APR 2017

CO-inoculation d’un champignon MYCorhizien à arbuscules (Funneliformis mosseae) avec une BACtérie bénéfique PGPR (Paraburkholderia phytofirmans PsJN)

dans la protection du blé contre l’agent responsable de l’oïdium (Blumeria graminis f.sp. tritici)

UCEIV –ULCO : Maryline MAGNIN-ROBERTRIBP –URCA : Lisa SANCHEZStagiaire Master 2 : Nour El-Houda RAOUANI

1

Master 2 Biologie Intégrative des Interactions Plante Microbe Environnement

2

2Production

Céréalière

mondiale

9.1 milliards d’habitants

2050

Alimentation :3 milliards de tonnes

Union Européenne = 1er producteur mondial

FRANCE= 1er producteur européen (27%)

2

2Production

Céréalière

mondiale

Union Européenne = 1er producteur mondial

= 1er producteur européen (27%)FRANCE

9.1 milliards d’habitants

2050

Alimentation :3 milliards de tonnes

Agent responsable

Champignon biotrophe :Blumeria graminis f. sp. tritici (Bgt)

Production rapide de spores par reproduction asexuée

Dissémination par le vent

Pustules blanchâtresobservées sur feuilles, tiges,épis

Oïdium du blé

Pertes de rendement 10 à 20%

SOLUTIONS ACTUELLES EFFICACES

Lutte chimique

Lutte génétique

3

Problèmes de durabilité Problèmes de pollution de l’environnement

Plan National Ecophyto II

-25% en 20201

-25% en 20252

4

Funneliformis mosseaeCMA : champignon mycorhizien à arbuscules

cultivar de blé phosphore du sol

NM

SZE

Fm

M

Ri

espèces CMA

Mustafa et al. 2016

Taux de mycorhization MHB

MycorhizzaHelper Bacteria Frey-Klett et al. 2007

PseudomonasParaburkholderiaBacillusPaenibacillus...

Paraburkholderia phytofirmans PsJNbactérie rhizosphérique et endophytique

Plant Growth Promoting Rhizobacteria

PGPR

Stimulation de la

croissance de la plante

Protection des plantes par résistance

induite (ISR)

Sessitsch et al. 2005

F. mosseae

0

20

40

60

80

100

*

Nom

bre

de

colo

nie

s

/feu

ille

NM M

Protection contre Bgt

Induction réactions de défense du blé

Mustafa et al. 2017

> 70%

Sharma et Nowak, 1998, Ait Barka et al. 2002, Miotto-Vilano et al. 2016

Protectionla tomatela pomme de terrela vigne

champignons pathogènes

SYMBIOSE BENEFIQUE

Meilleure nutrition de

la plante (eau et éléments

minéraux)

Protection des plantes

6

Funneliformis mosseaeCMA : champignon mycorhizien à arbuscules

Paraburkholderia phytofirmans PsJNbactérie rhizosphérique et endophytique

Meilleure protection du blé contre Bgtavec une double inoculation?Interactions entre 3 organismes

Meilleure compréhension...

(i) influence du CMA sur la capacité de P. phytofirmans PSJN à coloniser les tissus de la plante et à s’y établir

(ii) influence de la bactérisation du blé sur l’efficacité de la colonisation des racines de blé par le CMA

(iii) impacts de la bactérisation du blé associée à une inoculation mycorhizienne chez le blé après 6 semaines de co-culture :

- les paramètres de croissance chez le blé (taille de la plante, nombre de feuilles, longueur...) et les teneurs en pigments photosynthétiques

- sur la protection du blé contre Bgt et induction des gènes de défense (3 gènes cibles) chez la plante en conditions infectieuses

7

P. phytofirmans gfp 2xArrosage du sol

109 CFU/ml

4 semaines 6 semaines5 semaines

Test de colonisationP. phytofirmans PsJN GFP- Culture pasteurienne- Biologie moléculaire

Colonisation par F. mosseae

Mélange (2:1:1)Sable

VermiculitePerlite

+ PGPR

P. phytofirmans gfp 2xTrempage grain

109 CFU/mlCFU: colony forming unit

+ CMAF. mosseae

Blé tendreTriticum aestivum L.

