p6biochimie-bg

8/14/2019 P6biochimie-bg

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Universit Par is-VI

Biologie gnique

Objectifs au cours de

Formation de base IFTAB (2me anne)

Diplme dUniversit P. et M. Curie

Formation continue

2006 - 2007

Pr. A. Raisonnier ([email protected])Avec lautorisation des Professeurs J. Etienne et G. Lucotte

Mise jour : 14 juin 2006

Relecture : Pr. A. Raisonnier


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2/183 Biologie gnique - Pr A. Raisonnier 2006 - 2007


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Plan du cours

2006 - 2007 Biologie gnique - Pr A. Raisonnier 3/183

Plan du cour s

3 Plan du cours

9 Objectifs

11 Partie I : Enzymes agissant sur les acides nucliques

13 Chapitre 1 : Phosphorylation - dphosphorylation

14 1.1 Polynuclotide-kinase

15 1.2 Polynuclotide kinase T4

16 1.3 Terminal transferase17 1.4 Phosphatase alcaline

19 Chapitre 2 : Les polymrases

20 2.1 DNA polymrase (raction)

21 2.2 DNA polymrase (exonuclase 35)

22 2.3 DNA polymrase (fonction ddition)

23 2.4 DNA-polymrases (tableau)

24 2.5 DNA pol I (E. Coli)

25 2.6 Fragment de Klenow26 2.7 T4 DNA polymrase

27 2.8 Sequenase

28 2.9 Taq polymrase

29 2.10 Reverse transcriptase

30 2.11 RNA polymrase II (raction)

31 2.12 RNA polymrases (phages)

32 2.13 Poly(A) polymrase

33 Chapitre 3 : Les ligases

34 3.1 DNA ligase (raction)

35 3.2 DNA ligase (E. Coli )

36 3.3 DNA ligase (phage T4)

37 3.4 RNA ligase (phage T4)

39 Chapitre 4 : Les isomrases

40 4.1 Topoisomrase


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Plan du cours


41 Chapitre 5 : Les nuclases

42 5.1 Fragment de restriction (dfinition)

43 5.2 Systme de restriction-modification

44 5.3 Nomenclature des enzymes de restriction

45 5.4 Restriction (raction gnrale)46 5.5 Tampons dincubation (restriction)

47 5.6 EcoR I

48 5.7 EcoR V

49 5.8 Pvu II

50 5.9 Hae III

51 5.10 Pvu I

52 5.11 Pst I

53 5.12 Kpn I

54 5.13 Alphabet dgnr

55 5.14 Ava II

56 5.15 Hind II

57 5.16 Hga I

58 5.17 Mbo II

59 5.18 Hha I

60 5.19 Hpa I

61 5.20 Digestion dune squence (Hae III)

62 5.21 Digestion dune squence (Mbo II)

63 5.22 Ribonuclase A

64 5.23 Ribonuclase T1

65 5.24 Ribonuclase H

66 5.25 Dsoxyribonuclase I67 5.26 Nuclase BAL 31

68 5.27 Nuclase S1

69 5.28 Nuclease de mung-bean

70 5.29 Exonuclase de phage

71 5.30 Exonuclase III

73 Chapitre 6 : Autres enzymes

74 6.1 -galactosidase

75 6.2 Protinase K

77 Partie II : Prparation des acides nucliques

79 Chapitre 7 : Extraction et purification

80 7.1 Purification des lymphocytes

81 7.2 Homognisation des tissus, dprotinisation


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Plan du cours


82 7.3 Extraction de lADN

83 7.4 Isolation de lARN

84 7.5 Techniques de purification (tableau)

85 7.6 Purification par lthanol

86 7.7 Purification du RNA-poly(A)

87 Chapitre 8 : Synthse des polynuclotides

88 8.1 Polymerase Chain Reaction (PCR)

89 8.2 PCR (I-1)

90 8.3 PCR (I-2)

91 8.4 PCR (I-3)

92 8.5 PCR (II-1)

93 8.6 PCR (II-2)

94 8.7 PCR (II-3)

95 8.8 PCR (III-1)96 8.9 PCR (III-2)

97 8.10 PCR (III-3)

98 8.11 Nested-PCR

99 8.12 Phosphoramidites : dA-3-support protge

100 8.13 Phosphoramidites : dtritylation

101 8.14 Phosphoramidites : addition dun nuclotide

102 8.15 Phosphoramidites : blocage des supports

103 8.16 Phosphoramidites : oxydation

104 8.17 Phosphoramidites : dprotection

105 8.18 Synthse dun cDNA

106 8.19 Sondes de cDNA amplifi107 8.20 Structures secondaires

108 8.21 Synthse des queues poly(dN)

109 Chapitre 9 : Caractr isation des acides nucliques

110 9.1 Principaux oligonuclotides

111 9.2 Spectres UV des bases nucliques

112 9.3 Spectre UV des acides amins

113 9.4 Dosage des acides nucliques

114 9.5 Electrophorse des acides nucliques115 9.6 Sonde nuclique (dfinition)

116 9.7 Hybridation dune sonde

117 9.8 Calcul de la Tm

118 9.9 Southern blot

120 9.10 Drpanocytose (anmie falciforme)

121 9.11 Marquage : nick translation

122 9.12 Marquage : random priming

123 9.13 Marquage : terminal transferase


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Plan du cours


124 9.14 Marquage : polynuclotide kinase

125 9.15 Didsoxyadnosine triphosphate

126 9.16 Raction de squence

127 9.17 Squenage de lADN

128 9.18 Squenage : dye primers

130 9.19 Squenage : dye terminators131 9.20 Gel de squence

132 9.21 Squenage : image du gel

133 9.22 Squenage : analyse de limage

134 9.23 Squenage : analyse de limage

135 9.24 Promoteur : foot printing

136 9.25 Dosage dARN : PCR quantitative

137 9.26 Dosage dARN : protection la RNase

139 Partie III : Caractrisation des vnements gntiques

141 Chapitre 10 : Mutations

142 10.1 Polymorphismes de restriction

143 10.2 Polymorphisme Msp I de lapoA-II

144 10.3 Haplotypes

145 10.4 Cartes de restriction

147 Chapitre 11 : Expression

148 11.1 Vecteur (dfinition)

149 11.2 Cellules-htes

150 11.3 Cycle du phage

151 11.4 Phage

152 11.5 Clonage (I)

153 11.6 Clonage (II)

154 11.7 EMBL

155 11.8 Polylinker

156 11.9 Clonage directionnel

157 11.10 Carte du plasmide pBR322

158 11.11 Carte des plasmides pUC18/19159 11.12 Cycle de M13

160 11.13 Carte du M13


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Plan du cours


161 Par tie IV : Le gnie gntique

163 Chapitre 12 : Mutagnse

164 12.1 Cration dun site de restriction165 12.2 Mutagnse par PCR

167 Chapitre 13 : Transposition - recombinaison

168 13.1 Transposition (dfinition)

169 13.2 Protine rec-A

170 13.3 Transposition (mcanisme)

171 13.4 Recombinaison simple (mitose)

172 13.5 Modle Holliday

173 13.6 Crossing-over

175 Chapitre 14 : Construction de vecteurs

176 14.1 Carte du virus SV40

177 14.2 Construction dun vecteur

179 14.3 Vecteurs hybrides

181 Chapitre 15 : Transgnse

182 15.1 Vecteurs de thrapie183 15.2 Souris knock out


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Plan du cours



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Objectifs


ObjectifsDes connaissances de base en enzymologie, en virologie et en biochimie des acides nucliques sont

indispensables pour suivre cet enseignement. (Objectifs pr-requis).

1. Enzymes agissant sur les acides nucliques

Pour chacune des enzymes suivantes, utilises au laboratoire de biologie molculaire,

connatre1 les facteurs en prsence utiles la raction (substrat, modles, produits, co-

facteurs, effecteurs, conditions physiques), la spcificit de lactivit enzymatique et

donner des exemples de lusage quon peut en faire : polynuclotide kinase, terminal

transferase, phosphatase alcaline, DNA polymrases, reverse transcriptase, RNA poly-

mrases, poly(A) polymrase, DNA ligases, RNA ligase, topoisomrase, enzymes de

restriction, ribonuclases (A, T1, H), dsoxyribonuclases, protinase K, -galactosida-

se.

2. Prparation des acides nucliques

Dfinir 2 les termes suivants : oligonuclotide, sonde, ADN complmentaire.

Dcrire les gestes3 qui permettent de faire lextraction et la purification dADN gnomi-

que partir dun prlvement de sang.

Expliquer le principe de lextraction de lARN messager dun tissu et de la ralisation

pratique dune banque de cDNA.

Dcrire les gestes qui permettent de faire lamplification par PCR dun fragment dADN

dont on possde les amorces.

Expliquer le principe de la synthse dun oligonuclotide au moyen dun synthtiseur et

de la technique des phosphoramidites.

Dcrire les gestes qui permettent de faire la synthse dune queue de nuclotides lex-

trmit dun fragment dADN.

