synthèse d’inhibiteurs potentiels de l’enzyme de...

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UNIVERSITE STRASBOURG I – LOUIS PASTEUR

THESE de DOCTORAT

Présentéepour l’obtention du grade de :

Docteur de l’Université de Strasbourg I

Mention : ChimieDiscipline : Pharmacochimie

par

Gilles CUREIngénieur chimiste

Synthèse d’inhibiteurs potentiels de l’enzyme de conversion del’endothéline (ECE).

Soutenue le 19 mars 2004 devant la commission d’examen :

Dr Gilles Hanquet Rapporteur interneDr Pierre Renard Rapporteur externeDr Philippe Bisseret Rapporteur externePr Camille-Georges Wermuth ExaminateurDr André Mann Co-directeur de thèseDr Yveline Rival Co-directrice de thèse

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UNIVERSITE STRASBOURG I – LOUIS PASTEUR

THESE de DOCTORAT

Présentéepour l’obtention du grade de :

Docteur de l’Université de Strasbourg I

Mention : ChimieDiscipline : Pharmacochimie

par

Gilles CUREIngénieur chimiste

Synthèse d’inhibiteurs potentiels de l’enzyme de conversion del’endothéline (ECE).

Soutenue le 19 mars 2004 devant la commission d’examen :

Dr Gilles Hanquet Rapporteur interneDr Pierre Renard Rapporteur externeDr Philippe Bisseret Rapporteur externePr Camille-Georges Wermuth ExaminateurDr André Mann Co-directeur de thèseDr Yveline Rival Co-directrice de thèse

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Remerciements

Je remercie les professeurs Camille Georges Wermuth et Marcel Hibert de m’avoir

offert l’opportunité d’effectuer ma thèse au sein du laboratoire de Pharmacochimie de La

Communication Cellulaire. Je tiens à exprimer ma reconnaissance au professeur Camille

Georges Wermuth ainsi qu’à Yveline Rival et André Mann qui m’ont aidé tout au long de ce

travail par leur soutien scientifique et leurs précieux conseils.

Je remercie également les membres du jury, Philippe Bisseret, Gilles Hanquet et Pierre

Renard d’avoir accepté de juger ce travail et de venir en discuter à Illkirch.

Merci à Hélène Dozol et à Bernard Spiess pour m’avoir fait découvrir la physico-

chimie, domaine qui m’était encore inconnu.

J’adresse une pensée affectueuse à tous mes collègues qui m’ont aidé par leurs

conseils et leur bonne humeur à mener à bien ce travail au quotidien: Angèle, Anh, Benoit,

Bruno, Cécile, Céline, Chouaïb, Christophe, Cyril, Dominique, Evelyne, Françoise, Hadjila,

Isabelle, Jacques, Jean-Jacques, Jean-Laurent, Marlyse, Martine, Maryline, Nadia, Patricia,

Patrick, Paul, Philippe, Romain, Saïd, les deux Sébastien, Valérie et les Neuro-3D.

Enfin, je tiens également à remercier Eric Sartory, ma famille et Magali pour leur

soutien durant ces trois ans.

5

Résumé

En 1985, les endothélines (ET-1, ET-2, ET-3), de puissants vasoconstricteurs, ont étédécouvertes. Ces peptides sont constitués de vingt et un aminoacides et de deux bouclesdisulfures intramoléculaires et proviennent d’un précurseur prépro-ET, composé d’environdeux cent résidus aminoacides. L’hydrolyse de ce précurseur par des peptidases conduit aux“ big ” ETs, peptides de quarante acides aminés, qui sont finalement dégradés par l’enzyme deconversion de l’endothéline (ECE), métalloprotéase à zinc, pour générer les ETs.

L’administration d’ET-1 exogène, peptide prépondérant de cette famille, aboutit à unevariété de disfonctionnements dans le système nerveux central, rénal et cardiovasculaire. Uneapproche possible pour inhiber ces effets est d’utiliser des antagonistes de récepteurs de cesystème. Une approche alternative pourtant moins étudiée réside dans la suppression de labiosynthèse de l’ET-1 en utilisant des inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’endothéline,sujet de cette thèse.

Le premier inhibiteur connu de l’ECE a été le phosphoramidon, inhibiteur classiquedes métalloprotéases à zinc. D’autres ont ensuite été obtenus, pouvant être classés dans diversgroupes comme par exemple les inhibiteurs peptidiques, les composés phosphorylés, lesthiols, les acides hydroxamiques ou carboxyliques. Un chef de file a donc été choisi pourdébuter nos travaux. C’est un acide aminophosphonique présentant une très bonne affinitépour l’ECE, une bonne sélectivité face aux autres métalloprotéases à zinc, un squelette sedifférenciant des autres et permettant un grand nombre de variations structurales. Cettemolécule de référence et 22 analogues ont été synthétisés dans le but d’une étude de relationstructure-activité.

Une étude physico-chimique a été faite afin de mieux comprendre le manque deréactivité chimique remarquable de l’amine basique portée par cette famille de composés. Unetrès forte interaction intramoléculaire de type liaison hydrogène entre l’atome de phosphore etl’azote a été mise en évidence sur une très large gamme de pH, celle-ci devant certainementavoir une influence pour la reconnaissance de nos ligands par l’ECE.

Enfin, dans le but d’obtenir une plus grande diversité pour nos ligands, la synthèse deβ-aminophosphonates diversement substitués a été mise au point via une réactiontricomposante mettant en jeu un aldéhyde, un phosphite et un carbamate en présence d’acidede Lewis.

Les caractéristiques inhibitrices de nos molécules ont été évaluées. Nous ne sommespas parvenus à obtenir une molécule meilleure que celles connues dans la littérature maisnous avons réuni des renseignements structuraux relativement intéressants pour lareconnaissance de nos ligands par l’ECE. Pour le type de composés étudiés, la fonction acideaminophosphonique semble être la meilleure fonction pour la chélation du zinc. L’aminebasique de cette famille de produits contribue également à cette reconnaissance et desinteractions de type aryl-aryl doivent être mises en jeu à proximité de la zone occupée parcelle-ci. Au niveau de la poche S1’ des interactions de type aryl-aryl et de type accepteur-donneur ont été mises en évidence. Le même de type de conclusion a été obtenu pour la pocheS2’ puisque l’apport d’un noyau aromatique hétérocyclique s’est avéré bénéfique. Par contre,la position des fonctions servant à assurer ces interactions semble assez importante.

Mots clés : endothéline, enzyme de conversion de l’endothéline, big-ET, inhibiteur,phosphoramidon, interaction intramoléculaire, acide β-aminophosphonique.

6

Summary

The endothelin (ET-1, ET-2, ET-3), potent peptidic vasconstrictors, have beendiscovered in 1985. These peptides are composed of 21-amino acids and two intramoleculardisulphide bonds. They are biosynthesized from about 200-amino acid precursors namedpreproETs. The hydrolysis of these precursors by an endopeptidase leads to the big Ets, 40-amino acid peptides, which are converted in Ets by a membrane-bound zinc metalloproteasenamed endothelin converting enzyme (ECE).

The administration of exogene ET-1, the preponderant peptide of this family, leads toa variety of cardiovascular, renal and central nervous system dysfunctions. One possibleapproach to inhibit the effects of ET-1 is by means of receptor antagonists. An alternative butless studied approach is to suppress the biosynthesis of ET-1 using ECE inhibitors. The latterwill be the subject of our work.

The first known ECE inhibitor was the phosphoramidon, a classical zincmetalloprotease inhibitor. Subsequently others inhibitors have been discovered, which can beclassified as metal chelator, peptidic inhibitor, organic compounds featuring a phosphorus-containing functionality, a sulfhydryl, a hydroxamic acid or a carboxylic acid as the zincbinding group. A leader compound has been selected to initiate our work. It’s anaminophosphonic acid showing a good affinity and selectivity for ECE and a differentskeleton which allow a large possibility for structural variations. This compound and twenty-two others have been synthesized within the structure-activity relationship study.

A physico-chemical study has been made to better understand the noteworthy lowchemical reactivity of the basic amin of this compounds family. A very strong intramolecularinteraction (hydrogen bond) between the phosphonate fonctionality and the nitrogen atom hasbeen revealed for a large scale of pH. This interaction must certainly have an influence on therecognition of our compounds by ECE.

Finally, in order to obtain a larger diversity for our products, the synthesis of variedsubtituted β-aminophosphonate has been focused by way of a tri-compounds reaction usingan aldehyde, a phosphite and a carbamate in the presence of a Lewis acid.

The inhibitive characteristics of our compounds have been evaluted. We have notobtained a better product than these known in the literature but we have collected structuralinformations for the recognition of products by ECE. For the type of studied compounds, theaminophosphonic acid functionality is the best functionality for the zinc chelation. The basicamin of this products family contribute too to this recognition and aryl-aryl interactions arenecessary near to the zone occupied by this functionality. For the S1’ pocket, aryl-aryl andacceptor-donnor interactions have been revealed. The same conclusions have been obtainedfor the S2’ pocket since the supply of a heterocyclic aromatic core proved beneficial.However, the position of the fonctionality allowing these interactions is important.

Key words : endothelin, endothelin converting enzyme , big-ET, inhibitor, phosphoramidon,intramolecular interaction, β-aminophosphonic acid.

7

Abréviations

Les acides aminés sont décrits dans l’annexe

AA acide arachidonique

ACE enzyme de conversion de l’angiotensine

AMPc adénosine monophosphate cyclique

ANP peptide natriurétique atrial

ARN acide ribonucléique

Boc tert-butyloxycarbonyl

BOP benzotriazol-1-yl-oxytrisdiméthylaminophosphonium hexafluorophosphate

cADN acide désoxyribonucléique cyclique

CI50 concentration nécessaire à l’obtention de 50% d’inhibition.

DIPEA diisopropyléthylamine

DMAP 4-diméthylaminopyridine

DMF diméthylformamide

ECE enzyme de conversion de l’endothéline

EDTA acide éthylènediaminetétraacétique

EGTA acide éthylèneglycol-bis-(2-aminoéthyl)-tétraacétique

ET endothéline

EtOH éthanol

Fmol femtomolaire

GMPc guanosine monophosphate cyclique

hECE enzyme de conversion de l’endothéline de source humaine

HPLC chromatographie liquide à haute performance

KOD potasse deutérée

M mole / litre

8

mARN acide ribonucléique messager

MeOH méthanol

NEP endopeptidase neutre

nm nanomolaire

nM nanomole / litre

NMM N-méthylmorpholine

nmol nanomole

NO oxyde d’azote

PGI2 prostacycline

PMSF fluorure de phénylméthylsulfonyle

RMN résonance magnétique nucléaire

TFA acide trifluoroacétique

TGF-β transforming growth factor β

TMSBr bromure de triméthylsilyle

TNF-α Tumor necrosis factor α

TRIS 2-amino-2-hydroxyméthyl-1,3-propanediol

UMR unité mixte de recherche

UV ultra-violet

9

Table des matières

Introduction générale 11

…………………………………..

Chapitre I : Système de l’endothéline et inhibition de l’enzyme deconversion de l’endothéline (ECE) 14

1 : Présentation du système de l’endothéline : 17

2 : Rôle pathophysiologique de l’endothéline endogène : 41

3 : Les inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’endothéline : 46

4 : Conclusion : 60

…………………………………..

Chapitre II : Synthèse d’inhibiteurs de l’ECE et chimie mise en jeu 61

1 : Choix d’une référence pour nos travaux : 65

2 : Synthèse racémique de notre référence et travail de relation structure activité: 77

3 : Etude physico-chimique de molécules dérivées de nos produits : 116

4 : Synthèse d’une plateforme β-aminophosphonate : 140

5 : Conclusions : 151

…………………………………..

10

Chapitre III : Résultats pharmacologiques 152

1 : Description de différents types de test : 158

2 : Résultats pharmacologiques obtenus pour la molécule (±) 1 : 167

3 : Etude de relation structure-activité : 168

4 : Conclusions et perspectives : 185

…………………………………..

Conclusion générale 191

…………………………………..

Bibliographie 194

…………………………………..

Annexe 201

11

Introduction générale

12

En 1985, la découverte de l’endothéline, un puissant vasoconstricteur, a donné lieu à

un grand nombre de travaux pour déterminer son rôle dans des physiopathologies humaines.

Suite à la caractérisation de ce peptide et de sa biosynthèse, des agonistes et des antagonistes

des récepteurs du système endothélial ainsi que des inhibiteurs de l’enzyme spécifique, notée

ECE, entrant en jeu dans l’étape finale du processus biosynthétique de ce peptide, ont été

obtenus. Durant le présent travail de thèse, nous nous sommes surtout intéressés à la synthèse

de molécules potentiellement inhibitrices de cette enzyme.

Dans un premier chapitre, nous décrirons cette famille de peptides, sa biosynthèse et

les agents mis en jeu au cours de celle-ci, ainsi que le système endothélial global. Pour ce

faire, nous nous intéresserons aux précurseurs de ce peptide, aux différents récepteurs du

système ainsi qu’aux isoformes de l’enzyme de conversion de l’endothéline. Puis, nous

décrirons les différentes maladies dans lesquelles l’endothéline est impliquée avant de

présenter plus particulièrement les différents types d’inhibiteurs décrits dans la littérature. Un

acide aminophosphonique a été choisi comme molécule chef de file parmi l’ensemble des

composés de la littérature afin de construire notre travail de synthèse chimique et de relation

structure-activité.

Dans un second chapitre, nous motiverons notre choix avant de nous intéresser plus

particulièrement à la synthèse de ce produit et de différents analogues. Nous étudierons les

caractéristiques de la fonction amine portée par cette famille de composés par le biais d’une

étude physico-chimique, cette fonction ayant curieusement présenté une réactivité chimique

limitée. Nous terminerons cette partie par la description de la mise au point d’une réaction

tricomposante conduisant à l’obtention de β-aminophosphonates diversement substitués au

départ d’aldéhyde.

Enfin, dans un troisième chapitre, après avoir décrit les tests usuels pour l’évaluation

de l’efficacité des composés vis-à-vis de l’ECE, nous nous intéresserons aux données

13

pharmacologiques obtenues pour nos propres ligands en nous attachant plus particulièrement

aux conséquences structurales qui en découlent.

14

Chapitre I :

Système de l’endothéline et inhibition de l’enzyme de

conversion de l’endothéline (ECE)

15

Sommaire du chapitre I

1.1 : Présentation du système de l’endothéline : 17

1.1.1 : Découverte de l’endothéline : 18

1.1.2 : Biosynthèse des ETs : 21

1.1.2.1 : les gènes encodant les ETs : 21

1.1.2.2 : les précurseurs des big ETs : 23

1.1.2.3 : les big ETs : 24

1.1.2.4 : les ETs : 25

1.1.3 : Les récepteurs du système endothéline : 29

1.1.3.1 : le récepteur ETA : 29

1.1.3.2 : le récepteur ETB : 31

1.1.3.3 : Agonistes et antagonistes de ces récepteurs : 32

1.1.4 : L’enzyme de conversion de l’endothéline : 34

1.1.4.1 : L’ECE-1 : 39

1.1.4.2 : L’ECE-2 : 40

1.1.4.3 : L’ECE-3 : 41

1.2 : Rôle physiopathologique de l’endothéline endogène : 41

1.2.1 : L’hypertension : 42

1.2.2 : L’hypertension pulmonaire : 42

1.2.3 : L’insuffisance rénale aigüe : 43

1.2.4 : Les lésions du cerveau et les vasospasmes cérébraux : 44

1.2.5 : L’épaississement vasculaire : 44

1.2.6 : L’hypertrophie cardiaque : 45

1.2.7 : Insuffisance cardiaque chronique : 45

1.2.8 : Conclusion : 46

16

1.3 : Les inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’endothéline : 46

1.3.1 : Les chélatants du zinc : 48

1.3.2 : Les inhibiteurs peptidiques : 48

1.3.3 : Les produits naturels : 49

1.3.4 : Les molécules organiques portant une fonction chélatante : 51

1.3.4.1 : Fonction chélatante phosphorée : 51

1.3.4.1.1 : Les phosphoramidates : 51

1.3.4.1.2 : Les phosphonamides : 52

1.3.4.1.3 : Les acides phosphiniques : 53

1.3.4.1.4 : Les acides aminophosphoniques : 54

1.3.4.2 : Les thiols : 56

1.3.4.3 : Les acides hydroxamiques : 56

1.3.4.4 : Les acides carboxyliques : 58

1.3.5 : Les composés plus exotiques : 59

1.4 : Conclusion : 60

17

Durant le présent travail, nous nous sommes attachés à la synthèse de molécules

pouvant inhiber l’enzyme de conversion de l’endothéline (ECE) et à leur évaluation

pharmacologique dans le but de mener à bien une étude de relation structure-activité. Nous

allons commencer ce manuscrit en détaillant le système endothélial afin de comprendre

comment ces composés agissent sur cette enzyme et quelles peuvent être leurs applications

thérapeutiques.

1.1 : Présentation du système de l’endothéline :

Des peptides endogènes vasoactifs agissent à travers une grande variété de

mécanismes sur le contrôle du tonus vasculaire et du flux sanguin périphérique.1,2 Certains de

ces peptides, comme l’angiotensine II, la vasopressine, le neuropeptide Y et l’endothéline sont

de puissants vasoconstricteurs agissant sur les muscles lisses et sur le système nerveux

central.3 Une large gamme de vasodilatateurs peptidiques endogènes, comme l’ANP, la

bradykinine, les neurokinines ou encore la substance P, agissent de manière concertée avec les

peptides vasoconstricteurs pour maintenir l’équilibre homéostatique.

Les cellules endothéliales libérent des substances vasoactives régulant le tonus

vasculaire et les fonctions plaquettaires. L’endothélium, produisant des substances

vasoconstrictives en réponse à des stimuli variés aussi bien chimiques que physiques, a alors

été proposé comme participant à la vasoconstriction.4

La découverte de l’endothéline-1 (ET-1), un puissant vasoconstricteur peptidique

libéré par les cellules endothéliales, a redonné un grand attrait à ces facteurs.

1 Said S. I. Vasoactive peptides. Hypertension 1983, 5, 17-26.2 Moine M. C., Ralevic V., Burnstock G. Peptides and vasomotors mechanisms. Pharmacol. Ther. 1990, 46,429-468.3 Doherty A. M. Endogenous vasoactive peptides. Annu. Rep. Med. Chem. 1991, 26, 83-92.

18

1.1.1 : Découverte de l’endothéline :5

En 1985, Hickey et ses collaborateurs ont reporté l’existence d’un facteur

vasoconstricteur peptidique dans des milieux conditionnés de culture cellulaire endothéliale

bovine.6 La purification et l’identification de ce facteur ont donc été faites en 1987 : c’est un

peptide constitué de vingt et un acides aminés incluant quatre cystéines formant deux ponts

disulfures intramoléculaires. Ce peptide a été nommé endothéline (ET) (fig. 1).7

Figure 1 : Séquence peptidique de l’ET.

L’endothéline a été décrite comme un vasoconstricteur très puissant caractérisé par un

temps d’action très long. Elle a été initialement notée comme induisant une augmentation de

la pression sanguine ce qui suggérait qu’elle était impliquée dans les mécanismes de

régulation de la pression sanguine. Il a été montré ensuite qu’elle jouait un rôle physiologique

fondamental dans cette dernière chez l’homme.8

Par la suite, le gène de l’ET humain a été identifié et cela a permis de révéler

l’existence de deux autres gènes de la même famille qui sont exprimés dans différents tissus et

4 Whittle B. J., Lopez B. J., Rees D. D. Modulation of the vasodepressor actions of acetylcholine, bradykinin,substance P and endothelin in the rat by a specific inhibitor of nitric oxide formation. Br. J. Pharmacol. 1989,89, 646-654.5 Masaki T. The discovery of endothelins. Cardiovasc. Res. 1998, 39, 530-533.6 Hickey K. A., Rubanyi G., Paul R. J., Highemith R. F. Characterization of a coronary vasoconstrictor producedby cultures endothelial cells. Am. J. Physiol. 1985, 248, C550-C556.7 Yanagisawa M., Kurihara H., Kimura S. A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascularendothelial cells. Nature 1988, 332-415.8 Haynes W. H., Ferro O. J., O’kane K. P. J., Somerville D., Lowax C. C., Webbs J. D. Systemic endothelinreceptor blockade decreases peripheral vascular resistance and blood pressure in humans. Circulation 1996, 93,1860-1870.

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerLeuMet

AspLys Glu Val Tyr Phe His Leu Ile Ile Trp

13

COOH

NH2

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerLeuMet


13

COOH

NH2

19

cellules.9 Ce peptide a été renommé ET-1, ayant été découvert en premier, et les deux autres

respectivement ET-2 et ET-3 (fig. 2).

Figure 2 : Séquence peptidique des ETs.

L’analyse de la séquence du cADN de l’ET a révélé qu’il est produit par un

précurseur, noté préproendothéline. Après le déplacement du signal peptidique au début de la

biosynthèse conduisant au proET, ce nouveau précurseur est coupé par une endopeptidase

spécifique (de type furine) pour conduire à une forme intermédiaire inactive, nommée big-ET.

Celle-ci est à nouveau coupée par une enzyme, notée enzyme de conversion de l’endothéline

(ECE) pour donner l’ET (fig. 3).

9 Inoue A., Yanagisawa M, Kimura S. The human endothelin family : three structurally and pharmacologicallydistinct isopeptides predicted by three separate genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 1989, 86, 2863-2867.

13

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerLeuMet


13

COOH

NH2ET-1

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerTrp

Leu

AspLys Glu Val Tyr Phe His Leu Ile Ile Trp COOH

NH2 ET-2

Asp

CysThrCys

Cys Cys

PheThrTyrLys

AspLys Glu Val Tyr Lys His Leu Ile Ile Trp

13

COOH

NH2 ET-3

13

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerLeuMet


13

COOH

NH2ET-1

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerLeuMet


13

COOH

NH2

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerLeuMet


13

COOH

NH2ET-1

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerTrp

Leu


NH2 ET-2

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerTrp

Leu


NH2 ET-2

Asp

CysThrCys

Cys Cys

PheThrTyrLys


13

COOH

NH2 ET-3

Asp

CysThrCys

Cys Cys

PheThrTyrLys


13

COOH

NH2 ET-3

20

Figure 3 : Biosynthèse de l’ET-1.10

Des études ont montré que trois isoformes de l’ECE existent notées respectivement

ECE-1, ECE-2 et ECE-3.11,12,13

De même, deux récepteurs (ETA et ETB) ont également été découverts, comportant

68% d’homologie entre eux.14,15 Nous voyons donc que ce système est composé d’un grand

10 Gray G. A., Webb D. J. The endothelin system and its potential as a therapeutic target in cardiovasculardisease. Pharmacol. Ther. 1996, 72, 109-148.11 Shimada K., Takahashi M., Ikeda M., Tanzawa K. Identification and characterization of two isoformes of anendothelin-converting enzyme-1. FEBS Lett. 1995, 371, 140-144.12 Emoto N., Yanagisawa M. Endothelin-converting enzyme-2 is a membrane bound phosphoramidon-sensitivemetalloprotease with acidic pH optimum. J. Biol. Chem. 1995, 270, 15262-15268.13 Hasegawa H. Hiki K., Sawamura T. Purification of a novel endothelin-converting enzyme specific for bigendothelin-3. FEBS Lett. 1998, 428, 304-308.14 Arai H., Hori S., Aramori I., Ohkubo H., Nakanishi S. Cloning and expression of a cDNA encoding anendothelin receptor. Nature 1990, 348, 730-732

Arg-Arg

Arg-Arg

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerLeuMet


introns

exons I II III IV V5’ 3’

Gène ET-1

Promoteurs

Transcription mArn ET-1

3’5’

Traductionprepro ET-1

COOHNH217-18 52-53 90-91 2121

Lys-Arg

Sécrétion à partir du noyau pro ET-1

COOHNH2

Lys-Arg

17-18 52-53 90-91 212

Protéase de type furine

Big ET-1

ECE

ET-113

11 15 21COOH

NH2

Facteurs extérieurs

Arg-Arg

Arg-Arg

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerLeuMet


introns

exons I II III IV V5’ 3’

Gène ET-1

Promoteurs

Transcription mArn ET-1

3’5’

Traductionprepro ET-1

COOHNH217-18 52-53 90-91 2121

Lys-Arg

Sécrétion à partir du noyau pro ET-1

COOHNH2

Lys-Arg

17-18 52-53 90-91 212

Protéase de type furine

Big ET-1

ECE

ET-113

11 15 21COOH

NH2

Facteurs extérieurs

21

nombre d’éléments auxquels nous allons nous intéresser dans la suite de ce chapitre, en

commençant par ceux impliqués dans la biosynthèse des ETs.

1.1.2 : Biosynthèse des ETs :

Nous allons nous intéresser plus particulièrement à la première partie du schéma

représenté figure 3, c'est-à-dire à la génération des précurseurs des ET-1. Les explications qui

vont suivre porteront principalement sur l’ET-1 pour deux raisons. Tout d’abord, c’est ce

peptide qui est principalement exprimé dans les cellules endothéliales. De plus, dans le cadre

de cette thèse, nos travaux vont porter sur des inhibiteurs de l’ECE.

1.1.2.1 : les gènes encodant les ETs :10,16

Les premières descriptions de l’ET-1 et le clonage du cADN encodant pour le

précurseur préproET-1 ont rapidement conduit à l’identification d’au moins trois séquences de

gènes encodant pour des séquences de type Ets.9 En fait, ces séquences encodent pour les

préproET-2 et -3 en plus du préproET-1. Dans le génome humain, le gène de l’ET-117 se

trouve sur le chromosome 6, celui de l’ET-218 sur le 1 et celui de l’ET-3 sur le 20.19

Cependant, c’est le mARN de l’ET-1 qui semble le plus exprimé. En effet, il est obtenu dans

un grand nombre de tissus comme les cellules endothéliales de la veine ombilicale, dans le

15 Sakumi T., Yanagisawa M., Takuwa Y. Cloning of a cDNA encoding a non-isopeptide-selective subtype ofthe endothelin receptor. Nature 1990, 348, 782.16 Goto K., Hama H., Kasuya Y. Molecular pharmacology and pathophysiological significance of endothelin. Jp.J. Pharmacol. 1996, 72, 261-290.17 Bloch K. D., Freidrich S. P., Lee M. E., Eddy R. L., Shows T. B., Quetermous, T. Structural organisation andchromosomal assignment of gene encoding endothelin. J. Biol. Chem. 1989, 264, 10851-10857.18 Bloch K. D., Hong C. C., Eddy R. L., Shows T. B., Quetermous, cDNA cloning and chromosomal assignmentof the endothelin 2 gene : vasoactive intestinal contractor peptide is rat endothelin 2. Genomics 1991, 10, 236-242.19 Bloch K. D., Eddy R. L., Shows T. B., Quetermous, T cDNA cloning and chromosomal assignment of theendothelin 3. J. Biol. Chem. 1989, 264, 18156-18161.

22

pancréas, les poumons et la rate de fœtus humains, ces trois dernières localisations étant aussi

valables pour le mARN de l’ET-3 mais dans des proportions moindres. Par contre le mARN

de l’ET-2 est plus difficile à obtenir n’ayant été identifié que dans les intestins de souris.

Des facteurs extracellulaires peuvent également influencer la génération d’ET-1, aussi

bien positivement que négativement, par le biais de la libération de médiateurs intracellulaires

modulant l’étape de transcription.

Le gène ET-1 humain contient cinq exons, quatre introns et des régions terminales 5’

et 3’. Chacun des cinq exons encode une partie du preproET-1. Quelques éléments régulateurs

caractéristiques ont été trouvés dans le gène ET-1 comme les motifs de la séquence

consensuelle de liaison pour le facteur de transcription du facteur-1, quatre copies de

l’hexanucléotide CTGGGA, l’élément régulateur de la phase réactionnelle aigue, etc …20

Le facteur physiologique le plus important au niveau de la régulation de la production

et de la libération d’ET-1 à partir des cellules endothéliales semble être le flux sanguin. Une

augmentation de ce flux produit une vasodilation en mettant en jeu les recepteurs

d’évacuation du stress des cellules endothéliales, ce qui entraîne une diminution de la

concentration en mARN de l’ET-1. Une diminution de ce flux entraîne une augmentation de

l’expression de celui-ci (fig. 4).21

20 Inoue A., Yanagisawa M, Takuwa Y., Mitsui Y, Kobayashi M, Masaki T. The human préproendothéline-1gene : complete nucleotide sequence and regulation of expression. J. Biol. Chem. 1989, 264, 14954-14959.

23

Figure 4 : Mécanisme possible de régulation de la production d’ET-1 dans les cellulesendothéliales (R : récepteur de la famille des rhodopsines, G : protéine G, PLC :phospholipase C, PKC : protéine kinase C, TGF-β : Facteur de développement, TPA : 12-o-tétradécanoylphorbol-13-acétate, IP3 : inositol-1,4,5-triphosphate, DG : 1,2-diacylglycérol,AP-1 et NF-1 : facteurs de transcription).

1.1.2.2 : les précurseurs des big ETs :10,16

Les prépro ETs ont donc été obtenus à partir des mARN correspondants. En effet, à

partir des gènes encodant pour l’ET-1, l’ET-2 et l’ET-3, trois précurseurs notés

respectivement prépro ET-1, prépro ET-2 et prépro ET-3 sont obtenus. Ceux-ci sont en fait

21 Yoshizumi M., Kurihara H., Sugiyama T., Takaku F., Yanagisawa M., Masaki T., Yazaki Y. Hemodynamicshear stress stimulates endothelin production by cultured endothelial cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989,161, 859-864.

Evacuation du stressTGF-β

TPA

PIP2

PLC G

R

DG

PKC

?IP3 SR

Ca2+

NF-1 FOS/JUN

NF-1 AP-1 Gene ET-1

Perpro ET-1 mRNA AUUUA

Membrane

Noyau

ThrombineAngiotensine IIVasopressine

Mecanorécepteur

+ Transcription

Signal de dégradation post-transcriptionnelle ( - )

TGF-β

TPA

PIP2

PLC G

R

DG

PKC

?IP3 SR

Ca2+

NF-1 FOS/JUN

NF-1 AP-1 Gene ET-1

Perpro ET-1 mRNA AUUUA

Membrane

Noyau

ThrombineAngiotensine IIVasopressine

Mecanorécepteur

+ Transcription

Signal de dégradation post-transcriptionnelle ( - )

24

eux-mêmes des précurseurs des proETs permettant d’obtenir les précurseurs directs des ETs

notés big-ETs.

Ces précurseurs notés prépro ETs sont des peptides constitués de 160 à 238 acides

aminés (fig. 3). Lors de la sécrétion du préproET-1 (212 acides aminés) à partir du noyau des

cellules endothéliales vers le cytoplasme, la partie N-terminale (16 acides aminés) est clivée

pour conduire au proET-1, peptide de 196 acides aminés. Les préproET-2 et ET-3 subissent la

même étape de clivage pour conduire respectivement au proET-2 et -3.

Ce sont ces précurseurs qui subissent alors une maturation enzymatique pour conduire

aux big-ETs, peptides composés de 37 à 41 acides aminés. En effet, le proET-1 subit une

étape protéolytique mettant en jeu deux coupures entre Lys52-Arg53 et entre Arg90-Arg91 pour

conduire au peptide composé de 38 acides aminés noté big ET-1 par le biais d’une

endopeptidase spécifique des paires dibasiques.22 La furine semble être une enzyme

correspondant à ce type de clivage spécifique. Cette étape est similaire dans le cas de

l’obtention du big ET-2 et du big ET-3.

1.1.2.3 : les big ETs :

Tout d’abord, les big-ETs ont des structures similaires entre eux et proches des ETs

correspondantes (fig. 5). Malgré ces ressemblances structurales avec les ETs en particulier par

la position et le maintient des ponts disulfures entre les quatre cystéines, ces précurseurs ne

présentent aucune réelle activité biologique23,24, à l’exception du big ET-1 ayant des effets

comparables à ceux de l’ET-1 à des concentrations plus élevées.25

22 Denault J. B., Claing A., D’Orleans-Juste P., Sawamura T., Kido T., Masaki T., Leduc R. Processing ofproendothelin-1 by furin convertases. FEBS Lett. 1995, 362, 276-280.23 Yanagisawa M., Inoue A., Ishikawa T., Kasuwa Y., Kimura S., Kumagaye S. I., Nakajima K., Watanabe T.,Sakakibra S., Goto K., Masaki T., Primary structure, synthesis and biological activity of rat endothelin, anendothelium-derived vasoconstrictor peptide. Proc. Natl. Acad. Sci. 1988, 85, 6964-6968.

25

Figure 5 : Séquence peptidique des big ETs.

Parmi tous les précurseurs, c’est le big ET-1 qui est prépondérant dans le système

endothélial. D’un point de vue localisation, tous sont distribués dans une large gamme

d’organes, tels les tissus ombilicaux, le cœur, les vaisseaux, les poumons, les reins, etc…26

Ces trois précurseurs sont à nouveau coupés par une enzyme spécifique au système

endothélial, à savoir l’enzyme de conversion de l’endothéline (ECE). Celle-ci coupe dans le

cas des big ET-1 et -2 la liaison Trp21-Val22 et dans le cas du big ET-3 la liaison Trp21-Ile22

pour conduire aux peptides ET-1, ET-2 et ET-3 respectivement.

1.1.2.4 : les ETs :

24 Cade C., Lumma W. c., Mohan R., Rubanyi G. M., Parker-Bothelo L. H. Lack of biological activity ofpréproendothéline (110-130) in several endothelin assays. Life Sci. 1990, 47, 2097-2103.25 Hirata Y., Kanno K., Watanabe T., Kumagaye S., Nakajima K., Kimura T., Sakakibara S., Marumo F.Receptor binding and vasoconstrictor activity of big endothelin. Eur. J. Pharmacol. 1990, 176, 225-228.26 Kuc R. E. Immunocytochemical localization of endothelin peptides, precursors and endothelin-convertingenzyme. Methods in Molecular Biology 2001, 206, 3-19.

Leu

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerLeuMet


13

COOH

NH2big ET-1

AsnVal Thr Pro Glu His Val Val Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Pro Arg Ser

13

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerTrp


NH2 big ET-2

Asn Thr Pro Glu Gln Thr Ala Pro Tyr Gly Leu Gly Asn Pro ProVal

Asp

CysThrCys

Cys Cys

PheThrTyrLys


13

NH2

NH2 big ET-3

Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr ArgIle Gly Ser Phe Arg

Leu

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerLeuMet


13

COOH

NH2big ET-1

AsnVal Thr Pro Glu His Val Val Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Pro Arg SerAsp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerLeuMet


13

COOH

NH2big ET-1

AsnVal Thr Pro Glu His Val Val Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Pro Arg Ser

13

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerTrp


NH2 big ET-2


13

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerTrp


NH2 big ET-2


Asp

CysThrCys

Cys Cys

PheThrTyrLys


13

NH2

NH2 big ET-3

Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr ArgIle Gly Ser Phe ArgAsp

CysThrCys

Cys Cys

PheThrTyrLys


13

NH2

NH2 big ET-3

Asn Thr Pro Glu Gln Thr Val Pro Tyr Gly Leu Ser Asn Tyr ArgIle Gly Ser Phe Arg

26

Ces trois peptides présentent donc entre eux une très forte homologie de séquence. Ils

sont tous composés de 21 acides aminés dont quatre cystéines liées deux à deux par des ponts

disulfures dans les mêmes positions et une partie C-terminale hydrophobe identique sous la

forme d’un hexapeptide. L’ET-2 ne diffère de l’ET-1 que par deux résidus amino-acides et

l’ET-3 par six. De plus, ils présentent aussi une grande ressemblance, à la fois de structure et

d’activités, avec les safarotoxines (fig. 6), famille isopeptidique isolée à partir du venin du

serpent Atractaspis engaddensis.27 Ces deux familles de peptides utilisent des récepteurs

communs pour donner lieu à de multiples effets et les safarotoxines ont été un outil pour la

caractérisation des ETs.28

Figure 6 : Les safarotoxines.

Les ETs ont un rôle important dans beaucoup de domaines, comme par exemple dans

la régulation du tonus vasculaire, dans des maladies cardiaques, en tant que vasoconstricteurs,

etc… Cependant c’est l’ET-1 qui est l’isopeptide prépondérant aussi bien en terme de

production par les cellules endothéliales qu’en terme d’activités biologiques. Mais nous

étudierons ultérieurement le rôle pathophysiologique de ce peptide endogène. Nous pouvons

tout de même voir que l’ET-1 est en partie responsable des contractions des muscles lisses

vasculaires et de la prolifération des cellules de ces mêmes muscles (fig. 7 voie b). Cet effet

27 Kloog Y., Ambar I., Sokolvky M., Kochva E., Wollberg Z. Safarotoxin, a novel vasoconstrictor peptide :phosphoinositide hydrolysis in rat heart and brain. Science 1988, 242, 268-270.

Asp

CysSerCys

Cys Cys

LysAspMetThr

AspLys Glu Leu Asn Phe His Gln Val Ile Trp

13

COOH

NH2 SX6a

Asp

CysSerCys

Cys Cys

LysAspMetThr

AspLys Glu Leu Tyr Phe His Gln Val Ile Trp

13

COOH

NH2 SX6b

Asp

CysThrCys

Cys Cys

AsnAspMetThr


13

COOH

NH2 SX6c

Asp

CysThrCys

Cys Cys

LysAspMetThr

AspLys Glu Leu Thr Phe His Gln Ile Ile Trp

13

COOH

NH2 SX6d

Asp

CysSerCys

Cys Cys

LysAspMetThr


13

COOH

NH2 SX6a

Asp

CysSerCys

Cys Cys

LysAspMetThr


13

COOH

NH2 SX6a

Asp

CysSerCys

Cys Cys

LysAspMetThr


13

COOH

NH2 SX6b

Asp

CysSerCys

Cys Cys

LysAspMetThr


13

COOH

NH2 SX6b

Asp

CysThrCys

Cys Cys

AsnAspMetThr


13

COOH

NH2 SX6c

Asp

CysThrCys

Cys Cys

AsnAspMetThr


13

COOH

NH2 SX6c

Asp

CysThrCys

Cys Cys

LysAspMetThr


13

COOH

NH2 SX6d

Asp

CysThrCys

Cys Cys

LysAspMetThr


13

COOH

NH2 SX6d

27

peut être limité par l’apport d’AMP et de GMP cycliques dans les muscles lisses vasculaires

via respectivement la dégradation de l’acide arachidonique (AA) en prostacycline (PGI2) et la

libération de NO à partir de la L-arginine par action de la NO synthase dans l’endothélium.

De plus l’ET-1 peut lui-même initier le phénomène de relaxation par activation des récepteurs

ETB situés sur l’endothélium vasculaire (fig. 7 voies a et a’).

Un grand nombre d’étude se sont portées sur l’ET-1 afin de déterminer ses actions

biologiques. Il a été montré qu’il engendre par exemple des constrictions durables des

muscles lisses vasculaires29, des actions mitogéniques sur leurs cellules30, la libération de

facteurs de relaxation dérivés de l’endothélium31 et des vasoconstrictions de l’artère

coronaire.32 Il conduit aussi à des constrictions des muscles lisses intestinaux, de la trachée, de

l’utérus ou encore du coeur.33,34,35,36

28 Sokolovsky M. Endothelins and safarotoxins : receptor heterogeneity. Int. J. Biol. 1994, 26, 335-340.29 Fortes Z. B., de Nucci G. Garcia L. J. Effect of endothelin-1 on arterioles and venules in vivo. J. Cardiovasc.Pharmacol. 1989, 13 S 5, S200-S201.30 Hirata Y., Takagi Y., Fukuda Y., Marumo F. Endothelin is a potent mitogene for rat vascular smooth musclecells. Artherosclerosis. 1989, 78, 225-288.31 De Nucci G., Thomas G. R., D’Orleans-Juste P., Antunes E., Walder C., Warner T. D., Vane J. R. Pressoreffects of circulating endothelin are limited by its removal in the pulmonary circulation and by the release ofprostacycline and endothelium-derived relaxing factor. Proc. Natl. Acad. Sci. 1988, 85, 9797-9800.32 Fukuda K., Hori S., Kusuhara M., Satoh T., Kyotani S., Handa S., Nakamura Y., Oono H., Yamaguchi K.Effect of endothelin as a coronary vasoconstrictor in the Langendorff-perfused rat heart. Eur. J. Pharmacol.1989, 165, 301-304.33 Han S. P., Trapani A. J., Fok K. F., Westfall T. C., Knuepfer M. M.. Effects of endothelin on regionalhemodynamics in conscious rats. Eur. J. Pharmacol. 1989, 159, 303-305.34 Moravec C. S., Reynolds E. E., Stewart R. W., Bond M.. endothelin is a positive inotropic agent in human andrat heart in vitro. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989, 159, 14-18.35 Ishikawa T., Yanagisawa M., Kimura S., Goto K., Masaki T. Positive chronotropic effects of endothelin, anovel endothelium-derived vasoconstrictor peptide. Pflugers Arch. 1988, 413, 108-110.

28

Figure 7 : Action de l’ET-1 sur les muscles lisses vasculaires.10

Il permet également d’augmenter le taux de neurotransmetteurs libérés dans les tissus

nerveux.37 Au niveau des reins, il inhibe la formation de rénine38 et fait diminuer le flux

36 Winquist R. J., Scott A. L., Vlasuk G. P. Enhanced release of atrial natriuretic factor of endothelin in atriafrom hypertensive rats. Hypertension 1989, 14, 111-114.37 Reid J. J., Wong D. H., Rand M. J. The effect of endothelin on noradrenergic transmission in rat and guinea-pig atria. Eur. J. Pharmacol. 1989, 168, 93-96.38 Rakugi H., Nakamaru M., Saito H., Higaki J., Ogihara T. Endothelin inhibits rennin release from isolated ratglomureli. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1988, 155, 1244-1247.

ETB ETB

ETBETA

ET-1 ET-1

ET-1

ET-1

AA

PGI2

cyclooxygenase

cAMP

relaxation

endothélium

muscle lissevasculaire

CONTRACTIONprolifération

L-arginine

NONO synthase

cGMP

relaxation

big ET-1ECE

big ET-1

proET-1préproET-1ETB ETB

ETBETA

ET-1 ET-1

ET-1

ET-1

AA

PGI2

cyclooxygenase

cAMP

relaxation

endothélium

muscle lissevasculaire

CONTRACTIONprolifération

L-arginine

NONO synthase

cGMP

relaxation

big ET-1ECE

big ET-1

proET-1préproET-1

--

(a) (a’)

(b)

29

sanguin et l’excrétion urinaire de Na+ et K+.39 Enfin, au niveau des glandes surrénales, il

stimule la biosynthèse d’aldostérone40 et la libération de catécholamine.41

Nous avons relevé que pour certains de ces effets, des récepteurs spécifiques sont mis

en jeu, nous allons donc brièvement les étudier avant de nous intéresser à l’ECE et à ses

différentes isoformes.

1.1.3 : Les récepteurs du système endothéline :42

Deux sous-types de récepteurs, notés ETA et ETB, permettant l’activité biologique des

ETs, ont été identifiés et clonés43, ceux-ci appartenant tous les deux à la famille des récepteurs

couplés à la protéine G. Leur taille est de 45000 à 50000 daltons et leurs localisations sont

assez variées. Ils présentent une structure classique de récepteurs couplés à la protéine G, à

savoir sept hélices transmembranaires séparées par trois boucles extracellulaires et trois

boucles cytoplasmiques avec une région C-terminale cytoplasmique et une région N-terminale

extracellulaire relativement longue. Leur séquence peptidique présente environ 50%

d’homologie, les principales différences étant localisées dans le domaine N-terminal, dans la

partie C-terminale et dans les boucles extracellulaires.44

1.1.3.1 : le récepteur ETA :

39 Topouzis S., Pelton J. T., Miller R. C. effects of calcium entry blockers on contraction evoked by endothelin-1.[Ala3,11]endothelin-1 and [Ala1,15]endothelin-1 in rat isolated aorta Br. J. Pharmacol. 1989, 98, 669-677.40 Cozza E. N., Gomez S. C., Foecking M. F., CHiou S. Endothelin binding to cultured calf adrenal zonaglomerulosa cells and stimulation of aldosterone secretion. J. Clin. Invest. 1989, 84, 1032-1035.41 Boarder M. R., Marriott D. B. Characterization of endothelin-1 stimulation of catecholamine release fromadrenal chromaffin cells. J. Cardiovasc. Pharmacol.. 1989, 13 S5, S223-S224.42 Giannessi D., Del Ry S., Vitale R. L. The role of endothelins and their receptors in heart failure. Phamacol.Res. 2001, 43, 111-126.43 Hosada K., Nakao K., Arai H., Nagakawa O., Hosada K., Suga S., Nakanishi S., Imura H. Molecular cloningof a non-isopeptide-selective human endothelin receptor. Biochem. Biophys. Chem. Comm. 1991, 178, 248-255.44 Rubany G. M., Polokoff M. A. Endothelins : molecular biology, biochemistry, pharmacology, physiology andpathophysiology. Pharmacol. Rev. 1994, 46, 325-415.

30

Le gène encodant pour ce récepteur est localisé sur le chromosome 445 et le cADN

correspondant code pour un peptide constitué de 427 acides aminés.46 La structure de ce

récepteur est donc classique (fig. 8).

Figure 8 : Structure de l’ETA.

Le mARN de ce récepteur est fortement exprimé dans les cellules des muscles lisses et

dans les myocytes cardiaques alors qu’il ne l’est pas dans les cellules endothéliales.43 Il

permet l’action vasoconstrictive de l’ET-1. Ce récepteur est préférentiellement activité par

l’ET-1, plus faiblement par l’ET-2 et pas du tout par l’ET-3, il reconnaît en fait la partie N-

terminale des peptides ETs, ce qui explique en partie la non reconnaissance de l’ET-3 se

différenciant des deux autres par des changements sur cette zone.

45 Hosada K., Nakao K., Tamura N., Arai H., Ogawa Y., Suga S., Nakanishi S., Imura H. Organization, structure,chromosomal assignment and expression of the human endothelin-A receptor. J. Biol. Chem. 1992, 267, 18797-18804.

H2N D N P E R Y S T N L S NHV

DDF S L E T G R F T T FV L N T P Q H T T V LS P L

QQ P C N N H M S G N

TKITSAFK

Y I NT V I S

C T IF I V G

M V GN A T L

L R II

YQN

K C M R

NP

GN

V F KL P I N

V I DL I I V

L G DA S L A

L L

A L I

FPWRGA

D H N DF

G

FLC

V

K L FP F L Q

K S SV G I T

V L NL C A L

S VD

I II

RYRA

VA

SW

S R V QGI

TVLPIG

IIIF V M

E A I GA I P

S F I LW I L

I V S I

P F

A I E

V

YE

RG

E

HQ

KT M L N A T SC

FE

FM

K

YQDV K D

W W L FG F Y

F C M PL V C

T A I FY T

M

IVL

RNG

S

TC

EM

LNR

L S E HR I AL

KL

QR

R

VE

TKA

K K TS R I L

L H LC W F P

F A LL V V I

V Y

V F C

V VI

KD

ME

N

N RC

LLS

E

F L LL M D Y

I G IN L A T

M N SC I N P

I AV

LY F

VII

S

NK

KF

K

CFQSC

S C C C CS Q YKL

M P V S T M LT G NK W Q I SN

Q D H N

NHN T M NK D SD R S S H COOH

H2N D N P E R Y S T N L S NHV

DDF S L E T G R F T T FV L N T P Q H T T V LS P L

QQ P C N N H M S G N

TKITSAFK

Y I NT V I S

C T IF I V G

M V GN A T L

L R II

YQN

K C M R

NP

GN

V F KL P I N

V I DL I I V

L G DA S L A

L L

A L I

FPWRGA

D H N DF

G

FLC

V

K L FP F L Q

K S SV G I T

V L NL C A L

S VD

I II

RYRA

VA

SW

S R V QGI

TVLPIG

IIIF V M

E A I GA I P

S F I LW I L

I V S I

P F

A I E

V

YE

RG

E

HQ

KT M L N A T SC

FE

FM

K

YQDV K D

W W L FG F Y

F C M PL V C

T A I FY T

M

IVL

RNG

S

TC

EM

LNR

L S E HR I AL

KL

QR

R

VE

TKA

K K TS R I L

L H LC W F P

F A LL V V I

V Y

V F C

V VI

KD

ME

N

N RC

LLS

E

F L LL M D Y

I G IN L A T

M N SC I N P

I AV

LY F

VII

S

NK

KF

K

CFQSC

S C C C CS Q YKL

M P V S T M LT G NK W Q I SN

Q D H N

NHN T M NK D SD R S S H COOH

Site extracellulaire

Site intracellulaire

31

La présence de facteurs de développement épidermaux, de facteurs de développement

des fibroblastes, d’AMP cyclique ou d’oestrogènes favorise l’activité de ce récepteur alors

que celle de l’angiotensine ou de facteurs de développement dérivés des plaquettes provoque

l’effet contraire.

L’ETA est largement distribué dans les vaisseaux ombilicaux, la glande

parathyroïdique, le myométrium, les bronches, l’artère pulmonaire, la peau, le myocarde, le

système atrioventriculaire, l’artère coronarienne, l’utérus, le cerveau, l’aorte, les poumons et

l’estomac. Il est également présent mais de manière moins importante que l’ETB dans le foie,

le système surénalien et les reins.47

1.1.3.2 : le récepteur ETB :

Le gène encodant pour ce récepteur est localisé sur le chromosome 1348 et le cADN

correspondant code pour un peptide constitué de 442 acides aminés.49 La structure de ce

récepteur est très proche de celle de l’ETA puisqu’elle présente entre 55 et 64% d’homologie.

Le mARN de ce récepteur est le plus fortement exprimé dans les cellules endothéliales où il

permet la vasodilatation (fig. 7 voies a et a’).43 Il est aussi exprimé dans les muscles lisses

vasculaires où il accentue le phénomène de vasoconstriction obtenu par le biais de l’ETA (fig

7. voie b).

Ce récepteur n’est pas sélectif pour les ETs ni pour les safarotoxines. Il reconnaît en

fait la partie C-terminale, peu différente, de ces peptides. La présence de facteurs de

46 Adachi M., Yang Y. Y., Furuichi Y., Watanabe T. Cloning and characterization of cDNA encoding human A-type endothelin receptor. Biochem. Biophys. Chem. Comm. 1991, 180, 1265-1272.47 Cheng X. M., Nikam S. S., Doherty A. M. Development of agents to modulate the effects of endothelin.Current Med. Chem. 1994, 1, 271-312.48 Arai H., Nakao K., Takaya K., Hosada K., Ogawa Y., Nakanishi S., Imura H. The human endothelin Breceptor gene. Structural organization and chromosomal assignment. J. Biol. Chem. 1993, 268, 3463-3470.49 Elshourbagy N. A., Korman D. R., Wu H. L., Sylvester D. R., Lee J. A., Nuthalaganti P., Bergsma D. J.,Kumar C. S., Nambi P. Molecular characterization and regulation of the human endothelin receptors. J. Biol.Chem. 1993, 268, 3873-3879.

32

développement des fibroblastes, d’hormone natriurétique de type C ou d’angiotensine II

favorise son activité alors que celle d’AMP cyclique ou de catécholamine la limite.

L’ETB est largement distribué dans le placenta, le cortex rénal, la glande

parathyroïdique, les bronches, le cœur, le foie, la peau, le myocarde, le système

atrioventriculaire, l’artère coronarienne, l’hippocampe, le cerveau, le corps spinal, les reins et

dans le système surénalien. Il est également présent mais de manière moins importante que

l’ETA dans l’aorte, les poumons et l’estomac.47

1.1.3.3 : Agonistes et antagonistes de ces récepteurs :

Quelques travaux ont abouti à l’obtention d’agonistes sélectifs ou non de ces deux

récepteurs. Ceux-ci se sont, pour la plupart, inspirés des séquences peptidiques des ETs et des

safarotoxines (fig 9).

Figure 9 : Agonistes des récepteurs ETA et ETB.

Asp

AlaSerAla

Ala Ala

SerSerLeuMet


13

COOH

NH2ET-1[Ala 1,3,11,15]

Asp

CysThrCys

Cys Cys

AsnAspMetThr


13

COOH

NH2 SX6c

AspAla AlaGlu Val Tyr Phe His Leu Ile Ile Trp COOH

N-Acetyl-ET-1[10-21, Ala 11,15]

AcHN

AspAla AlaMet Asp Lys Glu Val Tyr Phe His Leu Ile Ile Trp COOHAcHN

BQ-3020

Leu

COOHAspAla AlaMet Asp Lys Glu Val Tyr Phe His Leu Ile Ile TrpH2N

ET-1[6-21, Ala 11,15]

Leu

Asp

AlaSerAla

Ala Ala

SerSerLeuMet


13

COOH

NH2ET-1[Ala 1,3,11,15]

Asp

AlaSerAla

Ala Ala

SerSerLeuMet


13

COOH

NH2ET-1[Ala 1,3,11,15]

Asp

CysThrCys

Cys Cys

AsnAspMetThr


13

COOH

NH2 SX6c

Asp

CysThrCys

Cys Cys

AsnAspMetThr


13

COOH

NH2 SX6c

AspAla AlaGlu Val Tyr Phe His Leu Ile Ile Trp COOH

N-Acetyl-ET-1[10-21, Ala 11,15]

AcHN AspAla AlaGlu Val Tyr Phe His Leu Ile Ile Trp COOH

N-Acetyl-ET-1[10-21, Ala 11,15]

AcHN

AspAla AlaMet Asp Lys Glu Val Tyr Phe His Leu Ile Ile Trp COOHAcHN

BQ-3020

Leu AspAla AlaMet Asp Lys Glu Val Tyr Phe His Leu Ile Ile Trp COOHAcHN

BQ-3020

Leu

COOHAspAla AlaMet Asp Lys Glu Val Tyr Phe His Leu Ile Ile TrpH2N

ET-1[6-21, Ala 11,15]

Leu COOHAspAla AlaMet Asp Lys Glu Val Tyr Phe His Leu Ile Ile TrpH2N

ET-1[6-21, Ala 11,15]

Leu

33

Malgré le fait qu’ils puissent avoir des actions biologiques variées comme par exemple

des activités vasorelaxantes ou encore vasoconstrictives, ces composés ont davantage été

utilisés comme outils pharmacologiques qu’à des fins thérapeutiques.50,51,52,53 De plus,

l’utilisation de versions radiomarquées de ces molécules, comme par exemple le [125I]BQ-

3020, ont permis de localiser précisément ces récepteurs.54

Beaucoup plus d’équipes ont cherché à obtenir des antagonistes sélectifs ou non de ces

récepteurs dans un but thérapeutique afin de bloquer par exemple les effets vasoconstricteurs

de l’ET-155, les spasmes cérébrovasculaires suivant des hémorragies sub-arachnoïde, et pour

réguler les maladies cardiaques ischémiques, l’hypertension pulmonaire ou encore les

problèmes rénaux56 ou encore les contractions de l’artère coronaire.56 Ces antagonistes

peuvent être des peptides, naturels ou non, ou des molécules non peptidiques (fig 10).

Ces différentes molécules ont aussi permis de mieux comprendre les différences entre

ces récepteurs.

50 Saeki T., Ihara M., Fukuroda T., Yamagiwa M., Yano M. [Ala1,3,11,15]Endothelin-1 analogs with ETB agonisticactivity. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1991, 179, 286-292.51 Saeki T., Ihara M., Fukuroda T., Yano M. Structure-activity relationsgip for ETB agonism in truncatedendothelin-1 analogs. Biochem. Int. 1992, 28, 305-312.52 Heyl D. L., Cody W. L., He J. X., Flynn M. A., Welch K. M., Reynolds E. E., Doherty A. M. Truncatedanalogs of endothelin and safarotoxin are selective for ETB receptor subtype. Pep. Res. 1993, 6, 238-241.53 Kitazumi K., Shiba T., Nishiki K.,Furukawa Y., Takasaki C., Tasaka K. Vasodilatator effects of safarotoxinsand endothelin-1 in spontaneously hypertensive rats and rat isolated perfused mesentery. Biochem. Pharmacol.1990, 40, 1843-1847.54 Kobayashi M., Ihara M., Sato N., Saeki T., Ozaki S., Ikemoto F., Yano M. A novel ligand [125I] BQ-3020,reveals the localization of endothelin ETB receptors. Eur. J. Pharmacol. 1993, 235, 95-100.55 Spinella M. J., Malik A. B., Everitt J., Andersen T. T. Design and Synthesis of a Specific Endothelin 1Antagonist: Effects on Pulmonary Vasoconstriction Proc. Natl. Acad. Sci. 1991; 88: 7443-7446.56 Wilson C., Hargreaves R. B. Inhibition of the pharmacological effects of endothelin. Progress in Med. Chem.1994, 31, 371-410.

34

Asp

SerCys

Cys

SerSerLeuMet

AspLys Glu Val Tyr Phe

His Leu Ile Ile Trp

3

COOHNH

O

ONHNH2

O

N NH

O

O

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O

O

N

N

N N

SO

O

OH O

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His Leu Ile Ile Trp

3

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3

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NH

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O

O

N

N

N N

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O

OH O

O O

O

O OH

OH

N

FFF

O

O

OH

Figure 10 : Antagonistes des récepteurs ETA et ETB.

1.1.4 : L’enzyme de conversion de l’endothéline :

Les peptides ETs sont obtenus à partir des précurseurs big ETs par clivage de la

liaison Trp21-Val22 (ET-1 et ET-2) ou Trp21-Ile22 (ET-3) par action d’une enzyme spécifique,

notée enzyme de conversion de l’endothéline. Plusieurs études ont été faites pour déterminer à

quelle famille enzymatique appartient l’ECE, plusieurs possibilités ont été proposées comme

les protéinases de type chymotrypsine7,57, de type sérine58, de type aspartique59,60,61, de type

thiol62 ou encore les métalloprotéases.

57 Takaoka M., Miyata Y., Takenobu Y., Ikegawa R., Matsumura Y., Morimoto S. Mode of cleavage of pig bigendothelin-1 by chymotrypsin. Production and degradation of mature endothelin-1. Biochem. J. 1990, 270, 541-544.58 Wypij D. M., Nichols J. S., Novak P. J., Stacy D. L., Berman J., Wiseman J. S. Role of mast cell chymase inthe extracellular processing of big endothelin-1 to endothelin-1 in the perfused rat lung. Biochem. Pharmacol.1992, 43, 845-853.59 Takaoka M., Takenobu Y., Miyata Y., Ikegawa R., Matsumura Y., Morimoto S. Pepsin, an aspartic protease,converts porcine big endothelin-1 to 21-residue endothelin. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1990., 166, 436-442.60 Takaoka M., Hukumori Y.., Shiragami K., Ikegawa R., Matsumura Y., Morimoto S. Proteolitic processing ofporcine big endothelin-1 catalyzed by cathepsin D. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1990., 173, 1218-1223.

35

La clé de l’identification de l’ECE comme étant une métalloprotéase réside dans

l’utilisation du [(N-α-rhamnopyranosyl-oxy-hydroxy-phosphinyl)-Leu-Trp], inhibiteur

puissant et spécifique de la thermolysine et de la E-24.11 (NEP), deux peptidases au zinc (fig

11).

Figure 11 : (N-α-rhamnopyranosyl-oxy-hydroxy-phosphinyl)-Leu-Trp (Phosphoramidon).

De nombreuses études ont montré que le phosphoramidon était capable d’inhiber la

conversion du big ET-1 en ET-1 dans des cultures cellulaires à des concentrations

micromolaires et ainsi la production d’ET-1 dans les cellules endothéliales.63,64, Ces résultats

ont conduit à la possibilité que l’ECE soit structurellement et catalytiquement similaire à la

NEP avec une affinité plus faible pour le phosphoramidon.

