rapport mini-projet_da biotech_simon et thibault

8/19/2019 Rapport Mini-projet_DA Biotech_Simon Et Thibault

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UC Exploration moléculaire des ressources végétales :

Rôle de la cyclophiline ROC4 dans la germination de la

graine : Etude de la régulation transcriptionnelle de 4 gènes

Corneloup Thibault

Simon Léonard

Encadrant : Nardjis Amiour

Sylvain Chaillou


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Rapport UC exploration moléculaire des ressources végétales

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Introduction :

Les conditions de l’environnement lors du développement et de la maturation des semences

impactent considérablement leur vigueur germinative. La vigueur germinative est définie par la

capacité de l’embryon contenu dans la graine à reprendre son activité métabolique de manière

coordonnée et séquentielle. Les études protéomiques et transcriptomiques ont conforté que le

principal facteur du succès de la germination est la qualité de l’ARN messager stocké durant lamaturation de la plante mère. Mais, la vigueur germinative dépend aussi de multiples variables

biochimiques et moléculaires. Son amélioration permettrait d’améliorer les rendements si on les

inclut dans des programmes biotechnologiques. En effet, la germination est la phase la plus critique

dans le cycle de la vie de la plante, on la définit du moment où la graine sèche mature prend l’eau

et termine là où la radicule émerge de l’enveloppe de la graine (Figure 1) ce qui met à contribution

les ARN messagers et protéines stockés au cours de la formation de la graine (Rajjou et al, 2012).

Figure 1. Phénoménologie de la germination en trois phases. Rentrée d’eau, germination au sens strict,émergence de la radicule. On voit ici les différentes implications hormonales avec l’acide gibbérellique (GA)et l’acide abscissique (ABA). Durant cette phase, des protéines stockées et les ARN messagers stockés vontêtre dégradés. Des ARN messagers et protéines vont être synthétisées de novo. Puis le métabolisme vareprendre. Adapté de Rajjou et al, 2012.

Ce stage d’un mois a été effectué au sein de l’équipe « Physiologie de la germination » qui étudie

les mécanismes essentiels de la régulation de la dormance, la longévité et la réponse de la graine à

l'environnement, dans le but d'améliorer la qualité germinative des semences. Au niveau

moléculaire, c’est la conformation protéique au cours de la transition entre la maturation et la

germination qui est un élément prépondérant pour l’entrée et le maintien à l’état quiescent de la

semence et pour le redémarrage brutal de l'activité métabolique à l’imbibition. Par exemple, parmi

les remaniements post-traductionnels du protéome, l’isomérisation (cis-trans) des résidus prolines

dans les chaines polypeptidiques émerge comme un mécanisme moléculaire clé contrôlant la

fonction d’un grand nombre de protéines (Kumari et al, 2012). L’étude du protéome de la graine

mature sèche de la plante modèle d’Arabidopsis Thaliana révèle la présence de plusieurs peptidyl- prolyl cis-trans isomérases (PPIases) telles que les cyclophilines ROC1 et ROC4. Une PPIase est

une isomérase qui convertit la forme trans en fome cis du peptidyl-propyl (Figure 2).


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Figure 2. Illustration schématique des isomères trans et cis du groupement peptidyl-propyl. L’interconversion entre les deux formes est catalysée par les cyclophilines et les autres peptidyl-prolylisomérases (PPIases). Adapté de Kumari et al, 2013.

Les PPIase sont impliquées dans plusieurs processus tels que le trafic cellulaire, la stabilisation des

complexes, l’apoptose, la signalisation, la différenciation, la détoxification et la réparation (figure 3).

Une partie des cyclophilines, un sous-groupe de la famille des immunophilines ont ce domaine

PPIase. Elles auraient aussi un rôle dans le repliement des protéines ce qui les rend affilié à la classe

des chaperones (Kumari et al, 2013).

Figure 3. Modèle théorique du rôle des PPiases dans les différents stress de la cellule. De Kumari et al,2013.

Le projet étudie la cyclophiline ROC4 qui est une PPIase des plus abondantes dans la graine sèche

d’Arabidopsis. Il y aurait 29 séquences conservées chez cette espèce. Un phénotype lié à la

germination a été observé chez le mutant « knock-out » roc4. Des expériences préalables ont

montré que ce mutant germe plus vite que le génotype sauvage columbia (Col0). Cette observation

a soulevé la question suivante : l’activité de la PPIase est-elle corrélée avec la vigueur germinativede la graine ?

