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Place de la bactériologie dans l’évaluation du statut sanitaire
Animaleries rongeurs
Christine Médaille, Dr vétérinaire,diplômée du collège européen
de biologie cliniqueLaboratoire Vébiotel
Plan
• Mise en perspective
• Définitions et terminologie
• Qui chercher, comment et où ?
• Limites et robustesse des méthodes
Mise en perspective : pourquoi la pourquoi la recherche de bactéries ?recherche de bactéries ?
Médecine vétérinaire individuelleMédecine vétérinaire individuelle : mise en évidence d’un agent infectieux, évaluation de sa pathogénicité, détermination des anti-infectieux utilisables, contrôle de son éradication.
Médecine de groupe : Médecine de groupe : dépistage d’un agent infectieux latent dépistage d’un agent infectieux latent ou en phase infraclinique dans le but d’une éradication de la ou en phase infraclinique dans le but d’une éradication de la ou en phase infraclinique dans le but d’une éradication de la ou en phase infraclinique dans le but d’une éradication de la maladie ou d’un contrôle de son extension dans le groupemaladie ou d’un contrôle de son extension dans le groupe
Cas particulier d’une animalerie de recherche : Cas particulier d’une animalerie de recherche : notion notion d’interférence avec les résultats d’un essai de façon directe d’interférence avec les résultats d’un essai de façon directe ou indirecte.(Baker: Naturel ou indirecte.(Baker: Naturel pathogenspathogens of of laboratorylaboratory animalsanimals))
Interférence avec la recherche
même en l’absence de signes cliniques ou pathologiquesinfluence directe ou indirecte
1.1. impact sur les études en immunologie, impact sur les études en immunologie, reproduction,oncologiereproduction,oncologie
2.2. inhiber l’induction du modèle animalinhiber l’induction du modèle animal2.2. inhiber l’induction du modèle animalinhiber l’induction du modèle animal3.3. entraîner des difficultés d’interprétation des résultats entraîner des difficultés d’interprétation des résultats
finauxfinaux4.4. générer des modifications dosesgénérer des modifications doses--dépendantesdépendantes5.5. induire des variations dans un groupeinduire des variations dans un groupe
Et ce malgré la présence d’un groupe témoin ou contrôle
Buts de l’examen bactériologique en animalerie de recherche Buts de l’examen bactériologique en animalerie de recherche
Prévenir l’impact de la présence d’un agent infectieux Prévenir l’impact de la présence d’un agent infectieux (bactérie ou virus ou parasite)(bactérie ou virus ou parasite)
Etablir un diagnostic sur un maladeEtablir un diagnostic sur un malade
Mais le statut microbiologique de la colonie est plus Mais le statut microbiologique de la colonie est plus important que le statut d’un animal particulier:sentinelleimportant que le statut d’un animal particulier:sentinelle
Etablir un diagnostic sur un maladeEtablir un diagnostic sur un malade
Définitions et terminologie
Infection versus maladieInfection versus maladie
•• Présence d’un microorganisme dans un animal Présence d’un microorganisme dans un animal •• Présence d’un microorganisme dans un animal Présence d’un microorganisme dans un animal ou une colonieou une colonie
•• Apparition de signes cliniques liés à la présence Apparition de signes cliniques liés à la présence de cet agent microbiende cet agent microbien
•• Commensal : présent sans impact négatif sur l’hôteCommensal : présent sans impact négatif sur l’hôte
•• Saprophyte : incapable de déclencher une maladieSaprophyte : incapable de déclencher une maladie
•• Symbiote : impact positif sur l’hôteSymbiote : impact positif sur l’hôte
Différentes pathogénicités
•• Symbiote : impact positif sur l’hôteSymbiote : impact positif sur l’hôte
•• Opportuniste : pathogène facultatif/ besoin d’un Opportuniste : pathogène facultatif/ besoin d’un
déclencheurdéclencheur
•• Pat. obligatoire : responsable d’une maladie si présentPat. obligatoire : responsable d’une maladie si présent
FloreFlore
1.1. Il existe une flore naturelle des muqueuses et de la Il existe une flore naturelle des muqueuses et de la
peau chez les mammifères : elle est constituée de peau chez les mammifères : elle est constituée de
bactéries commensales et de bactéries éventuellement bactéries commensales et de bactéries éventuellement
opportunistes : opportunistes : définir «définir « vos opportunistesvos opportunistes »?»?