Expliquer le principe du dosage des acides nucliques. Faire le calcul de la quantit

dacides nucliques partir des donnes brutes fournies par un spectrophotomtre, en te-

nant compte des dilutions et du volume du milieu considr.

Expliquer le principe de lhybridation dune sonde. Faire le calcul de la Tm de cette son-

1. Connatre

corps chimique : crire sa formule dveloppe, numrer les molcules simples dans une structure complexe

et nommer les liaisons qui les unissent, expliquer une exprience mettant en vidence une proprit

chimique ou physique ;

image : dessiner un objet ou une structure ;

raction : crire lquation chimique ;

voie mtabolique : tablir son bilan chimique partir des ractions de chaque enzyme.

2. Dfinir : prciser dans une phrase concise lessence dun objet ou les limites dun concept en excluant

toute notion trangre et en comprenant toutes les variations possibles de lobjet ou du concept cern.

3. Expliquer le principe, dcrir e ou mimer les gestes ou faire un schma explicatif: prciser le motif de

chacun de ces gestes. Etre capable de dceler une erreur qualitative dans la description dun protocole.

Au niveau des travaux pratiques, les connaissances techniques thoriques tant acquises, on devra tre capa-

ble de passer la manipulation sans avoir apprendre que la partie proprement manuelle.


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Objectifs


de partir de sa squence et dune formule de calcul. Etablir les conditions des phases

dun programme de PCR utilisant deux amorces de Tm voisines. Expliquer les tapes des

techniques dhybridation molculaire qui auront t pratiques ou expliques en cours

titre dexemples : hybridation sur filtre, hybridation in situ, hybridation en solution.

Dcrire le principe technique et les gestes qui permettent de faire le marquage dune son-

de par un atome de 32P ou par un nuclotide marqu. Expliquer le principe du squenage dun fragment dADN au moyen dun squenceur

et de la technique des dye primers ou des dye terminators ; dcrire et interprter les r-

sultats1 apparaissant sur lcran de lordinateur aprs un squenage automatique.

Expliquer les principes de la recherche des lments cis-rgulateurs sur la squence dun

promoteur (foot printing).

Expliquer le principe des ractions permettant le dosage des ARN transcrits : PCR quan-

titative, protection la Rnase.

3. Exemples dapplications

Dcrire et interprter les rsultats danalyse (sur un exemple emprunt au cours, aux T.P.ou votre exprience personnelle) dune lsion molculaire conduisant une expression

anormale du gne considr : mutation faux-sens, non-sens, dcalage du cadre de lectu-

re, protine tronque,

Expliquer les tapes (sur un exemple emprunt au cours, aux T.P. ou votre exprience

personnelle) des techniques ayant permis : un diagnostic gnotypique, une analyse gni-

que ou une empreinte gntique : RFLP, carte de restriction, haplotypes, squenage.

4. Gnie gntique

Dfinir les termes suivants : vecteur, clonage, polylinker, plasmide.

Dcrire les tapes de linsertion dun fragment dADN dans un plasmide.

Expliquer les tapes (sur un exemple emprunt au cours, aux T.P. ou votre exprience

personnelle) des techniques ayant permis : une mutagnse, la transposition dun gne

dans une bactrie, la cration dun animal ou dune plante transgnique.

Expliquer le principe de la construction dun vecteur : cet objectif servira tester la fa-

cult pour ltudiant(e) de faire une synthse des connaissances de lensemble des cha-

pitres prcedents.

1. Interpreter les rsultats : partir des donnes affiches par la machine, aprs la validation technique de

la squence, savoir dcrire la structure de lacide nuclique squen et reconnatre sur cette squence des

lsions molculaires dont linterprtation ne ncessite la leve daucune ambigut.


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Enzymes agissant sur les acides nucliques


Partie I

Enzymes agissant sur les

acides nucliquesRappel des objectifs

Pour chacune des enzymes suivantes, utilises au laboratoire de biologie molculaire, conna-

tre1 les facteurs en prsence utiles la raction (substrat, modles, produits, cofacteurs, effec-

teurs, conditions physiques), la spcificit de lactivit enzymatique et donner des exemplesde lusage quon peut en faire : polynuclotide kinase, terminal transferase, phosphatase alca-

line, DNA polymrases, reverse transcriptase, RNA polymrases, poly(A) polymrase, DNA

ligases, RNA ligase, topoisomrase, enzymes de restriction, ribonuclases (A, T1, H), d-

soxyribonuclases, protinase K, -galactosidase.

1. Connatre

corps chimique : crire sa formule dveloppe, numrer les molcules simples dans une structure complexe

et nommer les liaisons qui les unissent, expliquer une exprience mettant en vidence une proprit

chimique ou physique ;

image : dessiner un objet ou une structure ;

raction : crire lquation chimique ;

voie mtabolique : tablir son bilan chimique partir des ractions de chaque enzyme.


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Enzymes agissant sur les acides nucliques



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Phosphorylation - dphosphorylation


Chapitre 1

Phosphorylation -

dphosphorylation


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1.1 Polynuclotide-kinase

BG 01

La polynuclotide kinase catalyse le transfert du phosphate de lATP sur une fonction alcooldu carbone 5 dun ADN ou dun ARN. Le substrat requiert une dphosphorylation pralable

si la fonction est estrifie.

Lenzyme catalyse aussi lchange du phosphate 5 terminal dun ADN ou dun ARN avec le

phosphate de lATP, en prsence dADP comme accepteur de phosphate.

La polynuclotide kinase du commerce est extraite dune bactrie (E. coli ) infecte par le pha-

ge T4. Une unit denzyme catalyse le transfert de 33 picomoles de phosphate par minute

37 C.

La polynuclotide kinase est utilise au laboratoire pour incorporer du phosphate radioactif

(32P) sur lextrmit 5 dun acide nuclique, soit par transfert, soit par change.


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1.2 Polynuclotide kinase T4

BG 02

La polynuclotide kinase catalyse le transfert du phosphate de lATP sur une fonction alcooldu carbone 5 dun ADN ou dun ARN. Le substrat requiert une dphosphorylation pralable

si la fonction est estrifie. Lenzyme catalyse aussi lchange du phosphate 5 terminal dun

ADN ou dun ARN avec le phosphate de lATP, en prsence dADP comme accepteur de

phosphate.

La polynuclotide kinase du commerce est extraite dune bactrie (E. coli ) infecte par le bac-

triophage T4. Une unit denzyme catalyse le transfert de 33 picomoles de phosphate par mi-

nute 37 C.

La polynuclotide kinase est utilise au laboratoire pour incorporer du phosphate radioactif

(32P) sur lextrmit 5 dun acide nuclique, soit par transfert, soit par change.


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1.3 Terminal tr ansferase

BG 03

La transfrase terminale catalyse laddition de dsoxynuclotides sur une fonction alcool3OH terminale de lADN. Lenzyme prfre les molcules dADN dont lextrmit 3OH est

sortante, mais il existe des conditions qui favorisent la catalyse sur lADN bouts francs, voi-

re sur les extrmits 3OH rentrantes. Elle incorpore plus spcifiquement les purines ou les

pyrimidines en fonction du cation divalent quon lui donne comme cofacteur : Mg++ pour les

purines, Co++ pour les pyrimidines ou encore Mn++.

La transfrase terminale du commerce est extraite du thymus de veau. Une unit denzyme

catalyse le transfert de 17 picomoles de dsoxyribonuclotide par minute 37 C.

La transfrase terminale est utilise au laboratoire pour :

construire des squences polymrises de nuclotides (queues) lextrmit 3OH de

lADN (en vue du clonage des fragments dADN) ;

marquer les extrmits 3 de lADN avec un nuclotide marqu sur le phosphate ;

ajouter un nuclotide la fin dune squence pour induire une mutation (mutagnse di-

rige).


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1.4 Phosphatase alcaline

BG 04

Les phosphatases sont des enzymes trs large spcificit, hydrolysant le radical phosphoryleport par une liaison ester ou anhydride... On les divise en plusieurs classes en fonction de leur

pH optimum daction : phosphatases acides, phosphatases alcalines. Certaines phosphatases

ont une spcificit de substrat plus troite : 5 nuclotidase. La raction catalyse par les phos-

phatases est irrversible, mais certaines sont capables dchanger le radical phosphate partir

de molcules plus riches en nergie comme le pyrophosphate.

La phosphatase alcaline du commerce est celle extraite de lintestin de veau. Une unit den-

zyme catalyse lhydrolyse dune micromole de paranitrophnylphosphate par minute 37 C.

La phosphatase alcaline est utilise au laboratoire pour dphosphoryler les extrmits 5 des

acides nucliques, soit pour prparer un marquage en 5 par une polynuclotide kinase, soit

pour empcher la rannalisation dun ADN circulaire linaris (vecteurs de clonage).