Dans un premier temps une première approche a été conduite, la protéomique. La comparaison

entre le génotype sauvage et le mutant roc4 a révélé une quarantaine de protéines différentiellement

exprimées (figure 3). Quelques spots ont pu être identifiés grâce à la carte « Arabidopsis Seed

Proteome» (tableau 1)


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Figure 4 : Gel d’électrophorèse bidimensionnelle montrant les 40 spots protéiques différentiellement

exprimées chez le mutant roc4 .

Tableau 1. Présentation des protéines identifiées à partir de la carte « Arabidopsis Seed Proteome ».Spot n Effet Nom Implication

127 roc4

down

Alcool déshydrogénase Oxydation et stress oxydant, réponse au

stress salin, réponse au cadmium.

146 roc4

down

Glyceraldehyde-3-phosphate

dehydrogenase, cytosolic

156 roc4

down

Phosphoglucomutase,

cytoplasmic 2

Réponse au cadmium

157 roc4

down

Actin 7

121 roc4

up

ATP-dependent Clp

protease ATP-binding

subunit / ClpC

Chaperone

121 roc4

up

Ferritine 1 Gène de régulation pour la réponse au

stress phosphate.

129 roc4 up

Cell division cycle protein(CDC48)

Réponse au cadmium. Croissance descellules.


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On a choisi 4 protéines identifiées pour étudier l’abondance de leurs transcrits :

L’Alcohol deshydrogenase (ADH), la phosphoglucomutase (PG), la Ferritine (Fe) et la Cell division

cycle protein (CDC). Celles-ci sont intéressantes à étudier en premier car elles sont impliquées aussi

dans différents stress (au cadmium, au phosphate, au stress oxydant) où interviennent les PPiases.

En étudiant l’abondance des transcrits de ces 4 protéines on va chercher à savoir comment sontrégulés les gènes codant ces protéines au niveau transcriptionnel. On comparera le taux

d’expression des ADNc chez le mutant roc4 par rapport au génotype sauvage cultivés dans

différentes conditions de température.

I. Matériels et Méthodes :

Des plantes de génotype sauvage (Col-0) et mutants roc4 d’ Arabidopsis Thaliana ont été cultivées

dans trois conditions de température : Standard (21-23°C), chaud (26-28°C) et froid (16-18°C)

(Tableau 2). Pour chaque génotype nous avons travaillé sur deux réplicats biologiques.

Tableau 2 : Echantillons utilisés et plan d’expérience de l’étude. Des graines sauvages ou mutantesd’Arabidopsis Thaliana cultivées dans trois conditions de température (S : standard, C : chaud, F : froid).Deux réplicats biologiques ont été réalisés par couple (phénotype, Température) pour n=12. Lescorrespondances utilisées (1T, 2T…) pour les expériences sont indiquées.

Sauvage col-0

(T)

Mutant roc4

( R)

Température Standard (21°C-23°C)Col1 S, col2 S

(1T,2T)

Roc 1 S, Roc 2 S

(1R,2R)

Température froid (16-18°C)Col3 F, Col4 F

(3T, 4T)

Roc 3 F, Roc 4 F

(3R, 4R)

Température chaud (26-28°C)Col5 C, col6 C

(5T, 6T)

Roc5 C, Roc6 C

(5R,6R)


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Extraction d’ARN

• Broyage azote liquide, tampon d’extraction avec beta-mercaptoethanol 1,5%, Phénol /Chloroforme, chlorure delithium (précipitation des ARN)

• Evaluation au nanodrop de la quantité et qualité ARN

• Purification éventuelle sur colonne de PVP

Rétro transcription

• A partir d’1ug d’ARN, avec traitement DNASEFermentas

• Vérification de l’expression des rétrotranscrits par

PCR avec les amorces d’un contrôle (facteurd’élongation, EF)

PCR quantitative

• Test de dilution et choix desamorces spécifiques

• Q-PCR sur les différentséchantillons sauvages etmutants

1. Méthodes :

1.1 Extraction des ARN, Rétrotranscription et Q-PCR

Le protocole général est présenté en figure 5, il va de l’extraction des ARN dans les graines à

l’analyse de l’abondance des rétrotranscrits (ADNc) par Q-PCR.

