170,9 (2 x C, C9nic et C2'nic), 168,2 (C, C3nic), 161,2, 154,13, 124,0 et 118,3 (4 x C, C4ad, C5ad, C6ad et C11ad), 143,3 (C, C4nic), 134,9 (C, C11nic), 157,9 et 144,9 (2 x CH, C2ad et C8ad), 155,6 (CH, C6), 148,1 (CH, C2), 134,4 (CH, C5), 127,0 (CH, C14nic), 134,0 (2 x CH, C12nic et C16nic), 131,0 (2 x CH, C13nic et C15nic), 94,4, 92,9, 88,6 et 86,7 (4 x CH, C1'ad, C2'ad, C3'ad et C4'ad), 90,2 (C, C7nic), 68,9, 65,6, 62,2 et 57,2 (4 x CH2, C1'nic, C3'nic, C5'nic et C5'ad), 36,4 (CH2, C4'nic) 32,2 et 30,3 (2 x CH3, C12ad). C13ad manquant caché sous le massif du DMSO (~45 ppm). RMN 31P (81 MHz, MeOD-d4) δ (ppm) : -1 (PV). SM (FAB) m/z : 726 (M+ - 80), 343 (M+ - 80 - adénosine monophosphate).

Synthèse du (1-hydroxy-3-oxo-1-phényl-1,2,3,4-tétrahydro-5H-pyrrolo[3,4-c]pyridin-5-

yl)acétate de 3-hydroxypropyle (46)

N

NHO

HO

O

O

OHBr1'

2

12

4'

5

6N

NHO

HO

O

O

OH

16

5'

11

10

6'

13

9

3'

87

15

14

2'

2046

A une solution de sel de pyridinium 20 (200 mg, 0,47 mmol) dans l'éthanol (18 mL) est

ajouté sous atmosphère inerte, à 0 °C, le tétraborohydrure de sodium (21 mg, 0,55 mmol).

Après 10 minutes sous agitation à 0 °C, quelques gouttes d'acétone puis de l'eau sont ajoutées

(15 mL) et le mélange réactionnel est extrait à l'acétate d'éthyle (3 x 20 mL). Les phases

organiques sont réunies, séchées sur sulfate de sodium anhydre et concentrées sous pression

réduite pour donner 137 mg (90%) de la 1,2 dihydropyridine 46 sous forme d'une huile jaune.

IR (film, cm-1) : 3355 (large, O-H et N-H), 2960 (C-H), 2926 (C-H), 1732 (C=O ester), 1668 (C=O hémiamidal), 1553, 1190 (C-C(=O)-O), 1050 (C-O). RMN 1H (250 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 8,25 (s, 1H, H8), 7,42-7,24 (m, 5H, H12, H13, H14, H15 et H16), 6,44 (s, 1H, H10), 6,39 (d, J = 7,1 Hz, 1H, H6), 4,56 (s large, 1H, H6'), 4,45 (d, J = 7,0 Hz, 1H, H5), 4,23 (2s, 2H, H1’), 4,16 (t, J = 6,4 Hz, 2H, H3’), 3,90 et 3,92 (2 x s, 2H, H2), 3,46 (m, 2H, H5’), 1,73 (q, J = 6,3 Hz, 2H, H4’). RMN 13C (63 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 170,7 et 169,4 (2 x C, C2’ et C9), 155,7, 141,1 109,6 (3 x C, C3, C4 et C11), 144,6 (CH, C6), 132,6 (CH, C14), 128,0 (2 x CH, C12 et C16), 125,4 (2 x CH, C13 et C15), 86,7 (CH, C5), 86,6 (C, C7), 61,9 (CH2, C3'), 57,1 et 53,3 (2 x CH2, C1’ et C5’), 45,4 (CH2, C2), 31,4 (CH2, C4’).

Partie expérimentale complémentaire : Synthèse

177

SM (DCI/NH3) m/z : 362 (M + NH4

+), 345 (M + H+), 327 (M + H+ - H2O), 227 (M + H+ - CH3COO(CH2)3OH).

Synthèse du (3-aminocarbonyl-4-benzoyl-1,4-dihydropyridin-1-yl)acétate de 3-

hydroxypropyle (47)

N

NHO

HO

O

O

OHBr 1'

2

12

4'

5

6N

O

O

OH

11

5'

10

6'

13

9

3'

8

71514

NH2

OO

2'

20 47 A une solution de sel de pyridinium 20 (100 mg, 0,24 mmol) dans l'éthanol (9,5 mL) est

ajoutée sous atmosphère inerte à 0 °C une solution de triacétoxyborohydrure de sodium (75

mg, 0,35 mmol) dans l'acide acétique (2 mL). Après 10 minutes sous agitation à 0 °C,

quelques gouttes d'acétone puis de l'eau sont ajoutées (10 mL) et le mélange réactionnel est

extrait à l'acétate d'éthyle (3 x 15 mL). Les phases organiques sont réunies, lavées avec une

solution saturée en bicarbonate de sodium, séchées sur sulfate de sodium anhydre et

concentrées sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur

colonne de gel de silice (éluant : gradient dichlorométhane/méthanol : de 100/0 à 95/5), pour

donner 50 mg (62%) de la 1,4 dihydropyridine 47 sous forme d'une huile jaune.

IR (film, cm-1) : 3354 (large, O-H et N-H), 2957 (C-H), 2929 (C-H), 1738 (C=O ester), 1683 (C=O cétone), 1652 (C=O amide), 1595 (C=C), 1393, 1218 (C-C(=O)-O), 1048 (C-O). RMN 1H (250 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 7,99 (d, J = 7,0 Hz, 2H, H11 et H15), 7,63-7,61 (m, 1H, H13), 7,55-7,50 (m, 2H, H12 et H14), 7,21 (s, 1H, H2), 6,67 (s large, 2H, H9), 6,06 (d, J = 7,7 Hz, 1H, H6), 5,05 (d, J = 4,6 Hz, 1H, H4), 4,63 (dd, J = 4,6 Hz et J = 7,8 Hz, 1H, H5), 4,56 (t, J = 5,0 Hz, 1H, H6'), 4,16 (t, J = 6,5 Hz, 2H, H3’), 4,13 (s, 2H, H1’), 3,46 (q, J = 5,6 Hz, 2H, H5’), 1,73 (q, J = 6,4 Hz, 2H, H4’). RMN 13C (63 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 197,5, 169,7 et 168,7 (3 x Cq, C7, C8 et C2’), 137,5 (CH, C2), 135,5 (C, C10), 132,6 (CH, C6), 130,6 (CH, C13), 128,6 (4 x CH, C11, C12, C14 et C15), 102,6 (C, C3), 99,8 (CH, C5), 62,1 (CH2, C3'), 57,0 et 53,3 (2 x CH2, C1’ et C5’), 41,4 (CH, C4), 31,4 (CH2, C4’). SM (DCI/NH3) m/z : 362 (M + NH4

+), 345 (M + H+).