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Les polymrases


Chapitre 2

Les polymrases


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Les polymrases


2.1 DNA polymrase (raction)

BG 05

Les DNA-polymrases sont des enzymes du noyau cellulaire qui agissent en phase S du cyclepour doubler systmatiquement lensemble du gnome diplode.

Dautres DNA polymrases interviennent dans la synthse des amorces RNA/DNA, dans la

rplication du gnome mitochondrial ou dans la rparation du DNA.

Elles ne peuvent dmarrer la condensation des nuclotides que sur la fonction alcool en 3 du

ribose du dernier nuclotide dune amorce, nuclotide qui doit tre hybrid avec le nuclotide

complmentaire qui sert de modle.

Elles utilisent comme substrats des dsoxyribonuclotides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP

et dTTP) et des amorces de RNA et de DNA synthtises par une primase (RNA polymrase

capable de synthtiser un brin de RNA complmentaire dun brin de DNA sur 10 nuclotides)

suivie dune DNA polymrase (qui prolonge lamorce de RNA de 20 dsoxyribonucloti-

des environ). Elles synthtisent lADN nouveau par fragments qui, aprs excision des amorces, sont lis en-

tre eux par une DNA-ligase.

Elles ont aussi une activit exonuclasique, qui leur permet en particulier dhydrolyser le der-

nier nuclotide en 3 du brin synthtis si celui-ci ne sapparie pas correctement avec le nu-

clotide complmentaire du brin modle.


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Les polymrases


2.2 DNA polymrase (exonuclase 35)

BG 05/1

Les DNA-polymrases sont des enzymes du noyau cellulaire qui agissent en phase S du cyclepour doubler systmatiquement lensemble du gnme diplode.

Dautres DNA polymrases interviennent dans la synthse des amorces RNA/DNA, dans la

rplication du gnome mitochondrial ou dans la rparation du DNA.

Elles ne peuvent dmarrer la condensation des nuclotides que sur la fonction alcool en 3 du

ribose du dernier nuclotide dune amorce, nuclotide qui doit tre hybrid avec le nuclotide

complmentaire qui sert de modle.

Elles utilisent comme substrats des dsoxyribonuclotides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP

et dTTP) et des amorces de RNA et de DNA synthtises par une primase (RNA polymrase

capable de synthtiser un brin de RNA complmentaire dun brin de DNA sur 10 nuclotides)

suivie dune DNA polymrase (qui prolonge lamorce de RNA de 20 dsoxyribonucloti-

des environ). Elles synthtisent lADN nouveau par fragments qui, aprs excision des amorces, sont lis en-

tre eux par une DNA-ligase.

Elles ont aussi une activit exonuclasique, qui leur permet en particulier dhydrolyser le der-

nier nuclotide en 3 du brin synthtis si celui-ci ne sapparie pas correctement avec le nu-

clotide complmentaire du brin modle.


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Les polymrases


2.3 DNA polymrase (fonction ddition)

BG 05/2

Les DNA polymrases ont la fois une activit de polymrase pour ajouter des nuclotidesau nouveau brin de DNA, et une activit de 35 exonuclase pour hydrolyser le dernier nu-

clotide incorpor.

Si le nuclotide incorpor est complmentaire du nuclotide du brin modle et donc que lhy-

bridation des bases se fait normalement, lactivit de polymrase est plus rapide que celle

dexonuclase et le nuclotide suivant va tre incorpor.

Si le nuclotide incorpor nest pas complmentaire du nuclotide du brin modle et donc

quil y a msappariement, lactivit dexonuclase est plus rapide que celle de polymrase et

ce nuclotide sera hydrolys.


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Les polymrases


2.4 DNA-polymrases (tableau)

BG 06

Les DNA polymrases sont des enzymes qui catalysent la synthse de lADN partir des d-soxyribonuclosides triphosphates en recopiant la squence dune matrice dADN. Certaines

dentre elles ont aussi des activits dexonuclase qui peuvent sexercer de 5 vers 3 ou dans

lautre sens, afin de corriger les erreurs dincorporation (fonction ddition). Les DNA poly-

mrases sont spcifiques de lADN double brin et incorporent les nuclotides pour faire la

synthse dun deuxime brin en utilisant le premier comme matrice. Les DNA polymrases

ont besoin dune amorce (extrmit 3OH rentrante dun deuxime brin) pour initier la

raction.

Tous les tres vivants ont besoin dune DNA polymrase pour la rplication de leur ADN. Ce

sont en gnral des protines denviron 100000 daltons. Celles des tres vivants les plus sim-

ples (virus, archobactries) sont souvent dpourvues de fonctions ddition. Toutes les DNA

polymrases exigent la prsence de lion magnsium. Beaucoup dentre elles fonctionnent enmilieu alcalin. Leur temprature optimale daction se situe habituellement dans une fourchette

de 20 40 C.


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Les polymrases


2.5 DNA pol I (E. Coli )

BG 07

La DNA polymrase I dEscherichia coli (DNA pol I) est une protine qui assure la fonctionde rplication de lADN bactrien.

Elle initie la raction lextrmit 3 rentrante dune amorce dADN ou dARN. Elle incor-

pore des nuclotides partir des quatre dsoxyribonuclosides triphosphates, en hydrolysant

un pyrophosphate et en incorporant le nucloside et le phosphate . Lorsque cet atome de

phosphore est radioactif, le brin dADN produit est aussi marqu.

DNA pol I est doue dune double fonction ddition :

exonuclase 53 pour digrer le deuxime brin partir de son extrmit 5 (nick

translation )

exonuclase 35 pour digrer lextrmit 3 dun brin (correction immdiate des mi-

sappariements) Les activits dexonuclase sexercent aussi sur les brins dARN hybrids (amorces).

DNA pol I est utilise pour la synthse de brins dADN marqus sur toute la longueur de la

chane par la technique de translation de brche avec des dNTP marqus.


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Les polymrases


2.6 Fr agment de Klenow

BG 07/1

La digestion de la DNA polymrase I par une protase (subtilisine) donne deux fragments :celui de 76 kD (fragment de Klenow) possde encore deux des activits catalytiques de la

polymrase : 53 polymrase et 35 exonuclase. Ce fragment peut-tre utilis pour

synthtiser le deuxime brin partir dun ADN simple brin et dune amorce.

La raction est la mme que celle de la DNA polymrase I. Les conditions de milieu et la vi-

tesse de raction sont les mmes que celles de lenzyme entire.

Le fragment de Klenow est utilis pour :

la synthse du deuxime brin, complmentaire dun cDNA ;

le marquage des extrmits 5 sortantes du DNA double brin ;

le marquage du DNA par la technique des amorces alatoires ;

le squenage du DNA par la technique des didsoxynuclotides ; la mutagnse dirige partir doligonuclotides synthtiques.


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Les polymrases


2.8 Sequenase

BG 09

Les squenases sont une famille denzymes issues de la DNA polymrase du bactriophageT7. Elles sont constitues dune protine du phage (gne 5) et dune protine de la cellule-hte

(thioredoxine). Elles sont dpourvues par une modification du gne de toute activit ddition

(53 exonuclase et 35 exonuclase).

Les squenases sont les plus rapides de toutes les DNA polymrases.

Les squenases sont utilises dans les techniques de squenage avec des didsoxyribonu-

clotides (Sanger). Elles sont responsables de quelques erreurs dfaut dactivit ddition :

de lordre de 1 misappariement pour 1000 paires de bases.


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Les polymrases


2.9 Taq polymrase

BG 10

Thermus aquaticus est une bactrie thermophile des sources chaudes du parc de Yellowstone(Californie). Elle possde des enzymes thermorsistantes, dont une DNA polymrase (Taq

polymrase) rsistante lbullition et active 75-80 C. La Taq polymrase est dpourvue

dactivits ddition (53 exonuclase et 3 5 exonuclase).

La Taq polymrase est inhibe par les ions phosphates.

La Taq polymrase est utilise pour la raction de polymrisation en chane (Polymerase

Chain Reaction = PCR), technique courante damplification des fragments de DNA. Parce

quelle est dpourvue dactivits ddition la Taq polymrase est responsable de nombreux

misappariements : de lordre de 1 pour 100 paires de bases.


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Les polymrases


2.10 Reverse tr anscr iptase

BG 11

Les transcriptases rverses sont des DNA polymrases qui peuvent synthtiser un brin dADNcomplmentaire (ADNc ou cDNA) en prenant un ARN comme matrice, pour former un hy-

bride ADN:ARN. Elles catalysent donc la raction inverse de la transcription, do le nom de

transcriptases rverses.

Les transcriptases rverses sont produites par des cellules infectes par des rtrovirus, virus

ARN qui font synthtiser un ADNc par la cellule-hte afin de permettre leur rplication.

La transcriptase rverse est utilise pour ltude des ARN. Aprs la synthse de lADN com-

plmentaire, on dtruit lARN matrice, puis on soumet lADNc lamplification par la PCR,

qui fournit une grande quantit dADNc hybrid avec une copie ADN de la squence de

lARN de dpart.


