Annales de pathologie (2010) 30, 357—373

RECOMMANDATIONS

Mise à jour des recommandations du GEFPICS pourl’évaluation du statut HER2 dans les cancers du seinen France

Update of the GEFPICS’ recommendations for HER2 status determination inbreast cancers in France

Frédérique Penault-Llorcaa,∗,1, AnneVincent-Salomonb,1, Jean-Pierre Bellocqc,1,Marie-Christine Matthieud,1, Gaetan-Mac Grogane,1,Isabelle Treilleuxf,1, Francette Ettoreg,1, SophieLaberge-Le Couteulxh,1, Brigitte Sigalb,1, JeromeCouturierb,1, Magali Lacroix-Triki i,1, MartineAntoinej,1, André Balatonk,1, Marie-ChristineBaranzelli l,1, Valérie Becettem,1, Cécile

Blanc-Fourniern,1, Frédéric Bibeauo,1,Eva Brabencovap,1, Sabrina Crocec,1,Viviana Fridmanq,1, Pascal Géninr,1,Jean-Pierre Ghnassia s,1, Jocelyne Jacquemier t,1,Bruno Pouletu,1, Pascal Rogerv,1, Christine Saganw,1,Patrick Tasx,1, Martine Trassardm,1, VéroniqueVerrieley,1, Laurent Arnouldz,1, pour le GEFPICS

a Centre Jean-Perrin, département de pathologie, 58, rue Montalembert,63011 Clermont-Ferrand, Franceb Service d’anatomie pathologique, institut Curie, 26, rue d’Ulm,75248 Paris cedex 05, Francec Service d’anatomie pathologique, hôpital Hautepierre, 1, avenue Molière,67098 Strasbourg, Franced Département de biologie et de pathologie médicales, institut Gustave-Roussy,rue Camille-Desmoulins, 94805 Villejuif cedex, Francee Service d’anatomie et cytologie pathologie, institut Bergonie, 180, rue de Saint-Genès,33076 Bordeaux cedex, France

∗ Auteur correspondant.Adresse e-mail : fpenault@cjp.fr (F. Penault-Llorca).

1 Groupe d’évaluation des facteurs pronostiques par immunohistochimie dans les cancers du sein.

0242-6498/$ — see front matter © 2010 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.doi:10.1016/j.annpat.2010.07.001

358 F. Penault-Llorca et al.

f Centre Léon-Bérard, service d’anatomie et cytologie pathologique, 28, rue Laennec, 69373Lyon cedex 8, Franceg Centre Antoine-Lacassagne, service d’anatomie pathologique, 33, avenue Valombrose,06189 Nice cedex 2, Franceh CRLCC Henri-Becquerel, service d’anatomie et cytologie pathologique, 1, rue d’Amiens,76000 Rouen, Francei Service d’anatomie pathologique, institut Claudius-Regaud, 20-24, rue du Pont-Saint-Pierre,31052 Toulouse cedex, Francej Service central d’anatomie pathologique, hôpital Tenon, 4, rue de la Chine, 75970 Paris,Francek Centre de pathologie, 20, avenue de la Gare, 91570 Bievres, Francel Centre Oscar-Lambret, service d’anatomie pathologique, 3, rue Frédéric-Combemale, 59020Lille, Francem Centre René-Huguenin, service d’anatomie et cytologie pathologie, 35, rue Dailly, 92210Saint-Cloud, Francen Centre Francois-Baclesse, service d’anatomie et cytologie pathologie, route deLion-sur-Mer, BP 5026, 14021 Caen cedex, Franceo Centre Val-D’aurelle, service d’anatomie pathologique, 208, rue des Apothicaires, parcEuromédecine, 34298 Montpellier cedex 5, Francep Service d’anatomie et cytologie pathologique, institut Jean-Godinot, 1, avenue duGénéral-Koenig, 51100 Reims, Franceq Service d’anatomie et cytologie pathologie, hôpital de La Citadelle, boulevard du12e-de-Ligne, 1B, 4000 Liège, Belgiquer Centre Alexis-Vautrin, service d’anatomie pathologique, avenue de Bourgogne, 54511Vandœuvre-Lès-Nancy, Frances Centre Paul-Strauss, service d’anatomie pathologique, 3, rue de la Porte-de-l’Hôpital,67085 Strasbourg, Francet Service d’anatomie pathologique, institut Paoli-Calmettes, 232, boulevardSainte-Marguerite, 13027 Marseille cedex 9, Franceu Centre de pathologie, 49, rue du Ranelagh, 75016 Paris 16, Francev Groupe hospitalo-universitaire Caremeau, place du professeur-Debré, 30029 Nîmes cedex09, Francew Service d’anatomie pathologique, hôpital G- et R-Laënnec, BP 105, 44800 Saint-Herblain,Francex Cabinet ACP-Richier, rue JL-Bertrand, BP11633, 35016 Rennes cedex, Francey Centre Paul-Papin, service d’anatomie pathologique, 2, rue Moll, 49033 Angers, Francez Centre G.F.-Leclerc, service d’anatomie pathologique, 1, rue Professeur-Marion, 21034 Dijoncedex, France

