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A) Introduction

1) Les Staphylocoques

1) Généralités sur les Staphylocoques

      Les staphylocoques appartiennent au règne des bactéries, qui sont des unicellulaires procaryotes (le chromosome n'est pas délimité par une membrane nucléaire) dépourvus de réticulum, de mitochondries et d'appareil de Golgi. Les bactéries peuvent être différentiées par l'application d'une coloration appelée Gram. Les bactéries colorées sont nommées Gram+ et possèdent une couche épaisse de peptidoglycane située au-dessus leur membrane sélective (Fig. 1). Au contraire, les bactéries Gram-, qui ne sont pas ou peu colorées, possèdent une mince couche de peptidoglycane entourée par une membrane interne et une externe rendue perméable par la présence de porines. Ce sont des différences dans la taille et les propriétés du peptidoglycane qui permettent de différentier ces deux types bactériens (Gram-/Gram+) par la coloration.

      

Figure 1 : Structures de la membrane et de la paroi de peptidoglycane chez les bactéries Gram+/Gram-

      Les staphylocoques font partie des bactéries Gram+, sont asporulées, d'un diamètre variant de 0.5 à 1.5 µm, et ont comme particularité de former des amas en forme de grappe. Les bactéries deviennent visibles à l'oeil nu en formant des colonies sur des milieux solides appropriés (boîtes gélosées). Chaque colonie contient des milliards de cellules filles issues d'une cellule originale (ou d'un tout petit groupe de cellules agrégées): on parle alors d'unités formant des colonies (UFC).

      Les staphylocoques sont classés en deux grands groupes que l'on distingue par la production d'un enzyme déclenchant la coagulation du plasma: la coagulase. Le premier groupe comprend les staphylocoques coagulase-positifs dont le représentant principal est Staphylococcus aureus, bien connu pour sa virulence. Le deuxième groupe comprend les staphylocoques coagulase-négatifs (SCN) subdivisés en une vingtaine d'espèces, dont le représentant principal est S. epidermidis.

      S. aureus peut provoquer des infections localisées, résultant souvent de blessures ou de la présence de matériaux implantés. Parfois, les foyers infectieux peuvent disséminer et provoquer des septicémies, des endocardites (infection de l'endocarde), des ostéomyélites (infection du tissu osseux). Malgré un arsenal assez fourni d'antibiotiques et d'antiseptiques puissants, les infections à SCN ou à S. aureus sont toujours présentes et peuvent même causer des mini-épidémies dans les hôpitaux. Ceci s'explique en partie par l'acquisition récente d'un nombre croissant de déterminants de résistances à de multiples antibiotiques. Les souches

résistantes à la méticilline (un ß-lactamine) sont l'exemple typique d'association de déterminants de résistance multiples non apparentés.

2) Aspects cliniques et épidémiologiques des infections causées par S. aureus

a) Introduction

      S. aureus est un pathogène majeur de l'homme causant des infections nosocomiales et épidémiques en milieu hospitalier. C'est le pathogène le plus fréquemment rencontré lors de pneumonies nosocomiales, d'infections de plaies chirurgicales, d'infections de brûlures, d'infections des corps étrangers (valves cardiaques, prothèses de hanche, agrafes, pacemakers, etc.) et d'infections systémiques 1 qui sont souvent dues à l'usage de cathéters intravasculaires ou à la dissémination de la bactérie à partir d'un autre foyer infectieux 136.

      C'est en 1950 que des souches de S. aureus virulentes ont été pour la première fois décrites comme responsables d'infections nosocomiales dans divers hôpitaux 177. Dès 1960, l'introduction de la méticilline a permis de diminuer le nombre d'infections, mais dès les années 70, des souches de S. aureus résistantes à la méticilline sont apparues. Elles se sont par la suite disséminées à travers les hôpitaux provoquant une augmentation des infections nosocomiales à S. aureus 26,115. Ces souches portent l'abréviation MRSA (Methicillin Resistant S. aureus) et sont, comme nous le verrons plus tard, très souvent caractérisées par de multiples déterminants additionnels de résistance à divers antibiotiques/antiseptiques, en plus de la résistance à la méticilline 40,70.

      En 1995, le taux infections nosocomiales dues à S. aureus dans les hôpitaux américains était de 13 % 1. La prévention des infections nosocomiales est aujourd'hui un objectif prioritaire dans la plupart des hôpitaux de façon à réduire les coûts des hospitalisations prolongées chez les patients infectés et ceux dus à l'emploi intensif d'antibiotiques.

b) Les souches MRSA

      Les antibiotiques appartenant à la classe des ß-lactamines s'attaquent à des enzymes appelés PBPs (penicillin binding proteins), qui sont ancrés à la surface bactérienne et qui participent à la biosynthèse du peptidoglycane 182,214. L'élément mec confère à la souche de staphylocoque qui le possède la faculté de résister à l'ensemble des ß-lactamines, dont la méticilline. Les souches MRSA se retrouvent principalement en milieu hospitalier où la pression sélective exercée par l'emploi massif des antibiotiques est importante. Les souches MRSA ont la propriété d'accumuler des déterminants de résistance variés et non reliés (ex: résistance aux ammoniums quaternaires, aux fluoroquinolones etc.).

      Le déterminant de résistance mec se situe sur un élément d'ADN de 30 Kb (l'élément mec) qui s'est inséré dans le chromosome près du gène codant la protéine A 16. Seul environ 10% de l'élément mec contribue à la résistance à la méticilline. L'élément mec est retrouvé dans les souches de staphylocoques coagulase-négatifs et semble avoir été transmis aux souches de

S. aureus par transfert horizontal 7,196. Le produit majeur du déterminant mec est un enzyme nommé PBP2' codé par le gène mecA. PBP2' est caractérisé par une faible affinité pour les ß-lactamines, par contraste avec les autres PBPs impliquées dans la biosynthèse du peptidoglycane. Le gène mecA est régulée par deux gènes appartenant au déterminant mec: le premier agit comme activateur (mecR1) et le second comme répresseur (mecI1) 91,188. Certains gènes appartenant au chromosome de souches sensibles ou résistantes de S. aureus, peuvent affecter le niveau de résistance des MRSA. D'autres gènes impliqués dans la biosynthèse du peptidoglycane influencent fortement la résistance à la méticilline: l'inactivation des gènes femA et femB, qui contribuent au pont transversal pentaglycine, abolit cette résistance alors que l'inactivation des gènes femC et femD diminue partiellement la résistance à la méticilline 191.

      Enfin, il existe des souches ne possèdant pas le déterminant mec, mais exprimant un bas niveau de résistance à la méticilline. Ces souches, aussi appelées 'borderline', sont soit hyperproductrices de ß-lactamase 128, soit expriment des PBPs altérées 192. En clinique ces souches ne sont pas aussi répandues que les MRSA. Leur identification demeure délicate et la recherche du gène mecA, qui code pour PBP2', permet de distinguer les 'borderline' des MRSA.

c) Réservoirs et modes de transmission de S. aureus

i) Les réservoirs de S. aureus

      Les souches de S. aureus sont introduites ou transmises dans les hôpitaux par les patients colonisés ou le personnel hospitalier 31,32,169,178,185,211. Les patients colonisés représentent la source majeure de S. aureus dans les hôpitaux 38,190,212,216 et leur transfert entre différents hôpitaux a provoqué la dissémination de certaines souches 97,106,174. Chez les personnes colonisées on détecte souvent la présence d'un même clone de S. aureus dans la partie antérieure du nez et sur la peau, représentant une source endogène de bactéries pouvant provoquer une infection 38,107,118,212,216 ou permettant leur dissémination sur d'autres patients 69,213. On estime que 20-40% des adultes sains sont porteurs de S. aureus dans le nez 68.

      Les membres du personnel hospitalier représentent un second réservoir à partir duquel S. aureus peut être transmis aux patients 12,25,56,57,81,137,169,178,180,211,215. Ils peuvent être soit des porteurs occasionnels, soit des porteurs permanents 12,57,178,211. Un autre source potentielle de contamination peut être les blouses du personnel ou les surfaces de travail. S. aureus peut survivre plusieurs jours sur des surface souillées 15,54,73.

ii) Modes de transmission

      Le personnel colonisé (mains, narines) travaillant en salle de chirurgie peut directement transmettre une souche au patient 12,32,63,81,178,215.

      Un autre mode de transmission fréquent est la colonisation indirecte du patient par des objets (gants, équipement médical) souillés 2.

      Il existe aussi des possbilités de contamination par voie aérienne impliquant de micro-goutelettes (5 µm de diamètre) ou de particules en suspension (poussière) 2,55,119,210.

d) Les facteurs de risque

      Les facteurs influençant le risque de transmission de S. aureus sont : a) les caractéristiques microbiologique des souches ; b) les facteurs de risque des patients ; c) la politique d'utilisation des antibiotiques ; d) les mesures de contrôle des infections en milieu hospitalier 177.

a) Certaines souches se transmettent plus facilement que d'autres, y compris entre différents hôpitaux 40,124. On a constaté que les souches MRSA qui surexpriment la coagulase ou possèdent plusieurs copies du gène codant la protéine A sont plus souvent la cause d'épidémies 38,80,101.

b) La probabilité pour un patient d'être contaminé par S. aureus augmente avec : i) sa localisation dans une unité à haut risque telles que les soins intensifs, unités des grands brûlés, pouponnières ; ii) une intervention chirurgicale ; iii) une hospitalisation prolongée ; vi) la présence de cathéters ou de biomatériaux implantés 136,190.

c) L'utilisation d'antibiotiques à large spectre augmente le risque de voir l'émergence de germes multirésistants 59,129,157

e) Prévention et contrôle des infections nosocomiales dues à S. aureus

      Un certain nombre de règles (guidelines) ont été introduites dans les hôpitaux pour prévenir les infections à S. aureus. Seules quelques unes d'entre-elles seront abordées ici.

      Beaucoup d'hôpitaux appliquent des mesures drastiques pour réduire la transmission nosocomiale de souches MRSA. Ainsi, les patients colonisés par des souches MRSA sont répertoriés, ce qui permet de les identifier plus rapidement lors d'une nouvelle hospitalisation. Le screening de ces patients se fait par la recherche de S. aureus au niveau nasal ou inguinal 107. Si le screening est positif pour MRSA, un traitement intranasal à la mupirocine peut être tenté en vue d'une éradication. Ce traitement s'applique également au personnel hospitalier colonisé. Dans la plupart des cas les patients sont mis en isolement : le personnel revêt des blouses propres, des gants, des lunettes, des masques (selon le type d'intervention). Le lavage des mains avec une solution antiseptique avant et après les soins est particulièrement recommandé. Le matériel de diagnostic (radio-, echographie, etc.) doit être désinfecté avant et après usage 68. La prévention implique également une sauvegarde (congélation) des souches MRSA récoltées sur les patients. Le typage du MRSA peut être entrepris par la technique de PFGE (pulsed-field gel electrophoresis) pour déterminer si un clone de S. aureus est présent sur différents patients, ce qui offre la possibilité de remonter à la source de la contamination 11,160,186. Finalement, les surfaces sont traitées plus soigneusement et plus efficacement contre les pathogènes

      En cas d'infection, l'antibiothérapie appropriée pour traiter les patients MRSA se limite le plus souvent à la vancomycine. L'utilisation intensive de vancomycine peut contribuer à l'émergence et la dissémination de souches glycopeptides-résistantes qui sont insensibles à la quasi totalité des antibiotiques actuellement sur le marché 68.

2) Caractéristiques microbiologiques expliquant la virulence de S. aureus

1) Phases de croissance in vitro

      La croissance des bactéries dans un milieu liquide (bouillon de culture) se caractérise par plusieurs phases (Fig. 2):

      

Figure 2 : Phases de croissance du staphylocoque in vitro La première (phase « lag », cf. 1) est une phase d'adaptation des cellules à leur milieu. Dans la phase exponentielle (cf. 2), les bactéries se multiplient par divisions

successives selon un temps de génération constant. A la fin de la phase exponentielle, les bactéries entrent dans une phase de transition

(phase post-exponentielle, cf. 3). Finalement, les bactéries atteignent une phase de plateau dite stationnaire (cf. 4). Dans

cette phase, on admet que certaines bactéries meurent alors que d'autres les remplacent.

Après 24 h ou davantage, la viabilité décroît et la culture meurt (cf. 5).

2) Les facteurs de virulence chez S. aureus

a) Les toxines

      

Tableau 1: Principaux enzymes et toxines produits par les Staphylocoques

Toxines Mode d'action Effets biologiques

Leucocidine Toxine formant des pores Lyse les neutrophiles

TSST 1Superantigène-> ; Hyper sensibilité

Activation des leucocytes. Sécrétion des interleukines (Il1, 2 et TNF), choc toxique.