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Les polymrases


2.11 RNA polymrase II (raction)

BG 12

La RNA polymrase II est lenzyme de la transcription des gnes exprims sous forme de pro-tines. Elle est inhibe spcifiquement par un poison extrait de lAmanite phallode, l-ama-

nitine.

Elle est prsente dans tous les noyaux cellulaires. Sa masse molculaire est de 500000 daltons

pour 10 sous-units.

La transcription quelle catalyse ncessite des ribonuclosides triphosphates comme substrats

(ATP, CTP, GTP et UTP), plusieurs cofacteurs protiniques (transcription factors TFIIA

TFIIJ). Lnergie de la raction est fournie par lhydrolyse des liaisons riches en nergie des

nuclosides triphosphates (42 kJ/mol).


31/183

Les polymrases


2.12 RNA polymrases (phages)

BG 13

Les RNA polymrases sont les enzymes de la transcription. Elles sont essentielles au cycledes bactriophages ADN comme le SP6 de Salmonella typhimurium ou le phage T7 dEs-

cherichia coli . Elles sont trs spcifiques des promoteurs correspondants. Lorsque ces pro-

moteurs sont rguls par un inducteur spcifique, la prsence de cet inducteur est

indispensable la raction.

Les RNA polymrases des phages sont capables dincorporer 17 picomoles de nuclotides

la minute 37 C.

Les RNA polymrases des phages sont utilises pour la transcription in vitro, pour la synthse

des sondes dARN et pour lanalyse des messagers (protection la RNase).


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Les polymrases


2.13 Poly(A) polymrase

BG 14

Lextrmit 3OH terminale du dernier exon du transcrit est dabord coupe par une nuclaseenviron 15 nuclotides aprs la bote de polyadnylation.

Ensuite, une polymrase additionne des nuclotides adnine (plusieurs centaines) pour

constituer une queue polyA. La raction se fait sans matrice, partir de lATP et en pr-

sence de Magnsium. Le pyrophosphate produit est hydrolys.

La queue polyA est indispensable la sortie du mRNA du noyau vers le cytoplasme. Elle pro-

tge le mRNA au cours de la traduction. Les mRNA dsadnyls ne sont plus traduits et seront

rapidement digrs par la ribonuclase.

Ces deux activits (nuclase et polymrase) seraient catalyses par un mme complexe

multienzymatique : polyA polymrase ou polyadnylyl synthtase.


33/183

Les ligases


Chapitre 3

Les ligases


34/183

Les ligases


3.1 DNA ligase (raction)

BG 15

Les DNA ligases sont des enzymes qui sont capables de reconstituer la liaison phosphoesterentre le carbone 3-OH et le phosphate-5 de deux nuclotides voisins sur un brin de DNA.


35/183

Les ligases


3.2 DNA ligase (E. Coli)

BG 16

Les DNA ligases catalysent la liaison de lextrmit 5-phosphate terminale dun brin dADNavec lextrmit 3-OH terminale dun autre brin. La DNA ligase de E. coli ne lie les bouts

francs de lADN quen prsence de ractifs dexclusion (polythylne glycol ou Ficoll), mais

elle est toujours active pour souder les fragments dADN double brin extrmits collantes,

ou pour fermer une brche dans un brin dADN dont la resynthse est acheve.

La DNA ligase de E. coli utilise le NAD+ comme coenzyme donneur dnergie selon la

raction :

Elle na pas dactivit sur les RNA. Les DNA ligases sont utilises dans le clonage des fragments dADN et dans la construction

des vecteurs.

NAD+ NMN+ + AMP


36/183

Les ligases


3.3 DNA ligase (phage T4)

BG 17

La DNA ligase du bactriophage T4 est moins spcifique que celle deE. coli : elle lie bienles fragments de DNA bouts francs et fonctionne dans la plupart des tampons utiliss par les

enzymes de restriction. La T4 DNA ligase agit aussi mais moins rapidement sur les ARN.

La DNA ligase du phage T4 utilise lATP comme donneur dnergie.


37/183

Les ligases


3.4 RNA ligase (phage T4)

BG 18

La RNA ligase du bactriophage T4 catalyse la liaison des fonctions 5-phosphate des ADNou ARN simple brin la fonction 3-OH dautres fragments simple brin dARN ou dADN.

Lenzyme est capable de lier un fragment dun seul nuclotide.

La RNA ligase du bactriophage T4 est utilise pour le marquage des ARN sur leur extrmit

3 et pour la synthse doligonuclotides.


38/183

Les ligases



39/183

Les isomrases


Chapitre 4

Les isomrases


40/183

Les isomrases


4.1 Topoisomrase

BG 19

La rplication ou la transcription de lADN ncessite une fusion partielle de la double hliceet modifie lenroulement des deux brins.

Afin de permettre ces ractions, la topoisomrase est capable de modifier lenroulement en

hydrolysant un brin de lADN et en le reconstituant aprs avoir fait le tour de lautre brin.

Aprs cette opration, la torsion de la double hlice tend se rapprocher de la valeur normale :

pas de lhlice = 10 paires de nuclotides par tour. Au cours de la rplication et de la traduction

le pas de lhlice diminue en avant des polymrases et lhlicase (une des topoisomrases) tra-

vaille alors pour augmenter le pas. Au contraire en arrire des polymrases les topoisomrases

ajoutent des tours pour reconstituer la double hlice.


41/183

Les nuclases


Chapitre 5

Les nuclases


42/183

Les nuclases


5.1 Fr agment de restr iction (dfinition)

BG 20

Les endonuclases de restriction sont des enzymes bactriennes participant un mcanismede dfense des bactries vis--vis des virus : systme de restriction-mthylation.

Elles catalysent la coupure de lADN non mthyl en des endroits caractriss par une squen-

ce spcifique de nuclotides (site de restriction). Les produits de cette digestion sont les frag-

ments de restriction, dont la longueur, toujours la mme pour un ADN donn, ne dpend que

de la squence primaire de cet ADN.

Lanalyse de la longueur des fragments de restriction, la recherche de variations individuel-

les (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des techniques

danalyse de la squence primaire de lADN la recherche de substitutions, dinsertions ou

de dltions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur des fragments

de restriction.

Les extrmits des fragments de restriction peuvent tre formes de deux brins dgale lon-gueur (bouts francs) ou bien prsenter un brin plus long que lautre de quelques nuclotides

(bouts collants).


43/183

Les nuclases


5.2 Systme de r estr iction-modification

BG 20/1

Les Bactries sont lyses sous leffet de virus bactriophages dont lADN est rpliqu par laBactrie elle-mme avant sa destruction.

Pour dtruire lADN du parasite la Bactrie exprime des gnes de restriction et de mthyla-

tion. Les gnes de restriction permettent la synthse dendonuclases coupant lADN en des

sites trs spcifiques.

Afin de protger lADN bactrien de lhydrolyse par lenzyme, une mthylase, code par le

gne de mthylation, va modifier les nuclotides de lADN bactrien en les mthylant pour

quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction.

Lensemble du gne de restriction et du gne de mthylation constitue un systme de dfense

de la Bactrie vis--vis des phages.


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Les nuclases


5.3 Nomenclature des enzymes de restr iction

BG 21

Les enzymes de restriction sont des hydrolases (classe 3 de la E.C.) agissant sur des liaisonsesters (sous-classe 3.1), cest--dire des estrases.

Parmi les estrases on distingue celles qui hydrolysent un acide nuclique en fragments poly-

nuclotidiques (endonuclases) et en particulier celles dont les produits gardent leur phospha-

te 5 initial (sous-sous-classe 3.1.21).

Enfin en fonction des cofacteurs, les enzymes de restriction ne ncessitent que la prsence de

lion Mg++ dans le milieu (3.1.21.4)

Le nom de chaque enzyme est driv du nom despce ou de varit de la Bactrie qui la pro-

duit. On crit linitiale du nom du genre, les deux initiales du nom de lespce, 1 lettre ou

1 nombre pour dsigner la varit (ou souche) et aprs un espace un chiffre romain pour d-

signer successivement les diffrentes enzymes de restriction obtenues partir de la mme sou-

che.


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Les nuclases


5.4 Restr iction (raction gnrale)

BG 22

La raction gnrale catalyse par les enzymes de restriction implique la prsence dans le mi-lieu ractionnel des facteurs suivants :

Enzyme (3.1.21.n)

Substrat : ADN double brin non digr

Produit : ADN double brin digr

Cofacteurs

En gnral, seul le Mg++ est indispensable. Quelques endonuclases font appel dautres co-

facteurs. Les enzymes de mthylation ont pour coenzyme la S-Adnosyl-Mthionine (S-Ado-

Met).

Des facteurs physiques contrlent aussi ces ractions : pH, potentiel doxydorduction, force

ionique. Lnergie libre dgage par lhydrolyse est suffisamment importante pour que laraction ne soit pratiquement pas rversible dans les conditions habituelles.