Partie expérimentale complémentaire : Synthèse

178

Synthèse de l'adénosine-5’-phosphoromorpholidate (53)

17 18

14N

NN

N

NH2

O

OHOH

OPO

HOOH

N

NN

N

NH2

O

OHOH

P

1112

10

5'

2'4' 3'1'

82

15 ON

OO O

55 53 A une solution portée à reflux d'adénosine monophosphate 55 (300 mg, 0,86 mmol) et de

morpholine (0,3 mL, 3,60 mmol) dans un mélange eau (8,7 mL) et tert-butanol (8,7 mL), est

ajoutée goutte à goutte une solution de 1,3-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (713 mg, 3,60

mmol) dans du tert-butanol (13,0 mL). La réaction est suivie par RMN 31P (pic du

monophosphate de départ δ = 0,96 ppm et pic du phosphoromorpholidate δ = 6,76 ppm).

Après 40 h, le mélange réactionnel est filtré pour séparer le précipité blanc. Le tert-butanol est

évaporé sous pression réduite, la phase aqueuse restante est extraite à l’éther (3 x 20 mL). Les

phases organiques sont réunies et concentrées sous vide. Le résidu obtenu est dissous dans un

minimum de méthanol, de l’éther est rajouté et le précipité est lavé plusieurs fois à l'éther puis

il est séché pour donner 350 mg (98%) de phosphoromorpholidate 53 sous forme d'une

poudre blanche.

Pf : 130 °C. IR (KBr, cm-1) : 3391 (O-H et N-H), 2931 (C-H), 2855 (C-H), 1615 (C=N), 1258 (C-O), 1207 (P=O), 1112 (C-O). RMN 1H (300 MHz, MeOD-d4) δ (ppm) : 8,54 (s, 1H, H2), 8,22 (s, 1H, H8), 6,09 (d, J = 5,7 Hz, 1H, H1’), 4,70 (t, J = 5,3 Hz, 1H, H2’), 4,42 (dd, J = 3,6 Hz et J = 4,8 Hz, 1H, H3’), 4,23-4,22 (m, 1H, H4’), 4,08-4,04 (m, 2H, H5’), 3,75 (t, J = 4,8 Hz, 4H, H14 et H18 ou H15 et H17), 3,43 (t, J = 4,8 Hz, 4H, H14 et H18 ou H15 et H17). RMN 13C (63 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) : 155,9, 149,6 et 118,7 (3 x C, C4, C5 et C6), 152,5, 139,3 (2 x CH, C2 et C8), 86,9, 84,2, 74,1 et 71,0 (4 x CH, C1', C2', C3' et C4'), 66,8 (CH2, C5'), 45,4 et 43,1 (4 x CH2, C14, C15, C17 et C18). RMN 31P (121 MHz, MeOD-d4) δ (ppm) : 6,8 (PV). SM (ESI) mode négatif m/z : 415 (M-).

EVALUATION BIOLOGIQUE

Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique

181

I. Evaluation de l'activité inhibitrice sur InhA I.1. Le Principe de la cinétique enzymatique sur InhA

L'enzyme InhA de M. tuberculosis est une énoyl-ACP réductase (voir introduction) qui

catalyse la réduction NADH-dépendante de la double liaison conjuguée au carbonyle de

l'acide gras 2-trans-énoyl-ACP (Schéma 44). La réaction a lieu lorsque le substrat 2-trans-

énoyl-ACP et le cofacteur NADH sont fixés dans le site actif d'InhA. L'activité catalytique

d'InhA peut être suivie par spectrométrie UV en suivant la disparition du signal du cofacteur

NADH à 340 nm en fonction du temps.

RS R

S

NADH, H+ NAD+

O

ACPH

H O

ACPH

H

H

H Schéma 44 : Réduction NADH-dépendante de 2-trans-énoyl-ACP catalysée par InhA.

Le substrat utilisé est le 2-trans-décénoyl-CoA au lieu du 2-trans-énoyl-ACP en raison de

commodité de synthèse et de purification.

Bien que les substrats de 2-trans-énoyl-CoA montrent des valeurs de Km nettement plus

grandes que celles des Km des substrats 2-trans-énoyl-ACP (approximativement deux décades

pour une chaîne C8, R = CH3(CH2)3- : Km(C8ACP) = 2 µM et Km(C8CoA) = 467 µM), les

valeurs de Vmax restent similaires (Vmax(C8ACP) = 2,2 µmol. min-1. mg-1 et Vmax(C8CoA) =

3,6 µmol. min-1. mg-1).22

I.2. Préparation d'InhA La protéine InhA a été exprimée dans E. coli après clonage du gène inhA dans un vecteur

plasmidique pET. La croissance de la souche résultante et l'induction de l'expression du gène

inhA par 1 mM d'IPTG (isopropyl β-D-thiogalactoside) conduit à la production de la protéine

InhA hydrosoluble d'environ 28,5 KDa (28 368 Da) (monomère) qui est purifiée par des

techniques standards de purification de protéines.22 L'enzyme existe à l'état de tétramère en

solution et est conservée dans du tampon hepes 50 mM, 50% glycérol à -20 °C. L'enzyme

nous a été gracieusement fournie par Annaïk Quémard.

