1. UCP1 ET THERMOGENSE SANS FRISSON

2. La protine dcouplante UCP1 - Ltude des mitochondries du TAB de hamster montre que ces derniers admis une permabilit aux cl-et aux H+ -Cette permabilit est fortement diminue en prsence de GDP et dalbumine -Elle est relie au potentiel de la membrane et au dcouplage de la respiration remarque dans les mitochondries du TAB, -La prsence dun site de forte affinit pour le GDP, mis en vidence une hypothse qui suggre la prsence dune protine liant le GDP ( en 1976 ) :protine serait responsable du dcouplage de la respiration -Utilisation de photo marquage par des nuclotides radioactifs en 1978 a permet l identification de cette protine :32 kDa et lappellent UCP (UnCoupling Protein). -Les premires caractrisations biochimique sont faites grce la mthode de purification de la protine en se basant sur la mthode de purification utilise pour le transporteur ADP/ATP - La squence protique dUCP1 est dtermine en 1985 tandis que le clonage dUCP1 tait en 1986 -UCP1 prsente une topologie commune aux transporteurs mitochondriaux -Sa structure na pas encore t dtermine. Mais en se basant sur la structure de lAAC (21% didentit de squence protique entre bAAC1 et rUCP1. 3. )UCP1 Gene in genomic location: bands according to Ensembl, locations according to (and/or Entrez Gene and/or Ensembl if different) 4. structureFigure 10 : Lorganisation des transporteurs mitochondriaux (Pebay-Peroula et al., Nature, 2003) (A) Topologie de lADP/ATP translocase, reprsentative des transporteurs mitochondriaux. Leur struture secondaire comporte 6 hlices a-transmembranaires (H), 3 boucles matricielles (M) et 2 boucles dans lespace inter-membranaire. Les extrmits N- et C- terminales sont dans lespace inter-membranaire. (B) Schma de la structure de la translocase. 5. UCP1 - transporteur de protons -La fonction dUCP1 est de transporter des protons de lespace intermembranaire vers la matrice mitochondriale (ou des OH- dans lautre sens). -La reconstitution de la protine dans des liposomes, montre quUCP1 tait capable de transporter des protons dans les deux sens, -La vitesse de transport dcrite pour lUCP1 varie en fonction des conditions exprimentales, allant de 1000 s-1 20 s-1 et 14 s-1 pour lUCP1 native et 7 s-1 et 3 s-1 pour lUCP1 recombinant. -Lunit fonctionnelle dUCP1 est gnralement dcrite comme tant un dimre. -Ceci a t suggr par des tudes de pontage chimique sur les mitochondries du TAB et sur la protine purifie et incorpore en liposomes -Des travaux de centrifugation analytique et des approches analogues faites sur lAAC avaient galement permis lhypothse de lexistence dun dimre pour lAAC.- Cependant, plusieurs tudes rcentes suggrant ltat monomrique de lAAC remettent aussi en question ltat oligomerique dUCP. 110 6. II)Rgulation de lUCP Les principaux rgulateurs de lactivit protonophore dUCP1 sont: les acides gras qui agissent en activant le transport les nuclotides qui agissent en linhibant ce transport1) La rgulation par les nuclotides La liaison et linhibition par les nuclotides ont t tudies sur la mitochondrie et sur la protine isole ou incorpore en liposomes UCP1 prsente une affinit pour les nuclotides di et tri phosphate et une trs pour les nuclotides monophosphate.affinitUCP1 prfre les bases purines et plus spcialement guanine lordre de laffinit des nuclotides purines pour lUCP tant : GTP > GDP > ATP > ADP >>> GMP/AMP Les KD pour les nuclotides purines di et tri phosphate sont de lordre du micro molaire, allant de 0,4 4 #M pH 6,7 UCP1 lie seulement les nuclotides libres, non-complexs au. Mg2+ 7. a) Site de liaison des nuclotides La localisation de site de liaison des nuclotides est faite grce des expriences utilisant la mutagense dirige et des nuclotides marqus. Lutilisation des nuclotides prsentant des groupements ractifs sur le cycle purine, mis en vidence des interactions entre ces nuclotides et trois rsidus de la troisime hlice matricielle prdite (h56), C253, T259, T264, Dans cette rgion de