purification et propriétés de la l-amino acide aromatique décarboxylase (4.1.1.28) du cerveau de...

BIOCHIMIE, 1~975, 57, 1005-1017.

Purification et propridtds de la L-amino acide aromatique ddcarboxylase (4 .1 .1 .28) du cerveau de rat

M o n i q u e COR{~II~R et H e n r i I:~ACHECO~.

Service de Chimie biologique, Insti tut National des Sciences Appliqudes de Lyon, 20 Avenue Albert Einstein, 69621 Villeurbanne.

(19-4-1975).

(3,

Summary. - - L-aromat ic ,aminoaeid ~ecaTboxy.l,a, se h,a~s been p~urifi.ed, nmve fla~n t h o u s a n d t imes f rom h~mo~en,ates ~f r a t brain~ in several steps : cen4rifuga.tion., DE&E celltllose, CM eel,~lose, hy.droxyl.~p~atite, DEAE sep~h.adex.

I ts Frop~.rti~es have been studied, mos t of t h e m on a n i m e r m e d i a t e fracti~on~ o,f the purifi.eaAion, beea.us,e of .the. in, stazbility ,~f the purified ,enzyme in sp~i~e of tim add~ition, of different s tabi l iz ing a g e n t s : the enzyme decarboxyla tes 5-hydroxytry .p tophan (5 HTP) and DOPA in a ra t io cons tan t t h r o u g h o u t the p u r i f c a t i o n but does not decarboxyla te t.ryptola~han, tyrosine , h,istit~ilre at a measurab le ra~e. Op t imum pH, Km, Vm, have been measured w i t h 5 HTP and DOPA as subst ra tes . The enzyme h a s a molecula r weight of 115.000, an ap,pa:rent is~electri,c po in t of 6,4-6,5. I¢ is inh.ibit.ed by seroton,in, dopamine, some ca~tions : Cu ÷+, Fe ÷÷, N,i ÷÷ by N~ethyl.nml,eimi&e, so&i~m d~dlecylsufate. S.ome pyr ido- ~al-5 phospha t e (PLP) r em a i ns stron,~ly bound to the enzyme.

F,~r re la t ive ly v~eak concemtra~ions of substra le , the enzyme is in.hib,ited by an excess of PLP ; for v~eak con,centrations of PLP, ~l~e enzyme is in,hib,i~ed by an. excess of sub str~te, pa r t i cu ,h r ly of DOPA.

We also observe a spontaneous decarboxylati .on of the subs t ra tes t ha t reaches a p la teau ~nd is .enh~n.ced by l~igh concen t ra t ions of PLP, by se~otonin~, dopamine, Cu ++ and reduced by mereap toe thano l and the presence of crude or boiled homogenates .

Severat possible expla,n~tio.n.s of the~ slaon,taneous deca,rboxylation and of the enzymic inhibit~on,s by a n ,ex~eess .of PLP and, by ~b.e subst~a,tes are ~i~en.

I N T R O D U C T I O N .

D i v e r s a u t e u r s o n t m o n t r 6 que l ' h y d r o x y - 5 t r y p - t o p h a n e d 6 c a r b o x y l a s e et la D o p a - d 6 c a r b o x y l a s e s e n t u n e s eu l e et m 6 m e e n z y m e , en u t i l i s a n t des m o y e n s d i f f 6 r e n t s : p u r i f i c a t i o n [1, 2, 3, 4~, i n h i - b i t i o n c o m p d t i t i v e des d e u x s u b s t r a t s [5, 6 7], md- t h o d e s i m m u n o l o g i q u e s [8, 9] qu i s u p p o s e n t au m o i n s u n e a n t i g d n i c i t 6 e r o i s de s ' i l n e s ' ag i t p a s de la m.Sme p r o t d i n e . E n c o n s d q u e n c e ]a c o m m i s s i o n des e n z y m e s de 1972 a at t r i b u 6 le m d m e c o d e (4.1.1.28) ~ la 5 H T P - D et h l a DOPA-D. Cet te en-

(*) Trava i l effeetu6 dan,s le cadre d 'u~e eo.nve~atio.n d,e ~ockerch,es INSA/DI~ME. H co ns t i t ue ~ne parole de la tbdse ¢~e D,octeur 6s Soiences quc dol t so.utelrir M. Gorgiev.

Abr~viations utilisdes : LA~D : L-amino-a~i, de aroma.t ique ddearboxylase. 5 H.TP : hydvox7-5 tryp~opha, n,e. 5 HTP-D 5 HITP ddca~rbox:~l,ase. DOPA : d, ihydTox'y-3,4 ph~ndyla, lanine . DO PA-D Doira-d~earboxylase. 5 H T : hydroxy-5 tryp~.a.mi~e ou sdrotonine. DA : ~opamin~e. DS. : ddcarb~xyl~t.ion spontan~e. DE~AE ~idthyl~an~ino-dthyl. (-cel,l~h)se ; -sdphadex). CM c a r b o x y m f t h y l (ce'l~l,ul,ose). P L P pyridox:a*l-5 phosphate .

.~ A qni tO~lt,e correspo,n~a.nee ~oit 6tre advess$e.

z y m e d d c a r b o x y l e 6 g a l e m e n t d ' a u t r e s a c i d e s ami - nds a r o m a t i q u e s , e n p a r t i c t t l i e r l ' o . t y r o s i n e et l a m . t y r o s i n e . L ' a c t i v i t 6 v i s -h -v i s d ' a u t r e s a c i d e s a m i - nds te l s clue le t r y p t o p h a n e , Ia p A y r o s i n e , la p h d - n y l a l a n i n e , l ' h i s t i d i n e es t dd tec t6e d a n s c e r t a i n s cas [1, 2] m a i s i l n ' e s t p a s c e r t a i n q u ' i l s s o i e n t des s u b s t r a t s de l ' e n z y m e [3, 5, 10]. N o u s l ' a p p e l - l e r o n s n d a n m o i n s L - a m i n o a c i d e a r o m a t i q u e dd- c a r b o x y l a s e (LAD), 5 H T P - D et D O P A - D d d s i g n a n t l ' ac t iv i*6 m e s u r d e a v e c le 5 H T P el la D O P A t o m - m e s u b s t r a t s r e s p e c t i v e m e n t .

L a LAD d o n n e n a i s s a n c e h l a d o p a m i n e et h la s d r o t o n i n e (5 HT) ; d a n s le c e r v e a u ces a m i n e s s e n t p a r t i c u l i d r e m e n t i m p l i q u d e s d a n s ]es 6 ta t s de ve i l l e et de s o m m e i l . C h e z r a n i m a l , la LAD n ' e s t p a s l ' d t a p e l imi t . an te de l e u r f o r m a t i o n [11]. Chez l ' h o m m e , e l le p o u r r a i , t l ' d t r e : c e r t a i n s au - t e u r s n ' e n on t f r o u v 6 q u ' u n e t r d s f a i b l e q u a n t i t 6 d a n s le c e r v e a u h u m a i n , f a i t qu i ne s e m b l e p a s dfi h la d d g r a d a t i o n postmortem [12] ; p a r c e n t r e d ' a u t r e s a u t e u r s e n t r o u v e n t u n e q u a n t i t 6 p r a t i - quemen , t 6gale h ce l i e m e s u r d e chez ]e c h a t [13].

La DOPA-D est 6 g a l e m e n i i m p l i q u d e d a n s le p a r k i n s o n i s m e : c h e z les p a r k i n s o n i e n s , o n ob-

1006 M. Corgier el H. Pacheco.

serve une d6g6n6rescence du syst~me nigro-stria- tal ascendant [14] avec d ispar i t ion presque to|ale de la ty ros ine-hydroxylase d'ofl impossibil i t6 de former de la dopamine ; la DOPA-D diminu~e est cependan t en quanti t6 suffisante pour d6carboxy- ler la L.DOPA adminis t r6e aux pat ients et permet- tre ainsi une am61ioration des symptbmes. L'ad- min i s t r a t ion de pyr idoxine , pr6curseur du pyr i - doxal-5 phosphate (PLP) qui est le coenzyme de la LAD contrecarre les effets du t ra i tement ~ la DOPA au lieu de l 'ani61iorer [15].