L’activité optimale de l’enzyme de conversion de l’endothéline est obtenue à pH

neutre. Elle est membranaire et inhibée par les chélatants métalliques (EDTA et EGTA) et

insensible aux inhibiteurs des autres classes de protéases.65 D’autres travaux ont permis de

montrer que l’on retrouvait cette activité dans des fractions cytosoliques et membranaires64

61 Bird J. E., Waldron T. L., Little D. K., Asaad M. M., Dorso C. R., DiDonato G., Norman J. A. The effects ofnovel cathepsin E inhibitors on the big endothelin pressor response in conscious rats. Biochem. Biophys. Res.Comm. 1992., 182, 224-231.62 Deng Y., Savage P., Shetty S. S., Martin L. L., Jeng A. Y. Identification and partial purification of a thiolendothelin-converting enzyme from porcine aortic endothelial cells. J. Biochem. 1992, 111, 346-351.63 Ikegawa R., Matsumura Y., Tsukahara Y., Takaoka M., Morimoto S. Phosphoramidon, a metalloproteinaseinhibitor, suppresses the secretion of endothelin-1 from culture endothelila cells by inhibiting a big endothelin-1converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1990, 171, 669-675.64 Takada J., Okada K., Ikenaga T., Matsuyama K., Yano M. Phosphoramidon-sensitive endothelin convertingenzyme in the cytosol of cultured bovine endothelial cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1991, 176, 860-865.65 Ohnaka, K. ; Takayanagi, R. ; Yamauchi, T. ; Okazaki, H. ; Ohashi, M. ; Umeda, F. ; Nawata, H. Identificationand characterization of endothelin converting activity in cultures bovine endothelial cells. Biochem. Biophys.Res. Commun 1990, 168, 1128-1136

O

O PO

OHNH

NH

O

O

OH

NH

OHOH

OH O

O PO

OHNH

NH

O

O

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NH

OHOH

OH O

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NH

O

O

OH

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OH O

O PO

OHNH

NH

O

O

OH

NH

OHOH

OH

36

ainsi que dans des cellules de muscles lisses66 et dans les leucocytes polymorphonucléaires

humains.67

L’ECE a été purifiée à partir de préparations microsomiales de poumon de rat68,

d’endothélium aortique de porc69, de cortex surénalien bovin70 et de lignées cellulaires

endothéliales humaines transformées.71 Ces purifications ont rapidement conduit au clonage

moléculaire et au séquençage de cette enzyme. La topologie prévue de cette protéine est la

suivante (fig. 12).72

66 Hioki, Y. ; Okada, K. ; Ito, H. ; Matsuyama, K. ; Yano, M. Endothelin converting enzyme of bovine carotidartery smooth muscle cells. Biochem. Biophys. Res. Commun 1991, 174, 446-451.67 Sessa, W. C. ; Kaw, S. ; Hecker, M. ; Vane, J. R. The biosynthesis of endothelin-1 by humanpolymorphonuclear leukocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun 1991, 174, 613-618.68 Takahashi, M. ; Matsushita, Y. ; Iijima, Y. ; Tanzawa, K. Purification and characterization of endothelin-converting enzyme from rat lung. J. Biol. Chem. 1993, 268, 21394-21398.69 Ohnaka, K. ; Takayanagi, R. ; Nishikawa, M. ; Haji, M. ; Nawata, H. Purification and characterization of aphosphoramidon-sensitive endothelin-converting enzyme in porcine aortic endothelium. J. Biol. Chem. 1993,268, 26759-26766.70 Xu D., Emoto N., Giaid A., Slaughter C., Kaw S., deWit D., Yanagisawa M. ECE-1 : a membrane-boundmetalloprotease that catalyzes the proteolytic activation of big endothelin-1. Cell 1994, 78, 473-458.71 Edgell C. J. S., McDonald C. C., Graham J. B. Permanent cell line expressing human factor VIII-relatedantigen established by hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. 1983, 80, 3734-3737.72 Takahashi M., Fukada K., Shimada K., Branes K., Turner A. J., Ikeda M., Koike H., Yamamoto Y., TanzawaK. Localization of rat endothelin-converting enzyme to vascular endothelila celles and some secretory cells.Biochem J. 1995, 311, 657-665.

37

C C

Zn Zn

S S

N N

Domaine catalytiqueHydrophile 681 résidus

Segmenttransmembranaire21 résidusDomainecytoplasmique51 à 56 résidus

C C

Zn Zn

S S

N N

Domaine catalytiqueHydrophile 681 résidus

Segmenttransmembranaire21 résidusDomainecytoplasmique51 à 56 résidus

Figure 12 : Topologie de l’ECE.

Sur cette figure, nous pouvons voir que l’ECE est représentée sous la forme d’un

dimère réalisé par des ponts disulfures, mais le nombre et la localisation de ces liaisons n’ont

pas été déterminés. La présence de dix sites de glycosylation potentiels sur chaque monomère

dans le domaine extracellulaire est aussi remarquable. L’ECE est une protéine membranaire

intégrale de type II avec une partie cytoplasmique N terminale petite, un domaine

transmembranaire hydrophobe et un large domaine extracellulaire contenant le site catalytique

ainsi que le motif HEXXH typique des peptidases au zinc.73

73 Jongeneel C. V., Bouvier J., Bairoch A. A unique signature identifies a family of zinc-dependantmetallopeptidase. FEBS. Lett. 1989, 242, 211-214.

38

L’ECE est une protéine fortement glycosylée avec dix sites de glycosylation N-liés.

Elle présente de grandes homologies avec la NEP surtout dans la partie C terminale.74 Elle

contient de plus un cluster formé de quatre résidus cystéine au sein d’une chaîne peptidique de

32 acides aminés juste après le domaine transmembranaire. Il existe différentes sous-unités

d’ECE différant seulement par leurs domaines cytoplasmiques. Par contre toutes les formes de

l’ECE présentent une homologie supérieure à 95% au niveau du domaine extracellulaire.

L’expression de la protéine est forte dans les poumons, le pancreas, le placenta, les

glandes surrénales, les ovaires et les testicules.70,75 L’ARN messager de l’ECE dans les

cellules endothéliales vasculaires est présent dans un grand nombre de tissus, tels le cœur, les

poumons, le foie, le cerveau, le pancréas, les reins et les glandes surrénales.70 On note que

l’ECE est relativement bien distribuée, ce qui découle de la large distribution du prépro-ET-1.

Cela contraste avec la NEP dont la distribution est plus faible, à savoir assez forte dans les

reins, les intestins et quelques cellules du système immunitaire, mais peu représentée dans les

autres tissus.76 L’ECE, la NEP et l’ACE sont présentes dans les cellules reproductrices mâles

et femelles mais on ignore leurs fonctions physiologiques dans ces cellules.

Les études sur l’ECE à partir de cellules et de tissus variés révèlent quelques

caractéristiques distinctes de sa spécificité. Dans tous les cas, la conversion de la big ET se

limite à la formation d’endothéline et aucune autre dégradation n’est visible. Aucun autre

peptide biologiquement actif ni aucun autre précurseur n’ont été décrit comme substrat de

l’ECE. L’activité de l’ECE partiellement purifiée à partir de cellules humaines est décrite

74 Lee S., Zambas E. D., Marsh W. L., Redman C. M. Molecular cloning and primary structure of kell bloodgroup protein. Proc. Natl. Acad. Sci. 1991, 88, 6353-6357.75 Schmidt, M. ; Kröger, B. ; Jacob, E. ; Seulberger, H. ; Subkowski, T. ; Otter, R. ; Meyer, T. ; Schmalzing, G. ;Hillen, H. Molecular characterization of human and bovine endothelin-converting enzyme (ECE-1). FEBS Lett.1994, 356, 238-243.76 Howell, S. ; Murray, H. ; Scott, C. S. ; Turner, A. J. ; Kenny, A. A highly sensitive e.l.i.s.a. for endopeptidase24.11, the common acute-lymphoblastic-leukaemia antigen (CALLA, CD-10) applicates to material of procineand human origin. J. Biochem. J. 1991, 278, 417-421.

39

comme dégradant plus efficacement le big ET-1 humaine que le big ET-2, il n’y a pas

d’activité notable pour le big ET-3.77

Le phosphoramidon inhibe la conversion de big ET-1 administrée de manière exogène

en ET-1.78 Depuis que l’ECE a été trouvée dans les cellules des muscles lisses, l’hypothèse

d’une conversion immédiate après la sécrétion de big ET-1 par les cellules endothéliales ou à

la surface des muscles lisses dans le voisinage des récepteurs de l’endothéline a été étudiée.

Ce dernier concept est confirmé par le fait que la suppression de l’endothélium n’affecte pas

l’effet vasoconstricteur du big ET-1 dans les artères mesentériques du rat, ni l’inhibition par le

phosphoramidon.79 Cependant, le big ET-1 peut être obtenu par une autre voie à partir de son

précurseur exogène et d’autres données conduisent à conclure que la conversion du big ET-1

en ET-1 se fait de manière intracellulaire. La biologie cellulaire de formation de l’endothéline

est donc controversée.

Le séquençage du cADN a conduit à l’obtention de deux enzymes de conversion

notées respectivement ECE-1 et ECE-2, présentant 59% d’homologie et clivant

préférentiellement le big ET-1.12,75 Une troisième forme, nommée ECE-3 a été ensuite

purifiée à partir des microsomes d’iris bovins clivant préférentiellement le big ET-3. Mais

c’est l’ECE-1 qui est prédominante chez l’homme.13

1.1.4.1 : L’ECE-1 :

77 Waxman, L. ; Doshi, K. P. ; Gaul, S. L. ; Wang, S. ; Bednar, R. A. ; Stern, A. M. Identification andcharacterization of endothelin converting activity from EAHY 926 cells : evidence dor the physiologicallyrelevant human enzyme. Arch. Biochem. Biophys. 1994, 308, 240-253.78 Corder, R. ; Vane, J. R. Radioimmunoassay evidence that the pressor effect of big endothelin-1 is due to localconversion to endothelin-1. Biochem. Pharmacol. 1995, 49, 375-380.79 Hisaki, K. ; Matsumura, Y. ; Nishiguchi, S. ; Fujita, K. ; Takaoka, M. ; Morimoto, S. Endotheliumindependent pressor effect of big endothelin-1 and its inhibition by phosphoramidon in rat mesenteric artery.Eur. J. Pharmacol. 1993, 241, 75-81.

40

Quatre isoformes ont été décrits pour cette forme de l’ECE notés ECE-1a/β11,80, ECE-

1b11,80, ECE-1c/α81 et ECE-1d.82 . Ces quatre isoformes présentent une grande homologie

mais se différencient principalement par les résidus amino-acides de la partie N-terminale de

leur séquence. L’ECE-1a,-1b, -1c et -1d sont respectivement constituées de 758, 770, 754 et

767 acides aminés.80,81 Tous sont obtenus à partir du même gène localisé sur le chromosome 1

mais quatre promoteurs différents sont mis en jeu.80,83,84

C’est l’ARN messager de l’ECE-1c qui est le plus exprimé au sein par exemple des

cellules endothéliales des muscles lisses, des cellules de la veine ombilicale ou encore des

bronches. Celui de l’ECE-1a est lui aussi relativement bien distribué dans les cellules

endothéliale de la veine ombilicale. Par contre l’ARN messager de l’ECE-1b et de l’ECE-1d

sont très faiblement exprimés, ne représentant à eux deux que moins de 10% de l’expression

totale de ces mARN. D’un point de vue activité, aucune différence notable n’a été obtenue

pour la dégradation du big ET-1 en ET-1 par ces quatre isoformes mais un optimum d’activité

est obtenu à pH neutre.

Enfin, leur localisation varie. En effet, l’ECE-1a est distribuée abondamment dans les

membranes plasmiques et dans des compartiments intracellulaires, alors que l’ECE-1b ne l’est

que dans ces derniers. De même, l’ECE-1c se trouve de manière relativement abondante dans

les membranes plasmiques ainsi qu’en surface des cellules endothéliales. L’ECE-1d, peu

80 Valdenaire O., Rohrbacher E., Mattei M. G. Organization of the Gene Encoding the Human Endothelin-converting Enzyme (ECE-1). J. Biol. Chem. 1995, 270, 29794-29798.81 Schweizer A., Valdenaire O., Nelböck P., Deuschle U., Dumas Milne Edwards J. B., Stumpf J. G., Loffler B.M. Human endothelin-converting enzyme (ECE-1): three isoforms with distinct subcellular localizationsBiochem. J. 1997, 328, 871-877.82 Valdenaire O., Lepailleur-Enouf D., Egidy G., Thouard A., Barret A., Vranckx R., Tougard C., Michel J. B. Afourth isoform of endothelin-converting enzyme (ECE-1) is generated from an additional promoter. Molecularcloning end characterization. Eur. J. Biochem. 1999, 264, 341-349.83 Matsuoka R., Sawamura T., Yamada K., Yoshida M., Furutani Y., Ikura T., Shiraki T., Hoshikawa H.,Shimada K., Tanzawa K., Masaki T. Human endothelin converting enzyme gene (ECE1) mapped tochromosomal region 1p36.1. Cytogenet Cell Genet. 1996, 72, 322-324.

41

distribuée, se trouve en surface des cellules endothéliales, dans les cellules de l’appareil de

Golgi et dans les structures endosomiales.72,81,85

L’ECE-1 n’ayant pas été cristallisée, la modélisation de cette enzyme n’a pas été

possible. Par contre, de par son homologie avec l’enzyme de conversion de l’angiotensine et

avec la NEP, des modèles ont été proposés par différentes équipes pour cette enzyme.86

1.1.4.2 : L’ECE-2 :

Cette isoforme de l’ECE présente des caractéristiques similaires à celles

précédemment décrites pour l’ECE-1, elle coupe préférentiellement le big ET-1. Cependant,

au lieu de présenter un optimum d’activité à pH neutre, un pH plus acide (pH=5,5) est

nécessaire. Sur le plan Structural, l’ECE-1 et l’ECE-2 présentent 60% d’homologie, l’ECE-2

conservant 9 sites de glycosylation et les quatre résidus cystéines. Cependant, l’ECE-2 n’agit

que de manière intracellulaire et est beaucoup moins exprimée que l’ECE-1. Plusieurs

isoformes ont aussi été découvertes pour l’ECE-2, notés ECE-2a et ECE-2b, provenant

comme pour l’ECE-1 d’un gène unique porté par le chromosome 3. Les cADN de l’ECE-2a et

de l’ECE-2b comportent respectivement 787 et 765 acides aminés.87 Ceux-ci sont localisés

uniquement dans les neurones et dans les zones enrichies en neuropeptides du système

nerveux central.88

84 Albertin G., Rossi G. P., Majone F., Tiso N., Mattara A., Danieli G. A., Pessina A. C., Palù G. Fine Mappingof the Human Endothelin-Converting Enzyme Gene by Fluorescent in Situ Hybridization and Radiation Hybrids.Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996, 221, 682-687.85 Azarani A., Boileau G., Crine P. Recombinant human endothelin-converting enzyme ECE-1b is located in anintracellular compartment when expressed in polarized Madin–Darby canine kidney cells. Biochem. J. ,1998,333, 439-448.86 Bur D., Dale G. E., Oefner C. A three dimensional model of endothelin-converting enzyme (ECE) base donthe X-ray structure of neutral endopeptidase 24.11 (NEP). Protein Engineering. 2001, 14, 337-341.87 Lorenzo M. N., Khan R. Y., Wang Y., Tai S. C., Chan G. C., Cheung A. H., Marsden P. A. Human endothelinconverting enzyme-2 (ECE2) : characterization of mRNA species and chromosomal localization. Biochim.Biophys. Acta 2001, 1522, 46-52.88 Mzhavia N., Pan H., Che F. Y., Frickers L. D., Devi L. A. Characterization of endothelin-converting enzyme-2. Implication for a role in the nonclassical processing of regulatory peptides. J. Biol. Chem. 2003, 278, 14704-14711.

42

1.1.4.3 : L’ECE-3 :13

Cette isoforme clive préférentiellement le big ET-3 en ET-3 et pas le big ET-1

contrairement aux deux précédents. Elle est beaucoup moins distribuée, n’étant présente que

dans les globes oculaires et dans quelques régions du cerveau. Un optimum d’activité a été

décrit pour un pH de 6,6. Peu d’études ont été faites sur cette isoforme, mais celles-ci ont

permis de montrer que la chaîne peptidique la caractérisant est plus longue que celle des deux

autres.

Maintenant que la biosynthèse des ETs a été décrite, intéressons nous aux diverses

activités physiologiques qu’ils engendrent. Pour toute la suite de ce chapitre, nous

commettrons un abus de langage en remplaçant l’ET-1 par l’ET.

1.2 : Rôle physiopathologique de l’endothéline endogène :

Malgré un grand nombre d’études sur les fonctions de l’endothéline, son rôle

physiologique au niveau du système cardiovasculaire reste peu clair.

Elle agit sur les muscles lisses pour augmenter la résistance vasculaire périphérique.

Elle induit, dans des muscles cardiaques isolés, des contractions et exerce ainsi une action

inotrope positive puissante. De plus, elle induit aussi des actions chronotropes positives via

les récepteurs ETB et négatives via les récepteurs ETA. Son administration par voie

intraveineuse conduit à une chute transitoire de la pression sanguine suivie d’une réponse

pressorielle, ce qui s’explique pour la dépression par la libération de facteurs relaxants à partir

de l’endothélium et pour la réponse pressorielle par l’action directe de l’endothéline sur les

muscles lisses.

43

1.2.1 : L’hypertension :

L’endothéline cause de puissantes vasoconstrictions et une augmentation prolongée de

la pression sanguine. Ainsi, l’endothéline endogène est considérée comme un médiateur du

tonus vasculaire et de la circulation sanguine dans certaines régions du corps à la manière

d’une hormone circulante.

Cette implication dans l’hypertension peut être liée à une surproduction ou à une

mauvaise dégradation de ce peptide, à une sensibilité accrue des cellules des muscles lisses

vasculaires pour l’endothéline89, à une augmentation des sécrétions de médiateurs

neurohumoraux (norepinephrine, vasopressine, angiotensine II, etc…) régulant la pression

sanguine ou encore à une diminution de la production des médiateurs vasodilatateurs (NO,

prostacycline, ANP, etc…)90. Aucune relation n’a pu cependant être mise en évidence entre le

taux d’endothéline dans le plasma et la gravité de l’hypertension.91 L’utilisation

d’antagonistes des récepteurs de l’endothéline est controversée mais elle a permis d’observer

des hypotensions significatives et durables.

1.2.2 : L’hypertension pulmonaire :

Cette maladie correspond à une détérioration progressive des poumons caractérisée par

une augmentation du tonus vasculaire pulmonaire, par une vasoréactivité, une prolifération

accrue des cellules des muscles lisses vasculaires pulmonaires conduisant à une forte

augmentation de la résistance vasculaire pulmonaire et à une hypertrophie progressive du

89 Vanhoutte P. M. Is endothelin involved in the pathogenesis of hypertension? Hypertension 1993, 21, 747-758.90 Richard V., Hogie M., Cloezl M., Loffler B. M., Thuillez C. In vivo evidence of an endothelin-inducedvasopressor tone after nitric oxyde synthesis in rats. Circulation 1995, 91, 771-775.91 Battistini B. D’Ortleans-Juste P., Sirois P. Biology of diseases, endothelin : circulating plasma levels andpresence in other biological fluids. Lab. Invest. 1993, 6, 600-628.

44

ventricule droit.92 Elle est associée à une augmentation du taux d’endothéline dans le plasma

en forte corrélation avec la gravité de la maladie.93 Elle engendre une augmentation de

l’expression de l’ARN messager de l’endothéline dans les cellules endothéliales vasculaires

pulmonaires.

1.2.3 : L’insuffisance rénale aigüe :

L’insuffisance rénale aigüe se caractérise par une diminution du flux sanguin rénal

associée ou non à des disfonctionnements des reins.94 L’endothéline, étant un puissant

vasoconstricteur rénal, réduit à la fois le flux sanguin rénal et la vitesse de filtration

glomérulaire.95 Les patients, souffrant de cette maladie, présentent un taux élevé

d’endothéline dans le plasma et dans les tissus rénaux. L’usage d’antagonistes des récepteurs

de l’endothéline a permis d’atténuer la détérioration des fonctions rénales, les

dégénérescences des tubulures et l’accumulation de calcium dans les mitochondries sur des

rats souffrant d’occlusion rénale.96,97,98

92 Heath D., Smith P., Gosney J., Mulcahy D., Fox K., Yacoub M., Harris P. The pathology of the early and latestages of primary-pulmonary hypertension. Br. Heart J. 1987, 58, 204-213.93 Yoshibayashi M., Nishioka K., Nakao K., Saito Y., Matsumura M., Ueda T., Temma S., Shirakami G., ImuraH., Mikawa H. Plasma endothelin concentrations in patients with pulmonary hypertension associated withcongenital heart defects-evidence for increase production of endothelin in pulmonary circulation. Circulation1991, 84, 2280-2285.94 Brezis M., Epstein F. H. Cellular mechanisms of acute ischemic injury in the kidney. Annu. Rev. Med. 1993,44, 27-37.95 Nord E. P. Renal actions of endothelin. Kidney Int. 1993, 44, 451-463.96 Gellai M., Jugus M., Fletcher T., DeWolf R., Nambi P. Reversal of postischemic acute renal failure with aselective endothelin A receptor antagonist in the rat. J. Clin. Invest. 1994, 93, 900-906.97 Kon V., Badr K. F. Endothelin and cyclosporine nephrotoxicity. Ren. Fail. 1992, 14, 345-350.

45

1.2.4 : Les lésions du cerveau et les vasospasmes cérébraux :

Un aspect pathophysiologique plus rare de l’endothéline réside dans son action au

niveau du processus de cicatrisation des lésions du système nerveux central. L’endothéline

libérée dans les tissus lésés exerce une activité mitogène sur les astrocytes favorisant ainsi la

cicatrisation.16

Les vasospasmes cérébraux après une hémorragie subarachnoïde se caractérisent par

des contractions persistantes des muscles lisses artériels engendrant des changements

organiques au niveau des parois des vaisseaux.99 Le taux d’endothéline des sujets atteints par

ces vasospasmes est élevé aussi bien dans le plasma que dans les fluides cérébrospinaux.

L’utilisation d’antagoniste des récepteurs de l’endothéline a permis de limiter ces

vasospasmes.100

1.2.5 : L’épaississement vasculaire :

L’endothéline cause la prolifération des cellules des muscles lisses vasculaires, des

cellules endothéliales capillaires et des fibroblastes.101,102,103. Outre ces actions mitogéniques,

une action synergique existe entre l’endothéline et une large variété de facteurs de

développement, incluant par exemple l’insuline ou l’angiotensine II. Celle-ci permet

98 Brooks D. P., Ohlstein E. H., Contino L. C., Storer B., Pullen M., Caltabiano M., Nambi P. Effects ofnifedipine on cyclosporine A-induced nephrotoxycity, urinary endothelin excretion and renal endothelin receptornumber. Eur. J. Pharmacol. 1991, 194, 115-117.99 Findlay J. M., Weir B. K. A., Kanamaru K., Epinosal F. Endothelin and the production of cerebral vasospasmin dogs. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989, 25, 736-746.100 Itoh S., Sakaki T., Asai A., Kuchino Y. Prevention of delayed vasospasm by an endothelin ETA receptorantagonist, BQ-123 : change of the ETA receptor mRNA expression in a canine subarachnoid hemorrhage model.J. Neurosurg. 1994, 81, 759-764.101 Janakidevi K., Fisher M. A., Del Vecchio P. J., Tiruppathi C., Figge J., Malik A. B. Endothelin 1 stimulatesDNA synthesis and proliferation of pulmonary artery smooth muscle. Am. J. Physiol. 1992, 263, C1295-C1301.102 Shichirei M., Hirata Y., Nakajima T., Ando K., Imai T., Yanagisawa M., Maski T., Marumo F. Endothelin-1is an autocrine-paracrine growth factor for human cancer cell lines. J. Clin. Invest. 1991, 87, 1867-1871.

46

d’augmenter la synthèse et la sécrétion de glycoprotéines, de la trombospondine et de la

ténascine, ce qui conduit à la modification des constituants extracellulaires dans les tissus

cardiovasculaires.104

1.2.6 : L’hypertrophie cardiaque :

L’hypertrophie semble être une réponse fondamentale du cœur lui permettant de

s’adapter à une surcharge de travail imposé. Elle résulte en l’augmentation du dépôt de

protéines matricielles extracellulaires et en un important remodelage des interstices

cardiaques résultant alors en la diminution de la conformité myocardiale.

L’utilisation d’antagonistes des récepteurs de l’endothéline a permis de prévenir

l’hypertrophie cardiaque chez le rat, suggérant que l’endothéline peut jouer un rôle crucial

contre le développement d’hypertrophie myocardiale.105,106

1.2.7 : Insuffisance cardiaque chronique :

Des antagonistes des récepteurs de l’endothéline ont été utilisés sur des patients

présentant des arrêts cardiaques chroniques, maladie souvent accompagnée d’une forte

concentration d’endothéline dans le plasma.107

103 Takuwa N., Takuwa Y., Yanagisawa M., Yamashita K., Masaki T. A novel vasoactives peptide endothelinstimulates mitogenesis through inositol lipid turnover in Swiss 3T3 fibroblasts. J. Biol. Chem. 1989, 264, 7856-7861.104 Hahn A. W., Resink T. J., Kern F., Buhler F. R. Peptide vasoconstrictors, vessel structure, and vascularsmooth muscle cell proliferation. J. Cardiovasc. Pharmacol. 1993, 22 S5, S37-S43.105 Yorikane R., Sakai S., Miyauchi T., Sakurai T., Sugishita Y., Goto K. Increased production of endothelin-1 inthe hypertrophied rat heart due to pressure overload. FEBS Lett. 1993, 332, 31-34.106 Miyauchi T., Yorikane R., Sakai S., Sakurai T., Okada M., Nishikibe M., Yanao M., Yamaguchi I., SugishitaY., Goto K. Contribution of endogenous endothelin-1 to the progression of cardiopulmonary alterations in ratswith monocrotaline-induced pulmonary hypertension. Circ. Res. 1993, 73, 887-897.107 Kiowski W., Sutsch G., Hunziker P., Muller P., Kim J., Oechslin E., Schmitt R., Jones R., Bertel O. Evidencefor endothelin-1-mediated vasoconstriction in severe chronic heart failure. Lancet 1995, 346, 732-736.

47

L’augmentation du taux d’endothéline semble provoquer des lésions au niveau du

myocarde conduisant à une aggravation progressive des défaillances de celui-ci pouvant aller

jusqu’à des arrêts cardiaques chroniques.108,109

1.2.8 : Conclusion :

En plus de ses actions cardiovasculaires puissantes, l’endothéline cause aussi la

contraction des muscles lisses non vasculaires comme ceux des intestins, de la trachée, des

bronches, de l’utérus ou encore de la prostate. Elle peut aussi stimuler la libération de

neuropeptides, d’hormones pituitaires et d’ANP ainsi que la biosynthèse d’aldostérone ou la

modulation de la libération de neurotransmetteurs. Elle a aussi des actions mitogènes

provoquant la prolifération et l’hypertrophie des muscles lisses vasculaires, des myocytes

cardiaques, des muscles lisses des bronches et des fibroblastes. Elle induit de plus

l’expression de plusieurs proto-oncogènes.

Toutes ces actions peuvent jouer un rôle dans l’arrêt cardiaque chronique,

l’insuffisance rénale, l’hypertension, les vasospasmes cérébraux et l’hypertension pulmonaire.

1.3 : Les inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’endothéline :

L’ECE-1 étant l’enzyme prépondérante de notre système, nous allons à nouveau faire

un abus de langage en utilisant les termes inhibition de l’ECE pour l’inhibition de l’ECE-1 et

inhibiteurs de l’ECE pour les inhibiteurs de l’ECE-1.

Les inhibiteurs de l’ECE, et plus particulièrement le phosphoramidon, ont montré une

certaine efficacité dans des modèles animaux variés de maladies cardiovasculaires, rénaux ou

108 OmLand T., Lie R. T., Aakvaag A., Arsland T., Dickstein K. Plasma endothelin determination as a prognosticindicator of 1-year mortality after acute myocardial infarction. Circulation 1994, 89, 1573-1579.109 Stawski G., Olsen U. B., Grande P. Cytotoxic effect of endothelin-1 during ‘stimulated’ ishaemia in culturedmyocytes. Eur. J. Pharmacol. 1991, 201, 123-124.

48

du système nerveux central avec des résultats comparables à ceux obtenus pour les

antagonistes sélectifs ou non des récepteurs ETA et ETB de l’endothéline. L’utilisation du

phosphoramidon a entraîné des améliorations dans le traitement de l’hypertension pulmonaire,

de l’infarctus du myocarde ou encore de l’insuffisance rénale sur l’animal. Cependant, à cause

de la faible durée d’action et de la mauvaise biodisponibilité orale du phosphoramidon, le

développement d’inhibiteurs de l’ECE ayant de meilleures caractéristiques dans ces deux

domaines pourrait être très intéressant.110,111

Des applications prometteuses pour ces composés résident dans le traitement de

l’hypertension, de l’hypertension pulmonaire, des arrêts cardiaques chroniques et plus

particulièrement des vasospasmes cérébraux qui ne connaissent pour l’instant aucun

traitement réellement efficace.

Des inhibiteurs mixtes de l’enzyme de conversion de l’angiotensine II (ACE) et de la

NEP sont déjà connus pour être d’excellents agents de traitement des arrêts cardiaques

congestifs et des insuffisances rénales chroniques. Des inhibiteurs mixtes de ces deux

enzymes et de l’ECE pourraient donc avoir des caractéristiques très intéressantes. Cependant,

l’utilisation d’inhibiteurs mixtes de l’ACE et de la NEP conduit à des taux élevés de

bradykinine, un puissant bronchoconstricteur. L’utilisation d’inhibiteurs triples est donc

problématique pour des patients asthmatiques, d’où l’intérêt d’obtenir des inhibiteurs sélectifs

de l’ECE.

Intéressons nous aux composés décrits dans la littérature pour ce type d’activité.

Plusieurs familles de composés peuvent être discernées comme par exemple les chélatants

métalliques, les inhibiteurs peptidiques, les produits naturels, les composés organiques portant

une fonctionnalité comprenant un atome de phosphore, un thiol, un acide hydroxamique ou un

110 Jeng A. Y., De Lombaert S. Endothelin converting enzyme inhibitors. Current Pharmaceutical Design 1997,3, 597-614.111 Jeng A. Y. Therapeutic potential of endothelin converting enzyme inhibitors. Exp. Opin. Ther. Patents 1997,7, 1283-1295.

49

acide carboxylique comme fonction chélatante du zinc. Commençons par les composés les

plus simples, à savoir les chélatants du zinc.

1.3.1 : Les chélatants du zinc :

Tableau 1 : Chélatants du zinc.110

Composé Structure CI 50 (µM) ECE

Ratio des CI 50 ECE Phosphoramidon /

composé

I 82 0,005

II 30 0,013

III 5,1 0,078

IV EDTA 0,5 0,77

SHSH

OH

SHSH

NSH

C’est la déplétion de l’atome de zinc par les composés I à IV qui leur confère une

activité inhibitrice de l’ECE. Cependant, celle-ci est irréversible ce qui pose des problèmes

d’effets secondaires importants.

1.3.2 : Les inhibiteurs peptidiques :

Comme la substitution des acides aminés de configuration L du big ET-1, mis en jeu

lors du clivage par l’ECE, par leur homologue de configuration D est connue pour conduire à

des composés inhibiteurs et comme le big ET-1 (16-38) est clivé par l’ECE quatre fois plus

50

vite que le big ET-1 lui-même, les composés [D-Val22]-big ET-1 (16-38)112 et [D-Trp21]-big

ET-1 (16-38) ont été étudiés. Le premier s’est avéré être un candidat intéressant inhibant

l’ECE avec une CI50 de 280 µM mais le second ne présente qu’un faible pourcentage

d’inhibition pour une concentration millimolaire.110

D’autres analogues tronqués du big ET-1, comme le [Phe22]-big ET-1 (19-37)113,

[Phe21]-big ET-1 (18-34) ou le [Ala31]-big ET-1 (18-34)114, ont aussi conduit à de bonnes

caractéristiques inhibitrices.

1.3.3 : Les produits naturels :

Au niveau des inhibiteurs de l’ECE isolés à partir de sources naturelles, ce sont les

composés V et VI qui sont les plus puissants avec des CI50 pour l’ECE respectives ayant pour

valeurs 79 nM et 140 nM (tableau 2).115,116 De plus, ces composés présentent une très bonne

sélectivité pour l’inhibition de l’ECE par rapport à la NEP.

112 Morita A., Nomizu M., Okitsu M., Horie K., Yokogosji H., Roller P. P. D-Val22 containing human bigendothelin-1 analog, [D-Val22]Big ET-1 (16-38), inhibits the endothelin converting enzyme. FEBS Lett. 1994,353, 84-88.113 Claing A., Neugebauer W., Yano M., Rae G. A., D’Orleans-Juste P. [Phe22]-Big ET-1 (19-37) : a new andpotent inhibitor of the endothelin-converting enzyme. J. Cardiovasc. Pharmacol. 1995, 26 S3, S72-S74.114 Liu W., Takayanagi R., Ito T., Oba K., Nawata H. [Phe21]big ET-1 (18-34) and [Ala31]big ET-1 (18-34)inhibit the human endothelin-converting enzyme-1 (ECE-1) expressed in CHO-K1 cells in a different fashion.FEBS. Lett. 1997, 420, 103-106.115 Yoshimura S., Tsurumi Y., Takase S., Okuhara M. WS75624 A and B, new endothelin converting enzymeinhibitors isolated from Saccharotrix sp No. 75624. I. Taxonomy, fermentation, isolation, physico-chemicalproperties and biological activities. J. Antibiotics 1995, 48, 1066-1072.

51

Tableau 2 : Produits naturels.

116 Tsurumi Y., Fujie K., Nishikawa M., Kiyoto S., Okuhara M. Biological and pharmacological properties ofhighly selective new endothelin converting enzyme inhibitor WS79089B isolated from Streptosporangiumroseum No. 79089. J. Antibiotics 1995, 48, 169-174.

Composé Structure CI 50 (µM)ECE

Ratio des CI50 ECEPhosphoramidon /

composé

Ratio des CI50

ECE / NEP

V 0,079 2,3 0,024

VI 0,14 3,5 0,0014

VII 0,9 1 0,013

VIII 2,1 ND ND

IX 2,9 ND ND

OHS

N

N

MeO OMe

COOH

O

O OH

OH

OH

OH

OHCOOH

OMe

OH

S

NO

S

ON

OHC CHOOH

HO 3S

HO 3S

N O

OH

O

O

OHOH

O

HOOC

52

Le composé VII, bien que présentant une activité moins forte, reste pourtant

intéressant de par sa sélectivité.117 De même, les composé VIII et IX présentent aussi des

caractéristiques inhibitrices intéressantes.118,119

Toutes ces molécules sont comparables au phosphoramidon en terme d’activité

inhibitrice mais sont, pour la plupart, plus sélectives. Elles apportent des renseignements

structuraux sur le site actif de l’ECE, bien que leur mode de liaison reste peu clair. Ceci est

accentué par le fait qu’elles aient peu de points communs et surtout pas de fonction chélatante

commune.

1.3.4 : Les molécules organiques portant une fonction chélatante :

1.3.4.1 : Fonction chélatante phosphorée :

Le phosphoramidon est l’inhibiteur de référence pour l’ECE. Il contient une fonction

phosphoramidate chélatant le zinc. A partir de sa structure, en faisant varier le degré

d’oxydation du noyau phosphore et ses substituants, différentes familles de composés porteurs

d’un atome de phosphore ont été décrites comme inhibiteurs de l’ECE (par exemple d’autres

phosphoramidates, des phosphonamides, des acides phosphiniques et des acides

aminophosphoniques).

1.3.4.1.1 : Les phosphoramidates :

117 Takaichi S., Tuchiya N., Sato A., Negishi T., Takamatsu Y., Matsushita Y., Watanabe T., Iijima Y.,Haruyama H., Kinoshita T., Tanaka M., Kodama K. B-90063, a novel endothelin converting enzyme inhibitorfrom a new marine bacterium, Blastobacter sp SANK 71894. J. Antibio. 1998 51, 805-815.118 Patil A. D., Freyer A. J., Breen A., Carte B., Johnson R. K. Halistanol disulfite B, a novel sulfated sterol fromthe sponge Pachastrella sp : Inhibitor of endothelin converting enzyme. J. Nat. Prod. 1996, 59, 606-608.

53

Les composés XI et XII n’ont pas permis d’améliorer les caractéristiques inhibitrices

du phosphoramidon mais ont permis d’obtenir des renseignements structuraux comme par

exemple le fait que le remplacement du rhamnosyle du phosphoramidon par une chaîne

aliphatique hydrophile peut être envisagé (tableau 3).

Tableau 3 : Phosphoramidates.111



composé

Ratio des CI 50

NEP / ECE

X Phosphoramidon 1,2 1 0,025

XI 48 0,03 ND

XII 6 0,2 ND

NH

NH

OOH

O

NH

PO

OHO

NH

NH

OOH

O

NH

PO

OHOOH

OH

1.3.4.1.2 : Les phosphonamides :

119 Asai Y., Nonaka N., Suzuki S. I., Nishio M., Takahashi K., Shima H., Ohmori K., Ohnuki T., Komatsubara S.TMC-66, a new endothelin converting enzyme produced by Streptomyces sp. A5008. J. Antibio. 1999, 52, 607-612.

54

Cette famille de composés présente en général des potentiels inhibiteurs meilleurs que

celui obtenu avec le phosphoramidon. En effet, les composés XIII, XIV et XV sont

respectivement 6, 1,5 et 17 fois plus puissant que le phosphoramidon (tableau 4).111,120

Tableau 4 : Phosphonamides.



composé

Ratio des CI 50

NEP / ECERatio des CI 50

ACE / ECE

XIII 0,55 6,4 0,036 0,72

XIV 2,4 1,5 0,077 2

XV 0,003 17 2 ND

NH

NH

NH

OOH

O

PO

OH

NH

NH

OPO

OH

ClCl

NH

OHO

NH

NH

NH

OOH

O

PO

OH

Cependant l’intérêt thérapeutique de ce type de composés est souvent limité à cause de

leur forte labilité chimique de la liaison phosphore-azote en milieu acide.

1.3.4.1.3 : Les acides phosphiniques :

120 Kukkola P. J., Savage P., Sakane Y., Berry J. C., Bilci N. A., Ghai R. D., Jeng A. Y. Differential structure-activity relationships of phosphoramidon analogues for inhibition of three metalloproteases : endothelin-converting enzyme, neutral endopeptidase, and angiotensin-converting enzyme. J. Cardiovasc. Pharmacol.1995, 26 S3, S65-S68.

55

Ces composés sont plus stables que les phosphonamides ce qui leur confère un plus

grand intérêt thérapeutique. Cependant, bien qu’ils présentent pour la plupart des profils

inhibiteurs pour l’ECE assez intéressants, ils ne permettent pas d’obtenir une sélectivité vis-à-

vis de l’ACE et de la NEP (tableau 5).

Tableau 5 : Acides phosphiniques.111,121,122



composé

Ratio des CI 50

ECE / NEP

XVI 0,025 4 0,2

XVII 0,07 7,1 0,8

XVIII 0,05 10 0,9

NH

NH

OOH

OPN

HO

OHO

NH

SO

O

NH

O

O

NH

NH

OOH

OPN

HO

OHO

NH

SO

O

NH2

NH

NH

OOH

OPN

HO

OHO

NH

NH2

O

O2N

1.3.4.1.4 : Les acides aminophosphoniques :

121 Chackalamannil S., Chung S., Stamford A. W., McKittrick B. A., Wang Y., Tsai H., Cleven R., CzarnieckiM. Highly potent and selective inhibitors of endothelin converting enzyme. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996, 6,1257-1260.122 McKittrick B. A., Stamford A. W., Weng X., Ma K., Chackalamannil S., Czarniecki M., Cleven R. M., FawziA. B. Design and synthesis of phosphonic acids that triply inhibit endothelin converting enzyme, angiotensinconverting enzyme and neutral endopeptidase 24.11. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996, 6, 1629-1634.

56

Ce type de composé a été étudié afin d’éliminer le problème de labilité des

phosphonamides par insertion d’un groupement méthylène entre le phosphore et l’azote. Les

composés XIX à XXIV présentent tous des caractéristiques inhibitrices très intéressantes, les

CI50 obtenues pour l’ECE variant de 6 à 52 nM mais les composés XX et XXI123 ne sont pas

sélectifs pour l’ECE (tableau 6).

Tableau 6 : Acides aminophosphoniques.

123 De Lombaert S., Stamford L. B., Blanchard L., Tan J., Hoyer D., Diefenbacher C. G., Wei D., Wallace E. M.,Moskal M. A., Savage P., Jeng A. Y. Potent non-peptidic dual inhibitors of endothelin-converting enzyme andneutral endopeptidase 24.11. Bioorg. Med. Chem. Lett.. 1997, 7, 1059-1064.

57



composé

Ratio des CI 50

NEP / ECE

XIX 0,052 2,7 20

XX 0,045 27 0,15

XXI 0,023 52 0,06

XXII 0,006 200 19

XXIII 0,022 55 105

XXIV 0,008 150 725

P NH

NH

OOH

O

NH

OOH

OH

N

O

O

N NN

NH

P NH

O

O

OHOH

N NN

NH

P NH

O

O

OHOH

N

N NN

NH O

P NH

O

O

OHOH

O

P NH

OH

O

O

OHOH

P NH

O

O

OHOH

F F

NH

O

NH

OH

O

Les composés XIX111, XXII124, XXIII125 et XXIV126 sont eux de très bons inhibiteurs

sélectifs de l’ECE.

124 De Lombaert S., Blanchard L., Stamford L. B., Tan J., Wallace E. M., Satoh Y., Fitt J., Hoyer D.,Simonsbergen D., Moliterni J., Marcopoulos N., Savage P., Chou M., Trapani A. J., Jeng A. Y. Potent andselective non-peptidic inhibitors of endothelin-converting enzyme-1 with sustained duration of action. J. Med.Chem. 2000, 43, 488-504.

58

1.3.4.2 : Les thiols :

La fonction thiol peut être envisagée pour remplacer toutes les fonctions porteuses

d’un atome de phosphore décrites précédemment pour chélater le zinc. Les composés XXV et

XXVI sont de moins bons candidats, en terme d’inhibiteur de l’ECE, que le phosphoramidon

ce qui est sans doute du à un métabolisme trop rapide de ces ligands.127 Les composés XXVII

et XXVIII montrent des caractéristiques intéressantes mais comme aucune référence n’est

faite au phosphoramidon, leur puissance ne peut être réellement évaluée.128,129 Par contre les

composés XXIX et XXX sont décrit comme étant un peu plus puissants que le

phosphoramidon (tableau 7).130,131

1.3.4.3 : Les acides hydroxamiques :

Peu de données sont accessibles au niveau de ce type de composés bien que la

fonction acide hydroxamique soit une fonction connue pour chélater le zinc. Les

caractéristiques inhibitrices des composés XXXI et XXXII sont proches de celle du

phosphoramidon (tableau 8).110

125 Jeng A. Y., De Lombeart S., Beil M. E., Bruseo C. W., Savage P., Chou M., Trapani A. J. Design andsynthesis of a potent and selective endothelin converting enzyme inhibitor , CGS 35066. J. Cardiovasc.Pharmacol. 2000, 36 S1, S36-S39.126 Wallace E. M., Moliterni J. A., Moskal M. A., Neubert A. D., Marcopoulos N., Stamford L. B., Trapani A. J.,Savage P., Chou M., Jeng A. Y. Design and synthesis of potent, selective inhibitors of endothelin convertingenzyme. J. Med. Chem. 1998, 41, 1513-1523.127 Deprez P., Guillaume J., Dumas J., Vevert J. P. Thiol inhibitors of endothelin converting enzyme. Bioorg.Med. Chem. Lett. 1996, 6, 2317-2322.128 Finck C.A., Moskal M., Firooznia F., Hoyer D., Symonsbergen D., Wei D., Qiao Y., Savage P, Beil M.,Trapani A. J., Jeng A. Design and synthesis of potent thiol-based inhibitors of endothelin converting enzyme-1.Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000, 10, 2037-2039.129 Firooznia F., Gude C., Chan K., Finck C. A., Qiao Y., Satoh Y., Marcopoulos N., Savage P., Beil M. E.,Bruseo C. W., Trapani A. J., Jeng A. Y. Synthesis and biological activity of novel potent endothelin-convertingenzyme-1 inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, 11, 375-378.130 Kukkola P. J., Bilci N. A., Kozak W. X., Savage P., Jeng A. Y. Optimization of retro-thiorphan for inhibitionof endothelin converting enzyme. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996, 6, 619-624.131 Kitas E. A., Löffler B. M., Daetwyler S., DehmLow H., Aebi J. D. Synthesis of triazole tethered pyrrolidinelibrairies : novel ECE inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002, 12, 1727-1730.

59

Tableau 7 : Inhibiteurs portant une fonction thiol.



composé

XXV 0,02 0,5

XXVI 0,025 0,4

XXVII 0,011 ND

XXVIII 0,077 ND

XXIX 1,7 2,1

XXX 0,15 6,7

NH

O

SH NH

OH

O

Br

NH

O

SH NH

OH

O

Br

NH

OOH

O

NH

OSH

H O

NH

OOH

O

NH

OSH

NH

SHNH

O

F

N

NN

SNS OO

SH

60

Tableau 8 : Acides hydroxamiques.



composé

XXXI 0,001 ND

XXXII 0,013 ND

NH

NH

O

OHNH

ONH

O

NO

NH

NH

O

OHNH

O

O

OH

1.3.4.4 : Les acides carboxyliques :

Tableau 9 : Acides carboxyliques.110



composé

XXXIII 0,52 ND

XXXIV 1,5 0,33

NH

O

N

O OH

O

OOH

NH

NH

O

NH

OOH

O

OH

OOH

SO

O

NH2

Comme pour les acides hydroxamiques, les acides carboxyliques ont été peu étudiés

en terme d’inhibiteur de l’ECE. De plus, les composés décrits ne présentent pas de meilleurs

potentiels inhibiteurs que le phosphoramidon.

61

1.3.5 : Les composés plus exotiques :

Tableau 10 : Quinazoline, Pyrazole et Pyridine.



composé

XXXV 0,9 0,33

XXXVI 0,042 16

XXXVII 0,86 ND

N

N

NHI

Cl

Cl

Cl

N

NN

N

NH

NH

OS

O

O Cl

N

O

O

OHN

S

Des structures différentes ont également été décrites comme inhibiteurs de l’ECE,

comme par exemple des quinazolines (composé XXXV)132, des pyrazoles (composé

XXXVI)133 ou des pyridines (composé XXXVII).134 Ces molécules présentent des

caractéristiques biologiques proches ou supérieures à celles du phosphoramidon.

132 Ahn K., Sisneros A. M., Herman S. B., Pan S. M., Hupe D., Lee C., Nikam S., Cheng X. M., Doherty A. M.,Schroeder R. L., Haleen S. J., Kaw S., Emoto N., Yanagisawa M. Novel selective quinazoline inhibitors ofendothelin converting enzyme-1. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1998, 243, 184-190.133 Yamazaki K., Hasegawa H., Umekawa K., Ueki Y., Ohashi N., Kanaoka M. Design, synthesis and biologicalactivity of novel non-peptidyl endothelin converting enzyme inhibitors, -1phenyl-tetrazole-formazan analogues.Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002, 12, 1275-1278.134 Massa M. A., Patt W. C., Ahn K., Sisneros A. M., Herman S. B., Doherty A. Synthesis of novel substitutedpyridines as inhibitors of endothelin converting enzyme-1 (ECE-1). Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998, 8, 2117-2122.

62

1.4 : Conclusion :

Depuis la découverte de l’endothéline, un puissant vasoconstricteur, beaucoup de

travaux ont été mis en œuvre pour mieux comprendre son mode d’action. Tout d’abord, trois

peptides de structure très proches, l’ET-1, l’ET-2 et l’ET-3, ont été caractérisés. Ceux-ci sont

obtenus à travers un processus biosynthétique particulier. En effet, les gènes encodant pour ce

système sont tout d’abord transcrit pour conduire aux ARN messagers correspondants. Une

étape de maturation mène alors aux premiers précurseurs notés prépro-ETs. Ceux-ci sont

coupés lors de leur sécrétion à partir des noyaux pour conduire aux pro-ETs. Une protéase de

type furine entre en action pour former les big ETs qui sont ensuite à nouveau coupés par une

enzyme spécifique nommée ECE. Deux récepteurs ont également été caractérisés, notés

respectivement ETA et ETB médiant plus particulièrement l’homéostasie de la pression

sanguine. Plusieurs isoformes de l’ECE ont également été découvertes. Cependant, dans le

système endothélial, c’est l’ET-1 et l’ECE-1 qui sont respectivement le peptide et l’enzyme

prépondérant.

De plus, nous avons vu que l’ET-1 peut être mis en cause dans de multiples

pathologies comme par exemple l’hypertension, l’hypertension pulmonaire, l’insuffisance

rénale aigue, les vasospasmes cérébraux, l’épaississement vasculaire, l’hypertrophie

cardiaque, l’insuffisance cardiaque chronique et bien d’autres encore. Beaucoup d’études ont

été faites pour obtenir des agonistes ou des antagonistes des récepteurs de ce système ainsi

que des inhibiteurs de l’ECE.

Enfin, nous intéressant plus particulièrement à ce dernier type de composés, nous

avons vu que plusieurs familles de composés avec une grande diversité structurale et

fonctionnelle ont été essayées comme inhibiteurs de l’ECE, métalloprotéase à zinc. Nous

allons maintenant décrire les choix que nous avons faits et les travaux qui en ont découlé.

63

Chapitre II :

Synthèse d’inhibiteurs de l’ECE et

chimie mise en jeu

64

Sommaire du chapitre II

2.1 : Choix d’une référence pour nos travaux : 65

2.1.1 : Molécule choisie comme référence : 66

2.1.2 : Présentation du site actif de l’ECE : 67

2.1.2.1 : Site S1’ et position P1’ : 69

2.1.2.2 : Site de chélation du zinc : 70

2.1.2.3 : Site S2’ et position P2’ : 72

2.1.2.4 : Site S1 et position P1 : 74

2.1.2.5 : Amine basique : 75

2.1.3 : Premiers travaux envisagés : 76

2.2 : Synthèse racémique de notre référence et travail de relation structure activité: 77

2.2.1 : Présentation de la stratégie de synthèse choisie : 78

2.2.1.1 : Synthèse de la base de Schiff : 78

2.2.1.2 : Synthèse de la chaîne aralkyle: 79

2.2.1.3 : Synthèse du dipeptide : 79

2.2.1.4 : Synthèse du précurseur de l’acide phosphonique: 81

2.2.1.5 : Synthèse de la molécule (±) 1 : 82

2.2.1.6 : Explication des problèmes rencontrés : 84

2.2.2 : Travaux pour l’étude de relations structure-activité: 86

2.2.2.1 : Amélioration de notre schéma de synthèse générale : 86

2.2.2.2 : Variation autour de la position P1’ : 87

2.2.2.2.1 : Synthèse de la molécule 2: 87



2.2.2.3 : Etude de la fonction chélatante : 92

65

2.2.2.3.1 : Synthèse des produits porteurs d’un acide carboxylique enposition P2’ : 93

2.2.2.3.2 : Synthèse des produits porteurs d’une chaîne aminée enposition P2’ : 95

2.2.2.4 : Etude de la position P2’ : 100

2.2.2.4.1 : Composé porteur de la chaîne aralkyle : 101

2.2.2.4.2 : Composés sans partie C-terminale : 102

2.2.2.4.3 : Produits portant une chaîne aminée : 103

2.2.2.5 : Etude de l’amine basique : 109

2.2.2.6 : synthèse de composés « rétros » : 111

2.2.3 : Conclusions : 115

2.3 : Etude physico-chimique de molécules dérivées de nos produits : 116

2.3.1 : Synthèse des trois composés utilisés pour cette étude : 116

2.3.2 : Titrage potentiométrique de nos ligands : 119

2.3.2.1 : Conditions opératoires : 120

2.3.2.2 : Calcul des constantes macroscopiques de protonation : 121

2.3.2.3 : Titrage potentiométrique du ligand 14 : 122

2.3.2.4 : Titrage potentiométrique des ligands 98, 100 et 105 : 123

2.3.2.5 : Conclusion sur ces dosages potentiométriques : 125

2.3.3 : Titrage potentiométrique suivi par RMN 31P et 1H de nos ligands : 125

2.3.3.1 : Conditions opératoires : 126

2.3.3.1.1 : RMN 31P : 126

2.3.3.1.2 : RMN 1H : 127

2.3.3.2 : Calcul des constantes microscopiques de protonation : 127

2.3.3.3 : titrage RMN du ligand 14 : 130

2.3.3.3.1 : RMN 31P et RMN 1H : 130

66

2.3.3.3.2 : Micro-constantes : 132

2.3.3.4 : Titrages RMN des ligands 98, 100 et 105 : 133

2.3.3.4.1 : RMN 31P: 133

2.3.3.4.2 : RMN 1H : 135

2.3.3.4.3 : Constantes de protonation : 137

2.3.4 : Conclusions de cette étude : 138

2.4 : Synthèse d’une plateforme β-aminophosphonate : 140

2.4.1 : Présentation de la réaction mise en jeu : 141

2.4.1.1 : Intérêt de cette synthèse : 141

2.4.1.2 : Mise au point de cette synthèse : 142

2.4.2 : Variations effectuées sur cette réaction : 143

2.4.2.1 : Utilisation de différents types d’aldéhydes : 143

2.4.2.2 : Utilisation de différents carbamates : 148

2.4.2.3 : Utilisation de différents acides de Lewis : 149

2.4.2.4 : Conclusions : 150

2.5 : Conclusions : 151

67

Comme nous venons de le voir, un grand nombre de composés sont décrits comme

étant des inhibiteurs de l’ECE. Cependant la plupart se présente sous la forme d’inhibiteurs

mixtes, inhibant également la NEP ou l’ACE, et parfois même ces trois enzymes en même

temps. En général ces molécules présentent une assez grande diversité chimique. En effet,

elles appartiennent à différentes familles de composés (inhibiteurs peptidiques, molécules

portant une fonction comportant un atome de phosphore, ou une fonction acide

hydroxamique, ou un acide carboxylique, ou d’autres encore).

C’est pourquoi, nous souhaitions orienter notre sujet de recherche en choisissant une

molécule de référence, chef de file pour guider nos travaux. De plus, en préparant ainsi une

molécule citée dans la littérature, nous avions en main un outil nous servant d’étalon afin de

valider les tests biologiques futurs.

2.1 : Choix d’une référence pour nos travaux :

Afin de faire ce choix, plusieurs critères ont été examinés. Le premier a été de

sélectionner une molécule présentant une très bonne activité pharmacologique en terme

d’inhibition de l’ECE. Il existe, en effet, un grand nombre d’inhibiteurs de l’enzyme de

conversion de l’endothéline décrits dans la littérature, de puissance variable. Il était

primordial de partir d’un squelette présentant déjà un caractére inhibiteur afin d’augmenter

nos chances de trouver une molécule fortement active.

Mais nous avons également considéré la sélectivité des candidats potentiels car nous

voulions préférentiellement synthétiser un inhibiteur sélectif de l’ECE. En partant d’un

composé déjà relativement sélectif, les variations de structure que nous introduirons devront

conduire à la fois à une bonne activité inhibitrice et à une sélectivité forte vis-à-vis des autres

enzymes proches de l’ECE.

68

Enfin, le dernier critère auquel nous nous sommes intéressés a été l’étude des

fonctions portées par le squelette des candidats. En choisissant une molécule portant de

nombreuses fonctions, nous pourrons entamer un travail de relation structure activité. En

effet, afin de pouvoir obtenir une diversité au cours de nos synthèses, il est important d’avoir

un squelette avec une grande « souplesse chimique » nous permettant de mettre en place de

nombreuses variations. Celles-ci nous conduiront à mieux comprendre les interactions mises

en jeu entre nos molécules et l’ECE et nous permettront de valider l’importance de certains

groupements.

2.1.1 : Molécule choisie comme référence :

C’est pourquoi, au regard de tous ces critères, nous avons choisi un acide

aminophosphonique noté 1, comme molécule de référence (fig. 14).126

Figure 14 : Molécule de référence 1126.

Nous voyons que cette molécule présente une très bonne activité inhibitrice (8 nM /

ECE) ainsi qu’une bonne sélectivité puisqu’elle est 725 fois plus puissante pour l’ECE que

pour la NEP. De plus, sa structure permet d’envisager un nombre important de variations de

par la présence de nombreux sites réactionnels. Enfin, elle comporte un azote basique en β de

OH

ONH

ONH

ONH

F F

PO

OHOH

IC50 (µM/ ECE) : 0,008IC50 (µM/ NEP) : 5,8

IC50 NEP/IC50 ECE : 725

1

69

l’atome de phosphore ce qui est assez original au regard de l’ensemble des familles

d’inhibiteurs connus de l’ECE.

Intéressons nous maintenant au site actif de l’enzyme de conversion de l’endothéline

et surtout à la manière par laquelle cette molécule se lie à l’ECE dans ce site. Cela nous

permettra alors de voir quels sont les types d’interactions mises en jeu et de prédéterminer les

zones où des variations seront intéressantes.

2.1.2 : Présentation du site actif de l’ECE :

Comme le phosphoramidon a été le premier composé décrit comme inhibiteur de

l’ECE, disposons le dans le site actif de celle-ci (fig. 15) en définissant les résidus de

l’enzyme et du substrat à la manière de la littérature bien que cette enzyme n’ait pas été

cristallisée. Ceci est fait par analogie avec l’enzyme de conversion de l’angiotensine.135

O

O PO

OHNH

NH

O

O

OH

NH

OHOH

OH

Site S2’

Site S1’

Site S1

Site de chélation du zinc

Position P2’

Position P1’Position P1

O

O PO

OHNH

NH

O

O

OH

NH

OHOH

OH

Site S2’

Site S1’

Site S1


Position P2’

Position P1’Position P1

Figure 15 : Positionnement du phosphoramidon dans le site actif de l’ECE.111

70

Afin de mieux décrire notre référence, nous allons la positionner dans le site actif de la

même façon que le phosphoramidon (fig. 16).

Figure 16 : Positionnement de la molécule 1 dans le site actif de l’ECE.

Maintenant que ce positionnement est établi, nous allons pouvoir nous intéresser aux

interactions qui sont mises en jeu entre la molécule 1 et le site actif de l’ECE. Nous pouvons

distinguer quatre zones importantes que nous allons détailler, à savoir les positions P1, P1’ et

P2’ ainsi que le site de chélation du zinc.

Notons que le carbone porteur de la chaîne aralkyle présente une asymétrie favorisant

la reconnaissance de cette molécule par l’enzyme de conversion de l’endothéline. En effet,

l’étude des racémates et des molécules optiquement actives de cette famille de composés a

montré que c’est l’énantiomère S qui est le plus affin pour cette enzyme. Cependant, dans le

cadre d’une étude relation structure-activité, l’évaluation pharmacologique des mélanges

racémiques permet dans un premier temps de déterminer si les molécules étudiées sont de

135 Schlechter I., Berger A. On the size of the active site in protease L. Papain. Biochem. Biophys. Res. Commun.1967, 27, 157-162.

Site S2’

Site S1’

Site S1


Position P2’

Position P1’

Position P1

O

NH

O

NH

OH

O

F F

NH

POHO

OH

71

bons candidats en terme d’inhibiteur. Si tel est le cas, il sera nécessaire par la suite de

synthétiser les énantiomères des produits actifs.

C’est finalement la synthèse de (±) 1 qui a été effectuée dans un premier temps afin

d’obtenir une référence pour la suite de nos travaux. Mais détaillons maintenant ce qui est

connu et les choix que nous avons fait afin d’étudier les autres parties de ce squelette.

2.1.2.1 : Site S1’ et position P1’ :

Dans notre référence, la position P1’ est occupée par une chaîne aralkyle porteuse de

deux atomes de fluor en position ortho et para sur le groupement phényle. On note ici que

deux types d’interactions peuvent être mises en jeu par cette chaîne, à savoir : des interactions

aryl-aryl à travers la triple liaison et le phényle ainsi que des interactions accepteur-donneur à

travers les atomes de fluor. D’après les études préalables sur ce type de molécules, le fluor en

ortho ne semble pas réellement être important contrairement à celui en para.126

Au niveau de ce site, il y a un grand nombre d’arguments qui militent pour une

coexistence de ces deux types d’interactions. Nous pouvons remarquer que, chimiquement

parlant, un grand nombre de variations semble réalisable au niveau de la chaîne aralkyle

comme par exemple le remplacement de la triple liaison par un groupement cyclique

aromatique, l’élimination ou la substitution des atomes de fluor et bien d’autres encore.

Nous voyons qu’au sein de cette poche, un bon nombre d’informations reste à

confirmer afin d’obtenir la chaîne la mieux adaptée. C’est pourquoi nous avons décidé de

synthétiser trois molécules présentant des variations au niveau de la position P1’ (fig. 17).

72

Figure 17 : Variations de la position P1’.

La molécule 2 a été synthétisée dans le but d’appréhender les variations engendrées

par le remplacement de la triple liaison portée par (±) 1 par un groupement isostère sous la

forme d’un reste phényle, alors que le produit 3 permettrait de mesurer l’influence du

deuxième groupement aromatique, et le composé 4 d’obtenir une référence ne portant pas de

chaîne peptidique.

Par commodité de synthèse et suite aux données pharmacologiques obtenues pour ces

produits que nous étudierons de manière plus approfondies au cours du chapitre III, nous

avons décidé de conserver la chaîne biphényle pour la plupart de nos molécules.

2.1.2.2 : Site de chélation du zinc :

L’ECE étant une protéase au zinc, la présence d’une fonction chélatante de ce métal

est nécessaire sur nos molécules. Pour la molécule 1, cette fonction est un acide

phosphonique. Mais un certain nombre d’autres fonctions peuvent convenir, comme par

exemple une fonction thiol, un acide hydroxamique, un acide carboxylique ou d’autres

groupement phosphorés tel qu’un phosphoramidate, un phosphonamide, etc…

NH

OH

OPO

OHOH

NH

OH

OPO

OHOH N

HOH

O

FF

PO

OHOH

2

HCl

3 4

HCl

73

Nous voyons donc que ce site est primordial car il nous permet d’avoir un autre point

de variations dans notre étude. C’est pourquoi nous avons décidé d’étudier deux autres

fonctions chélatantes du zinc, à savoir les acides carboxyliques et les acides hydroxamiques.

Deux séries de composés ont été synthétisées dans ce but (fig. 18). En partant de la

molécule 2, nous avons tout d’abord synthétisé l’acide hydroxamique 5 et l’acide

carboxylique 6. Afin de pouvoir généraliser les résultats obtenus sur ces trois produits, les

produits 7, 8 et 9 ont ensuite été préparés, ils portent le même type de variations. L’amino-

acide bicyclique occupant la position P2’ pour ces derniers, est en fait une structure provenant

du groupe Servier. Celle-ci est connue pour amplifier le caractère inhibiteur sur l’ACE.

