portage des ehec par les ruminants et effet de … · 2012. 10. 26. · portage des ehec par les...

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PORTAGE DES EHEC PAR LES RUMINANTS RUMINANTS ET EFFET DE PROBIOTIQUES E. FORANO, F. CHAUCHEYRAS-DURAND, Y. BERTIN, C. MARTIN INRA UR454 Unité de Microbiologie INRA, UR454, Unité de Microbiologie, Centre de Clermont-Ferrand/Theix L ll d A i l N t iti Lallemand Animal Nutrition Evelyne Forano Colloque France-Brésil 2012 Des recherches pour l'agronomie, la biodiversité et la santé 17 octobre 2012, Agropolis International, Montpellier

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PORTAGE DES EHEC PAR LESRUMINANTSRUMINANTS

ET EFFET DE PROBIOTIQUESE. FORANO, F. CHAUCHEYRAS-DURAND,

Y. BERTIN, C. MARTIN,

INRA UR454 Unité de Microbiologie INRA, UR454, Unité de Microbiologie, Centre de Clermont-Ferrand/TheixL ll d A i l N t itiLallemand Animal Nutrition

Evelyne Forano Colloque France-Brésil 2012Des recherches pour l'agronomie, la biodiversité et la santé

17 octobre 2012, Agropolis International, Montpellier

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Escherichia coli entérohémorragiques(EHEC)(EHEC)

EHEC (Ali t )EHEC (Aliments)

Lésions A/E (gènes eae)

Adhésion à l'épithélium intestinal: LEE

Libération de Shiga toxines (Stx)

(gènes stx1, stx2)

Lésions A/E (gènes eae)

Diarrhée aqueuse

(gènes stx1, stx2)

Colite hémorragiqueSyndrome hémolytique et urémique (SHU)

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EpidémiologiePrincipal réservoir ruminant adulte sain

Contamination via excrétion fécaleexcrétion fécale

des EHEC

Définitions

STEC (gènes stx)EHEC = STEC isolé des malades

400 sérotypes Différents sérogroupes

E. coli O157:H7, O103, O26, O111, O113..)

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A l’échelle mondiale-USA : 265 000 infections à STEC par an (~100 000 O157), 30 décèsEpidémies de grande ampleur: -Canada / Mai 2000 : plus de 2000 cas, 27 SHU, 7 décès. + Nombreux casp , ,-Allemagne/ Mai-Juin 2011: 4000 cas, 850 SHU, 58 morts sporadiques

En FranceEn France• Juin 2011 Lille, Steak hachés surgelés, O157, 19 SHU• Été 2011 Bordeaux, Graines de fenugrec germées, O104:H4, 15 personnesÉté 2011 Bordeaux, Graines de fenugrec germées, O104:H4, 15 personnes

infectées, 8 SHU• Juin 2012 Aquitaine, Steak hachés frais, O157:H7, 15 infectés, 9 SHU

Portage

• 2000 : animaux abattoir : 70% STEC (PCR stx+), 34% STEC (isolement),seulement 0,5% O157:H7

Sources : ANSES InVS CDC ; Pradel et al 2000 ; Auvray et al 2012

seulement 0,5% O157:H7• 2010-11: animaux abattoir: 67% STEC (PCR stx+), 2,3% EHEC (potentielles, isolées)

Sources : ANSES, InVS, CDC ; Pradel et al, 2000 ; Auvray et al, 2012Evelyne Forano Colloque France-Brésil 2012

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Au BrésilPortagePortage• Bovins laitiers et viande, 1999. Rio de Janeiro (Cerqueira et al, 1999)• Vaches laitières, 2005. Sao Paulo (Irino et al, 2005)• Water buffaloes, 2007. Minas Gerais (Oliveira et al, 2007)

Prévalence STEC très variable (0 à 85%), gde diversité STECPrévalence O157:H7 : 0,6 à 1,5 %,

Infections humaines• Très peu de cas identifiés : 2000-02 : 3 cas O103:H2 (enfants) ; qqs cas O157:H7• Incidence infections à O157:H7 et non O157difficile à évaluer (pas d’épidémio-surveillance, peu de laboratoires peuvent rechercher ces souches)• Immunité des Brésiliens due contacts EPEC ?