Nous avons en t repr i s une puri f icat ion de la LAD du cerveau de rat et une 6tude de ses propri6t~s physico-chimiques , cin6tiques, ainsi que des inter- act ions substrats enzyme- coenzyme- produi ts de la r6action.

MATERIEL ET METHODES.

A --- MESURES DES ACTIVIT~S ENZYMATIQUES.

1 °) Hydroxy-5 tryptophane ddcarboxylase (5 HTP-D).

On mesure l 'activit6 de la 5 HT,P-D suivant les m6thodes de Davis et A~vapara [16] et Lovenberg et coll. [1] modifi6es : pour un volume final de 1,4 ml on fait i ncuber 0,5 ml de solut ion enzymatique pendan t 2 h h 37°C en pr6sence de DL 5 HTP 3 ~4C (53-55 mC/mmole ; 0,1 ~C par essai), de DL 5 HTP 10 -~ M, de phosphate de pyr idoxal PLP 10 -5 M, d' iproni.azide 10 -a M, de tampon phosphate pH 7,8 0,02 M h 0,05 M, et 6ventuel lement de divers addit i fs : EI)TA 10-4 M, mercapto6thanol 10 -4 M, s6rum a lbumine de bceuf 0,1 mg /ml (concent ra t ions finales). L ' iproniaz ide est supprim6 "h par t i r de l '6tape DEAE cellulose qui ne cont ient plus de monoamine oxyd,ase.

La r6act ion est a rr6t6e par 0,2 ml d 'un m61ange 1/1 d 'acide perch lor ique 0,4 N e t d 'acide ac6tique 0,2 N, m~lange con lenan t 1 mg /ml de 5 HTP et 2 mg /ml de s6rotonine cr6at inine sulfate (5 HT). Apr6s cent r i fugat ion des prot6ines, 1 ml du surnageant est d6pos6 sur une colonne (dimm6tre : 1 cm) de 1 g de permuti te , 6changeur d ' ions cat ionique, activ6 par 6bull i t ion dans une solut ion de KC1 20 per cent con tenan t 5 per cent d 'acide ac6tique [17]. Un lavage par 30 ml d'H20 61imine le 5 HTP. La 5 HT est ensuite 61u6e par 6 ml d 'acide ac6ti- que 4N. Une par t ie aliquote de l'61uat est m61an- g6e avec l ' Ins tagel Packard ou l 'Unisolve Sochibo et la radioact ivi t6 mesur6e.

enceinte herm6tique. Le mil ieu d ' incuba t ion con- t ient les m~mes composants que pour la 5 HTP-D, le DL 5 HTP 6rant remplao~ par de la DL DOPA, le DL 5 HTP 14C-3 par de la DL DO,PA 1 14C (53 mC/mmole ; 0,025 ~C par essai).

La r~action est arr~t6e par in ject ion de 1 ml d'H2SO 4 5N dans }a tubulure lat6rale de ]a fiole. La microdiffusion du CO 2 radioact i f pi6g6 sur un papier filtre en fibre de verre impr6gn6 de NaOH 2,N est ponrsuiv ie 1 h 2 heures ap'r~s arr~t de la r6action. La radioactivit~ est mesur6e duns 5 ml d 'Instagel ou d'Unisolve.

3°) Histidine d~carboxglase.

Elle est mesur6e par la m6me m6thode que la DOPA-D ; le mil ieu d ' incuba t ion (%4 ml) cont ient 0,5 ml de solution enzymatique, 10 -5 M de L-histidine, 0,5 ~C de DL his t id ine 1-14C, 10-~ M PLP, du tampon phosphate 0,(~2 M pH 6,9 ou 7,8. Ces condi t ions sont assez proches de celles d 'autres auteurs qui dosent l 'activit6 his t id ine-d6carboxylase centrale ou p6riph6rique [18, 19, 20].

4 °) Trgptophane-d~carboxglase et tgrosine d~- carboxylase.

Elles sont mesur6es par la m6me mdthode que pour l a 5 HTP D en ut i l isant du t ryptophane 3 1~C (46-5~ mC/mmole ; 03 ~C par essai) ou de la tyrosine uni form6ment marqu6e au 1~C (513 mC /mmole ; 0,1 ~C par essai) : apr6s incubat ion , le surnageant est d6pos~ sur une colonne de permu- tire : le t ryptophane ou la tyrosine sont 61imin6s par lavage h l 'eau, la t ryp tamine ou la ty ramine 6ventuel lement form6es restent fix6es et sont ~lu6es par l 'acide ac6tique.

B --- DOSAGES SPECTROMETRIQUES.

1 °) Ddtection et dosage des protdines.

Les pics prot6iques des effluents de chromatographies sont d6tect6s par leur pourcentage de t ransmiss ion h 280 nm grfice h un spectrophoto- m6tre h 6coulement (Uvicord II). Les tubes corres- pondan t h u n pic sont ensuit.e regroup6s et ]eur concent ra t ion en prot6ines mesur6e par la m6- ihode de Lo~xry [21].

2 °) Dosage [luorimdtrique du PLP.

Le PLP est dos6 suivant la m6thode d 'Adams [223 par t ransformat ion en d6riv6 fluorescent. On obtient une courbe 6talon droite qui permet de doser faci lement jusqu'h O,1 nmole de P~LP.

2°) Dopa-d~carboxylase (DOPA-D).

Elle est d6termin6e par mesure de la radioacti- vit6 du CO 2 lib6r6 -h par t i r de DOPA 1-1~C dans nne

C - - ELECTROPHOR~SE.

On effectue une 61ectrophor6se en cont inu au moyen de l 'apparei l << Beckman Spinco mod61e

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 9.

L-amino-acide aromat ique ddcarboxylase (4.1.1.28). 1007

C.P. >> dans un champ 61ectrique de 800 V. L'ex- p6r ience faite dans te t ampon phosphate 5.10-~ M est r6p6t6e h des pH diff6rents jusqu'h ce que la migra t ion d,e l 'enzyme par rappor t au glucose soit nulle ou presque.

D ~ PRF.PARATION DES RESINES UTILISt~ES POUR LA

PURIFICATION,

La DEAE cellulose (,Carl Schleicher et SchfiÂl ; 0,86 m Val/g) (100 g maximum) est p'r6eyel~e par lavages suceessifs avee HC1 0,1 N e t NaOH 0,l N puis 6quilibr6e eontre du t ampon phosphate 0,01 M pH 7,8. La eolonne est de 2,5 × 15 era.

La CM cellulose C~ 23 (Whatman) est pr6cycl6e par lavages successifs avec NaOH 0,1 N e t H:C1 0,1 N puis 6quilibr6e contre du t ampon phosphate 0,03 M pH 5,2 con tenan t PLP 10 -5 M + EDTA 10-4 M. La colonne est de 1,5 × 10 cm.

L 'hydroxyl apatite (Bio-Rad) est d6cant6e plusieurs lois A l 'eau distiI16e puis 6quil ibr6e contre du tampon phosphate 0,03 M pH 7,8 contenant I~LP 10-5 M -4- EDTA 10-4 M. La colonne est de 1,5 × 5,6 cm.

La D EAE sGphadex A-50 (1 g) est raise h gon- tier env i ron 2 h an h a i r mar ie boui l lan t dans le t ampon phosphate 0,03 M pH 7,8, Ies << fines >> 6tant dGcantGes 3 ou 4 fois. A la dernibre dGcanta-

RESULTATS ET DISCUSSION.

P U R I F I C A T I O N DE I A L-AMINO ACIDE AROMATIQUE

DI~CARBOXYLASE (,LAD) DU CERVEAU DE RAT

(tabMau 1).

Toutes les opGrations sont effectuGes h + 4°C. Le 5 HTP est utilis6 eomme substrat .

1 °) Centrifugation.