Exfoliative toxine Toxine formant des pores Epidermolyse

-toxine Toxine formant des pores Hémolysines et formation

-toxine Toxine formant des pores de pores dans les

-toxine Toxine formant des pores membranes de nombreux

-toxine Toxine formant des pores types cellulaires

Entérotoxines   Intoxications alimentaires

Coagulase Activation de la prothrombine Formation du caillot fibrineux

Staphylokinase Dislocation des caillots Dissémination de micro-emboles

Nucléase, Lipase, Estérase Hyaluronidase

Hydrolyse de leur substrat respectif (ADN, lipides, ac. Hyaluronique)

Lésions tissulaires, lésions cutanées, lésions du tissu conjonctif

      Les staphylocoques sécrètent une quantité impressionnante de toxines et d'enzymes hydrolysant différents constituants cellulaires. Ces toxines et enzymes extracellulaire (cf. Tableau 1) contribuent à la pathogénie des staphylocoques.

      Les principales toxines sont les hémolysines, la leucocidine, exfoliatine, des entérotoxines, et la toxine de choc toxique TSST-1 206.

      Les principaux enzymes extracellulaires sont la désoxyribonucléase, lipase, phosphatase, protéase, catalase, hyaluronidase, et coagulase.

b) Les adhésines

i) Structure des adhésines

      S. aureus possède des composantes de surface, appelées adhésines, reconnaissant différentes protéines du plasma et/ou de la matrice extracellulaire (Fig. 4). Les adhésines les mieux caractérisées sont celles qui reconnaissent le fibrinogène ou la fibrine, le collagène, ou la fibronectine. La structure commune de ces adhésines qui sont aussi appelées MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) 79,150 est montrée sur la figure 3.

      

Figure 3 : Protéines de Surface de S. aureus : Cna : adhésine du collagène ; ClfA : adhésine du fibrinogène ; FnBP : adhésine à la fibronectine.

      Les MSCRAMMs ont en commun plusieurs domaines 79: une séquence signal (domaine S) en position N-terminale adressant l'adhésine néo-synthétysée au niveau de la membrane plasmique ; en position C-terminale se trouvent des régions hydrophobes W et M séparées par une séquence dont le motif consensus est LPXTG ; l'extrémité C-terminale contient une région chargée positivement. L'adhésine au collagène (Cna) possède un site de liaison à son ligand dans le domaine A. Le nombre de domaines B, qui ne lient pas le collagène, varie de 1 à 4. L'adhésine au fibrinogène (ClfA) contient également un site de liaison au ligand dans le domaine A. Le domaine R, est une région contenant de nombreuses répétitions du dipeptide Asp-Ser permettant l'exposition du domaine A pour permettre l'interaction avec le ligand. Les adhésines à la fibronectine (FnBPA et FnBPB) possèdent un site de liaison au ligand en position C-terminale. Ce site est situé dans la région D contenant une séquence répétée trois fois et partiellement une quatrième fois (d'où son nom de D1-D4) 96.

ii) Maturation des adhésines

      Lorsque l'adhésine arrive au niveau de la membrane plasmique, un enzyme nommé 'signal peptidase' permet la translocation de l'adhésine au travers de la membrane, après clivage du peptide signal (Fig. 3, 4) 79. Le motif LPXTG est reconnu par un enzyme appelé sortase qui va lier covalemment l'adhésine au péptidoglycane pariétal 127,193,194.

      

Figure 4 : Structure et maturation des adhésines

c) Interaction de S. aureus avec la fibronectine

i) Structure de la fibronectine

      Avant de décrire en détail les deux adhésines à la fibronectine, quelques propriétés de la fibronectine seront rappelées. Cette protéine multifonctionnelle de la matrice extracellulaire et du plasma (300 mg/L) est aussi une composante mineure des caillots sanguins. Cette protéine comprend plusieurs domaines fonctionnels ayant chacun une activité spécifique et indépendante des autres domaines (Figure 5).

      

Figure 5: Structure de la fibronectine humaine

      Le domaine amino-terminal est capable de lier plusieurs catégories de macromolécules (fibrine, héparine) et les staphylocoques. Le domaine suivant lie le collagène (gélatine), puis un autre domaine contribue à l'attachement cellulaire par son motif RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser), qui est reconnu par les intégrines des cellules eucaryotes 170. Les deux domaines carboxy-terminaux reconnaissent l'un l'héparine et l'autre la fibrine.

      La structure moléculaire de la fibronectine comprend trois types de séquences répétées. Le type I a une longueur de 45 acides aminés et se trouve aux extrémités de la protéine (N- et C-terminale). Le type II comprend 60 acides aminés répétés deux fois. Le type III a 90 acides aminés et est répété de 15 à 17 fois; une de ces séquences contient le motif RGDS. L'association des chaînes A et B de la fibronectine est réalisée par deux ponts S-S situés à l'extrémité C-terminale de chaque chaîne.

ii) Structure et propriétés des adhésines à la fibronectine (fibronectin-binding proteins : FnBPs)

      Les adhésines à la fibronectine n'ont pas pu être caractérisées aisément par voie biochimique 72,112,172. Leur structure a été déterminée à partir de 1987 par le clonage et séquençage du gène de la première (FnBPA) des deux FnBPs présentes dans la souche de laboratoire 8325-4 183. La deuxième FnBP (FnBPB) a été clonée en 1991 et localisée à la suite du gène codant pour la FnBPA 77.

      

Figure 6 : Homologies entre les protéines FnBP A et FnBP B

      Les deux protéines FnBP présentent des régions hautement conservées, particulièrement dans la séquence de liaison à la fibronectine.

      (Les pourcentages d'homologie sont indiqués entre les régions délimitées par les lignes pointillées verticales).

      S : peptide signal. A, B, C, D : Régions extracellulaires. Wr, Wc : Régions pariétales. M : Région membranaire. + : Région cytoplasmique chargée positivement.

      La comparaison des séquences de FnBPA et FnBPB a montré une grande similarité (Fig. 6).

iii) Mutagenèse des adhésines à la fibronectine

      La mutagenèse par transposition a été utilisée sur la souche 8325-4 de S. aureus pour étudier la contribution des deux gènes fnbA et fnbB dans l'adhérence à la fibronectine déposées sur des lamelles. Des mutants déficients pour une ou pour les deux adhésines à la fibronectine ont ainsi été produits. L'expression des adhésines A et B a été contrôlée par Western Immunoblot (Fig. 7). Les mutants déficients pour une seule de ces deux FnBP conservent leur propriété d'adhérence, alors que le double mutant a perdu toute possibilité d'attachement à la fibronectine immobilisée 85. La complémentation du double mutant avec fnbA ou fnbB cloné sur un plasmide multicopie permet la restauration du phénotype sauvage d'adhérence.

      

Figure 7 : Etude moléculaire et fonctionnelle des gènes fnbA et fnbB de S. aureus

d) Rôle des adhésines dans la virulence de S. aureus

i) Etudes décrivant le rôle des adhésines

      Dans un model canin de shunt artérioveineux (ex vivo), l'adhérence d'un mutant clfA (codant l'adhésine au fibrinogène) aux surfaces exposées au sang est réduite. La complémentation de ce mutant par le gène sauvage clfA permet de restaurer l'attachement de S. aureus au niveau parental 202. De même, dans un modèle in vivo d'endocardite chez le rat, le mutant clfA est moins infectieux 130.

      Dans un model d'arthrite septique, un mutant déficient dans la production de l'adhésine au collagène (Cna, cf. figure 4) s'est montré moins infectieux que son parent producteur de Cna 152.

      Les études in vivo sur le rôle de l'adhésine à la fibronectine dans la virulence de S. aureus sont controversées. Dans une étude, un mutant déficient dans la production de FnBP a été comparé à la souche parentale pour son adhérence à des valves cardiaques 113. Le mutant défectif dans la production de l'adhésine a montré une adhérence beaucoup plus faible que celle du parent ainsi qu'une capacité réduite à induire une infection de l'endocarde. Au contraire, un autre groupe n'a pas trouvé de différences dans l'infectivité du mutant et celle de la souche sauvage 78.

      L'adhérence à la fibronectine a été particulièrement étudiée dans le contexte des infections au matériaux artificiels implantés (ou biomatériaux). Des études ex vivo utilisant du matériel

explanté ont montré le rôle important joué par la fibronectine déposée pour permettre l'adhérence de S. aureus 60,76.

ii) Le rôle des adhésines dans l'infection staphylococcique sur biomatériaux implantés

      L'utilisation croissante des matériaux temporaires (ex : cathéters) ou permanents (ex : prothèses orthopédiques, valves cardiaques) a augmenté la fréquence des infections à staphylocoques 158,159. Ces infections ont souvent des conséquences sévères pour les patients et concernent tous les biomatériaux. Leur guérison est particulièrement difficile si l'implant reste en place 3.

      Lors d'une infection bactérienne, S. aureus reconnaît et s'attache de manière spécifique à des protéines déposées à la surface des biomatériaux qu'il colonise (Fig. 8). Cette adhérence représente une première étape menant à la colonisation, et éventuellement à l'invasion de l'hôte. Les protéines les plus actives pour cet attachement bactérien proviennent du plasma ou de la matrice extracellulaire. Les plus importantes sont le fibrinogène ou la fibrine (éléments du caillot sanguin) 46,89, et la la fibronectine 89,195,199-201. D'autres protéines de l'hôte éventuellement adsorbées sur les biomatériaux pourraient aussi contribuer à l'attachement, mais leur rôle n'a pas été démontré de façon rigoureuse. Parmi ces protéines, la thrombospondine (sécrétée par les plaquettes) 88, la vitronectine 50,117,155, 203, le collagène 92,151,153,154 et la laminine 89 pourraient jouer un rôle important.

      

Figure 8 : L'adhérence de S. aureus à la matrice extracellulaire est une première étape menant à l'invasion (échelle non respectée)

      Un modèle expérimental d'infections sur corps étrangers a été développé dès 1980 par le laboratoire de la DMI pour étudier les caractéristiques de l'attachement bactérien et les mécanismes de défenses de l'hôte. Dans ce modèle, des cylindres perforés en Téflon ('cages') sont implantés sous anesthésie dans l'espace sous-cutanée de cobayes. Quatre semaines après l'implantation et après la phase aiguë de la réaction inflammatoire, un inoculum de 100-1000 bactéries est injecté dans le liquide inflammatoire accumulé dans les 'cages'. Cet inoculum suffit pour déclencher une infection aiguë qui persiste pendant 1-2 semaines. Si l'infection est très importante, la cage est expulsée de l'animal et l'infection à staphylocoques se guérit spontanément (sans traitement antibiotique). Ceci est dû à la disparition du corps étranger.

      Le modèle des 'cages' implantées sous-cutanées, qui se rapproche des conditions d'infections sur implants chez les humains, a fourni trois informations importantes:

1) un faible inoculum de S. aureus ou de S. epidermidis est suffisant pour provoquer une infection chronique.

2) L'infection peut être évitée par l'utilisation d'antibiotiques administrés prophylactiquement, c'est-à-dire avant l'infection. Par contre, l'infection ne peut pas être éradiquée si les antibiotiques sont administrés 12-24 h après le début de l'infection.

3) Les expériences effectuées ont montré que les neutrophiles sont localement déficients dans l'élimination des germes qu'ils ont phagocytés. Ceci s'explique par une diminution de leur production en radicaux oxydants utilisés comme agents bactéricides 52,121,149,225,226.

4) Des lamelles implantées à l'intérieur des cages sous-cutanées ont été recouvertes d'une matrice extracellulaire riche en fibronectine. Le rôle clé de cette fibronectine dans l'attachement de S. aureus a été démontré soit par des anticorps bloquant la fibronectine 200, soit par l'adhérence réduite du double mutant fnbA fnbB comparée à celle de son parent 85.

3) Régulation de la virulence chez S. aureus et réponses au stress chez les bactéries

1) Introduction

      Durant les différentes étapes de croissance, et surtout à la fin de la phase exponentielle, les bactéries doivent continuellement réorganiser l'expression de gènes « housekeeping » et d'autres gènes dits accessoires, qui n'interviennent que dans certaines situations. La figure 8 illustre cette situation, en particulier l'expression temporelle des adhésines et des facteurs de virulence relâchés par S. aureus (toxines, enzymes divers, etc.). Cette expression temporelle de facteurs de virulence est contrôlée par des régulateurs globaux dont les mieux connus sont agr (accessory gene regulator) et sar (staphylococcal accessory regulator). La réaction du « quorum-sensing » dans les populations bactérienne de densité croissante joue un rôle clé dans l'expression temporelle du régulateur global agr.