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Les nuclases


5.5 Tampons dincubation (restriction)

BG 22/1

Diffrents tampons sont utiliss pour les enzymes de restriction permettant loptimisation desractions de multiples enzymes avec le mme tampon.

Toutes les enzymes de restriction ncessitent la prsence de lion Mg++

Le pH (7,0 - 7,9), le potentiel doxydo-rduction (dithiothritol 1 mM), la force ionique (NaCl

ou CH3COOK de 0 100 mM) varient dun tampon lautre.

De rares enzymes ncessitent des conditions spciales prcises par leur mode demploi.


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Les nuclases


5.6 EcoR I

BG 23

EcoR I est une enzyme de restriction produite parEscherichia coli, souche R. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides :

Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur

les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons

phosphodiester se fait loin du centre de symtrie du palindrome certaines paires de nucloti-

des restent non apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts collants .

La mthylation des adnines ou de la cytosine du site dhydrolyse inhibent la reconnaissancedu site par EcoR I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN

parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

5 GAATTC 3

3 CTTAAG 5


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Les nuclases


5.7 EcoR V

BG 24

EcoR V est une enzyme de restriction produite parEscherichia coli, souche R. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides :



phosphodiester se fait au centre de symtrie du palindrome toutes les paires de nuclotides

restent apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts francs .

La mthylation des adnines du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par EcoR V.LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest

pas mthyl sera hydrolys.

5 GATATC 3

3 CTATAG 5


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Les nuclases


5.8 Pvu II

BG 24/1

Pvu II est une enzyme de restriction produite parProteus vulgaris. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides :





La mthylation des cytosines au niveau du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du sitepar Pvu II. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite

qui nest pas mthyl sera hydrolys.

5 CAGCTG 3

3 GTCGAC 5


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Les nuclases


5.9 Hae III

BG 25

Hae III est une enzyme de restriction produite parHaemophilus aegypticus. Le site de liaison lADN est form de quatre paires de nuclotides :





La mthylation de la cytosine immdiatement en aval du site dhydrolyse inhibe la reconnais-sance du site par Hae III. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que

lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

5 GGCC 3

3 CCGG 5


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Les nuclases


5.10 Pvu I

BG 26

Pvu I est une enzyme de restriction produite parProteus vulgaris. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides :





La mthylation de la deuxime cytosine proche du site dhydrolyse inhibe la reconnaissancedu site par Pvu I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN


5 CGATCG 3

3 GCTAGC 5


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Les nuclases


5.11 Pst I

BG 26/1

Pst I est une enzyme de restriction produite parProvidencia stuartii. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides :





La mthylation de la premire cytosine ou de ladnine du site dhydrolyse inhibent la recon-naissance du site par Pst I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que

lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

5 CTGCAG 3

3 GACGTC 5


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Les nuclases


5.12 Kpn I

BG 26/2

Kpn I est une enzyme de restriction produite parKlebsiella pneumoniae. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides :





La mthylation de ladnine ou des cytosines du site dhydrolyse inhibent la reconnaissancedu site par Kpn I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN


5 CTGCAG 3

3 GACGTC 5


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Les nuclases


5.13 Alphabet dgnr

BG 27

La spcificit large de certaines enzymes ou encore la dgnrescence du code gntique im-plique quon doit indiquer quelquefois dans les squences des lettres correspondant plu-

sieurs bases azotes diffrentes pour le mme nuclotide prsent une position.

Le choix peut porter sur deux des 4 nuclotides : A ou G, C ou T, G ou T, A ou C, C ou G, A

ou T ; ou bien sur 3 nuclotides : C, G ou T, A, G ou T, A, C ou T, A, C ou G ; ou enfin sur

les 4 nuclotides : A, C, G ou T.

Les rgles de complmentarit impliquent videmment une dgnrescence de la squence de

lautre brin en regard dune position dgnre.


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Les nuclases


5.14 Ava II

BG 28

Ava II est une enzyme de restriction produite parAnabaena variabilis. Le site de liaison lADN est form de cinq paires de nuclotides :





La mthylation des cytosines du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Ava II.LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest


5 GGWCC 3

3 CCWGG 5


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Les nuclases


5.15 Hind II

BG 29

Hind II est une enzyme de restriction produite parHaemophilus influenzae, souche Rd. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides :





La mthylation de ladnine du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Hind II.LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest


5 GTYRAC 3

3 CARYTG 5


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Les nuclases


5.16 Hga I

BG 30

Hga I est une enzyme de restriction produite parHaemophilus gallinarum. Le site de liaison lADN est form de cinq paires de nuclotides :

Les sites de restriction ne sont quelquefois pas des palindromes, cest dire quils sont diff-

rents sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lhydrolyse des

liaisons phosphodiester se fait en dehors du site de liaison et le site hydrolys nest pas dans

le site de restriction. Pour indiquer le site de coupure on ajoute la squence du site de res-

triction une fraction indiquant le nombre de nuclotides en aval de la squence qui sparentlextrmit 3 de la squence du site de coupure sur le brin de la squence et sur le brin

complmentaire : ici, 5 nuclotides en aval de la squence sur le brin de la squence et 10 nu-

clotides sur le brin complmentaire. Ici, il va rester des nuclotides non apparis : les frag-

ments de restriction sont donc bouts collants .

La mthylation de la deuxime cytosine du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site

par Hga I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite


5 GACGC 3

3 CTGCG 5


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Les nuclases


5.17 Mbo II

BG 31

Mbo II est une enzyme de restriction produite parMoraxella bovis . Le site de liaison lADN est form de cinq paires de nuclotides :

Les sites de restriction ne sont quelquefois pas des palindromes, cest dire quils sont diff-

rents sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lhydrolyse des

liaisons phosphodiester se fait en dehors du site de liaison et le site hydrolys nest pas dans

le site de restriction. Pour indiquer le site de coupure on ajoute la squence du site de res-

triction une fraction indiquant le nombre de nuclotides en aval de la squence qui sparentlextrmit 3 de la squence du site de coupure sur le brin de la squence et sur le brin

complmentaire : ici, 8 nuclotides en aval de la squence sur le brin de la squence et 7 nu-

clotides sur le brin complmentaire.

La mthylation de la dernire adnine du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par

Mbo II. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui

nest pas mthyl sera hydrolys.

5 GAAGA 3

3 CTTCT 5


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Les nuclases


5.18 Hha I

BG 32

Hha I est une enzyme de restriction produite parHaemophilus haemolyticus. Le site de liaison lADN est form de quatre paires de nuclotides :



phosphodiester se fait en dehors du centre de symtrie du palindrome certaines paires de nu-

clotides restent non apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts collants .

La mthylation des cytosines au niveau du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du sitepar Hha I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite


5 GCGC 3

3 CGCG 5


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Les nuclases


5.19 Hpa I

BG 33

Hpa I est une enzyme de restriction produite parHaemophilus parainfluenzae. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides :





La mthylation de la deuxime adnine de la squence inhibe la reconnaissance du site parHpa I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui

nest pas mthyl sera hydrolys.

5 GTTAAC 3

3 CAATTG 5


61/183

Les nuclases


5.20 Digestion dune squence (Hae III)

BG 34

Voici le rsultat de la digestion du gne de lapoA-II (brin codant) par Hae III. Chacune des squences GGCC engendre une coupure de lADN, ce qui produit des fragments

de restriction dont le longueur dpend de la frquence de cette squence sur lADN.

On peut tablir des cartes des emplacements de ces sites sur lADN (cartes de restriction).

La recherche de ces sites sur lADN extrait dun sujet permet de dtecter des squences dif-

frentes qui ajoutent ou suppriment des sites de restriction. Il en rsulte que les fragments de

restriction chez ces individus nont pas la mme longueur que les mmes fragments chez les

autres individus : il y a un polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP =

Restriction Fragment Length Polymorphism).


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Les nuclases


5.21 Digestion dune squence (Mbo II)

BG 34/1

Voici le rsultat de la digestion du gne de lapoA-II (brin codant) par Mbo II. Mbo II est spcifique dun site non palindromique donc dissymtrique : GAAGA (N)8/7. Cha-

cune des squences GAAGA engendre une coupure de lADN, huit nuclotides cot 3 du

site. La squence doit tre recherche sur les deux brins, ou bien on peut rechercher la squen-

ce complmentaire TCTTC qui engendre une coupure sept nuclotides cot 5.

On peut tablir des cartes des emplacements de ces sites sur lADN (cartes de restriction).

La recherche de ces sites sur lADN extrait dun sujet permet de dtecter des squences dif-

frentes qui ajoutent ou suppriment des sites de restriction. Il en rsulte que les fragments de

restriction chez ces individus nont pas la mme longueur que les mmes fragments chez les

autres individus : il y a un polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP =

Restriction Fragment Length Polymorphism).