Figure 18 : Variations de la fonction chélatante.

Au regard des évaluations pharmacologiques de ces molécules, nous avons décidé par

la suite d’utiliser l’acide phosphonique comme fonction chélatante du zinc pour la majeure

partie de nos produits.

NH

OH

O

OH

ONH

OH

O

NH

O

OH

NH

N

O H

HH

OH

ONH

O

OHNH

N

O H

HH

OH

OOH

ONH

N

O H

HH

OH

OPO

OHOH

NH

OH

OPO

OHOH

65

987

HCl

2

HCl HCl

74

2.1.2.3 : Site S2’ et position P2’ :

Ce site est occupé, dans le cas de la molécule 1, par une chaîne peptidique composée

de deux amino acides. Nous notons qu’ici, ce sont à priori des liaisons de type accepteur-

donneur qui sont mises en jeu du fait de la présence de fonctions oxygénées.

Un nombre important de variations a déjà été reporté au niveau de cette poche mais

beaucoup d’hypothèses restent encore à confirmer en terme d’interactions comme par

exemple la longueur de chaîne, l’emplacement exact des sites de liaisons, etc… Nous voyons

qu’ici aussi un certain nombre de variations peuvent être envisagées comme l’ajout de

fonctions donnant des interactions accepteur-donneur ou leur suppression, l’ajout d’espaceurs,

l’introduction d’interactions de type aryl-aryl, etc…

C’est à nouveau un site providentiel pour notre étude et un bon point de départ pour

l’obtention de composés diversifiés. Nous avons synthétisé neuf molécules allant dans le sens

de cette étude. En effet, nous avons tout d’abord complété la série de molécules constituée par

les produits 1 et 4 par l’obtention de la molécule 10 portant une chaîne linéaire pour

remplacer la chaîne peptidique de (±) 1 (fig. 19) afin de voir l’influence des fonctions amides

de celle-ci.

OH

ONH

ONH

ONH

PO

OHOH

F F

NH

OH

O

FF

PO

OHOH

NH

NH

O

FF

OH

OPO

OHOH

4 101

75

Figure 19 : Variations de la chaîne peptidique à partir de (±) 1.

De même, afin de voir quel est le rôle de l’acide carboxylique porté par la molécule 3,

nous avons décidé de synthétiser trois molécules, notées 11,12 et 13 sans partie C-terminale,

ces dernières se différenciant entre elles par l’apport d’un deuxième groupement phényle et

par une rigidification via un cycle pipérazine (fig. 20).

Enfin, cinq autres produits ont été synthétisés, porteurs de chaîne aminée sur la

position P2’ (fig. 21). Toutes ces molécules portent des substituents différents permettant de

vérifier si des interactions de type aryl-aryl ou de type accepteur-donneur peuvent être mises

en évidence lors de leur reconnaissance par l’ECE.

Figure 20 : Molécules sans partie C-terminale.

NH

OH

OPO

OHOH

P NO

OHOH N

P NH

OOH

OH

P NH

OOH

OH

HCl

3

2 HCl

12

11

13

HCl

HCl

76

Figure 21 : Molécules ayant une chaîne aminée sur la position P2’.

2.1.2.4 : Site S1 et position P1 :

Certaines équipes ont travaillé sur cette position.121 De leurs travaux, il ressort que

plusieurs types de groupement peuvent être placés dans ce site comme par exemple des

chaînes alkyles, des groupements aryles, etc…

Nous n’avons pas synthétisé de molécules permettant d’obtenir ce type de variations.

Par contre, nous avons mis au point une synthèse de plate-forme de type β-aminophosphonate

NH

OH

OPO

OHOH

NH

N

O H

HH

OH

OPO

OHOH

NH

N

O

N

PO

OHOH

NH

NH

ON

N

O

POHOH

O

NH

N

O

N

PO

OHOH

NH

NH

OP NO

OHOH N

HN

O

N

PO

OHOH

N

N

2

HCl

7

HCl

14

2 HCl

3 HCl

1516

17

2 HCl

18

2 HCl

2 HCl

77

par le biais d’une réaction tricomposante (décrite ultérieurement dans ce chapitre) ouvrant la

voie à la synthèse de produits diversement substitués dans cette position.

2.1.2.5 : Amine basique :

Une des caractéristiques de la molécule de référence étant de porter une amine basique

en β de l’atome de phosphore, nous avons voulu étudier quel pouvait être son rôle vis-à-vis de

l’affinité de nos produits pour l’ECE. Pour ce faire nous avons décidé de la rendre tertiaire par

méthylation ou par benzylation (fig 22).

Figure 22 : Amines tertiaires.

Les molécules 19 et 20 ont été synthétisées portant respectivement un groupement

méthyle et benzyle sur l’amine. Ces deux composés ont été faits dans le but de vérifier

l’importance de l’atome d’hydrogène porté par l’amine du ligand 2. Par la suite, des

problèmes de réactivité de cette amine nous ont amenés à faire une étude physico-chimique

qui sera détaillée à la fin de ce chapitre.

Enfin une dernière série de composés de type « rétro » a été envisagé engendrant

simultanément des variations au niveau des positions P1’, P2’ et de l’amine basique (fig 23.).

NOH

OPO

OHOH

NOH

OPO

OHOH

NH

OH

OPO

OHOH

19 20

HCl HCl

2

HCl

78

Figure 23 : Composés « rétros ».

En comparant les composés 21, 22 et 23 aux molécules 5 et 6, nous voyons en effet,

que la chaîne occupant la position P1’ est décalée d’un carbone si l’on prend les fonctions

chélatantes comme référence. De plus, l’amine basique est remplacée par une fonction amide

et il n’y a plus d’acide carboxylique terminal au niveau de la position P2’.

Maintenant que nous avons décortiqué le squelette de la molécule de référence et

présenté les produits que nous avons décidé d’étudier, nous allons détailler leurs synthèses.

2.1.3 : Premiers travaux envisagés :

NH

OH

O

NH

O

OHNH

OH

O

OH

O

NH

O

OHO

NH

ONH

O

NH

ONH

O

OH

NH

O

OHO

NH

O

5

HCl

6

21 22

23

79

Au début de nos travaux de synthèse, c’est l’obtention de la molécule 1 qui a été notre

principal objectif. Ce composé possède trois centres asymétriques. Deux possibilités s’offrent

alors à nous, à savoir la synthèse du produit optiquement actif et/ou la synthèse du mélange

racémique de ce composé. Nous plaçant dans l’optique d’une étude de relation structure-

activité, nous avons décidé de synthétiser la molécule (±) 1.

2.2 : Synthèse racémique de notre référence et travail de relation structure

activité:

Tout d’abord, nous pouvons remarquer que cette molécule peut être coupée en quatre

parties (fig. 24). En effet, trois précurseurs peuvent être synthétisés en parallèle pour être

ensuite couplés à une plate-forme conduisant à la molécule (±) 1.

OH

ONH

ONH

ONH

PO

OHOH

F F

PO

OO OTf O

ONH

ONH2

F F

Br

NO

O

Figure 24 : Rétrosynthèse de la molécule (±) 1.

80

Les synthèses du bromure, du dipeptide, du triflate et de la base de Schiff seront

nécessaires à l’obtention de la molécule (±) 1.

2.2.1 : Présentation de la stratégie de synthèse choisie :

Le schéma de synthèse global que nous allons utiliser est largement inspiré de la

littérature.126 Nous allons détailler l’obtention de ces quatre précurseurs ainsi que leur

couplage.

2.2.1.1 : Synthèse de la base de Schiff :

Cette synthèse se fait en deux étapes, à savoir une estérification suivie d’une trans-

amination (schéma 1).

Schéma 1 : Synthèse de la base de Schiff 25.124,136

Cette synthèse débute par une estérification de la glycine aboutissant à l’obtention du

chlorhydrate de l’ester éthylique de la glycine 24 avec un rendement quantitatif.136 Ensuite, la

base de Schiff 25 est synthétisée, présentant l’intérêt d’être facilement alkylable. Nous avons

136 Bey, P., Vevert J. P. Synthesis of α-alkyl and α-functionalized methyl-α-amino acids. Tetrahedron Lett.1977, 17, 1455-1458.

NH2OH

ONH2

O

ON

O

O

HCl,16 17

SOCl2EtOH

98%Benzophénone imine

CH2Cl280%

81

choisit la benzophénone imine comme initiateur de cette base de Schiff, celle-ci étant connue

comme assez réactive et facilement hydrolysable. En couplant ce composé au sel 24 dans du

dichlorométhane, nous obtenons l’imine 25 avec un rendement global à partir de la glycine de

78%.124

2.2.1.2 : Synthèse de la chaîne aralkyle:

Ce synthon se prépare en deux étapes137 à partir du 2,4-difluoroiodobenzène et de

l’alcool propargylique (schéma 2).

Schéma 2 : Synthèse du bromure 27.137

La première étape est une réaction de Sonogashira catalysée par du palladium en

présence d’iodure de cuivre. Le composé 26 est obtenu après purification par

chromatographie sur colonne de silice avec un rendement de 82%. La seconde étape nous

permet d’obtenir le bromure 27 par une substitution nucléophile de la fonction hydroxyle en

présence de PBr3 en milieu basique dans de l’éther avec un rendement de 70%.

Le rendement global de cette synthèse est d’environ 60%. On note qu’il est intéressant

dans ce cas de pouvoir synthétiser de manière convergente cette partie de la molécule.

2.2.1.3 : Synthèse du dipeptide :

137 Wrobel J., Li Z., Dietrich A., McCaleb M., Mihan B., Sredy J., Sullivan D. Novel 5-(3-aryl-2-propynyl)-5-(arylsulfonyl)thiazolidine-2,4-diones as antihyperglycemic agents. J. Med. Chem. 1998,41, 1084-1091.

I

F

F

F

FOH

F

FBr

Alcool propargylique

PdCl2(PPh3)2, CuIEt2NH, 82%

PBr3, Pyridine

Et2O70%26 27

82

L’obtention de ce précurseur se fait en cinq étapes mettant en jeu des protections

fonctionnelles, des déprotections et un couplage peptidique (schéma 3).

Schéma 3 : Synthèse du dipeptide 32.126,136,138,139

La première étape correspond à une estérification de la fonction acide de la leucine en

présence de chlorure de thionyle en solution méthanolique.136 Le chlorhydrate de l’ester

méthylique de la leucine 28 est obtenu de façon quasi quantitative sous forme de cristaux

blancs. La protection de l’amine par un groupement Boc est ensuite mise en œuvre de manière

classique.138 L’utilisation de DMAP sert à activer la réaction et nous permet d’obtenir en

quatre heures le composé protégé 29 avec un rendement de 87%. Une solution méthanolique

de 29 est ensuite saponifiée en présence de soude 1N afin d’obtenir l’acide libre 30 de

manière quasi quantitative.126

Pour l’étape suivante, nous avons utilisé une voie de couplage peptidique mettant en

jeu du BOP comme agent de couplage afin de faciliter la purification du composé 31 attendu.

138 Ruan F., Chen Y., Itoh K., Sasaki T., Hopkins P. B. Synthesis of peptides containing unnatural, metal-ligatingresidues : aminodiacetic acid as a peptide side chain. J. Org. Chem. 1991, 56, 4347-4354.

NH2OH

O

NH2O

ONH

O

O

O

O

NH

OH

O

O

ONH

NH

O

O

O O

O

NH2NH

OO

O

HCl,

HCl,

SOCl2MeOH

98%

Boc2O, DMAPEt3N, CH2Cl2

87%

NaOH 1NMeOH

97%

HCl, Ala-OMe BOP, NMM, DMF

92%

HCl gazAcOEt

97%

28 29

303132

83

L’acide est solubilisé dans du diméthylformamide, le chlorhydrate d’ester méthylique

d’alanine est alors ajouté, puis le milieu est alcalinisé par ajout de N-méthylmorpholine

servant à la fois à neutraliser le sel d’alanine et à rendre l’amine ainsi libérée nucléophile. Puis

l’agent de couplage, le BOP, est ajouté afin d’activer l’acide libre 30. Après purification par

chromatographie sur colonne de silice, le composé 31 est obtenu avec un rendement de

92%.126 Par hydrolyse du groupement Boc du composé 31 dans une solution d’acétate

d’éthyle saturée en acide chlorhydrique le dipeptide 32 est obtenu sous forme de chlorhydrate

avec un rendement quasi quantitatif.139

Nous voyons que la synthèse de cette plate-forme est surtout composée d’étapes de

protections et de déprotections ce qui est classique en chimie peptidique. De plus, elle est

assez efficace car le sel 32 est obtenu avec un rendement global de 75%.

2.2.1.4 : Synthèse du précurseur de l’acide phosphonique:

Le triflate 33 est obtenu en une étape à partir du diméthylphosphite (schéma 4).

Schéma 4 : Synthèse du triflate 33.140

Ce synthon nécessite en fait deux étapes140 mais celles-ci sont faites « one pot » sans

isoler d’intermédiaire. Tout d’abord, le dimethylphosphite est chauffé à 140°C en présence de

paraformaldéhyde et de diisopropyléthylamine jusqu’à l’obtention d’une huile incolore. Cette

réaction est très exothermique. Une fois remis à température ambiante ce mélange réactionnel

est alors solubilisé dans du dichlorométhane en présence de 2,6-lutidine servant à piéger

139 Kise N., Ozaki H., Terui H., Ohya K., Ueda N. A convenient synthesis of N-Boc-protected tert-butyl esters ofphenylglycines from benzylamines. Tetrahedron Lett. 2001, 42, 7637-7639.140 Phillion D. P., Ansrew S. S. Synthesis and reactivity of diethyl phosphonomethyl-triflate. Tetrahedron Lett.1986, 27,1477-1480.

P HO

MeOOMe

PO

MeOOMe

OSO2CF3

33

1) paraformaldehyde, iPr2EtN

2) (CF3SO2)2O 2,6-lutidine, CH2Cl2

84

l’acide trifluoroacétique formé au cours de la réaction. De l’anhydride

trifluorométhanesulfonique est alors ajouté afin d’obtenir le triflate 33 qui est utilisé tel que

pour l’étape suivante.

A présent l’utilisation des quatre précurseurs (25, 27, 32 et 33) pour obtenir (±) 1 va

être développée.

2.2.1.5 : Synthèse de la molécule (±) 1 :

Afin d’obtenir la molécule (±) 1 par couplage des quatre précurseurs décrits ci-dessus,

huit étapes sont encore nécessaires. En effet, outre les 3 étapes de condensation, des

protections et des déprotections de fonctions sont utilisées.

85

NO

ON

O

O

FF

NH2

O

O

FF

NH

O

O

FF

O

O

NH

OH

O

FF

O

O

NH

NH

O

FF

O

O

NH

OO

ONH2

NH

O

FF

NH

OO

O

NH

NH

O

FF

NH

OO

OPO

MeOOMe

NH

NH

O

FF

NH

OOH

OPO

OHOH

25 34

27, tBu4NIK2CO3, CH3CN

HCl,35

HCl 1NEt2O

100%80%

36


82%

37

NaOH 1NMeOH

38

HCl, Leu-Ala-OMe 32BOP, NMM, DMF 94%

HCl gazAcOEt

HCl,

39

40

(MeO)2OPCH2OSO2CF3 33DIPEA, CH2Cl2

40%

1

1) NaOH 1N, MeOH2) TMSBr, DIPEA CH2Cl2

92%

100%

3) H2O 20%

Schéma 5 : Synthèse de la molécule (±) 1.124,126,136,138,139,141

La base de Shiff 25 est tout d’abord alkylée par une méthode utilisant un transfert de

phase. En effet, la base, K2CO3, utilisée pour former l’anion est peu soluble dans

l’acétonitrile, solvant de réaction. C’est pourquoi l’ajout d’un agent de transfert de phase,

141 Lopez A., Moreno-Manas M., Pleixats R., Roglns A. Ethyl N-(diphenylmethylene)glycinate as anionicglycine equivalent. Monoalkylation, dialkylation and Michael additions under solid-liquid phase-transfertcatalysis. Tetrahedron 1996, 52, 8365-8386.

86

Bu4N+I-, est nécessaire afin de faciliter l’obtention de cet anion. Après vingt quatre heures de

reflux en présence du bromure 27, le composé 34 est isolé avec un rendement de 80%.141

L’imine 34 est alors hydrolysée dans un mélange éther / acide chlorhydrique 1N par

simple agitation à température ambiante pendant trois heures. La benzophénone libérée est

soluble dans l’éther, il suffit de laver la phase aqueuse à l’éther et d’éliminer ensuite l’eau

pour obtenir 35 sous forme de sel de manière quantitative.124

Recommence alors une série de protection / déprotection de ce sel afin d’obtenir la

plate-forme 37 sur laquelle nous pourrons coupler notre chaîne peptidique. La fonction amine

du composé 35 est protégé tout d’abord par un groupement Boc avec un rendement 82%.138

L’ester éthylique 36 est alors saponifié en présence de soude 1N dans du méthanol et l’acide

libre 37 est obtenu avec un rendement de 92%.126

Une étape de couplage peptidique identique à celle précédemment utilisée conduit au

produit 38, comportant une amine protégée par un groupement Boc, avec un rendement de

94%. L’hydrolyse est réalisée dans de l’acétate d’éthyle saturé en acide chlorhydrique pour

donner quantitativement le sel 39, plate-forme nécessaire à la fixation de la fonction

phosphonate.126

A ce stade, l’entrée du groupement porteur de l’atome de phosphore est maintenant

réalisable. En effet l’addition nucléophile de cette amine, la base ayant été libérée par de la

diisopropyléthylamine, sur la solution contenant le triflate 33 se fait à température ambiante

avec un rendement modéré de 40%.126

Il ne nous reste plus qu’à déprotéger complètement ce composé pour obtenir la

molécule de référence (±) 1. Tout d’abord, une saponification a lieu en présence de soude 1N

(3,1 équivalents) dans du méthanol afin de déprotéger l’ester méthylique et un des

groupements méthoxyles du phosphonate. Le mélange réactionnel est alors concentré et

resolubilisé dans du dichlorométhane en présence de diisopropyléthylamine. Du bromure de

87

triméthylsilyle est ensuite ajouté afin de déprotéger totalement le phosphonate pour conduire

au produit (±) 1 avec un rendement de 20%.126

2.2.1.6 : Explication des problèmes rencontrés :

Lors du passage du composé 39 au composé 40, on note que le rendement n’est pas

très élevé. Ceci peut être lié à plusieurs facteurs. Tout d’abord, nous avons remarqué que cette

réaction n’est pas totale et ce malgré l’emploi d’un excès de la solution de triflate 33. Comme

l’amine libre du composé 39 et le composé 40 ont des pouvoirs migratoires très proches et

sont de plus assez polaires, l’obtention de 40 nécessite une purification par chromatographie

sur colonne de silice assez laborieuse.

Nous avons imaginé une étape chimique supplémentaire permettant de séparer le

produit 40 du réactif 39. En effet, en protégeant les fonctions amines de ces deux produits par

un groupement Boc, nous pouvons espérer diminuer la polarité des deux composés et surtout

augmenter l’écart de leur pouvoir migratoire. Cette technique s’est avérée concluante mais

surprenante (schéma 6)

88

NH

NH

O

FF

NH

OO

OPO

MeOOMe

NH

NH

O

FF

NH

OO

OPO

MeOOMe

NH

NH

O

FF

NH

OOH

OO

O

NH2NH

O

FF

NH

OOH

O40

+


4038

+

39

Schéma 6 : Purification du composé 40.8

En fait, seule l’amine primaire 39 réagit pour donner l’amine protégée 38. L’amine

secondaire, porteuse du groupement phosphonate, ne réagit absolument pas avec le Boc2O

même en large excès et dans des conditions drastiques de protection. Nous avons essayé

plusieurs méthodes (changement de solvant, ajout de DMAP, chauffage,…) mais aucune n’a

permis d’obtenir l’amine secondaire protégée. Cela nous a intrigué et nous avons décidé de

faire une étude physico-chimique dont nous parlerons ultérieurement. Néanmoins cette

constatation est intéressante car cela nous permet effectivement de mieux séparer les deux

produits et surtout aucune déprotection n’est à rajouter pour l’obtention du composé 40.

89

Un autre point faible de notre synthèse provient du triflate 33 qui n’a pas été

proprement isolé. Nous avons décidé de procéder en deux étapes distinctes142 plutôt qu’en une

« one-pot » (schéma 7).

Schéma 7 : Synthèse du triflate.

L’alcool 41 est obtenu avec un rendement de 90%, il est isolé et purifié par

chromatographie sur colonne de silice.142 Puis nous sommes parvenu à isoler le triflate 33

avec un rendement de 83% après une série de lavages rapides à froid et évaporation du

dichlorométhane. Nous avons pu le caractériser par RMN et l’obtenir avec un rendement

global de 75%.142 Il est par contre nécessaire de conserver le triflate au congélateur.

La dernière étape, correspondant à la déprotection totale et à la mise en forme de la

molécule, a été réalisée par hydrolyse en milieu acide chlorhydrique 6N à reflux pendant deux

heures. C’est cette technique qui sera utilisée pour obtenir les prochains composés.

2.2.2 : Travaux pour l’étude de relations structure-activité:

2.2.2.1 : Amélioration de notre schéma de synthèse générale :

Finalement, nous avons procédé à quelques changements dans notre schéma de

synthèse (schéma 8) afin d’essayer de résoudre les problèmes rencontrés lors de l’obtention de

la molécule (±) 1.

142 Kehler J., Henriksen U., Vejbjerg H., Dahl O. Synthesis and hybridization properties of an acyclic achiralphosphonate DNA analogue. Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 315-322.

P HO

MeOOMe

PO

MeOOMe

OSO2CF3PO

MeOOMe

OHParaformaldehyde

2,6-lutidineCH2Cl2

83%

Et3N90%

(CF3SO2)2O

41 33

90

Schéma 8 : Amélioration de l’étape de déprotection finale.124,126,138,139,141,143,144

Nous nous sommes alors intéressé dans un premier temps à la chaîne aralkyle

occupant la position P1’ de la molécule de référence. Les molécules 2 et 3 ont été synthétisées

en tenant compte de ces changements et la molécule 4 selon le premier schéma réactionnel.

2.2.2.2 : Variation autour de la position P1’ :

143 Solladié-Cavallo A., Schwarz J. A four-step, highly enantioselective synthesis and enzymatic resolution of3,4-dichloro-phenylalanine. Tetrahedron Asymmetry 1994, 5, 1621-1626.144 McKillop A., Taylor R. J. K., Watson R. J., Lewis N. An improved procedure for the preparation of theGarner aldehyde and its use for the synthesis of N-protected 1-halo-2-(R)-amino-butenes. Synthesis 1994, 31-33.

NO

ON

O

O

R

NH2O

O

R

NH

O

O

R

O

O

NH

OH

O

R

O

O

NH

NH

O

R

O

O

R'

NH2NH

O

R

R' NH

NH

O

R

PO

MeOOMe

R' NH

NH

O

R

PO

OHOH

R'

25

RX, tBu4NIK2CO3, CH3CN

HCl,

HCl 1NEt2O


NaOH 1NMeOH

HCl, H2N-R'BOP, NMM, DMF

HCl gazAcOEt

HCl,

(MeO)2OPCH2OSO2CF3 33 DIPEA, CH2Cl2

HCl 6N

91

2.2.2.2.1 : Synthèse de la molécule 2:

Dans ce produit, nous avons introduit un résidu aryle à la place de la triple liaison. Il a

suffit de remplacer le bromure 27 par le 4-phényl-1-chlorobenzyle (schéma 9).

Schéma 9 : Obtention du composé 2.124,126,141,143,144

Au niveau de la synthèse de ce composé, l’obtention de l’imine, son hydrolyse et

l’introduction du groupement porteur de l’atome de phosphore ont données respectivement

des rendements de 80, 91 et 56%.

NH2

OH

ONH2

O

ON

O

O

NO

ONH2

O

ONH

O

OPO

MeOOMe

NH

OH

OPO

OHOH

Cl

HCl,

HCl,

Chlorured'acétyle

MeOH Benzophénone imine

CH2Cl2, 80%

Bu4NI, K2CO3CH3CN


HCl 6N44%

99%

72%

91%56%

42 43

44

4546

2

HCl

HCl 1NEt2O

92

La nouvelle réaction utilisée pour la synthèse du chlorhydrate de l’ester méthylique de

la glycine 42 est concluante.144 Le rendement obtenu est du même ordre que ceux obtenus par

l’utilisation du chlorure de thionyle et la chimie mise en jeu est beaucoup plus douce.

L’alkylation se déroule normalement, le produit de couplage 44 étant isolé avec un rendement

de 72% malgré l’utilisation d’un chlorure moins favorable que le bromure.141

L’utilisation du triflate 33 purifié nous a bien permis d’augmenter le rendement de

l’étape d’insertion de ce composé sur la plate-forme 45.126 Ainsi, on a purifié par

chromatographie sur colonne de silice le composé 46 avec un rendement de 56% et ce, après

la protection par un Boc de l’amine primaire 45, comme précédemment (cf. p. 82).

Enfin, la nouvelle étape de déprotection en milieu acide nous a permis d’obtenir de

meilleurs rendements malgré les conditions drastiques. Le chlorhydrate 2 a été obtenu avec un

rendement global de 13%.143


Afin de vérifier si l’encombrement et/ou les interactions liés à la présence d’un résidu

biphényle étaient importants, le composé 3 a été synthétisé (schéma 10).

Ce produit est obtenu en trois étapes à partir de la phénylalanine. Une protection de

l’acide sous forme d’ester méthylique en présence de chlorure d’acétyle dans du méthanol est

utilisée pour conduire au chlorhydrate 47, isolé quantitativement après trituration dans de

l’éther diéthylique.144 L’addition de ce dernier sur le triflate 33, en milieu basique aboutit au

phosphonate 48 après purification par chromatographie sur colonne de silice avec un

rendement de 49%.126 Cet adduit est déprotégé à reflux dans de l’acide chlorhydrique 6N pour

obtenir l’acide phosphonique 3 avec un rendement de 39%.143 La molécule 3 est ainsi

synthétisée avec un rendement global de 19%.

93

Schéma 10 : Obtention du composé 3.124,143,144


Etant donné que les produits 2 et 3 ne portent qu’un acide carboxylique en position

P2’, nous avons synthétisé la molécule 4 afin de pouvoir comparer les résultats

pharmacologiques de ces ligands avec la molécule (±) 1.

Pour obtenir ce nouveau ligand, nous sommes partis du chlorhydrate 35 (schéma 11).

Nous voyons que la chimie mise en jeu pour obtenir ce composé est similaire à celle utilisée

NH2OH

ONH2

O

O

NH

O

OPO

OON

HOH

OPO

OHOH

HCl,

HCl

47

483

Chlorured'acétyle

MeOH

100%

HCl 6N39%

(MeO)2OPCH2OSO2CF3 33 DIPEA, CH2Cl2

49%

94

pour la référence (±) 1. Ce sont d’ailleurs à nouveau les mêmes étapes limitantes que nous

retrouvons.

Schéma 11 : Synthèse de la molécule 4.126

Une fois les molécules 2, 3 et 4 obtenues, nous avons alors accès à la plate-forme 45

(schéma 9) à partir de laquelle nous pouvons soit oeuvrer directement sur la fonction

chélatante soit, après un jeu de protections-déprotections obtenir une nouvelle plate-forme

nous permettant alors de travailler sur la position P2’ (schéma 12).

Pour obtenir le composé 51, nous sommes partis de la plate-forme 45 sur laquelle nous

avons d’abord protégé la fonction amine par un groupement Boc, par action du Boc2O dans

du dichlorométhane en milieu basique (présence de triéthylamine) et en présence d’une

NH2O

O

F F

NH

O

O

FF

PO

MeOOMe

NH

OH

O

FF

PO

OHOH

HCl,35 49


1) NaOH 1N, MeOH2) TMSBr, DIPEA, CH2Cl23) H2O 21%

4

37%

95

quantité catalytique de DMAP pour accélérer la réaction. L’amine protégée 50 est obtenue

après purification par chromatographie sur colonne de silice en deux heures avec un

rendement de 83%.138 L’étape suivante est une saponification de l’ester méthylique pour

obtenir l’acide carboxylique 51 avec un rendement de 92%.126

Schéma 12 : Variations possibles à partir de la plate-forme 45.126,138,145

Nous avons choisi d’utiliser le composé 45 pour réaliser des variations sur la fonction

chélatante du zinc.

2.2.2.3 : Etude de la fonction chélatante :

145 Takenouchi K., Tabe M., Watanabe K., Hazato A., Kato Y., Shionoya M., Koike T., Kimura E. Novelpendant-type macrocyclic bifunctional chelating agents: (carboxymethyl)amino derivatives of 2-(4-nitrobenzyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N'',N'''-tetraacetic acid and their complex formation with yttrium(III). J.Org. Chem. 1993, 58, 6895-6899.

NH2O

O

NH

O

O

RNH

O

OO

O

NH

OH

OO

O

NH

NH

OO

O

R'

HCl,

451) Et3N, DMF

2) RBr, Et3N, DMF

50

51


83%

NaOH 1N, MeOH 92%

BOP, NMMDMF

R'-NH2

96

Cinq composés ont été synthétisés pour cette étude, ceux-ci pouvant être classés dans

deux groupes distincts, les uns portant un acide carboxylique en position P2’, les autres

portant une chaîne aminée. Nous allons donc commencer par décrire la synthèse du premier

groupe.

2.2.2.3.1 : Synthèse des produits porteurs d’un acidecarboxylique en position P2’ :

Nous avons décidé de remplacer le groupement phosphonate respectivement par une

fonction acide hydroxamique et par une fonction acide carboxylique à partir de la plate-forme

45, point de départ pour l’obtention des molécules 5 et 6 (schéma 13).

Schéma 13 : obtention des acides hydroxamique et carboxylique 5 et 6.126,143,145,146,147

146 Dolence E. K., Lin C. E., Miller M. J., Payne S. M. Synthesis and siderophore activity of albomycin-likepeptides derived from N5-acetyl-N5-hydroxy-L-ornithine. J. Med. Chem. 1991, 34, 956-968.

NH2O

ONH

O

O

O

O

NH

OH

O

OH

O

NH

O

O

OH

O

NH

OH

O

NH

O

OH

NH

O

O

NH

O

O

NH

OH

O

NH

O

O

HCl, HCl,

TFA,

45 52

53

5

6

1) Et3N, DMF

2) t-butylbromoacétateEt3N, DMF, 75%

HCl 6N

TFA, CH2Cl2100%

BnONH2, HCl

BOP, NMMDMF, 85%54

55

NaOH 1N, MeOH93%

Pd / BaSO4, H2

MeOH, 98%

55%

97

Pour ce faire, le chlorhydrate 45, est mis en réaction avec le t-butylbromoacétate en

milieu basique pour donner le dicarboxylate 52 protégé par un ester tert-butylique et

méthylique. Ce couplage se fait avec un rendement de 75% après purification par

chromatographie sur colonne de silice.145

L’intérêt d’avoir deux groupements protecteurs orthogonaux sur cet intermédiaire

réside dans le fait de pouvoir les déprotéger de manière sélective. En effet, si l’on utilise les

conditions de déprotection finale de nos molécules, à savoir deux heures de reflux dans de

l’acide chlorhydrique 6N, nous obtenons l’acide carboxylique 6 sous forme de chlorhydrate

avec un rendement de 55%143 et un rendement global de 40% à partir de la plate-forme 45.

Par contre, en utilisant des conditions acides plus douces, comme un mélange 50 / 50 d’acide

trifluoroacétique (TFA) et de dichlorométhane, seul l’ester tert-butylique est déprotégé pour

donner l’intermédiaire 53 sous forme de sel de TFA de manière quantitative après trituration

dans l’éther, ces conditions étant trop douces pour toucher l’ester méthylique.146

A partir de ce produit, nous pouvons faire un couplage entre l’acide obtenu et le

chlorhydrate de la O-benzylhydroxylamine. Cette réaction est faite dans les conditions

classiques de couplage peptidique, c'est-à-dire en utilisant le BOP comme agent de couplage.

Nous obtenons le composé 54, précurseur de l’acide hydroxamique désiré avec un rendement

de 85% après purification par chromatographie sur colonne de silice.126

Ce composé est encore une fois doublement protégé par un groupement benzyle sur la

fonction acide hydroxamique et un ester méthylique sur la partie acide carboxylique. Nous

avons choisi de saponifier d’abord cette molécule dans le but d’obtenir uniquement la

fonction acide hydroxamique protégée. L’acide carboxylique 55 est obtenu avec un

rendement de 93%.126

147 Reichelt A., Gaul C., Frey R. R., Kennedy A., Martin S. F. Design, synthesis, and evaluation of matrixmetalloprotease inhibitors bearing cyclopropane-derived peptidomimetics as P1’ and P2’ replacements. J. Org.

98

Enfin, nous avons utilisé une hydrogénation catalytique en présence de palladium

désactivé par du sulfate de baryum pour obtenir l’acide hydroxamique déprotégé 5 avec un

rendement quasi quantitatif et un rendement global à partir de la plateforme 45 de 60%.147

Nous avons synthétisé deux nouveaux produits qui n’ont plus pour groupement

chélatant du zinc un acide phosphonique mais un acide carboxylique ou un acide

hydroxamique, ce qui nous donnera des éléments de réflexion sur les caractéristiques de ces

fonctions vis-à-vis de l’enzyme de conversion de l’endothéline.

Afin d’approfondir les résultats obtenus vis-à-vis du groupement chélatant, trois autres

produits ont été synthétisés dans cette série portant respectivement un acide phosphonique (7),

un acide hydroxamique (8) et un acide carboxylique (9) (fig. 25).

2.2.2.3.2 : Synthèse des produits porteurs d’une chaîne aminéeen position P2’ :

Figure 25 : ligands 7,8 et 9.

Pour la synthèse de ces trois produits, nous sommes partis du carbamate 50

préalablement décrit afin d’obtenir une nouvelle plateforme, notée 57, portant la chaîne

aminée désirée (schéma 14).

Chem. 2002, 67, 4062-4075.

NH

N

O H

HH

OH

ONH

O

OHNH

N

O H

HH

OH

OOH

ONH

N

O H

HH

OH

OPO

OHOH

987

HCl

99

Schéma 14 : Synthèse de la plateforme 57.126,146

Nous pouvons coupler l’acide 51 sur le sel que nous a fournit le laboratoire Servier

dans les conditions de couplage précédemment utilisées (BOP, NMM, DMF). Ce couplage se

déroule de manière similaire aux autres couplages déjà effectués et nous conduit au produit

protégé 57 avec un rendement après purification par chromatographie sur colonne de silice de

72%.126 Nous avons à ce stade une espèce doublement protégée à la fois par un Boc sur la

NH

OH

OO

O

NH

N

OO

O

H

HH

O

O

NH2N

O H

HH

O

O

NHH

H

H

O

O

5156

57

TFA,

BOP, NMMDMF72%

APTS

TFACH2Cl2 98%

100

partie N-terminale et par un ester benzylique sur la partie C-terminale. Ceci nous permet la

déprotection sélective de l’amine pour obtenir le sel 57 en présence d’acide trifluoroacétique

dans du dichlorométhane. Ce trifluoroacétate est isolé par trituration dans de l’éther

diéthylique avec un rendement quasi quantitatif.146 Le rendement global à partir de la

plateforme 51 est de 70%.

Nous avons tout d’abord synthétisé l’acide phosphonique 7 à partir de cette nouvelle

plateforme (schéma 15).

Schéma 15 : Obtention de l’acide phosphonique 7.126,143,148

148 Park J. D., Kim D. H., Kim S. J., Woo J. R., Ryu S. E. Sulfamide-based inhibitors for carboxypeptidase A.Novel type transition state analogue inhibitors for zinc proteases. J. Med. Chem. 2002, 45, 5295-5302

PO

OO

OTf

NH2N

O H

HH

O

O NH

N

O H

HH

O

OPO

OO

NH

N

O H

HH

OH

OPO

OHOH

NH

N

O H

HH

OH

OPO

OO

TFA, DIEACH2Cl2

41%

33

HCl 6N33%

57 58

759

Pd / C, MeOH93%

HCl

101

Pour obtenir la molécule 7, trois étapes sont mises en jeu, à savoir une substitution

nucléophile sur le triflate 33 en milieu basique, une déprotection de l’ester benzylique par

hydrogénation catalytique et une étape de déprotection finale dans de l’acide chlorhydrique.

Le résultat obtenu pour l’entrée du triflate 33 sur l’amine 57 est celui attendu. Après

purification, le phosphonate 58 est isolé avec un rendement 41%.126 L’hydrogénation

catalytique en présence de palladium sur charbon conduit à l’acide carboxylique 59 avec un

rendement de 93%.148 Enfin, l’étape de déprotection finale permet d’isoler le produit 7 avec

un rendement de 33%.143

Nous avons synthétisé cet acide phosphonique à partir de la plateforme 57 avec un

rendement global de 13%.

L’acide hydroxamique 8 et l’acide carboxylique 9 sont obtenus de manière similaire

(schéma 16 et 17).

102

NH2N

O H

HH

O

O NH

N

O H

HH

O

OO

O NH

N

O H

HH

O

OOH

O

NH

N

O H

HH

O

ONH

O

ONH

N

O H

HH

OH

ONH

O

OH

BrO

O

57

TFA,

60

61

TFA

628

Et3N, DMF82%

TFACH2Cl2

BnONH2, HClBOP, NMM

DMF77%

Pd / BaSO4H2, MeOH

100%

94%

Schéma 16 : Obtention de l’acide hydroxamique 8.126,145,146,147

103

NH2N

O H

HH

O

ONH

N

O H

HH

O

OO

O

NH

N

O H

HH

OH

OOH

O

BrO

O

57

TFA,

63

9

Et3N, DMF86%

Pd / BaSO4H2, MeOH

97%

Schéma 17 : Obtention de l’acide carboxylique 9.145,147

A partir de la plateforme 57, nous pouvons synthétiser l’acide hydroxamique 8 en

quatre étapes. Tout d’abord, une alkylation est utilisée afin de greffer l’espaceur nécessaire

sur notre synthon. L’amine 57 traitée par du tert-butylbromoacétate en milieu basique dans du

diméthylformamide conduit au composé 60 avec un rendement de 82%.145 L’étape suivante

est une déprotection de l’ester tert-butylique obtenu conduisant à l’acide carboxylique 61

après trituration dans l’éther diéthylique de manière quantitative sous forme de

trifluoroacétate.146 Un couplage de type peptidique est mis en jeu afin de greffer la O-

benzylhydroxylamine sur le sel 61 en présence de BOP. L’acide hydroxamique 62 protégé par

une fonction benzyle est ainsi obtenu avec un rendement de 77%.126 Une déprotection par

104

hydrogénation catalytique en présence de palladium sur sulfate de baryum produit l’acide

hydroxamique 8 avec un rendement de 94%.147 Ce composé est donc synthétisé à partir de la

plateforme 57 avec un rendement global de 60%.

De manière similaire, l’acide carboxylique 9 a été obtenu en deux étapes à partir de la

plateforme 57. Dans ce cas le bromoacétate de benzyle est utilisé comme alkylant à la place

du bromoacétate de tert-butyle conduisant à l’intermédiaire 63 avec un rendement de 86%.15

La protection des deux acides carboxyliques est identique dans le cas du produit 63

contrairement au produit 60. Une déprotection globale de ce diacide par hydrogénation

catalytique donne l’acide carboxylique 9 avec un rendement de déprotection de 97%147 et un

rendement global à partir de la plateforme 57 de 85%.

Les résultats pharmacologiques, qui seront détaillés dans le chapitre III, obtenus pour

ces ligands ont conduit à la conclusion que dans le cas de cette famille de produit, c’est la

fonction acide phosphonique qui est favorable à l’affinité pour l’ECE. C’est pourquoi nos

autres ligands seront pour la plupart des composés portant cette fonction.

Une fois ces produits obtenus, nous nous sommes naturellement intéressés à la

position P2’ sur laquelle nous pouvons introduire des variations à partir du carbamate 52

(schéma 12).

2.2.2.4 : Etude de la position P2’ :

Pour mener à bien cette étude, trois séries de composés ont été mis en œuvre, à savoir

un premier groupe de molécules portant la chaîne aralkyle de la molécule de référence, un

second groupe constitué de composés n’ayant pas de partie C-terminale et enfin un troisième

comprenant des produits portant une chaîne aminée sur cette position. Nous allons donc voir

la synthèse de ces différents ligands.

105

2.2.2.4.1 : Composé porteur de la chaîne aralkyle :

Dans un premier temps, une variation a été faite sur le squelette de la molécule (±) 1.

Dans le composé 10, la chaîne peptidique a été remplacée par une chaîne linéaire de même

longueur, ceci dans le but de déterminer l’influence des fonctions amide et de l’acide

carboxylique terminal (schéma 18).

Schéma 18 : Synthèse du ligand 10.126,136,139

NH

OH

O

FF

O

O

NH

NH

O

FF

O

OO

O

NH2NH

O

FF

O

O

NH

NH

O

FF

O

OPO

MeOOMe

NH

NH

O

FF

OH

OPO

OHOH

NH2 OH

O

NH2 O

O

HCl,

37

6667

10

Composé 64BOP, NMM, DMF

88%

HCl 1N97%


42%

1) NaOH 1N, MeOH2) TMSBr, DIPEA, CH2Cl23) H2O 25%

65

HCl,

SOCl2MeOH

96%64

106

Nous voyons que la chimie mise en jeu pour obtenir ce composé est identique à celle

utilisée pour la synthèse de la molécule de référence.

2.2.2.4.2 : Composés sans partie C-terminale :

Plusieurs des ligands précédemment décrits ont un acide carboxylique dans la position

P2’. Afin d’évaluer l’intérêt de cette fonction, nous avons décidé de synthétiser trois composés

11, 12 et 13 qui en sont dépourvus (schéma 19).

Schéma 19 : Synthèse des composés 11, 12 et 13.126,143

P OTfO

OO

P NH

OO

OP NH

OO

O

P NO

OO N

P NO

OHOH N

P NH

OOH

OH P NH

OOH

OH

NNH

NH2

NH2

2 HCl,HCl,

HCl,

33

68 69 70

1211

13

HCl 6N48%

HCl 6N51%

HCl 6N45%

DIEACH2Cl2

52%

DIEACH2Cl2

47%

DIEACH2Cl2

49%

107

En fait les molécules 11, 12 et 13 sont obtenus assez rapidement en deux étapes à

partir d’amines commerciales et du triflate 33, en présence de diisopropylamine avec des

rendements compris entre 47 et 52%.126 Afin de pouvoir chromatographier ces intermédiaires,

nous avons protégé les amines primaires résiduelles n’ayant pas réagit avec du Boc2O de

manière à obtenir une meilleure séparation, les esters diméthyliques des acides phosphoniques

11 à 13 ne réagissant pas en présence de cette anhydride.146 Enfin, il nous suffit alors de

déprotéger ces synthons par reflux dans une solution d’acide chlorhydrique 6N durant 3

heures.143 Les acides phosphoniques 11, 12 et 13 sont isolés avec des rendements respectifs de

48, 51 et 45%. L’obtention de ces composés se fait donc avec des rendements globaux variant

de 22 à 25%.

2.2.2.4.3 : Produits portant une chaîne aminée :

La chaîne peptidique de la molécule de référence (±) 1 a été remplacée par des résidus

basiques. Ces chaînes permettent d’introduire des groupements aromatiques pour saisir

d’éventuelles interactions de type aryle-aryle. Les groupements aromatiques utilisés sont de

natures différentes, nous avons utilisé un groupement phényle conduisant uniquement à ce

type d’interaction ou un groupement pyrimidine pouvant en plus aboutir à des interactions de

type donneur-accepteur.

De même, la nature des groupements porteurs des fonctions amines a été diversifiée.

Nous avons introduit un groupement pipérazine afin d’obtenir des ligands rigides, un

groupement pyrrolidine ou encore une chaîne linéaire permettant une liberté

conformationnelle. Enfin, nous avons également fait varier la longueur des chaînes mises en

jeu afin de mieux comprendre la topologie de cette partie du site actif de l’ECE.

Cinq nouveaux ligands ont été synthétisés dans le cadre de cette étude (fig. 26).

108

Figure 26 : Ligands 14 à 18.

Intéressons nous maintenant à la synthèse de ces ligands. A partir de la

plateforme 51, les cinq précurseurs désirés peuvent être obtenus par une étape de couplage de

type peptidique utilisant des conditions opératoires classiques, à savoir du BOP comme agent

de couplage en milieu basique dans du diméthylformamide. Ainsi, les composés 71 à 75 sont

isolées avec des rendements variants de 76 à 83% (Schéma 20).126

NH

N

O

N

PO

OHOH

NH

NH

ON

N

O

POHOH

O

NH

N

O

N

PO

OHOH

NH

NH

OP NO

OHOH

NH

N

O

N

PO

OHOH

N

N

14

2 HCl3 HCl

15

16 17

2 HCl

18

2 HCl 2 HCl

109

Schéma 20 : Introduction d’une diversité au niveau de la position P2’ via la plateforme 51.126

Pour obtenir les molécules 14 à 18, les mêmes schémas réactionnels sont utilisés.

Trois étapes sont mises en jeu pour obtenir les produits finaux, à savoir une étape de

déprotection en milieu acide trifluoroacétique dans du dichlorométhane afin d’obtenir des

amines primaires sous forme de sel.146 Puis une substitution nucléophile sur le triflate 33 est

effectuée en milieu basique.126 Enfin, ces synthèses se terminent par une étape de déprotection

finale dans de l’acide chlorhydrique à reflux pour obtenir les composés désirés143 (Schéma 21

à 25).

NH

OH

OO

O

NH

N

OO

O N

NH

NH

OO

O

NN

O

NH

N

OO

O N

NH

NH

OO

O

N

NH

N

OO

O N N

N

NNH

NH2 NN

O

NNH

NH2 N

NNH

NN

5171

72

73

74

75

BOP, NMMDMF78%

3 HCl,BOP, NMM

DMF76%

BOP, NMMDMF83%

BOP, NMMDMF83%

BOP, NMMDMF80%

110

Schéma 21 : Synthèse de la molécule 14.126,143,146

Schéma 22 Synthèse de la molécule 15. 126,143,146

NH

N

OO

O N

NH2N

O

N

NH

N

O

N

PO

OO

NH

N

O

N

PO

OHOH

PO

OO

OTf

71 76

2 TFA,

77142 HCl,

TFACH2Cl2

97%

DIEACH2Cl2

46%33

HCl 6N

37%

PO

OO

OTf

NH

NH

OO

O

NN

O

NH2NH

ON

N

O

NH

NH

ON

N

O

POO

ONH

NH

ON

N

O

POHOH

O

3TFA,

3 HCl,

TFACH2Cl2

97%

DIEACH2Cl2

46%33

HCl 6N

37%

72 78

7915

111

Schéma 23 : Synthèse de la molécule 16. 126,143,146


NH2N

O

N

NH

N

O

N

PO

OO

NH

N

O

N

PO

OHOH

PO

OO

OTf

NH

N

OO

O N

80

2 TFA,

81162 HCl,

TFACH2Cl2

99%

DIEACH2Cl2

43%33

HCl 6N

41%

73

PO

OO

OTf

NH

NH

OO

O

N NH2NH

O

N

NH

NH

OP NO

OO

NH

NH

OP NO

OHOH

2 TFA,

TFACH2Cl2

91%

DIEACH2Cl2

51%33

HCl 6N

39%

74 82

8317

2 HCl

112


Pour tous ces composés l’étape de déprotection des amines conduit aux sels

correspondants (76, 78, 80, 82 et 84) qui sont obtenus avec des rendements variant de 91 à

99%.146 Les résultats obtenus pour l’entrée du triflate 33 sur ces amines sont ceux attendus.

Après purification, les phosphonates (77, 79, 81, 83 et 85) sont isolés avec des rendements

variants de 41 à 51%.126 Enfin, les étapes de déprotection finale permettent d’isoler les

produits 14 à 18 avec des rendements de l’ordre de 37%.143

Nous avons synthétisé ces molécules avec des rendements globaux de 13% à partir de

la plateforme 51. Comme un grand nombre de nos composés comporte une amine secondaire

en β du phosphore, possédant un atome d’hydrogène pouvant conduire à des liaisons

hydrogènes, il nous a semblé important de savoir si celui-ci avait un rôle dans l’activité

biologique.

NH2N

O

N N

N

NH

N

O

N

PO

OO

N

N

NH

N

O

N

PO

OHOH

N

N

PO

OO

OTf

NH

N

OO

O N N

N

84

2 TFA,

85182 HCl,

TFACH2Cl2

95%

DIEACH2Cl2

48%33

HCl 6N

38%

75

113

2.2.2.5 : Etude de l’amine basique :

Afin d’obtenir des informations, deux molécules ont été imaginées (Fig. 27).

Figure 27 : Composés 19 et 20.

Pour les synthétiser, nous avons tout d’abord essayé d’alkyler les amines secondaires à

partir des phosphonates correspondants. Mais cela n’est pas possible même dans des

conditions drastiques, ce que nous tenterons d’expliquer par le biais d’une étude physico-

chimique dans la partie suivante. Nous avons du le faire avant de mettre en place l’étape

d’addition nucléophile de nos amines sur le triflate 33. Nous avons adapté notre schéma de

synthèse (schéma 26) afin de préparer des amines secondaires porteuses soit d’un groupement

méthyle soit d’un groupement benzyle. Par contre, nous avons tout de même pu utiliser la

plateforme 50 précédemment décrite.

NOH

OPO

OHOH

NOH

OPO

OHOH1920

114

Schéma 26 : Synthèse des molécules 19 et 20.126,143,146,149

En effet à partir de cette plateforme, nous pouvons obtenir les amines respectivement

méthylées et benzylées notées 86 et 89. Pour ce faire, nous avons utilisé une méthode

classique mettant en jeu de l’hydrure de sodium dans du diméthylformamide en présence soit

149 Dinh T. Q., Du X., Armstrong R. W. Synthesis and conformational analysis of the multidrug resistance-reversing agent hapalosin and its non-N-methyl analog. J. Org. Chem. 1996, 61, 6606-6616.

NH

O

OO

O

NO

OO

O

NO

OO

O

NHO

O

NHO

O

NO

OPO

OO

NO

OPO

OO

NOH

OPO

OHOH

NOH

OPO

OHOH

PO

OO

OTfPO

OO

OTf

TFA,TFA,

5086

87

88

19

89

90

91

20

HClHCl

TFACH2Cl2

96%

DIEACH2Cl2

48%33

HCl 6N

42%

33

DIEACH2Cl2

43%

HCl 6N38%

TFACH2Cl2

94%

MeI, NaHDMF

BnBr, NaHDMF

97%92%

115

d’iodure de méthyle soit de bromure de benzyle. Les amines tertiaires 86 et 89 ont alors été

isolées avec de très bons rendements (92 et 97%).149 Celles-ci sont en fait protégées par un

groupement Boc que nous avons clivé en présence d’acide trifluoroacétique dans du

dichlorométhane permettant l’obtention des sels 87 et 90 de manière quasi quantitative.146

Nous avons alors pu coupler ces amines sur le triflate 33 en présence de diisopropylamine

dans du dichlorométhane comme pour les autres synthons déjà décrits. Cette étape reste une

des étapes limitantes de nos synthèses puisque les phosphonates 88 et 91 sont isolés avec des

rendements de l’ordre de 45%.126 Enfin, ces synthèses se terminent par la déprotection globale

de nos intermédiaires par chauffage à reflux dans de l’acide chlorhydrique 6N. Les

chlorhydrates 19 et 20 sont isolés avec des rendements moyens de 40%.143

2.2.2.6 : synthèse de composés « rétros » :

Dans cette série, nous souhaitions synthétiser trois molécules, notées 21, 22 et 23,

nous permettant de changer plusieurs paramètres simultanément (fig 28).

Figure 28 : Composés « rétros ».

NH

O

OHO

NH

ONH

O

NH

ONH

O

OH

NH

O

OHO

NH

O

21 22

23

116

Figure 29 : Composé 5.

En effet, en comparant les composés 5 (fig 29) et 22 par exemple, nous remarquons

plusieurs choses importantes. Tout d’abord, l’amine basique du composé 5 est remplacée par

une fonction amide aux propriétés complètement différentes. De plus, la chaîne occupant la

position P1’ se trouve déplacer d’un cran. Enfin, la partie C-terminale est occupée par un reste

acétyle au lieu d’un acide carboxylique ce qui change également les possibilités d’interactions

mises en jeu.

Tout d’abord, nous avons synthétisé l’acide carboxylique 21 et l’acide hydroxamique

22 qui sont de vrais candidats rétros. La synthèse de ces deux composés nous a donné l’idée

de synthétiser le composé 23 qui est un peu plus exotique. En fait, c’est une sorte de dimère

de notre molécule, qui, de par l’encombrement qu’il représente, peut nous fournir des

renseignements intéressants.

Mais intéressons nous maintenant à la synthèse de ces trois ligands (Schéma 27 et 28).

Celles-ci s’effectuent au départ de la plateforme 45.

NH

OH

O

NH

O

OH

5

117

Schéma 27 : Synthèse des dérivés « rétros » 21 et 22.126,147,150

L’amine 45 est acétylée en présence d’anhydride acétique en milieu basique dans du

dichlorométhane. L’intermédiaire 92 est ainsi obtenu avec un rendement de 95%.150 Cet

intermédiaire est alors saponifié pour conduire à l’acide carboxylique 93 avec un rendement

de 90%.126 A ce stade, un couplage peptidique est alors possible de la même manière que ceux

faits auparavant. Nous utilisons à nouveau le BOP comme agent de couplage en milieu

basique dans du diméthylformamide pour condenser le chlorhydrate d’ester méthylique de la

150Tsang K. Y., Diaz H., Graciani N., Kelly J. W. Hydrophobic cluster formation in necessary for dibenzofuran-based amino acids to function as β-sheet nucleators. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 3988-4005.

NH2O

ONH

O

O

O

NH

OH

O

O

NH

O

OO

NH

ONH

O

OHO

NH

O

NH

O

NH

ONH

O

O

NH

O

NH

ONH

O

OH

HCl,

45 92 93

9421

95

22

Anhydride acétique

Et3N, CH2Cl295%

NaOH 1N, MeOH

90%

HCl, Gly-OMeBOP, NMM

DMF85%

NaOH 1N, MeOH

95%

BnONH2, HClBOP, NMM

DMF82%

Pd / BaSO4, H2

MeOH, 91%

118

glycine sur l’acide 93. Nous obtenons le composé 94 avec un rendement de 85%.4 Celui-ci est

alors déprotégé pour conduire au composé désiré 21 par une saponification classique avec un

rendement de 95%.126 Le rendement global de la synthèse du produit 21 à partir de la

plateforme 45 est donc de 70%. Ce composé 21 se trouve être à la fois un intermédiaire utile à

l’obtention du composé 22 ainsi qu’un produit final à part entière.

Sa mise en réaction avec le chlorhydrate de la O-benzylhydroxylamine en utilisant à

nouveau le BOP comme agent de couplage conduit au composé 96 avec un rendement de

82%.126 Il ne nous reste ensuite qu’à déprotéger cet intermédiaire réactionnel par

hydrogénation catalytique dans du méthanol en présence de palladium sur sulfate de baryum

pour obtenir la molécule 21 avec un rendement de 91%.147 Le rendement global pour

l’obtention de ce produit à partir de la plateforme 45 est d’environ 50%.

Schéma 28 : Synthèse du dimère 23.126

L’obtention du composé 23 peut se faire à partir de l’intermédiaire 93. En effet, au lieu

de coupler le chlorhydrate de l’ester méthylique de la glycine, il suffit de remplacer celui-ci

par la plateforme 45 pour obtenir le dimère de cette plateforme sous forme protégée. Ce

couplage, utilisant les conditions opératoires déjà décrites préalablement, conduit à

NH

OH

O

O

NH

O

OO

NH

O

NH2O

O

NH

O

OHO

NH

O9396

BOP, NMMDMF NaOH 1N

MeOH

90%

HCl, 45

23

85%

119

l’obtention du synthon 96 avec un rendement de 85%.126 Une simple saponification est

ensuite utilisée pour déprotéger ce composé et conduire au produit final 23 désiré avec un

rendement de 90%. L’acide 23 est donc obtenu avec un rendement global à partir de la

plateforme 45 de 65%.126

2.2.3 : Conclusions :

Vingt trois composés ont été synthétisés durant ce travail de développement de

candidats potentiellement inhibiteurs de l’ECE. Nous avons apportés quelques améliorations à

la synthèse décrite dans la littérature pour l’obtention de la molécule de référence. En effet,

nous avons tout d’abord isolé et caractérisé par RMN le triflate 33 au lieu d’utiliser la solution

dans laquelle il était formé, ceci nous a permis d’améliorer sensiblement les résultats des

étapes mettant en jeu son couplage avec différentes amines.

De même, les réactions décrites pour la déprotection finale de nos produits n’étant pas

très efficace, nous avons mis en place des conditions plus drastiques, permettant une meilleure

mise en forme des sels finaux.

Enfin, afin de réussir à alkyler l’amine basique de la molécule de référence, nous

avons changé notre stratégie de synthèse. En effet, lorsque cette amine est liée au

phosphonate, il n’est apparemment plus possible de l’atteindre chimiquement parlant, nous

avons donc du le faire avant de condenser le triflate 33 sur nos intermédiaires. Nous allons

d’ailleurs essayer de mieux comprendre le manque de réactivité de cette amine par le biais

d’une étude physico-chimique qui sera détaillé ultérieurement. Ceci nous aidera dans un

premier temps au niveau de la synthèse de ce type de dérivés et pourra surtout peut être nous

donner des informations sur le site actif de l’enzyme de conversion de l’endothéline.

120

2.3 : Etude physico-chimique de molécules dérivées de nos produits :

Par le biais de cette étude faite en collaboration avec Hélène Dozol et Bernard Spiess,

nous avons voulu déterminer les pKa des fonctions portées par nos molécules et voir si des

interactions, expliquant la faible nucléophilie de l’azote en β du phosphonate, étaient mises en

jeu. Pour cela, nous avons choisi de faire un titrage potentiométrique de la molécule 14, suivi

d’un titrage par RMN 31P et 1H. De plus, afin de généraliser cette méthode, nous avons

préparé trois autres composés en essayant de diversifier les structures chimiques (Fig. 30).

Figure 30 : Composés titrés par potentiométrie, RMN 31P et 1H.

2.3.1 : Synthèse des trois composés utilisés pour cette étude :

Dans le cadre de cette étude, nous avons décidé de titrer la molécule 14 préalablement

synthétisée et trois autres produits respectivement notés 98, 100 et 105. La molécule 98

comporte un groupement phényle sur le carbone en α du phosphore ce qui nous permet

d’avoir un encombrement assez important dans le voisinage du phosphore. La molécule 100

ne comporte aucune contrainte contrairement au ligand 105 qui est une amine tertiaire

faiblement encombrée au lieu d’une amine secondaire comme dans les autres composés.

NH

N

O

N

PO

OHOH

NH

OH

OPO

OHOH

NH

OH

OPO

OHOH

NOH

OPO

OHOH

142 HCl

HCl HCl

HCl

98 100 105

121

Nous ne reviendrons pas sur l’obtention de la molécule 14. Par contre, comme les trois

autres produits ont été synthétisés uniquement dans le but de ce titrage, nous allons détailler

leur synthèse (Schéma 29 et 30).

Schéma 29 : Synthèse de la molécule 98124,143.

Afin d’obtenir la molécule 98, nous sommes partis du chlorhydrate de l’ester éthylique

de la glycine. Celui-ci est mis en réaction dans du dichlorométhane avec du benzaldéhyde en

présence de triéthylamine et de sulfate de sodium afin d’obtenir l’imine correspondante. Cette

dernière n’étant pas isolée, du triméthylphosphite et du BF3.OEt2 sont alors ajoutés afin

d’obtenir le phosphonate 97 avec un rendement de 41%.124 Il est alors chauffé à reflux dans de

l’acide chlorhydrique 6N pour conduire au chlorhydrate 98 avec un rendement global de

l’ordre de 18%.143

Pour synthétiser les ligands 100 et 105, nous sommes partis du chlorhydrate de l’ester

méthylique de la glycine. Le composé 100 est obtenu en deux étapes. Par contre, cinq étapes

sont nécessaires pour synthétiser le composé 105, ce qui est lié à la faible réactivité de l’amine

secondaire 99 vis-à-vis des alkylations. Mais remarquons que toutes ces séquences chimiques

ont déjà été utilisées auparavant.

NH2O

O NH

O

OPO

OO

NH

OH

OPO

OHOH

HCl,

97 98

1) BenzaldéhydeEt3N, Na2SO4

CH2Cl2

41%

HCl 6N

43%2) (MeO)3P, BF3. OEt2

122

Schéma 30 : Synthèse des molécules 100 et 105.126,138,143,145,146,149

Pour l’obtention du composé 100 à partir du chlorhydrate 42, nous avons du à nouveau

utiliser une étape d’addition nucléophile sur le triflate 33. Les conditions opératoires sont

exactement les mêmes que pour les synthèses déjà décrites. Le phosphonate 99 est obtenu

avec un rendement de 50%.126 Celui-ci est ensuite déprotégé selon la méthode habituelle, à

savoir chauffage à reflux dans de l’acide chlorhydrique 6N.143 Le chlorhydrate 100 est isolé

avec un rendement global à partir de la glycine de 18%.