      Les bactéries possèdent des systèmes très élaborés (réponses aux stress) pour réparer les dommages causés par certains agents physiques ou chimiques qui menacent l'intégrité de l'ADN ou la fonction des protéines. Les bactéries confrontées à un choc thermique produisent

une série d'enzymes (chaperones) contribuant au repliement correct des protéines dénaturées. Les gènes codant pour ces enzymes sont sous un contrôle génétique particulier. Leur région promotrice, caractérisée par des motifs -10 et -35 spécifiques, est reconnue par le facteur sigma B qui est une sous-unité de l'ARN polymérase. Ce facteur sigma est également activé durant la phase stationnaire. Pour la réparation de l'ADN, ce sont plutôt les systèmes SOS et de recombinaison homologue qui sont activés.

2) Les régulateurs globaux de S. aureus

a) Le système agr

      Comme illustré sur la figure 9 on remarque que S. aureus synthétise surtout des adhésines pendant la phase exponentielle, alors qu'il élabore et relâche ses principales toxines et enzymes hydrolytiques pendant la phase post-exponentielle. Le système agr contribue de manière majeure à cette régulation 108,163. En particulier, on constate que la synthèse de protéine A et des FnBPs, qui est prédominante dans la phase exponentielle, est réprimée durant la phase post-exponentielle 108,173. Le contrôle du régulateur global agr a été démontré par l'inactivation de ce locus, qui a produit une dérégulation des protéines de surface. Le contrôle du régulateur global agr sur les toxines et les enzymes hydrolytiques a également été démontré par inactivation spécifique de ce locus. Durant la phase post-exponentielle, les mutants agr perdent la faculté d'exprimer les principales toxines et autres facteurs de virulence sécrétés 47,108.

      

Figure 9 : Expression temporelle des adhésines et des facteurs de virulence de S. aureus.

i) L'organisation du locus agr

      Trois régions promotrices ont été identifiées dans le locus agr (P1, P2 et P3) (Fig. 10) 108,131. Le promoteur P1 est faiblement actif tout au long du cycle cellulaire 145 et contribue à la transcription de agrA 156. Le promoteur P2 permet la transcription d'un ARN polycistronique de 3.5 Kb appelé ARN II. L'ARN II code pour AgrA, AgrB, AgrC et AgrD. Finalement le promoteur P3 initie, dans la direction opposée, la transcription de l'ARN III (0.5 Kb) dont les 160 premiers nucléotides codent pour la -hémolysine, qui ne contribue pas à l'activité de l'agr. L'activité des promoteurs P2 et P3 augmente progressivement pendant la croissance exponentielle pour atteindre un maximum en phase post-exponentielle.

      

Figure 10: Organisation du locus agr

      La transcription de l'ARN III dépend du produit des gènes codés par l'ARN II 8,144. L'ARN III semble être l'effecteur principal du système agr.

ii) L'ARN III est responsable de l'activité agr

      Une délétion de 39 pb dans l'ORF codant pour la -hémolysine et n'altérant pas la séquence des codons en aval (in-frame), a permis de montrer que cette séquence n'est pas impliquée dans le phénotype agr 108. La transformation d'une souche agr- avec le gène codant l'ARN III d'une autre espèce de staphylocoque (S. lugdunensis), qui ne possède pas la -hémolysine, restaure en grande partie la fonction de l'agr chez S. aureus 17. On constate donc que l'ARN III est seul responsable de l'activité agr permettant l'expression des protéines sécrétées dans le milieu. Des études ultérieures ont montré que l'ARN III agirait comme activateur de la transcription et même de la traduction du gène de l'-toxine 133,145. En revanche, on ne sait pas comment l'ARN III peut intervenir dans la régulation des adhésines.

iii) L'agr contient un système de transduction du signal à deux composantes

      L'étude des différents gènes du locus agr a mis en évidence un modèle de transduction d'un signal à deux composantes (Fig. 11): la faible activité constitutive du promoteur P2 permet la production d'un octapeptide codé par le gène agrD 10,100,126 et sécrété dans le milieu s'accumulant jusqu'en fin de phase exponentielle. Le gène agrB codant la protéine de membrane permet la translocation de l'octapeptide vers le milieu externe 99,100,126. Cet octapeptide se lie à la protéine transmembranaire AgrC (46 Kda) provoquant son autophosphorylation dans le compartiment cytosolique 120,144. Le groupement phosphate est ensuite transféré sur la protéine cytosolique AgrA 132. La phosphorylation de AgrA est supposée augmenter l'activité transcriptionnelle des promoteurs P2 et P3 120 avec le concours du produit majeur du locus sar (cf. plus loin) 132.

      

Figure 11: Modèle de l'activation de la transcription de l'ARN III

b) Le système sar

      sar est un autre régulateur global capable d'influencer l'expression des protéines sécrétées dans le milieu 47. Le phénotype d'un mutant sar se distingue de celui d'un mutant agr par une diminution de certaines adhésines (ClfA, FnBPs, etc.) et par une augmentation de la production de protéases 41,45,47. Le clonage de ce locus a révélé la présence d'un opéron, dont le gène principal est nommé sarA, codant pour la protéine effectrice SarA de 13.5 KDa 13,48,51,87. Plusieurs études ont mis à jour la présence de trois transcrits (0.58, 0.84 et 1.15 Kb) initiés par les promoteurs P1, P2 et P3 et nommés sarB, sarC et sarA (Fig. 12) 13,51. Chacun de ces transcrits possède le même point de terminaison de la transcription situé à la fin du gène sarA.

      

Figure 12: Organisation du locus sar

      Les transcrits sarA et sarB sont produits en phase exponentielle, mais sont remplacés en phase stationnaire par le transcrit sarC absent auparavant 13,123. Ce contrôle multiple de l'opéron sar module la quantité de protéine régulatrice SarA. Des études récentes ont montré la liaison de SarA aux promoteurs P2 et P3 de l'agr permettant leur activation 44,134.

c) Régulation des facteurs de virulence par agr et sar

      agr et sar augmentent ou diminuent la synthèse de certaines adhésines comme les FnBPs. Ces activités dépendent de la phase de croissance et aboutissent soit à des effets synergiques soit antagonistes tels que démontrées sur des mutants simples ou combinés d'agr et de sar 219.

      Une diminution de la résistance à la méticilline a également été montrée chez les souches double mutantes agr sar 66, sans que PBP2' soit affectée par la double mutation agr sar.

      Les rôles respectifs de l'agr et du sar ont été explorés dans différents modèles animaux en comparant des souches sauvages à leurs mutants respectifs. Les doubles mutants agr sar sont moins infectieux dans l'endocardite expérimentale 45,49. Dans d'autres modèles animaux d'infection (ostéomyélites, arthrite septique, endophtalmites), l'absence de agr ou de sar peut mener a une diminution de la virulence et de l'infectiosité de S. aureus 4,24,83. En résumé, les effets des mutations inactivant agr et sar sont tellement complexes que leur interprétation au niveau moléculaire est très délicate.

3) La réponse au choc thermique (heat-shock)

a) Généralités

      La réponse heat-shock (choc thermique) est universelle. Toutefois, cette réponse ne se limite pas à l'agression thermique mais à d'autres agents tels que l'éthanol, les oxydants et l'hyperosmolarité. On la retrouve aussi bien chez les eucaryotes que chez les procaryotes 139,140. Les études très élaborées faites chez E. coli ont montré qu'en augmentant la température de 37°C à 42°C on observait une augmentation d'un petit nombre de protéines sur des gels d'électrophorèse à deux dimensions 140. Ces protéines induites par le choc thermique (ex. GroES, GroEL, DnaK, GrpE, DnaJ etc.) agissent pour replier correctement des protéines en formation ou dénaturées par la chaleur et dans la structuration correcte des protéines destinées a être sécrétées. D'autres sont responsables (ex. ClpA/ClpB) de l'élimination des protéines trop endommagées.

      Chez S. aureus, on a retrouvé certains gènes de la réponse heat-shock, homologues à ceux décrit chez E. coli, par exemple les gènes codant pour Hsp10 et Hsp60 (respectivement 55% homologue à GroES et 63% homologue à GroEL de E. coli) 147,148 ; Hsp70 (75% homologue à DnaK de E. coli) et Hsp40; une protéine X ayant 25% d'homologie avec ClpB de E. coli (une protéase semblable à ClpA 220) et HSP20 (homologue à GrpE de E. coli) 148. D'autres protéines régulées par le choc thermique chez S. aureus n'ont pas d'homologues connus chez E. coli 148.

b) Importance du facteur B

      Le facteur B, un facteur sigma alternatif, a été récemment identifié chez B. subtilis 21,103,217. C'est un facteur qui serait l'homologue de 32 (facteur sigma du choc thermique) de E. coli. On le détecte lorsque la population bactérienne entre en phase stationnaire 28,30,98,217 ou est exposée à des stress divers (choc thermique, éthanol, oxydants et hyperosmolarité) 20,27,205. Le gène sigB codant B se trouve au sein d'un opéron comprenant 4 gènes (rsbV-rsbW-sigB-rsbX) dont la transcription dépend de B lui-même 103. La régulation de B est surtout post-transcriptionelle. La protéine RsbW est un facteur anti- B régulant négativement l'activité de B en bloquant son interaction avec l'ARN polymérase (Fig. 13) 19,29. Lors d'un stress, la protéine RsbV contrecarre RsbW et restaure l'activité de B 18,27,29,65. Cette activation de B

semble également impliquer les cofacteurs RsbU (une phosphatase) 82,204, et RsbX 204.

      

Figure 13 : régulation de B [...]

      Le facteur B de S. aureus a été cloné, et des séquences homologues avec celles de l'opéron sigB de B. subtilis (codant B) ont été révélées (Fig. 14) 110,221.

      

Figure 14 Homologies de séquences de l'opéron sigB chez B. subtilis et S. aureus

      Malgré les homologies constatées entre B. subtilis et S. aureus, on constate des différences significatives entre les deux espèces dans l'organisation et la régulation de leur opéron sigB 110.

c) Contribution de B à l'expression de la virulence chez S. aureus

      L'inactivation de sigB chez S. aureus provoque la disparition de la pigmentation caractéristique de S. aureus (staphyloxanthine). D'autres protéines, comme la protéine de choc alcalin 23 82,111 ou la lipase et la thermonucléase sont soit régulées positivement ou négativement par B 111. Comme mentionné plus haut, le promoteur P3 de sar possède une séquence caractéristique reconnue par le facteur B 123.

      Le rôle de B dans la virulence reste controversé 42. Une étude très récente indique un rôle important de B dans la régulation de la production de biofilm par S. aureus 164.

4) La réponse SOS et la recombinaison homologue

a) Généralités

      Le système SOS, largement décrit chez E. coli, est mis en route par l'interaction de deux protéines (RecA et LexA), qui déclenche l'activation spécifique d'une vingtaine de gènes impliqués dans la réparation de l'ADN. La protéine RecA, qui joue un rôle primordial dans la réponse SOS, est également un facteur clé d'un autre système de réparation de l'ADN qui est la recombinaison homologue 53 catalysant les réactions de synapse (association de brins d'ADN homologues en début de division) et d'échange de brins de chromatine 166.

      La réponse SOS et la recombinaison homologue ont été très étudiées chez E. coli mais très peu chez S. aureus.

b) La réponse SOS et la recombinaison chez E. coli

      Le système de réparation SOS intervient lors d'agressions particulièrement graves de l'ADN et augmente le nombre d'erreurs dans les séquences réparées (error-prone repair) 207. Cet effet secondaire du système SOS joue peut être un rôle important dans l'évolution des espèces bactériennes 208,218.

      Les premières expériences menées chez E. coli ont montré que des mutations dans chacun des gènes lexA et recA inhibent l'induction du système SOS, indiquant le rôle essentiel de ces deux gènes dans l'activation de ce système 94,135,167,168,218.

      Les principaux gènes régulés par le système SOS, à part recA et lexA, sont:

uvrABCD, impliqués dans la réparation des dimères de pyrimidines créés par l'exposition aux UVs 208 ;

recN, recF, ruvABC, impliqués dans la réparation de cassures de la double hélice 208. La plupart de ces gènes interviennent également lors de la recombinaison homologue pour réparer les dommages subit par l'ADN (error-free repair) (ex : recA, recBCD, recF, ruvABC, etc.) 114.