Test de colonisationP. phytofirmans PsJN GFP- Culture pasteurienne- Biologie moléculaire

Colonisation par F. mosseae

Mesure de croissanceDosage de pigments photosynthétiques

B. graminis f.sp. tritici5.105 spores/ml

TEST DE PROTECTION

Suivi expression gènes de défense

à 0, 4, 12 et 24 h après infection par Bgt

Influence du CMA sur la capacité de la bactérie à coloniser les tissus du blé et à s’y établir

Après 4 et 6 semaines, détermination de la présence de la bactérie dans les tissus des plantules de blé (racines et feuilles) P. phytofirmans PsJN gfp 2x

Méthode de culture pasteurienne Observation aux UV

Méthode de biologie moléculaire Amplification d’une partie de séquence ciblée du gène gfp

8

Echantillon témoinP. phytofirmans

PsJN gfp 2X

Pas de détection de la présence de labactérie dans nos essais, quelque soit lamétholodogie employée.

A OPTIMISER

9

M M+B

4ème sem. 6ème sem. 4ème sem. 6ème sem.

Taux de colonisation totale (%)

35±11 37± 41±16 52±8*

Arbuscule (%) 10±5 14±9 18±9 20±5

Vésicules (%) 12±6 12±7 13±6 19±4

Après 4 et 6 semaines, le taux de mycorhization est évalué par coloration au bleu de trypan. Détermination des taux de mycorhization totale, arbusculaire et vésiculaire.

hyphe

vésicule

hyphe

arbuscule

Taux de mycorhization de racines de blé par F. mosseae après 4 et 6 semaines en présence du CMA seul (M) ou en combinaison avec la bactérie PGPR P. phytofirmans PsJN (M+B)

Amélioration de lacolonisation totalede 40% enprésence de labactérie après 6semaines de co-culture.

Influence de la bactérisation du blé sur l’efficacité de la colonisation des racines de blé par le CMA

Amélioration du taux de mycorhizationdes racines d’orge par le CMA Glomusintraradices de 40, 50 et 60% en présencede Pseudomonas fluorescens, deRhizobium leguminosarum etd’Agrobacterium rhizogenes,respectivement. Fester et al. 1999

11

Impacts de la double inoculation du CMA et de la bactérie sur la croissance du blé

Après 6 semaines,aucun effet significatifdes traitements sur lacroissance desplantules de blé paramètres suivis

Gain des teneurs en pigmentsphotosynthétiques pour letraitement combinant le CMA+ la bactérie

Mesure des paramètres de croissance des plantules à – semaines de culture. Les paramètres suivis sont (A) la taille de la plante, (B) le nombre de talles par plante, (C) le nombre de feuilles par plante, (D) la longueur de la feuille 4, (E) la masse fraîche et (F) la masse sèche de la partie aérienne. Conditions testées sont T: Témoin, B: bactérie seule, M: CMA seul, M+B : bactérie + CMA.

T B M M+B T B M M+B T B M M+B

T B M M+BT B M M+BT B M M+B

Teneur en pigments photosynthétiques de la feuille 4 des plantules âgées de 6 semaines. Teneurs en (A) chlorophylles totales, (B) en chorophylle a, (C) en chlorophylle b, (D) en caroténoides. Conditions testées sont T: Témoin, B: bactérie seule, M: CMA seul, M+B : bactérie + CMA.

T B M M+B

T B M M+BT B M M+B

T B M M+B

11

Impacts de la double inoculation du CMA et de la bactérie sur la protection du blé contre Bgt et

l’induction des réactions de défense

Protection du blé observée dans nos conditions deculture par les 3 traitements testés.