I.3. Préparation et purification du substrat 2-trans-décénoyl-CoA d'InhA Les substrats 2-trans-énoyl-CoA d'InhA peuvent être synthétisés à partir des acides gras

libres correspondants et du coenzyme A (CoA-SH) par la méthode de Goldman et Vagelos via

un anhydride mixte186,187 et purifiés par HPLC. La synthèse comprend deux étapes. La

Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique

182

première est l'activation de l'acide 2-trans-énoïque par réaction avec le chloroformate d'éthyle

et la diisopropyléthylamine et conduit à un anhydride mixte. La seconde étape est la formation

du thioester par couplage entre le coenzyme A réduit et l'anhydride mixte. (Schéma 45).

ROH

O+

O Cl

ON+ Et2O sec R

O O

O O

NaHCO3

EtOHAcOEt

CoA-SH

RS

O

ACPH

H

+ +OHO

ONH

Cl

énoyl-CoA Schéma 45 : Synthèse d'énoyl-CoA. R = alkyle

Nous avons ainsi pu synthétiser le 2-trans-décénoyl-CoA ou C10CoA (Figure 34) avec

un rendement de 35-40% comparable à celui de la littérature.

O

OHO

OP

N

NN

N

P

NH2

OH

OO

P

OHOHO

O

OH

O

HNO

HNO

S

O

HO

Partie acide 2-trans-décénoïque

Partie coenzyme A (CoASH)

82

3' 2'1'

5'

4'11

26

2725

28

23

22

18

19

14

12

1313

33

30

29 31

32

Figure 34: Structure du substrat 2-trans-décénoyl-CoA

Synthèse du C10-CoA

A une solution d'acide 2-trans-décénoïque (13 µL, 72 µmol) dans le diéthyl éther anhydre

(2 mL) sont ajoutés la diisopropyléthylamine (15 µL, 87 µmol) et le chloroformate d'éthyle

(8,3 µL, 87 µmol). Après une nuit sous agitation, le surnageant contenant l'anhydride mixte

est prélevé et concentré à environ 100 µL. Puis une solution de coenzyme A (20 mg, 24 µmol)

dans un mélange NaHCO3 aq (0,3 M)/EtOH/AcOEt (1/1/1) (v/v/v) (3 mL) est ajoutée sur

l'anhydride mixte. Après agitation (vortex), le mélange est laissé au repos 30 minutes à

Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique

183

température ambiante. La réaction est stoppée par addition de 50 µL d'acide acétique. La

phase aqueuse est lavée à l'acétate d'éthyle (3 x 1 mL).

La purification de la phase aqueuse contenant le 2-trans-décénoyl-CoA (C10CoA) est

réalisée par HPLC semi préparative (Waters Delta Prep 400, avec un détecteur UV : Waters

486 tunable Absorbance Detector) sur colonne C18 phase inverse (Hyperprep C18 250 mm x

21 mm) équilibrée avec une solution aqueuse de KH2PO4 20 mM pendant 10 min (débit : 15

mL/min) et éluée 10 min avec de l'eau (débit : 15 mL/min) puis avec un gradient linéaire

eau/MeOH (de 100/0 à 70/30 en 20 min) (débit : 25 mL/min et détection UV à 260 nm). Les

fractions collectées sont rassemblées et lyophilisées pour donner environ 8 mg (40%) d'un

solide blanc floconneux, très hygroscopique de C10CoA.

RMN 1H (250 MHz, D2O) δ (ppm) : 8,43 (s, 1H, H8), 8,17 (s, 1H, H2), 6,86 (dt, J = 7,0 Hz et J = 15,4 Hz, 1H, H26), 6,08 (d, J = 15,4 Hz, 1H, H25), 6,08 (m, 1H, H1'), 4,76-4,72 (m, H2O et H3'), 4,50 (s, 1H, H4'), 4,16 (s, 2H, H5'), 3,95 (s, 2H, H14), 3,76 (dd, J = 4,7 Hz et J = 9,7 Hz, 1H, H11), 3,47 (dd, J = 4,0 Hz et J = 9,7 Hz, 1H, H11), 3,36 (t, J = 6,5 Hz, 2H, H18), 3,29 (t, J = 6,4 Hz, 2H, H22), 2,97 (t, J = 6,4, Hz, 2H, H23), 2,35 (t, J = 6,5 Hz, 2H, H19), 2,09 (td, J = 7,0 Hz et J = 7,0 Hz, 2H, H27), 1,31 (m, 2H, H28), 1,14 (m, 8H, H29 à H32), 0,81 (s, 3H, H13), 0,75 (t, J = 7,0 Hz, 3H, H33), 0,67 (s, 3H, H13). MS (ESI) mode négatif m/z : 962 (M2- + 2 Na+ - H+).

Les données spectroscopiques de ce composé sont en accord avec celles décrites dans la

thèse de Michel Nguyen.

I.4. Synthèse et purification des adduits INH-NAD (inhibiteurs d'InhA) Synthèse du pyrophosphate de Mn(III)

Une solution aqueuse de pyrophosphate de sodium (200 mM), acidifiée jusqu'à un pH =

4,5 avec de l'acide pyrophosphorique et contenant de l'acétate de manganèse (III) (5,5 mM)

produit après 24 h à température ambiante le complexe rouge [MnIII(H2P2O7)3]Na3 avec un

rendement > 90% (basé sur les données de la littérature ε260 = 6200 M-1 cm-1 et ε480 = 104 M-1

cm-1).62,188

Synthèse des adduits INH-NAD

Le milieu réactionnel (volume final de 15 mL) contient de l'INH (2 mM), du NAD+ (2

mM) et du pyrophosphate de MnIII (4 mM) dans un tampon phosphate (100 mM, pH = 7,5)

sous agitation pendant 15 min. Le pool d'adduits est séparé des autres composés du mélange

réactionnel sur une cartouche sep Pak Vac® 20 cc (5 g). Le mélange réactionnel (15 mL) est

Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique

184

déposé sur la cartouche et est élué avec une solution aqueuse d'acétate d'ammonium 4 mM

(500 mL), seul le pool d'adduits est retenu. Après un lavage avec un petit volume d'eau (7

mL), les adduits sont collectés par élution à l'acétonitrile. Les fractions qui absorbent en UV-

visible à 330 nm sont réunies et évaporées sous pression réduite pour donner le pool d'adduits

INH-NAD (40%) (conservé à -20°C pendant plusieurs semaines).