la protine, il ya une similarit des rsidus 261-269 dUCP1 avec le site de fixation de lADN du rcepteur aux oestrognes.La suppression de trois rsidus au niveau de cette rgion (F267, K268, G269) conduit surmonter linhibition de transport par les nuclotides . Les rsidus 261-269 sont prsents dans le troisime tiers de la protine. Des dltions ont donc t ralises dans les rgions analogues situes dans le premier et deuxime tiers de la protine aboutis au mme rsultat 8. Figure 11 Localisation des rsidus impliqus dans la liaison du GDP sur le modle tridimensionnel de hUCP1 A. Vue dans le plan de la membrane B. Vue depuis lespace intermembranaire 9. b) Dpendance en fonction du pH La liaison des nuclotides lUCP1 est fortement influence par le pH. Laffinit augmente lorsque le pH mais pas de faon linaire, laugmentation tant moins importante des pH infrieurs 6,8. Linfluence du pH sur laffinit est plus remarquable pour les nuclotides triphosphates que pour les nuclotides di-phosphate(GTP ;ATP ;GDP ;ADP) Des tudes de mutagense dirige ont montr que le rsidu E190 joue un rle important dans la dpendance du pH de la liaison des nuclotides . Des diffrences dans la liaison des nuclotides la protine sont montr en fonction de la technique utilise pour la mesurer : mthode par change ionique (le complexe UCP1-nuclotide est pass { travers dune rsine anionique qui retient seulement les nuclotides non lis), par fluorescence (utilisation de nuclotides fluorescents). deux tats de liaison : Un tat de faible liaison, atteint trs rapidement et qui ne provoque pas linhibition du transport proton, Un tat de forte liaison pour lequel lactivit de transport est inhibe En effet, la mthode par fluorescence dtecte les deux tats alors que la mthode par change ionique ne rvle que le nuclotide fortement li la protine. En identifiant par mutagense un rsidu (R276) qui naffecte pas la liaison aux nuclotides 1 17 mais linhibition du transport, 10. C)Effet des anions Par comptition, les anions inhibent la liaison du GDP { lUCP1 . lordre dinhibition de diffrents anions est le suivant : pyrophosphate (Ki = 0,16 mM) > sulfate (1 mM) > phosphate (4,4 mM) > maleate ( 8mM) > chlorure (9,3 mM) >>> actate limidazole inhibe aussi la liaison2) La rgulation par les acides gras Les tudes sur les adipocytes bruns, sur les mitochondries du TAB et sur la protine purifie reconstitue en liposomes ont montr que lactivit de transport de protons par lUCP1 est active par les acides gras. Cette activation est dpendante du pH, et augmente vers les pH basiques La longueur de la chane est un paramtre important. Une chane hydrophobe suprieure 8 carbones est ncessaire pour activer le transport, A Max pour les AG :C12 et C14. Pour les AGLC, la conductance avec le nombre dinsaturations. Les acides gras estrifis ne sont pas capables dactiver le transport. En construisant des dimres UCP1-UCP2 il a t dmontrer que la deuxime boucle matricielle dUCPLE h34 (boucle connectant les hlices 3 et 4) est critique pour lactivation par les acides gras. 11. Mcanisme de transport de protons Deux modles principaux ont t proposs : Fatty acid cyclic model. , les acides gras, protons dans lespace intermembranaire passent dun feuillet { lautre (mouvement de flip-flop) travers la membrane mitochondriale interne indpendamment dUCP1. Dans la matrice, en raison du pH lev, les protons se dissocient des acides gras et les acides gras anioniques sont transports vers lespace inter-membranaire par lUCP1. UCP1 transporte des acides gras anioniques et non des protons et le transport H+ observ serait donc totalement dpendant de la prsence des AG. . Ceci est bas sur des tudes qui suggrant la capacit dUCP1 { transporter des anions et plus prcisment des anions des acides gras. En effet lUCP1 incorpor dans les liposomes est capable de faire un transfert de charge travers la membrane en utilisant des acides gras et plus prcisment un analogue non protonable dacide gras : le undcanesulfonate.En revanche, ce