De même, toujours à partir du chlorhydrate 42, nous pouvons synthétiser le composé

105. Il nous faut dans un premier temps protéger l’amine correspondante libérée en milieu

basique par un groupement Boc, en la mettant en réaction avec du Boc2O en milieu basique

dans du dichlorométhane.148 L’amine protégée 101 est isolée avec un rendement de 83%. Ce

composé est ensuite alkylé par l’iodure de méthyle en présence d’hydrure de sodium dans du

diméthylformamide. L’amine tertiaire 102 est obtenue avec un rendement de 89%.149 Suit

NH2OH

ONH2

O

ONH

O

O

O

O

NO

O

O

ONH

O

OPO

OO

NHO

O

NH

OH

OPO

OHOH

NO

OPO

OO

NOH

OPO

OHOH

PO

OO

OTf

PO

OO

OTf

HCl,

TFA,

HCl

HCl

42

99100

101

102

103104105

Chlorured'acétyle

MeOH

99%

33

33

DIEACH2Cl2

50%

DIEA, CH2Cl244%

HCl 6N

HCl 6N

37%

41%

TFACH2Cl2 96%

MeI, NaHDMF

Boc2O, Et3NDMAP, CH2Cl2

83%

89%

123

alors une étape de déprotection afin d’obtenir, avec un rendement de 96%, le sel de l’amine

103 par un traitement à l’acide trifluoroacétique dans du dichlorométhane.146 Nous pouvons à

nouveau coupler ce sel avec le triflate 33 pour obtenir le phosphonate 104 avec un rendement

de 44%.126 Ce composé est ensuite déprotégé dans les conditions habituelles pour conduire au

chlorhydrate 105 avec un rendement global à partir de la glycine de 12%.143

Une fois ces ligands obtenus, nous avons entrepris l’étude physico-chimique qui se

déroule en deux temps, à savoir une série de titrages potentiométriques des composés 14, 98,

100 et 105, suivie d’une série de titrage par RMN 31P et 1H.

2.3.2 : Titrage potentiométrique de nos ligands :

Ces titrages sont fait par mesure de pH après des ajouts réguliers (10 µl) de base

(KOD) dans une solution aqueuse des ligands. Leur intérêt réside dans le fait qu’ils nous

permettent tout d’abord de déterminer les points d’équivalence. En théorie, chaque

groupement phosphonate est capable de se protoner deux fois, chaque groupement aminé et

chaque groupement carboxylique une fois. En pratique, seule la première étape de protonation

est accessible dans le cas des groupements phosphonates. En effet, la seconde constante

étagée de protonation a une valeur de pKa trop faible pour être déterminée sur la zone de pH

utilisée lors de cette étude.

Puis, à partir de ces points d’équivalence, nous pouvons déterminer les constantes

macroscopiques de protonation des ligands à l’aide du logiciel Hyperquad 2000151,152, ce

logiciel affinant les constantes macroscopiques globales de protonation à partir des courbes

pH = f(VKOD).

151 Alderighi L., Gans P., Ienco A., Peters D., Sabatini A., Vacca A. Hyperquad simulation and speciation (hyss):a utility program for the investigation of equilibria involving soluble and partially soluble species. CoordinationChemistry Reviews 1999, 184, 311-318.

124

Les constantes de protonation permettent de définir la proportion des différentes

formes d’un acide ou d’une base ainsi que leur état d’ionisation prédominant, à une valeur de

pH donnée. En effet, de très faibles variations de pH peuvent engendrer d’importants

changements dans l’état d’ionisation d’une espèce acido-basiques, et plus particulièrement

aux alentours des différents points d’équivalence.

Pour les molécules biologiques, la connaissance de leurs propriétés acido-

basiques et de leurs états d’ionisation est primordiale pour évaluer la biodisponibilité et le

transport d’une substance à travers les membranes. D’autres facteurs tels les cinétiques

d’association ou de dissociation pour une enzyme, sont étroitement liées à la structure

électronique de la molécule active.

2.3.2.1 : Conditions opératoires :

Les solutions de ligand et de base (KOD) sont préparées le matin même en utilisant

D2O comme solvant et KCl (0,2M) comme sel de fond. Ces solutions sont également utilisées

pour les titrages RMN. La base est dosée par une solution d’hydrogénophtalate de potassium

dont la concentration est connue avec précision.

La chaîne de titrage utilisée est constituée d’une cellule thermorégulée (± 0,1°C) par

un bain thermostaté Haake DC1 à 37°C, d’une microélectrode de verre combinée de type

Ingold P/N 10 402 3522, dont le liquide de remplissage du compartiment de référence interne

est régulièrement renouvelé avec une solution de chlorure de potassium (KCl) 2,0 M,

connectée à un pH-mètre Tacussel Isis 20000 et d’une burette électronique Tacussel EBX2.

La microélectrode est étalonnée à l’aide d’une solution de pH 2 constituée de HCl 0,01 M et

KCl 0,19 M. Le tout est piloté par un PC.

152 Gans P., Sabatini A., Vacca A. Investigation of equilibria in solution. Determination of equilibrium constantswith the hyperquad suite programs. Talanta 1996, 43, 1739-1753.

125

Pour la préparation de 1,2 mL de solution des ligands à environ 3 mM, une masse

prédéterminée des ligands et de sel de fond (KCl) est dissoute dans 1,2 mL de D2O.

2.3.2.2 : Calcul des constantes macroscopiques de protonation :

Les ligands étudiés dans ce travail sont des aminophosphonates (AP) portant deux

amines et un phosphonate pour le ligand 14 et une amine, un phosphonate et un acide

carboxylique pour les ligands 111, 113 et 118. Ils sont susceptibles de se protoner selon

l’équilibre général suivant :

+− + yHAPp ( )−−ypy APH (1)

A cet équilibre correspond la constante thermodynamique globale de protonation 0yβ :

( )

)()()(0

−+

−−

= py

ypy

y APHAPH

β (2)

où (HyAP(p-y)-), (H+) et (APp-) désignent les activités des espèces correspondantes.

En introduisant un électrolyte-support à une concentration nettement supérieure à celle

des autres composés présents dans la solution, on peut rendre constante la force ionique de la

solution.

Dans des conditions de force ionique et de température données, on peut définir une

constante apparente globale de protonation βy :

( )[ ][ ] [ ]−+

−−

=py

ypy

yAPH

APH

.β (3)

où [HyAP(p-y)-], [H+] et [APp-] désignent les concentrations des espèces correspondantes.

Au lieu d’être envisagées de manière globale, les étapes de protonation peuvent être

considérées les unes après les autres selon l’équilibre général :

( )−+−−

+ + 11

ypy APHH ( )−−yp

y APH (4)

auquel correspondant les constantes apparentes successives ou étagées Ky :

126

[ ][ ][ ]−+−

−+

−−

= )1(1

)(

. ypy

ypy

y APHHAPH

K (5)

Le logarithme de la constante apparente de protonation Ky correspond au pKay, c'est-à-

dire au cologarithme de la constante apparente de dissociation.

En fait, tous ces calculs sont faits par ordinateur. En effet, le fichier de données obtenu

lors du titrage est traité dans un premier temps par le programme Equipot permettant de

trouver les volumes équivalents par calcul des points où la dérivée seconde s’annule. A partir

de ces volumes, nous pouvons déterminer la concentration en ligand (CL) et en acide (CH).

L’analyse de l’ensemble de ces données par le programme Hyperquad 2000 permet d’obtenir

les constantes βy et donc par soustraction les constantes Ky à l’aide de l’équation suivante :

∑=

=i

jji K

1loglog β (6)

2.3.2.3 : Titrage potentiométrique du ligand 14 :

Ce ligand est dosé par une solution de KOD 1,65 10-2 M .

VKOH (m l)0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

pH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

1 éq 2 équivalences

Figure 31 : Titrage du ligand 14 par KOD (KCl 0,2 M ; 100% D2O ; 37°C).

NH

N

O

N

PO

OHOH

2 HCl

127

Sur cette courbe, nous observons trois équivalences correspondant à la seconde

déprotonation du groupement phosphonate et à la déprotonation des deux amines.

Tableau 11 : Constantes macroscopiques calculées par Hyperquad 2000 pour le ligand 14.

y log Ky ∆log Ky

1 8,10 0,012 6,79 0,013 5,08 0,01

A partir de la courbe de titrage, nous pouvons calculer les constantes macroscopiques

de protonation à l’aide du logiciel Hyperquad 2000. Nous avons donc obtenus trois pKa qui

ont pour valeur 8,10 ; 6,79 et 5,08. Pour pouvoir attribuer avec certitude un pKa à une

fonction, il faut que la différence entre les deux constantes de protonation (par exemple log

K1-log K2) soit supérieure à deux unités logarithmiques. Ceci n’est donc pas possible dans

notre cas.

2.3.2.4 : Titrage potentiométrique des ligands 98, 100 et 105 :

Les ligands 98, 100 et 105 ont été dosés par des solutions de KOD de concentration

respective 1,87 10-2 M, 1,06 10-2 M et 1,06 10-2 M.

128

VKOD (m l)0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

pH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

1 équivalence 1 équivalence


VKOH (m l)0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30

pH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12



NH

OH

OPO

OHOH

HCl

NH

OH

OPO

OHOH

HCl

129

VKOD (m l)0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0

pH

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11



Dans le cas de ces trois ligands, seules deux équivalences sont obtenues, ce qui

signifie que l’acide carboxylique se trouve déjà déprotoné pour des valeurs de pH inférieures

à deux. Les deux équivalences obtenues correspondent donc à la seconde déprotonation du

groupement phosphonate et à celle de l’amine.

Tableau 12 : Constantes macroscopiques de protonation pour les ligands 98, 100 et 105

Ligand y log Ky ∆log Ky 98 1 9,62 0,02

2 5,81 0,03 100 1 10,25 0,03

2 5,85 0,07 105 1 9,57 0,04

2 5,38 0,07

Les constantes macroscopiques de protonation ont été calculées de la même manière

que précédemment et nous avons obtenus pour chaque ligand deux pKa ayant pour valeur

9,62 et 5,81 pour le composé 98, 10,25 et 5,85 pour le composé 100 et 9,57 et 5,38 pour le

NOH

OPO

OHOH

HCl

130

composé 105 correspondant à la déprotonation de l’amine et à la seconde déprotonation du

groupement phosphonate.

2.3.2.5 : Conclusion sur ces dosages potentiométriques :

Nous pouvons donc voir que ces quatre ligands se comportent de la même manière et

que les valeurs de pKa déterminées par potentiométrie à l’aide d’Hyperquad 2000 varient

d’un composé à l’autre mais restent dans des domaines assez proches. Aucune anomalie n’est

remarquée au niveau des valeurs de pKa obtenues, celles-ci étant conformes aux valeurs

classiques de chacune des fonctions prises isolément.

2.3.3 : Titrage potentiométrique suivi par RMN 31P et 1H de nos ligands :

Une procédure consisterait à mesurer le pH dans le tube après chaque ajout de base.

Celle-ci conduirait alors à une perte de solution sur l’électrode de mesure. Pour éviter cet

inconvénient, le même titrage est effectué deux fois. A partir d’une même solution initiale, un

premier titrage potentiométrique permet d’accéder aux valeurs de pH en fonction du volume

ajouté de base. En considérant que les mêmes ajouts de base dans la même solution initiale

aboutissent aux mêmes pH, un deuxième titrage est effectué en RMN. Les valeurs de pH sont

donc obtenues par correspondance avec les volumes. Les volumes de base ajoutés lors du

titrage RMN sont choisis de telle manière que l’écart maximum entre deux points soit de 0,3

unité pH, dans la mesure du possible.

Lors des titrages RMN, le volume initial est généralement de 0,5 mL. Nous avons

ajouté au milieu d’étude 5 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) afin d’éviter la

131

perturbation des spectres par d’éventuelles impuretés paramagnétiques, l’EDTA étant connu

pour ses propriétés complexantes vis-à-vis des cations métalliques.

2.3.3.1 : Conditions opératoires :

Deux séries de spectres RMN ont été nécessaires à cette étude, à savoir un spectre 31P

découplé du proton et un spectre 1H découplé du phosphore avec une présaturation du signal

résiduel de l’eau (HDO).

2.3.3.1.1 : RMN 31P :

Les spectres ont été enregistrés à 121,50 MHz sur un spectromètre à transformée de

Fourier Bruker de type DPX300. Les déplacements chimiques sont mesurés avec une

calibration par rapport à une référence externe d’acide orthophosphorique à 85% dont le

déplacement chimique est fixé à 0,00 ppm. Typiquement, les spectres sont acquis sur une

fenêtre spectrale de 10 ppm en utilisant un délai de 0,1 seconde entre chaque séquence dont

l’angle d’impulsion est π/2. Pour l’acquisition, 1024 points sont utilisés, ce qui correspond à

un temps d’acquisition de 0,4 seconde. Le traitement se fait sur un nombre de points double

de celui utilisé pour l’acquisition (2048) et une fonction exponentielle est appliquée avant la

transformation de Fourier.

2.3.3.1.2 : RMN 1H :

Les spectres ont été enregistrés à 300,13 MHz sur un spectromètre à transformée de

Fourier Bruker de type DPX300. En général, les spectres ont été acquis sur une fenêtre

132

spectrale de 12 ppm en utilisant un délai de trois secondes entre chaque séquence dont

l’impulsion est π/2. Pour l’acquisition, 4096 points ont été utilisés, ce qui correspond à un

temps d’acquisition de 1,14 seconde. Le traitement se fait sur un nombre de points double (8

K) de celui utilisé pour l’acquisition et une fonction exponentielle est appliquée avant la

transformation de Fourier.

2.3.3.2 : Calcul des constantes microscopiques de protonation :

Si les constantes macroscopiques de protonation permettent de prédire l’état

d’ionisation globale d’une molécule en fonction du pH, celles-ci ne permettent pas, dans le

cas d’aminophosphonates, de rendre compte de l’état de protonation au niveau de chaque

groupement fonctionnel présent. Pour avoir accès à ces données, il faut faire appel à un

schéma de protonation plus détaillé qui fait intervenir des constantes microscopiques qui

régissent le système d’un point de vue inframoléculaire, c'est-à-dire à un niveau inférieur à

celui de la molécule (fig. 36).

En suivant les déplacements chimiques du pic de résonance correspondants au noyau

31P ou ceux correspondant à nos fonctions aminés en série proton en fonction du pH, nous

pouvons obtenir une description précise de l’état d’ionisation de la molécule, groupement par

groupement.

Ainsi, le déplacement chimique observé obsiδ , à un pH donné, correspond à la moyenne

des déplacements chimiques des formes protonée et déprotonée, pondérées par leurs fractions

molaires. Si pi,δ et di,δ sont respectivement les déplacements chimiques des formes protonée

et déprotonée de la fonction en position i et si, pif , et dif , sont respectivement les fractions

molaires protonée et déprotonée de cette même fonction, alors nous obtenons la relation :

133

didipipiobsi ff ,,,, .. δδδ += (7)

En considérant la protonation des ces fonctions plutôt que leur déprotonation et

sachant que,

pidi ff ,, 1−= (8)

l’équation 7 devient alors : dipi

diobsi

pif,,

,, δδ

δδ

−

−= (9)

Pour ce calcul de micro-constantes, nous nous sommes uniquement intéressés au

composé 14 (Fig. 35). Dans ce cas, le schéma des micro-équilibres est assez compliqué

puisque nous comptons trois formes monoprotonées et trois formes biprotononées auxquelles

s’ajoutent la forme entièrement protonée (à gauche) et celle complètement déprotonée (à

droite). Douze constantes microscopiques (ki, kii’ et kii’i’’) décrivent ce schéma (Fig. 36).

NH

N

O

N

PO

OHOH 2 HCl,

1 2

3

Figure 35 : Ligand 14.

134

Lig

Lig

Lig

Lig

Lig

P12-

N2H+

N3H+

P1H-

N2H+

N3

Lig

P12-

N2

N3

Lig

P1H-

N2H+

N3H+

Lig

P12-

N2

N3H+

P12-

N2H+

N3

P1H-

N2

N3

P1H-

N2

N3H+

k2

k1

k3

k13

k123

k132

k321

k12

k21

k23

k31

k32

Figure 36 : Schéma des micro-constantes

Les micro-constantes sont reliées aux macro-constantes par les relations :

32111 kkkK ++==β (10)

223113221223113112212 kkkkkkkkkkkkKK ++=++==β

332113112223331112 kkkkkkkkkkkk ++=++= (11)

332113221223331221 kkkkkkkkkkkk ++=++=

332331221332331112 kkkkkkkkkkkk ++=++=

1231213213 kkkKKK ==β

123212132131 kkkkkk == (12)

321323132313321232 kkkkkkkkk ===

135

Les paramètres d’interaction entre les fonctions ionisables ainsi que les constantes

microscopiques sont calculés par une méthode basée sur une approche statistique développée

par Borkovec153.

2.3.3.3 : titrage RMN du ligand 14 :

2.3.3.3.1 : RMN 31P et RMN 1H :

pH2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

δ (ppm )

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

P1

Figure 37 : Courbe de déplacements chimiques RMN-31P fonction du pH pour le ligand 14.

La figure 37 présente la courbe de variation de déplacement chimique du noyau

phosphore en fonction du pH. Entre pH 4 et 7, le premier déplacement vers les champs faibles

correspond à la déprotonation du phosphonate et le second, pour des pH supérieur à 7, à la

déprotonation de l’amine en β du phosphore.

153 Borkovec M., Koper G. J. M. A cluster expansion method for the complete resolution of microscopicionization equilibria from NMR titrations. Analytical Chemistry 2000, 72, 3272-3279.

NH

N

O

N

PO

OHOH 2 HCl,

1 2

3

136

pH2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

δ (ppm )

2.0

2.4

2.8

3.2

3.6

4.0

4.4

4.8

5.2

7.6

8.0

CH3

CH2-P

CH2 x 2 Har

CH2-N

4 Har

Figure 38 : Courbe de déplacements chimiques RMN-1H fonction du pH pour le ligand 14.

Cette figure présente les courbes de déplacement chimique des différents protons du

ligand 14 en fonction du pH :

- les protons (CH2(P)) situés entre les noyaux de phosphore et d’azote sont sensibles à

la déprotonation du groupement phosphonate et de l’amine en β de celui-ci puisque ils se

déplacent deux fois vers les champs fort de 0,6 ppm environ, entre pH 4 et 8. A partir de pH

8, leur signal se dédouble, les protons ne sont plus magnétiquement équivalents ce qui laisse

penser qu’ils sont fortement affectés par la déprotonation de l’amine en β. Ce phénomène doit

être lié à une anisotropie du doublet de l’azote.

- les protons CH2 (CH2-N) de la pipérazine et les protons du groupement méthyle sont

sensibles à la déprotonation de l’amine de la pipérazine puisque ils se déplacent vers les

champs forts de 0,2 ppm à 0,4 ppm, partir de pH 7.

- le proton situé entre l’azote et la fonction amide est également sensible à la

déprotonation du groupement aminé en β du phosphore puisqu’il subit un reblindage à entre

pH 5 et 6 de l’ordre de 0,8 ppm. Malheureusement ce signal est partiellement masqué par le

signal résiduel de l’eau (HDO).

137

- les protons aromatiques semblent être relativement insensibles aux déprotonations

des groupements aminés puisqu’ils ne bougent que très peu sur tout le domaine de pH.

2.3.3.3.2 : Micro-constantes :

Le calcul des micro-constantes de protonation revient donc à résoudre les équilibres

donnés sur la figure 36.

Les constantes macroscopiques sont calculées par le programme Hypnmr 2000154 et

les constantes microscopiques à l’aide de la méthode développée par Borkovec et al.153 en

utilisant les courbes de déplacement chimique du groupement phosphonate et des protons du

groupement méthyle. Pour le calcul des constantes, nous avons supposé que le premier

déplacement vers les champs faibles du noyau 31P est lié à la déprotonation du groupement

phosphonate et le deuxième à la déprotonation de la fonction amine secondaire, déprotonation

qui se font de manière indépendantes.

Tableau 13 : Constantes de protonation pour le ligand 14.

y log Ky ∆log Ky i log ki ii' log kii’ ii'i" log kii’i"1 8,55 0,03 1 4,01 12 7,96 123 8,542 6,65 0,23 2 8,55 13 7,87 132 8,643 5,04 0,24 3 6,24 21 3,43 321 5,05

23 6,9231 5,6432 9,23

2.3.3.4 : Titrages RMN des ligands 98, 100 et 105 :

154 Frassineti C., Ghelli S., Gans, P., Sabatini, A. Moruzzi M. S., Vacca P. Nuclear magnetic resonance as a toolfor determining protonation constants of natural polyprotic bases in solution. Anal. Biochem. 1995, 231, 374-382.

138

Figure 39 : Ligands 98, 100 et 105.

2.3.3.4.1 : RMN 31P:

pH2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

δ (ppm )

8

9

10

11

12

13

14

15

Figure 40 : Courbe de déplacement chimique RMN-31P en fonction du pH pour le ligand 98.

NH

OH

OPO

OHOH

NH

OH

OPO

OHOH

NOH

OPO

OHOHHCl HCl

HCl

98 100 105

NH

OH

OPO

OHOH

HCl

139

pH2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

δ (ppm )

7

8

9

10

11

12

13

14


pH2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

δ (ppm )

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5


Les figures 40, 41 et 42 présentent trois courbes aux allures similaires qui décrivent un

déplacement vers les champs forts entre pH 3 et 7 résultant de la seconde déprotonation du

groupement phosphonate et d’un déplacement vers les champs faibles pour des pH supérieurs

à 8 résultant de la déprotonation de l’amine. Les seules différences entre ces trois courbes sont

liées aux variations de déplacement chimique lors de la déprotonation des fonctions

ionisables. En effet, pour le déplacement vers les champs fort entre pH 4 et 7, cette variation

est inférieure à 1 ppm pour le ligand 98 alors qu’elle est d’environ 2 ppm pour le ligand 100 et

NH

OH

OPO

OHOH

HCl

NOH

OPO

OHOH

HCl

140

de 1,5 ppm pour le ligand 105. De même, pour le déplacement vers les champs faibles pour

les pH supérieurs à 8, les variations sont de l’ordre de 5 ppm pour les ligands 98 et 100 alors

qu’elle est d’environ 3 ppm pour le ligand 105.

2.3.3.4.2 : RMN 1H :

pH2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

δ (ppm )

3.0

3.2

3.4

3.6

3.8

4.0

4.2

4.4

4.6

7.4

7.6

7.8

H arom

CH

CH2

Figure 43 : Courbe de déplacement chimique RMN-1H en fonction du pH pour le ligand 98.

pH2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

δ (ppm )

2.6

2.8

3.0

3.2

3.4

3.6

3.8

4.0

CH2 (CO)

CH2 (P)


NH

OH

OPO

OHOH

HCl

NH

OH

OPO

OHOH

HCl

141

pH2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

δ (ppm )

2.8

3.0

3.2

3.4

3.6

3.8

4.0

4.2

CH2(CO)

CH2(P)

CH3


Les figures 43, 44 et 45 présentent les courbes de déplacements chimiques des

différents protons RMN 1H des ligands 98, 100 et 105 en fonction du pH. Il en résulte pour les

trois ligands que :

- le (ou les) proton (CH(P)) (ou (CH2(P)) situé(s) entre le phosphonate et l’amine est

sensible à la déprotonation de ces deux fonctions puisque leurs signaux présentent deux

déplacements vers les champs forts entre pH 4 et 6 puis pour des valeurs de pH entre 8 et 10.

- les deux protons (CH2(CO)) situés entre l’amine et la fonction carboxylique, pour des

valeurs de pH supérieures à 4, sont uniquement sensibles à la déprotonation du groupement

aminé puisqu’ils se déplacent vers les champs forts à partir de pH 8.

Pour le ligand 98 (fig. 43), les cinq protons aromatiques semblent être insensibles à la

déprotonation du groupement phosphonate puisqu’ils sortent sous forme d’un singulet fin. Par

contre, à partir de pH 7, le signal s’élargit et se dédouble, il semblerait que ces protons soient

affectés par la déprotonation de l’amine.

NOH

OPO

OHOH

HCl

142

Pour le ligand 105 (fig. 45), les protons du groupement méthyle se déplacent vers les

champs forts à partir de pH 8,5 suite à la déprotonation de l’amine. Les protons CH2(CO) et

CH2(P) sont également sensibles à la déprotonation respective de la fonction carboxylique et

du groupement phosphonate pour des valeurs de pH inférieures à 3

.

2.3.3.4.3 : Constantes de protonation :

Tableau 14 : Constantes macroscopiques de protonation pour les ligands 98, 100 et 105.

Ligand y log Ky ∆log K 98 1 9,64 0,03

2 5,46 0,13 100 1 10,41 0,03

2 5,59 0,05 105 1 9,91 0,02

2 5,48 0,03

Les constantes macroscopiques de protonation (pKa) sont calculées avec l’aide du

logiciel HypNMR 2000 (tableau 14) à partir des courbes de déplacement chimique du

phosphore et du ou des protons CH ou CH2 situés entre le phosphore et l’azote.

Les constantes microscopiques ne sont pas calculées puisque le groupement

phosphonate et l’amine se déprotonent de manière totalement indépendante comme le montre

le calcul des constantes macroscopiques de protonation puisque la différence entre log K1 et

log K2 est supérieur à deux unités logarithmiques pour les trois ligands étudiés. Ainsi, dans

tous les cas, log K1 et log K2 se rapportent respectivement à la déprotonation de l’amine et du

groupement phosphonate.

143

2.3.4 : Conclusions de cette étude :

L’étude de ces quatre ligands montre qu’une forte interaction s’établit entre le

phosphonate et l’azote en β de celui-ci. En effet, les courbes de titrage par RMN 31P des

ligands 98, 100 et 105 sont similaires et présentent un reblindage suivi d’un déblindage et

celle obtenu pour le ligand 14 deux variations vers les champs faibles consécutives mais sur

toutes les courbes nous voyons l’effet de la déprotonation de l’amine en β du phosphore ce

qui témoigne d’une interaction électrostatique entre P et N telle une liaison hydrogène. Les

courbes de titrage en RMN 1H présentent des comportements classiques, à savoir des

déplacements vers les champs forts lors de la déprotonation des fonctions ionisables.

De plus, nous pouvons également remarquer que les macro-constantes calculées

(tableau 14) montrent que les groupements phosphonates des ligands 98, 100 et 105 ont une

basicité similaire alors que celui porté par le ligand 14 est un peu plus acide (tableau 13). De

plus si nous prenons le ligand 100 comme référence, nous remarquons que l’apport d’un

méthyl sur l’amine en β du phosphore ou d’un groupement phényl sur le carbone en α du

phosphore diminue la basicité respectivement de 0,5 unité logarithmique ou de 0,8 unité

logarithmique. Enfin cette amine est plus acide dans le cas du ligand 14.

Sur toutes les courbes correspondant aux titrages par RMN 31P, deux plateaux

apparaissent. Hors, lorsqu’un plateau est obtenu c’est qu’un unique état d’ionisation est mis

en jeu. Nous proposons donc pour cette étude deux états notés I et II se rapportant

réciproquement au premier et au second plateau (fig 46).

Figure 46 : Schéma interactionnel.

NO

OHPO

OHO

H

HN

O

OHPO

OO

H

H-+

-+

-

Etat I Etat II

144

Grâce à cette étude, nous comprenons donc mieux pourquoi il nous était,

chimiquement parlant, difficile d’atteindre ce genre d’amine secondaire aussi bien dans des

réactions de protection que dans des alkylations. En effet, la liaison hydrogène

intramoléculaire entre le phosphonate et l’amine limite donc la réactivité chimique de l’amine

basique. Il aurait été intéressant de faire cette étude sur des composés portant des groupements

méthoxyle sur le phosphore afin de mettre en évidence l’interaction causant la diminution de

nucléophilie des amines obtenue lors de nos synthèses (fig. 47). Comme ces études sont

menées en milieu aqueux, il aurait fallu changer nos synthèses pour obtenir des composés

solubles dans l’eau. Cependant, nous pensons que l’interaction décrite sur la figure 46 doit

également être mise en jeu dans le cas des phosphonates non déprotégés.

Figure 47 : Ligand non étudié.

Afin de conclure nos travaux, nous avons décidé de mettre en place une synthèse

rapide et efficace de β-aminophosphonate diversement substitué sur le carbone entre le

phosphore et l’azote. En effet, l’obtention d’une plateforme de ce type nous permettrait alors

de pouvoir envisager un nouveau point de diversité pour nos synthons. De plus, cela

permettrait aussi dans le cadre d’autres travaux un accès facile à une large palette d’acides

aminophosphoniques de manière simple et rapide.

P NOH

O

R'RO

OO H

H

+

Cl -

145

2.4 : Synthèse d’une plateforme β-aminophosphonate :

Pour ce faire, nous avons décidé d’utiliser une réaction tricomposante entre un

aldéhyde, un carbamate et un phosphite en présence d’un acide de Lewis (fig. 48) par analogie

à des travaux du laboratoire qui permettaient de synthétiser des α-aminoallènes à partir

d’aldéhyde.155

Figure 48 : réaction tricomposante.

De plus, d’autres travaux avaient été réalisés dans ce sens en mettant en jeu le même

genre de composés156,157.

Le principe de cette réaction tricomposante repose sur la réactivité de l’intermédiaire

acyl-iminium, noté B, qui est beaucoup plus électrophile que l’aldéhyde correspondant

(schéma 31). Cette espèce provient du bis-carbamate A et subit l’attaque nucléophile du

phosphite.

Schéma 31 : réaction tricomposante.

155 Billet M., Schoenfelder A., Klotz P., Mann A. A convenient procedure for the preparation of α-aminoallenesusing a three-component reaction of aldehyde, carbamate and propargylsilane. Tetrahedron Lett. 2002, 43, 1453-1456.156 Klepacz A., Zwierzak A. An expeditious one-pot synthesis of diethyl N-Boc-1-aminoalkylphosphonates.Tetrahedron Lett. 2002, 43, 1079-1080.

P HO

O

R1

R1O

PO

O

R1

R1O R2

NH

R3+ R2CHO + R3NH2

Acide de Lewis

solvent

R H

O

NH2 O

O

RNH

NH

CO2Bn

CO2Bn RN CO2Bn

H+

+R H

O

NH2 O

O

RNH

NH

CO2Bn

CO2Bn RN CO2Bn

H+

+

A B

146

2.4.1 : Présentation de la réaction mise en jeu :

2.4.1.1 : Intérêt de cette synthèse :

Tout d’abord, au regard de la littérature, la syntèse d’acide β-aminophosphoniques

semble relativement intéressante car elle permettrait d’accéder facilement à un large panel de

β-aminophosphonates alkylés en position α après déprotection par hydrogénation des

carbamates obtenus à l’issu de cette étape. Ceci permettrait donc d’obtenir facilement un

nombre important d’acides β-aminophosphoniques diversement substitués. De plus, les

conditions opératoires utilisées dans cette réaction tricomposante sont assez douces et les

temps de réaction mis en jeu assez courts ce qui n’est pas le cas dans les travaux déjà décrits.

Dans le cadre de ma thèse, ces plateformes nous permettraient d’obtenir un nouveau

point de diversité pour l’étude de relation structure-activité et donc de nouveaux composés.

Cela pourra alors nous servir à obtenir de nouveaux renseignements structuraux vis-à-vis de

l’enzyme de conversion de l’endothéline et de mieux comprendre les interactions mises en

jeu. Il nous suffirait alors en effet de synthétiser des plateformes halogénées (fig 49) sur

lesquelles nous pourrions condenser ces amines pour obtenir une nouvelle classe de composés

susceptibles d’être des inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’endothéline.

Figure 49 : Plateforme halogénée.

157 Qian C., Huang T. One-pot synthesis of α-aminophosphonates from aldehydes using lanthanide triflate as acatalyst. J. Org. Chem. 1998, 63, 4125-4128.

BrO

O

147

2.4.1.2 : Mise au point de cette synthèse :

Pour initier ces travaux, nous avons choisi d’utiliser le benzylcarbamate en tant que

carbamate, le diméthylphosphite en tant que nucléophile et BF3.OEt2 comme acide de Lewis,

l’intérêt étant pour nous d’utiliser un large échantillon d’aldéhydes. Il nous restait alors à

choisir le solvant de réaction ainsi qu’un aldéhyde de référence. Au regard des travaux

publiés, deux solvants étaient préconisés, à savoir l’acétonitrile et le dichlorométhane. Le

benzaldéhyde a été choisi et utilisé comme référence (schéma 32).

Schéma 32 : Réaction tricomposante de référence.

Dans ces conditions, l’aminophosphonate 106 a été obtenu aussi bien dans le

dichlorométhane que dans l’acétonitrile mais avec des rendements respectifs de 45 et 80%.

L’acétonitrile semble être le solvent de choix pour cette réaction. Ce produit a été caractérisé

par RMN 1H, 13C et 31P.

Nous voyons que cette réaction semble très performante pour l’obtention

d’aminophosphonates. Nous avons décider de conserver ces conditions opératoires en faisant

varier l’aldéhyde afin d’obtenir des β-aminophosphonates diversement substitués, puis

d’essayer différents acides de Lewis et d’autres carbamates pour voir si cette réaction est

généralisable.

NH2 O

OPO

HOO

O

H

P NH

OO

OO

O+ + BF3.OEt2

CH2Cl2 ouCH3CN

106

148

2.4.2 : Variations effectuées sur cette réaction :

2.4.2.1 : Utilisation de différents types d’aldéhydes :

Dans un premier temps, nous avons fait varier l’aldéhyde utilisé dans cette synthèse en

choisissant des benzaldéhydes diversement substitués. Nous avons synthétiser dans cette série

onze composés différents, porteurs de groupements de type alkyle, halogènes, cyano,

méthoxyle, nitro, etc … Nous avons fait varier dans la mesure du possible leur position sur le

noyau aromatique (schéma 33 et 34).

Schéma 33 : Synthèse utilisant des dérivés du benzaldéhyde

NH2 O

O

PO

HOO

P NH

OO

OO

O

P NH

OO

OO

O

P NH

OO

OO

O

N

P NH

OO

OO

O

ClCl

P NH

OO

OO

O

OO

H

O

H

O

H

O

Cl

Cl

H

O

N

H

O

O

O

+

BF3.OEt2CH3CN

85%

BF3.OEt2CH3CN

76%

BF3.OEt2CH3CN

78%

BF3.OEt2CH3CN

79%

BF3.OEt2CH3CN

70%

106107

108

109

110

149

Schéma 34 : Synthèse utilisant des dérivés du benzaldéhyde

Pour toutes ces synthèses, un mélange équimolaire de benzylcarbamate, de

diméthylphosphite et d’aldéhyde a été solubilisé dans de l’acétonitrile. Ces solutions ont été

refroidies à 0°C avant l’ajout de 1,2 équivalents de BF3.OEt2 servant à activer la réaction. Au

bout d’une demi heure, les solutions sont remises à température ambiante, puis agitées

pendant quatre à six heures. Les produits 106 à 116 ont été isolé avec des rendements variant

de 65 à 88%.

NH2 O

O

PO

HOO

P NH

OO

OO

O

O

O

P NH

OO

OO

O

O

P NH

OO

OO

O

NO2

P NH

OO

OO

O

Cl

P NH

OO

OO

O

O

H

O

Cl

H

OO

P NH

OO

OO

O

OO H

O

O

H

O

NO2

H

O

O

O

H

O

OO

+

BF3.OEt2CH3CN

67%BF3.OEt2CH3CN

88%

BF3.OEt2CH3CN

77%

BF3.OEt2CH3CN

83%

BF3.OEt2CH3CN

65%

BF3.OEt2CH3CN

85%

111 112

113

114115

116

150

Afin de voir si cette réaction était généralisable, nous avons ensuite utilisé une

deuxième classe d’aldéhyde présentant toutefois toujours une activation par conjugaison

(schémas 35 et 36).

Schéma 35 : Synthèse utilisant des aldéhydes conjugués.

NH2 O

O

PO

HOO

P NH

OO

OO

O

P NH

OO

OO

OO

P NH

OO

OO

O

O

H

O

H

OO

H

O

O

+

BF3.OEt2CH3CN

85%

BF3.OEt2CH3CN

79%

BF3.OEt2CH3CN

75%

117118

119

151

NH2 O

O

PO

HOO

P NH

OO

OO

O

P NH

OO

OO

O

P NH

OO

OO

O

P NH

OO

OO

O

NO2

H

OH

O

NO2

H

OH

O

+

BF3.OEt2CH3CN

74%

BF3.OEt2CH3CN

78%

BF3.OEt2CH3CN

BF3.OEt2CH3CN

69%

120121

122

Schéma 36 : Synthèse utilisant des aldéhydes conjugués.

Nous avons pu ainsi obtenir les composés 117 à 122 avec des rendements comparables

à ceux obtenus précédemment variant de 69 à 85%.

Nous avons ensuite essayé cette méthode sur des aldéhydes non conjugués comme par

exemple le phénylpropionaldéhyde (schéma 36). Cette synthèse n’a pas fonctionnée puisque

nous n’avons pas obtenus l’adduit désiré même sous la forme de trace. Nous avons donc

essayé d’autres conditions opératoires comme par exemple de remplacer l’acétonitrile par

d’autres solvants. Pensant que dans des conditions plus acides, la réaction pourrait être

152

améliorée, nous avons choisi comme solvant l’acide formique dans un premier temps puis

l’acide acétique. Aucune de ces deux conditions ne nous a permis d’améliorer notre synthèse.

Voyant que le changement de solvant n’était pas salutaire, nous avons voulu voir si le

fait de faire varier la quantité d’acide de Lewis en maintenant l’acétonitrile comme solvant

pouvait améliorer nos résultats. Pour ce faire, nous avons fait varier cette quantité de 0,5

équivalent à 5 équivalents, mais là encore, aucune amélioration n’a été obtenue.

Nous nous sommes alors tournés vers un problème de réactivité engendré par les

réactifs et non par les conditions opératoires utilisées. Nous avons donc fait varier le

carbamate et le phosphite afin de voir si l’on pouvait améliorer soit la formation de l’imine

soit l’attaque nucléophile mises en jeu dans cette réaction tricomposante.

Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la formation de l’imine, c’est

pourquoi nous avons d’abord fait varier le carbamate. Nous avons donc remplacé le

benzylcarbamate par le tert-butylcarbamate ainsi que par le tosylcarbamate mais aucun de ces

changements n’a été bénéfique.

Pour augmenter le pouvoir nucléophile du réactif phosphorylant, nous avons décidé

d’engager le triméthylphosphite, espèce plus nucléophile que le diméthylphosphite, s’oxydant

in situ pour conduire à l’obtention des mêmes synthons. Ce changement a été très bénéfique

car il nous a permis d’obtenir la plateforme désirée 123 avec un rendement après purification

de 71% (schéma 37).

153

NH2 O

O

POO

O

P NH

OO

OO

O

P NH

OO

OO

O

P NH

OO

OO

O

H

O

H

O

H

O

P NH

OO

OO

O

H

O

+

BF3.OEt2CH3CN

71%

BF3.OEt2CH3CN

85%

BF3.OEt2CH3CN

68%

BF3.OEt2CH3CN

73%

123106

124125

Schéma 37 : Synthèse utilisant des aldéhydes non conjugués.

Nous avons alors resynthétisé l’aminophosphonate 106 mais en utilisant le

triméthylphosphite comme nucléophile (schéma 37). Il a été obtenu avec un rendement de

85% après purification, ce qui est tout à fait comparable au résultat obtenu avec le

diméthylphosphite.

154

NH2 O

O

POO

O

P NH

OO

OO

O

P NH

OO

OO

O

H

O

H

O

P NH

OO

OO

O

H

O

+

BF3.OEt2CH3CN

69%BF3.OEt2CH3CN

66%

BF3.OEt2CH3CN

71%

126128

127

Schéma 38 : Synthèse utilisant des aldéhydes non conjugués.

Cinq autres aminophosphonates (124, 125, 126, 127 et 128) ont donc été synthétisés

dans cette série (schémas 37 et 37). Les conditions opératoires sont les suivantes : un mélange

équimolaire de benzylcarbamate, de triméthylphosphite et d’aldéhyde solubilisé dans de

l’acétonitrile. Les produits 124 à 128 ont été isolés avec des rendements variant de 66 à 73%.

2.4.2.2 : Utilisation de différents carbamates :

Afin de voir si nous pouvions obtenir d’autres types de protection sur l’azote de la

fonction aminée au cours de cette réaction tricomposante, nous avons fait varier le carbamate.

Pour ce faire, nous avons mis en œuvre deux autres carbamates, le tosylsulfonamide et le tert-

butylcarbamate (schéma 39).

155

Schéma 39 : Variation du carbamate

Les résultats obtenus sont positifs car ils montrent que l’utilisation du

tosylsulfonamide est possible, nous pouvons accéder à des amines protégées par un

groupement tosyle et ce dans les mêmes conditions que pour les amines benzylées puisque le

synthon 129 est isolé après purification par chromatographie sur colonne de silice avec un

rendement de 86%. Par contre, l’utilisation du tert-butylcarbamate n’a pas été productive.

2.4.2.3 : Utilisation de différents acides de Lewis :

Afin de déterminer si nous pouvions encore améliorer les conditions opératoires de

cette réaction, nous avons décidé d’utiliser deux autres acides de Lewis, le triflate de

scandium et le chlorure de titane (schéma 40).

POO

O

H

O

O

P NH

OO

OO

O

O

P NH

OO

O

S

O

O

O P NH

OO

OO

O

O

NH2 O

O

NH2SO

O

NH2 O

O

+

BF3.OEt2CH3CN

BF3.OEt2CH3CN

88%

BF3.OEt2CH3CN

86%

112

129

156

Schéma 40 : Variation de l’acide de Lewis.

L’utilisation de 1,2 équivalent de TiCl4 en solution dans du dichlorométhane (1N) a

permis d’obtenir la plateforme 106 d’une manière satisfaisante. Par contre, l’utilisation de

triflate de scandium n’a pas permis de mener à bien cette réaction.

2.4.2.4 : Conclusions :

Nous sommes donc parvenus à obtenir des β-aminophosphonates diversement

protégés et/ou substitués grâce à une réaction tricomposante mettant en jeu des conditions

opératoires douces en six heures de réaction.

Cette méthode semble généralisable à toutes les familles d’aldéhydes puisque

l’utilisation du triméthylphosphite comme nucléophile a permis de mener à bien ces synthèses

aussi bien à partir de dérivés du benzaldéhyde qu’à partir d’aldéhydes linéaires. En outre, les

fonctionnalisations portées par les aldéhydes mis en jeu ne semble pas limiter cette réaction

POO

O

H

O

P NH

OO

OO

O

P NH

OO

OO

O

P NH

OO

OO

O

NH2 O

O

+

Sc(OTf)3CH3CN

BF3.OEt2CH3CN

85%TiCl4

CH3CN82%

+

106

106

157

puisque des groupements de type nitro, cyano, méthoxy, halogénure, éthylénique, etc… n’ont

pas créés de soucis. Ces aminophosphonates peuvent donc être des précurseurs pour

l’obtention de synthons plus complexes.

Cependant, une étude plus approfondie au niveau de l’usage d’acide de Lewis pourrait

être nécessaire afin de déterminer s’il est possible de les utiliser en quantité catalytique.

2.5 : Conclusions :

Au cours de cette thèse, nous avons préparé une molécule de référence, notée (±) 1 et

des analogues susceptibles d’être des inhibiteurs de l’ECE par le biais d’un travail de relation

structure-activité.

Après avoir élucidé quelques problèmes de synthèse, nous sommes parvenus à

synthétiser ce ligand et vingt deux autres molécules qui ont ensuite été testés afin de

déterminer leurs caractéristiques biologiques.

Au cours de nos synthèses, un manque de réactivité des amines secondaires en β des

atomes de phosphores a été mis en évidence. Afin de mieux comprendre celui-ci, nous avons

alors décidé de faire une étude physico-chimique. Des titrages potentiométriques et RMN

nous ont permis de mettre en évidence une forte interaction entre l’atome de phosphore et

l’atome d’azote en β de celui-ci. De plus, sachant que l’ECE-1 présente une efficacité

maximale à pH neutre, cette étude nous montre que la liaison hydrogène intramoléculaire

mise en évidence doit également être mise en jeu dans le site actif de cette enzyme car à ce

pH, l’amine est encore sous forme protonée.

Enfin, nous sommes également parvenus à synthétiser une plateforme β-

aminophosphonate en utilisant une réaction tricomposante mettant en jeu un aldéhyde, un

158

carbamate et un phosphite en présence d’acide de Lewis. Cette synthèse a été généralisée à

toutes les familles commerciales d’aldéhydes.

159

Chapitre III :

Résultats pharmacologiques

160

Sommaire du chapitre III

3.1 : Description de différents types de test : 158

3.1.1 : Méthode utilisée par Novartis pour la molécule 1 : 158

3.1.1.1 : Test enzymatique : 159

3.1.1.2 : Réponse au niveau de la pression sanguine : 160

3.1.2 : Méthode utilisant des substrats fluorescents : 160

3.1.2.1 : Présentation de substrats utilisés pour ce type de tests : 161

3.1.2.2 : Méthodologie utilisée : 162

3.1.2.3 : Propriétés de fluorescence de ces substrats : 162

3.1.3 : Tests effectués sur nos molécules : 163

3.1.3.1 : Test effectué au Cerep : 163

3.1.3.1.1 : Préparation de l’ECE : 163

3.1.3.1.2 : Préparation des solutions : 164

3.1.3.1.3 : Test enzymatique : 165

3.1.3.2 : Test effectué par Smith : 165

3.2 : Résultats pharmacologiques obtenus pour la molécule (±) 1 : 167

3.3 : Etude de relation structure-activité : 168

3.3.1 : Variation du groupement chélatant le zinc : 168

3.3.1.1 : Résultats pharmacologiques obtenus : 169

3.3.1.2 : Conclusion : 170

3.3.2 : Variation autour de la position P1’ : 170


3.3.2.2 : Conclusion : 171

3.3.3 : Variation autour de la position P2’ : 172

3.3.3.1 : Variations autour de la molécule de référence (±) 1 : 173

161

3.3.3.1.1 : Molécules utilisées pour cette comparaison : 173

3.3.3.1.2 : Etude des données pharmacologiques obtenues : 173

3.3.3.1.3 : Conclusions : 174

3.3.3.2 : Molécules ne portant pas de partie C-terminale : 175


3.3.3.2.2 : Données pharmacologiques obtenues : 176

3.3.3.2.3 : Conclusions : 176

3.3.3.3 : Molécules ayant une chaîne aminée sur la position P2’: 177


3.3.3.3.2 : Données pharmacologiques obtenues : 178

3.3.3.3.3 : Conclusions : 179

3.3.4: Composés obtenus en série rétro : 181

3.3.4.1 : Données pharmacologiques : 181

3.3.4.1.1 : Comparaison de ces deux molécules : 181

3.3.4.1.2 : Comparaison des acides carboxyliques : 182

3.3.4.1.3 : Comparaison des acides hydroxamiques : 182

3.3.4.2 : Conclusions : 183

3.3.5: Etude du rôle de l’amine secondaire portée par la molécule (±) 1 : 183


3.3.5.2 : Conclusion : 184

3.4 : Conclusions et perspectives : 185

3.4.1 : Récapitulatif des résultats pharmacologiques : 185

3.4.1.1 : Valeurs données par Cerep : 185

3.4.1.2 : Valeurs données par Dr Smith : 185

3.4.2 : Conclusions : 189

162

Dans le chapitre II, nous avons décrit la synthèse de vingt trois produits (fig. 50 et 51).

Toutes ces molécules ont été faites dans le but d’obtenir des inhibiteurs potentiels de l’ECE.

Les études pharmacologiques ont été réalisées au sein du groupe Servier sous la responsabilité

du Dr P. Renard.

Figure 50 : Molécules 1 à 12.

OH

ONH

ONH

ONH

F F

PO

OHOH

NH

NH

O

FF

OH

OPO

OHOH

NH

OH

O

FF

PO

OHOH

NH

OH

OPO

OHOH

NH

OH

OPO

OHOH

NH

OH

O

NH

O

OHNH

OH

O

OH

O

NH

N

O H

HH

OH

ONH

O

OHNH

N

O H

HH

OH

OOH

ONH

N

O H

HH

OH

OPO

OHOH

P NH

OOH

OH

P NO

OHOH N

1

10

4

2

HClHCl

3

5

HCl

6

8 97

HCl

HCl

11

2 HCl

12

163

Figure 51 : Molécules 13 à 23.

Afin de déterminer l’affinité de ces différents produits vis-à-vis de l’ECE, nous avons

soumis toutes ces molécules à des tests biologiques. Au regard de la littérature, plusieurs

types de tests sont possibles pour déterminer leur pharmacologie.56

En effet, les inhibiteurs de l’ECE peuvent être évalués par des tests enzymatiques,

ainsi que par des études à partir de tissus isolés ou à partir d’animaux entiers. Une gamme de

tissus, comme par exemple l’endothélium vasculaire, les muscles lisses vasculaires ou les

P NH

OOH

OH

NH

N

O

N

PO

OHOH

NH

NH

ON

N

O

POHOH

O

NH

N

O

N

PO

OHOH

NH

NH

OP NO

OHOH N

HN

O

N

PO

OHOH

N

N

NOH

OPO

OHOH

NOH

OPO

OHOH

NH

O

OHO

NH

O

NH

O

NH

ONH

O

OH

NH

O

OHO

NH

O

HCl

13

14

2 HCl

3 HCl15

16

2 HCl

17

2 HCl

18

2 HCl

19 20

HCl

HCl21

22

23

164

poumons, ont permis de démontrer l’activité inhibitrice du phosphoramidon vis-à-vis de

l’ECE. L’ECE partiellement purifiée, obtenue à partir des poumons de lapin, est

classiquement utilisée pour ces études ainsi que le précurseur big-ET-1 en tant que substrat158.

Ces outils ont permis d’évaluer l’activité inhibitrice du phosphoramidon, de l’EDTA, du

thiorphan, du captopril et du kelatorphan. Les deux premiers ont été donnés comme présentant

une activité inhibitrice, alors que le thiorphan est décrit comme un inhibiteur très faible, et que

le captopril et le kelatorphan ne présentent aucune activité. La mesure de l’ET-1 produit peut

être faite de différentes manières, comme par exemple en utilisant un test radio-

immunologique (RIA) disponible commercialement ou par HPLC via un détecteur UV ou

radiochimique (125I). Des tests par fluorescence ont aussi été mis au point utilisant par

exemple le succinyl-Ile-Ile-Trp-méthyl-coumarinamide comme substrat159.

De plus, une ECE sensible au phosphoramidon a été identifiée par le biais d’études

fonctionnelles sur les canaux déférents du rat donnant ainsi un nouveau tissu isolé pouvant

servir à tester les caractéristiques inhibitrices de molécules. En effet, l’apport de 3 à 600 nM

de big-ET-1 augmente la puissance des contractions nerveuses obtenues par stimulation via

un champ électrique dans les canaux déférents isolés. Cet effet est inhibé par la présence de

phosphoramidon. L’apport de thiorphan à la place du phosphoramidon conduit au même

résultat mais de manière beaucoup moins efficace et l’usage d’enalapril, lui, ne conduit à

aucune diminution des contractions. Ces résultats, obtenus en utilisant un tissu isolé,

correspondent à ceux obtenus par le test enzymatique.

Enfin, la réponse pressorielle liée à l’apport de big-ET-1 peut servir de base pour des

tests in vivo de mesure d’inhibition. En effet, l’apport de big-ET-1 par voie intraveineuse

158 Bertenshaw S. R., Rogers R. S., Stern M. K., Norman B. H., Moore W. M., Jerome G. M., Branson L.M.,McDonald J. F., McMahon E. G., Palomo M. Phosphorus-containing inhibitors of endothelin convertingenzyme: effects of the electronic nature of phosphorus on inhibitor potency A. J. Med. Chem. 1993, 36, 173-176.159 Kundu G. C., Wilson I. B. Identification of endothelin converting enzyme in bovine lung membranes using anew fluorogenic substrate Life Sci. 1992, 50, 965-970.

165

conduit à une augmentation significative et de manière durable de la pression artérielle,

pouvant être inhibée par un prétraitement au phosphoramidon.

Nous voyons qu’un large panel de tests est possible afin de déterminer les

caractéristiques pharmacologiques de nos produits en tant qu’inhibiteurs de l’ECE. Nous

allons décrire ceux-ci de manière plus précise.

3.1 : Description de différents types de test :

3.1.1 : Méthode utilisée par Novartis pour la molécule 1 :

Deux tests ont été effectués pour cette étude, le premier étant un test enzymatique et le

second une étude de la réponse pressorielle.126

Dans le premier cas, l’ECE hydrolyse le big-ET-1 en ET-1. Ainsi, en utilisant une

quantité connue de big-ET-1, il est possible de déterminer la quantité d’ET-1 libérée au cours

de ce processus. Lorsqu’un inhibiteur de cette enzyme est utilisé, cette quantité sera donc

moindre et par comparaison des valeurs obtenues, le pourcentage d’inhibition ayant eu lieu

pourra être calculé. Il suffit de quantifier la quantité d’ET-1 libérée pour déterminer

l’inhibition des ligands testés.

Dans le second cas, l’apport de big-ET-1 ou d’ET-1 se traduit par une augmentation de

la pression artérielle. Lorsque l’on injecte préalablement du phosphoramidon, la pression

artérielle augmente plus faiblement. On note donc que le fait d’inhiber l’ECE entraîne une

réponse au niveau de la pression artérielle. En comparant la réponse pressorielle à celle

obtenue sans inhibiteur, il est possible de déterminer la puissance des ligands testés.

166

3.1.1.1 : Test enzymatique :

Pour mesurer l’activité inhibitrice de la molécule 1 vis-à-vis de l’ECE, une protéine de

préparation membranaire de cellules CHO exprimant l’ECE-1 humaine est préincubée avec

cette molécule, à la concentration voulue, pendant 20 minutes à température ambiante dans

une solution tampon à pH 7 (TES) en présence de 0,005% de Triton X-100. Puis une quantité

connue de big ET-1 humain est ensuite ajoutée et le milieu réactionnel ainsi obtenu est incubé

pendant 2h à 37°C. La réaction est alors stoppée par ajout d’une solution tampon saline de

phosphate, utilisée pour des tests radio-immunologiques, contenant 0,1% de Triton X-100,

0,2% d’albumine de sérum bovin et 0,02% de NaN3.

L’ET-1 obtenu après cette réaction est ensuite quantifié. Pour ce faire, la solution

d’incubation est diluée et des échantillons sont incubés à 4°C pendant une nuit en présence

d’une quantité précise de [125I]ET-1 (10000 cpm/tube) et d’anticorps lapin dilués 20000 fois,

ces anticorps reconnaissant spécifiquement le groupement carboxylique terminal du

tryptophane de l’ET-1. Des anticorps chèvres anti-lapins couplés à des billes magnétiques

sont ensuite ajoutés et le milieu réactionnel ainsi obtenu est incubé durant 30 minutes à T.A.

Les billes sont alors regroupées par un aimant et le surnageant est décanté. La radioactivité de

l’amas de billes est alors mesurée par un compteur gamma. Les liaisons totales et non

spécifiques sont mesurées en l’absence respective d’ET-1 non radioactif et d’anticorps anti-

ET-1. Dans ces conditions, l’ET-1 et le big ET-1 déplacent le [125I]ET-1 lié aux anticorps avec

des CI50 respectives de 21 et 260000 fmol.

167

3.1.1.2 : Réponse au niveau de la pression sanguine :

Des rats Sprague-Dawley mâles sont anesthésiés avec de l’inactine et sont cathétérisés

au niveau de l’artère fémorale et d’une veine pour pouvoir respectivement mesurer la pression

artérielle moyenne et administrer la molécule 1. Une trachéotomie est faite pour insérer une

canule dans la trachée permettant ainsi de maintenir la respiration. La température corporelle

des animaux est maintenue à 37°C grâce à une couverture chauffante. Suite à cette chirurgie,

la pression artérielle moyenne est stabilisée 30 minutes avant l’interruption de la

neurotransmission autonome avec de la chlorisondamine. A ce moment, la molécule 1 est

administrée et la stimulation par injection de big ET-1 (1 nmol/kg) a lieu 15 minutes et 90

minutes plus tard. La pression artérielle moyenne est mesurée à chaque injection.

3.1.2 : Méthode utilisant des substrats fluorescents :

Les tests précédemment décrits étant relativement longs à mettre en oeuvre, une

nouvelle méthode a été mise au point de manière à obtenir un test rapide, simple et sélectif

permettant de mesurer les caractéristiques pharmacologiques des inhibiteurs de l’ECE.

Au lieu de quantifier la quantité libérée d’ET-1 après son hydrolyse par l’ECE, c’est la

fluorescence libérée lors de la dégradation d’un substrat porteur d’un groupement fluorescent

et d’un « quencheur », par cette même enzyme, qui est mesurée. Le premier travail est

d’identifier des substrats reconnus et dégradés par l’ECE sur lesquels il serait possible de

greffer un fluorophore et un « quencheur ». De plus, le clivage de ce substrat par l’ECE doit

permettre de séparer ces deux groupements afin d’obtenir une émission de fluorescence lors

de l’hydrolyse.

168

3.1.2.1 : Présentation de substrats utilisés pour ce type de tests :

Plusieurs substrats (fig. 52) ont été décrits dans la littérature comme possédant ces

propriétés.160,161 Ceux-ci ont été structurés à partir de ligands connus comme étant des

inhibiteurs de l’ECE ou à partir du big-ET-1.

Figure 52 : Big-ET-1 et exemples de substrats utilisables pour des tests par fluorescence.

Sur les substrats 1 et 2, nous pouvons noter la présence de deux acides aminés peu

classiques, à savoir la Pya (pyrenylalanine) et la Nop (p-nitrophénylalanine) qui sont

respectivement le fluorophore et le « quencheur »162.

160 Luciani N., De Rocquigny H., Turcaud S., Romieu A., Roques B. P. Highly sensitive and selectivefluorescence assays for rapid screening of endothelin-converting enzyme inhibitors. Biochem. J. 2001, 356, 813-819.161 Johnson G. D., Ahn K. Development of an internally quenched fluorescent substrate selective for endothelin-converting enzyme-1. Anal. Biochem. 2000, 286, 112-118.

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerLeuMet

AspLys Glu Val Tyr Phe His Leu Ile Ile Pya

13

11 15 21

NH2

Asn Thr Pro Glu His Val Val Pro Tyr Gly Leu Gly Ser35

COOHNop

Substrat 1

22

Coupure par l’ECE

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerLeuMet


Big-ET-113

11 15 21

NH2

Val Asn Thr Pro Glu His Val Val Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Pro Arg Ser

38COOH

Coupure par l’ECE

Pya Nop NH2HOOC Ser Gly Lys Ala Phe Ala Gly Lys Substrat 23 8

Coupure par l’ECE

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerLeuMet


13

11 15 21

NH2


COOHNop

Substrat 1

22

Coupure par l’ECE

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerLeuMet


13

11 15 21

NH2


COOHNop

Substrat 1

22

Coupure par l’ECE

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerLeuMet


Big-ET-113

11 15 21

NH2


38COOH

Coupure par l’ECE

Asp

CysSerCys

Cys Cys

SerSerLeuMet


Big-ET-113

11 15 21

NH2


38COOH

Coupure par l’ECE


Coupure par l’ECE


Coupure par l’ECE

169

Ces deux substrats sont donc décrits comme étant reconnus par l’ECE qui les clive

respectivement entre le Pya21 et le Nop22 et entre l’Ala5 et le Phe6. Nous pouvons remarquer

qu’après l’hydrolyse, pour chacun de ces ligands, deux résidus sont obtenus l’un porteur du

groupement fluorophore et l’autre porteur du « quencheur », ce qui va permettre l’émission de

fluorescence par le premier résidu.

3.1.2.2 : Méthodologie utilisée :

Afin de déterminer les Ki, une quantité d’ECE-1 humaine recombinée est préincubée

pendant 10 minutes à 37°C dans une solution tampon à pH 6,8 (Tris/Maléate) avec des

concentrations croissantes d’inhibiteur (de 1*10-10 à 1*10-4 M) dans des plaques à 96 puits

noires. Les substrats précurseurs de fluorescence 1 ou 2 sont alors ajoutés et les milieux

réactionnels ainsi obtenus sont incubés pendant 1h ou 30 minutes à 37°C. La réaction est alors

stoppée par refroidissement sur de la glace et la fluorescence est mesurée par un fluorimètre

pour plaque à 96 puits. Des échantillons présentant 0% d’hydrolyse sont obtenus par ajout du

substrat directement dans la solution tampon et d’autres présentant 100% d’activité relative

sont obtenus en l’absence d’inhibiteurs. Le pourcentage de dégradation est évalué par

comparaison avec ces derniers échantillons et les valeurs des CI50 des inhibiteurs testés sont

déterminées par ce biais.

3.1.2.3 : Propriétés de fluorescence de ces substrats :

162 Solheilac J. M., Cornille F., Martin L., Lenoir C., Fournié-Zaluski M. C., Roques B. P. A sensitive and rapidfluorescence-based assay for determination of tetanus toxin peptidase activity. Anal. Biochem. 1996, 241, 120-127.

170

Les spectres de fluorescence du substrat 1 et du métabolite porteur de l’acide-aminé

Pya présentent deux maxima d’émission larges à environ 377 nm et 398 nm et un maximum

d’excitation à 343 nm. De plus le substrat tout seul ne donne qu’un signal résiduel d’émission.