I.5. Tests d'inhibition d'InhA Le NADH est obtenu de Sigma-Aldrich et est solubilisé dans l'eau. La concentration en

NADH est estimée par l'absorption de la solution à 340 nm (ε340 = 6220 cm-1).

Le pool d'adduits est dissous dans l'eau avec 5% de DMSO. La concentration du pool

d'adduits INH-NAD est déterminée par l'absorption de la solution à 330 nm (ε330 = 6900 M-1

cm-1).

Les solutions mères des composés à tester (y compris le triclosan), sont préparées dans

l'eau avec 5% de DMSO à des concentrations de 1 mM.

Le 2-trans-décénoyl-CoA est dissout dans l'eau et sa concentration est déterminée par

l'absorption de la solution à 260 nm (ε260 = 16 800 M-1 cm-1).

L'activité énoyl réductase d'InhA est suivie par spectrométrie UV en suivant la disparition

du signal du cofacteur réduit NADH à 340 nm en fonction du temps. Le pourcentage

d'inhibition est calculé en faisant le rapport des vitesses initiales (V) mesurées lors de

cinétiques avec et sans inhibiteur et multiplié par 100 : % inhibition = 100*blanc

inhib

VV . La vitesse

initiale est mesurée en traçant la tangente de la courbe DO = f(temps) au temps zéro.

La réaction enzymatique est effectuée dans un volume final de 100 µL (en cuve de quartz,

trajet optique 1 cm). L'absorption de chaque mélange réactionnel est déterminée avec un

spectrophotomètre UVIKON 293 (Bio-Tek Kontron Instruments) relié à un bain thermostaté

permettant de réguler la température de la cuve à 25°C. Une ligne de base est effectuée

pendant la préincubation juste avant le début des mesures.

Les mesures sont effectuées sur 3 min après une incubation de 5 min ou de 2 h.

Toutes les mesures sont réalisées au moins 3 fois.

Description du test initial

La préincubation est réalisée dans 80 µL (volume total) d'une solution de tampon

phosphate 100 mM, pH = 7,5 à 25 °C contenant 192 nM de InhA (5% (v/v) glycérol final

Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique

185

pour assurer une bonne stabilité de l'enzyme) et 100 µM de ligands (composés) ou 500 nM du

pool d'adduits. Après 5 min ou 2 h de préincubation, l'addition de 100 µM de NADH et de 35

µM du 2-trans-décénoyl-CoA initie la réaction. Les réactions de contrôle, sans ligands, sont

réalisées dans les mêmes conditions que celles décrites pour les ligands.

Etude d'une gamme de DMSO

La majorité des composés à tester n'est pas soluble dans l'eau. Ainsi, l'utilisation d'un co-

solvant comme le DMSO s'est révélée nécessaire. Par conséquent, il faut déterminer dans un

premier temps un seuil maximal de DMSO qui ne perturbe pas l'activité d'InhA. Nous avons

donc commencé par un test dans les conditions décrites pour les ligands, en remplaçant les

composés par différents pourcentages de DMSO. La gamme varie de 0% à 3% final de

DMSO. Les résultats montrent que jusqu'à 1% final en DMSO l'activité catalytique d'InhA

n'est pas perturbée.

% DMSO final % d'inhibition d'InhA 0 0

0,5 2 1 5 2 27 3 43

Tableau 8 : Inhibition d'InhA par le DMSO

Le test d'activité enzymatique d'InhA sera réalisé avec 0,5% de DMSO final pour

permettre la bonne solubilisation des différents composés, pour des préincubations de 5 min

ou de 2 h.

Evaluation des analogues simplifiés des adduits INH-NAD (Chapitre I)

Toutes les molécules du chapitre I ont été testées dans les conditions précédemment

décrites, à 100 µM et 0,5% DMSO final.

Etude de l'inhibition d'InhA par le Triclosan

Dans la littérature, il est décrit que le triclosan, un antiseptique, est un très bon inhibiteur

d'énoyl ACP réductase.105,116,124 Des études ont été réalisées avec une préincubation de 5 min

d'une solution tampon pipes 30 mM, NaCl 150 mM, pH = 6,8 contenant 1 nM de InhA (8%

(v/v) glycérol final et 0,1 mg/mL de BSA), différentes concentrations de triclosan et 250 µM

de NADH. La réaction est initiée par l'addition du 2-trans-dodécénoyl-CoA 85µM.

Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique

186

L'ensemble de ces résultats donne une constante d'inhibition Ki' = 220 nM et une

concentration pour inhiber 50% de la croissance bactérienne CI50 = 1 µM.

Nous avons voulu retrouver l'inhibition d'InhA par le triclosan décrite dans la littérature.

Dans les conditions décrites précédemment (description du test), le triclosan ne montre

aucune activité à 10 µM. Nous nous sommes donc rapprochés le plus possible des conditions

décrites par Sullivan et al.124

La préincubation est réalisée dans 90 µL (volume total) d'une solution tampon pipes 30

mM, NaCl 150 mM, pH = 6,8 à 25 °C contenant 70 nM d'InhA (5% (v/v) glycérol final), 10

µM de triclosan et 200 µM de NADH. Après la préincubation, l'addition de 35 µM du 2-

trans-décénoyl-CoA initie la réaction. La concentration en InhA n'a pas pu être diminuée

davantage car la mesure (DO) devient trop faible pour être interprétable. La concentration du

triclosan ne peut pas être augmentée pour des raisons de solubilité, il précipite dans le

mélange réactionnel. La concentration en NADH ne peut pas être supérieure à 200 µM sinon

le seuil de détection de l'appareil est dépassé (DO > 2,3). Et finalement nous avons continué à

travailler sur le C10-CoA comme substrat, sa concentration a été déterminée en fonction de la

quantité dont nous disposions (35 µM).

Dans ces nouvelles conditions expérimentales nous avons en effet observé une inhibition

d'InhA par le triclosan, cependant à 10 µM (dans 0,5% DMSO final) seule une inhibition de

l'ordre de 40% est observée.

