Nathalie Parthuisot2006 - 2009

Caractérisation et quantification des populations de Légionelles

naturellement présentes dans la rivière « Le Tech »

École Doctorale de Biochimie et Biologie Moléculaire B2M

Université Paris Diderot-Paris 7Université Pierre et Marie Curie-Paris 6

Maladie infectieuse bactérienne, connue depuis l’épidémie de 1976 .

La Légionellose

Les Légionelles

Les épidémies en constante progression

Deux manifestations cliniques : fièvre de Pontiac / infection

pulmonaire grave

Ces infections sont graves

C’est un bacille Gram-, aérobie, flagelle monopolaire, mesure 0.5µm

(largeur) et 2µm (longueur )

49 espèces décrites. Legionella pneumophila est la plus virulente

pour l’homme (plus de 80% des cas déclarés)

Introduction

Légionelles : bactéries ubiquitaires de l’environnement, qui se développent dans :

La contamination à l’homme : inhalation d'aérosols contaminés

eaux douces : les rivières, torrents et

lacs eaux marines et des sols mouillés ou

humides. Les milieux aquatiques artificiels : réseaux d’eau chaude (hôpitaux, hôtels,

immeubles) les systèmes de climatisation, thermes, spa (…)

mauvais entretien du réseau d’eau

Cependant, on ne connait pas les sources et les réservoirs naturels environnementaux des Légionelles.

Sources et réservoirs

Les milieux aquatiques naturels

:

Paramètres physico

chimiques

Multiplication (Abu Kwaik 1998)Rescucitation (Garcia 2007)

Inhibition (Temmerman 2007)Multiplication (Yammoto 1992)

Protection, Nutrition (Murga 2001, Storey 2004)

Interactions facteurs environnementaux

Facteurs biotiques :

pH

Température

Protozoaires

Flore

associée

Biofilm

Etats physiologiques :

Quels facteurs permettent aux Légionelles de se multiplier ?

Devenir : Comment acquièrent-elles leur virulence ? Et comment évaluer le risque sanitaire ?

Interactions facteurs environnementaux

Quels facteurs induisent ces états et quelle est l’occurrence des

Légionelles VNC en milieu naturel ?

Les Légionelles sont elles capables d’évoluer vers des états Viables

Non Cultivables (VNC) ?

Quels facteurs de stress entrainent la survie des

Légionelles ?

Ecologie des légionelles

Rivières, torrents,

lacs

Interactions facteurs

environnementaux :

Ecologie complexe

Paramètres physico chimiques Flore associée

Sources / Réservoirs : Milieux aquatiques naturels, Milieux aquatiques artificiels

Etats

physiologiques : Multiplication Survie Viables Non Cultivables

Evolution dans réservoirs : Virulence Risque sanitaire

Caractériser les sources et réservoirs environnementaux

de légionelles

Thèse :

Présentation site d’étude : Le Tech Sources principales de contamination / stations

analysées

Dynamique des Légionelles, dans les eaux et sédiments de la rivière « Le Tech »

1. Identification des sources et des réservoirs

environnementaux

Fleuve côtier, extrémité sud des Pyrénées-

Orientales.

Ecoulement sur 85.7 km, bassin versant de

780 km2

Source : massif du Costabonne (2345 m)

Le Tech (1)

Réalisation de la carte : année 2000

Le Tech (2)

Suivis mensuels et saisonniers, des 9 stations :

2. Etude de la dynamique des légionelles, dans les

eaux et sédiments de la rivière « Le Tech »

Caractériser les sources et réservoirs environnementaux de légionelles

Influence des paramètres environnementaux

Analyse de la diversité spécifique des

Légionelles

Quantification des L. pneumophila totales, Quantification des L. pneumophila actives et Quantification des L. pneumophila cultivables

Occurrence in situ des formes VNC

Développements méthodologiques (eaux et sédiments) :

Caractériser les sources et réservoirs environnementaux de légionelles

Méthodes de détection : Culture (norme AFNOR) PCR Immunofluorescence

Optimisation double-marquage L. pneumophila actives : Couplage spécificité (anticorps monoclonal) et activité métabolique Cytométrie phase solide Sédiments : application au préalable d’un gradient de séparation

Méthode alternative de quantification des L. pneumophila actives

Marquages immunofluorescents de L. pneumophila actives

L. pneumophila cells immunostained

Active L. pneumophila cell

L. pneumophila cells immunostained

Active L. pneumophila cell

Validation protocole de double-marquage

Principe : Eau robinet, dopée de 2.103 à 2.107 Lp/litre

Paramètres mesurés : L. pneumophila totales, actives et cultivables

Résultats :

Lp actives vs Lp cultivables

y = 0,893x + 2,1895

R2 = 0,9098

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00

Log (Lp cultivables /litre)

Lo

g (

Lp

act

ives

/lit

re)

Suivis mensuels : premiers résultatsLa Preste Céret

L. pneumophila totales

L. pneumophila actives

Céret Lp totales (NF) /litre

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

17/6/07 6/8/07 25/9/07 14/11/07 3/1/08 22/2/08

Aval Amont

La Preste Lp otales (NF) /litre

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

17/6/07 6/8/07 25/9/07 14/11/07 3/1/08 22/2/08

Aval Amont

Céret : % Lp actives/Lp totales

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

17/6/07 6/8/07 25/9/07 14/11/07 3/1/08 22/2/08

Aval Amont

Résultats préliminaires

La Preste : % Lpactives/ Lptotales

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

17/6/07 6/8/07 25/9/07 14/11/07 3/1/08 22/2/08

Aval Amont

Développements méthodologiques (eaux et sédiments) :

Caractériser les sources et réservoirs environnementaux de légionelles

Analyses des dynamiques des espèces de Légionelles : Méthodes de détection classique : L. pneumophila et quelques

Legionella spp Manque d’information sur dynamique intra-spécifique Optimisation outil d’empreintes moléculaires : CE-SSCP

variations spatio-temporelles des espèces variations des espèces en fonction des stations

Outil de quantification moléculaire (PCRq en temps réel) : Suivre variations Legionella spp et L. pneumophila

Conclusion

Résultats préliminaires : Concentrations L. pneumophila totales (vivantes et mortes) non

négligeables Concentrations faibles en L. pneumophila actives : 0.02 à 1% L.

pneumophila totales Quantifications de L. pneumophila viables non cultivables

Outils pertinants pour étudier dynamique des Légionelles

Etude de la dynamique des légionelles, dans les eaux et

sédiments de la rivière « Le Tech »

Perspectives : Dynamiques saisonnières et stations-dépendantes Influence des facteurs environnementaux