20 Rats Wistar tomes (2,00-300 g envi ron) sor t assommGs et dGcapitGs ; les cerveaux prGlevGs im- mGdiatement sont homogGnGisGs au 1/10 dans du saccharose 0,2,5 M avec un b royeur de Potter FAve- jehm. Une centr i fugat ion h 40.0.00 g mont re que la dGcarboxylase se t rouve dans le surnagean t (frac- t ion A). On obtient un r e n d e m e n t en activit6 de 95 p. cent avee un,e pur i f ica t ion de 4.

Par histofluorescence, Hokfelt, Fuxe et Gold- stein [9] localisent ,la DOPA-D da.ns Âe cytopIasme des neurones cent raux ehez le rat ; Laduron et t~elpaire [23] re t rouvent toute l'a.ctivit6 DOPA-D dans le surnageant h 1,00.000 g des surrGnales de bceuf ; par eontre Rodriguez De Lores Arnaiz [24] ne trouve que 55 p. cent de la 5 HTP-D du cerveau de .rat da,ns l ' ensemble du surnageant et des miero- somes, le reste 6rant loealis6 pour la plus grande par t dans le surnageant de la f rac t ion mi tochon-

TABLEAU I.

Purification de la LAD du cerveau de rat.

Etapes

Centrifugation . . . . DEAE Cellulose.. CM Cellulose . . . . . . HYdroxylapatite... DEAE sGphadex...

Fraction

l{0mog~nat A B C D E

Activit6 enzymatique

en ponreentage de l'activit6 de d6part

100 95 45 30 18 7

Prot6ine en

pourcentage dn taux initial

100 23,7

0,75 0,187 0,056 0,0058

Activit6 sp6ciflque

en nmole/5 HT/b/ Mg prot6ine

0,35 1,4

21 52,5

131 420

Taux de purification

Paw Global rapport

h l'Gtape prGeGdente

1 4 4

60 15 160 2,5 320 2,5

1 200 3,2

L',activit6 d~e d~part (ef conditions exp~rimenta,les A 1 °) est de 1,92 n rrmle 5 HT/heure ; la con.cen,tration e~ pr.o.tGi1~es .est de 5,5 mg/mL

t ion on opGre en prGsenee de PLP 10 -5 M + EDTA 10 -4 M. La colonne est de 1,5 X 8 cm.

Le Bio-gel A-l,5 M (Bio-Rad) (PM d 'exclus ion : 1.5{)0.000 ; 5.0-100 mesh) est 6qquil ibr6 contre le t ampon phosphate 0,03 M pH 7,8.

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 9.

driale ayant subi un choc osmotique. Cette diffG- rence avec nos rGsultats peut p roven i r du fair que Rodriguez De Lores Arnaiz [24] util ise une solu- t ion de saccharose 0,3.2 M contenan t des ions Ca ++ qui favor isera ient l 'agrGgation du lnatGriel cyto- p lasmique [23].

1008 M. Corgier et H. Pacheco.

2 °) DEAE cellulose (fig. 1),

On d6pose 300 ml de surnageant (fraction A) la vitesse de 100 ml /h . On 6lue par un gradient d i scon t inu du tam, pon phosphate pH 7,8 de nm- larit6.s croissantes : 0,01 -0,03 - 0,05 - 0,07 - 0,10 - 0',I5- 0,20 M. Dans la f ract ion 61u6e par le tampon 0,~)3 M (fraction B) on r6cupbre 50 p. cent de l 'ac- tivit6 enzymat ique (purif icat ion de 15 lois). Apr6s cette 6tape, l es tampons utilis6s pour 6quil ibrer les r6sines et pour 61uer les prot6ines con l i ennen t 10 -z M PLP et 10 -4 M EDTA qui prot6gent l 'enzyme de la d6naturat ion.

3 °) Carboxy mdthgl cellulose (CM cellulose) (figure 2).

L'61uat de DEAE cellulose (fraction B, 200 ml maximum) est amcn6/~ pH 5,2 par l 'acide ac6tique 0,1 froid goutte "~ gou,tte en pr6sence de PLP

30 ml /h . Les prot6ines son t 61ubes par des tampons phosphate de pH et de molarit6s croissants : 0,03 M pH 6,7-0,03 M pH 7,8-0,10 M pH 7,8. A par t i r de cette 6tape, l ' absorpt ion des prot6ines 280 nm est ~ peine visible sur I 'enregis t rement de la courbe d'61ution.

On r6cup6re l 'activit6 enzymatique dans la fraction 61u6e par le t ampon 0,03 M pH 7,8 (fraction D) qu 'on incube en pr6.sence de s6rum albumine de bceuf, s tabil isateur de l 'enzyme (cf § propri6t6s A-4a).

5 °) DEAE S@hadex A-50.

La fract ion D (50 ml maximum) est d6pos6e sur DEAE s6phadex & la vitesse de 20 ml /h . On 61ue par des tampons phosphate pH 7,8 de molari t6 croissante : 0,03 M-0,07 M. 0,10 M. L'activit6 enzymatique est retrouv6e dans la fract ion 0,10 M (fraction E) qu 'on incube en pr6sence de s6rum

T As ---15 -~

3O I

I I I

50 I

[b

o g

° ~ \ Z l ' - z ~, o N z

B ~ 2 1 0 0 I 1 J V o l u m e t l i

0 3 6 12 15 18 21 on rn~x lO0

FIo. 1 . - Purilication de la LAD du ceroeau de rat par chromatographic sur DEAE cellulose.

La [faction d@osde est la [raction A. - - poureentage &e transmis-

sion h 280 nm. ........... activit~ sp6eifique (AS.) en

unit6s arbitraires. molarit6 du tampon phosphate pH 7,8. vol : volume d'dlution en ml.

10-SM qui prot6ge contre la d6natura t ion par changement de pH (cf § propri6t6s A-4b). I1 est ensui te d6pos6 & la vitesse de 55 ml /h . L'61ution est faite par des tampons phosphates de molarit6 cons lante (0;03 M) et de pH croissants : 5 , 2 - 5 , 7 - 6,2 - 6,7 - 7,8.

Les fract ions obtenues sont amen6es h pH 7,8 par NaOH 0,1 N froid, goutte h goutte, pour la mesure de l 'activit6 enzymatiqu.e. La fract ion 61u6e h pH 6,2 (fraction C) cont ient l 'enzyme purifi6e.

4 °) Hydroxylapati te .

La fract ion C (environ 60-70 ml) amen6e fi pH 6,7 est d6pos6e sur la colonne & la vitesse de

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 9.

a lbumine de bceuf. La fract ion E ainsi purifi6e 1200 fois avec un rendement global de 7 p. cent (durOc de la purif icat ion : 6 jours) perd la plus grande part ie de son activit6 en 24 H, m6me h - - 20, ° C.

P R O p R I ~ T ~ S D E L A LAD D u C I ~ R V E A U D E R A T .

Elles sont d6ternfin6es h + 4°C h moins qu 'une autre temp6rature ne soit sp6citi6e.

A - - Pnopni~T~S PHYSICO-CHIMIQUES,

1 °) Poids moldculaire (PM).

Le PM est d6termin6 h par t i r d 'un 61uat de DEAE cellulose (fraction B) par fi l tration sur

L - a m i n o - a c i d e a r o m a t i q u e ddcarboxy lase (~.1.I .28). 1009

Biogel A-I,5 M. Le volume mort de la colonne est d6termin6 par le Bleu Dextran. Etant donn6 que :

Volume d'6'lution de l a prot6ine = f (log PM)

volume mor t

T A s

--25

I I

- 1 1 1 9(? I

I

100 ~ 0 ~

I . . . . . . I I I

'-OI n3 'TI " r

2 V o l u m e

3 e n n~l x 1 0 0

FI6. 2; - - Purification de la LAD du cerveau de rat par chromatographic sur CM cellulose.