Etude de l'effet du tampon et du sel sur l'inhibition d'InhA par le triclosan

Suite à ce résultat, nous avons voulu vérifier si l'inhibition était liée uniquement au

changement de concentration des différents partenaires ou s'il y avait un lien avec le tampon

utilisé. Nous avons donc réalisé de nouvelles mesures où d'une part le tampon pipes a été

remplacé par le tampon phosphate 100 mM pH = 7,5 (sans NaCl) et d'autre part le tampon

pipes 30 mM pH = 6,8 est utilisé en absence de NaCl. Dans ces tampons, aucune activité

inhibitrice du triclosan n'a pu être observée. Bien que ce phénomène n'ait pas été décrit dans

la littérature, la présence de NaCl semble indispensable à l'inhibition d'InhA par le triclosan.

Etude de l'effet du tampon et du sel sur l'inhibition d'InhA par les adduits INH-NAD

Suite à la mise en évidence de l'importance du tampon et de la présence de sel sur

l'inhibition d'InhA par le triclosan, nous avons voulu déterminer les conditions idéales pour

lesquelles les adduits INH-NAD montreraient une inhibition maximale. Nous avons donc

Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique

187

réalisé une étude comparative en utilisant le tampon pipes 30 mM; NaCl 150 mM, pH = 6,8,

le tampon pipes 30 mM, pH = 6,8 et le tampon phosphate 100 mM, pH = 7,5.

La préincubation est réalisée dans 90 µL (volume total) d'une solution de tampon à 25°C

contenant 70 nM d'InhA (5% glycérol final), 10 µM, 1 µM ou 500 nM du pool d'adduits et

200 µM de NADH. Après 5 min de préincubation, l'addition de 35 µM du 2-trans-décénoyl-

CoA initie la réaction.

Les résultats obtenus sont identiques quel que soit le tampon utilisé. Le tampon et le sel

n'ont pas d'inflence sur l'inhibition d'InhA par les adduits INH-NAD.

Effet du temps de préincubation sur l'inhibition d'InhA par les adduits INH-NAD

Tonge24 décrit les adduits INH-NAD comme des inhibiteurs de type "slow tight binding"

(voir introduction). En effet, les adduits inhibent InhA plus efficacement avec une

préincubation plus longue.

Une fois de plus nous avons voulu retrouver ce résultat. La préincubation est réalisée dans

90 µL (volume total) d'une solution de tampon pipes 30 mM, NaCl 150 mM, pH = 6,8 à 25°C

contenant 70 nM de InhA (5% glycérol final), 10 µM, 1 µM ou 500 nM du pool d'adduits et

200 µM de NADH. Après 2 h de préincubation, l'addition de 35 µM du 2-trans-décénoyl-

CoA initie la réaction.

Les résultats obtenus sont décrits dans le tableau 9.

Temps de préincubation [INH-NAD]

5 min

% d'inhibition de InhA

2 h

% d'inhibition de InhA

10 µM 92 97

1 µM 67 87

500 nM 53 69

Tableau 9 : Inhibition d'InhA par les adduits INH-NAD

Une préincubation de 2 h permet en effet d'augmenter d'environ 20% l'inhibition d'InhA

par les adduits. Il est donc intéressant de tester à nouveau les molécules ayant une activité

inhibitrice avec un temps de préincubation de 5 min, dans ces nouvelles conditions.

Evaluation des inhibiteurs de type bisubstrat : test définitif

L'ensemble des expériences réalisées préalablement a permis de déterminer les meilleures

conditions pour tester les nouvelles molécules (Chapitre II). Le tampon pipes 30 mM, NaCl

Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique

188

150 mM, pH = 6,8 semble être le tampon le plus approprié car il permet de voir l'activité

inhibitrice du triclosan qui n'est pas retrouvée dans les autres et ne modifie pas l'inhibition du

pool d'adduits. InhA est utilisé à 100 nM pour permettre une meilleure discrimination de

l'inhibition entre les différents composés (pente du témoin sans inhibiteur plus forte). Tous les

résultats précédents ont été confirmés à cette nouvelle concentration d'InhA. Le cofacteur

NADH est utilisé à 200 µM et le 2-trans-décénoyl-CoA à 35 µM.

Dans un premier temps l'ensemble des composés est testé avec une préincubation de 5

min et seul les composés présentant une activité inhibitrice sont étudiés avec 2 h de

préincubation.

Les composés ont tous été testés à 100 µM avec 0,5% de DMSO, sauf le 125 qui précipite

dans la cuve UV. Elle est donc testée à 10 µM et 0,5% de DMSO pour éviter la précipitation.

Le 122 présentant une bonne activité a aussi été testé à 10 µM et 20 µM pour obtenir une

inhibition moyenne à 5 min de préincubation ce qui permettrait de mettre en évidence une

amélioration de l'inhibition avec un temps de préincubation de 2 h.

Les 122, 123, 124, 125 et 119 sont testés avec une préincubation de 2 h avec des

concentrations de 20 µM, 100 µM, 100µM, 10 µM et 100 µM respectivement.

La préincubation est réalisée dans 90 µL (volume total) d'une solution de tampon de pipes

30 mM, NaCl 150 mM, pH = 6,8 à 25 °C contenant 100 nM d'InhA, 100 µM, 20 µM ou 10

µM du composé à tester (ou 10 µM de triclosan ou 500 nM du pool d'adduits) et 200 µM de

NADH. Après 5 min ou 2 h de préincubation, l'addition de 35 µM du 2-trans-décénoyl-CoA

initie la réaction. Ou bien la préincubation est réalisée dans 80 µL (volume total) d'une

solution de tampon de pipes 30 mM, NaCl 150 mM, pH = 6,8 à 25 °C contenant 100 nM

d'InhA et 100 µM, 20 µM ou 10 µM du composé à tester (ou 10 µM de triclosan ou 500 nM

du pool d'adduits). Après 5 min ou 2 h de préincubation, l'addition de 200 µM de NADH et de

35 µM du 2-trans-décénoyl-CoA initie la réaction.