Accepté pour publication le 2 juillet 2010Disponible sur Internet le 16 octobre 2010

MOTS CLÉSCancer du sein ;HER2 ;Assurance qualité ;Recommandations ;Immunohistochimie ;Hybridation in situ

Résumé En Europe, les patientes atteintes d’un cancer du sein invasif susceptibles de recevoirun traitement ciblé anti-HER2 sont actuellement sélectionnées sur la base d’un test immu-nohistochimique (IHC). Les techniques d’hybridation in situ (HIS) doivent être utilisées pourl’évaluation des cas IHC ambigus (2+) et pour l’étalonnage de la technique IHC. Les patienteséligibles au traitement ciblant HER2 présentent un statut HER2 positif défini par un test IHC 3+ou un test 2+ amplifié. Une détection correcte du statut HER2 est indispensable à une utili-sation optimale des thérapeutiques ciblées puisque leur efficacité est limitée aux patientessurexprimant HER2. Il est capital que l’évaluation du statut HER2 soit optimisée et fiable.Ces recommandations du groupe d’étude des facteurs pronostiques IHC dans le cancer dusein (GEFPICS) détaillent et commentent les différentes étapes des techniques IHC et HIS, lescontrôles utilisables et les règles générales de l’apprentissage de la lecture. Une fois acquis, cesavoir-faire doit être pérennisé par l’observation de règles de bonnes pratiques techniques (uti-lisation rigoureuse de témoins internes et externes et participation régulière à des programmesd’Assurance qualité [AQ]).© 2010 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

ientsemisentHER2. Relgs bevaluguid

nterpof g

. All

anti-HER2.

Recommandations tests HER2

KEYWORDSBreast cancer;HER2;Quality assurance;Recommandations;Immunohistochemistry;In situ hybridization

Summary In Europe, patselected by immunohistochfor complementary assessmtechnique. Eligibility to anIHC test 3+ or 2+ amplifiedusage of HER2 targeted druIt is essential that the IHC eand reliable. This GEFPICS’controls and, the rules for iby the observation of rulesassurance programs).© 2010 Elsevier Masson SAS

Préambule, rationnel et recommandations

Le ciblage thérapeutique par anticorps (AC) monoclonauxou petites molécules type inhibiteurs de tyrosine kinase aconstitué un véritable progrès en oncologie. Pour les can-cers du sein, le ciblage du récepteur HER2 est une avancéethérapeutique majeure, réduisant, par exemple, de près dela moitié, le risque de rechute dans les cancers du sein sur-exprimant HER2 en situation adjuvante avec le trastuzumab(Herceptin®, Roche) [1,2].

Les traitements ciblant HER2 ne sont efficaces que chezles patientes présentant une tumeur HER2 surexprimant laprotéine HER2, qui est la cible de ces traitements. Dansles cancers du sein, cette surexpression est la résultanted’une amplification du gène dans plus de 95 % des cas.Ainsi, un statut HER2 positif est défini par une amplifica-tion du gène HER2 ou une surexpression de la protéineHER2.

Il s’agit d’un prérequis indispensable à la prescription desdeux agents anti-HER2 actuellement reconnus et détenteursd’une Autorisation de mise sur le marché (AMM) : le trastu-zumab (Herceptin®, laboratoires Roche), pour les situationsadjuvantes et métastatiques et le lapatinib (Tyverb®, labo-ratoires Glaxo Smith Kline) pour les situations métastatiquesen seconde ligne, en cas d’échappement au trastuzu-

mab. La détermination du statut HER2 est donc un testincontournable en pathologie mammaire. Sa fiabilité et sareproductibilité d’une structure à l’autre sont indispen-sables pour une prise en charge adaptée et optimale despatientes en cancérologie mammaire.

Ce test permet également en complément du statut desrécepteurs aux œstrogènes et à la progestérone (RO et RP)de déterminer les classes moléculaires (luminales A et B,HER2 et triple négatives/basal-likes) des carcinomes mam-maires avec un impact sur la prise en charge clinique.