      En comparant les promoteurs de ces différents gènes on a mis en évidence une séquence consensus sur laquelle se lie LexA 207. L'affinité de la liaison de LexA aux différents opérateurs varie fortement 36,67. Malgré la répression des gènes cibles par LexA, certains d'entre eux sont tout de même exprimés de manière significative lorsque la bactérie n'est pas stressée 207,209. Ainsi, RecA (produit par le gène recA) se trouve en concentration suffisante pour remplir son rôle dans la recombinaison homologue 104.

      La nature du signal déclenchant les systèmes de réparation de l'ADN semble être l'exposition de brins libres d'ADN, qui résultent d'une cassure simple ou double brin du chromosome circulaire bactérien. RecA et d'autres cofacteurs se lient à ces brins d'ADN 208 et d'autre part activent le clivage du répresseur LexA, ce qui permet l'expression des gènes SOS 207,209. Lorsque le facteur de stress disparaît, RecA n'est plus activé et le pool de LexA est ramené à la normale, ce qui permet de réprimer les gènes de la réponses SOS 207,209.

c) La réponse SOS et la recombinaison chez S. aureus

      Les composantes moléculaires des systèmes de réparation de l'ADN chez S. aureus sont encore incomplètement décrits. Un mutant ayant le phénotype recA- 222 189 a été décrit 14,84. Des fragments de recA de S. aureus ont été clonés chez E. coli 14 ce qui a permis le séquençage de ce gène. Le gène recA de S. aureus a 85 % d'homologie avec celui de B. subtilis 14. Les similarités dans les régions promotrices des gènes recA de S. aureus et B. subtilis suggèrent une régulation et une fonction similaire de ces gènes 14.

      En dehors de recA on connaît très peu de choses sur les composantes de la recombinaison homologue chez S. aureus, à l'exception de recG 143.

5) Conclusion

      Les réponses aux stress qui peuvent affecter l'expression des facteurs de virulence chez S. aureus sont surtout déduites de ce qu'on a observé chez E. coli et B. subtilis. Par contre, sur un plan expérimental les données disponibles sont très minces chez S. aureus.

      Même si les régulateurs globaux spécifiques à S. aureus tels qu'agr et sar sont assez bien décrits in vitro leur importance in vivo et leur interaction avec les réponses aux stress telles que heat-shock, SOS et recombinaison homologue sont très mal connues. Alors que ces différents systèmes de régulation ont été présentés dans des chapitres séparés, il est peu probable qu'ils agissent de manière isolée. On peut au contraire penser que ces différents processus agissent de manière concertée pour la survie des bactéries dans les différents environnements auxquels elles sont soumises. On sait par exemple que :

L'expression de sar dépend en partie du facteur sigma (B) spécifique de la réponse de choc thermique

certains agents chimiques peuvent déclencher simultanément plusieurs systèmes de réponse aux stress (ex : ac. nalidixique déclenchant une réponse SOS puis une réponse de type choc thermique) 198,

La réponse SOS peu déclencher l'expression de certains gènes de la réponse de choc thermique 109.

      L'étude de ces systèmes de régulation est importante pour comprendre la pathogénèse de S. aureus chez l'humain.

4) Modes d'action des fluoroquinolones et mécanismes de résistance

1) Introduction

      Les antibiotiques se répartissent en trois catégories selon leur mode d'action:

Ceux qui inhibent la synthèse de la paroi (pénicilline, carbapenems, céphalosporines, bacitracine, vancomycine, teicoplanine, etc.)

Ceux qui inhibent la synthèse des protéines bactériennes au niveau ribosomal ou des ARN de transferts (chloramphénicol, tétracycline, érythromycine, streptomycine, gentamicine, tobramycine).

Ceux qui ont pour cible les topoisomérases de type II (fluoroquinolones).

2) Mécanismes généraux de résistance aux antibiotiques

      Les bactéries ont développé différents mécanismes pour contrecarrer l'action des antibiotiques:

Des enzymes hydrolysant les composés ß-lactamines (ß-lactamase) ou modifiant les aminoglycosides (par transfert de divers groupes chimiques) (Fig. 15A).

Un changement de perméabilité bloquant l'influx des antimicrobiens (changement des pores dans la membrane externe des Gram-) (Fig. 15B).

Une augmentation de l'efflux des antibiotiques (ac. fusidique, streptomycine, tétracyclines, fluoroquinolones, etc.) ou antiseptiques (ammoniums quaternaires, etc.) (Fig. 15B).

Une modification ou une substitution des cibles des antibiotiques (cf. fluoroquinolones, Fig 15 C ; méticilline, Fig. 15 D).

      

Figure 15 : Mécanismes de résistance aux antibiotiques chez les bactéries(tiré de 'La Recherche' N°314, p.63)

3) Mécanismes spécifiques des fluoroquinolones sur l'enroulement de l'ADN

a) Introduction

      La première fluoroquinolone est la norfloxacine (FLQ) efficace dans le traitement d'infections urinaires (Fig. 16). Les composantes de la seconde génération de FLQ, par exemple la ciprofloxacine et la pefloxacine, sont caractérisées par une plus grande activité antibactérienne, un plus large spectre (action contre les Gram+ également), une adsorption intestinale optimale pour l'administration orale, et des propriétés pharmacocinétiques permettant de traiter une grande variété d'infections systémiques.

      

      

Figure 16: Structure chimique de certains fluoroquinolones

b) Les mécanismes d'enroulement de l'ADN: rôle des topoisomérases

      Pour être emmagasiné dans la cellule, l'ADN doit être condensé dans une forme très compacte qui est définie par le terme de super-enroulement ('supercoiling') (Fig. 17). Cet état superenroulé est contrôlé en grande partie par une catégorie spéciale d'enzymes: les topoisomérases. De plus ces enzymes jouent un rôle important pour la réplication et la transcription de l'ADN. Le déroulement de l'ADN par les topoisomérases facilite l'accès des différents enzymes de transcription ou de réplication.

      Les topoisomérases modifient le super-enroulement de l'ADN en le coupant puis en le recollant. On les classe dans trois grands groupes:

Les topoisomérases de type I ne coupent qu'un seul des deux brins de la double hélice d'ADN et permettent la relaxation de super-enroulements négatifs.

Par contre les topoisomérases de type II (gyrase et topoisomérase IV) coupent les deux brins de la double hélice.

      

Figure 17 :Forme superenroulée de l'ADN Des topoisomérases particulières sont impliquées dans la transposition et l'excision de

phages de l'ADN.

      Les topoisomérases de type II, dont fait partie la Gyrase, possèdent 4 sous-unités: deux A (Gyr A), et deux B (Gyr B) (Fig. 19). Les sous-unités B ont une activité ATPasique qui est inhibée par la novobiocine. Au sein de la sous-unité A de la Gyrase, le résidu Tyr en position 122 est responsable de la coupure transitoire dans l'ADN. Il en résulte une phospho-tyrosine-gyrase sur chacun des brins permettant le passage d'une double hélice au travers de cette double coupure.

      La topoisomérase IV contribue à la décaténation des deux chromatides filles et à leur répartition dans les deux cellules filles 223.

c) Effets des fluoroquinolones sur l'interaction Gyrase-ADN

      L'interaction entre les fluoroquinolones et le complexe Gyrase-ADN peut être décrite en quatre étapes:

Les Topoisomérases de type II déroulent l'ADN (Fig. 18 et 19, point 1). Le modèle de Shen et al 179 postule que les fluoroquinolones s'auto-associent et

stabilisent le complexe Gyrase-ADN (Fig. 18 et 19, point 2). Ils empêchent ainsi la religation de l'ADN coupé par la gyrase 5,6,43,179. Ceci désorganise la réplication du

chromosome bactérien et peut mener à la mort cellulaire par des mécanismes encore mal définis.

      

Figure 18: Activité de la gyrase et interaction avec un fluoroquinolone ( fluoroquinolone auto-associé, cf. en bas à droite de la figure, d'après Shen et al 179

Un autre modèle, celui de Drilica et al 64 décrit les mécanismes menant à la mort cellulaire (Fig. 19). Dans l'étape n°3 (Fig. 19) les complexes Topoisomérase II-fluoroquinolones sont libérés laissant des bouts d'ADN clivés. Cette réaction est sensible à un inhibiteur de la synthèse de protéines (chloramphénicol), suggérant leur nécessité pour cette réaction. Certaines de ces protéines font peut être partie des systèmes de réparation de l'ADN.

A très hautes concentrations, les fluoroquinolones pourraient provoquer la dissociation des sous-unités des Topoisomérases II ce qui entraînerait la libération de l'ADN doublement coupé. Cette réaction est insensible au chloramphénicol, n'impliquerait pas de néosynthèse de protéines (CAM-insensible) (Fig. 19, point 4).

      

Figure 19: Effets des fluoroquinolones sur l'interaction Topoisomérases II-ADN (CAM, chloramphénicol ; d'après Drilica et Zhao 64)

4) Les mécanismes de résistance aux fluoroquinolones chez S. aureus

      Des observations récentes 197 74,75, ont montré que l'étape primaire d'acquisition de résistance aux fluoroquinolones n'impliquait pas de mutation dans les gènes gyrA ou B, mais dans la sous-unité A de la topoisomérase IV, codée par le locus grlA. Cette topoisomérase apparentée à la gyrase subit des mutations dans une région qu'on appelle QRDR (Quinolone Resistance Determining Region) analogue à celle du gène gyrA (voir tableau 2). Un modèle décrivant l'acquisition progressive de niveaux croissants de résistance aux fluoroquinolones a été proposé (ex. ciprofloxacine, voir tableau 2) 74,75. Lors de la première étape, les mutants modérément résistants aux fluoroquinolones montrent un changement d'acide aminé (Ser 88Tyr ou Glu 84 Lys) dans la sous-unité A (grlA) de la topoisomérase IV 74.

      

Tableau 2: modèle d'acquisition de la résistance aux fluoroquinolones chez S. aureus

Mutations

Mutant/Sauvage gyrA grlA (topo IV)CMI de Ciprofloxacine(g/ml)

Souche sensible --- --- 0.25

Mutant1ère étape ---Ser 80-> ;Tyr ou Glu 84-> ;Lys

2

Mutant2ème étapeGlu 88-> ;LysouSer 84-> ;Leu

Ser 80-> ;Tyr/Phe 32

Mutant3ème étape avec norA

Ser 84-> ;LeuSer 80-> ;Tyr ou Glu 84-> ;Leu

128

      Lors de la deuxième étape, les mutants grlA acquièrent une seconde mutation dans le gène gyrA (Glu 88Lys ou Ser 84->Leu) 74. La coexistence de ces deux mutations est indispensable pour obtenir un haut niveau de résistance aux fluoroquinolones chez S. aureus. Paradoxalement, une mutation survenant seulement dans le gène gyrA est n'augmente pas la résistance, la CMI de ciprofloxacine pour S. aureus restant identique à celle du parent sensible 142.

      Indépendamment de cette mutation dans le gène gyrA, certaines souches de S. aureus sont également capables d'augmenter l'efflux de fluoroquinolones par une pompe transmembranaire appelée NorA 142. Cette pompe est responsable de l'expulsion de fluoroquinolones hydrophiles (comme la ciprofloxacine) du milieu intracellulaire par un mécanisme actif 39,93,187 utilisant le gradient de protons transmembranaire 141. Une mutation du promoteur de norA affecterait la liaison sur cette région d'une protéine régulatrice augmentant ainsi l'expression de norA. De même, une mutation de la protéine régulatrice pourrait expliquer le phénotype de surexpression de NorA chez une souche n'ayant pas d'altérations dans le promoteur de norA 102.

      On constate que même les doubles mutants résistants dans les gènes grlA et gyrA peuvent acquérir cette troisième mutation liée à l'activation du gène norA. Ces triples mutants, qui ont une accumulation réduite de fluoroquinolones hydrophiles, montrent une résistance accrue à ces composés 74.

5) Impact des fluoroquinolones et autres antibiotiques sur l'expression des facteurs de virulence chez S. aureus

      L'introduction de chaque nouvelle catégorie d'antibiotique a été généralement suivie à plus ou moins long terme par l'émergence de la résistance chez S. aureus et la plupart des bactéries pathogènes 71,171. Une question qui est fréquemment posée est l'impact sur la virulence de concentrations sous-inhibitrices sur l'expression de divers facteurs de virulence (toxines, des adhésines, etc.). Un certain nombre de travaux tendent à démontrer que les concentrations sous-inhibitrices d'antibiotiques (fluoroquinolones, macrolides) diminuent la virulence des bactéries, dont S. aureus 175,176,181,184. On a ainsi pu observer une diminution de l'adhérence bactérienne sur des épithélia, une augmentation de leur phagocytose et de leur destruction intracellulaire par les polymorphonucléaires (PMN) 33-35,61. D'autres groupes ont étudié l'effet de concentrations sous-inhibitrices d'antibiotiques sur l'expression des adhésines liant la fibronectine ou le collagène chez S. aureus. Alors que les lincosamines, l'erythromycine, le chloramphénicol et la clindamycine diminuent le nombre d'adhésines à la fibronectine ou au collagène 37, les -lactames et la vancomycine en augmentent le nombre 161,162.