La fraction d61~t>s~e est la fraction B. - - - - Fou~eent~ge de rtran~s,mi, ssi,tm h 2'80 n,m. ............ activi£6 sp~bcifiq~e ,en ,un,i~t~,s ,a.rbi~ra*ires. - - ) " pH du ta,rt~pon p.t~oslah, ate 0,03 M.

est une droite, on trouve un PM de 115.000, iden- t ique h celui trouv6 par Ghris tenson et coll. [2] et sup6r ieur h eelui trouv6 par Lancaster et Sourkes [2.5] pour l 'enzyme du re in de pore.

+

c+8 .£

"~ - 8

FIG. 3. - - D~termination du point isodlectrique appa- rent de ta LAD (fra ctivn,/~), par dlectrophorJse en con- tinu.

La distance de migrati,on ~e ]'.enzyme est exprim~e en n,ombre d~e tribes d:ont ell~ .a d~vi6 pat ra~aport une s~bsta,nee n e,u~tre (glucose).

2 °) Point isodlectrique (figure 3).

I1 est ddtermin6 pa r dlectrophor6se en cont inu. La fract ion utilis6e est la f ract ion B conc entr6e

contre poly6thyl~ne glycol 20.000 ; 8 p. cent de l 'aetivit~ au ma x i mum sont r6cup~r~s. La courbe de la migra t ion de l ' enzyme suivant le pH montre que lorsque l ' enzyme est proche de son poin t iso- ~lectrique une faible var ia t ion de pH en t ra ine un d~placement plus grand que pour des pH plus 61oign6s du p H i : d a n s nos condi t ions exp6rimen- tales, le po in t iso61ectrique apparen t de l ' enzyme est de 6,4 - 6,5.

3 °) Act ion des dialyses, du doddcylsulfate de sodium (SDS), du N-~thyl mal~imide (NEM).

Nous avons effectu6 des dialyses de la frac- t ion A dans l 'eau, dans des boyaux de ce l lophane lav6s h I 'EDTA 10-2 M pe nda n t 48 h pour 61trainer les ions Cu ++ qui i n h i b e n t r e n z y m e (plus de 90 p. cent h 10-4 M). Apr~s 16 h de dialyse darts un boyau de 4,8 cm de diambtre, l ' enzyme con- serve une activit6 impor tan te (envi ron 60 p. cent) et la r6cupbre totalement par addi t ion de 10-~ M P L P ; par dialyse de 48 h dans un boyau de 4,8 cm de diambtre ou de 24 h dans un boyau de 2,5 cm de diam~tre (off la surface d '~change est plus grande pour un volume donn6 d 'enzyme), l 'activit6 tombe & moins de 10 p. cent et n 'est pas r6cup6r6e par addi t ion de P,LP. Dans ces condi- t ions on ne peut don:c r6soudre compl~,tement l 'holo-enzyme en apo-enzyme et coenzyme tout en gardan~ l 'activit6.

Le SDS, agent d6tergent ionique, affaibli t les l iaisons de faible 6nergie des prot6ines et les dis- socie en sous-unit6s [26, 27]. Dans le cas de la 5 H'DP D, le SDS h 0,1 p. cent r~duit l 'activit6 enzymat ique de 99 p. cent.

Le NEM produi t une inh ib i t i on de 48 p. cent 10-6 M e t de 95 p. cent & 10-5 M. On n 'observe aucune protect ion pour ]e PLP, le 5 HTP ou les deux. I1 semble done qtte ]es groupements sulfhy- driles de l ' enzyme ne se t rouvent pas au centre aetif, h moins que le N;EM n 'a i t une affinit6 pour l ' enzyme beaucoup plus forte que le PLP.

4 °) Stabilit~ de l 'enzyme.

a - - Agents stabilisateurs de l 'enzyme.

Les fract ions A e t B se conservent p lus ieurs mois h - - 2 9 ° C et ne perden t pas d'activit6 pendant le temps qne duren t les chromatographies . La f ract ion C ramen~e & pH 7,8 pr6sente une sta- bilit6 variable : de 20 p. cent de perte en 8 jours h 50 p. cent en un jour h + 4°,C. Les 61uats des 6tapes suivantes pe rden t plus de la moiti6 de leur aetivit6 en 24 h h - - 2 0 ° C s'ils sont pr6par6s sans agent s tabi l isant .

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 9.

1010 M. Corg i e r e t H. P a c h e c o .

Nous avons essay6 diff6rents agents stabilisateurs. Leur act ion d6pend du t ra i tement subi par l ' enzyme : ehangement de pH, temps de maint ien h e e pH, di lut ion de t 'enzyme, t aux de pur i f ica- tion. Les r6sultats les plus signifieatifs sont les suivants :

- - le P'LP 10 -5 M protbge l ' enzyme (.fraction B) lors du passage de pH 7,8 fi 5,2 (25 p. cent de perte d 'act ivi t6 au lieu de 80 p. cent sans PLP) mats protbge peu eontre la d6naturat ion due h la dilution.

la s6rum albumine de boeuf, 0,1 mg/ml , uti- lis6e pour conserver la 5 HTP-D de l ' in tes t in de singe [3] augmente l 'aet ivi t6 de diverses f ract ions: C et sur tout D et E ; eomme elle n 'a pas d 'aet ion sur les f rac t ions A e t B, il s 'agit p robablement d 'une am61ioration de la conserva t ion pendant l ' in,cubation ou d 'une r6act ivaf ion de l ' enzyme d6- natur6e mats non d 'une act ivat ion p rop remen t dite. Par contre, la s6rum albumine ne protbge pus cont re la d6naturat ion due au changernent de pH.

1o 9 A

fonc,tion du temps, en pr6sence ou non de coenzyme e t /ou de substrat. La figure 4 mont re que les cin6tiques de d6naturat ion de l ' enzyme par la ehaleur soni d 'o rdre 1.

B --- SPECIFICITE DE SUBSTRATS.

1 °) Trgp tophane , tgrosine.

Le t ryp tophane et la tyrosine ne sont pas d~car- boxyl6s de facon mesurable par l 'homog6'nat de cerveau ent ier ni par la LAD purif i6e 60 fois.

2 °) Hist id ine .

L'aetivi t6 his t id ine-d6carboxylase n'est pas d6- tectable avec l 'homog6nat de eerveau ent ier mats elle est significative dans l 'hypotha lamus [20] : dans nos condi t ions exp6rimentales un homog6nat d 'hypotha lamus au 1/3 dans une solution de saccharose 0,25 M d6carboxyle l 'h i s t id ine h pH 7,8 (V = 18 m n m o l e / m g p r o t 6 i n e / h ) . A pH 6,9 l 'act i- vit6 est de 5 h 10 p. cent inf6rieure. L 'act ivi t6

o 10 2o 3o 4~5 6'0 9'0

- - I 'FJ)TA 10 -a M e t l ' h6par ine 1 p. cent aug- menten t l 'act ivi t6 enzymat ique des f rac t ions D et E. Comme ces substances n 'on t p,as d 'act ion sur les f rac t ions A e t B, il ne s 'agit pas non plus d 'une act ivat ion de l 'enzyme.

- - l ' enzyme fLx6e sur suppor t ch romatograph i - que, en pa r t i cu l i e r hydroxy lapa t i t e et DEAE sephadex perd moins d 'acfivi t6 que l ' enzyme con- serv6e h q- 4°C pendan t le temps de la chromatographic.

b - - S t a b i l i t ~ it la cha leur (figure 4).

Nous avons mesur6 l 'act ivi t6 r6siduelle de Fen- zyme (fract ion B ) h une tcr~p6rature de 45°C en

BIOCHIM1E, 1975, 57, n ° 9.

t en m'~n

Fro. 4. - - Stabilit~ de la LAD (fraction B) la chaleur.

log A : log de ]'activit6 enzymatique r6si- dueHe, en pourcentage de l'activit~ de dfiparL

t : temps, en minutes, de pr6ineubation h 45°C en pr6sence de : • PLP 10-5M q- 5HTP 1t)-5M (eourbe 1) • PLP 10-5 M ~o(m.vbe 1) © 5 HTP 10-5 M (courbe 2~) [] 0 ~c~urbe ~)

h is t id ine d&carboxylase de l 'hypotha lamus est 32 lois plus faible que l '~ctivit6 DO,PA d6.curboxy- lase du cerveau entier. Mats on ne ]a re t rouve pas avec la LAD purifi6e 60 fois : on peut donc penser que la LAD ne d6carboxyle pas l 'his t idine.