modle demeure incompatible avec lobservation que les acides transrtinoiques qui nont pas une capacit de dcouplage et de flip-flopinn, peuvent activer le transport H+ 119 12. Proton buffering model Les protons traversent la membrane via des fonctions acides et amines de la protineUCP1 Les acides gras vont offrir des groupements protonables supplmentaires et activent ainsi le passage des protons.Un des arguments pour ce modle est lexistence de rsidus (H145, H147, R152) dont la mutation diminue lactivation par les acides gras du transport H+ ainsi que laffinit de la protine pour les acides gras ;mais naffecte pas le transport des anions ou la liaison du GDP Des tudes montrent par exemple quil y a une inhibition comptitive entre les acides gras et les nuclotides, la liaison du GDP { la protine tant diminue en prsence dacides gras Ceci suggre que les acides gras activent la protine de faon indirecte en surmontant linhibition par les nuclotides. Le transport de protons ne serait donc pas dpendant des acides gras. Il est possible aussi davoir deux voies indpendantes du transport de protons au sein dUCP1. La mutation de deux rsidus conservs du point du vue de lvolution (E134 et M140) inhibe le transport H+ basal mais pas le transport induit pas les acides gras ou la liaison au GDP120 13. Rgulation allostriqueLa thorie des navettesla thorie du cofacteurThorie de comptition 14. 3)Autres rgulateurs activateursinhibiteursles acides rtinoques le superoxide un produit de la peroxydation des lipides le 4-hyroxy2-nonnal (HNE) alkylsulfonates la coenzyme Q10 un co-facteur ncessaire pour le transport H+ par UCP1 Autres expriences montrent que lUCP1exprim dans une levure (le gne codant pour la coenzyme Q10 a t inactiv), a une activit de transport normale. la coenzyme Q10 peut activer UCP1 de faon indirecte, en augmentant son affinit pour lacide rtinoque(2009)CIDEA le deathinducing CIDEA cellule) fortement exprim dans le tissu adipeux brun. Des souris transgniques dficients en CIDEA montrent une dpense nergtique accrue ce qui peut suggrer une inhibition dUCP1 par cette protine (Lin 2004) 15. UCP1 - transporteur danions Une des caractristiques des mitochondries du tissu adipeux brun est leur permabilit aux ions chlorure cl-, permabilit fortement rduite en prsence de GDP. Des mesures effectues sur des liposomes ayant incorpors UCP1 purifi confirment que cette permabilit tait due { lUCP1. Des tudes plus extensives ont rvl quUCP1 est capable non seulement de transporter des ions chlorure mais aussi diverses classes danions comme: Les halogns (Br-, I- , F-), Les sulfonates, Les alkylsulfonates, Les oxohalognides, Les drivs du phosphate monovalent Les anions organiques monovalents (comme le pyruvate). Tous ces anions transports inhibent le transport Cl- de faon comptitiveDes tudes dlectrophysiologie sur des liposomes gants contenant UCP1 ont montr que ce transport chlorure prsente des caractristiques correspondant un canal avec une conductance de 75 pS en 100 mM KCl symtrique. Ce transport danions ne dpend pas du pH et est inhib par les nuclotides. 126 16. Effet des ions chlorure Les halognes tels que les ions chlorure peuvent avoir un effet inhibiteur du transport des protons par lUCP1 Le remplacement du gluconate de potassium (utilis habituellement) par le chlorure de potassium montre que la valeur maximale du courant na pas diminu mais la quantit des charges transportes a t diminue denviron 30%. Aucun effet na t observ sur les liposomes contrle. Cest la premire fois quil est montr que les ions cl- naffecte pas la vitesse de transport de la Protine mais plutt la quantit de charge totale transporte. Linactivation de la protine est Donc plus rapide en prsence des ions chlorure. Effet des ions chlorure sur lactivit dUCP1Le transport a t activ par la cration dun gradient de pH obtenu par lchange rapide dune solution de pH 7 (30 mM Mops pH 7 additionn de 140 mM gluconate de potassium ou 140 mM chlorure de potassium) avec