Des études ont récemment montré des disparités dans lerendu des taux de positivité allant jusqu’à 20 % dans le cadred’essais cliniques [3], voire plus, à savoir 23 % pour les 3+ et74 % pour les 2+, dans le cadre de comparaisons entre desstructures de pathologie locales et des structures amenéesà retester les cas pour des essais cliniques [4].

Il est donc indispensable de tout mettre en œuvre pourgarantir aux patientes une homogénéité nationale dans laprise en charge de leur cancer du sein. Il a été en outre mon-tré qu’avec l’acquisition de l’expérience dans la pratique dutest HER2, les performances s’amélioraient [5].

La réalisation fiable de ces tests nécessite une pre-mière étape de calibration de la détermination du statutde la protéine par immunohistochimie (IHC) en le compa-rant au statut du gène par hybridation in situ (HIS) jusqu’àl’obtention d’une concordance entre les deux techniques

359

who may benefit from an HER2 targeted drug are currentlytry (IHC). In situ hybridization (ISH) techniques should be usedof ambiguous 2+ IHC cases and for the calibration of the IHC

target treatment is defined by an HER2 positive status beingiable detection of HER2 status is essential to the appropriatecause its specificity is limited to tumors overexpressing HER2.

ation of the HER2 status of a mammary carcinoma is optimizedelines look over the different steps of the IHC technique, theretation. Once acquired, this knowledge must be perpetuated

ood technical practice (internal and external controls, quality

rights reserved.

de plus de 95 %, puis le maintien dans le temps de ce hautniveau de concordance [6—8].

Le groupe d’étude des facteurs pronostiques IHC dansle cancer du sein (GEFPICS), fondé par le docteur VivianneLeDoussal, est constitué d’une vingtaine de pathologistesreprésentant les différentes modalités d’exercice de lapathologie. Il a ainsi participé à l’adoption en routine del’évaluation IHC des récepteurs hormonaux en démontrantque les résultats étaient équivalents aux méthodes biochi-miques et la technique plus accessible et moins onéreuse.De même, pour l’analyse du statut HER2, le groupe aémis des recommandations pour la calibration des tech-niques et sur les règles d’interprétations des différentstests en 2002. Aujourd’hui, de nouvelles recommandationssont nécessaires car les techniques de détection du statutHER2 ont évolué depuis 2002, les résultats d’études cli-niques et d’études de concordances ont été publiées. Leprésent article n’a pas pour objet d’effectuer une revueexhaustive de la littérature sur le sujet du test HER2 etson utilité, cela ayant récemment été réalisé en détail pardeux grands groupes de travail : l’American Society of Clini-cal Oncology/College of American Pathologists (ASCO/CAP)[8] et le National Comprehensive Cancer Network (NCCN)[9]. Il s’agit ici de recommandations adaptées à la pratiquede la pathologie en France, à l’ère des thérapies ciblées

Notre groupe émet des recommandations dont le ration-nel sera détaillé plus loin.

Le GEFPICS recommande :• que le statut HER2 soit évalué sur tout cancer du sein

infiltrant au moment du diagnostic, sans restrictionconcernant l’âge de la patiente, le type histopatholo-gique, le type de prélèvement (sur biopsie ou pièceopératoire) ;

• que l’algorithme d’utilisation des tests HER2 et les scoresde positivité soient ceux préconisés par le groupe etdécrits ci dessous. La technique d’IHC est utilisée en pre-mière intention. Les techniques d’HIS sont réservées pourvérifier le niveau d’amplification des cas 2+ et pour cali-brer la technique IHC ;

• que les cas hétérogènes (définis par moins de 30 % de cel-lules tumorales avec un marquage membranaire intenseet complet associés ou non à une population 2+) et les casHER2 positifs concernant des tumeurs de moins de 1 cmsoient discutés en RCP au cas par cas. En revanche, les cashétérogènes avec plus de 30 % de cellules avec un mar-quage membranaire intense et complet sont considéréssans réserve comme surexprimés (3+) ;

• que pour les cas hétérogènes, le test soit en plus réa-lisé sur une éventuelle métastase axillaire si le bloc estdisponible ;