      Par contraste avec ces observations, certaines études ont montré l'augmentation de certains facteurs de virulence pendant la croissance bactérienne en présence de concentrations sous-inhibitrices d'antibiotiques. Par exemple, la nafcilline 105 ou d'autres -lactames 146 peuvent augmenter considérablement la production d'-toxine ou activer son gène chez S. aureus. D'autres observations récentes montrent l'induction de l'opéron icaADBC chez S. epidermidis par la tetracycline ou la quinupristin-dalfopristin 165. Les fluoroquinolones peuvent aussi activer la production de la toxine Shiga 2 de E. coli 0157 224.

      Ces études démontrent que les concentrations sous-inhibitrices d'antibiotiques peuvent avoir des effets très contrastés. Vu l'importance des fluoroquinolones dans la thérapie humaine et le fait qu'elles perturbent le fonctionnement de l'ADN, il nous a paru important d'évaluer en détail leur impact sur la virulence de S. aureus.

      Dans un contexte assez différent, des études cliniques suggèrent une relation entre l'emploi de la ciprofloxacine et l'émergence de souches multirésistantes de S. aureus. Une étude en soins intensifs a montré que l'emploi de la ciprofloxacine chez des patients présentant une infection pulmonaire entraînait fréquemment une surinfection par des germes résistants (MRSA) 122. Dans une étude multivariée, les auteurs ont mis à jour une corrélation entre l'incidence de souches MRSA nosocomiales et l'augmentation de l'utilisation de ceftazidime/cefsulodine, amoxicilline/ac. clavulanique, et des fluoroquinolones 58. Enfin, une étude très récente a analysé les facteurs de risque pour le portage de MRSA et conclu qu'une exposition à des fluoroquinolone prédisposait les patients à la colonisation par MRSA 86.

5) Buts de la recherche

      Le but de ce travail a été d'étudier l'interaction entre les mécanismes de résistance aux antibiotiques, les antimicrobiens eux-mêmes et l'expression de l'adhérence chez S. aureus. Les résultats sont présentés sous la forme d'articles déjà publiés ou d'un manuscrit soumis à publication, trouvés en annexe à la fin de cette thèse.

      Les résultats décrits en détails dans ces publications seront brièvement résumés dans les chapitres suivants :

      Le premier article décrira un modèle simplifié qui a permis de tester l'impact des fluoroquinolones en concentrations sous-inhibitrices sur l'adhérence à la fibronectine des S. aureus résistants aux fluoroquinolones. En testant une série de mutants dont les loci de résistance aux fluoroquinolones portent des mutations spécifiques, nous avons montré une augmentation de l'expression des adhésines à la fibronectine chez les bactéries ayant fait leur croissance en présence de ciprofloxacine.

      Dans le deuxième article, nous examinerons si l'observation paradoxale de surexpression des adhésines se produit aussi sur des souches cliniques en particulier des MRSA fréquemment retrouvés dans l'environnement hospitalier. Un autre objectif a été d'étudier au niveau moléculaire l'activation par la ciprofloxacine des promoteurs codant les adhésines à la fibronectine de type A ou B. Cette activation a été étudiée grâce au gène rapporteur luciférase fusionné à chacun des promoteurs des adhésines à la fibronectine.

      Dans la troisième article, nous avons recherché les mécanismes cellulaires impliqués dans l'activation des adhésines à la fibronectine par l'exposition aux fluoroquinolones. L'impact de la ciprofloxacine sur les régulateurs globaux de S. aureus ou sur les voies métaboliques de réponses aux stress a été testé grâce à des mutants de ces régulateurs globaux agr, sar ou facteurs de stress. Un rôle intéressant pour le facteur de réponse au stress recA dans la réponse de S. aureus à la ciprofloxacine a été mis en évidence.

      Une dernière partie décrira une étude en cours comparant l'impact de plusieurs fluoroquinolones sur l'activation du promoteur des adhésines à la fibronectine ainsi que sur le phénotype d'adhérence.

      Ces observations apportent un nouvel outil de travail qui permettra peut-être d'explorer les mécanismes d'attachement et de colonisation des souches multirésistantes de S. aureus (MRSA), en relation possible avec l'exposition fréquentes des patients hospitalisés à des fluoroquinolones à large spectre.

      Une autre avancée de ce travail est de mettre à jour le rôle des réponses aux stress, telles qu'illustrées par le facteur recA, dans l'expression des facteurs de virulence par des souches multirésistantes de S. aureus. Une telle exploration nous permettra peut-être de mieux comprendre comment ces souches multirésistantes colonisent progressivement l'environnement hospitalier.

B) Bref rappel méthodologique

1) Avant-propos

      Ce chapitre récapitule brièvement les techniques non conventionnelles qui ont été employées pour ce travail et sont adaptées aux staphylocoques. Les autres techniques ayant un emploi courant en laboratoire ne seront pas évoquées car elles sont décrites dans les articles figurant en annexe.

2) Mesure de l'adhérence de S. aureus

      Des stocks des différentes souches bactériennes sont conservés sous forme congelée dans un milieu skim milk à -70°C. Pour obtenir une culture bactérienne en phase stationnaire (~ 1*109 UFC), quelques colonies sont prélevées d'une gélose et ensemencées dans des tubes contenant 1 ml de milieu liquide Müller-Hinton (MHB). Après ~16 h de croissance à 37°C, les cultures sont centrifugées et le culot bactérien est rincé dans du NaCl physiologique (0.9 %). Pour obtenir une suspension bactérienne radiomarquée un aliquot de la culture de 16 h est ensemencé dans 1 ml de MHB contenant 25 Ci de 3H-thymidine (Fig. 22). Un autre aliquot est inoculé dans le même milieu additionné de ciprofloxacine en concentrations sous-inhibitrices (¼ ou 1/8 de la CMI). Après 5 h de croissance à 37° C, les bactéries radiomarquées sont lavées de leur milieu radioactif par deux centrifugations.

      

Figure 20 : Mesure de l'adhérence

      Des lamelles en plastique (PMMA) recouvertes de gélatine sont incubées avec des concentrations croissantes de fibronectine humaine purifiée (2 µg/ml; 1 µg/ml; 0.5 µg/ml; 0 µg/ml), ce qui permet l'adsorption linéaire de fibronectine sur les lamelles. Puis, les lamelles recouvertes de fibronectine sont incubées avec chaque souche bactérienne radiomarquée, provenant d'une culture avec ou sans fluoroquinolone. Après 1 h, le nombre de bactéries adhérentes est compté en transférant chaque lamelle rincée dans des flacons de radioactivité.

2) Evaluation des Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI)

      Les CMI de chaque antibiotique pour les différentes souches sensibles ou résistantes aux fluoroquinolones ont été évaluées par la technique dite de macro-dilution en milieu liquide 138(fig. 21):

      X représente la conc de l'antibiotique.

      

Figure 21 : Mesure de la CMI

      Une quantité X de l'antibiotique à tester est d'abord diluée en série dans le milieu MHB. Puis un inoculum bactérien contenant ~1*106 UFC est ajouté à chaque tube. Après 24 h d'incubation à 37°C, on procède à la lecture des tubes troubles (dans lesquels il y a eu croissance bactérienne) ou translucides (dans lesquels il n'y a pas eu de croissance bactérienne). Un tube contrôle, où seul l'inoculum bactérien est présent, permet de vérifier que la croissance bactérienne se déroule normalement dans ce milieu.

3) Extraction et analyse des protéines des lysats bactériens

      L'analyse des protéines présentes dans différentes fractions sub-cellulaires (paroi, membrane, cytoplasme) est compliquée par le relâchement de protéases très puissantes qui nécessite l'usage d'un cocktail d'anti-protéases à très large spectre 23. Le peptidoglycan de S. aureus est digéré par un enzyme spécifique, la lysostaphine, ce qui fait exploser par choc osmotique la bactérie privée de sa paroi protectrice. Pour diminuer la viscosité du lysat, on ajoute de la Dnase. Finalement, on récupère les protéines et autres composants cellulaires et membranaires par centrifugations. L'analyse des protéines par électrophorèse en gels SDS et Immunoblots se fait par des techniques standard.

4) Production de phages et transduction

      La transduction de gènes chromosomiques ou de plasmides a utilisé des phages spécifiques de S. aureus ainsi que des techniques bien établies 9. En résumé, la souche donneuse du plasmide/marqueur chromosomique, associé à une résistance antibiotique, est infectée par le phage. Au bout d'une nuit des plages de lyse apparaissent et les phages produits sont récoltés et concentrés par centrifugation. Ils vont servir à infecter une culture de la souche cible (~109-1010 CFU/ml). Les transductants apparaîtront 36-48 h plus tard sur des géloses contenant l'antibiotique de sélection.

5) Extraction de l'ADN bactérien

      Quelques colonies sont récupérées d'une gélose et ajoutées à 1 ml de PBS contenant 1mM CaCl2 et 0.5mM de MgCl2. Cette culture est mise en présence de lysostaphine et de lysozyme (digestion de la paroi) 22. La protéinase K est ensuite ajoutée pour éliminer la composante protéique 125. L'extraction de l'ADN se fait en présence de phénol:chloroforme:isoamyl-alcool (25:24:1). L'ADN récolté est ensuite précipité et quantifié par spectophotométrie.

6) Clonage et complémentation à l'aide d'un plasmide « suicide »

      Pour éviter un effet toxique de copies multiples du gène recA cloné dans E. coli comme décrit précédemment 14, nous avons utilisé un plasmide particulier présent en faible copies dans E. coli, qui ne peut subsister dans S. aureus que par son intégration spécifique (« suicide ») dans le gène codant la lipase dans la souche CYL316 de S. aureus restriction déficiente 116. Cette intégration est rendue possible par les homologies de séquences sur le plasmide et dans le gène chromosomique codant la lipase ainsi que par la production d'un enzyme favorisant cette recombinaison (intégrase) se trouvant sur un second vecteur présent dans la bactérie (« helper ») 116. Ainsi, le mutant RA1recA a pu être complémenté par l'introduction dans le gène codant la lipase d'une copie fonctionelle de ce gène (Fig. 22).

      Les autres techniques liées au clonage telles que la PCR et le séquençage de l'ADN proviennent de source commerciale. De même, l'insertion de 5 nucléotides dans la séquence codante de recA a utilisé la technique de « Quick change mutagenesis » (Stratagene) (Fig. 23)

      

Figure 22 : Stratégie de clonage de recA S. aureus

      

Figure 23 : Mutagénèse du gène cloné recA

7) Activation des promoteurs des gènes fnbA et fnbB par des concentrations sous-inhibitrices de ciprofloxacine

      Pour mesurer au niveau transcriptionnel l'induction des FnBPs par des concentrations sous-inhibitrices de ciprolfloxacine, nous avons transféré dans le double mutant grlA, gyrA EN1252a un plasmide contenant la fusion du promoteur du gène fnbA ou fnbB avec le gène rapporteur luxAB exprimant la luciférase (Fig. 24).

      

Figure 24: Système rapporteur utilisant la luciférase

      Le premier protocole expérimental a mesuré l'activation du promoteur de chaque fnb périodiquement durant 5 heures, chez les souches incubées en absence ou présence de ciprofloxacine (1/4 ou 1/8 de la CMI). Les mesures de luminescence effectuées après chaque heure ont été normalisées par la densité optique (OD540nm) des cultures en croissance (Fig. 25) et exprimées en SLU (specific light units).

      

Figure 25: Protocole utilisé pour mesurer l'activation des promoteurs fnb durant 5 heures

      Dans la deuxième série d'expériences, nous avons modifié le protocole pour étudier l'effet de la ciprofloxacine durant les premières 20 à 40 min. (Fig. 26). Après 4 heures de croissance sans antibiotique chaque souche a été mise en présence pendant 20-40 min de concentrations sous-inhibitrices de fluoroquinolones (1/4 ou 1/8 de la CMI).

      

Figure 26: Protocole utilisé pour mesurer l'activation des promoteurs fnb durant 20-40 min.