3.1.3 : Tests effectués sur nos molécules :

Ces tests ont été effectués par deux groupes différents, une équipe du Cerep (Paris) et

une équipe du laboratoire du Dr Smith (Australie). Les méthodes utilisées diffèrent, un test

enzymatique a été mis en œuvre au Cerep alors que l’équipe du Dr Smith a utilisé une

méthode par fluorescence. Nous allons d’ailleurs commenter ces méthodes.

3.1.3.1 : Test effectué au Cerep :

La mesure de l’activité de l’ECE se fait par le dosage de l’ET-1 formée après

l’hydrolyse de la big-ET-1. Pour ce faire, l’ECE utilisée provient d’une préparation

membranaire réalisée à Cerep à partir des cellules de la lignée cellulaire HUV-EC-C (ATCC).

Le substrat utilisé est classiquement de la big-ET-1 fournie par la société Bachem.

3.1.3.1.1 : Préparation de l’ECE :

Les cellules de la lignée cellulaire HUV-EC-C poussent dans un incubateur à CO2

(95% d’air et 5% de CO2) dans un milieu basal de cellules endothéliales avec 10% de sérum

de foetus de veau, 0,4% d’extrait de cerveau bovin, d’héparine à 40 ng/mL, un facteur de

171

développement épidermiale humain à 0,1 ng/mL, de la gentamicine à 50 ng/mL et de

l’amphotericine B à 0,05 ng/mL163.

Toutes les opérations qui suivent sont faites entre 0 et 4°C, sauf indication contraire.

108 cellules HUVEC sont lavées avec une solution saline tamponnée par du phosphate puis

par une solution de tampon A à pH 7,5 (10 mM de TRIS.HCl, 0,25 M de sucrose et 20 mM de

KCl). Les cellules en suspension dans 100 mL dans cette solution tampon sont ensuite

homogénéisées par cavitation d’azote (600 Psi pendant 10 minutes) puis centrifugées à 5000

g pendant 20 minutes. Le surnageant est alors centrifugé à 20000 g pendant 35 minutes. Le

nouveau surnageant est à son tour centrifugé à 100000 g pendant 1 heure. Ce dernier

surnageant obtenu est utilisé comme fraction cytosolique. Le résidu est lavé dans du tampon

A, remis en suspension dans une solution tampon à pH 7 (20 mM de TRIS.HCl et 0,5% Triton

X100) et utilisé ainsi comme fraction membranaire. Cette solution enzymatique est stockée

dans de la glace.

3.1.3.1.2 : Préparation des solutions :

Les milieux d’incubation sont préparés de la manière suivante :

Milieu d’incubation sans substrat servant pour les témoins :

500 mM de Tris HCl (pH 7), 1,25% de triton X100, 0,05% de NaN3 et 8,77*10-3%

d’acide acétique.

Milieu d’incubation avec substrat servant pour les points stimulés :

500 mM de Tris HCl (pH 7), 1,25% de triton X100, 0,05% de NaN3 et 10 µM de big-

ET-1.

163 Ahn K., Beningo K., Olds G., Hupe D. The endothelin-converting enzyme from human umbilical vein is amembrane-bound metalloprotease similar to that from bovine aortic endothelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci.1992; 89, 8606-8610.

172

La solution servant à stopper la réaction contient 10mM d’EDTA/Tris (pH 7,5), 0,4

mM de PMSF, 0,2 mM de leupeptine et 0,1 mM de Pepstatine. Elle est stockée à 4°C.

3.1.3.1.3 : Test enzymatique :

Les produits à tester sont tout d’abord distribués dans des tubes micronics concentrés

10 fois dans de la glace, puis la préparation membranaire d’ECE est ajoutée. Ce milieu est

alors incubé à 0°C pendant 30 minutes. Le milieu d’incubation comportant ou non de la big-

ET-1 concentré 5 fois est alors ajouté. Cette solution est alors placée à 37°C avant d’être mise

à incuber pendant 2 heures. La réaction est ensuite arrêtée par ajout de solution stop et les

tubes sont remis dans la glace.

Le dosage peut alors avoir lieu en utilisant le kit EIA (provenant de R&D

Systems) ou ultérieurement mais dans ce cas les tubes doivent être conservés à -80°C. La

lecture se fait à l’aide d’un lecteur de plaques (Spectrafluo plus, Tecan).

3.1.3.2 : Test effectué par Smith :

Les tests d’activité de l’ECE sont basés sur un substrat porteur d’un fluorophore ( 7-

méthoxycoumarine) et d’un « quencheur » (2,4-dinitrobenzène) structuré à partir de la

bradykinine (Fig. 53).161

173

L’ECE recombinée est sous une forme soluble, un système d’expression ayant été

développé pour l’exprimer et la purifier sous cette forme. Elle est exprimée à partir d’une

lignée cellulaire CHO-K1 qui secrète la protéine désirée dans un milieu sans sérum. Les

propriétés de cette forme soluble sont pour la plupart identique à celle des formes

membranaires à l’exception d’une préférence pour un pH très légèrement plus acide164.

Figure 53 : (7-méthoxycoumarin-4-yl)acétyl-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-Lys(2,4-dinitrophényle).

Ces tests se déroulent de la manière décrite dans la partie 3.1.2. Après préincubation

des inhibiteurs potentiels avec l’ECE sous forme soluble, le ligand précurseur de la

fluorescence est ajouté et la libération de fluorescence est suivie pendant toute la durée de la

réaction. Ces tests sont réalisés dans des plaques et la fluorescence est mesurée par un

fluorimètre de plaques. Les conditions opératoires ont été optimisées de manière à utiliser une

164 Ahn K., Herman S. B., Fahnoe D. C. Soluble human endothelin-converting enzyme-1 : expression,purification and demonstration of pronounced pH sensitivity. Arch. Biochem. Biophys. 1998, 359, 258-268.

O OO

O

Pro Pro Gly Phe Ser Ala PheArg NHO

OH

NH

NO2

NO2Coupure par l’ECE

ligand

O OO

O

Pro Pro Gly Phe Ser Ala PheArg NHO

OH

NH

NO2

NO2Coupure par l’ECE

ligand

O OO

O

Pro Pro Gly Phe Ser AlaArg COOH

O OO

O

Pro Pro Gly Phe Ser AlaArg COOH Phe NHO

OH

NH

NO2

NO2

H2N Phe NHO

OH

NH

NO2

NO2

H2N

Métabolite émetteur de fluorescence Métabolite porteur du « quencheur »

174

quantité minimale de substrat, d’enzyme et d’inhibiteur ainsi que de manière à ce que moins

de 10% du substrat soit hydrolysé (conditions de vitesse initiale). Cette optimisation inclut le

fait que les tests soient réalisés à un pH de 6,3 correspondant à une activité maximale de

l’ECE sous forme soluble. Dans ces conditions, l’ECE soluble est inhibé par le

phosphoramidon avec une CI50 de l’ordre de 30 nM.

Deux concentrations différentes d’inhibiteurs ont été testées, à savoir 10-5 et 10-7 M.

Maintenant que les tests effectués ont été décrits, nous allons pouvoir nous intéresser

aux résultats pharmacologiques obtenus pour nos inhibiteurs potentiels de l’ECE.

3.2 : Résultats pharmacologiques obtenus pour la molécule (±) 1 :

Cette molécule a été évaluée par les deux méthodes et les valeurs obtenues diffèrent de

manière assez importante (fig. 54).

Figure 54 : Molécule de référence.

En effet, la valeur de CI50 obtenue par le test enzymatique est de 220 nM alors qu’elle

est de 40 nM via le test utilisant la fluorescence. La différence entre ces deux mesures n’est

pas liée à la méthodologie utilisée mais certainement à la qualité de la source enzymatique. En

effet, dans la littérature les tests ont été effectués à partir d’une ECE recombinante humaine

OH

ONH

ONH

ONH

PO

OHOH

F F

OH

ONH

ONH

ONH

PO

OHOH

F F

Cerep : 60% d'inhibition à 10-7M 90% d'inhibition à 10-5M CI50 : 220 nMSmith : CI50 : 40 nM

littérature : CI50 : 8nM

175

via une protéine membranaire. L’équipe de Cerep a, quand à elle, utilisé une préparation

membranaire contenant un mélange enzymatique et a considéré uniquement l’activité de

l’ECE grâce à un substrat et à un kit de détection spécifique de cette enzyme. Enfin, l’équipe

du Dr Smith a mis en œuvre une ECE recombinante humaine soluble et purifiée. Les résultats

obtenus semblent montrer que l’utilisation d’un substrat et d’un kit de détection de l’ET-1

spécifique n’évitent pas les interférences avec d’autres enzymes présentes dans le milieu.

De plus, les données de la littérature correspondent à un composé optiquement pur, ce

qui n’est pas le cas de la molécule que nous avons synthétisée puisque nous l’avons fait en

série racémique. Il est donc normal d’obtenir des CI50 supérieures à 8 nM, l’un des

énantiomères du mélange racémique présentant moins d’affinité pour l’ECE.

Les résultats obtenus par l’équipe du Dr Smith semblent plus proches des données de

la littérature. Cette méthode a été retenue pour tester nos molécules. Notons que le composé

10, préalablemment testé par Cerep, est encore en cours de test en Australie.

Nous allons détailler maintenant les résultats pharmacologiques obtenus pour nos

molécules et en dégager des commentaires.

3.3 : Etude de relation structure-activité :

Toutes les molécules présentent un squelette relativement commun sur lequel des

petites variations fonctionnelles ont été apportées afin de moduler les interactions potentielles.

Nous nous sommes intéressés au cours de cette étude à quatre parties de la molécule de

référence, à savoir la partie occupée par la chaîne peptidique, celle occupée par la chaîne

aralkyle ainsi qu’au groupement phosphonate servant à chélater le zinc de l’ECE et à l’amine

secondaire. Nous allons commencer par étudier la fonction chélatante du zinc.

176

3.3.1 : Variation du groupement chélatant le zinc :

Plusieurs fonctions sont connues pour chélater le zinc comme par exemple les

phosphoramidates, les phosphonamides, les acides phosphoniques, les thiols, les acides

hydroxamiques, les acides carboxyliques et d’autres encore.

Nous avons décidé de nous restreindre aux acides phosphoniques, hydroxamiques et

carboxyliques pour notre étude. Pour cela deux séries de composés ont été synthétisées

comportant chacune un squelette identique et une des trois fonctions citées ci-dessus (fig 55 et

56).

Figure 55 : Variation du chélatant sur la plateforme acide 2-amino-3-biphényl-4-yl-propanoïque

Figure 56 : Variation du chélatant sur la plateforme acide (2S, 3aS, 7aS)-1-(2-amino-3-biphenyl-4-ylpropanoyl)-octahydro-1H-indole-2-carboxylique

NH

OH

OPO

OHOH

NH

OH

O

OH

ONH

OH

O

NH

O

OH

2

HCl HCl

65

34,1 % d'inhibition à 10-7M99,6 % d'inhibition à 10-5M


00,0% d'inhibition à 10-7M11,0 % d'inhibition à 10-5M

NH

N

O H

HH

OH

ONH

O

OHNH

N

O H

HH

OH

OOH

ONH

N

O H

HH

OH

OPO

OHOH

8 97

HCl



0 % d'inhibition à 10-7M0 % d'inhibition à 10-5M

177

3.3.1.1 : Résultats pharmacologiques obtenus :

Nous voyons que pour les composés de la figure 55, c’est la fonction acide

phosphonique 2 qui donne le meilleur résultat pour la chélation du zinc. En effet, les

pourcentages d’inhibition de l’ECE sont de 34,1 % et 99,6 % pour des concentrations

respectives de 10-7 et 10-5 M de ligands alors qu’ils sont très faibles dans le cas de l’acide

hydroxamique 5 et de l’acide carboxylique 6.

De même, au regard des résultats obtenus pour les molécules de la figure 56, les

conclusions sont similaires. En effet, les pourcentages d’inhibition du composé 7 sont de 13%

à 10-7 M et de 37,4% à 10-5 M alors qu’ils sont plus faibles pour l’acide hydroxamique 8 et

nuls dans le cas de l’acide carboxylique 9.

3.3.1.2 : Conclusion :

Dans les deux cas étudiés, nous voyons que pour un même squelette carboné, la

présence de l’acide phosphonique contribue à l’inhibition de l’ECE alors que les acides

hydroxamiques et carboxyliques limitent l’interaction avec l’ECE.

Ces résultats indiquent qu’une mauvaise chélation du zinc peut entraîner une perte

d’affinité pour l’ECE. C’est pourquoi nous avons décidé de nous limiter à des acides

phosphoniques pour le reste de notre étude.

3.3.2 : Variation autour de la position P1’ :

Pour l’étude de cette partie de nos molécules, nous allons nous intéresser à trois

composés qui ne différent que par cette chaîne (fig. 57). Pour cela nous avons remplacé la

178

chaîne aralkyle par un biphényle dans la molécule 2, substituant ainsi la triple liaison par un

groupement phényle, et par un benzyle dans la molécule 3 supprimant ainsi le deuxième

groupement phényle.

Figure 57 : Variation de la chaîne aralkyle à partir de la plateforme acide[(phosphonomethyl)amino]acetique


Pour les composés de cette série, les résultats pharmacologiques sont en faveur du

composé 2. En effet, les valeurs d’inhibition obtenues pour des concentrations de ligands à 10-

5 M pour les ligands 4 et 2 sont identiques alors qu’à 10-7 M, le composé 2 inhibe 1,7 fois plus

l’ECE que le 4. Le composé 3 est beaucoup moins intéressant n’inhibant l’ECE qu’à 10,8% à

10-5 M. Nous voyons que ces variations conduisent à d’importantes variations au niveau de

l’affinité de nos composés pour l’ECE.

3.3.2.2 : Conclusion

Les principales différences entre les composés 2 et 4 résident dans le remplacement de

la triple liaison par un reste phényle et dans la suppression des deux atomes de fluor. D’après

NH

OH

O

FF

PO

OHOH

NH

OH

OPO

OHOH

NH

OH

OPO

OHOH

4 2

HCl

3

HCl

19,8 % d'inhibition à 10-7M100 % d'inhibition à 10-5M



179

la littérature, le fluor en para ne semble pas avoir une grande importance contrairement à

celui en ortho. Nous remarquons que la perte des interactions de type accepteur-donneur est

compensée par la présence du phényle remplaçant la triple liaison. Cette substitution ne

change d’ailleurs rien au niveau des interactions mises en jeu qui sont de types aryle-aryle

mais se traduit par une augmentation du volume occupé. De plus, la géométrie mise en jeu

n’est plus du tout la même car la libre rotation du phényle portant les atomes de fluor dans le

composé 4 est plus difficile dans le composé 2 du fait de la présence du premier groupement

phényle.

Le composé 3 ne présente qu’une modeste affinité pour l’ECE. Ceci s’explique sans

doute par la perte des interactions liées à l’absence du second phényle. Le volume occupé par

le benzyle est plus petit et ne permet peut être pas une interaction optimale dans le site actif de

l’enzyme. De plus les interactions de type aryle-aryle liées à la présence du second phényle

n’existent plus ce qui doit également contribuer à défavoriser la reconnaissance de cette

molécule par l’ECE.

La substitution de la triple liaison par un phényle est plutôt bénéfique puisqu’en plus

de compenser la perte d’interactions liées à la disparition des deux atomes de fluor, elle

permet d’améliorer le pourcentage d’inhibition. De plus, chimiquement parlant, ce type de

molécule est plus facile à manipuler que ceux porteurs d’une triple liaison pouvant se

dégrader dans un bon nombre de réactions comme par exemple des oxydations ou des

hydrogénations au cours de nos synthèses. Ceci est également vrai en terme de

biotransformation mais l’hydroxylation en para du biphényle est maintenant possible

contrairement au cas de la molécule (±) 1, où cette position est occupée par un fluor.

Pour toutes ces raisons, nous avons décidé de remplacer la chaîne aralkyle par un

biphényle dans la plupart de nos produits.

180

3.3.3 : Variation autour de la position P2’ :

C’est la partie sur laquelle nous avons porté le plus d’effort. En effet, après avoir

observé les variations induites par des changements de fonctionnalités sur la molécule de

référence (±) 1, nous avons préparé une série de composés sans partie C-terminale et une

autre série correspond à des composés porteurs de fonctions aminées et hétérocycliques.

3.3.3.1 : Variations autour de la molécule de référence (±) 1 :

3.3.3.1.1 : Molécules utilisées pour cette comparaison :

Tout d’abord, la molécule (±) 1 et deux autres synthons peuvent être comparés dans le

cadre de cette étude (fig. 58). La chaîne peptidique a été remplacée par un espaceur linéaire de

même longueur dans le cas du synthon 10 et supprimée dans celui de la molécule 4.

Figure 58 : Etude de l’importance de la chaîne peptidique à partir de la plateforme acide -5-(2,4-difluorophényl)-2-(phosphonométhyl-amino)-pent-4-ynoïque.

3.3.3.1.2 : Etude des données pharmacologiques obtenues :

OH

ONH

ONH

ONH

PO

OHOH

F F

NH

NH

O

FF

OH

OPO

OHOH

NH

OH

O

FF

PO

OHOH

10 41



19,8 % d'inhibition à 10-7M100 % d'inhibition à 10-5M

181

La molécule (±) 1 présente la meilleure affinité dans cette série. Mais les résultats

obtenus pour les deux autres composés sont à noter. En effet, le fait de substituer cette chaîne

peptidique par une chaîne de même longueur sans maillon amide nous conduit à un composé

de puissance comparable à une concentration de 10-5 M (composé 10). Par contre ce composé

perd toute affinité à une concentration de 10-7 M. Nous devons toutefois utiliser ces valeurs

avec précaution car elles proviennent des tests effectués avec l’ECE mélangée à d’autres

enzymes. Ce composé est en cours d’évaluation sur l’ECE recombinante purifiée par l’équipe

du Dr Smith. De même, le composé 4, ne portant qu’une fonction acide carboxylique libre en

cette position présente un potentiel inhibiteur 3 fois moins fort que celui obtenu pour la

référence pour une concentration de 10-7 M.

3.3.3.1.3 : Conclusions :

Ces résultats nous suggèrent que le fait de supprimer toutes les interactions de type

liaison hydrogène sur cette partie de la molécule conduit à une perte d’affinité pour l’ECE.

Nous pouvons en conclure que des interactions de type accepteur-donneur doivent être mise

en jeu dans la reconnaissance des ligands par l’ECE dans le site S2’ du site actif de l’enzyme.

Par contre, le fait d’avoir un acide libre en bout de chaîne ne semble pas être un

facteur important pour l’affinité. En effet, au regard des molécules (±) 1 et 10, nous pouvons

constater une chute d’activité qui signale que l’interaction liée à l’amide au centre de la chaîne

doit être primordiale. Par contre, la comparaison des résultats obtenus pour les synthons 10 et

4, montre que le fait d’avoir une chaîne terminée par un acide carboxylique n’apporte rien, le

composé 10 présentant une plus faible affinité que le 4. Les interactions décisives semblent

liées à la présence des deux groupements amides et pas à sa partie C-terminale sinon le

composé 4 devrait être un meilleur candidat que le composé 10. La présence de la première

182

fonction amide dans notre molécule de référence est mimée dans le cas des produits 10 et 4

par la présence respective d’une fonction amide et d’un acide carboxylique.

Finalement, la conclusion qui se dégage est que la fonction amide en milieu de chaîne

semble importante. De plus, des interactions hydrophobes peuvent aussi favoriser un meilleur

positionnement de cette chaîne dans le site actif de l’ECE.

3.3.3.2 : Molécules ne portant pas de partie C-terminale :

La fonction amide au centre de la chaîne peptidique portée par la molécule de

référence joue un rôle important dans la reconnaissance de nos composés par l’ECE. Nous

avons voulu voir ce qu’il en était pour la première fonction amide de cette chaîne.


Trois composés ont été préparés dans le but de vérifier l’influence de cette partie dans

le cadre de notre étude relation structure-activité (fig. 59). Nous avons pris le composé 3

comme référence pour cette comparaison malgré sa relativement faible activité comme

inhibiteur de l’ECE. Il peut tout de même nous permettre de voir l’effet de la partie acide,

mimant la première fonction amide de la référence. Nous avons tout d’abord supprimé l’acide

carboxylique dans le cas de la molécule 11, puis rajouté un groupement phényle pour le

ligand 13. Le composé 12 est un peu différent car il porte un squelette beaucoup plus rigide de

par la présence d’une N-phénylpipérazine.

183

Figure 59 : Etude de l’importance de la fonction acide mimant la première fonction amide denotre référence en terme d’interaction.

3.3.3.2.2 : Données pharmacologiques obtenues

Dans cette série de molécules, c’est le composé 13 qui semble le plus intéressant. En

effet, il est 3,7 fois plus puissant que le 3. Ce dernier est relativement similaire à la molécule

12 d’un point de vue pharmacologique bien qu’il ait une affinité un peu plus forte à une

concentration de 10-7 M. Par contre la molécule 11 présente un meilleur potentiel inhibiteur

puisqu’elle bloque l’ECE 1,7 fois mieux que le composé 3, tout en étant moins bon que la

molécule 13.


La comparaison des molécules 3 et 11, identiques à l’exception de la présence d’un

acide carboxylique sur le synthon 3, laisse à penser que la présence de cette fonction n’est pas

essentielle. En effet, le composé 11, qui n’en est pas porteur, est un meilleur inhibiteur. Ceci

peut vouloir dire que l’interaction mise en jeu à ce niveau n’est pas importante.

NH

OH

OPO

OHOH

P NO

OHOH N

P NH

OOH

OH

P NH

OOH

OHHCl

3

2 HCl

11 12 13

HCl

HCl





184

De plus, au regard de la molécule 12, nous pouvons estimer que la rigidification liée à

la présence du noyau pipérazine ne permet pas le bon positionnement simultané de la fonction

phosphonate et du phényle dans le site actif de l’ECE.

Enfin, le composé 13, ne différant de la molécule 11 que par la présence d’un phényle

supplémentaire, présente un meilleur profil d’inhibition. L’ajout d’un phényle contribue donc

à la reconnaissance de ce ligand par l’ECE et témoigne du fait que des interactions aryle-aryle

supplémentaires peuvent être productrices d’affinité.

3.3.3.3 : Molécules ayant une chaîne aminée sur la position P2’:

Afin de synthétiser des molécules ayant des interactions plus proches de celles mises

en jeu par notre référence, nous avons préparé plusieurs produits porteurs de chaîne aminée à

la place de la chaîne peptidique. Sur ces composés, la présence de la première fonction amide

a été maintenue par commodité de synthèse.


Nous avons synthétisé six molécules (7, 14, 15, 16, 17 et 18) pouvant servir à cette

étude (fig. 60) en remplaçant la chaîne peptidique par la N-methylpipérazine, l’acide

octahydro-1H-indole-2-carboxylique, la 4-[4-(2-méthoxyphényl)-pipérazin-1-yl]-butylamine,

la N-phénylpipérazine, la 1-éthylpyrrolidin-2-yl-méthylamine et par la 2-pipérazin-1-

ylpyrimidine.

185

Figure 60 : Remplacement de la chaîne peptidique par une chaîne aminée à partir de laplateforme acide 3-biphényl-4-yl-2-[(phosphonométhyl)amino]propanoïque.

3.3.3.3.2 : Données pharmacologiques obtenues

Le composé 2 se détache à nouveau dans cette série. Les variations apportées à ces

ligands n’ont donc pas permis d’améliorer les caractéristiques pharmacologiques de nos

molécules.

Cependant, la comparaison de toutes ces molécules nous apporte tout de même des

renseignements sur les interactions mises en jeu pour la reconnaissance de ces produits par

NH

N

O

N

PO

OHOH

NH

N

O H

HH

OH

OPO

OHOH

NH

NH

ON

N

O

POHOH

O

NH

N

O

N

PO

OHOH

NH

NH

OP NO

OHOH N

HN

O

N

PO

OHOH

N

N

NH

OH

OPO

OHOH

14

2 HCl

7

HCl

3 HCl

15 16

1718

2 HCl

2 HCl2 HCl

2

HCl








186

l’ECE. Si l’on exclue le composé 2 de cette étude, le meilleur candidat en terme d’inhibiteur

pour une concentration à 10-7 M se trouve alors être la molécule 18, celle-ci étant 2 fois plus

puissante que les composés 7, 16 et 17 dont les profils sont relativement comparables. Les

molécules 14 et 15 présentent la moins bonne affinité avec une inhibition de l’ECE

respectivement 3 et 6,5 fois moins bonne que le composé 18 à la même concentration.


Les composés 14, 16 et 18 sont très proches puisqu’ils ne se différencient que par un

substituant. En effet, le groupement méthyle de la molécule 14 est remplacé dans la molécule

16 par un groupement phényle et dans la 18 par un groupement pyrimidine. Les résultats

obtenus pour ces trois composés sont remarquables puisque le produit 18 inhibe à 26% l’ECE

à une concentration de 10-7 M alors que les produits 16 et 14 ne le font respectivement qu’à

13, 5% (soit 2 fois moins) et 8,1% (soit plus de 3 fois moins). Nous voyons qu’un groupement

méthyle n’est pas très favorable, alors qu’un groupement phényle est bien meilleur, des

interactions de type aryle-aryle doivent probablement être mises en jeu dans la poche S2’. Le

composé 18 est meilleur alors que la seule variation mise en place est la substitution du noyau

phényle par un noyau pyrimidine, suggérant qu’outre des interactions de type aryle-aryle à cet

endroit de la poche P2’ du site actif de l’ECE, des interactions de type accepteur-donneur

doivent aussi être mises en jeu.

Les synthons 7, 16 et 17 présentent des profils similaires du point de vue

pharmacologique malgré des différences de structure importantes. En effet le composé 7

comporte un acide carboxylique à la place de l’amine des composés 16 et 17. De plus les

produits 7 et 17 n’ont pas de groupements aromatiques contrairement à la molécule 16. Ils

inhibent pourtant tous à environ 13% l’ECE à une concentration de 10-7 M. Le composé 7

187

comporte un acide carboxylique de configuration déterminée. Le produit 16 a lui une amine

dans cette même position qui est rigidifiée par un cycle pipérazine. De plus, il est porteur d’un

groupement phényle. Enfin, le ligand 17 porte aussi une amine dans cette position mais la

rigidification qu’il subit est beaucoup moins forte. La perte des interactions liées au

groupement phényle porté par le composé 16 est compensée, dans le cas du produit 7, par une

plus grande flexibilité de la position de l’acide carboxylique permettant des interactions de

type accepteur-donneur. De même, le système comportant l’amine dans le ligand 17 est

beaucoup moins rigide que celui mis en jeu dans le composé 16 puisqu’une rotation du cycle

est permise par le biais d’un espaceur méthyle. La rigidification liée au cycle pipérazine ne

permet certainement pas un positionnement optimal dans le site actif de l’ECE. Par contre,

une plus grande liberté de mouvement de l’amine dans cette position semble compenser la

perte des interactions de type aryle-aryle.

Enfin les composés 14 et 15 sont de moins bons candidats en terme d’inhibiteur. Ceci

peut s’expliquer pour le premier par le fait que la position de l’amine est relativement figée

par rigidification et qu’aucune interaction de type aryle-aryle n’est possible. Les deux

groupements aminés présents sur le composé 15 ne doivent pas être à la bonne place. En effet,

le résidu butyle servant d’espaceur, positionne ces amines plus loin dans la poche P2’ et

semble limiter les interactions de types accepteur-donneur. Ceci est peut être en plus accentué

par le fait qu’elles sont à nouveau sur un cycle pipérazine rigide ne peuvent donc pas se

positionner correctement.

En conclusion, des interactions de types accepteur-donneur et de types aryle-aryle

semblent nécessaires au niveau de cette poche P2’ du site actif de l’ECE.

188

3.3.4: Composés obtenus en série rétro :

Deux composés ont été synthétisés dans cette série, à savoir les produits 21 et 22,

respectivement porteur d’un acide carboxylique et d’un acide hydroxamique (fig 61).

Figure 61 : composés « rétros »

3.3.4.1 : Données pharmacologiques :

3.3.4.1.1 : Comparaison de ces deux molécules :

Si le composé 21 ne présente aucun intérêt pharmacologique, n’inhibant quasiment pas

l’ECE, nous retrouvons pour la molécule 22 une inhibition comparable à celle obtenue pour

plusieurs de nos synthons.

NH

O

OHO

NH

ONH

O

NH

ONH

O

OH

21 22



189

3.3.4.1.2 : Comparaison des acides carboxyliques :

Figure 62 : Acides carboxyliques

Nous voyons au regard des résultats obtenus pour ces trois composés qu’ils présentent

une faible activité inhibitrice de l’ECE. Cela nous permet de confirmer à nouveau que les

acides carboxyliques ne sont pas de bons chélatants du zinc.

3.3.4.1.3 : Comparaison des acides hydroxamiques :

Figure 63 : Acides hydroxamiques

Les résultats sont un peu plus encourageants dans cette série. En effet bien que les

composés 5 et 8 ne soient pas de bons candidats inhibiteurs, le profil du ligand 22 s’avère un

NH

O

OHO

NH

O

NH

OH

O

OH

O NH

N

O H

HH

OH

OOH

O21

HCl

6 9




NH

O

NH

ONH

O

OH

NH

OH

O

NH

O

OH

NH

N

O H

HH

OH

ONH

O

OH

22 5 8




190

peu plus convaincant. En effet, il inhibe l’ECE à 16,2 % et à 24,3 % pour des concentrations

respectives de 10-7 M et 10-5 M. La seule différence entre ce composé et le 5 réside dans

l’inversion de la partie amino-acide, elle entraîne une hausse d’activité non négligeable de ce

ligand.

3.3.4.2 : Conclusions :

Les deux composés obtenus dans cette série ne sont pas de bons candidats pour notre

travail. Cependant, le composé 22 est le seul acide hydroxamique de nos molécules qui

présente un réel potentiel inhibiteur.

3.3.5: Etude du rôle de l’amine secondaire portée par la molécule (±) 1 :

Trois molécules ont servi à cette étude. En effet, deux composés porteurs d’une amine

tertiaire ont été synthétisés pour déterminer l’influence de cette fonction vis-à-vis des

interactions mises en jeu dans le site actif de l’ECE (fig. 64).

NH

OH

OPO

OHOH

NOH

OPO

OHOH

NOH

OPO

OHOH

2

HCl

19

HCl

20

HCl




Figure 64 : Etude de l’amine à partir de la plateforme acide 3-biphenyl-4-yl-2-[(phosphonomethyl)amino]propanoïque

191


Grâce à cette étude, nous avons vu que l’amine secondaire semble avoir un rôle

important dans la reconnaissance de nos ligands par l’ECE. En effet, au regard des

pourcentages d’inhibitions de ces molécules. C’est l’amine secondaire qui a la meilleure

affinité. En effet, la présence d’un groupement benzyle supplémentaire sur cette amine

entraîne une diminution de plus d’un facteur deux du pourcentage d’inhibition obtenu et celle

d’un méthyle rend le composé presqu’inactif.

3.3.5.2 : Conclusion

Nous voyons que la présence de l’atome d’hydrogène semble importante pour la

reconnaissance de nos molécules par l’ECE. La substitution de celui-ci par un méthyle fait

perdre presque complètement l’activité de ce composé. Par contre, une compensation semble

avoir lieu lorsque c’est un benzyle qui est utilisé pour substituer cet atome d’hydrogène. Une

perte d’activité est constatée mais celle-ci est bien moindre, ce qui pourrait signifier que des

interactions de types aryle-aryle pourraient être mises en jeu dans le site S1 du site actif de

l’ECE.

192

3.4 : Conclusions et perspectives :

3.4.1 : Récapitulatif des résultats pharmacologiques :

3.4.1.1 : Valeurs données par Cerep :

Tableau 15 : Molécules 1 et 10.

10-7 M 10-5M

(±) 1 60,0% 90,0% 220 nM

10 0,0% 85,0% nd

% Inhibition ECERéférence de l'inhibiteur Structure

Inhibition ECE CI50

OH

ONH

ONH

ONH

PO

OHOH

F F

NH

NH

O

FF

OH

OPO

OHOH

3.4.1.2 : Valeurs données par Dr Smith :

Tableau 16 : Molécule de référence

10-7 M 10-5M

(±) 1 nd nd 40 nM


Inhibition ECE CI50

OH

ONH

ONH

ONH

PO

OHOH

F F

193

Tableau 17 : Molécules 2 à 9.

10-7 M 10-5M

2 34,1% 99,6%

3 6,7% 10,8%

4 19,8% 100,0%

5 2,7% 4,5%

6 0,0% 11,0%

7 13,0% 37,4%

8 3,3% 11,4%

9 0,0% 0,0%


NH

OH

OPO

OHOH

HCl

NH

OH

OPO

OHOH

HCl

NH

OH

O

NH

O

OH

NH

OH

O

OH

O

HCl

NH

N

O H

HH

OH

ONH

O

OH

NH

N

O H

HH

OH

OOH

O

NH

OH

O

FF

PO

OHOH

NH

N

O H

HH

OH

OPO

OHOH HCl

194


10-7 M 10-5M

11 11,3% 18,4%

12 1,5% 8,4%

13 24,7% 30,3%

14 8,1% 26,3%

15 4,0% 27,1%

16 13,5% 33,1%

17 13,4% 33,5%


P NH

OOH

OH HCl

P NH

OOH

OH

HCl

NH

N

O

N

PO

OHOH

2 HCl

P NO

OHOH N

2 HCl

NH

NH

ON

N

O

POHOH

O

3 HCl

NH

N

O

N

PO

OHOH

2 HCl

NH

NH

OP NO

OHOH 2 HCl

195


10-7 M 10-5M

18 26,0% 17,9%

19 6,4% 13,5%

20 15,1% 35,5%

21 0,3% 1,8%

22 16,2% 24,3%

23 nd nd


NH

N

O

N

PO

OHOH

N

N

2 HCl

NOH

OPO

OHOH

HCl

NOH

OPO

OHOH

HCl

NH

O

OHO

NH

O

NH

O

NH

ONH

O

OH

NH

O

OHO

NH

O

196

3.4.2 : Conclusions :

Tout d’abord, force est de constater que les molécules synthétisées dans ce travail de

relation structure-activité ne sont pas plus affines que la molécule de référence (±) 1. Mais

ceci n’était pas un travail trivial car celle-ci présentait déjà des caractéristiques puissantes

puisque c’est un très fort inhibiteur sélectif de l’ECE possédant une CI50 de 8 nM.

Par contre, tous les composés nous ont permis d’obtenir de plus amples

renseignements sur la nature du site actif de l’ECE. Nous savions que c’était une

métalloprotéase à zinc. Nous avons mis en évidence que pour le type de squelette que nous

avions choisi, c’était la fonction acide aminophosphonique qui était la meilleure. En effet,

l’étude des acides hydroxamiques et carboxyliques a conduit à des composés non reconnus

par l’ECE. De plus, le fait d’encombrer l’amine a conduit à une baisse d’activité mais a

montré que non loin de la zone interagissant avec cette fonction des interactions de type aryle-

aryle pouvaient avoir lieu. C’est pourquoi il serait intéressant d’obtenir des molécules

diversement substituées sur le carbone en α de l’atome de phosphore comme par exemple des

chaînes insaturées ou des groupements aromatiques.

De même, il a été montré qu’au niveau de la poche S1’ occupée dans le cas de notre

molécule de référence par la chaîne aralkyle, des interactions de type aryle-aryle et de type

accepteur-donneur étaient mises en jeu. Nous avons vu que le fait de remplacer la triple

liaison par un groupement phényle était bénéfique. Il est à noter que l’utilisation

d’hétérocycles azotés de type pyridine, pyrimidine ou pyridazine par exemple à la place d’un

groupement phényle pourrait être intéressante à mettre en œuvre afin de mimer les

interactions obtenues par la présence des atomes de fluors sur la molécule de référence.

Au niveau de la poche S2’, nous avons mis en évidence qu’en plus des interactions de

types accepteur-donneur obtenues par la chaîne peptidique de la molécule de référence, des

197

interactions de types aryle-aryle pouvaient aussi être imaginées. L’apport d’un noyau

aromatique en bout de chaîne s’est avéré bénéfique.

Enfin, l’inversion de la partie amino-acide peut conduire à une augmentation du

pourcentage d’inhibition. Ceci nous a amené à envisager de décaler d’un carbone la chaîne

aralkyle se logeant dans la poche S1’ ce qui suggèrent que la poche S1’ n’a pas été totalement

explorée. L’ensemble de ces résultats est reporté sur le schéma 41.

Schéma 41 : Récapitulatifs des interactions mises en évidence.

NH

POH

OHO

NH

O

InteractionAryle-Aryle

InteractionAccepteur-Donneur etAryle-Aryle

InteractionAccepteur-Donneur

InteractionAccepteur-Donneur etAryle-Aryle

InteractionAryle-Aryle

Site S1'

Site S2'

Site S1


198

Conclusion générale

199

Depuis la caractérisation de trois peptides endogènes de structure très proches,

présentant une forte activité vasoconstrictive, notés ET-1, ET-2 et ET-3, beaucoup de travaux

permis de comprendre leurs modes d’action et leur biosynthèse. Plusieurs isoformes de

l’ECE, enzyme spécifique permettant le clivage des big ETs en ETs, ont également été

découverts. Cependant, dans le système endothélial, c’est l’ET-1 et l’ECE-1 qui sont

respectivement le peptide et l’enzyme prépondérant. L’ET-1 peut être mis en cause dans de

multiples pathologies comme par exemple l’hypertension, les vasospasmes cérébraux, l’arrêt

cardiaque chronique et bien d’autres encore. De ce fait, beaucoup d’études ont été faites pour

obtenir des agonistes ou des antagonistes des récepteurs de ce système ainsi que des

inhibiteurs de l’ECE-1. Pour ce dernier type de composés, plusieurs familles de composés ont

été décrites comme par exemple des peptides, des acides phosphoniques, des acides

aminophosphoniques ou encore des acides hydroxamiques.

Durant cette thèse, nous avons préparé une molécule de référence (±) 1 comme chef de

file et vingt deux analogues susceptibles d’être des inhibiteurs de l’enzyme de conversion de

l’endothéline par le biais d’un travail de relation structure-activité. Ces ligands ont ensuite été

testés afin de déterminer leurs caractéristiques biologiques.

Au cours de nos synthèses, un manque de réactivité des amines secondaires en β des

atomes de phosphore a été mis en évidence. Afin de mieux comprendre celui-ci, nous avons

réalisé une étude physico-chimique de ce type de composés mettant en jeu des titrages

potentiométriques et RMN de ces ligands. Cette étude nous a permis de mettre en évidence

une forte interaction entre le résidu phosphonate et l’atome d’azote en β ce qui expliquerait

cette faible réactivité chimique. Une réaction tricomposante a également été développée

permettant l’accès à des plateformes β-aminophosphonate à partir d’un aldéhyde, d’un

carbamate et d’un phosphite en présence d’acide de Lewis. Cette réaction est particulièrement

simple à mettre en œuvre et très générale.

200

L’ensemble des molécules synthétisées dans ce travail ne nous a pas permis d’accéder

à un meilleur ligand que notre chef de file. Par contre, elles nous ont permis d’obtenir de plus

amples connaissances sur la topologie du site actif de l’ECE. Pour le type de composés

étudiés, la fonction acide aminophosphonique semble être la meilleure fonction en terme de

chélation du zinc. L’amine basique de cette famille de produits contribue également à la

reconnaissance de ce type de ligand par l’ECE et des interactions de type aryle-aryle doivent

être mise en jeu à proximité de la zone occupée par celle-ci. Au niveau de la poche S1’ des

interactions de type aryl-aryl et de type accepteur-donneur ont été mises en évidence.

L’insertion d’hétérocycles azotés de type pyridine, pyrimidine ou pyridazine par exemple à la

place d’un groupement phényle pourrait conduire à des ligands intéressants. Le même de type

de conclusion a été obtenu pour la poche S2’ puisque l’apport d’un noyau aromatique

hétérocyclique en bout de chaîne s’est avéré bénéfique. Par contre, la position des fonctions

servant à assurer ces interactions est assez importante.

Suite à l’ensemble de ces remarques nous pouvons envisager l’importance d’une

troisième poche dans le site actif (S1) de cette enzyme ou à l’élargissement de la poche S1’ ce

qui pourrait être mis en évidence par l’usage des plateformes β-aminophosphonique ou par un

pontage reliant le carbone en α du phosphore à la chaîne aralkyle. Nous voyons donc que

grâce aux molécules synthétisées durant cette thèse, nous avons affiné notre connaissance du

site actif de l’ECE et qu’un grand nombre de variations restent encore envisageables.

201

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208

Annexe

209

Annexe 1 : Les acides aminés naturels :

Acides aminés à chaîne aliphatique :

Acides aminés à chaîne hydroxylée :

Acides aminés à chaîne soufrée :

NH2OH

ONH2

OH

ONH2

OH

ONH2

OH

ONH2

OH

O

GGly

Glycine

AAla

Alanine

VVal

Valine

LLeu

Leucine

IIle

Isoleucine

NH2OH

O

OH

NH2OH

O

OH

SSer

Serine

TThr

Thréonine

NH2OH

O

SH

NH2OH

O

S

CCys

Cystéine

MMet

Methionine

210

Acides aminés à chaîne carboxylée ou amide :

Acides aminés à chaîne aminée :

Acides aminés à chaîne aromatique :

NH2OH

O

O

OH

NH2OH

O

O

NH2

NH2OH

O

O OH

NH2OH

O

NH2O

DAsp

Aspartate

NAsn

Asparagine

EGlu

Acide glutamique

QGln

Glutamine

NH2OH

O

NH2

NH2OH

O

NH

NNH2

NH2OH

O

NHN

KLys

Lysine

RArg

Arginine

HHis

Histidine

NH2OH

ONH2

OH

O

OH

NH2OH

O

NH

FPhe

Phénylalanine

YTyr

Tyrosine

WTrp

Tryptophane

211

Acide aminé cyclique :

Annexe 2 : Analyse :

RMN : Résonance magnétique nucléaire

Les spectres RMN 1H, 13C et 31P ont été enregistrés avec les spectrophotomètres Bruker

DPX 200 (200 MHz) et Bruker DPX 300 (300 MHz) à transformée de Fourier, à température

ambiante. Les déplacements chimiques (δ) sont exprimés en partie par million (ppm).

RMN 1H (fréquence d’irradiation (MHz), solvant), δ (ppm) : déplacement chimique

(multiplicité du signal, valeur absolue de la constante de couplage (J), valeur de l’intégration,

attribution (Hx)).

RMN 13C (fréquence d’irradiation (MHz), solvant), δ (ppm) : déplacement chimique

(nature du carbone (C, CH2, CH3 ; attribution Cx).

Point de fusion :

Les points de fusion (Pf) sont déterminés à l’aide d’un appareil Metler FP62 et les valeurs

ne sont pas corrigées.

NH

OH

O

PPro

Proline

212

Microanalyse :

Les analyses élémentaires ont été réalisées par le service de microanalyse du C.N.R.S.

(Vernaison)

Solvants et réactifs :

Tous les réactifs ont été achetés auprès des fournisseurs suivants : Aldrich, Avocado, Fluka,

Lancaster, Sigma, et sont utilisés sans purification. Les solvants employés ont été séchés ou

distillés avant utilisation, si nécessaire. L’éther éthylique et le THF sont distillés sur

sodium/benzophénone, sous argon. La di-iso-propylamine est distillée sur KOH sous argon.

Les chromatographies préparatives sur gel de silice sont effectuées avec de la silice 60

Merck (granulométrie 40-60 µm), sous pression.

Abréviations :

arom aromatique

Bn benzyle

d doublet

dd doublet de doublet

éq équivalent

g gramme

h heure

LDA diisopropylamidure de lithium

m multiplet

213

mg milligramme

mmol millimoles

mol moles

q quadruplet

s singulet

sl, singulet large

tr triplet

T.A température ambiante

214

Partie expérimentale du chapitre II

215

Modes opératoires généraux :

Déprotection des phosphonates par NaOH 1N et TMSBr :

De la soude (1N, 3,1 éq.) est ajoutée à une solution du phosphonate correspondant (1

mmol) dans du méthanol (5 mL). Après 1h30 d’agitation à T.A, le milieu réactionnel est

concentré sous pression réduite. L’huile ainsi obtenue est solubilisée dans du dichlorométhane

(15 mL) et cette solution est mise sous agitation à T.A. De la diisopropyléthylamine (5 éq.) est

alors ajoutée au milieu réactionnel ainsi que du bromure de triméthylsilyle (20 éq.). Après 0,5

h d’agitation à T.A, le milieu réactionnel est à nouveau concentré sous pression réduite sans

chauffage. Le résidu ainsi obtenu est mis en suspension dans de l’eau (mL) et la solution

obtenue est agité à T.A pendant 0,5 h. Le précipité brun formé est alors filtré et lavé à l’éther

pour conduire à l’obtention d’un solide.

Estérification des amino-acides par le chlorure de thionyle :

L’amino-acide (100 mmol) est mis en suspension dans de l’éthanol (360 mL). La

solution est alors refroidie à 0°C puis le chlorure de thionyle (3 éq.) est ajouté goutte à goutte.

Le milieu réactionnel est agité à T.A pendant 6 h avant d’être concentré sous pression réduite.

Le solide obtenu est ensuite trituré dans l’éther puis filtré et séché pour conduire à solide

blanc.

Synthèse de la base de Schiff :

La benzophénone imine (100 mmol) est solubilisée dans du dichlorométhane (180

mL). A cette solution est ajouté le chlorhydrate d’ester méthylique ou éthylique d’amino-

acide (1 éq.) en poudre fine. Le milieu réactionnel est alors agité à T.A pendant 24 h sous

garde à chlorure de calcium avant d’être filtré. Le filtrat est ensuite condensé sous pression

réduite, puis repris dans de l’éther diéthylique. Cette solution est alors lavée à l’eau et à la

saumure, puis séchée sur sulfate de sodium et concentrée sous pression réduite. Le résidu

obtenu est trituré dans un mélange éther/hexane, puis filtré et séché pour donner un solide

blanc.

Alkylation de la base de Schiff :

La base de Schiff (50 mmol) et l’halogénure d’alkyle (1,1 éq.) sont solubilisés dans de

l’acétonitrile (790 mL). A cette solution est ajouté de l’iodure de tétra-tert-butylammonium

216

(0,1 éq.) et du carbonate de potassium (3 éq.). Le milieu réactionnel est alors chauffé à reflux

sous agitation durant 24h, puis filtré. Le filtrat est alors condensé sous pression réduite pour

conduire à une huile brune qui est utilisée telle quelle pour la suite.

Hydrolyse de l’imine :

L’imine (50,6 mmol) est mise en solution dans de l’éther éthylique (620 mL). Une

solution d’acide chlorhydrique (1N, 620 mL) est alors ajoutée. Le milieu biphasique obtenu

est alors agité vivement à T.A pendant 3 h. Après avoir laissé décanter ce mélange, la phase

aqueuse est récupérée, lavée à l’éther et concentrée sous pression réduite. Le résidu obtenu est

alors rincé à l’éther et séché pour donner un solide blanc.

Protection d’amine par un groupement Boc :

Le chlorhydrate d’amine (50 mmol) est mis en suspension dans du dichlorométhane.

La triéthylamine (2 éq.) est ensuite ajoutée et une solubilisation totale est obtenue. Une

solution de di-tert-butyldicarbonate (1,2 éq.) et de diméthylaminopyridine (1 pointe de

spatule) dans du dichlorométhane (140 mL) est alors additionnée à ce milieu réactionnel.

Après 5 heures d’agitation à T.A, celui-ci est hydrolysé par de l’eau et extrait au

dichlorométhane. La phase organique est alors lavée à l’eau et à la saumure avant d’être

séchée sur sulfate de sodium et concentrée sous pression réduite. L’huile jaune ainsi obtenue

est purifiée par chromatographie sur colonne de silice pour conduire à une huile incolore.

Saponification des esters par de la soude 1N :

L’ester (50 mmol) est mis en solution dans du méthanol (195 mL). De la soude (1N, 1

éq.) est ensuite additionnée à ce milieu réactionnel. Après 4 h d’agitation à T.A, celui-ci est

hydrolysé par l’ajout d’une solution normale d’acide chlorhydrique, puis extrait à l’acétate

d’éthyle. La phase organique est ensuite lavée à l’eau et à la saumure avant d’être séchée sur

sulfate de sodium et concentrée sous pression réduite pour conduire à l’obtention d’une huile

légèrement jaune.

Couplage d’acide et d’amine en présence de BOP :

L’acide (10 mmol) et le chlorhydrate d’amine (1,05 éq.) sont solubilisés dans

du diméthylformamide (55mL). A cette solution sont ajoutée la N-méthylmorpholine (2,1 éq.)

et le BOP (1,1 eq.). La solution obtenue est ensuite agitée à T.A pendant 17 h avant d’être

hydrolysée par de l’eau et extraite à l’acétate d’éthyle. La phase organique est ensuite lavée à

217

l’eau, avec une solution saturée de bicarbonate de sodium et à la saumure. Elle est séchée sur

sulfate de sodium et concentrée sous pression réduite. L’huile obtenue est alors

chromatographiée sur colonne de silice pour donner une huile incolore.

Déprotection du Boc en milieu acide chlorhydrique :

L’amine protégée (10 mmol) est solubilisée dans de l’acétate d’éthyle (32 mL). Après

saturation de cette solution par de l’acide chlorhydrique gazeux, le milieu réactionnel est agité

à T.A pendant 30 minutes avant d’être concentré sous pression réduite. Le résidu obtenu est

alors trituré dans de l’éther diéthylique, filtré et séché pour conduire à un solide blanc.

Couplage d’une amine sur une solution de triflate :

Le chlorhydrate d’amine est mis en suspension dans du benzène. Du gaz l’ammoniac

est mis à buller dans cette suspension pendant 20 minutes afin de neutraliser le chlorhydrate.

Le milieu réactionnel obtenu est filtré et concentré sous pression réduite.

L’amine (10 mmol) est mise en suspension dans du dichlorométhane (45 mL). De la

diisopropyléthylamine (1,5 éq.) est ensuite additionnée. La solution obtenue est alors refroidie

à 0°C puis la solution de diméthyl((((trifluorométhyl)sulfonyl)oxy)methyl)phosphonate (1,25

éq.) est ajoutée en une fois. Le milieu réactionnel est agité à 0°C pendant 3 h avant d’être

hydrolysé par ajout d’eau puis extrait au dichlorométhane. La phase organique est ensuite

lavée par une solution saturée de bicarbonate de sodium et de la saumure avant d’être séchée

sur sulfate de sodium et concentrée sous pression réduite. L’huile jaune obtenue est purifiée

par chromatographie sur colonne de silice pour conduire à une huile incolore.

Estérification d’amino-acide par le chlorure d’acétyle :

Le chlorure d’acétyle (2,85 éq.) est ajouté goutte à goutte à du méthanol (140 mL)

refroidi à 0°C. Une fois l’addition terminée, le milieu réactionnel est agité à 0°C pendant 10

minutes, puis l’amino-acide (100 mmol) est ajouté d’un coup. La solution est alors chauffée à

reflux durant 3 h, puis concentrée sous pression réduite. Le résidu obtenu est trituré dans

l’éther, filtré et séché pour donner un solide blanc.

Couplage d’un chlorhydrate d’amine sur un triflate :

Le chlorhydrate d’amine (5 mmol) est mis en suspension dans du dichlorométhane (35

mL). De la diisopropyléthylamine (2 éq.) est ensuite additionnée. La solution obtenue est

alors refroidie à 0°C le diméthyl((((trifluorométhyl)sulfonyl)oxy)methyl)-phosphonate (1,2

218

éq.) est ajouté en solution dans du dichlorométhane (7 mL) en une fois. Le milieu réactionnel

est agité à 0°C pendant 30 minutes puis à T.A pendant 8 h avant d’être hydrolysé par ajout

d’eau et extrait au dichlorométhane. La phase organique est ensuite lavée par une solution

saturée de bicarbonate de sodium et de la saumure avant d’être séchée sur sulfate de sodium et

concentrée sous pression réduite. L’huile jaune obtenue est purifiée par chromatographie sur

colonne de silice pour conduire à une huile incolore.

Déprotection de phosphonate en milieu acide chlorhydrique :

Le phosphonate (1,0 mmol) est mis en suspension dans une solution aqueuse d’acide

chlorhydrique (6N, 10 mL). Ce milieu réactionnel est chauffé à reflux durant 2 h avant d’être

condensé sous pression réduite à l’aide d’un co-entraînement à l’éthanol et trituré dans un

mélange éthanol/éther pour conduire à un solide blanc.

Déprotection d’ester tert-butylique (ou de Boc) par de l’acide trifluoroacétique :

L’ester tert-butylique (ou l’amine boquée) (1 mmol) est mis en solution dans du

dichlorométhane (5 mL). A cette solution est ajouté de l’acide trifluoroacétique (5 mL). Au

bout de 3 h d’agitation à T.A, le milieu réactionnel est concentré sous pression réduite et le

résidu obtenu est trituré dans de l’éther diéthylique, filtré et séché pour conduire à un solide

légèrement beige.

Déprotection d’ester benzylique par hydrogénation catalytique en présence de

Pd/sulfate de baryum :

L’ester benzylique (1 mmol) est solubilisé dans du méthanol (30 mL). Du palladium

sur sulfate de baryum (0,41 g) est ajouté à cette solution après dégazage sous azote pendant 10

minutes. Le milieu réactionnel est ensuite agité à T.A sous une pression de 50 psis

d’hydrogène pendant 12 h. La solution est ensuite filtrée sur célite puis concentrée sous

pression réduite. Le résidu obtenu est ensuite trituré dans de l’éther diéthylique, filtré et séché

pour donner un solide blanc.

Synthèse de phosphonate par une réaction tricomposante :

Sous atmosphère d’azote, un mélange d’aldéhyde (10 mmol), de diméthylphosphate (1

éq.) et de carbamate de benzyle (1 éq.) en solution dans de l’acétonitrile (50 mL) est agité à

0°C. A cette solution est ajouté du BF3.OEt2 (1,2 éq.) en une seule fois. Au bout de quelques

minutes, un précipité fin apparaît qui disparaît au fur et à mesure de l’avancement de la

219

réaction. Au bout de 30 minutes d’agitation à 0°C, la solution est remise à T.A et agitée ainsi

pendant 4 h. Le milieu réactionnel est alors hydrolysé par ajout d’une solution saturée de

bicarbonate de sodium puis extrait au toluène. La phase organique est ensuite lavée à la

saumure, séchée sur sulfate de sodium, filtrée et condensée sous pression réduite. L’huile

obtenue est purifiée par chromatographie sur colonne de silice pour conduire à l’obtention

d’un solide blanc.

220

Acide (S, S)-2-{2-[5-(2,4-difluorophényl)-2-(phosphonométhylamino)-pent-4-ynoylamino]-4-méthyl-pentanoylamino}-propionique [(±) 1]

Formule brute : C21H28F2N3O7P

Masse molaire : 503,44 g/mol

Composé obtenu selon le mode opératoire de déprotection des phosphonates par

NaOH 1N et TMSBr en utilisant du (S, S)-2-{2-[5-(2,4-difluorophényl)-2-

([{diméthoxyphosphoryl}-méthyl]-amino)-pent-4-ynoylamino]-4-méthyl-pentanoylamino}-

propionate de méthyle 40 (0,70g, 1,3 mmol), de la soude (1N, 4 mL, 3,1 éq.), de la

diisopropyléthylamine (1,14 mL, 5 éq.) et du bromure de triméthylsilyle (3,4 mL, 20 éq.).

Obtention d’un solide beige (0,13 g).

Rendement : 20%Point de fusion : 205-208°C.

RMN 1H (300 MHz, DMSO-TFA) δ : 7,53-7,59 (m, 1H, Harom) ; 7,28-7,33 (m, 1H, Harom) ;7,05-7,12 (m, 1H, Harom) ; 4,45 (t, J=7 Hz, 1H, CH) ; 4,27 (t, J=7Hz, 1H, CH) ; 4,03 (m, 1H,CH) ; 3,00-3,28 (m, 5H) ; 1,55-1,73 (m, 1H) ; 1,50 (t, J=7 Hz, 2H) ; 1,20-1,30 (m, 1H) ; 1,15(d, J=7 Hz, 3H) ; 0,91 (d, J=7Hz, 6H).

RMN 13C (75 MHz, DMSO-TFA) δ : 176,2 (C, C=O) ; 174,3 (C, C=O) ; 171,6(C, C=O) ;167,8 (C, CaromF) ; 167,5 (C, CaromF) ; 133,1 (CH, CArom) ; 111,7 (CH, Carom) ; 106,5 (CH,Carom) ; 104,3 (CH, Carom) ; 90,3 (C, C13) ; 83,4 (C, C14) ; 64,8 (CH) ; 57,8 (CH) ; 47,9 (CH) ;41,6 (CH2, C21) ; 41,1 (CH2, C6) ; 25,1 (CH,) ; 22,0 (2 CH3, C8 et C9) ; 19,7 (CH2, C12) ; 17,3(CH3, C3)

RMN 31P (121,5 MHz, DMSO-TFA) δ : 13,1

Microanalyse : C21H28F2N3O7P, 0,5 H2OC H N

Calculé : 49,22 5,70 8,20Trouvé : 49,11 5,72 8,18

OH

ONH

ONH

ONH

F F

PO

OHOH

12

3

45

67

8

9

10

11

1213

14

15

16 17 18

1920

21

221

Chlorhydrate de l’acide 3-biphényl-4-yl-2-[(phosphonométhyl)amino]propanoïque (2)

Formule brute : C16H19ClNO5PMasse molaire : 371,76 g/mol

Composé obtenu selon le mode opératoire de déprotection de phosphonate en milieu

acide chlorhydrique en utilisant du 3-biphényl-4-yl-2-{[(diméthoxyphosphoryl)-méthyl]-

amino}-propanoate de méthyle 46 (0,30 g, 0,80 mmol). Obtention d’un solide blanc (0,13 g)

Rendement : 44%Point de fusion : 209-212°C

RMN 1H (200 MHz, DMSO) δ : 7,54-7,72 (m, 4H, 4 Harom) ; 7,23-7,51 (m, 5H, 5 Harom) ;4,22-4,54 (m, 1H, NH) ; 3,55-3,74 (m, 1H, CH) ; 2,94-3,51 (m, 4H, 2 CH2).

RMN 13C (50 MHz, DMSO) δ : 171,9 (C, C1) ; 140,3 (C, Carom) ; 139,9 (C, Carom) ; 136,7 (C,Carom) ; 129,3 (CH, 2 CHarom) ; 129,0 (CH, 2 CHarom) ; 128,3 (CH, 2 CHarom) ; 127,7 (C, C13) ;126,6 (CH, 2 CHarom) ; 57,2 (CH, C2) ; 45,5-41,5 (CH2, C17); 38,1 (CH2, C4).

RMN 31P (81 MHz, DMSO) δ : 14,2

Microanalyse pour C16H19ClNO5P, 0,2 H2OC H N

Calculé : 51,20 5,21 3,73Trouvé : 51,18 5,26 3,87

Chlorhydrate de l’acide 3-phényl-2-[(phosphonométhyl)amino]propanoïque (3)



acide chlorhydrique en utilisant du 2-{[(diméthoxyphosphoryl)méthyl]amino}-3-

phénylpropanoate de méthyle 48 (0,19 g, 0,63 mmol). Obtention d’un solide blanc (72 mg).

NH

OH

OPO

OHOH

HCl1

2

345

6

78

9

10

11 12

1314

15

16

NH

OH

OPO

OHOH

HCl,

12

34

56

7

8910

222


RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,31-7,50 (m, 5H, 5 Harom) ; 4,46 (t, 6,7 Hz, 1H, CH) ; 3,12-3,40 (m, 4H, 2 CH2)

RMN 13C (75 MHz, MeOD) δ : 172,0 (C, C1) ; 139,2 (C, C4) ; 130,1 (CH, 2 CHarom) ; 130,0(CH, 2 CHarom) ; 128,9 (CH, C7) ; 58,1 (CH, C2) ; 44,6-37,0 (CH2, C10); 41,5 (CH2, C3).

RMN 31P (121,5 MHz, MeOD) δ : 15,6


Calculé : 38,96 5,36 4,54Trouvé : 39,07 5,35 4,49

Acide -5-(2,4-difluorophényl)-2-(phosphonométhyl-amino)-pent-4-ynoïque (4)

Formule brute : C12H12F2NO5PMasse molaire : 319,20 g/mol

Composé obtenu selon le mode opératoire de déprotection des phosphonates par de lasoude 1N et du TMSBr en utilisant du 2-{[(diméthoxyphosphoryl)-méthyl]-amino}-5-(2,4-difluorophényl)-pent-4-ynoate d’éthyle 49 (0,28 g, 0,75 mmol), de la soude (1N, 2,3 mL, 3,1éq.), de la diisopropyléthylamine (0,66 mL, 5 éq.) et du TMSBr (2,0 mL, 20 éq.). Obtentiond’un solide beige (50 mg).