3 °) DOPA.

La 5 HTP-D d~carboxyle la DOPA : en testant les diverses f ract ions vis-h-vis des deux substrats, 5 HTP et DOPA, on obtient le mSme taux de pur i - fication. On peut donc penser que 5 HTP-D et DOPA-D sont la mSme enzyme. Ceci re joint les t ravaux de nombreux auteurs, bien que quelques propri~t6s diff6rant avec l ' emploi de Fun ou

L-amh~o-acide aromatique ddcarboxylase ( ~.1.1.28). 1011

l 'autre substrat aient pu faire penser qu ' i l s 'agis- salt de deux enzymes dist inetes E28].

Dans les organes p6r iph6riques , les auteurs [1 2, 3, 25] r appor ten t que le t ryp tophane est ddcar- boxyl6 h une vitesse de 30 h 40 fois in f6r ieure h celle de la DOPA, ce qui, darts le eas du cerveau, est h la l imite de d&tection de nos m6thodes, ia p . tyros ine pas du tout ou h une vitesse de 2 h 30'0 f, ois inf6r ieure ; seules 1'o ,et la m ty.rosi~n.e son~ d6carboxyl6es h des vitesses de l ' o rd re de gran- deur de celle de Ia DOPA. I1 n 'est done pas im- possible que t ryp tophane et tyros ine soient trbs fa iblement d6.earboxyl6s par la LAD du cerveau. Pour l 'h is t idine, il est g6n6ralement admis que deux enzymes la d6carboxylen.t : la LA,D faible- ment, tandis qu 'une autre enzyme serai t sp6ei- fiqne de la d6carboxyla t ion de l 'h i s t id ine [23].

HTP. Ni l 'uddi t ion d,e mercapto6thanol 10 "4 M, ni la concent ra t ion de 1O -6 M en PLP au l ieu de 1'0 -5 M ne le mo.di,fien.i. Dans la t i t t6rature, on t rouve des Km variables avee l 'o r ig ine de l ' enzyme [1, 2, 3] .

b - avec la DOPA comme s u b s t r a t : nous avons d~termin~ le Kin de ]a DL DOPA ~ pH 6,9 en pr6sence de PLP 10-5 M. On observe une inhi- bi t ion pa r excbs de substrat au del/~ de 2.10 -4 M (cf § propri6t6s III). Le Kin est de 2,9 10 -4 M. Ceci est h ra, p p r o c h e r de la va leur trouv~e pour ]e foie de rat : 3.10 -4 M en DL DOPA [27].

TABLEAU II.

Vm et Kin de la LAD du cerveau de rat, ddtermi- n~s sur la traction B avec le DL-5 HTP et la DL-DOPA comme substrats.

(~ - - PROPRI~T~S CIN~TIQUES.

Elles sont mesur6es sur la f rac t ion B.

1 °) pH optimum.

a ~ avec le 5 HTP comme substrat. Le pH optimum a 6t6 d6.termin6 dans le t ampon phosphate 0,05 M entre p'H 7 et 7,9 dans le tampon tris-HCI 0,05 M entre pH 7,8 et 8,9. Dans les deux cas, l 'act ivi td max ima se situe ent re 7,6 et 7,9. Etant donn6 que le pH op t imum varie avec la concent ra- t ion de substrat pour cer ta ines enzymes comme l 'h is t id ine d6carboxylase [29, 20], nous avons v6ri- fi6 qu' i l esi le m6me pour la 5 HTP-D avec les concentra t ions : 1,4.10-6 M e t 10 -4 M.

Le pH op t imum trouv6 dans la l i t t6rature est var iable : 6,8 pour le rein de po rc [25], 7,2 pour le foie de rat [30], 8 pour l ' in tes t in de singe [3], 8,1 pour le re in de cobaye [28], 9 pour l e re in de cobaye [1].

b - - Avec la DOPA comme substrat. La DOPA s 'oxydan t fae i lement /i pH alcalin, nous avons ajout6 au mil ieu du mercapto6thanol 10 -4 M qui la stabilise. Le pH op t imum se situe entre 7,4 et 7,6. I1 est plus 61ev6 que celui t rouv6 par la p lupar t des auteurs, qni l'on,t mes.ur6 sans agent r6dueteur et l ' es t iment entre 6~7 et 7 [1, 3, 28]. L 'aet ivi t6 h pH 6,9 es~ de 1/3 inf6r ieure h celle mesur~e h pH 7,6.

2 °) Kin.

a - - avec le 5 HTP comme substrat : l 'act ivi t6 enzymat ique est l in6aire pendan t 4 heures en pr6- sen ce de P~LP 1.0 :-5 M et 5 HT, P 10-5 M. La courbe de la vitesse en fonct ion de la quanti i6 de substrat suit la lot mich, ael ienne. Dans nos condi t ions exp6- r imentales le Km est de 2,6.10 -5 M pour le DL-5

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 9.

Substrat pH

DL DOPA 6,9 DL 5 HTP 7,8

DOPA rapport

PLP

t0-~M 10-'~M ou 10-aM

Km (Iraction B)

2,9.1O-4M 2,6 10-SM

11,2

Ynl (fraction B) en nmole

produit/mg prot6ines/It

200 160

1,25

3 o) Vm (d6termin6 sur 1.a f rac t ion B) (tableau II).

D - - I N H I B I T I O N DE Izt L A D DE CERVEAU DE RAT

PAR LA SEROTONINE, LA DOPAMINE, X,I~S CATIONS

(DETERMIN~E SUR LA FRACTION B) .

Le 5 HTP a 6t~ utilis6 comme substrat .

I - - INHIBITION PAR L i 5 H T .

1 °) La cr6at inine sulfate (La 5 HT est utilis6e sous forme de cr6.atinine sulfate) n ' i nh ibe pas l ' enzyme m6me h 5..10 .4 M.

2°) . Certains lots de 5 HT et de DA cristallis6es, m6me neufs, pr6sentent une couleur ros6e : ceux- ci semblenl ne pas inh ibe r ta 5 HTP-D ou l ' inhi- bent i r r6gul ibrement : en fait la 5 HT et la DA p rovoqnen t ou augmentent la d6carboxyla t ion (s.pontan6e ,dr 5 HTP et de ta DOPA) (cf § propri6- t6s II 1°). Nous avons donc op6r6 avec un lot de 5 HT par fa i t ement blanc, en pr6sence de mercap- to6thanol 10-4 M.

3 ° ) Pour une concen t ra t ion en PLP = 10-6 M, on fait var ie r la quanti t6 de substrat et d ' inhib i - teur (5 HT). La repr&sentation de Dixon mont re

70

1012 M. C o r g i e r e t H. P a c h e c o .

que la 5 H T est un i n h i b i t e u r c o m p 6 t i t i f de ] 'en- z y m e v is -h-v is du 5 H T P et p e r m e t de ca l cu l e r le Ki de la 5 H T qu i es t de 7.10-~ M. Or le Km du D L 5 H T P est de 2,6 10 -5 M ; si le D 5 H T P n ' es t pas m6tabo l i s6 on p e n t e s t i m e r le Km du L-5 H T P

1,3.10-5 M. La 5 H T a u r a i t a lors une afqinit6 7

p o u r l ' e n z y m e 1,3 - - 5,4 fois p lus fa ib le seule-

m e n t que le 5 H T P . El le p o u r r a i t d o n c avo i r une ac t i on r 6 g u l a t r i c e de sa p r o p r e syn thbse : b i en que, sn r la tota l i t6 des 6 fi 7 t rg/g de ce rveau , la p lus g r a n d e p,artie se t r o u v e dans des s i tes de s tockage , une c e r t a i n e q u a n tit6 se t r o u v e dans le c y t o p l a s m e : d ' au t r e p a r t le 5 H T P est en quan t i t6

p e i n e m e s u r a b l e .