Approfondir les travaux sur portage et incidence des EHEC au Brésil : Approfondir les travaux sur portage et incidence des EHEC au Brésil : risque existe ; Brésil grand producteur de viande ; exportation vers UE pourrait augmenter dans futur…

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Limiter le portage des STEC

Stratégies de rechercheStratégies de rechercheProbiotiques = outil pour le contrôle du 

portage au niveau de la ferme?p g

Mieux comprendre la physiologie et l’écologie

d EHEC d l t t

Sélectionner et évaluer différentes souches

i bides EHEC dans le tractus gastro-intestinal bovin

microbiennes compétitrices

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Physiologie des EHECen contenu intestinal bovin

Contenu i t ti l/ MM

Méthodologie

EHEC

intestinal/ MM

EHEC O157:H7 EDL933

Analyse transcriptomique Analyse métabolomique

P K12

métabolites produits, sources C et N pouri b té i i ét b li

SM et RMN

Gè i é (192)

Puces K12+ 2 EHEC

croissance bactérienne : voies métaboliquesGènes sur-exprimés (192)

Identifier les voies métaboliques utilisées par les EHEC dans les conditions physiologiques pour leur survie et leur croissance

stratégies nutritionnelles pour limiter le portage

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Physiologie des EHECen contenu intestinal bovin

Serine EthanolamineSerine Ethanolamine

Sources d'azoteen contenu intestinal bovin

Serine Ethanolamine

eutH x 2sdaC x 3.1

eutB x 1 8sdaA x 2.9sdaB x 1 7

Serine Ethanolamine

eutH x 2sdaC x 3.1

eutB x 1 8sdaA x 2.9sdaB x 1 7

Tryptophane Pyruvate AcetaldehydeTryptophane

NH3 NH3 NH3

tnaAx 23

tnaB

x 3.6

eutB x 1.8eutC x 2.6

sdaB x 1.7tdcG x 1.7

Tryptophane Pyruvate AcetaldehydeTryptophane

NH3NH3 NH3NH3 NH3NH3

tnaAx 23

tnaB

x 3.6

eutB x 1.8eutC x 2.6

sdaB x 1.7tdcG x 1.7

Induction du l t E t

Asparagine Asparagine Aspartate Fumarate

NH3 NH3putP

x 1.4asnB

x 2.1aspAx 4.6

Asparagine Asparagine Aspartate Fumarate

NH3NH3 NH3NH3NH3putP

x 1.4asnB

x 2.1aspAx 4.6

cluster EutUtilisation éthanolamine

cellules épithéliales alimentAspartate

Glutamate

Proline

dctA

x 5.1

proXVW x 2 2 3

putA x 1.6AspartateGlutamate

Proline

dctA

x 5.1

proXVW x 2 2 3

putA x 1.6

• Expression des gènes

cellules épithéliales, aliment

Proline

proXVW x 2-2.3

Proline

proXVW x 2-2.3• Compétitions nutritionnelles• Analyses biochimiques

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Voies métaboliques exprimées dans le contenu digestif bovin

O2

EDL933

O2

EDL933

O2

EDL933

O2

EDL933

g

M9

O2

39°C without shaking

BICM9

O2

39°C without shaking

BIC M9-GlucM9

O2

39°C without shaking

BICM9

O2

39°C without shaking

BIC M9-Gluc

L'éth l i ' t U t t i bl d' tili• L'éthanolamine n'est pas consommée par le microbioteintestinal des bovins

• Un mutant incapable d'utiliserl'éthanolamine présente un défaut de croissance dans le contenu intestinal

L'utilisation de l'éthanolamine comme source d'azote confère aux EHEC un avantage nutritionnel compétitif qui contribue à leur survieEHEC un avantage nutritionnel compétitif qui contribue à leur survie

dans le tractus gastro-intestinal

Bertin et al 2011 Environ MicrobiolBertin et al., 2011, Environ. Microbiol.Evelyne Forano Colloque France-Brésil 2012

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Physiologie des EHEC en contenu intestinal bovin