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Les nuclases


5.22 Ribonuclase A

BG 35

La ribonuclase A est lenzyme de la digestion des ARN chez les animaux. Elle agit commeune endonuclase, prfrentiellement aprs les nuclotides pyrimidine, en hydrolysant la

liaison entre le phosphate et le carbone 5 du nuclotide suivant. Elle hydrolyse les ARN jus-

qu un mlange doligonuclotides se terminant tous par un nuclotide pyrimidine estrifi

par un phosphate en 3.

La ribonuclase pancratique est une des plus petites et des mieux connues des enzymes. Elle

est thermorsistante et extrmement active.

Il existe des inhibiteurs de la RNase : soit des dtergents comme le SDS (laurylsulfate de so-

dium), soit des protines comme celle extraite du placenta qui est souvent utilise pour prot-

ger les ARN dans les ractions enzymatiques.


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Les nuclases


5.23 Ribonuclase T1

BG 36

La ribonuclase T1 hydrolyse spcifiquement les ARN en rompant les liaisons 3-5 phospho-diester en aval des GMP, de telle manire que le produit soit une guanosine 3-phosphate ou

un oligonuclotide se terminant par une guanosine 3-phosphate.

Elle est utilise pour hydrolyser les ARN non-hybrids lors des expriences dhybridation

ARN:ADN.


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Les nuclases


5.24 Ribonuclase H

BG 37

La ribonuclase H est une ribonuclase bactrienne qui intervient dans la maturation des RNAamorces qui servent initier la rplication des plasmides.

Elle est utilise lors de la synthse du deuxime brin dun cDNA issu de la reverse transcrip-

tion, afin de limiter les brins synthtiss en dehors de lamorce spcifique (self-primed

strands).


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Les nuclases


5.25 Dsoxyribonuclase I

BG 38

La dsoxyribonuclase I est lenzyme de la digestion des ADN chez les animaux. Elle hydro-lyse les ADN double ou simple brin jusqu un mlange de nuclotides et doligonuclotides.

Elle agit comme une endonuclase, prfrentiellement sur les liaisons adjacentes aux nuclo-

sides pyrimidiques. En prsence de Mg++ elle hydrolyse les liaisons au hasard indpendam-

ment de la squence ; en prsence de Mn++ elle devient plus dpendante de la squence.

La DNase pancratique est utilise pour introduire des brches au hasard dans lADN double

brin en vue dun marquage par la DNA polymrase. Elle est galement lenzyme danalyse

des sites de liaisons protine-DNA par la technique defoot-printing.


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Les nuclases


5.26 Nuclase BAL 31

BG 39

La nuclase BAL 31 est tout dabord une exonuclase 35 qui rsorbe progressivement lesextrmits 3 des ADN double brin. Sur les brins 5 sortants quelle isole elle agit ensuite

comme une endonuclase pour dtruire les fragments dADN simple brin. Elle est absolument

dpendante de la prsence de Ca++ comme cofacteur. Elle a peu dactivit sur les ARN.

La nuclase BAL 31 est surtout utilise pour le caractre progressif de son activit

exonuclasique : on peut ainsi faire disparatre un un les sites de restriction dun ADN pour

connatre lordre dans lequel ils sont prsents dans la squence de cet ADN.


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Les nuclases


5.27 Nuclase S1

BG 40

La nuclase S1 est une nuclase spcifique des ADN (ou ARN) simple brin, bien qu desconcentrations leves elle agisse aussi sur les hybrides. Elle agit en milieu acide, en prsence

dions Zinc.

La nuclase S1 est utilise :

pour faire des bouts francs aux extrmits des fragments dADN double brin ;

pour hydrolyser les fragments dADN simple brin au niveau des brches (mme sil ne

manque quune seule liaison) ;

pour isoler les hybrides ADN:ARN lors de lhybridation entre un gne et le cDNA

correspondant ;

pour ouvrir les pingles cheveux formes lors de la synthse des cDNA.


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Les nuclases


5.28 Nuclease de mung-bean

BG 41

La nuclase des germes de haricot dor est aussi une nuclase spcifique des ADN (ou ARN)simple brin, bien qu des concentrations leves elle agisse galement sur les hybrides.

Encore plus douce que la nuclase S1, elle respecte les brins dADN prsentant des brches

dune seule liaison (nicks).


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Les nuclases


5.29 Exonuclase de phage

BG 42

Les exonuclases sont des enzymes qui hydrolysent le premier ou le dernier nuclotide aubout dun brin dacide nuclique.

Lexodsoxyribonuclase du bactriophage , quon rencontre aussi chez les bactriophages

T4 ou T7, ainsi que chez les Mammifres (DNase IV), hydrolyse de prfrence les extrmits

5-phosphate des DNA double-brin en continuant vers le ct 3. (53 exonuclase). Elle

produit des nuclosides 5-phosphate.

Elle est exprime dans les cultures bactriennes infectes par ces phages.


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Les nuclases


5.30 Exonuclase III

BG 43

Les exonuclases sont des enzymes qui hydrolysent le premier ou le dernier nuclotide aubout dun brin dacide nuclique.

Lexodsoxyribonuclase III d Escherichia coli, quon rencontre aussi chez Haemophilus

influenzae , hydrolyse de prfrence les extrmits 3OH des DNA double-brin en remontant

vers le ct 5. (35 exonuclase). Elle produit des nuclosides 5-phosphate.

Cette enzyme est aussi capable dhydrolyser un radical phosphoryl li la fonction 3 alcool

du ribose du dernier nuclotide (3-phosphate terminal).


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Les nuclases



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Autres enzymes


Chapitre 6

Autres enzymes


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Autres enzymes


6.1 -galactosidase

BG 44

La -galactosidase est une enzyme dEscherichia coli. Lorsque cette bactrie pousse sur unmilieu riche en lactose, elle exprime la -galactosidase qui est un des gnes de lopron lac-

tose.

La -galactosidase hydrolyse spcifiquement les liaisons osides dans lesquelles lanomre

du galactose engage son carbone rducteur.

La -galactosidase est utilise comme gne reporter dans beaucoup de constructions de

vecteurs. On introduit le promoteur de lopron lactose et le gne de la -galactosidase dans

un vecteur puis on transfecte des bactries avec. Les bactries utilises sont dpourvues de

lopron lactose (lac-).

En faisant pousser les bactries transfectes en prsence dun inducteur de lopron lactose

(IPTG = isopropyl-thio-galactoside) on induit la synthse de lenzyme dans les colonies. En

faisant pousser ces colonies en prsence dun substrat artificiel (X-Gal, compos incolore) onpermet lhydrolyse de ce substrat par lenzyme qui libre le produit X (5Br,4Cl-indol, color

en bleu).

La prsence de ce colorant donne la preuve de lactivit de la -galactosidase, donc de son

expression partir du gne et par consquent de la viabilit du vecteur transfect dans les bac-

tries.


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Autres enzymes


6.2 Pr otinase K

BG 45

La protinase K est une protase vgtale trs active, mme en prsence de laurylsulfate(SDS) ou dEDTA, et qui na aucun effet dhydrolyse sur les acides nucliques. Elle hydro-

lyse les protines de toutes origines en quelques heures avec une prfrence pour les liaisons

peptidiques situes aprs les acides amins hydrophobes (leucine, par exemple).

La protinase K est utilise dans les techniques de prparation et de purification des acides

nucliques.


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Autres enzymes



77/183

Prparation des acides nucliques


Partie II

Pr paration des acides

nucliquesRappel des objectifs

Dfinir 1 les termes suivants : oligonuclotide, sonde, ADN complmentaire.

Dcrire les gestes2 qui permettent de faire lextraction et la purification dADN gnomique

partir dun prlvement de sang. Expliquer le principe de lextraction de lARN messager dun tissu et de la ralisation pratique

dune banque de cDNA.

Dcrire les gestes qui permettent de faire lamplification par PCR dun fragment dADN dont

on possde les amorces.

Expliquer le principe de la synthse dun oligonuclotide au moyen dun synthtiseur et de la

technique des phosphoramidites.

Dcrire les gestes qui permettent de faire la synthse dune queue de nuclotides lextrmit

dun fragment dADN.

Expliquer le principe du dosage des acides nucliques. Faire le calcul de la quantit dacides

nucliques partir des donnes brutes fournies par un spectrophotomtre, en tenant compte

des dilutions et du volume du milieu considr. Expliquer le principe de lhybridation dune sonde. Faire le calcul de la Tm de cette sonde

partir de sa squence et dune formule de calcul. Etablir les conditions des phases dun pro-

gramme de PCR utilisant deux amorces de Tm voisines. Expliquer les tapes des techniques

dhybridation molculaire qui auront t pratiques ou expliques en cours titre

dexemples : hybridation sur filtre, hybridation in situ, hybridation en solution.

Dcrire le principe technique et les gestes qui permettent de faire le marquage dune sonde

par un atome de 32P ou par un nuclotide marqu.

Expliquer le principe du squenage dun fragment dADN au moyen dun squenceur et de

la technique des dye primers ou des dye terminators ; dcrire et interprter les rsultats3 ap-

paraissant sur lcran de lordinateur aprs un squenage automatique.