Il est ainsi possible d'envisager que l'addition du NADH après la préincubation permette à

l'inhibiteur potentiel d'avoir le site actif libre pour s'installer sans avoir besoin de déplacer le

NADH. Cependant aucune différence dans les résultats n'a été observée entre les deux

protocoles.

Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique

189

II. Evaluation de l'activité anti-bactérienne II.1. Principe du test.

L'activité antimycobactérienne est évaluée par des tests colorimétriques de réduction du

MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-2H-tétrazolium), sur la souche

M. smegmatis mc2155.

NN

NN

SN

BrNHN

NN

SN

Réduction

Enzymes mycobactériennes

MTT jaune MTT formazan violet Schéma 46

Lorsque que les bactéries ont pu se développer normalement, le sel de tétrazolium (MTT)

jaune se réduit et change de couleur, il devient violet. Par contre si la croissance des bactéries

est complètement inhibée par un de nos composés, la réduction ne peut plus avoir lieu et la

solution reste jaune. Une lecture de la densité optique à 570 nm permet d'observer la

formation du MTT formazan réduit de couleur violette. Le pourcentage d'inhibition est

calculé par le rapport des DO avec et sans inhibiteur multiplié par 100.

II.1. Inhibition de croissance de M. smegmatis. Préparation des suspensions bactériennes de Mycobacterium smegmatis.

La souche Mycobacterium smegmatis mc2155 (R0) est cultivée dans un milieu de culture

middelbrook 7H9-glycérol 0,2% (Difco) à 37 °C sous agitation (200 rpm) afin d'éviter la

formation de voile bactérien. Après 3 jours, la culture R0 est laissée au repos 10 min, le temps

que les plus gros agrégats sédimentent. Le surnageant est prélevé pour lancer une nouvelle

culture R1, dans les mêmes conditions, ensemencée au 1/100. Après 3 jours sous agitation à

37 °C, et 10 min de repos, le surnageant est prélevé. La densité optique de la suspension

bactérienne est mesurée à 650 nm et ramenée à une valeur comprise entre 0,002 et 0,003 par

dilution dans le milieu de culture, c'est la R2.

Test de l'homogénéité de la suspension bactérienne R2.

Les essais sont réalisés sur des microplaques NUNC (Merk-eurolab) 96 puits. Chaque

puits contient 100 µL de milieu de culture (7H9 + 0,2% Gro) et 100 µl de suspension

bacérienne R2. La plaque est fermée par du parafilm et incubée à 37°C sous agitation (200

Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique

190

rpm). Après 24 h, la densité optique est mesurée à 650 nm par un spectrophotomètre µQuant

Bio-tek instruments, INC, lecteur de plaque 96 puits.

L'homogénéité de la suspension bactérienne n'est pas bonne Figure 35a. Pour résoudre ce

problème, nous avons réalisé les cultures R0 et R1 en rajoutant 0,05% de tween 80 dans le

milieu de culture pour limiter la formation d'agrégat. Par contre la R2 est réalisée sans tween

80 afin de ne pas fragiliser l'enveloppe des mycobactéries.

a

0

0,02

0,04

0,06

0,08

Mesures

DO

650n

m

b0

0,02

0,04

0,06

0,08

Mesures

DO

650

n

Figure 35 : a) Homogénéité de R2 mc2155, préparée a partir de R0 et R1 sans tween 80. b) Homogénéité de R2 mc2155, préparée sans tween 80 à partir de R0 et R1 avec tween 80.

La même expérience est réalisée sur cette nouvelle suspension bactérienne. Dans ces

conditions elle est beaucoup plus homogène (Figure 35b). Les cultures R0 et R1 se font donc

avec 0,05% de tween 80 pour éviter les problèmes d'hétérogénéité.

Préparation du MTT (1 mg/mL)

Une solution mère de MTT à 10 mg/mL dans un tampon PBS (phosphate) est diluée dans

le milieu de culture pour donner une solution finale à 1 mg/mL.

Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique

191

Préparation du tampon de lyse

Le tampon de lyse sert à homogénéiser la solution, avant de faire la lecture de la densité

optique des puits. Il est constitué d'un mélange DMF/SDS20%, v/v : 1/2, pH = 4,7.

L'ajustement du pH se fait à l'aide d'acide acétique.

Test sur bactéries

Les essais sont réalisés sur des microplaques NUNC (Merk-eurolab) 96 puits. Chaque

produit est testé sur la même gamme de concentration allant de 5 mM à 78 µM en réalisant

des dilutions successives de deux en deux (la 1,4 DHPPy 66/67 est testée de 2,5 mM à 39 µM

et le 125 de 1,25 mM à 19,5 µM, limité par la quantité de produit disponible). Les composés

donnant une activité importante à ces concentrations sont testés à des concentrations plus

faibles pour déterminer les concentrations inhibant environ 50% de la croissance

mycobactérienne. L'INH est pris comme témoin dans une gamme de concentration allant de

156 µM à 2,4 µM. Toutes les concentrations sont testées au moins deux fois.

Chaque puits contient 100 µL de composé en solution dans le milieu de culture (7H9 +

0,2% Gro avec 1% de DMSO final). Il est ensuite ajouté 100 µL de suspension bactérienne

R2.

La plaque est fermée par du parafilm et incubée à 37 °C. Après 24 heures d'incubation, 50

µL d'une solution à 1 mg/mL de MTT sont rajoutés dans chaque puits. Après 3 heures

d'incubation à 37 °C, 100 µL de tampon de lyse sont ajoutés dans chaque puits et la plaque est

laissée sous agitation à température ambiante jusqu'à ce que la solution soit bien homogène.

La densité optique est mesurée à 570 nm avec un spectrophotomètre µQuant Bio-tek

instruments, INC, lecteur de plaque 96 puits.

Deux contôles ont été réalisés :

Tout d'abord, les dihydropyridines sont des réducteurs et pourraient réduire le sel de

tétrazolium ce qui fausserait les résultats, des molécules inhibant la croissance

mycobactériennes pourraient être masquées. Un contrôle sans bactérie, en présence des

différentes dihydropyridines a donc été réalisé. Les dihydropyridines sont effectivement

capables de réduire le MTT, mais uniquement à des concentrations supérieures au mM. Pour

ces concentrations, le pourcentage d'inhibition a été calculé en excluant la réaction de

réduction du MTT par les dihydropyridines.