2.2. Ces bactéries sont responsables d’une «Ces bactéries sont responsables d’une « infection infection 2.2. Ces bactéries sont responsables d’une «Ces bactéries sont responsables d’une « infection infection
maladiemaladie » en cas de rupture des défenses naturelles de » en cas de rupture des défenses naturelles de
l’hôte : l’hôte : définir «définir « vos animaux fragilesvos animaux fragiles »?»?
3.3. Des infections infraDes infections infra--cliniques chez les rongeurs cliniques chez les rongeurs
sauvages mais doivent être absentes en recherche : sauvages mais doivent être absentes en recherche :
continuer à rechercher des continuer à rechercher des «« pathogènespathogènes vrais»vrais»
Une bactérie peut être solitaire Une bactérie peut être solitaire
L’impact de la présence d’une bactérie sur l’expérimentation L’impact de la présence d’une bactérie sur l’expérimentation est difficile à connaître ou à évaluer :est difficile à connaître ou à évaluer :
«« méchancetéméchanceté » d’une bactérie» d’une bactérie
•• Facteurs intrinsèques = pathogénicitéFacteurs intrinsèques = pathogénicité
•• Facteurs environnementauxFacteurs environnementaux
•• Facteurs individuelsFacteurs individuels
•• Facteurs inhérents à l’expérienceFacteurs inhérents à l’expérience
F. intrinsèque : la pathogénicité
•Notion de pression bactérienne : Bordetella bronchiseptica (x10 3)
•Virulence différente des souches de Clostridium piliforme
•Co-infection : M. pulmonis et CAR bacillus , P.pneumotropica
Facteurs environnementaux
VentilationVentilation
NH3NH3ratsrats
infections respiratoires à infections respiratoires à Mycoplasma pulmonisMycoplasma pulmonis
Déficit en vit A ou EDéficit en vit A ou E ratsrats Mycoplasma pulmonisMycoplasma pulmonis
Acidification eau de Acidification eau de boissonboisson
toustousdiminue prévalence de diminue prévalence de
Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa
Ventilation insuffisanteVentilation insuffisanteAnx immunoAnx immuno--
déprimésdéprimés
Maladies respiratoires à Maladies respiratoires à Staphylococcus xylosus ou Staphylococcus xylosus ou Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa
Déficit vitamine CDéficit vitamine C cobayescobayesInfections cliniques à Infections cliniques à
Streptococcus et Klebsiella spStreptococcus et Klebsiella sp
Déficit en FerDéficit en Fer ratsrats Streptococcus pneumoniaeStreptococcus pneumoniae
Glucose et arachide :Glucose et arachide :
Effet protecteurEffet protecteursourissouris
Développement Développement
Maladie de TyzzerMaladie de Tyzzer
Caséine :Caséine :
Effet délétèreEffet délétèresourissouris
Développement Développement
Maladie de TyzzerMaladie de Tyzzer
Facteurs individuels et expérimentaux
1. Statut génétique : abcès des souris nude
(Staphylococcus aureus, Pasteurella, Citrobacter, Morganella, Streptococcus…
2. Age : sevrage des rats et Maladie de Tyzzer…
3. Sexe : cobaye femelle et Streptoccocus C ;3. Sexe : cobaye femelle et Streptoccocus C ;mâle non castré de souris et Citrobacter rodentium1. Expérience : infections post-chirurgicales
(Staphylococcus, Pseudomonas,E coli…)2. Immunodéficience expérimentale : passage d’un état
latent à un état clinique
Echantillonnage
1. Population de référence : souris Nude, animal en sevrage
2. Calcul de la taille de l’échantillon : dépend de la prévalence de la maladie dans la colonieprévalence de la maladie dans la colonie
3. Fréquence : variable suivant les besoins
4. Unité de lieu : une cage, une salle, une unité ?
Transport et demande d’analyse
1. S’assurer de la possibilité de réception assez tôt
2. Maintenir les conditions de départ pendant le transport
3. Rester joignable à la réception et après
4. Joindre des informations utiles
Etapes du prélèvementEtapes du prélèvement
1. Conserver « la barrière » le plus longtemps possible
1. Avoir une procédure d’autopsie et de prélèvement, la 1. Avoir une procédure d’autopsie et de prélèvement, la remettre en question
2. Avoir un personnel qualifié en terme de stérilité
3. Avoir un personnel formé en terme de risques
Où prélever pour trouver quoi ?