1. Dfinir : prciser dans une phrase concise lessence dun objet ou les limites dun concept en excluant

toute notion trangre et en comprenant toutes les variations possibles de lobjet ou du concept cern.

2. Expliquer le principe, dcrir e ou mimer les gestes ou faire un schma explicatif: prciser le motif de

chacun de ces gestes. Etre capable de dceler une erreur qualitative dans la description dun protocole.

Au niveau des travaux pratiques, les connaissances techniques thoriques tant acquises, on devra tre capa-

ble de passer la manipulation sans avoir apprendre que la partie proprement manuelle.

3. Interpr eter les rsultats : partir des donnes affiches par la machine, aprs la validation technique de

la squence, savoir dcrire la structure de lacide nuclique squen et reconnatre sur cette squence des

lsions molculaires dont linterprtation ne ncessite la leve daucune ambigut.


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Prparation des acides nucliques


Expliquer les principe de la recherche des lments cis-rgulateurs sur la squence dun pro-

moteur (foot printing).

Expliquer le principe des ractions permettant le dosage des ARN transcrits : PCR quantita-

tive, protection la Rnase.


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Extraction et purification


Chapitre 7

Extraction et pur ification


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7.1 Pur ification des lymphocytes

BG 46

Le prlvement de sang veineux au pli du coude est la technique la plus employe pour obtenirde lADN gnomique. Le sang est recueilli sur EDTA, chlateur des ions divalents, cofacteurs

des nuclases.

Pour faciliter lextraction de lADN on isole du sang total un culot de cellules nucles, les

lymphocytes.

Le sang est dabord dpos en gradient de densit dans un tube centrifuger, au-dessus dune

couche de polyfluorocarbone liquide (Ficoll ) de densit 1,077. Le plasma flotte au dessus

de ce produit car sa densit est de 1,006. Puis on centrifuge ce gradient pendant 25 min 700 g

la temprature ambiante.

Les lymphocytes et dautres cellules blanches sont recueillies la limite suprieure de la cou-

che de Ficoll, tandis que les autres cellules plus denses ont sdiment au fond du tube.

Les lymphocytes sont enfin lavs dans du NaCl 0,15 M et recentrifugs 10 min dans les m-mes conditions. Ils forment aprs cette deuxime centrifugation un culot blanc au fond du tu-

be.


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7.2 Homognisation des tissus,

dprotinisation

BG 47

Lextraction de lADN partir des tissus se fait par broyage dans une presse tissus, suivie

dune homognisation dans un tube de Potter.

Lhomognat quon obtient est un mlange de dbris de membranes (microsomes), de nom-

breuses particules subcellulaires (noyaux, mitochondries) et de molcules en solution (cyto-

plasme).

On dissous cet homognat avec une solution de lyse (tampon sans pression osmotique, faisant

clater les membranes fermes) en prsence dEDTA et de laurylsulfate de Sodium (SDS) qui

inhibent les nuclases.

On incube enfin le milieu avec la protinase K, pour dtruire les protines en prsence du d-

tergent (SDS), la temprature ambiante et pendant toute la nuit.


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7.3 Extr action de lADN

BG 48

Les solutions dacides nucliques et de protines issues des prparations prcdentes sont pu-rifies par addition de phnol satur de tampon Tris-EDTA.

Aprs agitation douce du mlange, on spare les phases par une centrifugation de 10 min sous

10000 g la temprature de 4C. A la sortie, on distingue une phase aqueuse surnageante con-

tenant les acides nucliques en solution, une phase organique au fond du tube : phnol + lipi-

des et linterface un gateau de protines prcipites.

On recueille la phase aqueuse avant de la laver par un mlange de chloroforme (CHCl3) et

dalcool isoamylique dans un rapport 24:1 (volume:volume). On recueille nouveau une pha-

se aqueuse contenant lADN en solution et une phase organique (24:1) contenant des restes

de phnol, de protines et de lipides.


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7.4 Isolation de lARN

BG 49

Pour extraire lARN dun tissu ou dune suspension de cellules, il faut imprativement inhibertoute trace de RNase.

Lhomognisation dans le tube de Potter se fait dans un tampon Tris-EDTA en prsence de

thiocyanate de guanidinium 4 M et de SDS. Les dbris cellulaires sont sdiments en 10 min

10 C.

Le surnageant contenant les acides nucliques est dpos sur un gradient de densit compre-

nant au fond du tube une solution trs dense de CsCl 5,7 M surmonte dune couche interm-

diaire de CsCl 2,4 M. Ce gradient est ultracentrifug durant 24 heures 30000 tours/min la

temprature ambiante.

On peut alors recueillir un culot dARN de masses molculaires leves qui seront soumis

lextraction par le phnol et le chloroforme.


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7.5 Techniques de pur ification (tableau)

BG 50

Il existe de nombreuses techniques de purification des acides nucliques. On peut purifier les ADN par chromatographie dans une colonne de gel en prsence dun d-

naturant ou bien par chromatographie dadsorption.

Le plus souvent on se contente de multiples prcipitations par lthanol qui suffisent dbar-

rasser lADN des protines contaminantes et des enzymes.


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7.6 Pur ification par lthanol

BG 51

La purification dune solution dADN se fait le plus souvent par prcipitations rptes danslalcool.

Une solution dADN, porte haute force ionique par addition de NaCl 3 M (1/10 du volu-

me), est additionne dun large excs dthanol absolu -20C. Au bout de quelques minutes

au maximum, on voit apparatre un prcipit blanchtre, translucide et filamenteux (la

mduse ) constitu de longs filaments dADN prcipit.

On recueille ce prcipit par centrifugation 10000 g pendant un quart dheure environ. Pour

laver lADN on resuspend le prcipit dans de lthanol 75 % toujours -20C. puis on cen-

trifuge nouveau. Le culot de cette dernire centrifugation est goutt, puis sch sous vide.

On peut conserver lADN sec ou le redissoudre immdiatement soit dans de leau pure st-

rile, soit dans un tampon Tris-EDTA.


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7.7 Pur ification du RNA-poly(A)

BG 52

Parmi les acides ribonucliques extraits des cellules, la classe la plus tudie est celle desARN messagers. Ils se caractrisent par la prsence du ct 3-terminal dune longue queue

poly(A) synthtise la phase post-transcriptionnelle.

On utilisera une chromatographie daffinit entre cette queue poly(A) et une colonne dont la

phase fixe est pourvue de fragments doligo(dT) de quelques dizaines de nuclotides qui peu-

vent shybrider avec les RNA poly(A).

Aprs avoir lav la colonne en milieu alcalin (potasse), on charge les RNA totaux haute for-

ce ionique (KCl 0,5 M) puis on rince la colonne avec du KCl 0,1 M en surveillant labsorban-

ce de lluat 260 nm pour sassurer de llimination des RNA non retenus par la colonne

(rRNA, tRNA,... ). Enfin, on lue la fraction retenue par la colonne en abaissant la concentra-

tion de KCl 0,01 M et en levant la temprature.

Un micro essai avec la reverse transcriptase permet de sassurer de la qualit de ce RNA po-ly(A) comme matrice pour la synthse de cDNA.


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Synthse des polynuclotides


Chapitre 8



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8.1 Polymerase Chain Reaction (PCR)

BG 53

La PCR (polymerase chain reaction) permet damplifier spcifiquement une rgion de DNAdouble brin de quelques centaines de paires de bases. Ce DNA doit dabord tre spar en sim-

ples brins (dnaturation 95C).

On ajoute au DNA de dpart une large quantit damorces (oligonuclotides synthtiques

complmentaires des deux extrmits de la rgion amplifier) qui vont shybrider 50-60C

environ avec la squence complmentaire sur chacun des brins de DNA, et les quatre dNTP

qui serviront de substrats.

On soumet le tout lactivit dune DNA polymrase (Taq polymerase) qui synthtise 72C

un brin complmentaire partir du 3OH de lamorce hybride. On obtient quatre brins de

DNA.

On recommence dnaturer ces 4 brins, puis on les laisse shybrider avec les amorces (tou-

jours en excs) et la polymrase entre en action pour aboutir 8 brins de DNA. On recommence dnaturer ces 8 brins, puis on les laisse shybrider avec les amorces (tou-

jours en excs) et la polymrase entre en action pour aboutir 16 brins de DNA.

Et ainsi de suite 30 40 fois, ce qui aboutit 34359738368 brins de DNA (34 milliards), ce

qui reprsente une quantit suffisante pour tudier le fragment de DNA amplifi.


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8.2 PCR (I-1)

BG 53/1

La PCR (polymerase chain reaction) est destine synthtiser un grand nombre de fragmentsdADN identiques un fragment dintrt afin de pouvoir le caractriser. Ce fragment mul-

tiplier est situ dans un ADN gnomique ou dans un cDNA. Il est indispensable que soient

connues les squences aussi exactes que possible de deux petits oligonuclotides (20 30 nt)

situs aux deux extrmits du fragment dintrt (ct 5 ou amont ; ct 3 ou aval).