3

•

•

•

•

D

Aecd

G

TLHpldmplt

QLcsm

b•

•

•

FLdtt

déot

mla1êbéd

gtnHte

SLtlcs

stfcp

60

l’utilisation de témoins calibrés à chaque série de tests ;ces témoins comprenant idéalement un témoin négatif(tumeur et glande normale), un cas 2+ faiblement amplifiéet un cas 3+ fortement amplifié, ou au minimum un cas3+ amplifié. Un témoin 3+ amplifié peut également êtreapposé sur chaque lame à tester pour valider la techniqueet aider au calibrage de la lecture ;une expertise médicale et technique pour la réalisation etl’interprétation des tests, qui impose un volume de tests àréaliser (volume proposé de 250 tests annuels pour IHC et100 pour l’HIS). Ce volume d’activité permet d’optimiserla qualité et les coûts des tests pour les structures ;que la réalisation des tests de ce marqueur soit« conditionnée à la participation à un contrôle de qua-lité » externe et, dans un avenir proche, avec des résultatssatisfaisants, selon les critères définis par l’organismed’Assurance qualité (AQ) ;que cette participation « soit confidentielle mais non ano-nyme (résultat connu seulement par structure d’AQ) »,comme cela est effectué dans le domaine de labiologie.

étails des recommandations techniques

fin de réduire au maximum les possibilités de variationsntre les différentes structures et les pathologistes, ilonvient de détailler les différentes étapes du processus’évaluation du statut HER2.

énéralités

ests disponiblesa cible du trastuzumab ou du lapatinib est le récepteurER2. La protéine peut être détectée par IHC et le gènear technique d’HIS. Ces deux approches sont citées danses libellés d’AMM du trastuzumab et du lapatinib. Nous neisposons pas à l’heure actuelle de données robustes per-ettant de privilégier une technique plus qu’une autre pourrédire la réponse aux thérapeutiques ciblées. En France,

es techniques d’HIS sont utilisées pour la calibration desechniques d’IHC et pour tester les cas ambigus (2+).

ui tester ?e standard aujourd’hui est de tester au diagnostic tout can-er du sein invasif. En effet, l’information donnée par letatut de HER2 contribue à la caractérisation du carcinomeammaire quel que soit son type histologique ou sa taille.Il ne doit pas y avoir de limitations à la pratique du test

asées :sur l’âge des patientes, les traitements pouvant bénéfi-cier à toutes les patientes sans limites d’âge. Le statutHER2 apporte aussi un paramètre pronostique ;sur le type histopathologique. Même si un statutHER2 positif reste une exception pour les carcinomestubuleux ou de grade 1 et est un événement peu fréquentpour les carcinomes lobulaires classiques, des cas positifsont été décrits ;sur la taille tumorale. Le statut HER2 positif étant un fac-teur de pronostic péjoratif pour les tumeurs T1a et T1b[10], la décision ou non de traiter une patiente T1a ou T1bdoit être prise en RCP en fonction des autres paramètresanatomocliniques (à noter que le NCCN recommandedepuis cette année le traitement par trastuzumab pourles patientes pT1b, HER2+) [11].

prdlepb

dEdpIledmbtddhH

vg

F. Penault-Llorca et al.

réquence de positivité attendue’oncogène HER2 est amplifié et surexprimé dans 12 à 20 %es cancers du sein pris dans leur globalité. Les taux de posi-ivité de HER2 sont directement liés au stade, ainsi qu’auype histologique et moléculaire de la tumeur.

Ces chiffres sont plus faibles que ceux avancés il y a uneizaine d’années car les tests avaient, à cette époque là,té principalement réalisés sur des patientes métastatiquesu sur des tumeurs de plus grande taille et/ou avec desechniques moins fiables qu’aujourd’hui.

Une étude épidémiologique rétrospective récente,enée en France sur la base de dossiers anatomopatho-

ogiques de pièces opératoires, a montré une prévalenceu diagnostic de 12,1 % de statut HER2 positifs sur899 patientes [12]. Cette prévalence assez basse pourraittre le reflet de plusieurs facteurs, éventuellement com-inés, tels que l’efficacité du dépistage et la pénétrancelevée du traitement hormonal substitutif ces dernièresécennies.

Les taux de positivité HER2 dépendent du type histolo-ique ou moléculaire. Par exemple, le type histologiqueubuleux n’est qu’exceptionnellement positif, les carci-omes de type lobulaire classiques et pléomorphes ne sontER2 positifs que dans 5 et 7 % des cas respectivement. Lesypes moléculaires luminal A et basal-like n’ont pas de sur-xpression de HER2.

ur quels tissus évaluer le statut HER2 ?e statut HER2 a été évalué sur plusieurs types de prépara-ions tissulaires et cellulaires. Nous ne développerons pas icies tests sanguins comme la recherche du fragment solubleirculant (ECD) dont l’utilité pour l’évaluation prédictive dutatut HER2 n’est pas démontrée [13].