4 °) I n h i b i t i o n p a r la 5 H T = f (PLP) (f igure 5). P o u r une c o n c e n t r a t i o n donn6e de subs t ra t et d i v e r s e s c o n c e n t r a t i o n s de 5 HT, des c o n c e n t r a - t i ons de P L P c r o i s s a n t de 10 -6 ~ 10-5 M d i m i n u e n t l ' i n h i b i t i o n p a r la 5 HT : on peu t d o n c p e n s e r que la 5 H T se c o m b i n e au P L P : le P L P ra jout6 se pap t agean t en t re la 5 HT et l ' e n z y m e , il ne se ra i t a lors pas suff isant p o u r s a tu r e r l ' e n z y m e .

de ch lo ru re s , les ions C1- n ' i n h i b a n l pas la LAD. A la c o n c e n t r a t i o n de 10 4 M, Mg +÷, Mn ÷+ et Fe ÷÷ (oxalate) Fe ,~, A]~+ ne sont pas i n h i b i t e u r s ; Cu ~ i n h i b e l ' e n z y m e de 92 p. cent , Zn ÷÷ de 73 p. cent , NP ÷ de 45 p. cent .

Les ions l o u r d s p e u v e n t ag i r en se c o m b i n a n t aux -SH de la p ro tb ine ou en f o r m a n t un ch61ate avec la base de Sch i f f PLP-5 H T P , s t ab i l i s an t le c o m p l e x e et e m p 6 c h a n t la d 6 c a r b o x y l a t i o n .

E - - P B O P R I E T E S M E T ' r A N T ]~N J E U L E I a Y R I D O X A L

~HOSPnATE (PLP).

I - - A F F I N I T I ~ DU P L P FOUR L'ENZYME.

1 ° ) I n f l u e n c e du P L P s u r la 5 H T P - D en nr~- s e n c e de d i f f d r e n t e s qnan t i t~ s de subs t ra t .

Un 61uat de D E A E ce l lu lose ( f r ac t i on B) est d ia- lys6 p e n d a n t 24 h c o n t r e du t a m p o n p h o s p h a t e 0,05 M p H 7,8 ne c o n t e n a n t pas de PLP.

Quel le que soi t la c o n c e n t r a t i o n de subs t ra t , l ' a d d i t i o n de 0 "h 10 -s M P L P n ' a c c r o i t pas l ' ac t i - vit6 e n z y m a t i q u e qui est s t imul6e h p a r t i r de

V[ ~ HT_~O

o,1

C' k-.-J 5A0-7 10"6

PLPajJout~ 10~-5 en M

Fro. 5. - - In f luence de la quan- titd de PLP ajout~ sur la mtesse de la 5 HTP-D (fraction B) pour di f f~renles concenlrations de 5 HT.

V = vitesse exprim6e en nmolc de 5 HT formic par h. 5 HTP =: 10-5 M.

II - - INHIBITION PAR LA DOPAMINE (DA).

La d o p a m i n e p r 6 s e n t a n t l e m 6 m e p h 6 n o m 6 n e d ' a u g m e n t a t i o n de ta d 6 c a r b o x y l a t i o n spontan&e du 5 H T P et de la D O P A (cf § p rop r i6 t6 s II 1"), nous avons 6 g a l e m e n t op6r6 en p r 6 s e n c e de mer - c a p t o 6 t h a n o l 10 -4 M. De m 6 m e que la s6 ro ton ine , la d o p a m i n e est un i n h i b i t e u r c o m p 6 t i t i f p a r rap- p o r t au 5 H T P . Son Ki est de 1,2'5.10 -4 M.

I I I - - INHIBITION PAR LES CATIONS.

IIs son t e x a m i n 6 s su r F e n z y m e , en u t i l i san t le 5 H T P c o n l m e subs t ra t , g6n6ra t emen t sous f o r m e

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 9.

10 7 et a t te in t un p l a t eau p o u r P~LP 10 -c' et 10-5 M p o u r d6c ro i t r e h p a r t i r de 10 ,4 M.

Nous avons r e p r i s la In6me e x p 6 r i e n c e p o u r une 6ch.elle p lus l imi t6e en c o n c e n t r a t i o n s de P L P (3.10-8 h 7.10 -7 M) : le c o e n z y m e p o u v a n t 6tre con- s id6r6 c o m m e subst ra t , on p o u r r a i t a ins i , h p a r t i r

1 des va leu r s v i tesses , ob t en i r des d r o i t e s - = f

1 (x -b PL I~) ' x ~tant la quant i t6 de c o e n z y m e li6e h

l ' e n z y m e , P L P la quan t i t6 ra jou t4e ; m a i s x n ' e s t

L-amino -ac ide a r o m a t i q u e d~.carboxylase (~.1.1.28). 1013

pas n~gligeable devant PLP et on ne p e u t t r a c e r les courbes cor respondantes , d 'oh la n6cessit6 de doser le PLP endog~ne ind6pendamment .

2 °) Dosage du PLP endog~ne par spectrofluori- m~trie.

Le I>LP est dos~ scion la m6thode d 'Adams [221. Nous obtenons une valeur de x ----- 2.10-7 M e n PLP dans la solution enzymatique. En por t an t x dans

1 1 - - = f ( ) nous n 'obtenons pas une droite v x + PLP

et nous ne pouvons done en t i rer le Km du PLP. Cela peut s ' exp l iquer pa r le f a r que le PLP endo- gbne n 'a pas forc6ment tes m6mcs caract6r is t iques que le PLP rajout6 : il semble for tement li6 h I 'enzyme [21 ; l 'affinit6 du PLP n'est sans doute pas homog~ne d'ofi l ' impossibi l i t6 de t race r une droite.

3 °) Dilution de l 'enzyme (fraction B).

Un autre argument en faveur de l 'hypoth~se qu 'une par t ie du PLP est fo r tement li6e h l ' enzyme est fournie pa r l ' exp6r ience suivante : la frac- t ion B, non satur6e en eoenzyme (poss6dant

fonct ion de la qn,antit6 d ' enzyme et en fonct ion de la concent ra t ion en P,LP. Le rappor t des activit6s de chaque f rac t ion mesur6es en absence et en pr6- sence de P, LP devra i t donc d iminue r quand la di lut ion augmente, ce qui n 'est pas le cas.

4 °) Action du chlorhydrate de pyridoxal.

A ]a concent ra t ion de 10 -5 M il n ' augmente pas l 'act ivi t6 de 1'enzyme non satur6e en P I P .

I I - D'ECARBOXYLATION SPONTAN~E (DS) DRS S U B S T R A T S .

1 °) Action de dif[drents [acteurs.

Los t6moins, pr6par6s en r emplacan t l ' enzyme par du tampon phosphate , auxquels on ajoute des quantit6s croissantes de PLP, pr6sentent une d6- carboxyla t ion spontan6e du substrat (5 HTP ou DO,PA) qui peut aller jusqu'& 10 p. cent et a{teint un plateau vers 2..10 -3 M PLP.

La DS est provoqu6e ou augment6e par Cu +÷ 10 -4 M de 5'0 p. cent, par la 5 H T et la DA, par t i - cul i~rement quand celles-ci sont sous forme de cr is taux ros6s.

i i i ' %~o5 3,1j o-5 to -4

3.10 -6

5-HTP"

3.1o& "e. M

Fro. 6. - - Vitesse de la 5 HTP-D (fraction B) en fonction de la concentration en 5 HTP pour diff~rentes concentrations de PLP.

V : vltesse exprim6e en nmole de 5 HT/h.

60 p. cent de l 'act ivi t6 mesur6e en presence de PLP), subit des di lut ions successives. Les f ract ions obtenues sont incub6.es en absence et en pr6sence de PLP 10-5 M. Le r appor t des activit6s de chaque f rac t ion en absence et en pr6sence de PLP est le m6me quelle que soit la dilution. Si 1.e PLP endo- g~ne n'6tait pas for tement it6 h l 'enzyme, it se di luerai t dans le mil ieu d ' incubat ion et sa concentra t ion serai t plus faible ; les f rac t ions dilu6es devra iea t alors avoi r une activit6 d iminuan t en

BIOCHIMIE, 1975, 57, n ° 9.