On synthtise ces oligonuclotides pour servir damorces la raction. Lamorce ct 5 est

identique la squence connue en amont. Lamorce ct 3 est antiparallle et complmen-

taire de la squence connue en aval, cest dire identique celle de lautre brin ce niveau.

Pour commencer la raction on dnature lADN en le chauffant 95 plusieurs minutes, pour

sparer les deux brins.


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8.3 PCR (I-2)

BG 53/2

Chacune des amorces amont et aval est complmentaire dune squence connue et on peut d-terminer la Tm de leur hybridation : ici, 52C pour la squence amont et 54C pour la squen-

ce aval.

En refroidissant la temprature vers 50C (un peu en-dessous des Tm des deux amorces) les

fragments dADN dnatur vont pouvoir shybrider avec des squences complmentaires. La

concentration des amorces tant beaucoup plus leve que celle des brins dADN, chaque brin

dADN shybridera avec une amorce qui lui est complmentaire.

Ainsi le brin du bas, orient 53 de droite gauche, shybridera avec lamorce amont,

oriente 53 de gauche droite et le brin du haut, orient 53 de gauche droite, shy-

bridera avec lamorce aval, oriente 53 de droite gauche.


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8.4 PCR (I-3)

BG 53/3

A 95C durant la phase de dnaturation, puis 50 C durant la phase dhybridation, la Taqpolymrase tait inactive parce que trop loigne de sa temprature optimale dactivit (75

80C).

En remontant la temprature 72C, lenzyme commence son activit. Comme toutes les

DNA polymrases elle ncessite un ADN double brin avec une extrmit 3OH rentrante pour

initier la polycondensation des dsoxyribonuclotides, elle lit le brin modle de 3 vers 5 et

elle construit le nouveau brin de 5 vers 3 qui se prolonge autant quil existe un brin compl-

mentaire pour servir de modle.

Le nouveau brin dADN est form partir de lamorce amont (ct 5) et se prolonge vers la

droite (ct 3). Lautre brin dADN est form partir de lamorce aval (ct 5) et se prolon-

ge vers la gauche (ct 3). La synthse nest limite que par le temps dincubation (environ

1000 nuclotides par minute).


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8.5 PCR (II-1)

BG 53/4

Au cours de la phase dlongation chacun des brins du fragment dintrt a t rpliqu unefois, la nombre de copies a donc doubl.

Le deuxime cycle commence par la phase de dnaturation pendant laquelle on dnature

nouveau lADN en le chauffant 95 plusieurs minutes, pour sparer les deux brins dorigine

des brins nouvellement synthtiss.


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8.7 PCR (II-3)

BG 53/6

La Taq polymrase, thermorsistante, a t inactive mais pas dnature durant la phase dednaturation de lADN.

En remontant la temprature 72C, lenzyme recommence donc son activit. Elle catalyse

la polycondensation des dsoxyribonuclotides, qui se prolonge autant quil existe un brin

complmentaire pour servir de modle.

Le nouveau brin dADN form partir de lamorce amont (ct 5) et se prolonge vers la droi-

te (ct 3). Lautre brin dADN form partir de lamorce aval (ct 5) et se prolonge vers

la droite (ct 3). Sur les brins dADN (en jaune) synthtiss partir des amorces au cycle

prcdent, la synthse sera limite au ct 5 de lamorce oppose, faute de modle pour pour-

suivre. Seul le fragment dintrt sera rpliqu sur ces nouveaux fragments.


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8.8 PCR (III-1)

BG 53/7

Au cours de la prcdente phase dlongation chacun des brins dADN contenant la squencedu fragment dintrt a t rpliqu une fois, la nombre de copies a donc encore doubl. A

chaque cycle ce nombre doublera nouveau et lamplification se poursuit comme la suite des

puissances de 2 : 22, 23, 24, 25, 26, 27,... la fin du 35me cycle, il y aura 235 copies soit plus

de 34 milliards de copies !

Le cycle suivant commence par la phase de dnaturation pendant laquelle on dnature nou-

veau lADN en le chauffant 95 plusieurs minutes. A ce stade, il reste encore les deux ADN

de dpart, quelques ADN limits par une seule des squences amorces et les squences, de

plus en plus nombreuses, limites par les squences des deux amorces.


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8.9 PCR (III-2)

BG 53/8

En refroidissant la temprature vers 50C (un peu en-dessous des Tm des deux amorces) lesfragments dADN dnatur et les fragments dADN nouvellement synthtiss vont pouvoir

shybrider nouveau avec les amorces.

Ainsi les brins orients 53 de droite gauche shybrideront avec lamorce amont, oriente

53 de gauche droite et les brins orients 53 de gauche droite shybrideront avec

lamorce aval, oriente 53 de droite gauche.


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8.10 PCR (III-3)

BG 53/9

En remontant la temprature 72C, lenzyme recommence encore son activit. Elle catalysela polycondensation des dsoxyribonuclotides, qui se prolonge autant quil existe un brin

complmentaire pour servir de modle.

Le nouveau brin dADN form partir de lamorce amont (ct 5) et se prolonge vers la droi-

te (ct 3). Lautre brin dADN form partir de lamorce aval (ct 5) et se prolonge vers

la gauche (ct 3). Sur les brins dADN (en jaune) synthtiss partir des amorces au cycle

prcdent, la synthse sera limite au ct 5 de lamorce oppose, faute de modle pour pour-

suivre. Seul le fragment dintrt sera rpliqu sur ces nouveaux fragments.

Le nombre de copies de lADN dorigine avec une seule amorce-limite va continuer crotre

arithmtiquement et le nombre de copies avec deux amorces-limites continuera crotre ex-

ponentiellement, jusqu ce que ces dernires, soient pratiquement pures dans lADN amplifi

final.


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8.11 Nested-PCR

BG 54

Les amorces spcifiques sont essentielles dans les techniques de PCR car elles seules vont d-terminer le fragment amplifier. Lorsquil existe des squences homologues cette spcificit

nexiste plus et la technique doit tre modifie pour mieux cibler le fragment amplifier.

On utilise deux couples damorces. Des amorces externes dont la spcificit peut permettre

damplifier la fois un petit nombre de squences homologues et des amorces internes per-

mettant damplifier spcifiquement une des squences rvles par le couple damorces ex-

ternes.

Cette technique dite de nested-PCR (PCR niche) se pratique comme la PCR avec le couple

damorces externes pour dix cycles damplification. A cette tape on ajoute un excs dune

ou de deux amorces internes avant de prolonger lamplification pour encore 25 cycles envi-

ron. Cette procdure permet le plus souvent dobtenir lamplification spcifique dun seul

fragment.


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8.12 Phosphoramidites : dA-3-support

protge

BG 55

La synthse des oligonuclotides se fait sur la phase fixe dune colonne parcourue par un flux

de liquide contenant successivement les ractifs ncessaires.

Contrairement ce qui se passe dans la nature, la synthse chimique des oligonuclotides se

fait de 3 vers 5.

Sur les particules solides de la colonne est fix au dpart un nuclotide qui sera le dernier de

la squence synthtiser (extrmit 3OH terminale). Ce nuclotide est li par sa fonction al-

cool secondaire en 3 une fonction amine du support, par lintermdiaire dun acide succi-

nique pour permettre la libre rotation de lensemble par rapport au support.

Pour permettre de diriger la synthse le nuclotide terminal a toutes ses fonctions bloques

par des radicaux empchant les ractions prmatures ou parasites :

radical dimthoxytrityl (DMTr), pour lalcool primaire en 5 du dsoxyribose

acide benzoque, pour les fonctions amines de ladnine ou de la cytosine

acide isobutyrique pour la fonction amine de la guanine.


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8.13 Phosphoramidites : dtr itylation

BG 55/1

Avant de faire la liaison du deuxime nuclotide (qui sera lavant-dernier de loligonuclotidefinal) on enlve le radical DMTr qui protge lextrmit 5OH du nuclotide de dpart.

Cette dtritylation est obtenue en faisant passer sur la colonne une solution dacide trichlora-

ctique (TCA) qui hydrolyse la liaison ther entre le DMTr et la fonction 5OH du dsoxyri-

bose.


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8.14 Phosphoramidites : addition dun

nuclotide

BG 55/2

Laddition dun nouveau nuclotide est faite en chargeant la colonne dune solution contenant

le nouveau nuclotide avec des fonctions protges :

par le DMTr pour la fonction 5OH

par les ractifs (benzoate, isobutyrate) protgeant les fonctions des bases azotes

le phosphore li la fonction alcool en 3 est un phosphoramidite dont la fonction amine

est substitue par deux radicaux isopropyl et la fonction acide par un radical mthyl.

En prsence de ttrazole, le nouveau nuclotide charg voit sa liaison phosphoamide hydro-

lyse et la fonction acide ainsi apparue va estrifier la fonction alcool dp

p6biochimie-bg

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