Le statut HER2 peut être réalisé avec fiabilité sur les biop-ies préopératoires. Il est maintenant bien admis que lesissus sont bien préservés sur ces fragments biopsiques, par-ois de facon plus optimale que sur une pièce opératoirear la fixation est effectuée immédiatement et le fixateurénètre rapidement et de facon homogène dans des petits

rélèvements [14]. Le seul risque étant une dessiccationapide des tissus si la biopsie n’est pas plongée rapidementans le fixateur. De nombreux travaux rapportent une excel-ente concordance entre le statut HER2 réalisé sur biopsiest sur pièces opératoires, à condition que le tissu soit bienréservé et sans artéfact d’écrasement sur les prélèvementsiopsiques [8,14].

Sur prélèvements cytologiques, le statut HER2 est consi-éré comme fiable uniquement s’il est recherché par HIS.n effet, les membranes cellulaires peuvent être lysées lorse la préparation des cellules et le marquage membranaireeut s’en retrouver altéré (risque de faux-négatifs) [8,9,15].l est, de plus, largement admis que les prélèvements cyto-ogiques doivent être réservés au diagnostic des métastasest pas comme seule méthode d’évaluation au diagnostic’un cancer primitif du sein. S’il doit être envisagé une chi-iothérapie néoadjuvante, il est nécessaire de réaliser desiopsies pour confirmer le caractère invasif de la proliféra-ion tumorale. En effet, sur une cytoponction à l’aiguille fine’une tumeur primitive, il existe un risque de surestimationu statut HER2 en cas de contingent de carcinome in situ deaut grade dans lequel la prévalence de l’amplification deER2 est plus élevée que dans un carcinome invasif.

Le statut HER2 reste stable sous chimiothérapie néoadju-ante [16]. Cependant, peu de données sont disponibles àrande échelle concernant la stabilité du statut HER2 après

Recommandations tests HER2

un traitement ciblant HER2 en cas de persistance ou derechute de la tumeur. À titre prospectif, dans le but devoir si des clones HER2 négatifs ont pu être sélectionnéspar le traitement ciblé, il peut être intéressant de retesterles tumeurs après traitement ciblé néoadjuvant. Récem-ment, Cottu et al. [17] ont montré dans un cas hétérogènepour le statut HER2, la sélection de clones métastatiquesHER2 négatifs sous traitement par trastuzumab. Cependant,cette attitude n’est pas un standard actuellement mais uneoption. Si une tumeur se présente au stade métastatiquesans avoir recu préalablement du trastuzumab en adjuvantet que le statut HER2 de la tumeur initiale est connu, iln’est pas nécessaire de retester le ou les sites métasta-tiques car le statut HER2 est stable au cours de l’histoirenaturelle de la maladie [18]. En cas de rechute ou de récidivelocale, il est souhaitable de réévaluer le statut HER2 afin dedéterminer s’il s’agit de la même tumeur ou d’une tumeurdifférente. Attention, toutefois, après décalcification, surdu tissus osseux, les tests IHC et HIS peuvent être non contri-butifs à cause de la dégradation tissulaire.

Techniques et interprétation

Phase préanalytiqueFixationUne fixation optimale est un prérequis indispensable àl’obtention de tests IHC et HIS fiables. Pour une bonnepénétration du fixateur, il convient de fixer le plus rapi-dement possible les échantillons tumoraux (moins d’uneheure après le prélèvement en cas de pièce opératoire).La fixation des pièces opératoires volumineuses passe parun tranchage préalable tous les 5 à 10 mm. Idéalement, unemacroscopie sur pièce fraîche avec prélèvement et fixa-tion tumorale immédiate permet une pénétration homogènedu fixateur. Dans les cas ou les conditions de prélève-ment immédiat ne peuvent être optimales, un prétranchage,tous les centimètres, des pièces opératoires avant fixationpermet d’obtenir une bonne pénétration du fixateur. Desvariations de marquage IHC entre le centre et la périphé-

rie du prélèvement sont le reflet du gradient de pénétrationdu fixateur dans une pièce improprement préparée pour lafixation [19].

Les recommandations internationales (ASCO/CAP,Royaume-Uni, Canada) portent sur une fixation au formol10 % tamponné, de 24 à 48 heures pour les pièces opéra-toires, et de six à huit heures pour les biopsies [8,20,21].Une fixation pendant des temps supérieurs (situation duweek-end ou d’un jour férié) ne constitue pas de problèmemajeur si les prélèvements ont été échantillonnés de faconadéquate [21]. Le problème majeur reste la sous-fixationtissulaire. Elle est évitée pour les grosses pièces par laréalisation des tranches fraîches avant fixation. L’étude deMiddleton et al. [22] montre qu’en augmentant le tempsde fixation des biopsies au formol pour arriver à six à huitheures, les performances des tests HER2 sont améliorées.