RMN 1H (300 MHz, DMSO-TFA) δ : 7,48-7,63 (m, 1H, Harom) ; 7,28-7,46 (m, 1H, 1 Harom) ;7,07-7,26 (m, 1H, 1 Harom) ; 6,17-6,33 (m, 1H, NH) ; 4,17-4,34 (m, 1H, CH) ; 3,15-3,38 (m,2H, CH2) ; 2,90-3,11 (m, 2H, CH2)

RMN 13C (75 MHz, DMSO-TFA) δ : 168,1 (C, C1) ; 159,9-161,6 (C, CaromF) ; 166,5-160,0(C, CaromF) ; 135,1 (CH, C7) ; 111,5-110,8 (CH, C8) ; 107,3-106,6-105,8 (CH, C10) ; 104,5-103,8 (CH, C6) ; 89,0 (C, Calcyne) ; 82,6 (C, Calcyne) ; 64,9 (CH, C2) ; 45,4-41,3 (CH2, C12) ;27,5 (CH2, C3).


NH

OH

O

FF

PO

OHOH

12

3

45

67

8

9

10

11

12

223

Microanalyse pour C12H12F2NO5P, 0,6 H2OC H N

Calculé : 43,67 4,03 4,25Trouvé : 43,56 4,05 4,31

Acide 3-biphényl-4-yl-2-{[2-(hydroxyamino)-2-oxoéthyl]amino}propanoïque (5)

Formule brute : C17H18N2O4Masse molaire : 314,34 g/mol

Composé obtenu selon le mode opératoire de déprotection d’ester benzylique par

hydrogénation catalytique en présence de Pd/sulfate de baryum en utilisant de l’acide 2-({2-

[(benzyloxy)amino]-2-oxoéthyl}amino)-3- biphényl-4-ylpropanoïque 55 (0,17 g, 0,42 mmol)

et 170 mg de palladium sur sulfate de baryum. Obtention d’un solide blanc (0,13 g).

Rendement : 98 %Point de fusion : 189-193°C

RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,28-7,72 (m, 9H, 9 Harom) ; 3,91-4,15 (m, 1H, CH) ; 3,45-3,72 (m, 2H, CH2), 3.01-3.35 (m, 2H, CH2).

RMN 13C (75 MHz, MeOD) δ : 171,1 (C, C=O) ; 170,6 (C, C=O) ; 140,2 (C, Carom) ; 138,7(C, Carom) ; 136,1 (C, Carom) ; 129,5 (CH, 2 CHarom) ; 129,2 (CH, 2 CHarom) ; 128,6 (CH, 2CHarom) ; 127,5 (CH, C13) ; 126;8 (CH, 2 CHarom) ; 56,2 (CH, C2) ; 44,8 (CH2, C16) ; 38,0(CH2, C3).

Microanalyse : C17H18N2O4C H N

Calculé : 64,96 5,77 8,91Trouvé : 65,11 5,59 8,97

NH

OH

O

NH

O

OH 1

2

34

56

78

9

10

1112

13

1415

16

17

224

Chlorhydrate de l’acide 3-biphényl-4-yl-2-[(carboxyméthyl)amino]propanoïque (6)

Formule brute : C17H18ClNO4Masse molaire : 335.79 g/mol

Composé obtenu selon le mode opératoire de déprotection des phosphonates en milieu

acide chlorhydrique en utilisant du 2-[(2-tert-butoxy-2-oxoéthyl)amino]-3-biphényl-4-yl-

propanoate de méthyle 52 (0,31 g, 0,84 mmol). Obtention d’un solide blanc (0,15 g).


RMN 1H (200 MHz, MeOD) δ : 7,25-7,74 (m, 9H, 9 Harom) ; 4,13-4,48 (m, 3H, CH et CH2) ;3,72-4,07 (m, 2H, CH2).

RMN 13C (50 MHz, MeOD) δ : 173,0 (C, C=O) ; 168,5 (C, C=O) ; 140,0 (C, Carom) ; 139,1(C, Carom) ; 136,3 (C, Carom) ; 130,2 (CH, 2 CHarom) ; 129,0 (CH, 2 CHarom) ; 128,4 (CH, 2CHarom) ; 127,3 (CH, C13) ; 127,0 (CH, 2 CHarom) ; 55,8 (CH, C2) ; 44,0 (CH2, C16) ; 38,9(CH2, C3).

Microanalyse pour C17H18ClNO4, 0,3 H2OC H N

Calculé : 59,84 5,50 4,11Trouvé : 59,76 5,48 4,19

Chlorhydrate de l’acide (2S,3aS,7aS)-1-(2-(phosphonométhyl)amino-3-(biphényl-4yl)-propanoyl)octahydro-1H-indole-2-carboxylique (7)

Formule brute : C25H35ClN2O6PMasse molaire : 522,97 g/mol


acide chlorhydrique en utilisant de l’acide (2S,3aS,7aS)-1-(2-

NH

OH

O

OH

O

HCl, 12

3

4

5 6

78

9

10

11 1213

1415

16

17

NH

N

O H

HH

OH

OPO

OHOH HCl

1 2

345

67

8

9

1011

12

13 14

15

1617

18192021

22 2324

25

225

((diméthoxyphosphoryl)méthyl)amino-3-(biphényl-4yl)-propanoyl)octahydro-1H-indole-2-

carboxylique 59 (0,33 g, 0,64 mmol). Obtention d’un solide blanc (0,11 g)

Rendement : 33%

RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,15-7,73 (m, 9H, 9 Harom) ; 4,27-4,72 (m, 1H, CH) ; 3,87-4,20 (m, 1H, CH) ; 3,63-3,82 (m, 1H, CH) ; 3,42-3,55 (m, 1H, CH2) ; 3,03-3,32 (m, 2H,CH2) ; 2,25-2,81 (m, 2H, CH2) ; 0,94-2,17 (m, 10H, 5 CH2).

RMN 13C (75 MHz, MeOD) δ : 174,3 (C, C=O) ; 174,1 (C=O) ; 141,3 (C, Carom) ; 140,0 (C,Carom) ; 136,1 (C, Carom) ; 129,5 (CH, 2 CHarom) ; 129,1 (CH, 2 CHarom) ; 128,0 (CH, 2 CHarom); 127,6 (CH, C13) ; 126,7 (CH, 2 CHarom) ; 65,0 (CH) ; 64,7 (CH) ; 61,3 (CH) ; 44,6-40,7(CH2, C1) ; 37,3 (CH2) ; 36,0 (CH) ; 33,1 (CH2) ; 29,8 (CH2) ; 28,1 (CH2) ; 24,3 (CH2) ; 23,0(CH2).

RMN 31P (121,5 MHz, MeOD) δ : 13,5

Microanalyse pour C25H35ClN2O6P, 0,8 H2OC H N

Calculé : 55,56 6,83 5,18Trouvé : 55,38 6,91 5,11

Acide (2S,3aS,7aS)-1-(2-{[2-(hydroxyamino)-2-oxoéthyl]amino}-3-biphényl-4-yl-propanoyl)octahydro-1H-indole-2-carboxylique (8)



hydrogénation catalytique en présence de Pd/sulfate de baryum en utilisant du (2S,3aS,7aS)-1-

(2-{[2-(benzyloxyamino)-2-oxoéthyl]-amino}-3-biphényl-4-yl-propanoyl)-octahydro-1H-

indole-2-carboxylate de phényle 62 (0,23 g, 0,36 mmol) et 150 mg de palladium sur sulfate de

baryum. Obtention d’un solide blanc (0,15 g).


NH

N

O H

HH

OH

ONH

O

OH 12 3

456

78

9

10

1112

13

14 1516

1718

1920

212223

2425

26

226

RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,15-7,73 (m, 9H, 9 Harom) ; 4,32-4,75 (m, 1H, CH) ; 3,92-4,31 (m, 1H, CH) ; 3,65-3,84 (m, 1H, CH) ; 3,51-3,60 (m, 1H, CH) ; 3,01-3,35 (m, 4H,2CH2) ; 0,94-2,22 (m, 10H, 5 CH2)

RMN 13C (75 MHz, MeOD) δ : 174,2 (C, C=O) ; 172,0 (C, C=O) ; 168,5 (C, C=O) ; 139,9(C, Carom) ; 139,5 (C, Carom) ; 136,0 (C, Carom) ; 130,2 (CH, 2 CHarom) ; 130,2 (CH, 2 CHarom) ;128,7 (CH, 2 CHarom) ; 128,1 (CH, 2 CHarom) ; 127,3 (CH, C14) ; 127,0 (CH, 2 CHarom) ; 65,1(CH); 64,6 (CH); 62,0 (CH); 45,7 (CH2) ; 37,9 (CH2); 36,0 (CH) ; 32,1 (CH2) ; 30,2 (CH2) ;28,7 (CH2) ; 23,5 (CH2) ; 22,9 (CH2).

Microanalyse pour C26H31N3O5, 0,5 H2OC H N

Calculé : 65,80 6,80 8,86Trouvé : 66,02 6,63 8,93

Acide (2S, 3aS, 7aS)-1-(2- carboxyméthyl)amino -3-biphényl-4-ylpropanoyl)octahydro-1H-indole-2-carboxylique (9)



hydrogénation catalytique en présence de Pd/sulfate de baryum en utilisant du (2S,3aS,7aS)-1-

(2-(2-benzyloxy-2-oxoéthyl)-amino-3-biphényl-4-yl-propanoyl)-octahydro-1H-indole-2-

carboxylate de phényle 63 (0,18 g, 0,28 mmol) et 120 mg de palladium sur sulfate de baryum.

Obtention d’un solide blanc (0,12 g).


RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,20-7,68 (m, 9H, 9 Harom) ; 4,20-4,46 (m, 1H, CH) ; 4,01-4,13 (m, 1H, CH) ; 3,52-3,61 (m, 1H, CH) ; 3,35-3,42 (m, 1H, CH) ; 3,11-3,27 (m, 2H, CH2) ;2,29-2,53 (m, 2H, CH2) ; 0,98-2,17 (m, 10H, 5 CH2).

RMN 13C (75 MHz, DMSO-TFA) δ : 174,8 (C, C=O) ; 174,1 (C, C=O) ; 168,2(C, C=O) ;140,2 (C, Carom) ; 139,7 (C, Carom) ; 135,5 (C, Carom) ; 130,2 (CH, 2 CHarom) ; 129,2 (CH, 2CHarom) ; 128,1 (CH, 2 CHarom) ; 127,5 (CH, C14) ; 127,0 (CH, 2 CHarom) ; 65,0 (CH); 64,6

NH

N

O H

HH

OH

OOH

O

12 3

54

6

78

9

10

1112

13

14 15

16

1718

1920

21

2223

24 25

26

227

(CH); 60,5 (CH); 49,1 (CH2) ; 38,9 (CH2); 36,0 (CH) ; 32,6 (CH2) ; 30,1 (CH2) ; 28,5 (CH2) ;23,6 (CH2) ; 23,0 (CH2).


Calculé : 67,16 6,85 6,03Trouvé : 66,89 6,71 6,21

Acide -2-[5-(2,4-difluorophényl)-2-(phosphonométhylamino)-pent-4-ynoylamino]-pentanoïque (10)

Formule brute : C17H21F2N2O6PMasse molaire : 418,34 g/mol

Composé obtenu selon le mode opératoire de déprotection des phosphonates par de la

soude 1N et du TMSBr en utilisant du 5-[2-(((diméthoxyphosphoryl)méthyl)amino-5-(2,4-

difluorophényl)-pent-4-ynoylamino]pentanoate de méthyle 67 (0,66 g, 1,4 mmol), de la soude

(1N, 4,5 mL, 3,1 éq.), de la diisopropyléthylamine (1,26 mL, 5 éq.) et du TMSBr (3,8 mL, 20

éq.). Obtention d’un solide beige (0,13 g).


RMN 1H (300 MHz, DMSO-TFA) δ : 7,45-7,61 (m, 1H, Harom) ; 6,80-7,05 (m, 2H, 2Harom) ;4,21 (t, J= 6,5 Hz, 1H, CH) ; 3,72 (s, 3H, OMe) ; 3,36-3,51 (m, 2H, CH2(N)) ; 3,14 (d,J=6,5 Hz, 2H, CH2alcyne) ; 2,78 (t, J=7,1 Hz, 2H, CH2(C=O)) ; 1,50-1,76 (m, 4H, 2 CH2).RMN 13C (75 MHz, DMSO-TFA) δ : 179,1 (C, C=O) ; 167,5-161,0 (C, CaromF) ; 165,9-159,3 (C, CaromF) ; 159,7 (C, C=O) ; 132,8 (CH, C12) ; 111,5-110,7(CH, C13) ; 107,2-106,4-105,9 (CH, C15) ; 104.1-104,0 (C, C11) ; 91,0 (C, CHalcyne) ; 81,8 (C, CHalcyne) ;64,8 (CH, C7) ;44,8-40,7 (CH2, C17) ; 40,3 (CH2, C5) ; 33,8 (CH2, C2) ; 28,1 (CH2) ; 22,0 (CH2) ; 20,1 (CH2).


Microanalyse pour C17H21F2N2O6PC H N

Calculé : 48,81 5,06 6,70Trouvé : 49,03 4,97 6,76

NH

NH

O

FF

OH

OPO

OHOH

12

3

4

5

67

89

1011 12

13

141516

17

228

Acide {[(2-phényléthyl)amino]méthyl}phosphonique (11)



acide chlorhydrique en utilisant du {[(2-phényléthyl)amino]méthyl}-phosphonate de

diméthyle 68 (0,22 g, 0,90 mmol). Obtention d’un solide blanc (0,12 g)

Rendement : 51%

RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ : 7,14-7,43 (m, 5H, 5 Harom) ; 3,13-3,37 (m, 4H, 2 CH2) ;2,81-3,02 (m, 2H, CH2).

RMN 13C (75 MHz, DMSO) δ : 140,6 (C, C6) ; 129,3 (CH, 2 CHarom) ; 128,1 (CH, 2 CHarom); 126,1 (CH, C7) ; 53,2 (CH2) ; 48,3 (CH2) ; 35,0 (CH2).

RMN 31P (121,5 MHz, DMSO) δ : 14,6

Microanalyse pour C9H15ClNO3PC H N

Calculé : 42,96 6,01 5,57Trouvé : 43,11 5,88 5,63

Acide [(4-phénylpipérazin-1-yl)méthyl]phosphonique (12)

Formule brute : C11H19Cl2N2O3PMasse molaire : 329,17 g/mol


acide chlorhydrique en utilisant du diméthyl [(4-phénylpipérazin-1-yl)méthyl]phosphonate 69

(0,30 g, 1,05 mmol). Obtention d’un solide blanc (0,16 g)

Rendement : 48 %

P NH

OOH

OH HCl,

1 2

3

4

56

7

89

P NO

OHOH N

2 HCl,

1 23

4 56 7

8

910

11

229

RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ : 7,12-7,30 (m, 2H, 2 Harom) ; 6,88-6,93 (m, 2H, 2 Harom) ;6,70-6,85 (m, 1H, Harom) ; 3,23-3,71 (m, 10H, 5 CH2).

RMN 13C (75 MHz, DMSO) δ : 150,6 (C, C6) ; 129,3 (CH, 2 CHarom) ; 120,5 (CH, C9) ;117,0 (CH, 2 CHarom) ; 53,1 (CH2, C1) ; 52,6 (2 CH2) ; 51,1 (2 CH2).

RMN 31P (121,5 MHz, DMSO) δ : 15,1

Microanalyse pour C11H19Cl2N2O3PC H N

Calculé : 40,14 5,82 8,51Trouvé : 39,96 5,86 8,37

Acide {[(2,2-diphényléthyl)amino]méthyl}phosphonique (13)



acide chlorhydrique en utilisant du {[(2,2-diphényléthyl)amino]méthyl}-phosphonate de

diméthyle 70 (0,26 g, 0,81 mmol). Obtention d’un solide blanc (0,12 g)

Rendement : 45%

RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ : 8,84 (sl, 1H, NH) ; 7,10-7,47 (m, 10H, 10 Harom) ; 4,43 (t,J= 5Hz, 1H, CH) ; 3,80 (d, J= 7,2 Hz, 2H, CH2) ; 3,17 (d, J= 13,1 Hz, 2H, CH2(-P)).

RMN 13C (75 MHz, DMSO) δ : 149,3 (C, C4 et C10) ; 128,5 (CH, 4 CHarom) ; 127,7 (CH, 4CHarom) ; 126,6 (CH, C7 et C13) ; 52,6 (CH2) ; 51,8 (CH2) ; 45,9 (CH, C3).

RMN 31P (121,5 MHz, DMSO) δ : 15,8


Calculé : 54,97 5,84 4,27Trouvé : 54,79 5,88 4,16

P NH

OOH

OHHCl,

1 23

4 56

7

89

1011

1213

14

15

230

Acide ({[1-(biphényl-4-yl)-2-(4-méthylpipérazin-1-yl)-2-oxoéthyl]amino}méthyl)phosphonique (14)



acide chlorhydrique en utilisant du {[((1-biphényl-4-yl)-2-oxo-2-(4-méthylpipérazin-1-yl)-

éthyl)-amino]-méthyl}-phosphonate de diméthyle 77 (0,27 g, 0,61 mmol). Obtention d’un

solide blanc (0,11 g)


RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,12-7,84 (m, 9H, 9 Harom) ;4,45-4,73 (m, 1H, CH) ; 3,30 (s,3H, Me) ; 2,98-4,04 (m, 8H, 4 CH2) ; 2,65-2,97 (m, 2H, CH2) ; 2,18-2,61 (m, 2H, CH2).

RMN 13C (75 MHz, MeOD) δ : 172,6 (C, C=O) ; 140,6 (C, Carom) ; 140,1 (C, Carom) ; 136,7(C, Carom) ; 130,0 (CH, 2 CHarom) ; 129,2 (CH, 2 CHarom) ; 127,9 (CH, 2 CHarom) ; 127,5 (CH,C13) ; 127,1 (CH, 2 CHarom) ; 62,3 (CH, C2) ; 55,0 (CH2) ; 54,6 (CH2) ; 47,2 (CH3, C21) ; 44,8-41,2 (CH2, C1) ; 41,0 (CH2) ; 40,2 (CH2) ; 37,3 (CH2).RMN 31P (121,5 MHz, MeOD) δ : 14,5

Microanalyse pour C21H30Cl2N3O4P, 1 H2OC H N

Calculé : 49,61 6,34 8,27Trouvé : 49,53 6,41 8,20

NH

N

O

N

PO

OHOH 2 HCl,

231

Trichlorhydrate de l’acide 4{[1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-oxo-2-{4-[4-(2-méthoxyphényl)pipérazin-1-yl]butyl}aminoéthyl]amino}méthylphosphonique (15)



acide chlorhydrique en utilisant du 4{[1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-oxo-2-{4-[4-(2-

méthoxyphényl)pipérazin-1-yl]butyl}aminoéthyl]amino}méthylphosphonate de diméthyle 79

(0,29 g, 0,48 mmol). Obtention d’un solide blanc (0,12 g)


RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,26-7,82 (m, 9H, 9 Harom) ; 6,78-7,21 (m, 4H, 4 Harom) ;4,33-4,37 (m, 1H, CH) ; 3,88 (s, 3H, OMe) ; 2,81-3,65 (m, 16H, 8 CH2) ; 1,11-1,85 (m, 4H, 2CH2).

RMN 13C (75 MHz, MeOD) δ : 170,3 (C, C=O) ; 150,4 (C, Carom) ; 141,5 (C, Carom) ; 141,1(C, Carom) ; 140,2 (C, Carom) ; 136,2 (C, Carom) ; 130,3 (CH, 2 CHarom) ; 129,0 (CH, 2 CHarom) ;128,1 (CH, 2 CHarom et C28) ; 127,5 (CH, C13) ; 127,1 (CH, 2 CHarom) ; 120,0 (CH, CHarom) ;114,5 (CH, CHarom) ; 111,9 (CH, CHarom) ; 60,5 (CH, C2) ; 56,0 (CH3, C31) ; 55,2 (CH2) ; 52,9(2 CH2) ; 52,5 (CH2) ; 45,1- 41,2 (CH2, C1) ; 40,1 (CH2) ; 36,5 (CH2) ; 28,7 (CH2) ; 28,2(CH2).

RMN 31P (121,5 MHz, MeOD) δ : 16,4

Microanalyse pour C31H44Cl3N4O5P, 0,5 H2OC H N

Calculé : 53,26 6,49 8,02Trouvé : 53,34 6,61 7,91

NH

NH

ON

N

O

POHOH

O

3 HCl,

1

2

345

6 7

89

10 1112

1314

15

16

17

18

19

20 2122

2324 25

2627

282930

31

232

Acide ({[(1-biphényl-4-yl)-2-oxo-2-(4-méthylpipérazin-1-yl)éthyl]amino}méthyl)phosphonique (16)


Composé obtenu selon le mode opératoire de déprotection phosphonate en milieu

acide chlorhydrique en utilisant du ({[(1-biphényl-4-yl)-2-oxo-2-(4-phénylpipérazin-1-yl)-

éthyl]-amino}-méthyl)-phosphonate de diméthyle 81 (0,18 g, 0,35 mmol). Obtention d’un

solide blanc (80 mg).


RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,69-7,83 (m, 2H, 2 Harom) ; 7,30-7,68 (m, 7H, 7 Harom) ;7,01-7,23 (m, 5H, 5 Harom) ; 4,03-4,27 (m, 1H, CH) ; 3,55-3,88 (m, 2H, CH2) ; 3,23-3,54 (m,8H, 4 CH2) ; 2,98-3,21 (m, 2H, CH2).

RMN 13C (75 MHz, MeOD) δ : 173,6 (C, C=O) ; 150,8 (C, Carom) ; 142,5 (C, Carom) ; 140,0(C, Carom) ; 135,8 (C, Carom) ; 130,1 (CH, 2 CHarom) ;129,2 (CH, 2 CHarom) ; 129,0 (CH, 2CHarom) ; 128,0 (CH, 2 CHarom) ; 127,5 (CH, C13) ; 126,9 (CH, 2 CHarom) ; 121,0 (CH, C24) ;117,3 (CH, 2 CHarom) ; 62,7 (CH, C2) ; 51,4 (2 CH2) ; 44,6-40,6 (CH2, C1) ; 41,8 (CH2) ; 41,7(CH2) ; 37,3 (CH2).

RMN 31P (121,5 MHz, MeOD) δ : 16,1


Calculé : 56,53 5,84 7,61Trouvé : 56,40 5,93 7,74

NH

N

O

N

PO

OHOH 2 HCl,

1

2

34

56 7

89

1011 12

1314

15

1617 18

1920

21

22 2324

2526

233

Dichlorhydrate de l’acide ({[1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-{[(1-éthylpyrrolidin-2-yl)méthyl]amino}-2-oxoéthyl]amino}méthyl)phosphonique (17)



acide chlorhydrique en utilisant du {[1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-{[(1-éthylpyrrolidin-2-

yl)méthyl]amino}-2-oxoéthyl]amino}méthylphosphonate de diméthyle 83 (0,23 g, 0,49

mmol). Obtention d’un solide blanc (0,1 g)

Rendement : 39%

RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,54-7,71 (m, 4H, 4 Harom) ; 7,27-7,50 (m, 5H, 5 Harom) ;4,78-4,90 (m, 1H, CH) ; 4,39-4,55 (m, 1H, CH) ; 3,16-3,80 (m, 8H, 4 CH2) ; 2,88-3,13 (m,2H, CH2) ; 1,54-2,12 (m, 4H, 2 CH2) ; 1,21-1,42 (m, 3H, Me).

RMN 13C (75 MHz, DMSO-TFA) δ : 171,2 (C, C=O) ;141,4 (C, Carom) ;139,8 (C, Carom) ;135,5 (C, Carom) ; 130,1 (CH, 2 CHarom) ; 129,0 (CH, 2 CHarom) ; 128,1 (CH, 2 CHarom) ; 127,6(CH, C13) ; 127,0 (CH, 2 CHarom) ; 64,5 (CH) ; 62,1 (CH) ; 54,6 (CH2) ; 48,9 (CH2) ; 44,6-40,6 (CH2, C1) ; 39,9 (CH2) ; 36,4 (CH2) ; 30,1 (CH2) ;23,0 (CH2) ; 13,3 (CH3, C23).


Microanalyse pour C23H34Cl2N3O4P, 1 H2OC H N

Calculé : 51,50 6,76 7,83Trouvé : 51,53 6,85 7,69

NH

NH

OP NO

OHOH 2 HCl

1

2

345

67

8910 11

12

1314

15

16 1718

1920

21

22

23

234

Dichlorhydrate de l’acide {[1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-oxo-2-(4-pyrimidin-2-ylpipérazin-1-yl)éthyl]amino}méthyl-phosphonique (18)



acide chlorhydrique en utilisant du {[1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-oxo-2-(4-pyrimidin-2-

ylpipérazin-1-yl)-éthyl]-amino}-méthyl-phosphonate de diméthyle 85 (0,30 g, 0,59 mmol).

Obtention d’un solide blanc (125 mg)


RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 8,40 (d, J= 4,9 Hz, 2H, 2 Harom) ; 7,28-7,71 (m, 9H, 9Harom) ; 6,80-6,84 (m, 1H, 1 Harom) ; 4,95-5,08 (m, 1H, CH) ; 3,03-4,00 (m, 10H, 5 CH2) ;2,77-3,04 (m, 2H, CH2).

RMN 13C (75 MHz, MeOD) δ : 173,9 (C, C=O) ; 162,0 (C, C21) ; 157,8 (CH, C22 et C24) ;141,5 (C, Carom) ; 140,1 (C, Carom) ; 136,0 (C, Carom) ; 129,8 (CH, 2 CHarom) ; 129,1 (CH, 2CHarom) ; 127,9 (CH, 2 CHarom) ; 127,4 (CH, C13) ; 126,9 (CH, 2 CHarom) ; 110,2 (CH, C23) ;62,8 (CH, C2) ; 44,5-40,6 (CH2, C1) ; 43,9 (CH2) ; 43,3 (CH2) ; 42,6 (CH2) ; 37,2 (CH2, C3).

RMN 31P (121,5 MHz, MeOD) δ : 16,9


Calculé : 51,99 5,45 12,63Trouvé : 52,12 5,48 12,69

Chlorhydrate de l’acide 3-biphényl-4-yl-2-[méthyl(phosphonométhyl)amino]propanoïque (19)


NH

N

O

N

PO

OHOH

N

N

2 HCl,

1

2

34

56 7

8

9

10

1112 13

1415

16 17

18

1920

21

2223

24

NOH

OPO

OHOH

HCl

1

2

3

45

6 7 8

910

11 1213

1415

16

17

235


acide chlorhydrique en utilisant du 3-biphényl-4-yl-2-[[(diméthoxyphosphoryl)-méthyl]-

(méthyl)-amino]-propanoate de méthyle 88 (0,30 g, 0,77 mmol). Obtention d’un solide blanc

(124 mg).


RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,56-7,74 (m, 4H, 4 Harom) ; 7,27-7,53 (m, 5H, 5 Harom) ;4,62-4,66 (m, 1H, CH) ;3,44-3,70 (m, 2H, CH2) ; 3,32 (s, 3H, Me) ; 2,73 (d, J= 15 Hz, 2H,CH2(-P)).

RMN 13C (75 MHz, MeOD) δ : 179,5 (C, C=O) ; 141,2 (C, Carom) ; 140,0 (C, Carom) ; 136,0(C, Carom) ; 129,5 (CH, 2 CHarom) ; 129,1 (CH, 2 CHarom) ; 128,6 (CH, 2 CHarom) ; 127,4 (CH,C14) ; 127,0 (CH, 2 CHarom) ; 57,8 (CH, C3) ; 55;1-51;8 (CH2, C3) ; 44;7 (CH3, C2) ; 32,9(CH2, C4).

RMN 31P (121,5 MHz, MeOD) δ : 14,7


Calculé : 52,93 5,49 3,63Trouvé : 52,87 5,61 3,78

Chlorhydrate de l’acide 3-biphényl-4-yl-2-[benzyl(phosphonométhyl)amino]propanoïque (20)



acide chlorhydrique en utilisant du 3-biphenyl-4-yl-2-[[(diméthoxyphosphoryl)méthyl]-

(benzyl)-amino]-propanoate de méthyle 91 (0,50 g, 1,07 mmol). Obtention d’un solide blanc

(187 mg)


NOH

OPO

OHOH

HCl

12

34

65

78

9

101112

1314

1516

17 1819

2021

22

23

236

RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,00-7,58 (m, 14H, 14 Harom) ; -3,93-4,02 (m, 2H, CH2-P) ;3,51 (s, 3H, OMe) ; 3,42 (d, J= 11,2 Hz, 6H, 2 OMe-P) ; 2,88-3,30 (m, 4H, 2 CH2).

RMN 13C (75 MHz, MeOD) δ : 175,1 (C, C=O) ; 141,0 (C, Carom) ; 140,2 (C, Carom) ; 140,0(C, Carom) ; 136,4 (C, Carom) ; 131,5 (CH, 2 CHarom) ; 129,1 (CH, 2 CHarom) ; 129,0 (CH, 4CHarom) ; 128,6 (CH, 2 CHarom) ; 127,4 (CH, C20) ; 127,1 (CH, C6) ; 126,9 (CH, 2 CHarom) ;63,0 (CH, C9) ; 55,9 (CH2, C2) ; 53,8-50,5 (CH2, C1) ; 33,3 (CH2, C10).

RMN 31P (121,5 MHz, MeOD) δ : 15,3


Calculé : 58,89 5,54 2,99Trouvé : 59,02 5,59 3,03

Acide {[2-(acetylamino)-3-biphényl-4-ylpropanoyl]amino}acétique (21)


Composé obtenu selon le mode opératoire de saponification d’ester par de la soude 1N

utilisant du {[2-(acétylamino)-3-biphényl-4-ylpropanoyl]amino}acétate de méthyle 94 (1,0 g,

2.82 mmol) et de la soude (1N, 3,4 mL, 1,2 éq.). Obtention d’une solide légèrement beige

(0,91 g).

Rendement : 95 %

RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,50-7,70 (m, 4H, 4 Harom) ; 7,23-7,48 (m, 5H, 5 Harom) ;;4,73-4,81 (m, 1H, CH) ; 3,69-3,98 (m, 2H, CH2) ; 2,90-3,18 (m, 2H, CH2) ; 2,06 (s, 3H, Me).

RMN 13C (75 MHz, MeOD) δ : 176,2 (C, C1) ; 169,2 (C=O) ; 168,5 (C, C=O) ; 141,2 (C,Carom) ; 140,0 (C, Carom) ; 135,8 (C, Carom) ; 130,2 (CH, 2 CHarom) ; 129,0 (CH, 2 CHarom) ;127,4 (CH, C15) ; 127,1 (CH, 4 CHarom) ; 56,8 (CH, C4) ; 43,1 (CH2) ; 38,1 (CH2) ; 23,1 (CH3,C19).

NH

O

OHO

NH

O

12 3

5 67

89

10

11

12 13

14

1516

17

4 18 19

237

Microanalyse pour C19H20N2O4C H N

Calculé : 67,05 5,92 8,23Trouvé : 66,88 5,85 8,20

2-(acétylamino)-3-biphényl-4-yl-N-[2-(hydroxyamino)-2-oxoéthyl]propanamide (22)



hydrogénation catalytique en présence de Pd/sulfate de baryum en utilisant du 2-

(acétylamino)-3-biphényl-4-yl-N-[2-(benzyloxyamino)-2-oxoéthyl]propanamide 95 (0,23 g,

0,52 mmol) et 240 mg de palladium sur sulfate de baryum. Obtention d’un solide blanc (0,17

g).

Rendement : 91 %

RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,55-7,70 (m, 4H, 4 Harom) ; 7,26-7,51 (m, 5H, 5 Harom) ;4,53-4,73 (m, 1H, CH) ; 3,78-4,02 (m, 1H, 1 H de CH2) ; 3,69-3,72 (m, 1H, 1 H de CH2) ;3,18-3,32 (m, 1H, 1 H de CH2) ; 2,90-3,11 (m, 1H, 1 H de CH2) ; 1,99 (s, 3H, Me).

RMN 13C (75 MHz, MeOD) δ : 171,0 (C, C=O) ; 169,7 (C, C=O) ; 168,6 (C, C=O) ; 140,1(C, Carom) ; 139,9 (C, Carom) ; 136,7 (C, Carom) ; 129,7 (CH, 2 CHarom) ; 129,2 (CH, 2 CHarom) ;127,5 (CH, C14) ; 127,3 (CH, 2 CHarom) ; 127,0 (CH, 4 CHarom) ; 53,1 (CH, C3) ; 44,6 (CH2) ;37,9 (CH2); 22,4 (CH3, C1).


Calculé : 62,01 6,14 11,42Trouvé : 61,88 6,12 11,29

NH

O

NH

ONH

O

OH

238

Acide 2-{[2-(acétylamino)-3-biphényl-4-ylpropanoyl]amino}-3-biphényl-4-ylpropanoïque (23)



en utilisant du 2-{[2-(acétylamino)-3-biphényl-4-ylpropanoyl]amino}-3-biphényl-4-

ylpropanoate de méthyle 96 (0,7 g, 1,34 mmol) et de la soude (1N, 1,6 mL, 1,2 éq.).


Rendement : 90 %

RMN 1H (300 MHz, DMSO-TFA) δ : 8,05-8,23 (m, 1H, 1 Harom) ; 7,80-7,98 (m, 1H, 1Harom) ; 7,03-7,68 (m, 16H, 16 Harom) ; 4,30-4,50 (m, 1H, CH) ; 4,11-4,28 (m, 1H, CH) ; 3,05-3,26 (m, 1H, 1 H de CH2) ; 2,85-2,98 (m, 2H, 2 H de CH2) ; 2,58-2,68 (m,1H, 1 H de CH2) ;1,74 (s, 3H, Me).

RMN 13C (75 MHz, DMSO-TFA) δ : 172,1 (C, C=O) ; 169,9 (C, C=O) ; 169,3 (C, C=O) ;141,3 (C, Carom) ; 140,2 (C, 2 Carom) ; 136,7 (C, Carom) ; 135,8 (C, Carom) ; 135,1 (C, Carom) ;129,2 (CH, 2 CHarom) ; 129,0 (CH, 4 CHarom) ; 128,5 (CH, 2 CHarom) ; 127,5 (CH, C14 et C29) ;127,2 (CH, 2 CHarom) ; 127,0 (CH, 6 CHarom) ; 57,1 (CH) ; 52,1 (CH) ; 37,6 (CH2) ; 37,0(CH2); 22,2 (CH3, C1)


Calculé : 74,80 6,04 5,45Trouvé : 74,97 6,10 5,48

NH

O

OHO

NH

O

239

Chlorhydrate du glycinate d’éthyle (24)

Formule brute : C4H10ClNO2Masse molaire : 139,58 g/mol

Composé obtenu selon le mode opératoire d’estérification des amino-acides par le

chlorure de thionyle en utilisant de la glycine (15 g, 199,8 mmol) et du chlorure de thionyle

(44 mL, 3 éq.). Obtention d’un solide blanc (27,3 g).


RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 4,18 (q, J= 7,1 Hz et 14,2 Hz, 2H, OCH2) ; 3,41 (s, 2H,CH2) ; 1,27 (t, J= 7,1 Hz, 3H, CH3).

2-Benzhydrylidèneaminoéthanoate d’éthyle (25)

Formule brute : C17H17NO2Masse molaire : 267,33 g/mol

Composé obtenu selon le mode opératoire de synthèse de la base de schiff en utilisant

de la benzophénone imine (15 g, 82,8 mmol) et du chlorhydrate du glycinate d’éthyle 24 (11,6

g, 1 éq.) en poudre fine. Obtention d’un solide blanc (17,7 g).


RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,60-7,75 (m, 2H, 2 Harom) ; 7,31-7,45 (m, 6H, 6 Harom) ;7,12-7,20 (m, 2H, 2 Harom) ; 4,28 (s, 2H, CH2) ; 4,16 (q, J=7 Hz et 14,2 Hz, 2H, OCH2) ; 1,28(t, J=7Hz, 3H, CH3).

3-(2,4-fluorophényl)prop-2-ynol (26)

Formule brute : C9H6F2OMasse molaire : 168,14 g/mol

NH2O

OHCl,

NO

O

F

FOH

240

Une suspension de 2,4-difluoroiodophényle (12,63 g, 52,6 mmol), d’alcool

propargylique (3,07 mL, 1 éq.), de dichlorobis(triphénylphosphine)-palladium (II) (370 mg,

0,01 éq.), d’iodure de cuivre (51 mg, 0,005 éq.) et de diéthylamine (88 mL) est agité à T.A

sous atmosphère d’azote. Au bout de 20 minutes, une solubilisation totale est obtenue. Après

5 h d’agitation à T.A, la diéthylamine est évaporée sous pression réduite et le milieu

réactionnel obtenu est solubilisé dans de l’éther éthylique et de l’eau puis extrait à l’éther. La

phase éthérée est ensuite lavée à la saumure, séchée sur sulfate de sodium et concentrée sous

pression réduite. L’huile brune ainsi obtenue est chromatographiée sur colonne de silice

(hexane/ether 4/1) pour donner une huile légèrement jaune (7,3 g)

Rendement : 82%

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,37-7,46 (m, 1H, Harom) ; 6,81-6,91 (m, 2H, 2 Harom) ; 4,53(s, 2H, CH2).

1-bromo-3-(2,4-fluorophényl)prop-2-yne (27)

Formule brute : C9H5BrF2Masse molaire : 231,04 g/mol

Le 3-(2,4-fluorophényl)prop-2-ynol 26 (3,96g, 23,6 mmol) est solubilisé dans de

l’éther diéthylique (14 mL) et de la pyridine (0,48 mL) est ajoutée. Cette solution est alors

refroidie à 0°C et une solution de tribromure de phosphore (1,14 mL, 0,5 éq.) dans de l’éther

diéthylique (7mL) est ajoutée doucement en l’espace de 15 minutes. Le milieu réactionnel est

ensuite agité à T.A pendant 3 heures puis refroidit à 0°C pour être hydrolysé par ajout de

glace. De l’eau est ensuite ajoutée et le milieu réactionnel est alors extrait à l’éther. La phase

éthérée obtenue est alors lavée à l’eau, puis avec une solution saturée de bicarbonate de

sodium et enfin à la saumure. Après séchage sur sulfate de sodium et concentration sous

pression réduite, une huile jaune est obtenue qui est purifiée par chromatographie sur colonne

de silice (hexane/ether 9/1) pour conduire à une huile légèrement jaune (3,8 g)

Rendement : 70%

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,37-7,46 (m, 1H, Harom) ; 6,81-6,90 (m, 2H, 2 Harom) ; 4,18(s, 2H, CH2).

F

FBr

241

Chlorhydrate du 2-amino-4-méthyl-pentanoate de méthyle (28)


Composé obtenu selon le mode opératoire d’estérification des amino-acides par du

chlorure de thionyle en utilisant de la leucine (5 g, 38,1 mmol) et du chlorure de thionyle (8,3

mL, 3 éq.). Obtention d’un solide blanc (6,8 g).


RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 4,59 (t, J=7 Hz, 1H, CH) ; 4,08-4,13 (m, 1H, CH) ; 3,79 (s,3H, OMe) ; 1,60-1,67 (m, 2H, CH2) ; 0,95-1,01 (m, 6H, 2 CH3).

2-N-tert-butoxycarbonylamino-4-méthyl-pentanoate de méthyle (29)


Composé obtenu selon le mode opératoire de protection d’amine par un groupement

Boc en utilisant du chlorhydrate du 2-amino-4-méthyl-pentanoate de méthyle 28 (6g, 33,0

mmol), de la triéthylamine (9,2 mL, 2 éq.), du di-tert-butyldicarbonate (8,65 g, 1,2 éq.) et de

la diméthylaminopyridine (1 pointe de spatule) Obtention d’une huile incolore (7,1 g) après

chromatographie sur colonne de silice (hexane/acétate d’éthyle 4/1).

Rendement : 87 %

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 4,57 (t, J=7 Hz, 1H, CH) ; 4,11-4,15 (m, 1H, CH) ; 3,75 (s,3H, OMe) ; 1,61-1,74 (m, 2H, CH2) ; 0,92-0,98 (m, 6H, 2 CH3), 1,45 (s, 9H, tBu)

NH2O

OHCl,

NH

O

O

O

O

242

Acide 2-N-tert-butoxycarbonylamino-4-méthylpentanoïque (30)



en utilisant du 2-N-tert-butoxycarbonylamino-4-méthyl-pentanoate de méthyle 29 (6g, 24,5

mmol) et de la soude (1N, 24,5 mL, 1 éq.). Obtention d’une huile légèrement jaune (5,5 g).

Rendement : 97 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 4,55 (t, J=7 Hz, 1H, CH) ; 4,12-4,18 (m, 1H, CH) ; 1,65-1,74 (m, 2H, CH2) ; 0,90-1,01 (m, 6H, 2 CH3), 1,45 (s, 9H, tBu)

2-(2-N-tert-butoxycarbonylamino-4-méthyl-pentanoylamino)propionate de méthyle (31)


Composé obtenu selon le mode opératoire de couplage d’acide et d’amine en présence

de BOP en utilisant de l’acide 2-N-tert-butoxycarbonylamino-4-méthyl-pentanoïque 30 (2g,

8,65 mmol), 1,27 g de chlorhydrate de l’ester méthylique de l’alanine (1,05 équ), 2,04 mL de

N-méthylmorpholine (2,1 équ) et 4,27 g de BOP (1,1 equ). Obtention d’une huile incolore

(2,5 g) après chromatographie sur colonne de silice (acétate d’éthyle/méthanol 95/5).

Rendement : 92 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 6,65 (d, J= 6,9 Hz, 1H, NH) ; 4,93 (d, J= 7 Hz, 1H, CH) ;4,57 (t, J= 7,2 Hz ; 1H, CH) ; 4,11-4,15 (m, 1H, CH) ; 3,75 (s, 3H, OMe) ; 1,61-1,74 (m, 2H,CH2) ; 1,45 (s, 9H, tBu) ; 1,40 (d, J=7,2 Hz, 3H, CH3) ; 0,92-0,98 (m, 6H, 2 CH3).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 173,1 (C, C=O) ; 172,2 (C, C=O) ; 156,3 (C=O) ; 77,3 (C,C12) ; 54,9 (CH, C6) ; 51,7 (CH3, C1) ; 47,4 (CH, C3) ; 41,2 (CH2; C7); 28,1 (CH3, C13, C14 etC15) ; 24,5 (CH, C8) ; 21,8 (CH3; C9 et C10) ; 18,1 (CH3, C4).

NH

OH

O

O

O

NH

NH

O

O

O O

O

123

4

56

78

9

10

11

12

13

1415

243

Chlorhydrate du 2-(2-amino-4-méthyl-pentanoylamino)propionate de méthyle (32)

Formule brute : C10H21ClN2O3Masse molaire : 252,74 g/mol

Composé obtenu selon le mode opératoire de déprotection du Boc en milieu acide

chlorhydrique en utilisant du 2-(2-N-tert-butoxycarbonylamino-4-méthyl-pentanoylamino)

propionate de méthyle 31 (2g, 6,32 mmol). Obtention d’un solide blanc (1,55 g).

Rendement : 97 %

RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 4,95 (m, 1H, CH) ; 4,55 (m 1H, CH) ; 4,08-4,15 (m, 1H,CH) ; 3,72 (s, 3H, OMe) ; 1,63-1,75 (m, 2H, CH2) ; 1,40 (m, 3H, CH3) ; 0,90-1,01 (m, 6H, 2CH3).

Trifluorométhylsulfonyloxyméthylphosphonate de diméthyle (33)

Formule brute : C4H8F3O6PSMasse molaire : 272,14 g/mol

Méthode A :

Le phosphite de diméthyle (2,75g, 25,0 mmol) et le formaldéhyde (0,75g, 1 éq.) sont

mis en suspension dans de la diisopropyléthylamine (0,34 mL, 1 éq.). Cette suspension est

alors agitée dans un bain d’huile préchauffé à 140°C sous agitation jusqu’à l’obtention d’une

huile incolore (réaction très exothermique). Après retour à T.A, elle est solubilisée dans du

dichlorométhane (100 mL). La solution obtenue est refroidie à -78°C avant l’ajout de la 2,6-

lutidine (4,4 mL, 1,5 éq.). Une solution d’anhydride trifluorométhanesulfonique (7,1 g, 1 éq.)

dans du dichlorométhane (100 mL) est alors ajoutée en une seule fois. L’agitation à -78°C est

alors maintenue pendant 3h puis la solution est remise à T.A, température à laquelle elle est

agitée pendant 24h. Cette solution est utilisée telle quelle pour la suite.

Méthode B :

L’hydroxyméthylphosphonate de diméthyle 41 (5,03 g, 35,9 mmol) est solubilisé dans

du dichlorométhane (80 mL). La solution obtenue est refroidie à -50°C avant l’ajout de la 2,6-

NH2NH

OO

O

HCl,

PO

MeOOMe

OSO2CF3

244

lutidine (5,13 mL, 1,25 éq.). Une solution d’anhydride trifluorométhanesulfonique (6,94 mL,

1,15 éq.) dans du dichlorométhane (20 mL) est alors ajoutée goutte à goutte. L’agitation est

alors maintenue jusqu’à ce que la température du bain soit revenue à 0°C (environ 6h). Le

milieu réactionnel est alors hydrolysé par ajout de glace et d’eau, puis extrait au

dichlorométhane. La phase organique est alors lavée rapidement à l’eau glacée, avec une

solution d’acide chlorhydrique 1N à 0°C et à la saumure, puis séchée sur sulfate de sodium et

concentrée sous pression réduite sans chauffage pour conduire à une huile brune (8,1 g)

conservée au congélateur.

Rendement : 83%

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 4,65 (d, J=8,8 Hz, 2H, CH2) ; 3,89 (d, J=11,0 Hz, 6H, 2OMe).

2-Benzhydrylidèneamino-5-(2,4-difluorophényl)pent-4-ynoate d’éthyle (34)

Formule brute : C26H21F2NO2Masse molaire : 417,46 g/mol

Composé obtenu selon le mode opératoire d’alkylation de la base de Schiff en utilisant

du 2-benzhydrylidèneamino-éthanoate d’éthyle 25 (16,9g, 63.2 mmol), du 1-bromo- 3-(2,4-

fluorophényl)prop-2-yne 27 (16,05 g, 1,1 éq.), de l’iodure de tétrabutylammonium (2,33 g,

0,1 éq.) et du carbonate de potassium (26,2 g, 3 éq.). Obtention d’une huile brune (21,1 g).

Rendement : 80%

Chlorhydrate du 2-amino-5-(2,4-difluorophényl)pent-4-ynoate d’éthyle (35)

Formule brute : C13H14ClF2NO2Masse molaire : 289,71 g/mol

NO

O

FF

NH2O

O

FF

HCl,

245

Composé obtenu selon le mode opératoire d’hydrolyse de l’imine en utilisant du 2-

benzhydrylidèneamino-5-(2,4-difluorophényl)pent-4-ynoate d’éthyle 34 (21,1 g, 50,6 mmol).

Obtention d’un solide blanc (14,6 g)


RMN 1H (200 MHz, MeOD) δ : 7,36 (q, J=8,6 Hz et 14,3 Hz, 1H, Harom) ; 6,80 (t, J=8,6 Hz,2H, 2Harom) ; 4,26 (q, J=7,1 Hz et 14,4 Hz, 2H, OCH2) ; 3,70 (t, J=5,6 Hz, 1H, CH) ; 2,88 (d,J= 5,6 Hz, 2H, CH2) ; 1,30 (t, J= 6,9 Hz, 3H, CH3).

2-N-tert-butoxycarbonylamino-5-(2,4-difluorophényl)pent-4-ynoate d’éthyle (36)



Boc en utilisant du chlorhydrate du 2-amino-5-(2,4-difluorophényl)pent-4-ynoate d’éthyle 35

(13,7g, 47,3 mmol), de la triéthylamine (13,2 mL, 2 éq.), du di-tert-butyldicarbonate (12,39g,

1,2 éq.) et de la diméthylaminopyridine (1 pointe de spatule). Obtention d’une huile incolore

(13,7 g) après chromatographie sur colonne de silice (hexane/acétate d’éthyle 3/1)

Rendement : 82 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,33 (q, J=7,1 Hz et 16,1 Hz, 1H, Harom) ; 6,79 (t, J=9,7 Hz,2H, 2 Harom) ; 5,39 (d, J=6,8 Hz, NH) ; 4,54-4,60 (m, 1H, CH) ; 4,28 (q, J=7 Hz et 14,2 Hz,2H, OCH2) ; 2,98 (t, J=4,7 Hz, 2H, CH2) ; 1,46 (s, 9H, tBu) ; 1,28 (t, J= 7Hz, 3H, CH3).

Acide 2-N-tert-butoxycarbonylamino-5-(2,4-difluorophényl)pent-4-ynoïque (37)


NH

O

O

FF

O

O

NH

OH

O

FF

O

O

246

Composé obtenu selon le mode opératoire de saponification des esters par de la soude

1N en utilisant du 2-N-tert-butoxycarbonylamino-5-(2,4-difluorophényl)pent-4-ynoate

d’éthyle 36 (13,6g, 38,5 mmol) et de la soude (1N, 38,5 mL, 1 éq.). Obtention d’une huile

légèrement jaune (11,5 g).

Rendement : 92 %

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,26-7,39 (m, 1H, Harom) ; 6,75-6,87 (m, 2H, 2 Harom) ; 5,34-5,43 (m, Hz, NH) ; 4,57-4,62 (m, 1H, CH) ; 2,98 (m, 2H, CH2) ; 1,47 (s, 9H, tBu).

2-{2-[2-N-tert-butoxycarbonylamino-5-(2,4-difluorophényl)-pent-4-ynoylamino]-4-méthyl-pentanoylamino}-propionate de méthyle (38)

Formule brute : C26H35F2N3O6Masse molaire : 523,58 g/mol


de BOP en utilisant de l’acide 2-N-tert-butoxycarbonylamino-5-(2,4-difluorophényl)-pent-4-

ynoïque 37 (1,47g, 4.54 mmol), du chlorhydrate du 2-(2-amino-4-méthyl-pentanoylamino)-

propionate de méthyle 32 (1,2g, 1,05 éq.), de la N-méthylmorpholine (1,08 mL, 2,1 éq.) et du

BOP (2,25 g, 1,1 éq.). Obtention d’une huile incolore (2,23 g) après chromatographie sur

colonne de silice (acétate d’éthyle/méthanol 95/5).

Rendement : 94 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,36 (q, J=7,1 Hz et 16,1 Hz, 1H, Harom) ; 6,75 (t, J=9,7 Hz,2H, 2 Harom) ; 6,73 (d, J= 6,9 Hz, 1H, NH) ; 5,48 (d, J=6,8 Hz, NH) ; 4,93 (d, J= 7 Hz, 1H,CH) ; 4,50-4,62 (m; 2H, 2 CH) ; 4,08-4,13 (m, 1H, CH) ; 3,71 (s, 3H, OMe) ; 2,83-2,92 (m,2H, CH2alcyne) 1,65-1,77 (m, 2H, CH2) ; 1,48 (s, 9H, tBu) ; 1,42 (d, J=7,2 Hz, 3H, CH3) ;0,90-1,00 (m, 6H, 2 CH3).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 172,9 (C, C=O) ; 172,0 (C, C=O) ; 171,3 (C, C=O) ; 168,7-162,1 (C, CaromF) ; 166,2-161,4 (C, CaromF) ; 150,6 (C, C=O) ; 133,8 (CH, C17) ; 111,3-110,6(CH, C18) ; 106,7-106,0-105,4 (CH, C20) ; 103,6-103,5 (CH, C16) ; 85,9 (C, C14) ; 82,4 (C,

NH

NH

O

FF

O

O

NH

OO

O1

23

4

56

78

9

10

11

12

1314

15

16

171819

2021

22

23

24

2526

247

C15) ; 76,8 (C, C23) ; 56,1 (CH) ; 52,3 (CH3, C1) ; 51,4 (CH) ; 47,8 (CH) ; 41,6 (CH2) ; 28,3(CH3 ; C24, C25 et C26) ; 23,7 (CH) ; 23,1 (CH2) ; 21,7 (CH3 ; C9 et C10) ; 18,2 (CH3, C4).

Chlorhydrate du 2-{2-[2-amino-5-(2,4-difluorophényl)-pent-4-ynoylamino]-4-méthyl-pentanoylamino}-propionate de méthyle (39)

Formule brute : C21H28ClF2N3O4Masse molaire : 459,92 g/mol

Composé synthétisé selon le mode opératoire de déprotection du Boc en milieu acide

chlorhydrique en utilisant du 2-{2-[2-N-tert-butoxycarbonylamino-5-(2,4-difluorophényl)-

pent-4-ynoylamino]-4-méthyl-pentanoylamino}-propionate de méthyle 38 (2,1 g, 4,0 mmol).


Rendement : 100 %

RMN 1H (200 MHz, MeOD) δ : δ : 7,30-7,42 (m, 1H, Harom) ; 6,72-6,81 (m, 2H, 2 Harom) ;4,90-4,98 (m, 1H, CH) ; 4,53-4,61 (m; 2H, 2 CH) ; 4,06-4,13 (m, 1H, CH) ; 3,74 (s, 3H,OMe) ; 2,83-2,90 (m, 2H, CH2alcyne) 1,69-1,75 (m, 2H, CH2) ; 1,46 (s, 9H, tBu) ; 1,39 (d,J=7,2 Hz, 3H, CH3) ; 0,92-0,99 (m, 6H, 2 CH3).

(S, S)-2-{2-[5-(2,4-difluorophényl)-2-(((diméthoxyphosphoryl)-méthyl)-amino)-pent-4-ynoylamino]-4-méthyl-pentanoylamino}-propionate de méthyle (40)


Composé obtenu selon le mode opératoire de couplage d’une amine sur une solution

de triflate en utilisant du 2-{2-[2-amino-5-(2,4-difluorophényl)-pent-4-ynoylamino]-4-

méthyl-pentanoylamino}-propionate de méthyle 39 (1,47 g, 3,47 mmol), de la

NH2NH

O

FF

NH

OO

OHCl,

NH

NH

O

FF

NH

OO

OPO

MeOOMe

248

diisopropyléthylamine (0,90 mL, 1,5 éq.), de la solution de

trifluorométhylsulfonyloxymethylphosphonate de diméthyle 33 (35,6 mL, 1,25 éq.).

Obtention d’une huile incolore (0,75 g) après chromatographie sur colonne de silice (AcOEt).

Rendement : 40%

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,32-7,41 (m, 1H, Harom) ; 6,68-6,73 (m, 2H, 2 Harom) ; 4,88(d, J= 7 Hz, 1H, CH) ; 4,50-4,62 (m; 2H, 2 CH) ; 4,08-4,13 (m, 1H, CH) ; 3,81 ( d, J=10,8 Hz,6H, 2 OMe(P)) ; 3,71 (s, 3H, OMe) ; 3,00-3,29 (m 2H, CH2-P) ; 2,83-2,92 (m, 2H, CH2alcyne) 1,65-1,77 (m, 2H, CH2) ; 1,48 (s, 9H, tBu) ; 1,42 (d, J=7,2 Hz, 3H, CH3) ; 0,90-1,00 (m, 6H, 2CH3).

RMN 31P (81 MHz, CDCl3) δ : 26,3

Hydroxyméthylphosphonate de diméthyle (41)

Formule brute : C3H9O4PMasse molaire : 140,08 g/mol

Le phosphite de diméthyle (6 g, 54,5 mmol) et le formaldéhyde (1,64 g, 1 éq.) sont

mis en suspension dans de la triéthylamine (0,77 mL, 0,1 éq.). Cette suspension est alors mise

dans un bain d’huile préchauffé à 140°C sous agitation jusqu’à l’obtention d’une huile

incolore (réaction très exothermique). Après retour à T.A, elle est chromatographiée sur

colonne de silice (dichlorométhane/méthanol 95/5) pour donner une huile incolore (6,87 g)

Rendement : 90%RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 3,95 (d, J=6 Hz, 2H, CH2) ; 3,81 (d, J=10,6 Hz, 6H, 2 OMe).

Chlorhydrate du glycinate de méthyle (42)


Composé obtenu selon le mode opératoire d’estérification d’amino-acide par le

chlorure d’acétyle en utilisant du chlorure d’acétyle (40,6 mL, 2,85 éq.) et de glycine (15 g,

200 mmol). Obtention d’un solide blanc (24,8 g).

Rendement : 99%

PO

MeOOMe

OH

NH2O

OHCl,

249

RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ : 8,63 (sl, 2H, NH2) ; 3,75 (s, 2H, CH2) ; 3,71 (s, 3H, OMe).

2-Benzhydrylidèneamino-éthanoate de méthyle (43)


Composé obtenu selon le mode opératoire de synthèse de la base de Schiff en utilisant

de benzophénone imine (15 g, 82,8 mmol) et du chlorhydrate du glycinate de méthyle 42

(10,4 g, 1 éq.). Obtention d’un solide blanc (16,8 g).


RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,58-7,73 (m, 2H, 2 Harom) ; 7,31-7,49 (m, 6H, 6 Harom) ;7,15-7,23 (m, 2H, 2 Harom) ; 4,23 (s, 2H, CH2) ; 3,75 (s, 3H, OMe).RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 176,2 (C, C=N) ; 168,1 (C, C=O) ; 140,2 (C, C5 et C11) ;130,1 (CH, 2 CHarom) ; 129,6 (CH, 2 CHarom) ; 129,1 (CH, 1 CHarom) ; 128,6 (CH, 2 CHarom) ;128,1 (CH, 1 CHarom); 127,9 (CH, 2 CHarom); 55,2 (CH2, C3); 52,9 (CH3, C1)

2-Benzhydrylidèneamino-3-biphényl-4-yl-propanoate de méthyle (44)


Composé obtenu selon le mode opératoire d’alkylation de la base de Schiff en utilisant

du 2-benzhydrylidèneamino-éthanoate de méthyle 43 (5 g, 19,7 mmol), du 4-chlorométhyl-

biphényle (4,40 g, 1,1 éq.), de l’iodure de tétrabutylammonium (0,73 g, 0,1 éq.) et du

carbonate de potassium (8,19 g, 3 éq.). Obtention d’une huile brune (6,0 g).

Rendement : 72%

NO

O1

234

56

78

9

10

1112

1314

15

16

NO

O

250

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : δ : 7,58-7,76 (m, 6H, 6 Harom) ; 7,30-7,55 (m, 11H, 11Harom) ; 7,15-7,23 (m, 2H, 2 Harom) ; 4,35 (t, J=6,8 Hz, 1H, CH) ; 3,72 (s, 3H, OMe), 3,10-3,31(m, 2H, CH2).

Chlorhydrate du 2-amino-3-biphényl-4-yl-propanoate de méthyle (45)


Composé obtenu selon le mode opératoire d’hydrolyse de l’imine en utilisant du 2-

benzhydrylidèneamino-3-biphényl-4-yl-propanoate d’éthyle 44 (6,0 g, 14,3 mmol). Obtention

d’un solide blanc (3,8 g).


RMN 1H (300 MHz, DMSO) δ : 8,87 (sl, 2H, NH2) ; 7,60-7,76 (m, 4H, 4 Harom) ; 7,45-7,55(m, 2H, 2 Harom) ; 7,30-7,42 (m, 3H, 3 Harom) ; 4,29 (t, J=7 Hz, 1H, CH) ; 3,70 (s, 3H, OMe) ;3,15-3,34 (m, 2H, CH2).

RMN 13C (75 MHz, DMSO) δ : 172,0 (C, C2) ; 145,1 (C, Carom) ; 141,3 (C, Carom) ; 136,8 (C,Carom) ; 129,7 (CH, 2 CHarom) ; 129,1 (CH, 2 CHarom); 128,2 (CH, 2 CHarom); 127,5 (CH, C14) ;127,1 (CH, 2 CHarom) ; 55,2 (CH, C3) ; 53,0 (CH3, C1) ; 42,1 (CH2, C4).

3-biphényl-4-yl-2-{[(diméthoxyphosphoryl)méthyl]amino}propanoate de méthyle (46)

Formule brute : C19H24NO5PMasse molaire : 377,38 g/mol

Composé obtenu selon le mode opératoire de couplage d’un chlorhydrate d’amine sur

un triflate en utilisant du chlorhydrate du 2-amino-3-biphényl-4-yl-propanoate de méthyle 45

(0,41 g, 1,4 mmol), de la diisopropyléthylamine (0,50 mL, 2 éq.) et du

NH2O

OHCl, 1

23

45

6 7 8

910

11 1213

14

1516

NH

O

OPO

MeOOMe

1

23

456

7

89

10

11

1213

1415

16

17

1819

251

trifluorométhylsulfonyloxyméthylphosphonate de diméthyle 33 (0,46 g, 1,2 éq.). Obtention

d’une huile incolore (0,30 g) après chromatographie sur colonne de silice (acétate

d’éthyle/méthanol 95/5).

Rendement : 56%

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,28-7,76 (m, 9H, 9 Harom) ; 3,72-3,75 (m, 1H, CH) ; 3,73 (d,J=11,2 Hz, 6H, 2 OMe(P)) ; 3,67 (s, 3H, OMe) ; 2,82-3,21 (m, 4H, 2 CH2).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 172,8 (C, C2) ; 140,8 (C, Carom) ; 140,0 (C, Carom) ; 136,8 (C,Carom) ; 130,2 (CH, 2 CHarom) ; 129,1 (CH, 2 CHarom) ; 128,3 (CH, 2 CHarom) ; 127,6 (CH, C14); 126,8 (CH, 2 CHarom) ; 56,3 (CH, C3) ; 53,8-53,4 (CH3, C18 et C19) ; 52,1 (CH3, C1) ; 38,7-34,6 (CH2, C17) ; 38,3 (CH2, C4).RMN 31P (121,5 MHz, CdCl3) δ : 28,1

Chlorhydrate du 2-amino-3-phénylpropanoate de méthyle (47)


Composé obtenu selon le mode opératoire d’estérification par le chlorure d’acétyle en

utilisant du chlorure d’acétyle (6,16 mL, 2,85 éq.) et de la phénylalanine (5 g, 30,3 mmol).