Figure 5 : Etapes Protocole expérimental de l’étude. Adapté de Thomas et al 1994, Galland, Godin et al

2011. Tout est certifié RNase free(Sigma). (A) Les graines sont broyées dans un mortier avec de l’azote

liquide. Un tampon d’extraction contenant 1,5% beta-mercaptoethanol et 1% SDS permet de

dénaturer les protéines et couper les ponts disulfures, de l’EDTA pour chélater les cations divalents

qui interviennent chez les Rnases et Dnases, cela permet d’inhiber ces métalloenzymes. Enfin, le

chlorure de Lithium LiCl permet de précipiter les ARN (Cathala et al, 1983). Evaluation au

nanodrop de la qunatité et qualité des ARN. Une éventuelle purification est effectuée sur colonne

PVP (Poly(Vinylpolypyrrolidone) (Biorad). (B) Avant la rétrotranscription, un traitement DnaseI

(kit fermentas) est effectué, la transcriptase inverse utilisée provient de Revert Aid H Minus. Une

PCR pour amplifier les rétrotranscrits suivie d’une électrophorèse sur gel d’agarose 1% avec TAE

0,5x et du BET a été effectuée. (C) Pour chaque gène 3 couples d’amorces ont déjà été testés par

PCR. Ceux présentant une bonne expression en PCR ont ensuite été testés par Q-PCR à différentes

dilutions afin de déterminer la dilution appropriée de l’échantillon et évaluer la spécificité dechaque couple d’amorce. La dilution au 1/20ème a été ensuite choisie pour l’étude de l’expression

des transcrits des 4 gènes : aldehyde dehydrogenase, ferritin, cell cycle division protein et

phosphoglucomutase.

A

B

C


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1.2 Séquences oligonucléotidiques utilisées :

Les séquences d’oligonucléotides sélectionnées pour l’analyse de l’expression différentielle des

échantillons sont présentées au tableau 3.

Tableau 3 : Séquences (primers) d’oligonucléotides retenus après test de dilutions pour lesamplifications en PCR quantitative Qpcr. Plusieurs couples d’amorces pour un même gène ont été testéesauparavant. Pour AD un hétérocouple AD1 reverse et AD2 forward a été retenu, ainsi que pour CD : CD1reverse et CD2 forward. Sigles : AD : alcool déshydrogénase, PG : phosphoglucomutase, Fe : ferritine, CD :

cell division protein factor.

Nom Séquence Forward Séquence reverse Taille (pb)

PG2 AGCTGCACTTGATGTCGTTG TCGACGTGAACTACAGCAAC 20

Fe2 GGCCATTCCAATCACATCTC CCGGTAAGGTTAGTGTAGAG 20

AD1* GGTCTTGGTGCTGTTGTTT CCAGAACCACGACAACAAA 19

AD2* CCATTTTTGGTCTTGGTGCT GGTAAAAACCAGAACCACGA 20

CD1* TTGCAAGTACGGCATCAGAG AACGTTCATGCCGTAGTCTC 20

CD2* CTTGGCAAGTACGCCATCAGA GAACCGTTCATGCGGTAGTCT 21

*Voir légende.

1.3 Test de de sensibilité de la germination à l’acide abscissique (ABA):

Une expérience préalable a montré que le mutant roc4 présente un phénotype de germination et

germe plus vite que le génotype sauvage Col-0. Pour vérifier si ce taux de germination est influencé par l’acide abscissique (ABA), un inhibiteur de germination, nous avons effectué un test de

sensibilité à l’ABA sur le génotype sauvage et le mutant roc4 avec une concentration de 1 µM.

Nous avons calculé le taux de germination sur 50 graines au bout de trois jours d’imbibition sur 5

ml de gélose avec ABA et sans ABA (groupe témoin) pour les deux génotypes Col-0 et roc4. Nous

avons réalisé chaque expérience en triplicat, soit n=12.

II. Résultats et Discussion :

1.

Rendement et pureté des extractions d’ARN :

Echantillon

(n=2)

Rendement moyen (%) [ARN] (ng/µl) Moyenne de

l’absorance

A260/280

Col S 0,14 ± 0,01 729 ± 43 1,50 ± 0,00

Col C 0,15 ± 0,04 786 ± 207 1,69 ± 0,01


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Col F 0,47 ± 0,06 2421 ± 326 1,82 ± 0,05

Roc S 0,23 ± 0,20 1204 ± 1073 1,72 ± 0,08

Roc C 0,31 ± 0,35 1596 ± 1787 1,59 ± 0,08

Roc F 0,35 ± 0,01 1821 ± 35 1,57 ± 0,21

Tableau 4 : Moyennes et écart types du rendement, de la teneur en ARN et de la pureté des extraits d’A RN pour chaque groupe sauvage et mutant par conditions de température.