L-LactateL-LactateBactéries lactiques

commensales

Sources de carbone

lldDlldD

fucAfucA

lldDlldDlldDPyruvate

lldD x 2,3L-Fuculose1P

x 2,9 x 2,1

aldAL-LactateL-LactateL-Lactaldehyde

manA

fucA

lldDlldD

fucAfucA

lldDlldD

lldP x 2

lldDPyruvate

lldD x 2,3L-Fuculose1P

x 2,9 x 2,1

aldA L-LactateL-LactateL-LactateL-LactateL-Lactaldehyde

manA

fucAL-Fucose

lldDlldD

fucAfucA

lldDlldDlldDPyruvate

lldD x 2,3L-Fuculose1P

x 2,9 x 2,1

aldAL-LactateL-LactateL-LactateL-LactateL-Lactaldehyde

manA

fucA

lldDlldD

fucAfucA

lldDlldD

lldP x 2

lldDPyruvate

lldD x 2,3L-Fuculose1P

x 2,9 x 2,1

aldA L-LactateL-LactateL-LactateL-LactateL-Lactaldehyde

manA

fucAL-Fucose

Mucus intestinal

Citrate

Oxaloacetate

Citrate

Oxaloacetate

y

Glycolysis

mdh Citrate

Oxaloacetate

CitrateCitratex 2Dih d t P

D-Mannose6P Fructose 6Px 2

manA

D-Galactose

α-D-glucose1P

galK

galT

galEgalU

x 1.5

x 1.8

CitrateOxaloacetate

Malatex 2

OxaloacetateOxaloacetate

y

Acetyl-CoAGlycolysis

mdh

Oxaloacetate

Dih d t P

D-Mannose6P Fructose 6Px 2

manA

D-Galactose

α-D-glucose1P

galK

galT

galEgalU

x 1.5

x 1.8

CitrateOxaloacetate

Malatex 2

Mannose

D GalactoseCitrate

Oxaloacetate

Citrate

Oxaloacetate

y

Glycolysis

mdh Citrate

Oxaloacetate

CitrateCitratex 2Dih d t P

D-Mannose6P Fructose 6Px 2

manA

D-Galactose

α-D-glucose1P

galK

galT

galEgalU

x 1.5

x 1.8

CitrateOxaloacetate

Malatex 2

OxaloacetateOxaloacetate

y

Acetyl-CoAGlycolysis

mdh

Oxaloacetate

Dih d t P

D-Mannose6P Fructose 6Px 2

manA

D-Galactose

α-D-glucose1P

galK

galT

galEgalU

x 1.5

x 1.8

CitrateOxaloacetate

Malatex 2

Mannose

D Galactose

UtilisationSucres mucus

AspartateAspartate

aspAx 4,6

Isocitrate

toglutarate

Malate IsocitrateMalate

glutarate

Aspartate

x 5,8

Glycerol

sn-Glycerol3PglpK

glpD

glpF

Aspartate

Isocitrate

toglutarate

MalatefumA

Isocitrate

toglutarate

Malate Isocitrate

toglutarate

Malate TCA

x 5

DihydroxyacetoneP

sdhC

D-Ribulose1P

fucAx 2,9

D-GalactoseIsocitrate

Fumarate

Succinate

Oxo-glutarate

Malate

x 2,5

Succinyl-CoA

x 4,2TCA cycle

AspartateAspartate

aspAx 4,6

IsocitrateIsocitrate

Aspartate

x 5,8

Glycerol

sn-Glycerolsn-Glycerol 3PglpK

glpD

x 3,6

glpF

Aspartate

IsocitratefumA

IsocitrateIsocitrateTCA

x 5

Dihydroxyacetone P

sdhC

D-Ribulose1P

fucAx 2,9

D-GalactoseIsocitrate

Fumarate

Succinate

Oxo-glutarate

Malate

x 2,5

Succinyl-CoA

x 4,2TCA cycle

D-GalactoseD-Arabinose

Glycerol AspartateAspartate

aspAx 4,6

Isocitrate

toglutarate

Malate IsocitrateMalate

glutarate

Aspartate

x 5,8

Glycerol

sn-Glycerol3Psn-Glycerol3PglpK

glpD

glpF

Aspartate

Isocitrate

toglutarate

MalatefumA

Isocitrate

toglutarate

Malate Isocitrate

toglutarate

Malate TCA

x 5

DihydroxyacetoneP

sdhC

D-Ribulose1P

fucAx 2,9

D-GalactoseIsocitrate

Fumarate

Succinate

Oxo-glutarate

Malate

x 2,5

Succinyl-CoA

x 4,2TCA cycle

AspartateAspartate

aspAx 4,6

IsocitrateIsocitrate

Aspartate

x 5,8

Glycerol

sn-Glycerolsn-Glycerol 3PglpK

glpD

x 3,6

glpF

Aspartate

IsocitratefumA

IsocitrateIsocitrateTCA

x 5

Dihydroxyacetone P

sdhC

D-Ribulose1P

fucAx 2,9

D-GalactoseIsocitrate

Fumarate

Succinate

Oxo-glutarate

Malate

x 2,5

Succinyl-CoA

x 4,2TCA cycle

D-GalactoseD-Arabinose

GlycerolCellules

épithélialesx 5.1dctA

Aspartate Succinate

x 5.1dctA

Aspartate SuccinateAliment

è Microbiote résident• Expression des gènes• Compétitions nutritionnelles• Analyses biochimiquesy q