C) Augmentation de l'Adhérence de S. aureus Résistants aux Fluoroquinolones par des Concentrations

Sous-Inhibitrices de Ciprofloxacine (Article N°1)

1) Avant-propos

      Ce chapitre présente un résumé succinct des résultats décrits en détail dans l'article n°1. Pour cette étude, nous avons disposé d'une série de mutants (gracieusement fournis par le Prof. D. Hooper, Boston) affectant spécifiquement chacun des loci de résistance aux fluoroquinolones (grlA, gyrA, norA, Tableau 3).

      

Tableau 3: Mutants isogéniques de S. aureus

2) Profils d'adhérence

      Lorsque la ciprofloxacine est absente du milieu de culture, les mutants exprimant différents niveaux de résistance présentent néanmoins des profils d'adhérence à la fibronectine uniformes et semblables à leurs parents respectifs (Fig. 27A). Le mutant grlA est le seul à montrer une adhérence un peu réduite, pour des raisons indéterminées. On constate également que la présence ou l'absence du marqueur de résistance à la novobiocine dans les souches parentales, utilisé pour faciliter les constructions des mutants, n'affecte pas du tout leur niveau d'adhérence.

      La figure 27B nous montre qu'après croissance en présence de ciprofloxacine (1/4 CMI), les différents mutants et leurs parents ne changent pas leur niveau d'adhérence par rapport aux conditions de croissance sans antibiotique (Fig. 27A). Ceci est aussi valable pour le mutant flqB affectant le gène norA (pompe d'efflux), qui n'augmente pas son adhérence après exposition à la ciprofloxacine (Fig. 27).

      

Figure 27: Adhérence à la fibronectine des mutants exprimant une faible résistance à la ciprofloxacine

      Par contraste, avec les mutants de bas niveau de résistance et leurs parents sensibles à la ciprofloxacine, nous avons observé que la croissance en présence de ¼ de la CMI de ciprofloxacine augmentait fortement l'adhérence des souches exprimant un haut niveau de résistance, tels que les doubles (grlA, gyrA) ou triple mutants (grlA, gyrA, flqB) (Fig. 28A, 28).

      

Figure 28: Adhérence à la fibronectine de mutants combinés exprimant une résistance élevée à la ciprofloxacine

3) Analyse quantitative des adhésines à la fibronectine par Western Blot et densitométrie

      L'immunodétection et quantification des FnBPs montre une augmentation substantielle de ces adhésines chez le double mutant (grlA, gyrA) par rapport aux simples mutants et aux parents, après croissance en présence de ¼ CMI de ciprofloxacine (Fig. 29). De même, la souche triple mutante exprime une quantité accrue de FnBPs après croissance en présence de ciprofloxacine.

      

Figure 29: Expression des adhésines à la fibronectine (FnBPs) chez le parent sensible (Cipros) et le mutant grlA gyrA (Cipror) après croissance avec ou sans Cipro (1/4 CMI)

      Vu le poids moléculaire similaire des FnBP, ce type d'approche ne permet pas de distinguer laquelle des deux adhésines à la fibronectine est la plus stimulée. Malgré l'emploi d'un cocktail d'antiprotéases pour limiter au maximum la digestion de ces adhésines on distingue sur les Western blots une bande identifiée comme un produit majeur de dégradation (FnBP tronquée, ~135 KDa) en plus de l'adhésine native (~190 KDa).

D) Induction des Adhésines à la Fibronectine par la Ciprofloxacine chez S. aureus résistants aux

fluroroquinolones (Article N°2)

1) Avant-propos

      Les buts de cette seconde étude étaient de :

confirmer la surexpression des FnBPs sur un échantillon de souches cliniques (10 MRSA et 6 MSSA) résistantes aux fluroquinolones, après croissance en présence de concentrations sous-inhibitrices de ciprofloxacine,

évaluer l'augmentation par la ciprofloxacine de l'adhérence de souches fluoroquinolones-résistantes sur des lamelles explantées des animaux,

mesurer l'induction des FnBPs par des concentrations sous-inhibitrices de ciprofloxacine au niveau transcriptionel.

2) L'adhérence de souches cliniques résistantes est aussi augmentée après croissance en présence de ciprofloxacine

      Seize souches cliniques résistantes aux fluoroquinolones provenant soit de Boston, de l'Institut pasteur ou du Laboratoire de Bactériologie de l'HCUG ont été étudiées. Certaines de ces souches sont sensibles à la méticilline (MSSA) et d'autres résistantes à la méticilline (MRSA). Toutes ont été séquencées au niveau des loci gyrA et grlA responsables de la résistance aux fluoroquinolones (tableau 4). Ce séquençage a montré la présence d'une grande diversité de mutations, indiquant qu'il n'y avait pas de clone prédominant dans cet échantillon de taille restreinte.

      

Tableau 4: Souches cliniques de S. aureus résistantes à la ciprofloxacine

Souches de S. aureus

Profil de résistance antibiotique

Changements d'a.a.:GrlA GyrA

CMI (µg/ml) de Cipro

% augmentation d'adhérence

MRSA          

4613 Mcr, Gmr, Fosr, Cipr S80F, E84K

E88K 64 149

4673 Mcr, Gmr, Cipr S80F, S81P

S84L, E88A

128 5

4753 Mcr, Gmr, Fosr, Cipr S80F, S81P

S84L 128 17

4718 Mcr, Gmr, Cipr S80FS84L, E88A

128 61

4623 Mcr, Gmr, Cipr S80F E88K 128 104

95067Mcr, Gmr, Fosr, SgAr, Cipr S80F S84A 16 353

BM10762Mcr, Gmr, Fosr, SgAr, SgBr, Rf r, Far, Cipr S80F S84L 64 206

95057Mcr, Gmr, Fosr, SgAr, SgBr, Rf r, Cipr

S80F, E84K

S84L 128 73

BM10835Mcr, Gmr, Fosr, SgAr, Rf r, Cipr

S80F, E84K

S84L 128 27

We Mcr, Gmr, Cipr S80Y S84L 16 29

MSSA          

Ch Cipr S80F, I45M

--- 4 16

Mc Cipr S80F --- 8 4

Mu Cipr E84K --- 8 46

Av Cipr S80F, S84A 8 22

I45M

Dec Cipr S80F S84L 16 112

Ki Cipr S80F S84A 16 66

      Abréviations: Mc, Methicilline; Gm, Gentamicine; Fos, Fosfomycine; SgA, Streptogramine A; SgB, Streptogramine B; Rf, Rifampine; Fa, Acide Fusidique; Cip, Ciprofloxacine.

      12 souches cliniques sur 16 montrent une augmentation significative de l'adhérence après croissance en présence de ciprofloxacine (1/4 de la CMI), les souches MRSA de manière plus marquée que les MSSA (Tableau 4, Fig. 30).

      

Figure 30 : Augmentation de l'adhérence des MRSA/MSSA après croissance en présence de ciprofloxacine (les symboles fermés représentent chaque souche dont

l'adhérence est significativement augmentée).

      Deux des souches MRSA (BM10762 et 95067), gracieusement fournies par l'Institut Pasteur, retrouvées dans plusieurs hôpitaux grâce à des marqueurs de résistance antibiotique atypiques quinupristin-dalfopristin et donc considérées comme épidémiques, montrent une augmentation particulièrement forte de leur adhérence après croissance en présence de

ciprofloxacine. Les niveaux d'augmentations atteignent respectivement 206 et 353 % (Tableau 4).

      La dose-réponse d'adhérence de la souche épidémique 95067 montre une très forte augmentation après croissance en présence de ciprofloxacine (Fig. 31A). En parallèle la quantité de FnBPs estimée par Western Blot augmente également après culture en présence de ciprofloxacine (Fig. 31A).

      

Figure 31: Augmentation de l'adhérence à la fibronectine et de la production de FnBPs (inserts) chez les souches résistantes en présence de concentrations sous-inhibitrices de

ciprofloxacine

      La figure 31B montre par comparaison la dose-réponse de stimulation de l'adhérence du double mutant grlA gyrA EN1252a en fonction de concentrations variables de ciprofloxacine. Cette expérience nous a permis de déterminer le seuil de stimulation de l'adhérence par les concentrations sous-inhibitrices de la fluoroquinolone. Cette expérience a clairement démontré que le seuil de stimulation se situait entre 1/16 et 1/8 de la CMI de ciprofloxacine. Par contre, la stimulation de l'adhérence par la ciprofloxacine n'a plus montré d'augmentation en passant de 1/8 (4 µg/ml) à ¼ (8 µg/ml) de la CMI de cet antibiotique. Cette observation a été déterminante pour la suite du travail où nous avons choisi d'utiliser 1/8 de la CMI de ciprofloxacine, parcequ'elle n'altère pas du tout la vitesse de croissance des souches testées.

3) Adhérence de souches de S. aureus résistantes aux fluoroquinolones sur des lamelles explantées des animaux

      L'adhérence de la souche épidémique 95067 à des lamelles retirées de l'espace sous-cutané du cobaye, recouvertes d'une matrice extracellulaire naturelle, est significativement stimulée après croissance en présence de 1/4 de la CMI de ciprofloxacine (Fig. 32A). De même, le double mutant grlA, gyrA EN1252a augmente significativement son adhérence aux lamelles explantées, après croissance en milieu ciprofloxacine, ce qui n'est pas le cas de la souche parentale sensible ISP794 (Fig. 32B).

      

Figure 32: Adhérence sur des lamelles explantées de la souche clinique 95067, du mutant isogénique EN1252a et de sa souche parentale ISP794

4) Activation des promoteurs des gènes fnbA et fnbB par des concentrations sous-inhibitrices de ciprofloxacine

      Pour mesurer au niveau transcriptionnel l'induction des FnBPs par des concentrations sous-inhibitrices de ciprofloxacine, nous avons transféré dans le double mutant grlA, gyrA EN1252a un plasmide contenant la fusion du promoteur du gène fnbA ou fnbB avec le gène rapporteur luxAB exprimant la luciférase Comme montré précédemment 85 le promoteur du gène fnbA a montré une activité deux à trois fois plus faible que le promoteur du gène fnbB. De plus, le promoteur de fnbA n'a pas montré une activation significative en présence de ciprofloxacine et n'a donc pas été étudié en détail.

      En revanche, le promoteur du gène fnbB a montré une activation significative pendant 5 heures d'incubation avec ¼ de la CMI de ciprofloxacine chez le double mutant EN1252a, mais pas chez son parent ISP794 (Fig. 33).

      

Figure 33: Activation du promoteur fnbB chez le double grlA gyrA mutant ou son parent sensible, incubées pendant 5 h en présence ou absence de ciprofloxacine

      La cinétique d'activation du promoteur fnbB durant les première 40 minutes suivant l'addition de fluoroquinolone a aussi été étudiée en détail. Seuls les résultats à 20 min. sont présentés, les résultats après 40 min. ne montrant pas de changements significatifs.

      20 min. après l'addition de ciprofloxacine soit à ¼ (8 µg/ml) ou 1/8 (4 µg/ml) de sa CMI pour la souche double mutante EN1252a, le promoteur du gène fnbB est significativement activé, par rapport au milieu sans antibiotique (Fig. 34A). Par contre, le promoteur du gène fnbB n'est pas significativement activé chez le parent sensible ISP794 (Fig. 34B).

      En pré-traitant les souches fluoroquinolone-résistantes ou fluoroquinolones-sensibles à la rifampicine (un inhibiteur de la transcription) 5 min. avant l'addition de ciprofloxacine, on bloque l'effet de cette fluoroquinolone sur le gène rapporteur. Ceci confirme que la ciprofloxacine agit bien au niveau de la transcription du gène fnbB et que le gène rapporteur luxAB donne une bonne représentation de ce phénomène

      

Figure 34: Activation du promoteur fnbB chez la souche double mutante ou sensible en présence de ¼ de la CMI de Cipro.

5) L'agr n'intervient pas dans l'activation du gène fnbB par la ciprofloxacine

      Comme nous l'avons vu au chapitre A-III (point 2), les régulateurs globaux agr et sar peuvent modifier l'expression des adhésines, dont les FnBPs. Le rôle de l'agr a été étudié indirectement, en introduisant une mutation knockout de ce régulateur global dans le double mutant grlA, gyrA EN1252a. La figure 35A montre que l'adhérence à la fibronectine reste stimulée dans le mutant agr de EN1252a. En parallèle, la figure 35B montre que l'activation du promoteur du gène fnbB mesurée par le système rapporteur luxAB est conservée dans le mutant agr de EN1252a.

      Donc, le régulateur global agr n'exerce aucune influence sur l'activation du promoteur du gène fnbB ni sur l'augmentation de l'adhérence du double mutant EN1252a incubé avec la ciprofloxacine.