une solution pH 6 (30 mM Mes pH 6 additionn de 140 mM gluconate de potassium ou 140 mM chlorure de potassium).27 17. Rgulations de lexpression des protines dcouplantes de mammifresPlusieurs systmes hormonaux, facteurs de transcription et kinases sont impliqus dans la rgulation de lexpression dUCP1, : les hormones thyrodiennes, le systme adrnergique, les facteurs de transcription peroxisomes proliferator-activated receptors (PPAR) AMP-activated protein kinase (AMPK). La T3 est capable de se lier au rcepteur nuclaire aux hormones thyrodiennes (TR) pour activer ce dernier. Celui-ci, une fois coupl un RXR, va se positionner sur les lments de rponse aux hormones thyrodiennes prsents au niveau des promoteurs des gnes pour favoriser leur transcription Il existe une forte relation entre les hormones thyrodiennes et la protine dcouplanteUCP1. Ainsi, la T3 est implique directement dans la rgulation de lexpression de lUCP1 de mammifres 18. .Une augmentation de la prolactine plasmatique et l'abondance rcepteur de la prolactine peuvent directement stimuler l'expression de plus de UCP1 chez le ftus dun rat Effet de la prolactine est oppos chez ladulte rat: une administration dmunie rglement labondance de UCP1 Augmentation des hormones thyrodiennes plasmatiques et renforcement de la capacit de convertir la thyroxine T4 l'activit mtabolique de tri- iodothyronine (T 3 ) par l'intermdiaire de l' enzyme 5- monodsiodinase est dmontr chez un rat expos au froidCette activation peut entraner une augmentation de la T 3 localise l'intrieur de l'adipocyte qui serait prvu de mettre { rguler et stabiliser de lUCP1 ,ainsi lexpression abondance de ce protine via abondance de T3 sensible un site du gne(recepteur nuclaire) de lUCP1 19. Fig. 1. Norepinephrine (NE)-induced thermogenesis in wild-type (WT) and uncoupling protein (UCP)1 knockout (KO) mice 20. BRL:AGONISTE de NE 21. Fig. 3. Effects of chronic CL-316243 (CL) treatment on CL-induced thermogenesis in WT and UCP1 KO mice. Mice were treated with saline (Sal) or CL daily for 6 days (CL-6d). On the 7th day, mice were anesthetized with Avertin, and metabolic rate (V O2) was determined under basal conditions (B) and after stimulation (S) by ip injection of CL (30 nmol). Basal values are averages of the 5-min period before injection, and stimulated values are averages of the 5-min period 2025 min after injection. Two-way ANOVA indicated significant effects of drug treatment and genotype (P 0.0001) but no significantinteraction. Values are means SE; n 79. 22. Autre rle de la fuite de proton la fuite de protons ne serait pas seulement implique dans la thermogense. elle pourrait aussi jouer un rle dans l'limination des radicaux libres en diminuant le potentiel de membrane de la mitochondrie (Brand, 2000). En effet, la production de radicaux libres est dpendante de la valeur du potentiel de membrane Ainsi, une diminution de 10% du potentiel de membrane rsulte en une diminution de 75% du taux de production de radicaux Libres . Rcemment, il a t montr que les ROS et leur accumulation dans la matrice mitochondriale taient des coactivateurs obligatoires des UCPs Quoiquil en soit, lensemble de ces tudes suggre que les radicaux libres sont capables de stimuler la fuite de protons induite par UCPs directement et indirectement (via la formation de drivs lipidiques de peroxydations). Ainsi la stimulation UCPs limiteraient la formation de ROS par la chane respiratoire, participant la dtoxification de la matrice mitochondrial 23. Figure 11 : Hypothses de limitation de la production de ROS par les UCP (A). Les protines dcouplantes pourraient tre charges du transport de substrats peroxyds pour les expulser vers lespace intermembranaire o ils peuvent tre neutraliss par dismutation. Cette raction, consommant des protons, diminuerait le gradient de protons (Echtay et al., 2002).