Confirmation de la capacité du CMA (F. mosseae) àprotéger le blé contre Bgt autre cultivarsensible Mustafa et al. 2017

heures après infection par Bgt

4 12 24

Expression relative / témoin infecté Bgt

heures après infection par Bgt

Chi1

LOX

POX

4 12 24

Expression relative / témoin infecté Bgt

heures après infection par Bgt

4 12 24

Expression relative / témoin infecté Bgt

B+MB Mheures après

infection par Bgt

Chi1

LOX

POX

4 12 24

Expression relative / témoin non

infecté par Bgt

0.01 1 80

Chi1 induction plus importante à 4h : M et B seuls

LOX induction légèrement plus marquée après 12h

3 gène ciblés : expression induite suite à l’infection par Bgt

POX induction transitoire à 4h : M et B seuls+ répression forte après 12h : M+B

I+B en non-infect.

Niveau expression POX induit (6X)

A

B

T B M B+M

T B M B+M

12

Méthode détection et évaluation despopulations bactériennes dans les tissus de laplante dans nos conditions d’expérimentations

Optimisation

Répétitions des expériences en ajoutant 1 ou 2 cultivars de blé (sensibles à Bgt) protection « généralisable » sur d’autres cultivars dans nos conditions

d’expérimentations ?

Reconduction des expériences

Protection contre d’autres maladies impactantes chez le blé ?+

Septoriose du blé

Fusariose du blé

Modification des métabolismes de la plante suite à l’ajoutdu CMA ± bactérie évaluée par méthodes plus globalestranscriptomique (RNAseq) et de métabolomique

Compréhension

Qualification de « MHB »concernant la soucheParaburkholderia phytofirmans

Approfondir

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Présentation des premiers résultats obtenus sous forme d’affiche

- Journées Jean Chevaugeon 2018, 12èmes rencontres de Phytopathologie et de Mycologie,Aussois, 15-19 janvier 2018

- Journées Jeunes Chercheurs Condorcet J2C2 2018, Amiens, 18-19 janvier 2018- PHLOEME, 1ères biennales de l’innovation céréalière, Cité des Sciences et de l’Industrie, Paris,

24-25 janvier 2018

Journées / Congrès nationaux

- 5èmes Journées Francophones des Mycorhizes (JFM5), Dunkerque, 27-29 juin 2018

Congrès internationaux

Merci de votre attention

Références

Ait Barka et al. 2002. Inhibitory effect of endophyte bacteria on Botrytis cinerea and its influence to promote the grapevine growth. Biol. Control 24 : 135-142.Fester et al. 1999. Accumulation of secondary compounds in barley and wheat roots in response to inoculation with a arbuscular mycorrhizal fungus and co-inoculation with rhizosphere bacteria. Mycorhizza 8, 241-254.Frey-Klett et al. 2007. The mycorrhiza helper bacteria revisited. New Phytol. 176:22-36Miotto-Vilano et al. 2016. Burkholderia phytofirmans PsJN confers grapevine resistance against Botrytis cinerea via a direct antimicrobial effect combinedwith a better resource mobilization. Front. Plant Sci. 7: 1236.Mustafa et al. 2016. Phosphorus supply, arbuscular mycorrhizal fungal species, and plant genotype impact on the protective efficacy of mycorrhizalinoculation against wheat powdery mildew. Mycorrhiza 26: 685-697.Mustafa et al. 2017. Defense mechanisms associated with mycorrhiza-induced resistance in wheat against powdery mildew. Func. Plant Biol. 44: 443-454.Sharma et Nowak 1998. Enhancement of Verticillium wilt resistance in tomato transplants by in vitro co-culture of seedlings with a plant growth-promotingrhizobacterium (Pseudomonas sp. strain PsJN). Can. J. Microbiol. 44: 528-536.Sessistch et al. 2005. Burkholderia phytofirmans sp. nov., a novel plant-associated bacterium with plant-beneficial properties. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55:1187-1192.

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Anissa HADJ-LOUNES SAHRAOUIBenoît TISSERANTMélodie SAWICKIPhilippe REIGNAULTBéatrice RANDOUXNour El-Houda RAOUANI

Lisa SANCHEZEssaïd AIT BARKAChristophe CLEMENT