      

Figure 35: Augmentation de l'adhérence à la fibronectine et activation du promoteur fnbB par ¼ de la CMI de Cipro chez le mutant agr de EN1252a.

E) L'Effet de la Ciprofloxacine sur l'Augmentation de l'Adhérence à la Ciprofloxacine Dépend de l'Activité du

Gène recA. (Article N°3)

1) Avant-propos

      

      

Figure 36 : Mécanismes éventuels expliquant l'augmentation de l'adhérence en présence de fluoroquinolones

      La figure 36 montre les mécanismes potentiellement impliqués dans l'activation du promoteur fnbB par les concentrations sous-inhibitrices de ciprofloxacine. Ces systèmes de régulation pourraient être soit des régulateurs globaux de S. aureus, en particulier le régulon sar non testé précédemment, ou bien des mécanismes de modification du superenroulement ou de réponses aux stress (protéines « heat-shock », réponse SOS, etc.) (Fig. 36 et chap A-III, pts.3-4).

      Pour évaluer la contribution de ces différents systèmes de régulation nous avons construit des mutants knockout de leur composantes clé.

2) sar n'est pas impliqué dans la stimulation du promoteur fnbB et dans l'augmentation de l'adhérence en présence de ciprofloxacine

      L'introduction d'une mutation knockout du régulateur global sar dans le double mutant grlA gyrA RA1 a permis d'étudier si son adhérence restait stimulable par la ciprofloxacine. La figure 37 montre l'adhérence à la fibronectine de RA1sar comparée à son parent RA1 ou au mutant Ra1agr après croissance en présence ou absence de 1/8 de la CMI de ciprofloxacine (4 µg/ml). Il est à signaler que la CMI de ciprofloxacine de RA1sar comme d'ailleurs de RA1agr est identique à celle de leur parent RA1.

      

Figure 37 : Adhérence du double mutant et de ses mutants agr, sar en présence ou absence de ciprofloxacine (1/8) de la CMI.

      Après croissance en absence de ciprofloxacine, on constate que le mutant sar adhère 3 fois moins à la fibronectine que son parent RA1 ou le mutant RA1agr. Ceci confirme une autre observation récemment publiée, montrant que pendant la phase exponentielle, la production des FnBPs est activée par le locus sar 219.

      Après croissance en présence de ciprofloxacine, on remarque que les trois souches testées atteignent le même niveau surélevé d'adhérence (Fig. 38). Il est donc frappant de constater que l'adhérence du mutant sar est beaucoup plus fortement stimulée (>600 %) par la croissance en présence de ciprofloxacine par rapport aux conditions sans antibiotique que les deux autres souches RA1 et RA1agr dont l'adhérence n'augmente que d'environ 100 %.

      La figure 38 montre l'activation du promoteur fnbB dans les souches RA1sar et RA1, après incubation en présence de ¼ ou 1/8 de la CMI de ciprofloxacine. Même si l'activation du promoteur fnbB par la ciprofloxacine est conservée dans la souche RA1sar par rapport à son parent RA1, cette activation n'est pas significativement plus élevée chez le mutant sar.

      En résumé, l'activation par la ciprofloxacine du promoteur fnbB et de l'adhérence de S. aureus fluoroquinolone-résistant ne semble pas faire intervenir le locus sar.

      

Figure 38 : Activation du promoteur fnbB après 20 min en absence ou présence de ¼ ou 1/8 de la CMI de ciprofloxacine chez le double mutant et le mutant sar

3) Evidence pour l'implication de recA dans la stimulation du promoteur fnbB et dans l'augmentation de l'adhérence en présence de ciprofloxacine

      Une mutation inactivant le locus recA 14 a été introduite dans la souche RA1. Les transductants recA montrent une hypersensibilité aux rayons UVs (Fig. 40) et une diminution spectaculaire de leur CMI à la ciprofloxacine qui chute de 32 à 2 µg/ml.

      L'adhérence de RA1recA après croissance en présence ou absence d' 1/4 de la CMI de ciprofloxacine est montrée sur la figure 39, par comparaison avec celle du parent RA1. On constate que l'adhérence de RA1recA ne peut plus être stimulée par la croissance en présence de ciprofloxacine, au contraire du parent RA1.

      

Fig. 39 : Adhérence de la souche RA1 et RA1recA en absence ou présence de ¼ de la CMI de ciprofloxacine.

4) Clonage de recA et complémentation du mutant défectif

      De manière à clarifier le rôle de recA, nous avons cloné ce locus et complémenté la souche mutante pour recA. Le clonage de recA a nécessité l'emploi d'une stratégie différente de celle suivie précédemment par un autre groupe, qui n'est pas parvenu à cloner l'intégralité de ce gène sur un plasmide multi-copies de E. coli 14. La séquence obtenue par ce groupe résulte du clonage de différentes parties du gène recA. Pour cloner l'intégralité du gène recA, nous avons utilisé un plasmide (pCL84) dont le nombre de copies dans E. coli est très limité 116. Le gène recA de la souche double mutante a été amplifié et cloné dans ce plasmide qui a ensuite été propagé dans E. coli. La séquence de recA s'est révélée identique à celle publiée précédemment sauf pour une base qui n'affecte pas la protéine (codon 260 : CT). Le plasmide portant recA a été purifié et utilisé pour transformer la souche CYL316 de S. aureus, restriction déficiente et portant un plasmide « helper » (pYL112 19). Le plasmide de clonage (pCL84) n'a pas la possibilité de se diviser dans S. aureus, mais peut s'insérer par homologies de séquences dans un site précis situé dans le gène lipase à l'aide d'une intégrase codée sur le plasmide « helper ».

      La figure 40 démontre que les souches complémentées par une copie fonctionnelle de recA+ redeviennent résistantes aux UVs. De plus, la CMI de ciprofloxacine vis-à-vis de RA1recA/recA+

attB est restaurée à 32 µg/ml.

      

Figure 40: Test de survie à une exposition croissante de rayons UVs

      La figure 41 montre la restauration de l'adhérence stimulée par la ciprofloxacine chez RA1recA/recA+

attB de manière équivalente à celle du parent original RA1. Pour confirmer la validité de la technique de complémentation ainsi que le rôle de recA+ dans la restauration du phénotype induit par la ciprofloxacine, nous avons testé deux souches additionnelles servant de contrôle : l'une d'entre elles est complémentée avec le plasmide sans insert alors que l'autre est complémentée avec le plasmide contenant une copie non fonctionnelle de recA (grâce à une insertion de 5 nucléotides dans la région 5'-codante de recA, provoquant une modification du cadre de lecture de recA).

      Les deux souches servant de contrôle à la procédure de complémentation, RA1recA/pCL84attB et RA1recA/recA(+5)attB restent phénotypiquement identiques au mutant RA1recA. Elles ont la même hypersensibilité aux UVs et CMI de ciprofloxacine abaissée à 2 µg/ml que la souche non complémentée RA1recA. Finalement, leur adhérence n'est pas non plus stimulée après croissance en présence de 1/8 de la CMI de ciprofloxacine, comme leur mutant RA1recA (Fig. 41).

      

Figure 41 : Comparaison de l'augmentation (%) de l'adhérence de la souche double mutante, de son mutant recA, et des souches complémentées avec recA sauvage,

recA(+5) et le vecteur de clonage pCL84

      Ceci a permis de valider les techniques de clonage et de complémentation du gène recA dans la souche fluoroquinolone-résistante RA1.

5) La ciprofloxacine induit une transcription rapide du gène recA et du gène fnbB dans la souche parentale RA1

      Comme le plasmide portant la construction fnbB-luxAB n'a pas pu être introduit et maintenu dans la souche RA1recA pour des raisons inconnues, nous avons utilisé la RT-PCR en temps réel (Taqman) pour évaluer les niveaux d'ARNm codés aux loci recA, fnbB, ou fnbA utilisé comme contrôle. Après 20 min. en présence de ciprofloxacine (1/8 de la CMI), le niveau (« steady-state ») d'ARNm transcrit par le locus recA augmente de plus de 2 cycles (Fig. 42).

      

Figure 42 : Amplification par RT-PCR du messager de recA en présence ou absence de ciprofloxacine

      

Figure 43 : Différence de cycles de RT-PCR pour détecter l'ARNm spécifique entre l'absence ou la présence de ciprofloxacine (1/8 de la CMI)

      Ceci correspond à une augmentation moyenne de 5.5 fois dans la quantité d'ARNm de recA induite par la ciprofloxacine (Fig. 43). En comparaison, la quantité d'ARNm de fnbB induite par la ciprofloxacine augmente de 2.7 fois, ce qui n'est pas le cas pour la fnbA dont la quantité reste inchangée (Fig. 43). Finalement, on retrouve la même quantité d'ARNr 16S contrôle en présence ou absence de ciprofloxacine (Fig. 43).

      Ces données montrent que la ciprofloxacine active rapidement la transcription des gènes recA et fnbB. L'activation de recA semble mener par des chemins métaboliques encore indéterminés à l'activation de fnbB et la surexpression du phénotype d'adhérence (cf. Discussion).

F) Stimulation par Différentes Fluoroquinolones de l'Activité des gènes fnBs et de l'Adhérence de S. aureus.

(travail en cours)

1) Avant-propos

      Les fluoroquinolones de seconde génération telles que la norfloxacine et la ciprofloxacine ont été suivies plus récemment de dérivés encore plus actifs contre les bactéries gram+. Parmi ces fluoroquinolones plus récentes, on trouve la levofloxacine, la sparfloxacine, la trovafloxacine, et la moxifloxacine. Certains de ces composés (sparfloxacine, trovafloxacine) ne sont plus utilisés intensivement pour des raisons de toxicité. Bien que les cibles gyrase et topoisomérase IV aient une affinité variable pour chacune de ces fluoroquinolones récentes, elles ont néanmoins des CMI sur S. aureus assez proches les unes des autres. De plus, les fluoroquinolones récentes perdent également une partie plus ou moins substantielle de leur activité contre des souches résistantes à la ciprofloxacine.

      Les buts de cette étude sont de comparer les effets de concentrations sous-inhibitrices de plusieurs de ces fluoroquinolones récentes sur i) l'activation du promoteur du gène fnbB dans le double mutante grlA, gyrA EN1252a ; ii) l'augmentation de l'adhérence à la fibronectine.

2) Activation du promoteur fnbB chez EN1252a par des concentrations sous-inhibitrices de différentes fluoroquinolones

      L'activation des promoteurs fnbA et fnbB par les différentes fluoroquinolones en concentrations sous-inhibitrices a été étudiée avec le système rapporteur luciférase.

      Des expériences pilotes ont comparé l'activation par chacune des 6 quinolones et la ciprofloxacine utilisée comme contrôle sur 2 différents temps d'incubation (20 et 40 min.) et deux fractions (1/4 et 1/8) de leur CMI contre le mutant grlA gyrA EN1252a. La figure 44 montre que les 2 temps d'incubation (20 et 40 min.) ont donné des résultats équivalents pour la souche EN1252a exposée à 1/8 de la CMI de chaque fluoroquinolone. De plus, les résultats

(non montrés) à ¼ de la CMI ce sont aussi montrés équivalents à ceux produits par 1/8 de la CMI de chaque fluoroquinolone. Pour voir si les différences observées entre fluoroquinolones (Fig. 44) étaient reproductibles et significatives nous avons effectué un groupe de 3 expériences avec une seule concentration sous-inhibitrice de fluoroquinolone et un seul temps d'incubation. De plus, nous n'avons testé que l'activation du promoteur fnbB, puisque le promoteur fnbA n'était pas significativement activé par les fluoroquinolones.

      

Figure 44 : Activation du promoteur fnbB chez EN1252a par des concentrations sous-inhibitrices de différentes fluoroquinolones

      Afin de simplifier l'analyse comparative, nous avons réparti les différentes fluoroquinolones dans deux différents groupes qui tous les deux contenaient la ciprofloxacine comme agent de référence. Le premier groupe comprenait la trovafloxacine, la moxifloxacine, et le Bay3118 alors que le second groupe comprenait la levofloxacine, la sparfloxacine et la norfloxacine.

      La figure 45A compare l'activation du promoteur fnbB par une fluoroquinolone en développement (Bay3118), la moxifloxacine (MOX), la trovafloxacine (TVX) à la ciprofloxacine (CFX). On se rend compte que par rapport au milieu contrôle sans antibiotique (CTL), 3/4 quinolones (MOX, TVX, CFX) activent significativement le promoteur fnbB. La figure 45B, qui compare l'activation du promoteur fnbB par 3 autres fluoroquinolones et la ciprofloxacine montre que la sparfloxacine (SPX) et la norfloxacine (NFX) sont tout aussi actives que la ciprofloxacine (CFX). En revanche, la levofoxacine (LVX) produit une activation significativement plus basse du promoteur fnbB.