RMN 1H (200 MHz, MeOD) δ : 7,28-7,45 (m, 5H, 5 Harom) ; 4,38 (t, 6,7 Hz, 1H, CH) ; 3,84(s, 3H, OMe) ; 3,25-3,34 (m, 2H, CH2).

2-{[(diméthoxyphosphoryl)méthyl]amino}-3-phénylpropanoate de méthyle (48)


NH2O

OHCl,

NH

O

OPO

OO 1

23

45

67

8

9101112

13

252

Composé obtenu selon le mode opératoire de couplage d’un chlorhydrate d’amine sur

un triflate en utilisant du chlorhydrate du 2-amino-3-phénylpropanoate de méthyle 47 (0,27 g,

1,25 mmol), de la diisopropyléthylamine (0,44 mL, 2 éq.) et du




Rendement : 49%

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,28-7,45 (m, 5H, 5 Harom) ; 4,38 (t, 6,7 Hz, 1H, CH) ; 3,84(s, 3H, OMe) ; 3,78 (d, J=11,7 Hz, 6H, 2 OMe) ; 3,09-3,34 (m, 4H, 2 CH2)

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 173,2 (C, C2) ; 141,2 (C, C5) ; 130,6 (CH, 2 CHarom) ; 128,4(CH, 2 CHarom) ; 126,0 (CH, C8) ; 56,2 (CH, C3) ; 53,1-52,6 (CH3, C12 et C13) ; 52,6 (CH3; C1); 38,5-34,5 (CH2, C11) ; 38,2 (CH2, C4).

RMN 31P (121,5 MHz, CDCl3) δ : 26,3

2-(((diméthoxyphosphoryl)-méthyl)-amino-5-(2,4-difluorophényl)-pent-4-ynoate d’éthyle(49)

Formule brute : C16H20F2NO5PMasse molaire : 375,31 g/mol

Composé obtenu selon le mode opératoire de couplage d’amine sur une solution de

triflate en utilisant du 2-amino-5-(2,4-difluorophényl)pent-4-ynoate d’éthyle 35 (0,68 g, 2,69

mmol), de la diisopropyléthylamine (0,70 mL, 1,5 éq.) et de la solution de

trifluorométhylsulfonyloxyméthylphosphonate de diméthyle 33 (27,6 mL, 1,25 éq.).

Obtention d’une huile incolore (0,37 g) après chromatographie sur colonne de silice (AcOEt).

Rendement : 37%

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,28-7,43 (m, 1H, Harom) ; 6,78-6,87 (m, 2H, 2 Harom) ; 4,24(q, 6,5 Hz et 14,7 Hz, 2H, OCH2) ; 3,81 (d, J=10,8 Hz, 6H, 2 OMe) ; 3,63 (t, J=6Hz, 1H,CH) ; 3,00-3,29 (m, 2H, CH2P) ; 2,89 (d, J=6 Hz, CH2) ; 1,30 (t, J=6 Hz, 3H, CH3).

NH

O

O

FF

PO

MeOOMe

12

34

5

67

89

10

11

1213

14

15

16

253

RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 173,1 (C, C3) ; 167,7-161,2 (C, CaromF) ; 166,0-159,4 (C,CaromF) ; 132,8 (CH, C9) ; 111,5-110,8 (CH, C10) ; 103,8-103,1 (C, C8) ; 87,7 (C, Calcyne) ; 81,1(C, Calcyne) ; 62,1 (CH2, C2) ; 60,3 (CH, C4) ; 52,8-52,6 (CH3, C15 et C16) ; 39,3-35,2 (CH2,C14) ; 25,7 (CH2, C5) ; 14,0 (CH3, C1).

RMN 31P (81 MHz, CDCl3) δ : 26,5

2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-3-biphényl-4-ylpropanoate de méthyle (50)



Boc en utilisant du chlorhydrate du 2-amino-3-biphényl-4-yl-propanoate de méthyle 45 (10 g,

34,3 mmol), de la triéthylamine (9,6 mL, 2 éq.), du di-tert-butyldicarbonate (9,0 g, 1,2 éq.) et

de la diméthylaminopyridine (1 pointe de spatule). Obtention d’une huile incolore (10,1 g)

après chromatographie sur colonne de silice (hexane/éther 4/1).

Rendement : 83 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,29-7,65 (m, 7H, 7 Harom) ; 7,21 (d, J=8,1 Hz, 2H, 2 Harom) ;5,01 (d, J= 7,8 Hz, 1H, NH) ; 4,60-4,68 (m, 1H, CH) ; 3,75 (s, 3H, OMe) ; 3,05-3,23 (m, 2H,CH2) ; 1,43 (s, 9H, tBu).

Acide 2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-3-biphényl-4-ylpropanoïque (51)



en utilisant de 2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-3-biphényl-4-ylpropanoate de méthyle 50 (10

NH

O

OO

O

NH

OH

OO

O

254

g, 28,1 mmol) et de la soude (1N, 33,4 mL, 1,2 éq.). Obtention d’une huile légèrement jaune

(8,8 g).

Rendement : 92 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,52-7,65 (m, 4H, 4 Harom) ; 7,17-7,50 (m, 5H, 5 Harom) ;4,99 (d, J= 8,1 Hz, 1H, NH) ; 4,63-4,68 (m, 1H, CH) ; 3,07-3,32 (m, 2H, CH2) ; 1,43 (s, 9H,tBu)

2-[(2-tert-butoxy-2-oxoéthyl)amino]-3-biphényl-4-yl-propanoate de méthyle (52)


Le chlorhydrate du 2-amino-3-biphényl-4-yl-propanoate de méthyle 45 (0,36 g, 1,23

mmol) est mis en suspension dans du diméthylformamide (5 mL). A cette solution est ajoutée

de la triéthylamine (0,18 mL, 1 éq.). Le milieu réactionnel est alors agité à T.A pendant 1 h,

filtré et condensé sous pression réduite. Le résidu obtenu est solubilisé dans du

diméthylformamide (6 mL). Du t-butylbromoacétate (0,56 mL, 3 éq.) et de la triéthylamine

(0,53 mL, 3 éq.) sont ajoutés à cette solution. Ce milieu réactionnel est agité 5 h à T.A avant

d’être filtré et concentré sous pression réduite. Le résidu obtenu est repris dans de l’acétate

d’éthyle, lavé à l’eau et à la saumure puis séché sur sulfate de sodium et concentré sous

pression réduite. L’huile jaune obtenue est purifiée par chromatographie sur colonne de silice

(hexane/éther 1/1) pour conduire à une huile incolore (0,34 g).

Rendement : 75%

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,22-7,66 (m, 9H, 9 Harom) ; 3,69 (s, 3H, OMe) ; 3,62 (t,J=6,8 Hz, 1H, CH) ; 3,30 (d, J=13 Hz, 2H, CH2) ; 2,95-3,12 (m, 2H, CH2) ; 1,44 (s, 9H, tBu).

RMN 13C (75 MHz, DMSO-TFA) δ : 173,5 (C, C=O) ; 172,9 (C, C=O) ; 140,0 (C, Carom) ;139,5 (C, Carom) ; 136,1 (C, Carom) ; 130,6 (CH, 2 CHarom) ; 129,1(CH, 2 CHarom); 128,4 (CH, 2CHarom) ; 127,5 (C, C14) ; 126,8 (CH, 2 CHarom) ; 78,5 (C, C19) ; 60,1 (CH, C3) ; 52,8 (CH2,C17) ; 52,0 (CH3, C1) ; 39,7 (CH2, C4) ; 26,9 (CH3, C20, C21 et C22).

NH

O

O

O

O 1

23

45

67

89

10

11

12 1314

15

16

17

18

1920

21

22

255

Trifluoroacétate de l’acide {[1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-méthoxy-2-oxoéthyl]amino}acétique (53)


Composé obtenu selon le mode opératoire de déprotection d’ester tert-butylique par de

l’acide trifluoroacétique en utilisant du 2-[(2-tert-butoxy-2-oxoéthyl)amino]-3-biphényl-4-yl-

propanoate de méthyle 52 (0,30 g, 0,81 mmol) d’un solide légèrement beige (0,35 g).

Rendement : 100%

RMN 1H (200 MHz, MeOD) δ : 7,25-7,71 (m, 9H, 9 Harom) ; 4,40-4,46 (m, 1H, CH); 3,98(m, 2H, CH2) ; 3,79 (s, 3H, OMe) ; 3,32-3,43 (m 2H, CH2).

2-({2-[(benzyloxy)amino]-2-oxoéthyl}amino)-3- biphényl-4-ylpropanoate de méthyle (54)



de BOP en utilisant du trifluoroacétate de l’acide {[1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-méthoxy-2-

oxoéthyl]amino}acétique 53 (0,30 g, 0,7 mmol), du chlorhydrate du O-benzylhydroxylamine

(0,11 g, 1,05 éq.), de la N-méthylmorpholine (0,34 mL, 3,1 éq.) et du BOP (0,47 g, 1,1 éq.).

Obtention d’une huile incolore (0,25 g) après chromatographie sur colonne de silice (acétate


Rendement : 85 %

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 8,78 (sl, 1H, NH) ; 7,10-7,68 (m, 14H, 14 Harom) ; 4,70 (s,2H, CH2) ; 3,76 (s, 3H, OMe) ; 3,43-3,51 (m, 1H, CH) ; 3,26-3,37 (m, 1H, 1 H de CH2), 3,00-3,15 (m, 2H, 2 H de CH2) ; 2,66-2,76 (m, 1H, 1 H de CH2).

NH

O

O

OH

O

TFA,

NH

O

O

NH

O

O

1

23

45

6 7 8

910

1112

13

1415

16

1718

19202122

23

24 25

256

RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 172,1 (C, C=O) ; 171,1 (C, C=O) ; 140,8 (C, Carom) ; 139,6(C, Carom) ; 136,1 (C, Carom) ; 135,7 (C, Carom) ; 130,0 (CH, 2 CHarom) ; 129,2 (CH, 2 CHarom) ;128,1 (CH, 2 CHarom) ; 127,4 (CH, C14) ; 126,6 (CH, 2 CHarom) ; 126,1 (CH, C23) ; 125,1 (CH,2 CHarom) ; 80,1 (CH2, C19) ; 55,3 (CH, C3) ; 52,1 (CH3, C1) ; 46,7 (CH2, C17) ; 38,2 (CH2, C4).

Acide 2-({2-[(benzyloxy)amino]-2-oxoéthyl}amino)-3- biphényl-4-ylpropanoïque (55)



en utilisant du 2-({2-[(benzyloxy)amino]-2-oxoéthyl}amino)-3- biphényl-4-ylpropanoate de

méthyle 54 (0,2 g, 0,48 mmol) et de la soude (1N, 0,57 mL, 1,2 éq.). Obtention d’une huile

légèrement jaune (0,18 g).

Rendement : 93 %

RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,15-7,81 (m, 14H, 14 Harom) ; 4,72 (s, 2H, CH2) ; 3,86-4,03(m, 1H, CH) ; 3,28-3,45 (m, 2H, CH2), 2,85-3,18 (m, 2H, CH2).

(2S, 3aS, 7aS)-1-(2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-3-biphényl-4-ylpropanoyl)octahydro-1H-indole-2-carboxylate de phényle (56)


NH

OH

O

NH

O

O

NH

N

OO

O

H

HH

O

O

1

23

45 6

78

9

1011

1213

141516

1718

19

2021

2223

24

2526

27 28

29

3031

32

3334

35

36

257

Composé obtenu selon le mode opératoire de coulage d’acide et d’amine en présence

de BOP en utilisant de l’acide 2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-3-biphényl-4-ylpropanoïque 51

(8,6 g, 25,2 mmol), du p-toluènesulfonate de (2S,3aS,7aS)-octahydro-1H-indole-2-carboxylate

de phényle (11,5 g, 1,05 éq.), de la N-méthylmorpholine (8,32 mL, 2,1 éq.) et du BOP (17,0 g,

1,1 éq.). Obtention d’une huile incolore (10,6g) après chromatographie sur colonne de silice

(acétate d’éthyle/hexane 2/8).

Rendement : 72 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,15-7,75 (m, 14H, 14 Harom) ; 5,11 (s, 2H, CH2-Ph) ; 4,99(d, J= 8,1 Hz, 1H, NH) ; 4,27-4,72 (m, 1H, CH) ; 3,87-4,20 (m, 1H, CH) ; 3,63-3,82 (m, 1H,CH) ; 3,42-3,55 (m, 1H, CH) ; 3,03-3,32 (m, 2H, CH2) ; 1,43 (s, 9H, tBu) ; 0,94-2,17 (m,10H, 5 CH2).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 172,1 (C, C=O) ; 171,3 (C, C=O) ; 158,2 (C, C=O) ; 140,5(C, Carom) ; 136,9 (C, Carom) ; 136,3 (C, Carom) ; 135,9 (C, Carom) ; 129,4 (CH, 2 CHarom) ; 129,0(CH, 2 CHarom) ; 128,7 (CH, 2 CHarom) ; 128,4 (CH, 2 CHarom) ; 128,2 (CH, C34) ; 127,8 (CH,2 CHarom) ; 127,5 (C, C17) ; 127,1 (CH, 2 CHarom) ; 79,7 (C, C4) ; 66,4 (CH2, C30) ; 60,1 (CH);58,6 (CH); 55,3 (CH); 38,5 (CH2) ; 36,2 (CH); 32,9 (CH2) ; 30,7 (CH2) ; 29,1 (CH2) ; 28,2(CH3, C1, C2 et C3) ; 24,2 (CH2) ; 22,9 (CH2).

Trifluoroacétate de (2S, 3aS, 7aS)-1-(2-amino-3-biphényl-4-ylpropanoyl)octahydro-1H-indole-2-carboxylate de phényle (57)


Composé obtenu selon le mode opératoire de déprotection d’amine protégée par un

Boc par de l’acide trifluoroacétique en utilisant du (2S,3aS,7aS)-1-(2-[(tert-butoxycarbonyl)-

amino]-3-biphényl-4-yl-propanoyl)-octahydro-1H-indole-2-carboxylate de phényle 56 (10,5

g, 18,0 mmol). Obtention d’un solide légèrement beige (10,5 g).

Rendement : 98%

NH2N

O H

HH

O

OTFA,

258

RMN 1H (200 MHz, MeOD) δ : 7,10-7,79 (m, 14H, 14 Harom) ; 5,18 (s, 2H, CH2-Ph) ; 4,35-4,88 (m, 1H, CH) ; 3,92-4,31 (m, 1H, CH) ; 3,75-3,89 (m, 1H, CH) ; 3,49-3,72 (m, 1H, CH) ;3,05-3,33 (m, 2H, CH2) ; 0,88-2,25 (m, 10H, 5 CH2)

(2S, 3aS, 7aS)-1-(2-((diméthoxyphosphoryl)méthyl)amino-3-(biphényl-4yl)-propanoyl)octahydro-1H-indole-2-carboxylate de benzyle (58)

Formule brute : C34H41N2O6PMasse molaire : 604,69 g/mol

Composé obtenu selon le mode opératoire de couplage d’amine sur un triflate en

utilisant du trifluoroacétate de (2S,3aS,7aS)-1-(2-amino-3-biphényl-4-ylpropanoyl)octahydro-

1H-indole-2-carboxylate de phényle 57 (1,1g, 1,84 mmol), de la diisopropyléthylamine (0,67

mL, 2 éq.) et du trifluorométhylsulfonyloxymethylphosphonate de diméthyle 33 (0,63 g, 1,2

éq.). Obtention d’une huile incolore (0,45 g) après chromatographie sur colonne de silice

(acétate d’éthyle/méthanol 95/5).

Rendement : 41 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,10-7,71 (m, 14H, 14 Harom) ; 5,18 (s, 2H, CH2-Ph) ; 4,98-5,03 (sl, 1H, NH) ; 4,20-4,61 (m, 1H, CH) ; 3,92-4,13 (m, 1H, CH) ; 3,60-3,71 (m, 1H, CH) ;3,58 (d, J= 11,4 Hz, 6H, 2 OMe) ; 3,39-3,45 (m, 1H, CH) ; 2,94-3,33 (m, 2H, CH2) ; 2,25-2,76 (m, 2H, CH2) ; 1,04-2,18 (m, 10H, 5 CH2).

RMN 31P (121,5 MHz, CDCl3) δ : 23,5

NH

N

O H

HH

O

OPO

OO

259

Acide (2S, 3aS, 7aS)-1-(2-((diméthoxyphosphoryl)méthyl)amino-3-(biphényl-4yl)-propanoyl)octahydro-1H-indole-2-carboxylique (59)


Le (2S,3aS,7aS)-1-(2-((diméthoxyphosphoryl)-méthyl)-amino-3-(biphényl-4yl)-

propanoyl)-octahydro-1H-indole-2-carboxylate de benzyle 58 (0,44 g, 0,73 mmol) est

solubilisé dans du méthanol (20 mL). Du palladium sur charbon (44 mg) est ajouté à cette

solution après dégazage sous azote pendant 10 minutes. Le milieu réactionnel est ensuite agité

à T.A sous une pression de 50 psis d’hydrogène pendant 12 h. La solution est ensuite filtrée

sur célite puis concentrée sous pression réduite. Le résidu obtenu est ensuite trituré dans de

l’éther diéthylique, filtré et séché pour donner un solide blanc (0,35 g).


RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,11-7,62 (m, 9H, 9 Harom) ; 4,94-5,01 (sl, 1H, NH) ; 4,20-4,63 (m, 1H, CH) ; 3,91-4,15 (m, 1H, CH) ; 3,63-3,72 (m, 1H, CH) ; 3,55 (d, J= 11,4 Hz, 6H,2 OMe) ; 3,35-3,48 (m, 1H, CH) ; 2,90-3,31 (m, 2H, CH2) ; 2,25-2,76 (m, 2H, CH2) ; 1,01-2,17 (m, 10H, 5 CH2).

(2S,3aS,7aS)-1-(2-(2-tert-butoxy-2-oxoéthyl)amino-3-biphényl-4-ylpropanoyl)octahydro-1H-indole-2-carboxylate de phényle (60)


NH

N

O H

HH

OH

OPO

OO

NH

N

O H

HH

O

OO

O

1

2

3

4

56 7

8910

1112

13

14

1516

1718

19

20

2122

2324

25

2627

2829

30

3132

33

343536

37

260

Le trifluoroacétate de (2S,3aS,7aS)-1-(2-amino-3-biphényl-4-ylpropanoyl)octahydro-

1H-indole-2-carboxylate de phényle 57 (0,60 g, 1,01 mmol) est mis en suspension dans du

diméthylformamide (5 mL). A cette solution est ajoutée de la triéthylamine (0,14 mL, 1 éq.).

Le milieu réactionnel est alors agité à T.A pendant 1 h, filtré et condensé sous pression

réduite. Le résidu obtenu est ensuite solubilisé dans du diméthylformamide (10 mL). Du t-

butylbromoacétate (0,45 mL, 3 éq.) et de la triéthylamine (0,42 mL, 3 éq.) sont alors ajoutés à

cette solution. Ce milieu réactionnel est agité 5 h à T.A avant d’être filtré et concentré sous

pression réduite. Le résidu obtenu est repris dans de l’acétate d’éthyle, lavé à l’eau et à la

saumure puis séché sur sulfate de sodium et concentré sous pression réduite. L’huile jaune

obtenue est purifiée par chromatographie sur colonne de silice (hexane/éther 1/1) pour

conduire à une huile incolore (0,49 g).

Rendement : 82%

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,11-7,77 (m, 14H, 14 Harom) ; 5,16 (s, 2H, CH2-Ph) ; 4,95-5,02 (sl, 1H, NH) ; 4,25-4,66 (m, 1H, CH) ; 3,87-4,12 (m, 1H, CH) ; 3,63-3,77 (m, 1H, CH) ;3,39-3,48 (m, 1H, CH) ; 2,90-3,32 (m, 4H, 2 CH2) ; 1,44 (s, 9H, tBu) ; 1,01-2,11 (m, 10H, 5CH2).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 176,1 (C, C=O) ; 172,5 (C, C=O) ; 170,7 (C, C=O) ; 140,2(C, Carom) ; 138,7 (C, Carom) ; 135,9 (C, 2 Carom) ; 129,8 (CH, 2 CHarom) ; 129,1 (CH, 2 CHarom); 128,2 (CH, 2 CHarom) ; 128,0 (CH, C35) ; 127,8 (CH, 2 CHarom) ; 127,7 (CH, 2 CHarom) ;127,4 (C, C18) ; 126,8 (CH, 2 CHarom) ; 80,1 (C, C4) ; 66,1 (CH2, C31) ; 65,2 (CH); 63,6 (CH);62,8 (CH); 48,5 (CH2) ; 39,5 (CH2); 36,8 (CH) ; 32,7 (CH2) ; 30,1 (CH2) ; 29,1 (CH2) ; 28,0(CH3, C1, C2 et C3) ; 23,5 (CH2) ; 22,7 (CH2).

Trifluoroacétate de (2S,3aS,7aS)-1-{2-[(carboxyméthyl)amino]-3-biphényl-4-yl-propanoyl}octahydro-1H-indole-2-carboxylate de phényle (61)


Composé obtenu selon le mode opératoire de déprotection d’ester tert-butylique par de

l’acide trifluoroacétique en utilisant du (2S,3aS,7aS)-1-(2-(2-tert-butoxy-2-oxoéthyl)-amino-

NH

N

O H

HH

O

OOH

O TFA

261

3-biphényl-4-yl-propanoyl)-octahydro-1H-indole-2-carboxylate de phényle 60 (0,40 g, 0,67

mmol). Obtention d’un solide légèrement beige (0,44 g).

Rendement : 100%

RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,06-7,75 (m, 14H, 14 Harom) ; 5,21 (s, 2H, CH2-Ph) ; 4,30-4,81 (m, 1H, CH) ; 3,92-4,31 (m, 1H, CH) ; 3,72-3,84 (m, 1H, CH) ; 3,51-3,72 (m, 1H, CH) ;3,00-3,37 (m, 4H, 2CH2) ; 0,92-2,29 (m, 10H, 5 CH2)

(2S,3aS,7aS)-1-(2-{[2-(benzyloxyamino)-2-oxoéthyl]amino}-3-biphényl-4-yl-propanoyl)octahydro-1H-indole-2-carboxylate de phényle (62)



de BOP en utilisant du trifluoroacétate de (2S,3aS,7aS)-1-{2-[(carboxyméthyl)amino]-3-

biphényl-4-yl-propanoyl}octahydro-1H-indole-2-carboxylate de phényle 61 (0,30 g, 0,46

mmol), du chlorhydrate du O-benzylhydroxylamine (74 mg, 1,05 éq.), de la N-

méthylmorpholine (0,15 mL, 2,1 éq.) et du BOP (0,30 g, 1,1 éq.). Obtention d’une huile

incolore (0,23 g) après chromatographie sur colonne de silice (acétate d’éthyle/méthanol

95/5).

Rendement : 77 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 8,01-8,19 (sl, 1H, NH) ; 7,09-7,81 (m, 19H, 19 Harom) ; 5,25(s, 2H, CH2-Ph) ; 5,16 (s, 2H, CH2-Ph) ; 4,91-4,99 (sl, 1H, NH) ; 4,23-4,61 (m, 1H, CH) ;3,89-4,13 (m, 1H, CH) ; 3,59-3,71 (m, 1H, CH) ; 3,40-3,49 (m, 1H, CH) ; 2,85-3,30 (m, 4H, 2CH2) ; 0,91-2,09 (m, 10H, 5 CH2).RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 173,8 (C, C=O) ; 171,3 (C, C=O) ; 168,9 (C, C=O) ; 140,0(C, Carom) ; 138,9 (C, Carom) ; 135,7 (C, 2 Carom) ; 135,0 (C, Carom) 130,2 (CH, 2 CHarom) ;

NH

N

O H

HH

O

ONH

O

O1

2 34

56

7

8

9 10

111213

1415

16

17

1819

2021

22

23

2425

2627

28

293031

32

33

3435

36

3738

39

40

262

129,4 (CH, 2 CHarom) ; 128,5 (CH, 2 CHarom) ; 128,1 (CH, C38) ; 127,9 (CH, 2 CHarom) ; 127,7(CH, 2 CHarom) ; 127,5 (CH, C21) ; 127,1 (CH, 2 CHarom) ; 126,9 (CH, 2 CHarom) ; 126,6 (CH,C1) ; 125,9 (CH, 2 CHarom) ; 79,0 (C, C7) ; 66,3 (CH2, C31) ; 65,0 (CH); 63,4 (CH); 63,0 (CH);45,9 (CH2) ; 38,1 (CH2); 36,8 (CH) ; 32,9 (CH2) ; 30,5 (CH2) ; 28,7 (CH2) ; 23,9 (CH2) ; 23,1(CH2).

(2S,3aS,7aS)-1-(2-(2-benzyloxy-2-oxoéthyl)amino-3-biphényl-4-ylpropanoyl)octahydro-1H-indole-2-carboxylate de phényle (63)


Le trifluoroacétate de (2S,3aS,7aS)-1-(2-amino-3-biphényl-4-ylpropanoyl)octahydro-

1H-indole-2-carboxylate de phényle 57 (0,56 g, 0,94 mmol) est mis en suspension dans du

diméthylformamide (5 mL). A cette solution est ajoutée de la triéthylamine (0,14 mL, 1 éq.).

Le milieu réactionnel est alors agité à T.A pendant 1 h, filtré et condensé sous pression

réduite. Le résidu obtenu est ensuite solubilisé dans du diméthylformamide (10 mL). Du

benzylbromoacétate (0,46 mL, 3 éq.) et de la triéthylamine (0,40 mL, 3 éq.) sont alors ajoutés

à cette solution. Ce milieu réactionnel est agité 5 h à T.A avant d’être filtré et concentré sous

pression réduite. Le résidu obtenu est repris dans de l’acétate d’éthyle, lavé à l’eau et à la

saumure puis séché sur sulfate de sodium et concentré sous pression réduite. L’huile jaune

obtenue est purifiée par chromatographie sur colonne de silice (hexane/éther 1/1) pour

conduire à une huile incolore (0,51 g).

Rendement : 86%

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,13-7,77 (m, 19H, 19 Harom) ; 5,31 (s, 2H, CH2-Ph) ; 5,18(s, 2H, CH2-Ph) ; 4,82-4,89 (sl, 1H, NH) ; 4,21-4,53 (m, 1H, CH) ; 3,92-4,11 (m, 1H, CH) ;3,57-3,65 (m, 1H, CH) ; 3,41-3,49 (m, 1H, CH) ; 3,11-3,30 (m, 2H, CH2) ; 2,36-2,69 (m, 2H,CH2) ; 0,97-2,01 (m, 10H, 5 CH2).

NH

N

O H

HH

O

OO

O

1

23

4

56

7

89 10

11

1213

14

1516

17

1819

2021

22

23

2425

2627

28

2930

31 32

33

3435

36

37

38 39

40

263

RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 175,9 (C, C=O) ; 171,3 (C, C=O) ; 170,3(C, C=O) ; 140,2(C, Carom) ; 138,7 (C, Carom) ; 135,6 (C, 2 Carom) ; 135,2 (C, Carom) 129,7 (CH, 2 CHarom) ;129,2 (CH, 2 CHarom) ; 128,8 (CH, 2 CHarom) ; 128,5 (CH, C1) ; 128,2 (CH, 2 CHarom) ; 128,1(CH, 2 CHarom) ; 128,0 (CH, C38) ; 127,8 (CH, 2 CHarom) ; 127,6 (CH, 2 CHarom) ; 127,4 (CH,C21) ; 127,1 (CH, 2 CHarom) ; 68,5 (CH2, CH2-Ph) ; 66,8 (CH2, CH2-Ph) ; 65,0 (CH); 64,1(CH); 63,6 (CH); 46,5 (CH2) ; 40,5 (CH2); 37,0 (CH) ; 32,6 (CH2) ; 30,5 (CH2) ; 28,5 (CH2) ;23,3 (CH2) ; 22,8 (CH2).

Chlorhydrate du 5-aminopentanoate de méthyle (64)


Composé obtenu selon le mode opératoire d’estérification d’amino-acide par le

chlorure de thionyle en utilisant de l’acide 5-aminopentanoïque (2 g, 17,1 mmol) et 3,74 mL

du chlorure de thionyle (3,74 mL, 3 équ). Obtention d’un solide blanc (2,75 g).

Rendement : 96%

RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 8,24 (sl, 2H, NH2) ; 3,68 (s, 3H, OMe) ; 3,05-3,09 (m, 2H, 1CH2(N)) ; 2,39 (t, J= 6,5 Hz, 2H, CH2(C=O)) ; 1,76-1,92 (m, 4H, 2 CH2).

5-[2-N-tert-butoxycarbonylamino-5-(2,4-difluorophényl)-pent-4-ynoylamino]-pentanoatede méthyle (65)



de BOP en utilisant de l’acide 2-N-tert-butoxycarbonylamino-5-(2,4-difluorophényl)-pent-4-

ynoïque 37 (1,62 g, 5,0 mmol), et du chlorhydrate du 5-aminopentanoate de méthyle 64 (0,88

g, 1,05 éq.), de la N-méthylmorpholine (1,63 mL, 2,1 éq.) et du BOP (3,33 g, 1,1 éq.).



NH2 O

O

HCl,

NH

NH

O

FF

O

OO

O

264

Rendement : 88 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,38-7,54 (m, 1H, Harom) ; 6,83-7,04 (m, 2H, 2 Harom) ;4,08-4,17 (m, 1H, CH) ; 3,63 (s, 3H, OMe) ; 3,18-3,30 (m, 2H, CH2(N)) ; 2,80-2,93 (m, 2H,CH2alcyne) ; 2,29 (t, J=7,2Hz, 2H, CH2(C=O)) ; 1,45-1,67 (m, 4H, 2 CH2) ; 1,45 (s, 9H, tBu).

Chlorhydrate du 5-[2-amino-5-(2,4-difluorophényl)-pent-4-ynoylamino]-pentanoate deméthyle (66)

Formule brute : C17H21ClF2N2O3Masse molaire : 374,82 g/mol

Composé obtenu selon le mode opératoire de déprotection du Boc en milieu acide

chlorhydrique en utilisant du 5-[2-N-tert-butoxycarbonylamino-5-(2,4-difluorophényl)-pent-

4-ynoylamino]-pentanoate de méthyle 65 (1,8 g, 4,1 mmol). Obtention d’un solide blanc (1,51

g).

Rendement : 97 %

RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,45-7,70 (m, 1H, Harom) ; 6,88-7,17 (m, 2H, 2 Harom) ;4,12(t, J= 6,5 Hz, 1H, CH) ; 3,69 (s, 3H, OMe) ; 3,42-3,68 (m, 2H, CH2(N)) ; 3,13 (d, J=6,1 Hz,2H, CH2alcyne) ; 2,62 (t, J=6,6 Hz, 2H, CH2(C=O)) ; 1,49-1,72 (m, 4H, 2 CH2).

5-[2-(((diméthoxyphosphoryl)-méthyl)-amino-5-(2,4-difluorophényl)-pent-4-ynoylamino]-pentanoate de méthyle (67)


Composé obtenu selon le mode opératoire de couplage d’amine sur une solution de

triflate en utilisant du 5-[2-amino-5-(2,4-difluorophényl)-pent-4-ynoylamino]-pentanoate de

NH2NH

O

FF

O

OHCl,

NH

NH

O

FF

O

OPO

MeOOMe

1

3 2

4

5

6

78

910

1112 13

1415

16

17

18

19

20

265

méthyle 66 (1,30 g, 3,84 mmol), de la diisopropyléthylamine (1,0 mL, 1,5 éq.) et de la

solution de trifluorométhylsulfonyloxyméthylphosphonate de diméthyle 33 (39,4 mL, 1,25


(AcOEt).

Rendement : 42%

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,48-7,67 (m, 1H, Harom) ; 6,83-7,12 (m, 2H, 2 Harom) ;4,12(t, J= 6,5 Hz, 1H, CH) ; 3,78 (d, J=11,5 Hz, 6H, OMe) ; 3,69 (s, 3H, OMe) ; 3,40-3,62 (m,2H, CH2(N)) ; 3,07 (d, J=6,1 Hz, 2H, CH2alcyne) ; 2,69 (t, J=6,6 Hz, 2H, CH2(C=O)) ; 1,54-1,70 (m, 4H, 2 CH2).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 171,7 (C, C=O) ; 161,5-167,4 (C, CaromF) ; 159,5 (C, C=O) ;159,3-167,8 (C, CaromF) ; 133,4 (CH, Carom) ; 110,9-111,9 (CH, C14) ; 105,5-106,3-106,8 (CH,C16) ; 102,7-103,4 (C, C12) ; 91,4 (C, Calcyne) ; 82,0 (C, Calcyne) ; 63,0 (CH, C8) ; 53,7-53,3(CH3, C19 et C20) ; 51,6 (CH3, C1) ; 41,1 (CH2, C6) ; 35,3-39,3 (CH2, C18) ; 33,4 (CH2, C3) ;28,0 (CH2) ; 20,9 (CH2) ; 19,8 (CH2).

RMN 31P (121,5 MHz, CDCl3) δ : 27,2

{[(2-phenyléthyl)amino]méthyl}phosphonate de diméthyle (68)



utilisant de la (2-phényléthyl)amine (0,23 g 1,90 mmol), de la diisopropyléthylamine (033

mL, 1 éq.) et du trifluorométhylsulfonyloxyméthylphosphonate de diméthyle 33 (0,62 g, 1,2



Rendement : 47 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,03-7,40 (m, 5H, 5 Harom) ; 3,75 (d, J= 10,8 Hz, 6H, 2OMe) ; 3,22 (d, J= 9Hz, 1H, NH) ; 2,73-3,16 (m, 6H, 3 CH2).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 140,7 (C, C6) ; 129,1 (CH, 2 CHarom) ; 128,2 (CH, 2 CHarom) ;126,9 (CH, C9) ; 53,8 (CH3, C1 et C2) ; 48,7 (CH2) ; 37,1 (CH2) ; 35,0 (CH2).

P NH

OO

O

266

RMN 31P (121,5 MHz, CDCl3) δ : 23,1

[(4-phénylpipérazin-1-yl)méthyl]phosphonate de diméthyle (69)



utilisant de la 1-phénylpipérazine (0,37 g, 2,25 mmol), de la diisopropyléthylamine (0,40 mL,

1 éq.) et du trifluorométhylsulfonyloxyméthylphosphonate de diméthyle 33 (0,75 g, 1,2 éq.).


d’éthyle/méthanol 95/5) pour conduire à une huile incolore (0,33 g).

Rendement : 52 %

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,20-7,31 (m, 2H, 2 Harom) ; 6,80-6,95 (m, 3H, 3 Harom) ;3,81 (d, J= 10,5 Hz, 6H, 2 OMe) ; 3,18-3,24 (m, 4H, 2 CH2) ; 2,78 -2,90 (m, 6H, 3 CH2).

RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 148,3 (C, C8) ; 129,3 (CH, 2 CHarom) ; 120,8 (CH, C11) ;117,5 (CH, 2 CHarom) ; 54,3 (2 CH2) ; 53,4 (CH3, C1 et C2) ; 46,3 (CH2, C3).

RMN 31P (81 MHz, CDCl3) δ : 22,6

{[(2,2-diphényléthyl)amino]méthyl}phosphonate de diméthyle (70)



utilisant de la (2,2-diphényléthyl)amine (0,33 g, 1,67 mmol), de la diisopropyléthylamine

(0,30 mL, 1 éq.) et du trifluorométhylsulfonyloxyméthylphosphonate de diméthyle 33 (0,55 g,

P NH

OO

O

1

2

3 4 56 7

8

910

11

1213

14

1516

17

P NO

OO N

1

2

3 45

678

910

1112

13

267

1,2 éq.). Obtention d’une huile incolore (0,26 g) après chromatographie sur colonne de silice


Rendement : 49 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,11-7,42 (m, 10H, 10 Harom) ; 4,19 (t, J= 7,6 Hz, 1H, CH) ;3,72 (d, J= 10,5 Hz, 6H, 2 OMe) ; 3,33 (d, J= 7,8 Hz, 2H, CH2) ; 3,04 (d, J= 12 Hz, 2H, CH2(-P)).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 148,1 (C, C6 et C12) ; 129,1 (CH, 4 CHarom) ; 127,2 (CH, 4CHarom) ; 126,3 (CH, C9 et C15) ; 55,1 (CH2) ; 53,0 (CH3, C1 et C2) ; 46,8 (CH, C5) ; 39,9(CH2).

RMN 31P (121,5 MHz, CDCl3) δ : 22,3

tert-butyl [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-(4-méthylpipérazin-1-yl)-2-oxoéthyl]carbamate(71)




(0,63 g, 1,83 mmol), de la 1-méthylpipérazine (0,23 mL, 1,05 éq.), de la N-méthylmorpholine

(0,23 mL, 1,1 éq.) et du BOP (0,90 g, 1,1 éq.). Obtention d’une huile incolore (0,60 g) après

chromatographie sur colonne de silice (acétate d’éthyle/méthanol 95/5).

Rendement : 78 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,21-7,62 (m, 9H, 9 Harom) ; 5,53 (d, J= 8,3 Hz, 1H, NH) ;4,88 (q, J= 8,3 Hz et 15,1 Hz, 1H, CH) ; 3,59-3,73 (m, 1H, 1 H de CH2) ; 3,44-3,56 (m, 1H, 1H de CH2) ; 3,28-3,42 (m, 1H, 1 H de CH2) ; 3,19-3,23 (m, 1H, 1 H de CH2) ; 2,91-3,15 (m,2H, 2 H de CH2) ; 2,31-2,42 (m, 1H, 1 H de CH2) ; 2,09-2,30 (m, 2H, CH2) ; 2,15 (s, 3H,Me) ; 1,67-1,73 (m, 1H, 1 H de CH2) ; 1,43 (s, 9H, tBu).

NH

N

OO

O N1

23

5

4

6

78

910 11

12

13

14 15

16

1718

19

20 2122

2324

25

268

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 170,1 (C, C=O) ; 158,2 (C, C=0) ; 140,3 (C, Carom) ; 137,8(C, Carom) ; 137,0 (C, Carom) ; 130,1 (CH, 2 CHarom) ; 129,2 (CH, 2 CHarom) ; 128,3 (CH, 2CHarom) ; 127,6 (CH, C17) ; 126,8 (CH, 2 CHarom) ; 79,3 (C, C4) ; 55,3 (CH2) ; 54,7 (CH2) ;54,1 (CH, C6) ; 47,2 (CH3, C25) ; 41,4 (CH2) ; 40,3 (CH2) ; 39,1 (CH2) ; 27,9 (CH3, C1, C2 etC3).

tert-butyl [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-{4-[4-(2-méthoxyphényl)pipérazin-1-yl]butyl}amino-2-oxoéthyl]carbamate (72)

Formule brute : C35H46N4O4Masse molaire : 586.78 g/mol



(0,75 g, 2,19 mmol), de la {4-[4-(2-méthoxyphényl)pipérazin-1-yl]butyl}amine (0,87 g, 1,05

éq.), de la N-méthylmorpholine (0,99 mL, 4,1 éq.) et du BOP (1,08 g, 1,1 éq.). Obtention



Rendement : 76 %

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,20-7,62 (m, 9H, 9 Harom) ; 6,79-7,08 (m, 4H, 4 Harom) ;6,57 (t, J= 5 Hz, 1H, NH) ; 5,30 (d, J= 7,9 Hz, 1H, NH) ; 4,28-4,39 (m, 1H, CH) ; 3,84 (s, 3H,OMe) ; 2,98-3,34 (m, 8H, 4 CH2) ; 2,48-2,70 (m, 4H, 2 CH2) ; 2,22-2,43 (m, 2H, CH2) ; 1,41(s, 9H, tBu) ; 1,34-1,62 (m, 4H, 2 CH2).

RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 172,1 (C, C=O) ; 155,3 (C, C=0) ; 150,1 (C, C34) ; 141,0 (C,Carom) ; 140,5 (C, Carom) ;137,6 (C, Carom) ; 136,5 (C, Carom) ; 130,1 (CH, 2 CHarom) ; 129,1(CH, 2 CHarom) ; 128,7 (CH, 2 CHarom) ; 127,9 (CH, C34) ; 127,5 (CH, C17) ; 126,8 (CH, 2CHarom) ; 120,5 (CH, CHarom) ; 115,2 (CH, CHarom) ; 112,1 (CH, CHarom) ; 79,3 (C, C4) ; 55,6(CH, C6) ; 55,2 (CH3, C35) ; 55,0 (CH2) ; 53,6 (2 CH2) ; 52,1 (2 CH2) ; 41,4 (CH2) ; 38,2(CH2) ; 28,7 (CH2) ; 27,9 (CH3, C1, C2 et C3) ; 27,6 (CH2).

NH

NH

OO

O

NN

O

1

23

4

5 6

78

910

1112

13

1415

16 17

18

19

20

21

22

23

2426

2728

29 3031

32

3334

35

25

269

tert-butyl [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-(4-phénylpipérazin-1-yl)-2-oxoéthyl]carbamate (73)




(0,44 g, 1,28 mmol), de la 1-phénylpipérazine (0,21 mL, 1,05 éq.), de la N-méthylmorpholine

(0,15 mL, 1,1 éq.) et du BOP (0,63 g, 1,1 éq.). Obtention d’une huile incolore (0,52 g) après


Rendement : 83 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,13-7,63 (m, 11 H, 11 Harom) ; 6,72-7,00 (m, 3H, 3 Harom) ;5,59 (d, J= 8,6 Hz, 1H, NH) ; 4,97 (q, J= 7,6 Hz et 14,3 Hz, 1H, CH) ; 3,80-4,00 (m, 1H, 1 Hde CH2) ; 2,85-3,74 (m, 8H, 3 CH2 et 2 H de CH2) ; 2,31-2,41 (m, 1H, 1 H de CH2) ; 1,50 (s,9H, tBu).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 167,8 (C, C=O) ; 156,8 (C, C=0) ; 150,3 (C, Carom) ; 140,2(C, Carom) ; 137,5 (C, Carom) ; 136,8 (C, Carom) ; 130,0 (CH, 2 CHarom) ; 129,8 (CH, 2 CHarom) ;128,9 (CH, 2 CHarom) ; 128,3 (CH, 2 CHarom) ; 127,5 (CH, C17) ; 127,0 (CH, 2 CHarom) ; 122,3(CH, C28) ; 117,0 (CH, 2 CHarom) ; 80,3 (C, C4) ; 54,3 (CH, C6) ; 51,3 (2 CH2) ; 43,2 (CH2) ;42,4 (CH2) ; 39,1 (CH2) ; 28,0 (CH3, C1, C2 et C3).

tert-butyl [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-{[(1-éthylpyrrolidin-2-yl)méthyl]amino}-2-oxoéthyl]carbamate (74)




NH

N

OO

O N1

23

45 6

789

10

111213

1415

16 17

18

19

2021 22

2324

25 2627

2829

30

NH

NH

OO

O

N

1

23

4

5 6

78

9 10

1112

13

14

1516

17

1819

20

21 22

2324

25

2627

270

(0,60 g, 1,75 mmol), de la [(1-éthylpyrrolidin-2-yl)méthyl]amine (0,28 mL, 1,05 éq.), de la N-


incolore (0,67 g) après chromatographie sur colonne de silice (acétate d’éthyle/méthanol

95/5).

Rendement : 83 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,20-7,65 (m, 9H, 9 Harom) ; 6,40 (sl, 1H, NH) ; 5,70 (sl, 1H,NH) ; 4,30-4,48 (m, 1H, CH) ; 3,33-3,56 (m, 1H, CH) ; 2,92-3,20 (m, 4H, 2 CH2) ; 2,38-2,78(m, 2H, CH2) ; 1,98-2,23 (m, 2H, CH2) ; 1,50-1,83 (m, 4H, 2 CH2) ; 1,43 (s, 9H, tBu) ; 0,79-1,09 (m, 3H, CH3).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 172,1 (C, C=O) ; 158,1 (C, C=O) ; 140,0 (C, CHarom) ; 137,5(C, CHarom) ; 136,2 (C, CHarom) ; 129,5 (CH, 2 CHarom) ; 129,0 (CH, 2 CHarom) ; 128,4 (CH, 2CHarom) ; 127,4 (CH, C17) ; 126,9 (CH, 2 CHarom) ; 80,1 (C, C4) ; 65,3 (CH, C22) ; 56,0 (CH,C6) ; 54,6 (CH2) ; 48,9 (CH2) ; 41,2 (CH2) ; 38,5 (CH2) ; 30,5 (CH2) ; 28,0 (CH3, C1, C2 et C3); 24,1 (CH2) ; 14,6 (CH3, C27).

tert-butyl [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-oxo-2-(4-pyrimidin-2-ylpipérazin-1-yl)éthyl]carbamate (75)

Formule brute : C28H38N5O3Masse molaire : 487,61g/mol



(0,75 g, 2,19 mmol), de la 2-pipérazin-1-ylpyrimidine (0,39 g, 1,05 éq.), de la N-


incolore (0,87 g) après chromatographie sur colonne de silice (acétate d’éthyle/hexane 1/1).

Rendement : 80 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 8,23 (d, J= 4,1 Hz, 2H, 2 Harom) ; 7,20-7,61 (m, 9H, 9Harom) ; 6,47 (t, J= 4,7 Hz, 1H, Harom) ;5,57 (d, J= 8,3 Hz, 1H, NH) ; 4,91 (q, J= 8,1 Hz et 14,6Hz, 1H, CH) ; 3,51-3,92 (m, 3H, CH2 et 1H de CH2) ; 3,34-3,47 (m, 1H, 1 H de CH2) ; 2,97-3,23 (m, 4H, 2 CH2) ; 1,43 (s, 9H, tBu).

NH

N

OO

O N N

N1

2

3

4

5 6

78

910 11

121314

1516 17

1819

20

2122

23 2425

2627

28

271

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 171,0 (C, C=O) ; 162,3 (C, C25) ; 158,3 (CH, C26 etC28) ;156,0 (C, C=O) ; 140,2 (CH, 2 CHarom) ; 137,8 (CH, 2 CHarom) ; 136,7 (CH, 2 CHarom) ;130,1 (CH, 2 CHarom) ; 129,8 (CH, 2 CHarom) ; 129,0 (CH, 2 CHarom) ; 128,6 (CH, 2 CHarom) ;127,4 (CH, C17) ; 126,8 (CH, 2 CHarom) ; 111,2 (C, C27) ; 79,6 (C, C4) ; 55,0 (CH, C6) ; 44,0 (2CH2) ; 43,7 (CH2) ; 43,2 (CH2) ; 38,2 (CH2) ; 28,1 (CH3, C1, C2 et C3).

Ditrifluoroacétate de [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-(4-méthylpipérazin-1-yl)-2-oxoéthyl]amine (76)



Boc par de l’acide trifluoroacétique en utilisant du tert-butyl [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-(4-

méthylpipérazin-1-yl)-2-oxoéthyl]-carbamate 71 (0,60 g, 1,23 mmol). Obtention d’un solide

légèrement beige (0,74 g).

Rendement : 97%

RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,18-7,67 (m, 9H, 9 Harom) ; 4,82-4,95 (m, 1H, CH) ; 3,65-3,81 (m, 1H, 1 H de CH2) ; 3,40-3,59 (m, 1H, 1 H de CH2) ; 3,30-3,38 (m, 1H, 1 H de CH2) ;3,19-3,27 (m, 1H, 1 H de CH2) ; 2,92-3,17 (m, 2H, 2 H de CH2) ; 2,30-2,41 (m, 1H, 1 H deCH2) ; 2,11-2,28 (m, 2H, CH2) ; 2,19 (s, 3H, Me) ; 1,69-1,85 (m, 1H, 1 H de CH2) ; 1,49 (s,9H, tBu)

{[((1-biphényl-4-yl)-2-oxo-2-(4-méthylpipérazin-1-yl)éthyl)amino]méthyl}phosphonatede diméthyle (77)


NH2N

O

N

2 TFA,

NH

N

O

N

PO

OO

272


utilisant du ditrifluoroacétate de [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-(4-méthylpipérazin-1-yl)-2-

oxoéthyl]amine 76 (0,74 g, 1,33 mmol), de la diisopropyléthylamine (0,72 mL, 3 éq.) et du



d’éthyle/méthanol/triéthylamine 95/5/3).

Rendement : 46 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,12-7,62 (m, 9H, 9 Harom) ; 3,98-4,07 (m, 1H, CH) ; 3,60 (d,J= 11,5 Hz, 6H, 2 OMe) ; 3,21-3,58 (m, 4H, 2 CH2) ; 2,67-3,18 (m, 6H, 3 CH2) ; 2,08-2,40(m, 2H, CH2) ; 2,11 (s, 3H, Me).

RMN 31P (121,5 MHz, CDCl3) δ : 24,3

Tri-trifluoroacétate de [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-{4-[4-(2-méthoxyphényl)pipérazin-1-yl]butyl}amino-2-oxoéthyl]amine (78)



Boc par de l’acide trifluoroacétique en utilisant du tert-butyl [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-{4-

[4-(2-méthoxyphényl)-pipérazin-1-yl]-butyl}-amino-2-oxoéthyl]-carbamate 72 (0,9 g, 1,53

mmol). Obtention d’un solide légèrement beige (1,23 g).

Rendement : 97%

RMN 1H (200 MHz, MeOD) δ : 7,23-7,67 (m, 9H, 9 Harom) ; 6,80-7,06 (m, 4H, 4 Harom) ;4,30-4,37 (m, 1H, CH) ; 3,87 (s, 3H, OMe) ; 2,99-3,37 (m, 8H, 4 CH2) ; 2,51-2,75 (m, 4H, 2CH2) ; 2,20-2,38 (m, 2H, CH2) ; 1,27-1,63 (m, 4H, 2 CH2).

NH2NH

ON

N

O

3TFA,

273

4{[1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-oxo-2-{4-[4-(2-méthoxyphényl)pipérazin-1-yl]butyl}aminoéthyl]amino}méthylphosphonate de diméthyle (79)



utilisant du tri-trifluoroacétate de [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-{4-[4-(2-méthoxyphényl)-

pipérazin-1-yl]-butyl}-amino-2-oxoéthyl]-amine 78 (1 g, 1,21 mmol), de la

diisopropyléthylamine (0,86 mL, 4 éq.) et du trifluorométhylsulfonyloxyméthylphosphonate

de diméthyle 33 (0,41 g, 1,2 éq.). Obtention d’une huile incolore (0,34 g) après


Rendement : 46 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,23-7,72 (m, 9H, 9 Harom) ; 6,79-7,17 (m, 4H, 4 Harom) ;6,60 (t, J= 5,2 Hz, 1H, NH) ; 5,42 (d, J= 7,6 Hz, 1H, NH) ; 4,30-4,39 (m, 1H, CH) ; 3,83 (s,3H, OMe) ; 2,80-3,62 (m, 16H, 8 CH2) ; 1,10-1,78 (m, 4H, 2 CH2).

Ditrifluoroacétate de [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-(4-phénylpipérazin-1-yl)-2-oxoethyl]amine (80)



Boc par de l’acide trifluoroacétique en utilisant du tert-butyl [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-(4-

NH

NH

ON

N

O

POO

O

NH2N

O

N

2 TFA,

274

phénylpipérazin-1-yl)-2-oxoéthyl]-carbamate 73 (0,5 g, 1,03 mmol). Obtention d’un solide


Rendement : 99%

RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ :7,10-7,68 (m, 11 H, 11 Harom) ; 6,70-7,03 (m, 3H, 3 Harom) ;4,15-4,36(m, 1H, CH) ; 3,55-3,88 (m, 2H, CH2) ; 3,23-3,54 (m, 8H, 4 CH2).

{[((1-biphényl-4-yl)-2-oxo-2-(4-phénylpipérazin-1-yl)éthyl)amino]méthyl}phosphonatede diméthyle (81)



utilisant du ditrifluoroacétate de [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-(4-phénylpipérazin-1-yl)-2-

oxoéthyl]-amine 80 (0,57 g, 0,93 mmol), de la diisopropyléthylamine (0,49 mL, 3 éq.) et du




Rendement : 43 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,18-7,58 (m, 11H, 11 Harom) ; 6,61-6,93 (m, 3H, 3 Harom) ;3,86-4,00 (m, 1H, CH) ; 3,76 (d, J= 11,2 Hz, 6H, 2 OMe) ; 3,38-3,69 (m, 2H, CH2) ; 3,00-3,31 (m, 4H, CH2) ; 2,78-2,98 (m, 4H, 2 CH2) ; 2,20-2,33 (m, 2H, CH2).

NH

N

O

N

PO

OO

275

Ditrifluoroacétate de [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-{[(1-éthylpyrrolidin-2-yl)méthyl]amino}-2-oxoéthyl]amine (82)



Boc par de l’acide trifluoroacétique en utilisant du tert-butyl [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-{[(1-

éthylpyrrolidin-2-yl)méthyl]amino}-2-oxoéthyl]carbamate 74 (0,6 g, 1,33 mmol). Obtention

d’un solide légèrement beige (0,70 g).

Rendement : 91%

RMN 1H (200 MHz, MeOD) δ : 7,23-7,69 (m, 9H, 9 Harom) ; 4,34-4,51 (m, 1H, CH) ; 3,36-3,58 (m, 1H, CH) ; 2,88-3,23 (m, 4H, 2 CH2) ; 2,39-2,77 (m, 2H, CH2) ; 1,95-2,20 (m, 2H,CH2) ; 1,48-1,87 (m, 4H, 2 CH2) ; 1,00-1,21 (m, 3H, CH3).

{[1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-{[(1-éthylpyrrolidin-2-yl)méthyl]amino}-2-oxoéthyl]amino}méthylphosphonate de diméthyle (83)



utilisant du ditrifluoroacétate de [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-{[(1-éthylpyrrolidin-2-

yl)méthyl]-amino}-2-oxoéthyl]-amine 82 (0,6 g, 1,04 mmol), de la diisopropyléthylamine

(0,55 mL, 3 éq.) et du trifluorométhylsulfonyloxyméthylphosphonate de diméthyle 33 (0,34 g,

1,2 éq.). Obtention d’une huile incolore (0,25 g) après chromatographie sur colonne de silice

(acétate d’éthyle/méthanol/triéthylamine 95/5/3).

NH2NH

O

N2 TFA,

NH

NH

OP NO

OO

276

Rendement : 51 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,11-7,67 (m, 9H, 9 Harom) ; 3,73 (d, J= 10,5 Hz, 3H, OMe) ;3,72 (d, J= 10,5 Hz, 3H, OMe) ; 3,42-3,63 (m, 2H, 2 CH) ; 2,68-3,32 (m, 6H, 3 CH2) ; 2,02-2,31 (m, 2H, CH2) ; 1,21-1,95 (m, 6H, 3 CH2) ; 1,07 (dt, J= 2,5 Hz et 7,1 Hz, 3H, Me).

Ditrifluoroacétate de [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-oxo-2-(4-pyrimidin-2-ylpipérazin-1-yl)éthyl]amine (84)



Boc par de l’acide trifluoroacétique en utilisant du tert-butyl [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-oxo-

2-(4-pyrimidin-2-ylpipérazin-1-yl)-éthyl]-carbamate 75 (0,80 g, 1,64 mmol). Obtention d’un

solide légèrement beige (0,96 g).

Rendement : 95%

RMN 1H (200 MHz, MeOD) δ : 8,20-8,31 (m, 2H, 2 Harom) ; 7,20-7,61 (m, 9H, 9 Harom) ;6,45-6,53 (m, 1H, Harom) ; 4,82-4,98 (m, 1H, CH) ; 3,67-3,99 (m, 2H, CH2) ; 3,34-3,56 (m,2H, CH2) ; 3,01-3,27 (m, 4H, 2 CH2).

{[1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-oxo-2-(4-pyrimidin-2-ylpipérazin-1-yl)éthyl]amino}méthyl-phosphonate de diméthyle (85)



utilisant du ditrifluoroacétate de [1-(biphényl-4-ylméthyl)-2-oxo-2-(4-pyrimidin-2-

NH2N

O

N N

N

2 TFA,

NH

N

O

N

PO

OO

N

N

277

ylpipérazin-1-yl)éthyl]amine 84 (0,90 g, 1,46 mmol), de la diisopropyléthylamine (0,78 mL, 3

éq.) et du trifluorométhylsulfonyloxyméthylphosphonate de diméthyle 33 (0,48 g, 1,2 éq.).



Rendement : 48 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 8,27 (d, J= 4,1 Hz, 2H, 2 Harom) ; 7,23-7,61 (m, 9H, 9Harom) ;6,47 (t, J= 4,7 Hz, 1H, 1 Harom) ; 5,57 (d, J=8,3 Hz, 1H, NH) ; 4,13 (t, J= 6,6 Hz, 1H,CH) ; 3,79 (d, J= 10,4 Hz, 3H, OMe) ; 3,78 (d, J= 10, 4 Hz, 3H, OMe) ; 3,32-3,72 (m, 6H, 3CH2) ; 3,01-3,23 (m, 4H, 2 CH2) ; 2,61-2,97 (m, 2H, CH2).

3-biphényl-4-yl-2-[( tert-butoxycarbonyl)(méthyl)amino]propanoate de méthyle (86)


Une solution de 2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-3-biphényl-4-ylpropanoate de

méthyle 50 (1 g, 2,81 mmol) et d’iodure de méthyle (0,36 mL, 2 éq.) dans du

diméthylformamide (10 mL) est agitée à 0°C. De l’hydrure de sodium est ajouté (0,15 g, 1,3

éq.) par portion. Une fois cet ajout terminé, le milieu réactionnel est agité à T.A pendant 15h.

Il est ensuite hydrolysé par ajout d’une solution de chlorure d’ammonium et le

diméthylformamide est évaporé sous pression réduite. La solution aqueuse obtenue est ensuite

extraite à l’acétate d’éthyle. La phase organique est lavée à l’eau et à la saumure avant d’être

séchée sur sulfate de sodium, filtrée et concentrée sous pression réduite pour conduire à

l’obtention d’une huile légèrement jaune (0,96g).

Rendement : 92 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,30-7,62 (m, 7H, 7 Harom) ; 7,21 (d, J= 8,1 Hz, 2H, 2Harom) ; 4,64 (q, J= 5,5 Hz et 13,3 Hz, 1H, CH) ; 3,75 (s, 3H, OMe) ; 3,05-3,23 (m, 2H, CH2) ;2,45 (s, 3H, Me) ; 1,49 (s, 9H, tBu).

RMN 13C (75 MHz, DMSO-TFA) δ : 172,8 (C, C=O) ; 157,1 (C, C=O) ; 140,1 (C, Carom) ;138,2 (C, Carom) ; 135,0 (C, Carom) ; 130,1 (CH, 2 CHarom) ; 129,1 (CH, 2 CHarom) ; 128,6 (CH,

NO

OO

O1

23

4

5

6

7

89

1011 12

1314

15 1617

1819

20

2122

278

2 CHarom) ; 127,5 (CH, C18) ; 126,9 (CH, 2 CHarom) ; 81,1 (C, C4) ; 58,2 (CH, C7) ; 52,0 (CH3,C22) ; 35,4 (CH2, C8) ; 31,2 (CH3, C6) ; 28,0 (CH3, C1, C2 et C3).

Trifluoroacétate de 3-biphényl-4-yl-2-(méthylamino)propanoate de méthyle (87)



Boc par de l’acide trifluoroacétique en utilisant du 3-biphényl-4-yl-2-[( tert-

butoxycarbonyl)(méthyl)-amino]-propanoate de méthyle 86 (0,96 g, 2,60 mmol). Obtention


Rendement : 96%

RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,20-7,64 (m, 9H, 9 Harom) ; 3,71 (s, 3H, OMe) ; 3,50 (t, J=7,2 Hz, 1H, CH) ; 2,98-3,03 (m, 2H, CH2) ; 2,40 (s, 3H, Me).

3-biphényl-4-yl-2-[[(diméthoxyphosphoryl)méthyl](méthyl)amino]propanoate deméthyle (88)



utilisant du trifluoroacétate de 3-biphényl-4-yl-2-(méthylamino)propanoate de méthyle 87

(0,90 g, 2,35 mmol), de la diisopropyléthylamine (0,83 mL, 2 éq.) et du


d’une huile incolore (0,40g) après chromatographie sur colonne de silice (acétate

d’éthyle/hexane 75/25).

NHO

OTFA,

NO

OPO

OO

1

2

3

4

5

67

89 10

1112

13 1415

16

1718

1920

279

Rendement : 43 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,49-7,63 (m, 4H, 4 Harom) ; 7,38-7,48 (m, 2H, 2 Harom) ;7,22-7,37 (m, 3H, 3 Harom) ; 3,70-3,75 (m, 1H, CH) ; 3,68 (d, J= 10,6 Hz, 6H, 2 OMe(-P)) ;3,67 (s, 3H, OMe) ; 2,91-3,24 (m, 4H, 2 CH2) ; 2,57 (s, 3H, Me).