El le est diminu6e dans diff6rentes condi t ions : h pH 6,9 elle est deux fois plus faible qu'h pH 7,8 ; le mercapto6thanol 10 -4 M la r6duit de 100 p. cent si eIle est due h une amine, pa r t i e l l ement si elle est due au PLP concentr6 ; ]a pr6sence d 'homo- g&nats crus ou bouil l is p rovoque une d iminu t ion de 24 h 63 p. cent su ivant leur concen t ra t ion en prot6ines.

Ces observat ions sont en accord avec les tra- vaux de diff6rents auteurs [13, 31, 32, 33, 34].

10'14 M . C o r g i e r e l H . P a c h e c o .

2 °) I n t e r p r d t a t i o n s .

Plusieurs r6actions peuvent expl iquer la DS :

la d6carboxyla t iou simple de la DOPA ou du 5 HTP. De nombreuses r6act ions impl iquan t de faibles concent ra t ions de PLP cn pr6sence d'enzyme peuven t se p rodu i re sans enzyme en pr6- sence de plus grandes quanti t6s de PLP [35]. On peut toutefois se demander si la DS se fait suivant le m6me m6canisme que la d6carboxylat ion enzymat ique 6tant donn6 que les ions Cu ~+ inhi - bent la r6.action enzymat ique naais favoriseut la DS, que le mercapto6thanol 10 _4 M inh ibe la DS mats n ' a pas d'effe~ sur la r6act ion enzymalique.

il se peut qu 'une oxydat ion part iel le de la DOPA favorise la d6carboxylat ion de la DOPA en dopamiue. Si la 5 HT et la dopamine peuvenl oxyder le 5 HTP ou la DOPA, cela pour ra i t expli- qner l ' augmenta t ion de la DS observ6e en leur pr6- sence.

- - l a format ion de m61anine (pour revue, cf r6f. 36). La m61anine se formerai t su ivant te sch6ma suivant : DOPA - )~ dopaquinone - - ~ - l eucodopachrome > dop~chrome - - ~ - 5,6 d ihydroxy- indo le q- CO 2 - - ~ - 5,6 indolequi- none - - ~ - (CsHaO2N) x. Eu fait la m61anine cont ient 6galement une cer taine quantit6 de

pouvant former des m61anines mixtes avec la DOPA, on pourra i t ainsi donner une explicat ion de l 'augrnentat ion de la DS en pr6sence de DA et de 5 HT.

Le fair qu 'une part ie de la DOPA et des com- pos6s conservant un .COOH (dopaquinone, acide 5,6 dihydroxyindole-2 carboxylique) soient inclus dans la m61anine pour ra i t expl iquer que la DS atteigne un plateau. La DOPA ayant d isparu sous d 'autres formes ne serait plus disponible pour donner du C0 2. Cela rejoint les t ravaux de Mac Kowiak et coll. [32].

- - la formation d 'un com, plexe stable entre PLP et DOPA ou 5 HTP (tStraisoquinoline) : le substrat 6tant int6gr6 sans d6carboxylation, cette r6act ion serait une explication possible du plateau obtenu h par t i r d 'une certaine concent ra t ion en PLP.

III - - I N H I B I T I O N S P A R EXCES DE S U B S T R A T ~ T DE

PLP.

1 °) Fai t s e x p d r i m e n t a u x .

a - - avec le 5 HTP comme substrat.

La courbe d 'activitg enzymatique : f (5 HTP) pour diff6rentes quantit~s de PLP allant de 10 -7 h 10~ M (fig. 6) montre que :

8O

4O

o ,

5.1 10

DL -dopa e~

FIG. 7. - - Actioitd de la DOPA-D (fraction B) en fonct ion de la quan- titd de DL-DOPA pour deux concentrations de PLP.

A : activit~ en.zymatique, en nmole de C_,O~ ddgag&

DOPA, de 5,6 d ihydroxyindole , de dopaquinone et d 'acide 5,6 d ihydroxyindole-2 carboxylique. Cela pour ra i t expl iquer qu 'une cer ia ine quanti t6 de CO 2 se d6gage du fait de la cycl isat ion de la DOPA qui donnera i t de la m61anine ou des produi ts in term6diai res . La dopamine (et peut ~tre la 5 HT)

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: pour PLP 10 -~ et 10-5 M l 'activit6 croit avec la concent ra t ion de substrat pour a t te indre nn max imum vcrs 5 H T P : 10 -4 M.

• . pour PLP 10 -7 M (concent ra t ion non saturante de I~LP), l 'activit6 crolt jusqu'~ 5 HTP = 10 -4 M

L-amino-acide aromal ique ddcarboxglase (&l. l .~8) . 1015

pour baisser ensui te : il y a i nh ib i t i on par exc~s de substrat.

• , pour P I P 10 -4 M e t 10 -~ M, l'activi~6 pour les faibles concent ra t ions de substrat est plus faible qu 'avec P, b P 10-6 ou 10 -5 M : il y a inh ib i t ion par exc6s de PLP. Cette inh ib i t ion est lev6e par augmenta t ion de la concen t ra t ion en substrat .

b - - avec la DOPA comme substrat.

La courbe activit6 enzymat ique = f (DOPA) (fig. 7) pour deux concent ra t ions de P I P mont re que :

• pour DL-DOPA = 10=5 M, l 'activit~ est la m6me pour PLP 10-~ M ou 10-z M.

• pour DL~DO,PA = 2.10-4 M, il y a inh ib i t ion par excbs de substrat par rappor t h I~L-OOPA 10-4 M pour P I P 10-6 M mats non pour PLP 10-~ M.

L ' inh ib i t ion pa r exc6s de substrat a l ieu au delh de BL DOPA 2.10-4 M pour les deux concent ra- t ions de P'LP.

I1 semble don,c que l ' i nh ib i t i on par exc6s de substrat , manifeste surtout pour la DOPA, soit r6- versible pa r augmenta t ion du PL,P et que ! ' inh ib i - t ion pa r exc~s de PLP soit r6versible pour de fortes concent ra t ions de substrat. Au lieu d 'une inhi- b i t ion par exe6s de DOPA, on peut penser qu'i l y a insuffisance de PLP pour cette concent ra t ion en DOPA ; de m6me pour l ' i nh ib i t ion par le PLP.

C'est ce qui expl iquerai t que les avis sont parta- g6s sur les inh ib i t ions par exc6s de substrat ou de PLP. Certains auteurs t rouvent une inh ib i t ion par exc6s de PLP [2, 37]. D'autres n 'on t pas observ6 d ' inh ib i t ion par le P I P concentr6 [3, 13]. I) 'autres enfin observent une inh ib i t i on par la DOPA mats pas par l e PLP [38~.

2 °) Plusieurs expl icat ions sont possibles :

a - - La format ion de m61anine ou d ' interm6- diaires, favoris6e par le PLP concentr6 (cf ci- dessus) qui peut agir de deux fa~ons, d 'une par t en eu t r a inan t une d iminu t ion du substrat disponible pour l 'enzyme ; d 'autre part , la L-DOPA m61a- nine, qui n ' i nh ibe 'la DOPA-d6carboxylase qu'~ fortes concentra,tions, peu,t se combiner au P I P pou r former un complexe inh ib i t eu r h plus faibles concent ra t ions [893.

b - - La format ion d 'un comptexe cycl ique entre PLP et substrat ( tdtraisoquinoline) qui se formerai t quand l 'un des deux au moins est concen.tr6, la base de Sehiff pr61iminaire h la forma- t ion du complexe 6rant hydrolys6e quand ils sont en faibles concentr~ations. ~ t6 t ra isoquinol ine pour ra i t 6galement agir de deux faqons : en dimi-

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nuan t de fa~on significative la concen t ra t ion du const i tuant le plus d i lu~ ; de plus le complexe form6 pour ra i t 6tre inh ib i t eu r de l 'enzyme. Bien que cette ra ison soit souvent invoqu6.e dans la l i t t6rature pour expl iquer l ' i nh ib i t ion de la d6car- boxylase par un execs de P'LP ou de DOPA, elle n'est ce r ta inement pas la seule en cause.

c - - I1 se peut que 1.e PLP concentr6 r6agisse avec des r~sidus s amino-lysyles de la prot6ine enzymatique qui ne font pas part ie du site cataly- t ique et produise ainsi un changem,ent de confor- mat ion de la prot6ine avec inactivatio.n. Ce ph6no- mbne a ~t6 d~montr~ pour la D-s~rine d6hy- dratase d'Escherichia colt [41] et pour la phos- phorylase du muscle de lap in [42, 43].

d - - I1 se peut 6galement que le PLP r~agisse avec les groupements -SH de l 'enzyme, about issant ~t une modif ica t ion des s t ructures ter t iaire ou qua- te rna i re et par 1~ h une inact ivat ion.