Les DO de toutes les solutions de composés ont aussi été mesurées, pour vérifier qu'il n'y

ait pas d'interférence entre la couleur du composé et la lecture de la DO à 570 nm.

Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique

192

Préparation des solutions de produits à tester

Pour chaque produit à tester, une solution mère est préparée à 500 mM dans le DMSO. La

dilution dans les puits conduira à 1% de DMSO final.

Test d'une gamme de DMSO sur la croissance de M. smegmatis mc2155.

Pour vérifier que 1% de DMSO n'affecte pas la croissance des bactéries, une gamme de

DMSO a été testée, allant de 10% à 0,16%, dilué de deux en deux, ainsi que sans DMSO.

Tous les pourcentages sont testés 4 fois. Comme on peut la voir sur la Figure 36, jusqu' à 1%

de DMSO la croissance des mycobactéries n'est pas influencée.

0

0,5

1

1,5

2

0,1 1 10

% DMSO

DO

570n

m

1234Sans DMSO

Figure 36 :Influence du DMSO sur la croissance de mc2155.

II.2. Test de la spécificité des composés

Inhibition de croissance de Escherichia coli DH5α et de Corynebacterium glutamicum

Préparation des suspensions bactériennes de E.Coli et de C.glutamicum.

La souche Escherichia coli DH5α est cultivée dans un milieu LB (Luria Browth Base,

Difco) à 37 °C sous agitation à 200 rpm. La DO de la culture est directement mesurée et

ajustée à une valeur de 0,002-0,003 par dilution dans le milieu de culture LB.

La souche de Corynebacterium glutamicum est cultivée dans un milieu BHI (Brain Heart

Infusion) à 30 °C sous agitation à 200 rpm. La DO de la culture est directement mesurée et

ajustée à une valeur de 0,002-0,003 par dilution dans le milieu de culture LB. C. glutamicum

pousse aussi dans le milieu LB, on l'utilise à la place du BHI car ce dernier est très coloré et

perturbe la lecture de la DO à 570 nm.

Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique

193

Préparation des solutions des composés à tester.

Les gammes de concentrations testées sur E. Coli sont décrites dans le Tableau 10

(dilution de deux en deux).

Composés Gamme de concentration testée

INH 5 mM à 2,4 µM 108 5 mM à 2,4 µM 109 5 mM à 4,9 µM 119 5 mM à 19,5 µM 122 78 µM à 1,2 µM 125 1,25 mM à 0,6 µM

Triclosan 19 µM à 5 nM

Tableau 10

Les gammes de concentrations testées sur C. glutamicum sont décrites dans le Tableau

11 (dilution de deux en deux).

Composés Gamme de concentration testée

INH 5 mM à 2,4 µM 108 156 µM à 2,4 µM 109 312 µM à 4,9 µM 119 5 mM à 19,5 µM 122 78 µM à 1,2 µM 125 39 µM à 0,6 µM

Triclosan 19 µM à 0,3 µM

Tableau 11

Les solutions mères sont préparées dans le DMSO à une concentration 100 fois supérieure

à la plus forte concentration à tester.

Test sur bactéries

Le test se déroule de la même façon que pour le test sur M. smegmatis.

Les essais sont réalisés sur des microplaques NUNC (Merk-eurolab) 96 puits. Toutes les

concentrations sont testées au moins deux fois.

Chaque puits contient 100 µL de composé en solution dans le milieu de culture (LB avec

1% de DMSO final). Il est ensuite ajouté 100 µl de suspension bactérienne de 0,002 de DO à

650 nm.

La plaque est fermée par du parafilm et incubée à 37 °C pour E. Coli et à 30 °C pour C.

glutamicum. Après 2 heures d'incubation, 50 µL d'une solution à 1 mg/mL de sel de

Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique

194

tétrazolium (MTT) sont rajoutés dans chaque puits. Après 1 heure d'incubation à 37 °C pour

E. Coli et 2h à 30 °C pour C. glutamicum, 100 µL de tampon de lyse sont ajoutés dans chaque

puits et la plaque est laissée sous agitation à température ambiante jusqu'à ce que la solution

soit bien homogène.

La densité optique est mesuré à 570 nm avec un spectrophotomètre µQuant Bio-tek

instruments, INC, lecteur de plaque 96 puits.

Inhibition de croissance de M. tuberculosis

Préparation des suspensions bactériennes de M. tuberculosis.

La souche Mycobacterium tuberculosis H37rv est cultivée dans un milieu de culture

middelbrook 7H9-glycérol 0,2% (Difco) à 37 °C sous agitation (200 rpm). La densité optique

de la suspension bactérienne est mesurée à 650 nm et ramenée à une valeur comprise entre

0,002 et 0,003 par dilution dans le milieu de culture.

Préparation des solutions de composés à tester.

Les gammes de concentrations testées sur M. tuberculosis sont décrites dans le Tableau

12 (dilution de deux en deux).

Composés Gamme de concentration testée

INH 156 µM à 0,3 µM 108 156 µM à 0,3 µM 109 312 µM à 0,6 µM 119 1250 µM à 2,44 µM 122 78 µM à 0,15 µM 125 39 µM à 0,075 µM

Triclosan 19 µM à 0,038 µM

Tableau 12 Les solutions mères sont préparées dans le DMSO à une concentration 100 fois supérieure

à la plus forte concentration à tester.

Test sur bactéries

Le test se déroule de la même façon que pour le test sur M. smegmatis.

Les essais sont réalisés sur des microplaques NUNC (Merk-eurolab) 96 puits. Les

concentrations ont été testées deux fois pour les composés 108, 109, 125 et triclosan mais

Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique

195

seulement une fois pour les composés INH, 119 et 122. La deuxième mesure pour ces

composés est en cours.

Chaque puits contient 100 µL de composé en solution dans le milieu de culture (7H9 +

0,2% Gro avec 1% de DMSO final). Il est ensuite ajouté 100 µl de suspension bactérienne de

0,002 de DO à 650 nm.

