méthodes d'extraction et de purification des enzymes
TRANSCRIPT
REPUBLIQUE ALGERIENNE
DEMOCRATIQUE ET
POPULAIRE
MINISTERE DE
L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR
ET DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE
Université
Constantine 1
Institut de la Nutrition, de l’Alimentation et des
Technologies Agro-Alimentaires (INATAA)
Microprojet
Thème:
Méthodes d’extraction et de purification des enzymes
Présenté par :
CHEBIRA Hadjar
MOUSSAOUI Rahima
Année universitaire 2014-2015
5e Année ingénieur
Plan de travail
Introduction
Généralité sur les enzymes
Méthodes d’extraction
Méthodes de purification
conclusion
1878 par Willy
Kuhne
Vient du grec « en zume » et signifie « dans
la levure »
L’industrie
agro-alimentaire
Gluco-amylase
Extraction et purification
Enzyme
Objectif: passer en revue les différentes méthodes d’extraction et de
purification des enzymes industrielles.
Améliorer les
qualité de
l’aliment
Une meilleur
conservation
Augmenter le
rendement et
la pureté
Glucose produit à
partir de l’amidon
enzyme
définition
propriétés
Protéine présentant des propriétés de catalyse
spécifiques d’une réaction chimique du
métabolisme de l’être vivant qui la produit
Biocatalyseurs de nature protéique qui accélèrent une réaction
biochimique et se retrouvent intact en fin de réaction et peuvent
être réutilisées
Les enzymes sont spécifiques, chaque enzyme possède un site actif
décomposer en site catalytique et site pour le substrat
Les enzymes sont sensibles à la température et au PH
De nombreuses enzymes ont besoin de cofacteurs pour fonctionner
(NAD)
enzyme
Classification et
nomenclature
1 • Oxydoréductases
2
3
4
5
6
• Transférases
• Hydrolases
• Isomérases
• Lyases
• Ligases
Selon l’enzyme commission une nomenclature des enzymes basée sur quatre
nombres précédés de EC : EC .1. 2. 3. 4
enzyme
Source
Industrie
Les enzymes jouent plusieurs rôles dans les productions
alimentaires industrielles.
enzymes source Action Usage
LipasesPénicillium
roqueforti,
hydrolyse les lipides en
acides gras et glycérides
Produire davantage de composés
d'arômes dans les fromages et
autres produits laitiers
Amylases
Aspergillus
oryzae
(moisissure)
Bacillus subtilis
(bactérie)
hydrolyse de l'amidon en
sucres solubles
Améliorer la fermentation (pain,
bière)
Clarifier les jus de fruits et de
légumes, etc.
InvertaseSaccharomyces
cerevisiœ
hydrolyse le saccharose
en glucose et fructose
Réduire la cristallisation dans les
sirops et Produire du sucre inverti
Définition :
l’extraction désigne l’action de séparer une enzyme du composé dont elle fait partie.
Cette méthode consiste à libérer l’enzyme de la cellule par éclatement de la paroi ou de
la membrane cellulaire par des procédés mécanique, physique ou chimique.
Pour l’isolement d’une enzyme, il est toujours préférable de choisir une source
enrichie en cette enzyme particulière.
physique
chimiqueMécanique
Méthodes d’extraction:
Choc osmotique
Les cellules sont incubées dans une solution
hypo-osmotique. Cherchant à rétablir
l’équilibre osmotique, l’eau pénètre dans la
cellule et finit par causer une rupture de la
membrane plasmique.
Méthodes mécaniques
Congélation-décongélation
Refroidissement
brusque
La
concentration
du soluté intra
et
extracellulaire
Formation
des cristaux
intra et
extracellulair
e
Cassures
dans la
cellule
Broyage ou agitation avec des abrasifs
Agitation violente Microbilles de verre
désintègre les
microorganismes
avec rupture de la
paroi
Bombe à disruption
La pression force l'azote à se solubiliser dans les liquides.
On libère alors la pression tout d'un coup; l'azote en solution
reprend son état gazeux, forme des bulles à l'intérieur des
cellules et les fait éclater.
Chambre pressurisée
CellulesAzote à haute
pression
Homogénéisateur d'Elvejm de potier
Equipement simple
Pilon sous forme de tige de verre
Des dents sur son bout
La manipulation du pilon se fait manuellement ou
par dispositif mécanique.
Les billes de verre
La suspension se répartit entre les billes, le tout est alors scellé et
on lance la machine, qui fait furieusement tourbillonner les
billes de verre dont l’action abrasive fait de dégrader les
cellules.
Liquide Cavitation Des ultrasons
Sonication
Des aires de compression et raréfaction apparaissent,
et les cavités s’effondrent rapidement.
Les bulles produites dans les cavités sont compressées
à plusieurs centaines d’atmosphère.
Ces chocs constituent les éléments de destruction des
tissus cellulaires.
Méthodes chimiques
Extraction chimique
Consiste à mélanger le produit en solution aqueuse
avec un petit volume de solvant organique dans lequel
il est très soluble.
On agite ensuite vigoureusement le mélange pour
permettre au produit de se déplacer de la phase
aqueuse vers la phase organique, puis on récupère
celle-ci.
Enzymes lytiques
Avec les levures, les plantes, les bactéries, il faut tenir
compte de la paroi cellulaire qui protège la membrane
plasmique.
Pour ceci les enzymes lytiques comme les cellulases,
Pectinases, etc., peuvent être employées pour rompre
les parois de ces cellules.