      

Figure 45 : Activation du promoteur fnbB après 20 min. en présence de 1/8 de la CMI de différents fluoroquinolones

      Pour faciliter la comparaison des résultats entre les deux groupes, nous avons cherché à normaliser ces résultats en prenant comme 0% d'activation les résultats mesurés dans le tube CTL et le 100% d'activation comme celui produit par la ciprofloxacine. En utilisant cette échelle, on constate que la plus forte augmentation est due à la sparfloxacine (132%), suivie par la norfloxacine (130%), la trovafloxacine (118%), la moxifloxacine (96%), la levofloxacine (33%), et le Bay3118 (19%). Toutes ces augmentations sont significatives par rapport au CTL sauf la levofloxacine et le Bay3118.

3) Stimulation de l'adhérence du mutant EN1252a après croissance en présence de 5 différentes fluoroquinolones

      La figure 46 montre que la présence de 1/8 de la CMI de ciprofloxacine ou de norfloxacine dans le milieu de croissance augmente significativement l'adhérence du mutant EN1252a à la fibronectine. Par contre, aucune des 3 autres fluoroquinolones (LVX, TVX et MOX) produit un accroissement significatif de cette adhérence.

      

Figure 46 : Adhérence du mutant EN1252a après croissance en présence de 1/8 de la CMI de 5 différentes fluoroquinolones (Abréviations : MHB :milieu sans antibiotique ; CFX :ciprofloxacine ; NFX :norfloxacine ; LVX :levofloxacine ; TVX :trovafloxacine ;

MOX :moxifloxacine)

      Ces résultats nous indiquent que la plupart des fluoroquinolones à l'exception de la levofloxacine et le composé expérimental Bay3118 sont capables d'activer à court terme le promoteur fnbB du double mutant EN1252a. Par contre, lorsque l'incubation avec chaque fluoroquinolone est prolongée pour une période de 5 heures, qui est requise pour les tests d'adhérence, on constate que seules la norfloxacine et la ciprofloxacine sont capables de stimuler l'adhérence de la souche fluoroquinolone-résistante de S. aureus.

G) Discussion et conclusion

      Les infections nosocomiales dues aux staphylocoques représentent un problème hospitalier important. La présence de souches multirésistantes au sein des S. aureus colonisant de nombreux patients est une difficulté additionnelle pour le contrôle de ces infections. Les souches MRSA sont non seulement résistantes à la méticilline comme à d'autres ß-lactamines, mais elles résistent aussi à des catégories très variées d'antibiotiques y compris les glycopeptides 90. La résistance aux fluoroquinolones est apparue peu de temps après leur mise

sur le marché, surtout chez les souches MRSA. Pour des raisons encore obscures, près de 90 % des souches MRSA sont aussi résistantes aux fluoroquinolones.

      La découverte inattendue que les souches exprimant un haut niveau de résistance aux fluoroquinolones étaient également stimulées dans leur adhérence à la fibronectine après exposition à des quantités sous-inhibitrices de ciprofloxacine a constitué le point de départ de tous ces travaux. L'analyse de mutants bien caractérisés au niveau de leur mutations dans la Topoisomérase IV et la Gyrase a prouvé que seules les souches ayant des mutations combinées dans ces deux loci étaient stimulées par la ciprofloxacine. Grâce à une technique améliorée d'extraction de protéines bactériennes réduisant l'impact de la protéolyse, nous avons pu montrer par immunodétection et densitométrie que les bactéries augmentaient leur production de FnBPs après exposition à la ciprofloxacine. Ceci contredisait les conclusions d'un grand nombre d'études antérieures qui tendaient à prouver l'effet bénéfique des concentrations sous-inhibitrices d'antibiotique au niveau thérapeutique. En effet, diverses observations in vitro nous indique que les fluoroquinolones ainsi que d'autres antibiotiques en concentrations sous-inhibitrices peuvent altérer la morphologie et l'adhérence bactérienne à des epithelia ou augmenter leur phagocytose 33,62,181,184.

      Par contre, une série d'études récentes semblent contredire le concept que les concentrations sous-inhibitrices d'antibiotiques diminuent la virulence. Par exemple, la nafcilline 105 ou d'autres -lactamines 146 augmentent significativement la production d'-toxine au niveau transcriptionnel chez S. aureus. D'autres observations récentes montrent l'induction de l'opéron icaADBC chez S. epidermidis par la tetracycline ou la quinupristin-dalfopristin 165. Les fluoroquinolones peuvent aussi activer la production de la toxine Shiga 2 de E. coli 0157 224.

      Dans ce contexte, notre étude indique un lien possible entre la résistance antibiotique, l'exposition à certaines fluoroquinolones, et l'augmentation de facteurs de virulence chez S. aureus. On peut émettre l'hypothèse que l'augmentation de l'adhérence de souches résistantes de S. aureus stimulée par des concentrations sous-inhibitrices de fluoroquinolones contribue au développement et à la sélection de souches multirésistantes de MRSA, bien adaptées à l'environnement hospitalier. Des arguments en faveur de cette hypothèse sont fournis dans la seconde étude dans laquelle une forte majorité de souches cliniques, en particulier MRSA, augmentent leur adhérence à la fibronectine après croissance en présence de ¼ de la CMI de ciprofloxacine. Finalement, nous avons également observé chez les souches MRSA une tendance à augmenter plus fortement leur adhérence en présence de ciprofloxacine que chez les MSSA, en particulier pour deux souches épidémiques multirésistantes provenant de l'Institut Pasteur.

      L'effet inducteur de la ciprofloxacine sur l'adhérence de la souche épidémique 95067 et celle du double mutant EN1252a a été confirmé sur des lamelles recouvertes d'une matrice extracellulaire naturelle, formée pendant leur implantation dans l'espace sous-cutané des cobayes. Ces lamelles sont non seulement recouvertes de concentrations variables de fibronectine, mais aussi d'un nombre important d'autres protéines insolubles qui pourraient aussi moduler l'adhérence de S. aureus. Ces circonstances expliquent pourquoi nous observons une large distribution des valeurs d'adhérence sur ces lamelles retirées du cobaye. Cette variabilité rend difficile la mise en évidence de différences significatives entre bactéries incubées en présence ou en absence de ciprofloxacine. Ceci pourrait expliquer pourquoi seulement ¼ et non 1/8 de la CMI stimule l'adhérence de S. aureus résistants aux fluoroquinolones d'une manière significative.

      Pour évaluer l'impact de la ciprofloxacine sur la transcription des gènes fnb nous avons utilisé un système rapporteur codant la luciférase. Ce système simple a permis de confirmer que le promoteur de l'adhésine de type A était moins activé que celui de type B. L'activation du promoteur fnbB par la ciprofloxacine est observée après 20 min. d'incubation et semble persister pendant plusieurs heures dans les souches fluoroquinolones-résistantes de S. aureus. L'effet de la ciprofloxacin sur la transcription du gène fnbB a été vérifié en utilisant comme inhibiteur de la transcription la rifampine qui a complètement bloqué ce phénomène. Enfin, nous avons montré que cet effet n'impliquait pas le régulateur global agr.

      Dans l'étape suivante (3ème article), nous avons évalué la contribution du régulateur global sar ainsi que de recA qui est un régulateur central de la réparation de l'ADN. L'inactivation du locus sar dans S. aureus fluoroquinolone-résistant n'a pas eu d'impact significatif sur l'activation du gène fnbB et l'accroissement de l'adhérence par les concentrations sous-inhibitrices de ciprofloxacine. En revanche, l'inactivation du locus recA a complètement supprimé la réponse de S. aureus fluoroquinolone-résistant à la ciprofloxacine. Les expériences de complémentation du mutant recA, rendues possible par le clonage d'une copie entière du gène sauvage recA, ont permis de démontrer que seule la présence du gène recA fonctionnel restaurait la réponse de S. aureus fluoroquinolone-résistant à la ciprofloxacine. La réussite de cette démarche génétique a été facilitée par l'emploi d'un plasmide présent en petit nombre de copies dans E. coli et s'intégrant dans le chromosome de S. aureus. Ce système a permis d'éviter les effets toxiques observés par un autre groupe 14, tentant de cloner sans succès recA sur un plasmide multicopies de E. coli.

      L'augmentation due à la ciprofloxacine de l'ARNm du gène recA a été mis en évidence par une RT-PCR en temps réel. Un autre avantage de cette technique a été de confirmer l'augmentation, aussi induite par la ciprofloxacine, de l'ARNm transcrit par le gène fnbB.

      Au vu de ce que nous savons sur le rôle de la protéine RecA dans plusieurs mécanismes essentiels de réparation de l'ADN (recombinaison homologue, réponse SOS), le lien entre la synthèse induite de cette protéine et la stimulation du gène fnbB ne sera compris que pas des études très élaborées au niveau moléculaire. Il faudra en particulier identifier d'autres composantes des systèmes de recombinaison homologue et de réponse SOS. L'élucidation de l'ensemble du génome de S. aureus facilitera le travail d'identification de gènes orthologues à ceux déjà identifiés chez E. coli et/ou B. subtilis. De plus, le criblage des transcriptomes de S. aureus sur des microarrays, en collaboration avec des groupes experts, permettra d'identifier plus rapidement les voies métaboliques activées par la ciprofloxacine ou d'autres fluoroquinolones.

      Un des mécanismes qui retient notre attention est l'activation par RecA de la protéolyse de LexA. En effet, LexA, ou son analogue DinR chez B. subtilis, est décrit dans E. coli comme exerçant une régulation négative sur l'ensemble des gènes du système SOS. Nous avons observé dans la région promotrice des gènes fnb de S. aureus une partie de la séquence consensus reconnue par LexA dans les gènes classiques du système SOS chez B. subtilis. La possibilité que la protéine LexA de S. aureus interagisse avec les promoteurs des gènes fnb va être testée par des expériences de 'Band-Shift' incubant chacun de ces promoteurs avec la protéine LexA recombinante (dont le gène est actuellement en cours de clonage). Un modèle expliquant l'augmentation de l'adhérence par la ciprofloxacine, via le clivage de LexA est proposé sur la figure 47 en accord avec des données publiées chez E. coli 95. Ce modèle propose que le clivage de LexA libérerait les promoteurs fnb en augmentant leur transcription, en particulier celle de fnbB. L'exposition de brins libres d'ADN due à l'agression des

fluoroquinolones, non démontrée dans notre étude, serait la cause directe de l'augmentation rapide de la transcription de recA. D'autres études sont également envisagées pour examiner l'activation potentielle au travers de RecA du système de recombinaison homologue., qui lui aussi contribue à la réparation de l'ADN.

      

Figure 47 : Modèle expliquant l'augmentation de l'adhérence en présence de fluoroquinolones

      La découverte des mécanismes de réponse cellulaire contribuant à l'activation du gène fnbB sera également essentielle pour comprendre pourquoi seuleument la norfloxacine et la ciprofloxacine, mais pas d'autres fluoroquinolones (sparfloxacine, trovafloxacine, moxifloxacine), peuvent augmenter l'adhérence à la fibronectine.

      Finalement, la propriété qu'ont certaines souches cliniques multirésistantes de S. aureus d'augmenter leur adhérence à la fibronectine en présence de ciprofloxacine sera aussi évaluée sur des collections de souches mieux documentées. En particulier, nous chercherons à établir si une préexposition aux fluoroquinolones à favorisé la sélection de certains clones de MRSA particulièrement bien adaptés à l'environnement hospitalier grâce à des propriétés de colonisation renforcée. Ceci sera évalué en collaboration avec des groupes experts en épidémiologie (Prof. Pittet, Genève) ou ayant collecté un grand nombre de souches de S. aureus au niveau européen (Prof. Schmitz, Allemagne), dont certaines ont montré un caractère épidémique très marqué.

      Les résultats de ce travail mettent en lumière par une approche originale le problème récurrent d'une surconsommation d'antibiotiques dans la médecine d'ajourd'hui. Les techniques d'analyses que nous avons proposées devraient faciliter l'identification des antibiotiques risquant de favoriser l'émergence de souches plus résistantes et plus virulentes. Elles devraient aussi contribuer à une prise de conscience sur un emploi raisonnable et bien ciblé des antibiotiques en général, et des fluoroquinolones en particulier 122.

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Annexe 1

Increased Expression of Fibronectin-Binding Proteins by Fluoroquinolone-Resistant Staphylococcus aureus Exposed to Subinhibitory Levels of Ciprofloxacin.

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