La plaque est fermée par du parafilm et incubée à 37 °C. Après 6 jours d'incubation, 50

µL d'une solution à 1 mg/mL de sel de tétrazolium (MTT) sont rajoutés dans chaque puits.

Après 24 heures d'incubation à 37 °C, 100 µL de tampon de lyse sont ajoutés dans chaque

puits et la plaque est laissée à température ambiante jusqu'à ce que la solution soit bien

homogène (environ 24 heures).

La densité optique est mesuré à 570 nm avec un spectrophotomètre µQuant Bio-tek

instruments, INC, lecteur de plaque 96 puits.

II.3. Détermination des CI50 des différents composés sur M. smegmatis, E. coli

et C. glutamicum. Après une détermination approximative des CI50 nous avons réalisé sur une même

expérience une gamme de concentration allant jusqu'à environ 1 log au dessus et 1 log en

dessous de la CI50 pour chaque souche de bactérie. Les gammes de concentration utilisées

sont décrites dans le Tableau 13 (dilution de deux en deux).

Composés Concentrations testées en µM M. smegmatis

Concentrations testées en µM

E. coli

Concentrations testées en µM C. glutamicum

INH 120 à 0,469 5000 à 19 5000 à 19 108 70 à 0,273 5000 à 19 160 à 0,625 109 700 à 2,734 5000 à 19 70 à 0,273 119 1000 à 3,906 5000 à 19 5000 à 19 122 50 à 0,195 2000 à 7,813 40 à 0,156 125 80 à 0,312 1250 à 4,883 50 à 0,195

Triclosan 20 à 0,078 0,2 à 0,00078 60 à 0,234

Tableau 13

Les courbes sont tracées avec le logiciel GraphPad prism. Le modèle utilisé pour fitter les

courbes est : "Sigmoïdal dose response". L'équation utilisée est la suivante :

Y = Bottom + (Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))

X est le logarithme de la concentration. Y est le pourcentage d'inhibition. Y commence au

"Bottom" et va vers le "Top" avec une courbe sigmoïde.

Partie expérimentale complémentaire : Evaluation biologique

196

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Tamara DELAINE

Design, synthesis, study of tautomerism equilibrium and biological evaluation of new

analogues of Isoniazid-NAD(H) adduct as inhibitors of InhA from Mycobacterium tuberculosis

Abstract The resurgence of tuberculosis can be associated to the resistance of Mycobacterium

tuberculosis strain to the most important antitubercular drugs as isoniazid (INH). INH is a

prodrug that requires activation by catase peroxydase KatG to form with NADH the INH-

NAD adduct. This adduct inhibits the InhA enzyme, necessary to the biosynthesis of mycolic

acids that are essential components of mycobacterial envelope. The resistance to INH is

resulting from mutations in katG that diminish its ability to convert INH in active form. So,

compounds able to inhibit directly InhA without requiring activation have tremendous

promise as novel drugs.

We have synthesized in one first stage, truncated analogues of INH-NAD adduct in order

to eliminate resistance problems attributed to KatG. The biological evaluation of these

compounds did not exhibit satisfactory inhibition of the enzyme InhA neither of the

mycobacterial growth.

In one second stage, we have developed another strategy named bi-substrate. All

compounds prepared was tested on the inhibition of InhA and mycobacterial growth and it

gave interesting and promising results.

Next we have used simplified analogues to studied tautomerism equilibrium of INH-NAD

adduct with experimental data supported by studies of molecular modeling.

Lastly, in order to try to understand this phenomenon, we carried out studies of

interaction of different adducts present in solution with InhA by docking and molecular

dynamics.

Key words : tuberculosis/ isoniazid / inhibitors of InhA / INH-NAD adduct / bi-substrate / ring-chain tautomerism

Auteur : Tamara DELAINE

Conception, synthèse, étude de l'équilibre tautomérique et évaluation biologique de nouveaux analogues de l'adduit Isiniazide-NAD(H) comme inhibiteur d'InhA de

Mycobacterium tuberculosis

Directeur de thèse : Vania BERNARDES-GENISSON Lieu et date de soutenance : LCC, 205 route de Narbonne, Toulouse, 18 octobre 2007

Résumé La résurgence de la tuberculose est due entre autre à l'apparition de souches résistantes

aux antituberculeux comme l'isoniazide (INH). L'INH est une prodrogue qui a besoin d'être activée par l'enzyme KatG pour former avec le cofacteur NADH les adduits INH-NAD. Ces adduits inhibent l'enzyme InhA impliquée dans la biosynthèse des acides mycoliques, constituants essentiels de l'enveloppe mycobactérienne. Il est admis que de nombreuses résistances à l'INH sont dues à des mutations de katG. L'INH ne peut plus être activé, il est inactif sur InhA. Des molécules capables d'inhiber directement InhA sans étape d'activation sont de bons candidats à de nouveaux médicaments.

Nous avons dans un premier temps, synthétisé des analogues simplifiés de l'adduit INH-NAD afin de contourner les problèmes de résistances liés à KatG. L'évaluation biologique de ces composés n'a pas montré d'inhibition significative ni de l'enzyme InhA, ni de la croissance mycobactérienne.

Dans un second temps, nous avons développé une autre stratégie, appelée bisubstrat. L'ensemble des composés préparés a été testé sur l'inhibition d'InhA et de croissance de mycobactéries et a donné des résultats intéressants et prometteurs.

Parallèlement nous nous sommes intéressés à l'étude de l'équilibre tautomérique des adduits INH-NAD. Nous avons étudié cet équilibre sur des modèles simplifiés des adduits avec des données expérimentales soutenues par des études de modélisation moléculaire.

Enfin pour essayer de comprendre ce phénomène, nous avons réalisé des études d'interaction des différents adduits présents en solution avec InhA par docking et de dynamique moléculaire. Mots clés : tuberculose / isoniazide / inhibiteur d'InhA / adduit INH-NAD / bisubstrat / tautomère chaîne-cycle. Discipline : Chimie, biologie, santé

Laboratoire de Chimie de Coordination du CNRS 205, route de Narbonne, 31077 Toulouse cedex 4