Corynebacterium, Pasteurella, Pseudomonas, Staphylococcus,
Streptococcus
Bordetellla, Pasteurella, Pseudomonas, Streptobacillus,
Streptococcus, Klebsiella
Staphylococcus, Pseudomonas, Corynebacterium
Chez les malades : Bordetella, Corynebacterium,Klebsiella,Streptococcus, Pseudomonas
Où prélever pour trouver quoi ?
Où prélever pour trouver quoi ?
Bordetellla, Pasteurella, Pseudomonas, Streptobacillus,
Streptococcus, Mycoplasma
Corynebacterium kutscheri, Escherichia coli, Pasteurella,
Streptococcus
Campylobacter, Citrobacter, Escherichia coli, Klebsiella,
Salmonella, Yersinia, Helicobacter
Où prélever pour trouver quoi ?
Prélever chez soi
• Affections cutanées• La désinfection de la surface cutanée sur le
site de prélèvement est déconseillée car elle tue les germes pathogènes autant que les contaminants.
• vésicules : aspiration du liquide vésiculaire• ulcérations : grattage du plancher• pustules : ouverture au scalpel stérile et • pustules : ouverture au scalpel stérile et
grattage des parois
• auriculaires : écouvillonnage profond après avoir enlevé le cérumen superficiel
• Pour les lésions cutanées profondes, il est possible de prélever une petite biopsie et de l’ensemencer en bouillon d’enrichissement.
Pus
aérobie et anaérobie
• Collections purulentes•• Lorsqu'on a affaire à un abcès circonscrit, il est
préférable après débridement chirurgical de prélever un morceau de la paroi de l'abcès ou d'écouvillonner les parois .
aérobie et anaérobie
• Les collections purulentes dans les grandes cavités sont aspirées à la seringue après préparation aseptique du site de ponction et transportées rapidement au laboratoire .On évitera d'introduire tout volume d'air dans la seringue pour pouvoir rechercher les germes aérobies et anaérobies
Poumons
aérobie et anaérobie
Affections pulmonaires• Seuls les lavages bronchoalvéolaires
sous fibroscopie ou par voie transtrachéale permettent le diagnostic bactériologique (ou mycologique) des infections pulmonaires.
• Les expectorations ou les écouvillonnages de gorge sont la plupart du temps ininterprétables en médecine des carnivores.
• Les biopsies pulmonaires, quand elles sont réalisables sont supérieures en qualité.
Urines
aérobie et anaérobie
• La qualité du diagnostic bactériologique des infections urinaires des carnivores domestiques est conditionnée plus que tout autre par la qualité du prélèvement. Les urines doivent être recueillies de façon stérile soit par cystocentèse, soit par soit par cystocentèse, soit par cathétérisme soigneux et conservées immédiatement à 4°C .
• Les urines prélevées par palpation-pression et élimination des premiers jets présentent l'inconvénient d'être potentiellement souillées par la flore urétrale ou vaginale.
Causes d’erreurs fréquentes
aérobie et anaérobie
1) le volume de l’échantillon est insuffisant :
• il faut préférer l'envoi de plusieurs millilitres d'un liquide pathologique à celui d'un écouvillon trempé dans le même liquide
2) le prélèvement est contaminé par des germes extérieurs :
3) un traitement antibiotique est déjà en place : il est recommandé de faire une "fenêtre" thérapeutique de 48 h avant d'effectuer le prélèvement
Conservation
aérobie et anaérobie
• La condition idéale est l'ensemencement immédiat de l'échantillon associé à la réalisation d’un frottis du site prélevé.
• Utilisation des écouvillons• L’écouvillon banal en bois et coton cardé sec
n’assure aux germes qu’une durée de vie inférieure à 30 minutes. Son utilisation pour les envois différés au laboratoire peut être responsable de cultures faussement négatives par assèchement
. Il est préférable d’utiliser des écouvillons en matériau neutre (dacron, polyester et alginate de calcium) associés à des milieux dits de transport (type Amies ou Stuart) dont la composition peut varier suivant le fournisseur ou l'agent infectieux recherché (aérobie, par assèchement infectieux recherché (aérobie, anaérobie, germe fragile) et transportés à température ambiante.Ces milieux permettent la survie des bactéries avec une croissance minimum indispensable pour la conservation des prélèvements polymicrobiens.