CONCLUSIO'N.

La LAD du cerveau de rat a 6td purif i6e plus de 1000' lois. Une qnant i t6 suffisante d 'enzyme pure pour ra i t permet t re de p r @ a r e r des ant icorps e t de la localiser par immunof luorescence darts le cerveau avec plus de s f re t6 qu 'avec des ant icorps obtenus h pa r t i r de l ' enzyme d 'organes p6riph6- riques. Cependant la p r6para t ion obtenue en fin de pur i f ica t ion d 'une par t cont ient une quant i t6 de prot6ines trop faibIe pour ~tre d6teet6e en 61ec- trophor6se et affirmer que l ' enzyme est parfai tement pure ; d'autve par t l ' enzyme est t rop ins table pour que ses propri~tds aient toutes ~fd 6tudides sur cette p r @ a r a t i o n finale : l 'activit~ DOPA-D a 6t6 mesur6e jusqu'h la phase finale et on a cons. tat~ un m~me taux de pur i f i ca t ion que pour la 5 HTP-D, ce qui conf i rme les t ravaux de nombreux auteurs. Les autres propri6t6s ont g6'n6rale- ment 6t6 6tudi6es sur une fract ion purif i6e 60 fois (fraction B).

De m6me que la LAD d~t re in de porc, l ' euzyme du cerveau poss6de des groupements -SH, est inhi- b6e pa r cer ta ins ions lourds, a l e m6me poids mo- 16culaire [2j. La non d6carboxyla t ion du Try et de la Tyr peut ~tre due soit au fait que ce ne sont pas des substrats, soit h la l imite de sensibil i t6 de nos m6thodes. Le pH op t imum de la DOPA-D est plus 41ev6 que celui trouv6 darts la l i t t6rature lorsqu 'on op6re en pr6s,ence de mercapto6thanol qui 6rite la d6gradat ion de la DOPA et il se rap- proche alors for tement de celui de la 5. HTP-D.

La LAD dialysee ou par t ie l lement purif i~e re- t ient une par t ie du PLpP qui reste for tement li6e. L 'addi t ion clans le mi l ieu d ' i ncuba t ion de PLP

1016 M. Corgier et H. Pacheco.

e x o g b n e f a i r q u e s a r 6 p a r t i t i o n n ' e s t p a s h o m o -

gbne et qu 'on ne peut d~terminer son Km.

La LAD est inhibbe pa r un execs de PI,P pour de faibles concent ra t ions de substrat et par un exc6s de substrat , par t icu l i6rement de DOPA, pour de faibles concen t ra t ions de PLP.

Elle est inhib6e comp6t i t ivement par la s6roto- n ine et la dopamine. L ' i nh ib i t i on par la s6rotonine est p a r t i e n e m e n t l.ev6e par l ' augmenta t ion de la concen t ra t ion en PI,P.

De fortes concent ra t ions de PLP favorisent ta d6carboxyla t ion spontan6e (DS) des substrats, qui at teint u n maximum, et qui est 6galement augmen- t6e par la s6rotonine, la dopamine, le Cw ÷ et dimi- nu6e par le mercapto6thanol ou par des prot6ines.

La format ion de t6 t ra isoquinol ine g6n6ralement invoqu6e pour expl iquer l ' i nh ib i t ion de la LAD par exc~s de PLP ou de substrat est cer ta inement insu,ffisante ; d 'autres ph6nom6nes tels que la format ion de m~lanines ou de compos6s interm6- diair,es, l ' in te rac t ion du PLP awec des gronpements lysyles ou sulfhydri les peuvent in te rven i r et four- n i r 6galement une expl icat ion de la DS.

R~SUM~.

La L - a m i n o ae ide a r o m a t i q u e d d c a r b o x y l a s e (E.C, 4.1.1.280 a dt~ p~r i f ide p l u s de 100'0 fois , h p a r t i r de t ' h ~ r ~ g ~ n a ~ de cerwe,a~ de ra t , cn plu.sie.urs 6 t apes : eer~trifugation. , DEAE ce l lu lose , CM eellu:h)se, h y d r o - xyl'a.patdte, D ~ A E s~p,h~d.ex.

S.es p rop r i~ tb s o n t 6t6 ~tud, i~es, po.ur ]'a plula.art s u r u n e f~raction i ~ e r m k d d a i r e de, la p~urification, h c ause de l,'inst.ahi,l.it6 de ] '~,nzyme p.urifide mal.gr6 t ' a d d i t i o n d,e d i v e r s a,~ents, s t aJ~ilisan,t:s. L ' e n z y m e ddcarl)oxyl,e F h y d r o x y - 5 i r y p t o p h a n e (5 HTP) et 1.a DOPA clans u n ~a~pp,~rt con .s tan t au co,urs de la t rur i f ica t ion m a i s ne d ~ c a r b o x y l e p,a,s d,e faqon m esurable~ 1.e t r y p t o p h a n e , t,a t y r o s i n e , l ' h i s t i d i n e . L es pH o p t i m u m , Kin, V m on t 6t,6 mes~.r~s ,avec l,e 5 H T P ct 1.a DOPA c o m m e s u b - s t r a t s . L ' e n z y m ~ a u n P M de 115:000, u n p o i n t i s(~61¢c- tricfu~e a, ppa~-en¢ d.e 6,4,-6,5. El le e s t inh~bde p a r la s6roton: ine, 1,a dopam.in, e, cer ta . ins c a t i o n s : Cu ++ ; Fe ~*, Ni *+ p a r le N-6thyl-m~t l~dmide, le s o d i u m dodecyl su l - f a te . Une cert, a i n e q u a n t i t 6 d~e pyridox~al-5 p h o s p h a t e (PLP) re.ste f o r t e m ~ n t l i6e h l ' e n z y m e .

Po.ur des coneent ra , t ion ,s r e l a t i v e m e n t f a i b l e s de s ubs t r a~ , l ' .~nzyme es t i n h i b 6 e p a r exc~s de P L P ; p o u r de s coneen t r a f ion . s f.aib!~s de PLP, l ' enzy r~e es t i n h i - b6e p a r an~ exc6s de s u b s t r a t , p a, r t i e u l i 6 r e m e n t de DOPA.

On o b s e r v e 6g~t~m, en t un.e d6e.arboxyl ,at ion s p o n t a - n6e d e,s s u b s t r a t s qn i a~tteint u n p l a t e a u et qui e~st f a~or i s~e l~ar d, es co .ncen t r a t i ons 6]ev6es de PLP, pax la s~ro~ooine , la dopam. ine , Cu ++ e t r6du i t e p a r le mereap to -~ tha ,no~ e t la pr~s,en,ce d'h~om.og,~nats c r u s o u boui,l l is .

Pl,usi,eu'rs expl, i ,cat ions p.oss~ibl.es de s ph~n ,om~nes de d6earboxyl ,a t i .on spo.ntand~e et d ' i n h i h i t i o n e n z y m a t i q u e pttrr exe6s de P L P et de s u b s t r a t , s on t d.onnSes.

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