En France, depuis l’arrêté du 13 juillet 2006, incluant les« travaux exposant au formaldéhyde » dans la liste des sub-stances, préparations et procédés cancérogènes, les travauxexposant au formol sont considérés comme cancérigènesde grade 3 [23]. Cela impose de mettre en place desmesures de prévention du risque formolé dans les struc-tures, ou bien de recourir à l’utilisation de substituts auformol. Depuis la publication de cet arrêté, L’associationfrancaise d’assurance qualité en anatomie et cytologiepathologiques (AFAQAP) a mis les pathologistes en garde

361

concernant l’utilisation de ces substituts sans une remiseà niveau préalable de toutes les techniques ancillaires vali-dées dans le service [24]. Il convient de rappeler ici queles tests standardisés d’IHC et d’HIS, en particulier ceuxapprouvés par la Food and Drug administration (FDA) auxÉtats-Unis, sont validés pour des prélèvements fixés en for-mol tamponné et inclus en paraffine.

De plus, la participation de patientes aux études ancil-laires de la plupart des grands essais internationaux estconditionnée par la fixation formolée de leurs échantillonstumoraux, ce qui peut être pénalisant pour la patiente si lefixateur utilisé par le pathologiste est différent.

Plusieurs publications ont rapporté que l’utilisation defixateurs à base d’alcool était potentiellement génératricede faux-positifs avec l’IHC et de problèmes de surdiges-tion des noyaux avec les techniques d’HIS conduisant à deséchecs techniques [25—27].

L’utilisation des fixateurs autres que le formol est doncproscrit en dehors des structures pouvant justifier d’unecalibration rigoureuse et d’un contrôle de la qualité interneet externe drastique de leur IHC et de leur ISH.

Quant à l’utilisation de liquide de Bouin (au moment de lafixation ou dans les automates d’imprégnation), elle inter-dit tout recours ultérieur à une technique d’HIS et peutdonc entraîner une perte de chance pour les patientes quiauraient une tumeur classée 2+.

Inclusion en paraffineAprès fixation adéquate, l’étape de déshydratation est réa-lisée dans des automates ad hoc. L’étape d’imprégnationen paraffine est aussi très importante car elle conditionnela qualité ultérieure des sites antigéniques. Il faut s’assurerque la température de la paraffine n’excède pas 60 ◦C, idéa-lement 56 à 57 ◦C. Une fois fixés et inclus en paraffine,les échantillons sont stables, pendant plusieurs dizainesd’années [28].

SectionsAprès section et étalement, plusieurs travaux ont mon-tré une chute de l’antigénicité avec le temps [28—30]. Ilest recommandé de préparer les lames extemporanément

pour la technique d’IHC, ou au maximum deux semaines àl’avance avec conservation des coupes tissulaires à l’abri dela lumière et de la poussière, à +4 ◦C. À noter que les recom-mandations ASCO/CAP [8] tolèrent jusqu’à six semaines.Ce délai nous paraît trop long et ne doit pas être retenu.Les sections peuvent être gardées plus longtemps si ellessont conservées à +4 ◦C, ou bien après avoir été recou-vertes d’une fine couche de paraffine mais il existe tout demême une baisse de l’antigénicité [28]. Il n’y a pas de don-nées publiées montrant un éventuel effet délétère sur lestechniques HIS. Néanmoins, il est recommandé de ne paspréparer à l’avance les lames.

Description des méthodes disponiblesLes deux méthodes recommandées actuellement sont l’IHCet l’HIS, sur coupes fixées et incluses en paraffine. Ces deuxtechniques présentent une grande spécificité puisqu’ellespermettent une visualisation directe du signal recherché auniveau des cellules carcinomateuses infiltrantes. Les tech-niques de PCR sont encore du domaine de la recherche etfont l’objet, en France, d’une évaluation dans le cadre d’unprotocole stratégies thérapeutiques innovantes et coûteuses(STIC).