(B). La chane respiratoire peut tre ralentie par un fort gradient de protons Elle laisse alors schapper des lectrons vers la matrice o ils forment un radical superoxyde avec les molcules dO2. Ces radicaux libres vont agir sur les phospholipides membranaires formant, entre autre, du HNE. Le HNE active lUCP ce qui diminue le gradient de protons et permet la chane respiratoire de racclrer produisant ainsi moins de radicaux libres (Brand et al., 2004). CR : chane respiratoire ; H+ : proton ; HNE : 4-Hydroxy-2-Nonenal ; O2 : radical superoxyde ; UCP : protine dcouplante. 24. UCP1 DANS LE THYMUSFigure 1 Detection of UCP1 protein in thymocytes Immunoblots using the Calbiochem anti-UCP1 peptide antiserum (A) and antibody to the -subunit of the F1-ATP synthase B) to mitochondria from BAT from cold-acclimated rats and BAT, thymocytes and liver from rats kept at room temperature thymus is not due to contamination of the preparation by BAT. In dissecting out the thymus any BAT is clearly visible and easily removed by dissection. We speculate that mitochondrial UCP1 would have a major bearing on metabolic flux in thymus and predict a 25. La comparaison des profils cellulaires dans le thymus et la rate des souris sauvages avec ceux des UCP 1 souris knock-out, donne une ide sur le niveau du potentiel apoptotique dans les thymocytes de ces souris. Le nombre de cellules de rate ont t rduits environ 3 fois dans souris knock-out UCP 1par rapport aux souris de type sauvage. Une diminution de moiti du nombre de cellules CD8 actives dans le thymus et avec une augmentation significative supplmentaire dans CD4/CD8 dans le thymus des UCP 1 souris knock-out par rapport aux souris de type sauvage. une diminution environ de moiti du nombre de cellules CD8 actives et un doublement du nombre de cellules CD4/CD8 dans la rate des souris knock-out UCP1 par rapport aux souris de type sauvage. Ces diffrences sont probablement expliqu par un potentiel apoptotique diminu et des niveaux plus levs d'ATP dans les thymocytes de UCP 1 souris knock-out par rapport la souche sauvage :contrles. Donc lexpression constitutif de lUCP 1 est un facteur dans la dtermination de slection de la population des lymphocytes T chez la souris. tude rcentes montrent des interaction directe entre lUCP1 et un protine de cascade apoptotique(Cidea) dans le BAT. Cidea (cell deathinducing DNA fragmentation factor a-like effector A) peut jouer le role dun regulateur endogne de lactivit d UCP1 dans BAT has implications for understanding the role of UCP1 in the thymus 26. Les rsultats actuels confirment que UCP1 est uniquement exprim dans les adipocytes bruns et dmontrent que tout signal dtect UCP1 dans le thymus est reprsent par les adipocytes bruns qui restent attachs au thymus, mme aprs dissection minutieuse. Que les adipocytes bruns adjacentes lobes thymiques jouer un rle dans la physiologie du thymus reste tudier.ThymusFigure UCP1 analyse immunohistochimique de la souris et du thymus de rat. Thymus de souris (B) et le rat (A, C, D) ont t tests pour UCP1 immunoractivit. BAT entourant la glande a t positive, mais la fois le cortex et la mdulla du thymus taient ngatifs (B). Les mmes rsultats ont t obtenus avec thymus de plusieurs rats acclimats au froid (ca). Pas de cellulaire UCP1 coloration a t observe dans le thymus un grossissement suprieur. (D) L'largissement de la zone correspondante de C. Bar: AC = 240 um; D = 50 um. 27. thymusBAT: contrleTractus gastro-intestinalWATFigure Utrusthymus ovairesrie nLa protine dcouplante (UCP1) analyse immun histochimique des tissus de rats acclimats au froid. Inter scapulaire tissu adipeux brun (BAT) a t utilis comme contrle positif pour UCP1 immunoractivit (A). Le tissu adipeux blanc (WAT) et squelettiques (sk) des muscles dans la mme prparation histologique taient UCP1 ngative. Tous les autres tissus analyss taient galement ngatifs UCP1. (B) du foie. (C) Tractus gastro-intestinal. (D) du pancras et de la rate. (E) de l'utrus et des ovaires. (F) du rein. En F, le signal positif est de BAT rsiduelle autour du rein. Bar = 240 um.