Comme confirmé dans les différentes publications d’extraction de l’ARN, les rendements sont très

pauvres (Cathala et al, 1983), mais l’extraction est assez pure dans l’ensemble. Deux échantillonsont été purifiés pour améliorer leur pureté, mais ce n’était pas très efficace avec une perte de 60%

de l’échantillon pour une pureté faiblement inchangée. Une colonne Cleanup pourrait être utilisée.

2. Rétrotranscription et PCR :

Figure 6. Vérification de la rétrotranscription des différents échantillons avec le gène de référence EF.(A) Migration sur gel TAE 0.5x, 1% agarose et BET à 100 mV après la PCR. (B) Répétition sur leséchantillons mal amplifiés. 1a est le témoin positif (10µl), B est le témoin négatif (eau), les produitscontiennent 1µg d’ADN. A1 : témoin positif (rétrotranscrit à partir de col-0 déjà validé dans une premièreexpérience). M : Marqueur de poids moléculaire Gene Ruler™ 1kb Plus DNA Ladder (PM). Les référencesdes échantillons sont énoncées au tableau 2.

A1


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La vérification de la rétrotranscription par PCR est présentée (Figure 6), le taux de réussite est de

50%. Des extractions d’ARN ont été effectuées à nouveau par la suite afin d’avoir des réplicats

supplémentaires pour les répétitions.

3. Résultat des Q-PCR

Pour chaque échantillon des tests de dilution des ADNc (1/10,1/20, …,1/100) ont été réalisés pourdéterminer la quantité adéquate pour réaliser la qPCR. La dilution au 1/20 a été retenue. La

spécificité de plusieurs couples d’amorces a été testée. Les courbes de fusion présentant un pic

unique caractéristique d’une bonne spécificité ont été retenues . Figure (7)

Figure 7 : Spécificité et efficacité des combinaisons d’amorces choisies. (A) Exemple d’une courbe de fusion pour le

couple d’amorces CD2/CD1. Un seul pic montre la spécificité. (B) Courbe standard de régression linéaire pour lecouple AD2/AD1, la qualité de la régression montre l’efficacité des amorces.

4. Expression différentielle des 4 gènes :

La figure suivante indique les résultats de l’abondance des 4 transcrits chez le mutant roc4 par

rapport au génotype sauvage Col-0 dans deux conditions de culture : standard et chaud.

Figure 8. Profil d’expression des 4 gènes ADH, CDC, PG et Fe dans deux conditions de culture (standard etchaud). La lecture en logarithme de base 2 permet d’interpréter plus facilement les résultats.

Standard

Chaud

A B


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On représente l’expression différentielle des quatre transcrits chez le mutant roc4 par rapport au

sauvage Col-0 (fold change) sur la figure 8. Les résultats qpcr de la culture dans la condition

« froid » ne sont pas présentés car les qpcr réalisées avec le contrôle interne EF ne sont pas

exploitables. Au niveau des deux autres conditions de température « standard » et « chaud », on

remarque que l’expression des 4 gènes est inversée, ils sont sous-exprimés dans la condition

« standard » et surexprimés dans la condition « chaud ». On sait que les variations climatiques

peuvent agir sur les conditions de maturation de la graine et probablement sur l’expression et laqualité des ARN stockés à l’état sec.

Figure 9. Sous-expression des 4 gènes chez le mutant roc4 en conditions standard (A) et comparaisonavec le protéome (B).

Si on compare l’expression, en condition standard, des 4 gènes au niveau transcriptionnel (figure 9)et au niveau traductionnel (protéome), on remarque qu’il y a une corrélation positive uniquement

pour deux gènes : l’aldéhyde dehydrogénase (ADH) et la phosphoglucomutase (PG). Ce résultat

n’est pas surprenant et est concordant avec ce qu’on connait déjà sur les deux régulations. En effet,

plusieurs études ont montré qu’en général la corrélation entre le transcriptome et le protéome est

autour de 50%.

Les deux autres gènes codant pour la Ferritine (Fe) et la « cell cycle division protein » (CDC) sont

sous-exprimés alors qu’au niveau protéique on observe une accumulation. Lors de la reprise

germinative, les pools d’ARN stockés et des protéines vont être mobilisées avant d’être dégradés.