En France, la technique d’IHC est la plus répandue etsert au « triage » de première intention des patientes. Seulsles cas ambigus (2+) sont actuellement vérifiés par une

3

tcctpltrhds[

TP

ascp4U

lsuLptCl

Itltulcm9Iupddrldlctdlp[

tuddtqqc

isGtltduHn

nltvLldaccnLdt

lde

ddd

naldbl

62

echnique d’HIS. Comme pour l’IHC, les techniques d’HISolorimétrique (BrISH pour Brightfield in situ hybridization),homogéniques (CISH pour chromogenic in situ hybridiza-ion) ou argentiques (SISH pour silver in situ hybridization)ermettent un bon contrôle morphologique du tissu [27,31],e statut devant être évalué dans le seul contingent infil-rant. Néanmoins, la technique d’HIS la plus évaluée parapport à la réponse au trastuzumab reste la technique deybridation in situ fluorescente (FISH) et toute techniquee BrISH devrait être d’abord validée par rapport à uneérie dont le niveau d’amplification a été évalué par FISH20,31,32].

echnique immunohistochimiquehase analytique

Deux kits standardisés. Approuvés par la FDAux États-Unis, ils sont largement répandus et utili-és. Le premier commercialisé a été le kit HercepTest®

ommercialisé par Dako (Glostrup, Danemark), utilisant l’AColyclonal A485, puis le kit Pathway® utilisant le cloneB5 commercialisé par Ventana-Roche (Tucson, AZ, États-nis).

Plusieurs anticorps spécifiques. Anti-HER2 sont éga-ement disponibles, hors kit standardisés. Les plus utilisésont l’AC monoclonal NCL-CB11 (Novocastra, Newcastlepon Tyne, Royaume-Uni), l’AC monoclonal SP3 (Microm,yon, France), l’AC monoclonal 4B5 (Ventana-Roche), et l’AColyclonal A485 (Dako), tous dirigés contre la partie intracy-oplasmique de la protéine HER2. L’AC Tab250 (Invitrogen,arlsbad, CA, États-Unis) reconnaît le domaine extracellu-

aire de HER2.Étapes techniques sujettes à faire varier les tests

HC. Les principales étapes sujettes à faire varier les résul-ats pour les techniques IHC non standardisées sont, hormises étapes préanalytiques que nous venons de voir, les condi-ions de démasquage antigénique, la concentration de l’ACtilisé, le type d’AC, le temps d’incubation, le type de révé-ation utilisée [7,8,33,34]. Entre nos mains, au GEFPICS, lesonditions optimales ont été réunies lorsque le prétraite-

ent par la chaleur était effectué dans un bain-marie, à

8 ◦C, pendant 40 minutes, dans un tampon citrate pH 6.l est déconseillé par le GEFPICS et l’AFAQAP de réalisern prétraitement au four micro-ondes ou à la cocotte àression et dans du tampon EDTA ou citrate à pH 9,9. Lesonnées des tests nationaux d’AQ montrent que l’utilisation’automate pour la technique d’IHC donne de meilleursésultats que les techniques manuelles [8,20,34]. De même,e test HercepTest® présente de bonnes performances lorses tests AQ, dans les pays où il est largement utilisé, commees États-Unis ou le Royaume-Uni avec une fixation formolée,ontrairement à ce qui avait été décrit en 1999, avec un fixa-eur à base d’alcool par Jacobs et al. [25]. Plus récemment,ans de grands essais internationaux, en fixation formolée,es performances de HercepTest® ont été évaluées par rap-ort à FISH avec des taux de concordance supérieurs à 95 %1,2,35].

Utilisation de témoins ou contrôles. Pour valider laechnique IHC : le marquage attendu pour l’IHC, HER2 estn marquage membranaire complet, « en maille de filet »ans le contingent invasif. Un bon témoin de la vali-ité des immunomarquages est l’absence de marquage duissu normal ou hyperplasique (témoin interne). Un mar-uage de ces structures témoigne d’un problème techniqueui peut être lié à une incubation trop longue ou à uneoncentration trop importante d’AC. En dehors des témoins

tpdd

(n(td

P

r[nd

Hi(

2mim

F. Penault-Llorca et al.

nternes, l’utilisation de témoins externes est indispen-able. Un témoin muti-tissulaire doit être construit. LeEFPICS recommande de mettre dans le bloc témoin mul-

itissulaire un témoin d’intensité intermédiaire (2+) dont’amplification a été prouvée par une technique d’HIS, unémoin d’intensité forte (3+) comme une maladie de Pagetu sein, un carcinome canalaire in situ de haut grade,n carcinome invasif au nombre précis de copies du gèneER2 déterminé par HIS, et enfin, un témoin négatif (seinormal et tumeur non amplifiée [7,8,34]).