Transport
aérobie et anaérobie
• Envoi des prélèvements par la posteLe prélèvement ne doit pas dépasser un
volume de 50 ml, placé dans un récipient correctement clos d'où les liquides ne peuvent s'écouler,
ce container est placé à l'intérieur d'un autre emballage, l'espace entre les deux étant comblé par des matériaux absorbants et antichocs
Etapes de l’analyse bactériologiqueEtapes de l’analyse bactériologique
1. Déroulement temporel de l’analyse
2. La technique de mise en culture2. La technique de mise en culture
3. Les différentes croissances bactériennes
4. Les autres méthodes de dépistage
Déroulement de l’analyse
1. Mise en culture2. Repiquage 3. Deuxième lecture et
deuxième jourpremière lecturerepiquage
deuxième jourpremière lecturerepiquage
deuxième jour première lecturerepiquage
premier jour : ensemencement
3. Deuxième lecture et lecture des repiquages
4. Tests d’identification5. Lecture des
identifications6. Conservation éventuelle
quatrième jouridentifications
tests complémentaires
troisième jourdeuxième lecturerepiquageidentification
repiquage
quatrième jouridentifications
tests complémentaires
troisième jourdeuxième lecturerepiquageidentification
repiquage
quatrième jouridentifications
tests complémentaires
troisième jourdeuxième lecturerepiquageidentification
repiquage
Mise en culture et repiquage
•• Choix des milieuxChoix des milieux : sélectifs et non sélectifs•• EnrichissementEnrichissement préalable ?•• TempératureTempérature et atmosphère d’incubation
Enrichissement
•• Enrichissement non sélectifEnrichissement non sélectif : gélose enrichie
•• Enrichissement sélectifEnrichissement sélectif : spécimen multimicrobien
Identification bactérienne
• Ne pas sauter d’étapes : gram, oxydase, catalase, coagulase, biochimie…
Identification bactérienne
• Résultat d’une gamme : intervalle de confiance en % : Staphyloccocus aureus à 95 %
• Résultat d’un test rapide : ATTENTION !!!
Conservation et identification poussée
• Parfois pas de réponse univoque : existence d’un doute raisonnable
• Nécessité de faire appel à des techniques plus spécifiques
Trois catégories de bactéries
• Les bactéries à croissance facile aérobie
• Les bactéries • Les bactéries anaérobies
• Les bactéries ne cultivant pas en gélose classique
Classés suivant leur croissance
• staphylocoques• streptocoques• groupe des
Pasteurelles• groupe des
• Helicobacter• Campylobacter• Streptobacillus
moniliformis
• Clostridium piliforme• groupe des Entérobactéries
• groupe des Pseudomonas et apparentés
• Clostridium piliforme• Mycoplasmes• Leptospires• Lawsonia intracellularis• CAR bacillus• Chlamydiae
Autres méthodes de dépistage
• Sérologie bactérienne : recherche d’anticorps
• Techniques • Techniques moléculaires : PCR classique, PCR en temps réel, séquençage
FAUX POSITIFSFAUX POSITIFS
Contamination externeContamination externe
Contamination interneContamination interne
Erreur d’identificationErreur d’identification
FAUX NEGATIFSFAUX NEGATIFS
Prélèvement inadéquatPrélèvement inadéquat
Quantité insuffisanteQuantité insuffisante
Mise en culture inadéquateMise en culture inadéquate
Limites des tests
Erreur d’identificationErreur d’identification
Faux positifs des techniques Faux positifs des techniques
sérologiques sérologiques
Manque de spécificité de la PCRManque de spécificité de la PCR
Contamination des PCRContamination des PCR
Mise en culture inadéquateMise en culture inadéquate
Identification inadéquateIdentification inadéquate
Temps de culture insuffisantTemps de culture insuffisant
Contamination par Contamination par ProteusProteus
Conséquences diverses
1. La bactériologie ne peut être réalisée dans l’urgence !
2. Le prélèvement pourquoi pas mais l’identification peut prendre du temps !
3. Faux négatifs et faux positifs : existent pour 3. Faux négatifs et faux positifs : existent pour toutes les méthodes !
4. Il faut savoir ce que l’on cherche, analyser ce que l’on trouve, se donner les moyens d’aller plus loin !
5. Dialogue, rigueur et bon sens !
Bibliographie : sites web : pubmed; bactériologie vétérinaire
• Pathology induced by opportunistic agentsin immunodeficient rodents: a case ofRalstonia pickettii -induced- ataxia in mice.
• Marion BERARD1, Christine MEDAILLE 2,• Marion BERARD1, Christine MEDAILLE 2,Meredith SIMON 3, Stéphanie SERRE 4,Kathleen Pritchett-Corning 4, VirginieDANGLES-MARIE 5, 6*
• 1 Institut Pasteur, Paris, France