Cette accumulation des transcrits est un niveau de régulation de la vigueur germinative via leur

qualité (Rajjou et al, 2012). On sait aussi que les PPiases interviendraient dans la régulation de laqualité de ces ARN stockés (Figure 3, Kumari et al, 2013) ou de la conformation protéique des

protéines. Ainsi, on peut supposer que la cyclophiline ROC4 régule bien les protéines Fe et CDC à

un niveau de régulation post-traductionnel ou post-transcriptionnel.

NameEffect

(Protéome)ADHDown

PG

FeUp

CDC

A

B


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5. Test de sensibilité à l’ABA :

Figure 10. Test de sensibilité des sauvages et mutants roc4 à l’ABA 1 Um. Vérification de la germination(sortie de la radicule) de 50 graines après 3 jours d’imbibition sur gélose 5 ml dans des boites de pétri. Les barres d’erreurs représentent les écarts types (n=3). Col : sauvage, Roc : mutant.

Précédemment, les expériences d’Isabelle Fabrissin ont montré un taux de germination plus

important chez le mutant roc4. L’acide abscissique inhibe la germination de la graine. Or le test de

sensibilité à l’ABA effectué dans cette étude ne montre pas empiriquement des résultats significatifs

(grands écarts types). On ne peut donc pas conclure, la concentration utilisée d’ABA était peut -être

trop faible pour différencier nos deux groupes.

Conclusion :

L’analyse protéomique réalisée sur des graines sèches du mutant roc4 cultivé dans des conditions

standard a révélé une différence d’accumulation d’une quarantaine de protéines par rapport au

génotype sauvage Col-0. Une première identification de ces protéines a été réalisée à partir de la

carte « seed proteome » d’Arabidopsis. Parmi les gènes codant ces protéines, nous avons choisi 4

pour étudier leur niveau de transcription : une alcohol déhydrogénase, une phosphoglucomutase,

une ferritine et une protéine du cycle de division cellulaire (CDC8). Ce choix a été réalisé enfonction de leur implication dans différents stress tels que le stress au cadmium, la carence en

phosphate ou au stress oxydant. En plus des conditions de culture standard, nous avons aussi étudié

l’expression de ces gènes dans deux autres conditions de culture : chaud et froid. Nous avons

ensuite comparé cette expression à celle des protéines régulées par les mêmes gènes.

Condition « Standard » (21-23°C) :

- Sousexpression des transcrits et diminution du taux des protéines pour l’alcohol

dehydrogenase et la Phosphoglucomutase.

- Sousexpression des transcrits et accumulation des protéines pour la « cell division

cycle protein (CDC48) » et la « ferritin 1 precursor » ce qui traduit une différence


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entre la régulation transcriptionnelle et traductionnelle pour ces deux gènes. En effet,

la régulation se fait à tous les niveaux et notamment au niveau de la qualité des ARN

stockés au cours de la maturation.

Condition « chaud » (26-28°C) : Surexpression des transcrits.

Condition « Froid » (16-18°C) : Nous n’avons pas pu exploiter les résultats.

Test de sensibilité du mutant roc4 à l’ABA : Le mutant roc4 n’est pas sensible à l’ABA à une

concentration de 1 µM et présente un taux de germination comparable au génotype sauvage.

Pour les perspectives, l’ensemble les manipulations a bien fonctionné sauf pour les échantillons

cultivés en condition de culture au froid. Ceci est dû à quelques erreurs de manipulations qui n’ont

pas permis d’obtenir des résultats. Pour le test de germination, une durée plus courte ou une

concentration plus élevée d’ABA serait nécessaire car le seuil de sensibilité n’est peut-être pas

suffisant. Il serait intéressant de réaliser des analyses protéomiques sur les deux autres conditions de

température (chaud et froid) pour comparer l’abondance en protéines et en transcrits dans ces deux

conditions et compléter nos résultats. Il serait intéressant aussi de tester la sensibilité de lagermination au cadmium car ces gènes étudiés présentent dans la littérature un stress au cadmium.

Bibliographie :

Loic Rajjou et al, « Seed Germination and Vigor ». The Annual Review of Plant Biology, 2012. Doi : 10.1146/annurev-

arplant-042811-105550

KUMARI ET AL, « Cyclophilins, proteins in search of function ».Plant Signaling & Behavior 8:1, e22734; January 2013;

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