RMN 13C (75 MHz, DMSO-TFA) δ : 173,7 (C, C=O) ; 142,0 (C, Carom) ; 139,9 (C, Carom) ;135,8 (C, Carom) ; 130,0 (CH, 2 CHarom) ; 129,1 (CH, 2 CHarom) ; 128,4 (CH, 2 CHarom) ; 127,6(CH, C16) ; 127,1 (CH, 2 CHarom) ; 62,3 (CH, C5) ; 53,5-53,1 (CH3, C1 et C2) ; 51,6 (CH3, C20); 48,4- 45,0 (CH2, C3) ; 45,6-45,4 (CH3, C4) ; 33,0 (CH2, C6).

3-biphényl-4-yl-2-[( tert-butoxycarbonyl)(benzyl)amino]propanoate de méthyle (89)

Formule brute : C28H31NO4Masse molaire : 445.56 g/mol

Une solution de 2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-3-biphényl-4-ylpropanoate de

méthyle 50 (1 g, 2,81 mmol) et de bromure de benzyle (0,70 mL, 2 éq.) dans du

diméthylformamide (10 mL) est agitée à 0°C. De l’hydrure de sodium est ajouté (0,15 g, 1,3

éq.) par portion. Une fois cet ajout terminé, le milieu réactionnel est agité à T.A pendant 15h.

Il est ensuite hydrolysé par ajout d’une solution de chlorure d’ammonium et le

diméthylformamide est évaporé sous pression réduite. La solution aqueuse obtenue est ensuite

extraite à l’acétate d’éthyle. La phase organique est lavée à l’eau et à la saumure avant d’être

séchée sur sulfate de sodium, filtrée et concentrée sous pression réduite pour conduire à

l’obtention d’une huile légèrement jaune (1,22 g).

Rendement : 97 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,05-7,72 (m, 14H, 14 Harom) ; 3,93-4,63 (m, 3H, CH etCH2(-Ph)) ; 3,67 (s, 3H, OMe) ; 3,10-3,45 (m, 2H, CH2) ;1,51 (s, 9H, tBu).

RMN 13C (75 MHz, DMSO-TFA) δ : 172,1 (C, C=O) ; 156,2 (C, C=O) ; 140,0 (C, Carom) ;139,1 (C, Carom) ; 138,0 (C, Carom) ; 135,1 (C, Carom) ; 129,5 (CH, 2 CHarom) ; 129,1 (CH, 2CHarom) ; 128,8 (CH, 2 CHarom) ; 128,5 (CH, 2 CHarom) ; 127,6 (CH, C24) ; 127,2 (CH, C10) ;

NO

OO

O1

23

45

678

9 10

11

1213

14 15 16 17

18

1920

2122

23

25

24

26

2728

280

126,9 (CH, 2 CHarom) ; 126,8 (CH, 2 CHarom) ; 79,9 (C, C4) ; 58,7 (CH, C13) ; 52,1 (CH3, C28) ;50,0 (CH2, C6) ; 36,2 (CH2, C14) ; 28,3 (CH3, C1, C2 et C3).

Trifluoroacétate de 3-biphényl-4-yl-2-(benzylamino)propanoate de méthyle (90)



Boc par de l’acide trifluoroacétique en utilisant du 3-biphényl-4-yl-2-[( tert-

butoxycarbonyl)(benzyl)-amino]-propanoate de méthyle 89 (1,22 g, 2,74 mmol). Obtention


Rendement : 94%

RMN 1H (200 MHz, MeOD) δ : 7,23-7,75 (m, 14H, 14 Harom) ; 3,90-3,98 (m, 1H, CH) ; 3,76(s, 3H, OMe) ; 3,63-3,72 (m, 2H, CH2) ; 3,06-3,12 (m, 2H, CH2).

3-biphényl-4-yl-2-[[(diméthoxyphosphoryl)méthyl](benzyl)amino]propanoate deméthyle (91)



utilisant du trifluoroacétate de 3-biphényl-4-yl-2-(benzylamino)propanoate de méthyle 90 (1,1

g, 2,40 mmol), de la diisopropyléthylamine (0,85 mL, 2 éq.) et du

NHO

OTFA,

NO

OPO

OO

1

2

3

45

6

7 8

910

11

1213

14 15 16

1718

19 2021

2223

24

2526

281

trifluorométhylsulfonyloxymethylphosphonate de diméthyle 33 (0,79 g, 1,2 éq.). Obtention

d’une huile incolore (0,54g) après chromatographie sur colonne de silice (acétate

d’éthyle/hexane 8/2 puis acétate d’éthyle/méthanol 95/5).

Rendement : 48 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,04-7,52 (m, 14H, 14 Harom) ; 4,06 (d, J=13,7 Hz, 1H, 1 Hde CH2-P) ; 3,91 (t, J= 7,5 Hz, 1H, 1 H de CH2-P) ; 3,57 (s, 3H, OMe) ; 3,55 (d, J=10,7 Hz,3H, OMe-P) ; 3,48 (d, J= 10,7 Hz, 3H, OMe-P) ; 2,90-3,31 (m, 4H, 2 CH2).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 172,8 (C, C=O) ; 141,4 (C, Carom) ; 140,2 (C, Carom) ; 139,9(C, Carom) ; 136,1 (C, Carom) ; 131,5 (CH, 2 CHarom) ; 130,0 (CH, 2 CHarom) ; 129,1 (CH, 2CHarom) ; 128,6 (CH, 2 CHarom) ; 128,1 (CH, 2 CHarom) ; 127,5 (CH, C22) ; 127,2 (CH, C8) ;127,0 (CH, 2 CHarom) ; 63,1 (CH, C11) ; 58,0 (CH2, C4) ; 53,6-53,2 (CH3, C1 et C2) ; 51,5(CH3, C26) ; 47,3-44,1 (CH2, C3) ; 33,6 (CH2, C12).

2-(acétylamino)-3-biphényl-4-ylpropanoate de méthyle (92)


Le chlorhydrate du 2-amino-3-biphényl-4-yl-propanoate de méthyle 45 (2,04g, 7,0

mmol) est mis en suspension dans du dichlorométhane (20mL). Cette suspension est alors

refroidie à 0°C avant l’ajout de triéthylamine (2,9mL, 3,5 éq.). La solution obtenue est agitée

à T.A et de l’anhydride acétique (0,73 mL, 1,1 éq.) est ajoutée goutte à goutte. Une fois

l’addition terminée, la solution est remise à T.A et agitée 10 h. Le milieu réactionnel est alors

repris dans de l’acétate d’éthyle avant d’être lavé par une solution d’acide chlorhydrique 1N,

de l’eau, de la soude 1N, à nouveau de l’eau et enfin de la saumure. La phase organique est

alors séchée sur sulfate de sodium avant d’être concentrée sous pression réduite. Le résidu

obtenu est trituré dans l’éther pour conduire après filtration et séchage à un solide blanc (1,98

g).

Rendement : 95 %

NH

O

O

O

12

3

456

7

89

10

1112

1314

1516

1718

282

RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,25-7,70 (m, 9H, 9 Harom) ; 4,73 (q, J= 6Hz et 8,9 Hz, 1H,CH) ; 3,74 (s, 3H, OMe) ; 3,18-3,40 (m, 1H, 1 H de CH2) ; 2,99-3,07 (m, 1H, 1 H de CH2) ;1,96 (s, 3H, CH3).

RMN 13C (75 MHz, MeOD) δ : 172,1 (C, C=O) ; 171,2 (C, C=O) ; 140,1 (C, Carom) ; 183,5(C, Carom) ; 135,3 (C, Carom) ; 130,1 (CH, 2 CHarom) ; 129,3 (CH, 2 CHarom) ; 127,4 (CH, C14) ;127,0 (CH, 2 CHarom) ; 126,8 (CH, 2 CHarom) ; 55,0 (CH, C3) ; 51,6 (CH3, C1) ; 38,5 (CH2, C4); 23,5 (CH3, C18).

Acide 2-(acétylamino)-3-biphényl-4-ylpropanoïque (93)



en utilisant du 2-(acétylamino)-3-biphényl-4-ylpropanoate de méthyle 92 (1,90 g, 6,39 mmol)

et de la soude (1N, 7,7 mL, 1,2 éq.). Obtention d’une huile légèrement jaune (1,63 g).

Rendement : 90 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,25-7,67 (m, 9H, 9 Harom) ; 4,69-4,73 (m, 1H, CH) ; 3,23-3,33 (m, 1H, 1 H de CH2) ; 2,97-3,06 (m, 1H, 1 H de CH2) ; 1,95 (s, 3H, CH3).

{[2-(acétylamino)-3-biphényl-4-ylpropanoyl]amino}acétate de méthyle (94)



de BOP en utilisant de l’acide 2-(acétylamino)-3-biphényl-4-ylpropanoïque 93 (1 g, 3,53

mmol), du chlorhydrate du glycinate de méthyle 42 (0,44 g, 1,05 éq.), de la N-

NH

OH

O

O

NH

O

OO

NH

O

283


incolore (1,06 g) après chromatographie sur colonne de silice (acétate d’éthyle/hexane 9/1).

Rendement : 85 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,23-7,62 (m, 9H, 9 Harom) ; 6,53 (t, J=5 Hz, 1H, NH(-CH2)) ; 6,26 (d, J= 8,1 Hz, 1H, NH(-CH)) ; 4,78 (q, J= 7,1 Hz et 14,3 Hz, 1H, CH) ; 3,98 (dd,J= 5,3 Hz et 12,1 Hz, 2H, CH2) ; 3,72 (s, 3H, OMe) ; 3,13 (d, J= 7,1 Hz, 2H, CH2) ; 2,00 (s,3H, Me).

2-(acétylamino)-3-biphényl-4-yl-N-[2-(benzyloxyamino)-2-oxoéthyl]propanamide (95)



de BOP en utilisant de l’acide {[2-(acétylamino)-3-biphényl-4-ylpropanoyl]amino}acétique

21 (0,97 mmol), du chlorhydrate du O-benzylhydroxylamine (0,15 g, 1,05 éq.), de la N-


incolore (0,35 g) après chromatographie sur colonne de silice (acétate d’éthyle).

Rendement : 82 %

RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,28-7,67 (m, 14H, 14 Harom) ; 4,88 (s, 2H, CH2(-Ph)) ; 4,60-4,66 (m, 1H, CH) ; 3,80 (q, J= 16,2 Hz, 36,8 Hz, 2H, CH2) ; 3,20-3,27 (m, 1H, 1 H de CH2) ;2,92-3,03 (m, 1H, 1 H de CH2) ; 1,97 (s, 3H, Me).

RMN 13C (75 MHz, MeOD) δ : 171,2 (C, C=O) ; 169,9 (C, C=O) ; 169,0 (C, C=O) ; 140,0(C, Carom) ; 139,7 (C, Carom) ; 135,3 (C, Carom) ; 134,6 (C, Carom) ; 130,2 (CH, 2 CHarom) ; 129,0(CH, 2 CHarom) ; 127,4 (CH, C14) ; 127,1 (CH, 2 CHarom) ; 126,7 (CH, 4 CHarom) ; 126,2 (CH,C24) ; 125,7 (CH, 2 CHarom) ; 77,6 (CH2, C20) ; 53,8 (CH, C3) ; 46,1 (CH2) ; 38,5 (CH2); 22,7(CH3, C1).

NH

O

NH

ONH

O

O 123

4 5 6

78

9

10

1112

13 14

15

16

1718

192021

2223

2425 26

284

2-{[2-(acétylamino)-3-biphényl-4-ylpropanoyl]amino}-3-biphényl-4-ylpropanoate deméthyle (96)



de BOP en utilisant de l’acide 2-(acétylamino)-3-biphényl-4-ylpropanoïque 93 (0,5 g, 1,76

mmol), du chlorhydrate du 2-amino-3-biphényl-4-yl-propanoate de méthyle 45 (0,54 g, 1,05

éq.), de la N-méthylmorpholine (0,57 mL, 2,1 équ) et du BOP (1,17 g, 1,1 éq.). Obtention


d’éthyle/hexane 8/2 puis acétate d’éthyle pur).

Rendement : 85 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,32-7,61 (m, 14H, 14 Harom) ; 7,23 (d, J= 8,1 Hz, 2H, 2Harom) ; 6,95 (d, J= 8,1 Hz, 2H, 2 Harom) ; 6,34 (d, J= 7,8 Hz, 1H, NH) ; 6,07 (d, J= 7,8 Hz, 1H,NH) ; 4,86 (q, J= 6,9 Hz et 14,6 Hz, 1H, CH) ; 4,71 (q, J= 6,9 Hz et 14,6 Hz, 1H, CH) ; 3,71(s, 3H, OMe) ; 2,92-3,18 (m, 4H, 2 CH2) ; 1,98 (s, 3H, Me).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 171,7 (C, C=O) ; 169,8 (C, C=O) ; 169,4 (C, C=O) ; 140,1(C, Carom) ; 139,7 (C, 2 Carom) ; 136,8 (C, Carom) ; 134,9 (C, Carom) ; 134,3 (C, Carom) ; 129,6(CH, 2 CHarom) ; 129,4 (CH, 2 CHarom) ; 129,1 (CH, 4 CHarom) ; 127,5 (CH, C14 et C29) ; 127,2(CH, 2 CHarom) ; 126,8 (CH, 6 CHarom) ; 56,0 (CH) ; 55,6 (CH) ; 53, 0 (CH3, C33) ; 37,8 (CH2); 37,5 (CH2); 22,6 (CH3, C1)

{[(diméthoxyphosphoryl)(phényl)méthyl]amino}acétate de méthyle (97)


NH

O

OO

NH

O

123

45

67 8

9

10

11

12

13 14

15

16

1718

192021

22 23

2425

26 2728

2930

31

3233

NH

O

OPO

OO

285

A une suspension sous agitation sous atmosphère d’azote de chlorhydrate de glycinate

d’éthyle 24 (2,02 g, 14,5 mmol) dans du dichlorométhane (50 mL) sont ajoutés de la

triéthylamine (2,01 mL, 1 éq.), du benzaldéhyde (1,62 mL, 1,1 éq.) et du sulfate de sodium

(8,33 g, 4 éq.). Le milieu hétérogène est ensuite agité à T.A pendant 1h avant d’être filtré

directement dans un autre ballon sous azote. Le frité utilisé est rincé avec du dichlorométhane

(5 mL). Le filtrat est ensuite refroidi à 0°C avant l’ajout de triméthylphosphite (2,73 mL, 1,6

éq.) et de BF3.OEt2 (2 mL, 1,1 éq.). La solution obtenue est alors agitée à T.A pendant 14 h

avant d’être diluée avec du dichlorométhane et lavée à l’eau, puis séchée sur sulfate de

sodium, filtrée et concentrée sous pression réduite. L’huile jaune obtenue est purifiée par

chromatographie sur colonne de silice (Acétate d’éthyle/hexane 8/2) pour donner une huile

incolore (1,80 g).

Rendement : 41%

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,27-7,52 (m, 5H, 5 Harom) ; 4,14 (q, J= 7,1 Hz et 14,4 Hz,2H, OCH2) ; 3,78 (dd, J=2,2 Hz et 11,7 Hz, 1H, CH) ; 3,69 (d, J= 18,8 Hz, 3H, OMe) ; 3,64(d, J= 18,8 Hz, 3H, OMe) ; 3,33 (d, J= 17,4 Hz, 2H, CH2) ; 1,22 (t, J= 7,1 Hz, 3H, Me).

Chlorhydrate de l’acide {[phényl(phosphono)méthyl]amino}acétique (98)



acide chlorhydrique en utilisant du {[(diméthoxyphosphoryl)(phényl)méthyl]-amino}-acétate

de méthyle 97 (0,5 g, 1,66 mmol). Obtention d’un solide blanc (0,2 g)

Rendement : 43 %

RMN 1H (300 MHz, MeOD) δ : 7,25-7,54 (m, 5H, 5 Harom) ; 3,87-4,01 (m, 1H, CH) ; 3,42 (s,2H, CH2).RMN 13C (75 MHz, MeOD) δ : 170,1 (C, C1) ; 138,7 (C, C4) ; 129,8-129,7 (CH, 2 CHarom) ;129,5-129,3 (CH, 2 CHarom) ; 128,2 (CH, C7) ; 60,2-57,0 (CH, C3) ; 48,0-47,8 (CH2, C2).RMN 31P (121,5 MHz, MeOD) δ : 12,4

NH

OH

OPO

OHOH

HCl

12

3

45

67

8

9

286

{[(diméthoxyphosphoryl)méthyl]amino}acétate de méthyle (99)



utilisant du chlorhydrate de glycinate de méthyle 42 (0,5 g, 3,98 mmol), de la

diisopropyléthylamine (1,41 mL, 2 éq.) et du trifluorométhylsulfonyloxyméthylphosphonate

de diméthyle 33 (1,41 mL, 1,2 éq.). Obtention d’une huile incolore (0,42 g) après


Rendement : 50 %

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 3,80 (d, J= 10,6 Hz, 6H, 2 OMe(-P)) ; 3,73 (s, 3H, OMe) ;3,50 (s, 2H, CH2) ; 3,06 (d, J= 12,7 Hz, 2H, CH2(-P)).

Chlorhydrate de l’acide [(phosphonométhyl)amino]acétique (100)



acide chlorhydrique en utilisant du {[(diméthoxyphosphoryl)méthyl]amino}acétate de

méthyle 99 (0,42 g, 1,99 mmol). Obtention d’un solide blanc (0,15 g)

Rendement : 37 %

RMN 1H (200 MHz, MeOD) δ : 3,58 (s, 2H, CH2) ; 3,11 (d, J= 11,1 Hz, 2H, CH2(-P))

RMN 13C (50 MHz, MeOD) δ : 170,9 (C, C1) ; 54,3-50,2 (CH2, C3) ; 48,8-48,6 (CH2, C2).

RMN 31P (81 MHz, MeOD) δ : 11,9

NH

O

OPO

OO

NH

OH

OPO

OHOH

HCl1

23

287

[(tert-butoxycarbonyl)amino]acétate de méthyle (101)



Boc utilisant du chlorhydrate du glycinate de méthyle 42 (2 g, 15,9 mmol), de la triéthylamine

(4,45 mL, 2 éq.), du di-tert-butyldicarbonate (4,17 g, 1,2 éq.) et de la diméthylaminopyridine

(1 pointe de spatule). Obtention d’une huile incolore (2,5g) après chromatographie sur

colonne de silice (hexane/éther 4/1).

Rendement : 83 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 3,76 (s, 2H, CH2) ; 3,69 (s, 3H, OMe), 1,48 (s, 9H, tBu).

[(tert-butoxycarbonyl)(méthyl)amino]acétate de méthyle (102)


Une solution de [(tert-butoxycarbonyl)amino]acétate de méthyle 101 (2,5 g, 13,2

mmol) et d’iodure de méthyle (1,70 mL, 2 éq.) dans du diméthylformamide (50 mL) est agitée

à 0°C. De l’hydrure de sodium est ajouté (0,70 g, 1,3 éq.) par portion. Une fois cet ajout

terminé, le milieu réactionnel est agité à T.A pendant 15h. Il est ensuite hydrolysé par ajout

d’une solution saturée de chlorure d’ammonium et le diméthylformamide est évaporé sous

pression réduite. La solution aqueuse obtenue est ensuite extraite à l’acétate d’éthyle. La

phase organique est lavée à l’eau et à la saumure avant d’être séchée sur sulfate de sodium,

filtrée et concentrée sous pression réduite pour conduire à l’obtention d’une huile légèrement

jaune (2,39 g).

Rendement : 89 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 3,77 (s, 2H, CH2) ; 3,69 (s, 3H, OMe), 2,45 (s, 3H, Me);1,49 (s, 9H, tBu).

NH

O

O

O

O

NO

O

O

O

288

Trifluoroacétate de (méthylamino)acétate de méthyle (103)



Boc par de l’acide trifluoroacétique en utilisant de [(tert-butoxycarbonyl)-

(méthyl)amino]acétate de méthyle 102 (2,39 g, 11,75 mmol). Obtention d’un solide


Rendement : 96%RMN 1H (200 MHz, MeOD) δ : 3,76 (s, 2H, CH2) ; 3,71 (s, 3H, OMe), 2,49 (s, 3H, Me).

[[(Diméthoxyphosphoryl)méthyl](méthyl)amino]acétate de méthyle (104)


Composé obtenu selon le mode opératoire de couplage d’amine sur un triflate

en utilisant du trifluoroacétate de (méthylamino)acétate de méthyle 103 (2,45 g, 11,28 mmol),

de la diisopropyléthylamine (4,0 mL, 2 éq.) et du




Rendement : 44 %

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 3,81 (s, 3H, OMe) ; 3,73 (d, J= 11Hz, 6H, 2 OMe) ; 3,50 (s,2H, CH2) ; 3,10 (d, J= 10,3 Hz, 2H, CH2(-P)) ; 2,57 (s, 3H, Me).

Chlorhydrate de l’acide [méthyl(phosphonométhyl)amino]acétique (105)


NHO

OTFA,

NO

OPO

OO

NOH

OPO

OHOH

HCl 12

3

4

289


acide chlorhydrique en utilisant du [[(diméthoxyphosphoryl)méthyl](méthyl)amino]-acétate

de méthyle 104 (0,42 g, 1,99 mmol). Obtention d’un solide blanc (0,15 g).

Rendement : 37 %

RMN 1H (200 MHz, MeOD) δ : 3,56 (s, 2H, CH2) ; 3,13 (d, J= 10,3 Hz, 2H, CH2(-P)) ; 2,55(s, 3H, Me)

RMN 13C (50 MHz, MeOD) δ : 172,7 (C, C1) ; 56,8-53,6 (CH2, C4) ; 56,2-56,1 (CH2, C2) ;46,4-46,1 (CH3, C3).

RMN 31P (81 MHz, MeOD) δ : 9,8

Benzyloxycarbonylaminophénylméthylphosphonate de diméthyle (106)


Méthode A :

Composé obtenu selon le mode opératoire de synthèse de phosphonate par une

réaction tricomposante en utilisant du benzaldéhyde (0,31 g, 2,92 mmol), du

diméthylphosphite (0,27 mL, 1 éq.), du carbamate de benzyle (0,44 g, 1 éq.) et du BF3OEt2

(0,37 mL, 1,2 éq.). Obtention d’un solide blanc (0,87 g) après chromatographie sur colonne de

silice (acétate d’éthyle/hexane 1/1 puis acétate d’éthyle pur).

Rendement : 85 %

Méthode B :


réaction tricomposante en utilisant du benzaldéhyde (0,31 g, 2.92 mmol), du

triméthylphosphite (0,35 mL, 1 éq.), du carbamate de benzyle (0,45 g, 1 éq.) et du BF3OEt2



Rendement : 85 %

P NH

OO

OO

O1

2

3

4

7

5

68

9

10

11

1213

1415

1617

290

Méthode C :


réaction tricomposante en utilisant de benzaldéhyde (0,31 g, 2.92 mmol), du

triméthylphosphite (0,35 mL, 1 éq.), du carbamate de benzyle (0,45 g, 1 éq.) et du TiCl4 en

solution normale dans le dichlorométhane (3,5 mL, 1,2 éq.). Obtention d’un solide blanc (0,84

g) après chromatographie sur colonne de silice (acétate d’éthyle/hexane 8/2 puis acétate

d’éthyle pur).

Rendement : 82 %

Point de fusion : 121-124°C

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,26-7,52 (m, 10H, 10 Harom) ; 5,23 (d, J= 9,4 Hz, 1H,CH) ;5,11 (d, J= 10,9 Hz, 2H, CH2) ; 3,74 (d, J= 10,5 Hz, 3H, OMe) ; 3,50 (d, J= 10,5 Hz, 3H,OMe).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 146,2 (C, C10) ; 138,1-137,9 (C, C4) ; 135,1 (C, C12) ; 129,9-129,6 (CH, 2 CHarom) ; 129,5 (CH, C7) ; 129,4-129,2 (CH, 2 CHarom) ; 128,6 (CH, 2 CHarom) ;128,2 (CH, 2 CHarom et C15) ; 65,6 (CH2, C11) ; 55,8-52,5 (CH, C3) ; 54,0-53,6 (CH3, C1 et C2).

RMN 31P (121,5 MHz, CDCl3) δ : 25,0

Benzyloxycarbonylamino-(4-méthylphényl)méthylphosphonate de dimethyle (107)



réaction tricomposante en utilisant de 4-méthylbenzaldéhyde (0,35 mL, 3,0 mmol), du





P NH

OO

OO

O1

2

3

45

678

9

10

11

12

1314

1516

1718

291

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,22-7,51 (m, 9H, 9 Harom) ; 5,72 (sl, 1H, NH) ; 5,13 (m, 3H,CH2 et CH) ; 3,76 (d, J= 10,6 Hz, 3H, OMe) ; 3,53 (d, J= 10,6 Hz, 3H, OMe) ; 2,35 (s, 3H,Me).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 153,7 (C, C11) ; 138,9 (C, C7) ; 135,3 (C, C13) ; 135,1-134,9(C, C4) ; 129,7-129,6 (CH, 2 CHarom) ; 129,7-129,5 (CH, 2 CHarom) ; 128,6 (CH, 2 CHarom) ;128,1 (CH, 2 CHarom et C16) ; 66,2 (CH2, C12) ; 56,1-52,8 (CH, C3) ; 54,2-53,8 (CH3, C1 et C2);21,3 (CH3, C10).

RMN 31P (121,5 MHz, CDCl3) δ : 24,6

Benzyloxycarbonylamino-(3,4-dichlorophényl)méthylphosphonate de diméthyle (108)

Formule brute : C17H18Cl2NO5PMasse molaire : 418,22 g/mol


réaction tricomposante en utilisant du 3,4-dichlorobenzaldéhyde (0,52 g, 3,0 mmol), du





RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,27-7,52 (m, 8H, 8 Harom) ; 5,88 (sl, 1H, NH) ; 5,11 (m, 3H,CH2 et CH) ; 3,78 (d, 3H, J= 11,0 Hz, 3H, OMe) ; 3,62 (d, J= 11,0 Hz, 3H, OMe).

RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 155,2 (C, C10) ; 136,0-135,7 (C, C4) ; 135,4 (C, C12) ; 134,1(C, C7) ; 132,8-132,7 (C, C6) ; 132,1-132,0 (CH, CHarom) ; 130,1-129,9 (CH, CHarom) ; 129,5-129,3 (CH, CHarom) ; 128,5 (CH, 2 CHarom) ; 128,2 (CH, 2 CHarom et C15) ; 66,1 (CH2, C11) ;58,1-54,9 (CH, C3) ; 54,2-53,9 (CH3, C1 et C2).

RMN 31P (121,5 MHz, CDCl3) δ : 24,8

P NH

OO

OO

O

ClCl

1

2

3

456

78

9

10

11

1213

1415

1617

292

Benzyloxycarbonylamino-(3,4-diméthoxyphényl)méthylphosphonate de diméthyle (109)



réaction tricomposante en utilisant du 3,4-diméthoxybenzaldéhyde (0,83 g, 5,0 mmol), du





RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,28-7,39 (m, 5H, 5 Harom) ; 6,81-7,07 (m, 3H, 3 Harom) ;5,85 (d, J= 6,0 Hz, 1H, NH) ; 5,05-5,23 (m, 3H, CH2 et CH) ; 3,90 (s, 6H, 2 OMe(-Ph)) ; 3,76(d, J= 10,5 Hz, 3H, OMe(-P)) ; 3,53 (d, J= 10,5 Hz, 3H, OMe(-P)) .

RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 155,1 (C, C12) ; 150,8 (C, C7) ; 150,6-150,5 (C, C6) ; 135,5(C, C14) ; 134,7-134,4 (C, C4); 128,5 (CH, 2 CHarom) ; 128,1 (CH, 2 CHarom et C17) ; 122,2-122,0 (CH, CHarom) ; 116,9-166,7 (CH, CHarom) ; 115,0-114,9 (CH, CHarom) ; 66,0 (CH2, C13) ;58,0-54,7 (CH, C3) ; 56,2 (CH3) ; 56,0 (CH3) ; 54,1-53,9 (CH3, C1 et C2).

RMN 31P (81 MHz, CDCl3) δ : 25,8

Benzyloxycarbonylamino-(4-cyanophényl)méthylphosphonate de diméthyle (110)



réaction tricomposante en utilisant du 4-formylbenzonitrile (0,24 g, 1,8 mmol), du


P NH

OO

OO

O

OO

1

2

3

456

78

9

10

11

12

13

1415

1617

1819

P NH

OO

OO

O

N

1

2

3

45

678

9

10

11

12

1314

1516

1718

293




RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,25-7,53 (m, 9H, 9 Harom) ;6,01 (sl, 1H, NH) ; 5,07-5,22 (m,3H, CH2 et CH) ; 3,76 (d, J= 10,7 Hz, 3H, OMe) ; 3,53 (d, J= 10,7 Hz, 3H, OMe).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 155,0 (C, C11) ; 142,0-141,8 (C, C4) ; 136,1 (C, C13) ; 134,2-134,1 (CH, 2 CHarom) ; 130,9-130,7 (CH, 2 CHarom) ; 128,4 (CH, 2 CHarom) ; 128,1 (CH, 2CHarom et C16) ; 118,8 (C, C10) ; 112,7 (C, C7) ; 66,0 (CH2, C12) ; 57,0-53,7 (CH, C3) ; 54,2-53,9 (CH3, C1 et C2).RMN 31P (121,5 MHz, CDCl3) δ : 26,2

Benzyloxycarbonylamino-(2,4-diméthoxyphényl)méthylphosphonate de diméthyle (111)



réaction tricomposante en utilisant du 2,4-diméthoxybenzaldéhyde (0,50 g, 3,0 mmol), du





RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,25-7,36 (m, 6H, 6 Harom) ; 6,45-6,53 (m, 2H, 2 Harom) ;5,92 (d, J= 7,3 Hz, 1H, NH) ; 5,46-5,67 (m, 1H, CH) ; 5,04 (d, J= 12,2 Hz, 2H, CH2) ; 3,81 (s,6H, 2 OMe(-Ph)) ; 3,73 (d, J= 10,5 Hz, 3H, OMe(-P)) ; 3,54 3,73 (d, J= 10,5 Hz, 3H, OMe(-P)).

RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 163,2-162,9 (C, C5) ; 160,2 (C, C7) ; 155,0 (C, C12) ; 135,4(C, C14) ; 128,6 (CH, 2 CHarom) ; 128,2 (CH, 2 CHarom et C17) ; 112,2-111,9 (C, C4) ; 109,0-108,9(CH, CHarom) ; 100,2-100,0 (CH, CHarom) ; 66,1 (CH2, C13) ; 56,0 (CH3) ; 55,6 (CH3) ;54,2-53,9 (CH3, C1 et C2) ; 49,8-46,6 (CH, C3).

P NH

OO

OO

O

O

O1

2

3

456

78

910

11

12

13

1415

1617

1819

294

RMN 31P (81 MHz, CDCl3) δ : 25,2

Benzyloxycarbonylamino-(4-méthoxyphenyl)méthylphosphonate de diméthyle (112)


Méthode A :


réaction tricomposante en utilisant du 4-méthoxybenzaldéhyde (0,36 mL, 3,0 mmol), du




Rendement : 88 %

Méthode B :


réaction tricomposante en utilisant du 4-méthoxybenzaldéhyde (0,23 g, 1,69 mmol), du




Rendement : 88 %

Point de fusion : 117-120°C

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,27-7,39 (m, 7H, 7 Harom) ; 6,85-6,93 (m, 2H, 2 Harom) ;5,99 (sl, 1H, NH) ; 5,02-5,23 (m, 3H, CH2 et CH) ; 3,80 (s, 3H, OMe(-Ph)) ; 3,73 (d, J= 10,8Hz, 3H, OMe(-P)) ; 3,50 (d, J= 10,8 Hz, 3H, OMe(-P)).

RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 161,5 (C, C7) ; 155,3 (C, C11) ; 135,4 (C, C13) ; 132,4-132,2(C, C4) ; 132,1-131,9 (CH, CHarom) ; 130,5-130,3 (CH, 2 CHarom) ; 128,4 (CH, 2 CHarom) ;128,1 (CH, 2 CHarom et C16) ; 115,1-115,0 (CH, CHarom) ; 66,1 (CH2, C12) ; 55,9-53,3 (CH, C3); 55,3 (CH3, C10) ; 54,1-53,7 (CH3, C1 et C2).

RMN 31P (81 MHz, CDCl3) δ : 25,3

P NH

OO

OO

O

O

1

2

3

45

67

8

9

10

11

12

1314

1516

1718

295

Benzyloxycarbonylamino-(4-chlorophényl)méthylphosphonate de diméthyle (113)



réaction tricomposante en utilisant du 4-chlorobenzaldéhyde (0,42 g, 3,0 mmol), du





RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,25-7,53 (m, 9H, 9 Harom) ; 5,92 (sl, 1H, NH) ; 518-5,27 (m,1H, CH) ; 5,10 (d, J= 5,4 Hz, 2H, CH2) ; 3,73 (d, J= 10,8 HZ, 3H, OMe) ; 3,48 (d, J= 10,8HZ, 3H, OMe).RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 155,1 (C, C10) ; 135,4 (C, C12) ; 135,3-135,0 (C, C4) ; 134,9(C, C7) ; 130,7-130,5 (CH, 2 CHarom) ; 129,7-129,5 (CH, 2 CHarom) ; 128,4 (CH, 2 CHarom) ;128,1 (CH, 2 CHarom et C15) ; 65,9 (CH2, C11) ;57,3-54,0 (CH, C3) ; 54,2-53,9 (CH3, C1 et C2).

RMN 31P (81 MHz, CDCl3) δ : 24,9

Benzyloxycarbonylamino-(3-méthoxyphényl)méthylphosphonate de diméthyle (114)







P NH

OO

OO

O

Cl

1

2

3

54

67

8

9

10

11 12 1314

1516

17

P NH

OO

OO

O

O

1

2

3

456

78

910

11

12 13 1415

16

1718

296


RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,27-7,78 (m, 5H, 5 Harom) ; 6,85-7,12 (m, 4H, 4 Harom) ;5,99 (sl 1H, NH) ; 5,04-5,31 (m, 3H, CH2 et CH) ; 3,83 (s, 3H, OMe(-Ph)) ; 3,75 (d, J= 10,5Hz, 3H, OMe(-P)) ; 3,53 (d, J= 10,5 Hz, 3H, OMe(-P)).

RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 159,8-159,6 (C, C6) ; 155,0 (C, C11) ; 140,1-139,9 (C, C4) ;135,5 (C, C13) ;; 131,2-131,0 (CH, CHarom) ; 128,5 (CH, 2 CHarom) ; 128,1 (CH, 2 CHarom etC16) ; 121,6-121,4 (CH, CHarom) ; 117,9-117,7 (CH, CHarom) ; 116,1 (CH, C7) ; 66,0 (CH2,C12) ; 58,1-54,9 (CH, C3) ; 55,4 (CH3, C10) ; 54,1-53,7 (CH3, C1 et C2).

RMN 31P (81 MHz, CDCl3) δ : 25,7

Benzyloxycarbonylamino-(4-nitrophényl)méthylphosphonate de diméthyle (115)



réaction tricomposante en utilisant du 4-nitrobenzaldéhyde (0,45 g, 3,0 mmol), du





RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 8,17-8,32 (m, 2H, 2 Harom) ; 7,56-7,65 (m, 2H, 2 Harom) ;7,21-7,38 (m, 5H, 5Harom) ; 5,82 (sl, 1H, NH) ; 4,98-5,12 (m, 3H, CH2 et CH) ; 3,79 (d, J=10,9 Hz, 3H, OMe) ; 3,64 (d, J= 10,9 Hz, 3H, OMe).RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 149,2 (C, C10) ; 148,7 (C, C7) ; 142,8-142,6 (C, C4) ; 135,5(C, C12) ; 130,6-130,4 (CH, 2 CHarom) ; 128,5 (CH, 2 CHarom) ; 128,1 (CH, 2 CHarom et C15) ;124,8-124,7 (CH, 2 CHarom) ; 66,0 (CH2, C11) ; 56,7-53,4 (CH, C3) ; 54,1-53,9 (CH3, C1 et C2).

RMN 31P (121,5 MHz, CDCl3) δ : 24,2

P NH

OO

OO

O

NO2

297

1,3-Benzodioxol-5-ylbenzyloxycarbonylaminométhylphosphonate de diméthyle (116)



réaction tricomposante en utilisant du 1,3-benzodioxazole-5-carbaldéhyde (0,45 g, 3,0 mmol),

du diméthylphosphite (0,28 mL, 1 éq.), de carbamate de benzyle (0,45 g, 1 éq.) et du BF3OEt2




RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,22-7,45 (m, 5H, 5 Harom) ; 6,71-6,87 (m, 3H, 3 Harom) ;5,97 (s, 2H, CH2(-O)) ; 5,80 (sl, 1H, NH) ; 5,07-5,23 (m, 3H, CH2 et CH) ; 3,77 (d, J= 11,0Hz, 3H, OMe) ; 3,58 (d, J= 11,0 Hz, 3H, OMe).

RMN 13C (75 MHz, DMSO-TFA) δ : 155,2 (C, C11) ; 149,9-149,8 (C, C6) ; 149,0 (C, C7) ;135,5 (C, C13) ;133,2-133,0 (C, C4) ; 128,4 (CH, 2 CHarom) ; 128,2 (CH, 2 CHarom et C16) ;123,0-122,7 (CH, CHarom) ; 111,2-111,0 (CH, CHarom) ; 110,7-110,6 (CH, CHarom) ; 110,2(CH2, C10) ; 65,9 (CH2, C12) ;58,0-54,7 (CH, C3) ; 54,1-53,9 (CH3, C1 et C2).


Benzyloxycarbonylamino-(2-naphthyl)méthylphosphonate de diméthyle (117)



réaction tricomposante en utilisant du 2-naphtaldéhyde (0,37 g, 2,37 mmol), du


P NH

OO

OO

O

OO

P NH

OO

OO

O1

2

3

45

67

89

1011

12

13

14

15 1617

18

1920

21

298



Rendement : 85 %Point de fusion :

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,75-8,00 (m, 4H, 4 Harom) ; 7,40-7,65 (m, 3H, 3 Harom) ;7,23-7,38 (m, 5H, 5 Harom) ; 6,35 (sl, 1H, NH) ; 5,40 (m, 1H, CH) ; 5,09 (d, J= 5,1 Hz, 2H,CH2) ; 3,76 (d, J= 10,8 Hz, 3H, OMe) ; 3,45 (d, J= 10,8 Hz, 3H, OMe).

RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 155,2 (C, C14) ; 137,4 (C, Carom) ; 135,4 (C, C16) ; 134,8-134,5 (C, C4) ; 133,8 (CH, CHarom) ; 131,0 (CH, CHarom) ; 130,1 (CH, CHarom) ; 128,8-128,7(CH, CHarom) ; 128,5 (CH, 2 CHarom) ; 128,3-128,1 (C, Carom) ; 128,2 (CH, 2 CHarom et C19) ;127,9-127,7 (CH, CHarom) ; 126,3-126,1 (CH, CHarom) ; 121,0 (CH, CHarom) ; 66,0 (CH2, C15) ;55,9-52,8 (CH, C3) ; 54,2-53,9 (CH3, C1 et C2).

RMN 31P (81 MHz, CDCl3) δ : 25,1

Benzyloxycarbonylamino-(5-méthyl-2-furyl)méthylphosphonate de diméthyle (118)



réaction tricomposante en utilisant du 5-méthyl-2-furaldéhyde (0,26 g, 2,36 mmol), du




Rendement : 79 %

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,30-7,45 (m, 5H, 5 Harom) ; 6,30 (t, J= 3Hz, 1H, 1Hpyr) ;5,94 (d, J= 3Hz, 1H, 1 Hpyr) ; 5,55 (d, J= 10 Hz, 1H, NH) ; 5,30 (dd, J= 10 Hz et 21 Hz, 1H,CH) ; 5,14 (s, 2H, CH2) ; 3,77 (d, J= 10,8 Hz, 3H, OMe) ; 3,67 (d, J= 10,8 Hz, 3H, OMe) ;2,28 (s, 3H, Me).

RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 154,2 (C, C10) ; 153,1 (C, C7) ; 146,8-146,6 (C, C2) ; 135,6(C, C11) ; 128,5 (CH, 2 CHarom) ; 128,2 (CH, 2 CHarom et C14) ; 116,2 (CH, CHarom) ; 96,3-96,1(CH, C5) ; 66,0 (CH2, C10) ; 54,1-53,8 (CH3, C1 et C2) ; 53,5-51,4 (CH, C3) ; 14,2 (CH3, C8).

P NH

OO

OO

OO

1

2

3

45

6 7

10 11 1213

1415

16

8

9

299

RMN 31P (81 MHz, CDCl3) δ : 23,8

Benzyloxycarbonylamino-(3-furyl)méthylphosphonate de diméthyle (119)



réaction tricomposante en utilisant du 3-furaldéhyde (0,26 g, 2,71 mmol), du




Rendement : 75 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,55 (s, 1H, 1 Hpyr) ; 7,25-7,48 (m, 6H, 5 Harom et 1 Hpyr) ;6,52 (s, 1H, 1 Hpyr) ; 5,68 (sl, 1H, NH) ; 5,05-5,30 (m, 3H, CH2 et CH) ; 3,74 (d, J= 10,8 Hz,3H, OMe) ; 3,68 (d, J= 10,8 Hz, 3H, OMe).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 154,1 (C, C8) ; 145,2 (CH, CHarom) ; 141,6-141,4 (CH,CHarom) ; 134,9 (C, C10) ; 128,4 (CH, 2 CHarom) ; 128,2 (CH, 2 CHarom) ; 122,8-122,7 (C, C4) ;103,3-103,1 (CH, CHarom) ; 66,1 (CH2, C9) ; 52,8-52,4 (CH3, C1 et C2) ; 49,2-47,1 (CH, C3).

RMN 31P (121,5 MHz, CDCl3) δ : 24,1

(1-Benzyloxycarbonylamino-3-phénylprop-2-en-1-yl)phosphonate de diméthyle (120)

Formule brute : C19H22NO5PMasse molaire : 375,36g/mol


réaction tricomposante en utilisant du 3-phénylacrylaldéhyde (0,40 g, 3,0 mmol), du


P NH

OO

OO

O

O

1

2

3

45

6

7

8

9 10 1112

1314

15

P NH

OO

OO

O1

2

3

4 56

7

8

910

12

11

13

1415

1617

1819

300

(0,42 mL, 1,2 éq.). Obtention d’une huile incolore (0,88 g) après chromatographie sur colonne

de silice (acétate d’éthyle/hexane 8/2 puis acétate d’éthyle pur).

Rendement : 78 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,28-7,42 (m, 10H, 10 Harom) ; 6,63 (dd, J= 5 Hz et 15 Hz,1H, 1 Halcène) ; 6,20-6,30 (m, 1H, CHalcène) ;5,38 (sl, 1H, NH) ; 5,25 (s, 2H, CH2) ; 4,85-5,02(m, 1H, CH) ; 3,85 (d, J= 10,8 Hz, 3H, OMe) ; 3,80 (d, J= 10,8 Hz, 3H, OMe).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 157,6 (C, C12) ; 137,5 (C, Carom) ; 136,3 (C, Carom) ; 130,0-129,8 (CH, CHalcène) ; 128,6 (CH, 2 CHarom) ; 128,2 (CH, 2 CHarom et C17) ; 128,1 (CH, 2CHarom) ; 128,0 (CH, 2 CHarom) ; 127,6 (CH, C9) ; 127,1-126,9 (CH, CHalcène) ; 66,7 (CH2, C13); 54,2-52,1 (CH, C3) ; 53,9-53,6 (CH3, C1 et C2).

RMN 31P (121,5 MHz, CDCl3) δ : 26,1

[1-Benzyloxycarbonylamino-3-(4-nitrophényl)prop-2-en-1-yl]phosphonate de diméthyle(121)

Formule brute : C19H21N2O7PMasse molaire : 420,36g/mol


réaction tricomposante en utilisant du 3-(4-nitrophényl)acrylaldéhyde (0.34 g, 1,92 mmol), du




Rendement : 74 %

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 8,18 (d, J= 8,8 Hz, 2H, 2 Harom) ; 7,49 (d, J= 8,8 Hz, 2H, 2Harom) ; 7,26-7,34 (m, 5H, 5 Harom) ; 6,72 (dd, J= 3,7 Hz et 15,9 Hz ; 1H, 1 Halcène) ;6,35-6,49(m, 1H, 1 Halcène) ; 5,48 (d, J= 8,5 Hz, 1H, NH) ; 5,17 (s, 2H, CH2) ; 4,95 (m, 1H, CH) ; 3,79(d, J= 10,8 Hz, 3H, OMe) ; 3,77 (d, J= 10,8 Hz, 3H, OMe).

RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 157,9 (C, C12) ; 148,6 (C, C9) ; 143,7-143,5 (C, C6) ; 136,5(C, C14) ; 130,1-129,8 (CH, CHalcène) ; 129,6 (CH, 2 CHarom) ; 128,4 (CH, 2 CHarom) ; 128,1

P NH

OO

OO

O

NO2

1

2

3

4 56

7

89

10

11

12

13

1415

1617

1819

301

(CH, 2 CHarom et C17) ; 127,0-126,8 (CH, CHalcène) ; 124,2 (CH, 2 CHarom) ; 66,8 (CH2, C13) ;53,9-51,8 (CH, C3) ; 53,5-53,2 (CH3, C1 et C2).

RMN 31P (81 MHz, CDCl3) δ : 25,8

1-Benzyloxycarbonylaminohex-2-en-1-ylphosphonate de diméthyle (122)



réaction tricomposante en utilisant de l’hex-2-enal (0,19 g, 1,94 mmol), du triméthylphosphite

(0,23 mL, 1 éq.), du carbamate de benzyle (0,30 g, 1 éq.) et du BF3OEt2 (0,30 mL, 1,2 éq.).

Obtention d’une huile légèrement jaune (0,46 g) après chromatographie sur colonne de silice

(acétate d’éthyle/hexane 8/2 puis acétate d’éthyle pur).

Rendement : 69 %

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,22-,750 (m, 5H, 5 Harom) ; 5,63-5,87 (m, 1H, 1 Halcène) ;5,38-5,61 (m, 1H, 1 Halcène) ; 5,12-5,27 (m, 1H, NH) ; 5,14 (s, 2H, CH2(-Ph)) ; 4,55-4,73 (m,1H, CH) ; 3,75 (d, J= 10,8 Hz, 3H, OMe) ; 3,74 (d, J= 10,8 Hz, 3H, OMe) ; 1,94-2,13 (m, 2H,CH2) ; 1,39 (q, J= 7,1 Hz et 14,2 Hz, 2H, CH2) ; 0,88 (t, J= 7,1 Hz, 3H, Me).

RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 158,1 (C, C9) ; 137,1 (C, C11) ; 134,2-133,9 (CH, CHalcène) ;128,5 (CH, 2 CHarom) ; 128,1 (CH, 2 CHarom et C14) ; 121,9-121,7 (CH, CHalcène) ; 66,7 (CH2,C10) ; 54,1-53,7 (CH3, C1 et C2) ; 52,0-49,9 (CH, C3) ; 33,8-33,7 (CH2, C6) ; 22,6 (CH2, C7) ;13,3 (CH3, C8).

RMN 31P (81 MHz, CDCl3) δ : 25,3

P NH

OO

OO

O1

2

3

45

6 7

8

9

10 11 1213

1415

16

302

(1-Benzyloxycarbonylamino-3-phénylpropyl)phosphonate de diméthyle (123)



réaction tricomposante en utilisant du 3-phénylpropionaldéhyde (0,23 g, 1,71 mmol), du




Rendement : 71 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,11-7,36 (m, 10H, 10 Harom) ; 5,22 (sl, 1H, NH) ; 5,11 (s,2H, CH2benzyle) ; 4,22-4,34 (m, 1H, CH) ; 3,80 (d, J= 10,8 Hz, 3H, OMe) ; 3,78 (d, J= 10,8 Hz,3H, OMe) ; 2,70-2,99 (m, 2H, CH2) ; 2,07 (q, J= 6,9 Hz et 13,7 Hz).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 154,9 (C, C12) ; 140,2 (C, C6) ; 135,6 (C, C14) ; 129,8 (CH, 2CHarom) ; 128,4 (CH, 2 CHarom) ; 128,2 (CH, 2 CHarom et C17) ; 127,9 (CH, 2 CHarom) ; 126,0(CH, 2 CHarom) ; 65,9 (CH2, C13) ; 54,1-53,7 (CH3, C1 et C2) ; 43,5-42,2 ( CH, C3) ; 33,8-33,7(CH2) ; 27,6-27,5 (CH2).

RMN 31P (121,5 MHz, CDCl3) δ : 25,7

(1-Benzyloxycarbonylamino-2-méthylbutyl)phosphonate de diméthyle (124)



réaction tricomposante en utilisant du 2-méthylbutanal (0,26 g, 3,01 mmol), du


P NH

OO

OO

O1

2

3

54

67

89

10

11

12

13

1415

1617

1819

P NH

OO

OO

O1

2

3

45 6

7

8

910 11

12

1314

15

303

(0,46 mL, 1,2 éq.). Obtention d’une huile légèrement jaune (0,67 g) après chromatographie

sur colonne de silice (acétate d’éthyle/hexane 8/2 puis acétate d’éthyle pur).

Rendement : 68 %

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,28-7,43 (m, 5H, 5 Harom) ; 5,41 (sl, 1H, NH) ; 5,12 (m, 3H,CH2 et CH) ; 3,95-4,37 (m, 1H, CH) ; 3,73 (t, J= 10,7 Hz, 6H, 2 OMe) ; 1,68-2,02 (m, 2H,CH2) ; 0,91-1,09 (m, 6H, 2 CH3).

RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 155,2 (C, C8) ; 135,5 (C, C10) ; 128,5 (CH, 2 CHarom) ; 128,1(CH, 2 CHarom et C13) ; 66,0 (CH2, C9) ; 54,6-51,5 (CH, C3) ; 54,0-53,5 (CH3, C1 et C2) ; 39,3-39,1 (CH, C4) ; 27,1-26,9 (CH2, C6) ; 18,5-18,3 (CH3, C5) ; 12,7 (CH3, C7).RMN 31P (81 MHz, CDCl3) δ : 24,9

(1-Benzyloxycarbonylaminopropyl)phosphonate de diméthyle (125)



réaction tricomposante en utilisant du propionaldéhyde (0,19 g, 3,27 mmol), du


(0,50 mL, 1,2 éq.). Obtention d’une huile légèrement jaune (0,72 g) après chromatographie

sur colonne de silice (acétate d’éthyle/hexane 8/2 puis acétate d’éthyle pur).

Rendement 73 %

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,26-7,45 (m, 5H, 5 Harom) ; 5,13 (s, 2H, CH2benzyle) ;4,98 (d,J= 10,0 Hz, 1H, NH) ; 3,90-4,18 (m, 1H, CH) ; 3,80 (d, J= 10,7 Hz, 3H, OMe) ; 3,75 (d, J=10,7 Hz, 3H, OMe) ; 1,75-2,00 (m, 2H, CH2) ; 1,01 (t, J= 7 Hz, 3H, Me).

RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 154,4 (C, C6) ; 135,1 (C, C8) ; 128,5 (CH, 2 CHarom) ; 128,1(CH, 2 CHarom et C11) ; 65,8 (CH2, C7) ; 55,1-54,7 (CH3, C1 et C2) ; 37,2-35,9 (CH, C3) ;26,6-26,4 (CH2, C4) ; 13,1-12,9 (CH3, C5).

RMN 31P (81 MHz, CDCl3) δ : 24,7

P NH

OO

OO

O1

2

3

45

6

7 8 910

111213

304

Benzyloxycarbonylamino-(bicyclo[2.2.1]hept-5-en-2-yl)méthylphosphonate de diméthyle(126)



réaction tricomposante en utilisant du bicyclo [2,2,1]hept-5-ene-2-carbaldéhyde (0,27 g, 1,94

mmol), du triméthylphosphite (0,27 mL, 1 éq.), du carbamate de benzyle (0,34 g, 1 éq.) et du

BF3OEt2 (0,34 mL, 1,2 éq.). Obtention d’une huile légèrement jaune (0,53 g) après

chromatographie sur colonne de silice (acétate d’éthyle/hexane 8/2 puis acétate d’éthyle pur).

Rendement : 66 %

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,20-7,47 (m, 5H, 5 Harom) ; 5,83-6,30 (m, 2H, 2 Halcène) ;5,73 (d, J= 10,7 Hz, 1H, NH) ; 4,90-5,27 (m, 3H, CH2 et CH) ;3,72 (m, 1H, CH) ; 3,60 (d, J=10,8 Hz, 3H, OMe) ; 3,57 (d, J= 10,8 Hz, 3H, OMe) ; 2,71-3,17 (m, 2H, 2 CH) ; 1,74-1,98 (m,2H, CH2) ; 1,18-1,50 (m, 2H, CH2).

RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 155,0 (C, C11) ; 138,2 (CH, CHalcène) ; 135,5 (C, C13) ; 134,5-134,4 (CH, CHalcène) ; 128,5 (CH, 2 CHarom) ; 128,1 (CH, 2 CHarom et C13) ; 66,1 (CH2, C12) ;54,0-53,6 (CH3, C1 et C2) ; 48,5-45,3 (CH, C3) ; 47,0-46,9 (CH2) ; 46,2 (CH) ; 46,1-46,0(CH) ; 41,5-41,3 (CH) ; 40,7-40,5 (CH) ; 32,6-32,3 (CH2).

RMN 31P (81 MHz, CDCl3) δ : 26,1

1-Benzyloxycarbonylaminohexylphosphonate de diméthyle (127)



réaction tricomposante en utilisant de l’hexanal (0,30 g 3,0 mmol), du triméthylphosphite


P NH

OO

OO

O1

2

3

45

6 7

89

10

11

12 13 1415

1617

18

P NH

OO

OO

O1

2

3

4 5

6 7

8

9

10

1112

1314

1516

305


d’éthyle/hexane 8/2 puis acétate d’éthyle pur).

Rendement : 71 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,21-7,50 (m, 5H, 5 Harom) ; 5,15 (s, 2H, CH2benzyle) ; 4,99 (d,J= 10,2 Hz, 1H, NH) ; 4,03-4,21 (m, 1H, CH) ; 3,75 (t, J= 10,8 Hz, 6H, 2 OMe) ; 1,75-1,97(m, 2H, CH2) ; 1,12-1,43 (m, 6H, 3 CH2) ; 0,90 (t, J= 7,1 Hz, 3H, Me).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 155,0 (C, C9) ; 135,5 (C, C11) ; 128,5 (CH, 2 CHarom) ; 128,1(CH, 2 CHarom et C14) ; 66,1 (CH2, C10) ; 54,1-53,5 (CH3, C1 et C2) ; 42,3-40,9 (CH, C3) ;31,2-31,0 (CH2) ; 30,5-30,0 (CH2) ; 27,8-27,5 (CH2) ; 23,5 (CH2, C7) ; 13,6 (CH3, C8).RMN 31P (121,5 MHz, CDCl3) δ : 25,6

(1-Benzyloxycarbonylaminopent-4-en-1-yl)phosphonate de diméthyle (128)



réaction tricomposante en utilisant du pent-4-enal (0,21 g, 2,5 mmol), du triméthylphosphite


Obtention d’une huile légèrement jaune (0,56 g) après chromatographie sur colonne de silice

(acétate d’éthyle/hexane 8/2 puis acétate d’éthyle pur).

Rendement : 69 %

RMN 1H (300 MHz, CDCl3) δ : 7,30-7,45 (m, 5H, 5 Harom) ; 5,70-5,90 (m, 1H, CHalcène) ;5,13 (s, 2H, CH2benzyle) ; 4,90-5,10 (m, 3H, CH2 et CH) ; 4,08-4,22 (m, 1H, NH) ; 3,78-3,88 –m, 1H, CH) ; 3,75 (t, J= 11,0 Hz, 6H, 2 OMe) ; 2,02-2,32 (m, 2H, CH2).

RMN 13C (75 MHz, CDCl3) δ : 155,0 (C, C8) ; 136,5 (CH, C6) ; 135,5 (C, C10) ; 128,4 (CH, 2CHarom) ; 128,2 (CH, 2 CHarom et C13) ; 117,5 (CH2, C7) ; 66,0 (CH2, C9) ; 54,1-53,6 (CH3, C1et C2) ; 31,2-31,0 (CH2) ; 29,7-29,6 (CH2).

RMN 31P (121,5 MHz, CDCl3) δ : 25,3

P NH

OO

OO

O1

2

3

45

6 7

8

9

1011

1213

1415

306

(4-Méthoxyphényl)-(4-méthylphényl)sulfonylaminométhylphosphonate de diméthyle(129)




triméthylphosphite (0,25 mL, 1 éq.), du p-toluènesulfonamide (0,36 g, 1 éq.) et du BF3OEt2



Rendement : 86%

RMN 1H (200 MHz, CDCl3) δ : 7,81 (sl, 1H, NH) ; 7,43 (d, J= 8 Hz, 2H, 2 Harom) ; 7,12 (dd,J= 1,3 Hz et 8 Hz, 2H, 2 Harom) ; 6,90 (d, J= 8Hz, 2H, 2 Harom) ; 6,52 (d, J= 8 Hz, 2H, 2Harom) ; 3,87 (d, J= 10,8 Hz, 6H, 2 OMe(-P)) ; 3,76 (d, J= 7,2 Hz, 1H, CH) ; 3,65 (s, 3H,OMe) ; 2,20 (s, 3H, Me).

RMN 13C (50 MHz, CDCl3) δ : 158,2 (C, C7) ; 141,7 (C, Carom) ; 139,3 (C, Carom) ; 133,2-133,0 (C, C4) ; 131,4-131,2 (CH, 2 CHarom) ; 130,0 (CH, 2 CHarom) ; 129,1 (CH, 2 CHarom) ;116,2-116,1 (CH, 2 CHarom) ; 58,3-55,0 (CH, C3) ; 55,8 (CH3, C10) ; 54,0-53,7 (CH3, C1 etC2); 19,7 (CH3, C17).

RMN 31P (81 MHz, CDCl3) δ : 23,6

P NH

OO

O

S

O

O

O

1

2

3

45

67

89

10

1112

13

14

1516 17

307

Résumé

En 1985, les endothélines (ET-1, ET-2, ET-3), de puissants vasoconstricteurs, ont étédécouvertes. Ces peptides sont constitués de vingt et un aminoacides et de deux bouclesdisulfures intramoléculaires et proviennent d’un précurseur prépro-ET, composé d’environdeux cent résidus aminoacides. L’hydrolyse de ce précurseur par des peptidases conduit aux“ big ” ETs, peptides de quarante acides aminés, qui sont finalement dégradés par l’enzyme deconversion de l’endothéline (ECE), métalloprotéase à zinc, pour générer les ETs.

L’administration d’ET-1 exogène, peptide prépondérant de cette famille, aboutit à unevariété de disfonctionnements dans le système nerveux central, rénal et cardiovasculaire. Uneapproche possible pour inhiber ces effets est d’utiliser des antagonistes de récepteurs de cesystème. Une approche alternative pourtant moins étudiée réside dans la suppression de labiosynthèse de l’ET-1 en utilisant des inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’endothéline,sujet de cette thèse.

Le premier inhibiteur connu de l’ECE a été le phosphoramidon, inhibiteur classiquedes métalloprotéases à zinc. D’autres ont ensuite été obtenus, pouvant être classés dans diversgroupes comme par exemple les inhibiteurs peptidiques, les composés phosphorylés, lesthiols, les acides hydroxamiques ou carboxyliques. Un chef de file a donc été choisi pourdébuter nos travaux. C’est un acide aminophosphonique présentant une très bonne affinitépour l’ECE, une bonne sélectivité face aux autres métalloprotéases à zinc, un squelette sedifférenciant des autres et permettant un grand nombre de variations structurales. Cettemolécule de référence et 22 analogues ont été synthétisés dans le but d’une étude de relationstructure-activité.

Une étude physico-chimique a été faite afin de mieux comprendre le manque deréactivité chimique remarquable de l’amine basique portée par cette famille de composés. Unetrès forte interaction intramoléculaire de type liaison hydrogène entre l’atome de phosphore etl’azote a été mise en évidence sur une très large gamme de pH, celle-ci devant certainementavoir une influence pour la reconnaissance de nos ligands par l’ECE.

Enfin, dans le but d’obtenir une plus grande diversité pour nos ligands, la synthèse deβ-aminophosphonates diversement substitués a été mise au point via une réactiontricomposante mettant en jeu un aldéhyde, un phosphite et un carbamate en présence d’acidede Lewis.

Les caractéristiques inhibitrices de nos molécules ont été évaluées. Nous ne sommespas parvenus à obtenir une molécule meilleure que celles connues dans la littérature maisnous avons réuni des renseignements structuraux relativement intéressants pour lareconnaissance de nos ligands par l’ECE. Pour le type de composés étudiés, la fonction acideaminophosphonique semble être la meilleure fonction pour la chélation du zinc. L’aminebasique de cette famille de produits contribue également à cette reconnaissance et desinteractions de type aryl-aryl doivent être mises en jeu à proximité de la zone occupée parcelle-ci. Au niveau de la poche S1’ des interactions de type aryl-aryl et de type accepteur-donneur ont été mises en évidence. Le même de type de conclusion a été obtenu pour la pocheS2’ puisque l’apport d’un noyau aromatique hétérocyclique s’est avéré bénéfique. Par contre,la position des fonctions servant à assurer ces interactions semble assez importante.

Mots clés : endothéline, enzyme de conversion de l’endothéline, big-ET, inhibiteur,phosphoramidon, interaction intramoléculaire, acide β-aminophosphonique.

synthèse d’inhibiteurs potentiels de l’enzyme de...

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