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Voies métaboliques exprimées dans le contenu digestif boving

4

5

tes (

mM

0.8

mM

A) B)

4

5

tes (

mM

0.8

mM

A) B)

Microbiote

2

3

4

-der

ived

car

bohy

drat0.4

0.6

***

***

***2

3

4

-der

ived

car

bohy

drat0.4

0.6

***

***

***

MicrobioteE. coli com

EHEC

MicrobioteE. coli comEHEC

0

1

0 1 2 3 4 5 6Time (hours)

Tota

l muc

us-

0.0

0.2

Fuc Gal Man GalNAc GlcNAc NeuAc

******

**

0

1

0 1 2 3 4 5 6Time (hours)

Tota

l muc

us-

0.0

0.2

Fuc Gal Man GalNAc GlcNAc NeuAc

******

**

• La souche d’EHEC utilise plus rapidement les sucres du mucus que le microbiote endogène ou une souchecommensale bovine d’E. coli

• Tous les sucres sont utiliséssimultanément

Time (hours)Time (hours)

L'utilisation de sucres issus de mucus bovin comme source de C confère aux EHEC un avantage nutritionnel compétitif qui contribue àconfère aux EHEC un avantage nutritionnel compétitif qui contribue à

leur survie dans le tractus gastro-intestinal

Bertin et al 2012 Environ MicrobiolBertin et al., 2012, Environ. Microbiol.Evelyne Forano Colloque France-Brésil 2012

Des recherches pour l'agronomie, la biodiversité et la santé17 octobre 2012, Agropolis International, Montpellier

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Effet de ProbiotiquesEffet de Probiotiques

• Bactéries lactiques (Lactobacillus acidophilus,…)• Levures (Saccharomyces cerevisiae,…)( y , )• Bactéries de la flore autochtone

Sur la croissanec et la survie des STEC

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Survie des EHEC dans contenus de rumen, intestinaux et fécauxrumen, intestinaux et fécaux

Méthodologie

• Effet du régime• Avec/sans microbiote

JR, JI ou susp fécale

commensal• Avec probiotiques

EHEC5.105 cfu/ml

Rôle fondamental du microbiote digestif

nutritionDégradation/fermentation des aliments

santé Morphologie du TDg

Apport de nutriments essentiels Élimination de molécules toxiques

p gSystème immunitaire

Barrière aux pathogènes

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Survie/croissance de souches EHEC dans le contenu ruminal et intestinaldans le contenu ruminal et intestinalRumen

8

9Contenu intestinal caecal

4

5

6

7

Log

cfu/

ml

7,00

8,00

cfu/

ml

6

7

8

g cf

u/m

l

1

2

3

4

EDL933

EDL933 + L. acidophilus 5,00

6,00

Log

c

4

5

6

Lo

Culture statique en anaérobiose de 24h

00 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Time (h)

4,00EDL933 AR1 AR2 AR3 AR4 AS1 AS2 AS3 AS4

STEC sensibles à l’acidité

4

EDL933 AR1 AR2 AR3 AR4 AS

S2h 8h

• EDL933 persiste 12 h dans le fluide ruminal, puis déclin et mortalité de 100% à 18h (dû pH acide et forte concentration AGV).

• Les STEC se développent dans le contenu intestinal et caecal• recherche de souches capables d’inhiber leur croissance

• En présence de Lactobacillus acidophilus (ou levure) EDL933 n’est plus détectée à 15h

Chaucheyras-Durand et al 2010 AEM

d’inhiber leur croissance

Chaucheyras Durand et al. 2010, AEMEvelyne Forano Colloque France-Brésil 2012

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ConclusionsLe rumen est un compartiment critique pour le contrôle du développement des STECdu développement des STECS.cerevisiae I-1077 et L.acidophilus BT-1386 augmentent la mortalité de STEC dans du contenu ruminalruminalLes STEC se développent dans le contenu intestinal et dans le contenu fécalDans l’intestin les EHEC utilisent des sources de C etDans l intestin les EHEC utilisent des sources de C et N plus efficacement que le microbiote endogène : avantage compétitif?P bi ti til l t ôl d tProbiotiques = outil pour le contrôle du portage au niveau de la ferme?Effet direct (métabolites inhibiteurs, ou compétition) et/ ou effet médié par la flore digestive ?

Comprendre les mécanismes

15

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Merci pour votre attentionThank you for your attentionThank you for your attention

ObrigadaObrigada

Questions ?QEvelyne Forano Colloque France-Brésil 2012

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