Extraction liquide-liquide
Extraire un ou plusieurs
constituants
Solvant initial
Solvant d’extraction
Pour lequel le ou les constituants à isoler ont une grande
affinité par rapport au liquide initial.
Les deux solvants A et B sont non miscibles.
Extraction liquide-solide
Se déroule en deux étapes
Consiste en un passage d’un soluté du milieu liquide au
milieu solide
Consiste en une élution du soluté d’intérêt, par un solvant approprié, permettant de rompre les interactions soluté-
matrice de la phase solide
Définition :Est un ensemble d’opérations visant à enlever toutes
les impuretés d’un extrait brut contenant l’enzyme
d’intérêt.
Elle a comme objectifs essentiels d’avoir:
un maximum du rendement de l’enzyme;
un maximum de pureté possible;
un maximum de son activité catalytique.
Méthodes de purification
Méthodes basées sur les différences de solubilité
Méthodes basées sur la taille des molécules
Méthodes basées sur les propriétés ioniques
Méthodes basées sur les différences de solubilité
Précipitation différentielle au sulfate d’ammonium
C’est une technique douce (préserve en générale la structure, et
donc la fonction des enzymes.)
solution protéique
sulfate d’ammonium
déshydratation et précipitation des protéines, induisant ainsi le phénomène de relargage.
Les ions sulfates et ammonium sont petits et neutralisent
efficacement les charges des protéines. Cette méthode devra
être suivie d’un lavage pour éliminer le sel résiduel.
Méthodes basées sur la taille des molécules
DialysePermet de séparer des substances en utilisant leur capacité respective
à franchir les pores d’une membrane de dialyse.
cylindres allongés
fermer aux deux
extrémités
contiennent le liquide à dialyser
« boudin » de dialyse
Il est placé dans un récipient contenant le liquide contre
lequel s’effectue la dialyse ou liquide de contre-dialyse.
Centrifugation
Différences de densité
Un solvant Force de gravité
En effet, si la particule à une densité plus élevée que le fluide
en lequel elle est immergée, elle tend à émigrer en bas, suivant
la direction de force de pesanteur.
Filtration membranaire
Consiste à séparer les particules solides qui se trouvent en
suspension dans un liquide par une membrane, tout en
limitant son colmatage pour obtenir un fonctionnement stable.
On distingue de type de procédés:
filtration tangentielle
filtration frontale
Méthodes basées sur les propriétés ioniques
chromatographie
Est une méthode relativement simple de séparation du
composé désiré de ses impuretés basée sur les différentes
affinités d’un composé à l’égard de deux phases.
L’une, dite stationnaire est emprisonné dans une colonne
ou fixé sur un support et l’autre, dite mobile se déplace au
contact de la première.
Types de chromatographie
Chromatographie par adsorption
La phase
solide
La phase
mobile
constituée d’une résine
adsorbante qui fixe certains
composé en solution par
l’entremise de liaisons de
Van der Waals lorsqu’on
charge la colonne
modifie ensuite les propriétés
de la résine, ce qui force la
désorption des composés qui
y étaient adsorbés et permet
leur séparation
Chromatographie par échange d’ions
Résines échangeuses d’anions (charges +) séparer les composés
chargés négativement.
Résines échangeuses de cations (charges -) séparer les
molécules chargés positivement.
Chromatographie de partage
fonctionne par partage de
solutés entre deux phases non miscibles
Stationnaire
Mobile
Plus la répartition des composés d’un mélange dans la phase
stationnaire est grande plus leur rétention est grande et
inversement.
Chromatographie d’exclusion
Phase stationnaire
(gel ou un réseau
macromoléculaire)
Exerçant un véritable
effet de tamis vis-à-vis
de grosses molécules
Les grosse molécules migrants plus vite que les molécules
de plus faible poids moléculaire qui elles peuvent diffuser
librement dans la phase stationnaire alors que les premières
ne le peuvent pas.
Chromatographie d’affinitéOn utilise ici un système biologique, un ligand ayant
la propriété de fixé spécifiquement une molécule est
lié de façon covalente à la phase solide. Ainsi, au
moment du chargement de la colonne les composés
qui ont une affinité pour le ligand sont fixés alors que
les impuretés sont éliminées.
L’électrophorèse
Le principe de l’électrophorèse repose sur le
mouvement d’un ion à charge dans un champ
électrique.
Si on dépose une espèce anionique, elle migrera
vers l’anode (+) et une espèce cationique migrera
vers la cathode (-).
Ce sont les caractéristiques intrinsèques de l’enzyme cible, qui permettront
de la séparer de ses congénères cellulaires.
Protéine
Des structures
Densité
charge
Masse
forme
retrouve peut-être dans une certaine région de la cellule ou dans une
organelle donnée
certain degré d’hydrophilicité ou d'hydrophobicité*
Tous ces critères peuvent être utilisés dans le choix de la
stratégie de purification.
Une bonne stratégie d’obtention d’une enzyme dans les
meilleures conditions possibles comportera donc le bon choix
du matériel biologique de départ, le choix des techniques
d’extraction les plus adaptées à ce dernier et les techniques de
séparation et de purification adéquates aux propriétés
physico-chimiques de l’enzyme.
REPUBLIQUE ALGERIENNE
DEMOCRATIQUE ET
POPULAIRE
MINISTERE DE
L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR
ET DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE
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Constantine 1
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Technologies Agro-Alimentaires (INATAA)
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Thème:
Méthodes d’extraction et de purification des enzymes
Présenté par :
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