Le groupe d’étude des facteurs pronostiques immu-ohistochimiques dans le cancer du sein recommande’utilisation de témoins externes à chaque série deests HER2. Ces témoins doivent être impérativementalidés par un pathologiste avant de distribuer les tests.’option idéale est de déposer un contrôle sur chaqueame testée, à côté de la tumeur à évaluer. L’utilisation’automates traitant chaque lame individuellement est unrgument supplémentaire pour utiliser ce type de stratégie,ar les résultats peuvent varier d’une lame à l’autre. Un seulontrôle valide sur une lame ne peut être garant que la tech-ique est valide sur chacune des lames testées dans le cycle.a principale limitation à cette pratique reste la limitatione la quantité de cas témoins disponibles, en particulier deype 2+ amplifiés.

L’utilisation de tissus micro-arrays ou de lignées cellu-aires disponibles dans le commerce et dont les niveaux’amplification sont connus est une bonne alternative, maislle est plus coûteuse.

Afin de calibrer la technique IHC. Il est recommandée tester une centaine de cas de carcinomes invasifs auiagnostic et de confronter les données de l’IHC avec celles’une technique d’HIS.

Le groupe d’étude des facteurs pronostiques immu-ohistochimiques dans le cancer du sein. Celui-cittire l’attention des pathologistes sur la variabilité desots d’AC et suggère d’être vigilant à chaque changemente lot d’AC, c’est-à-dire de le tester sur les témoins cali-rés du laboratoire (0, 1+, 2+ amplifié, 3+ amplifié) avant’utilisation du nouveau lot sur les échantillons diagnos-

iques. Il est également rappelé qu’il est conseillé deréparer extemporanément les AC et de ne pas utiliser’aliquots dilués qui sont plus souvent instables en termese concentration.

Chaque année, sur les sites de l’AFAQAPhttp://www.afaqap.org) et de l’United Kingdom Natio-al External Quality Assesment Service (UKNEQAS)www.ukneqas.org.uk), sont présentés les détails desechniques ayant données les meilleurs résultats aux tests’AQ.

hase postanalytiqueScore de positivité en IHC. Le score de positivité a

écemment été changé par les recommandations ASCO/CAP8]. Le seul marquage significatif est le marquage membra-aire complet du contingent invasif (Tableau 1). Un exemplee fiche de réponse type à un test HER2 est présenté (Fig. 1).

Un immunomarquage est considéré comme positif ouER2 3+ quand le marquage membranaire est complet et

ntense dans plus de 30 % des cellules tumorales invasivescontre plus de 10 % auparavant).

Un immunomarquage est considéré ambigu ou HER2+ quand le marquage membranaire est complet d’intensitéoyenne ou faible dans plus de 10 % des cellules tumorales

nvasives, ou membranaire complet d’intensité forte dansoins de 30 % des cellules invasives (tout ce qui ne peut

Recommandations tests HER2 363

Tableau 1 Score HER2 immunohistochimique [8].HER2 immunohistochemical score [8].

Marquage membranaire descellules du contingent invasif

Score 0 Absence de marquagemembranaire ou moins de10 % de cellules marquées

Score 1+ Marquage faible et incompletdes membranes de plus des10 % des cellules tumoralesinvasives

Score 2+ Plus de 10 % de cellulesmarquées, le marquagemembranaire étant faible àmodéré, mais completTumeurs de marquagemembranaire completintense de moins de 30 % decellules tumorales invasives(ne rentrant pas dans lacatégorie 3+)

364 F. Penault-Llorca et al.Tableau 1 (Suite)

Marquage membranaire descellules du contingent invasif

pre

1dm

Hei

cLucIàGlspdlc

Score 3+ Plus de 30 % de cellulesmarquées, le marquagemembranaire étant intenseet complet

lus être considéré comme 3+ et notamment les cas hété-ogènes avec co-existence de deux contingents l’un négatift l’autre 3+).

Un immunomarquage est considéré comme négatif, HER2+ quand le marquage membranaire est incomplet dans pluse 10 % des cellules tumorales invasives (pas de change-ent).Un immunomarquage est considéré comme négatif,

ER2 0 en l’absence de marquage ou quand le marquagest membranaire dans moins de 10 % des cellules tumoralesnvasives (pas de changement).

Le rationnel d’utilisation de ce nouveau seuil n’est paslairement établi dans les recommandations ASCO/CAP.’objectif majeur de ce changement de score était d’obtenirn taux de concordance entre l’IHC et la FISH de 95 % pour lesas 3+ et de diminuer ainsi le nombre de cas faux-positifs.l n’y a aucun rationnel prédictif par rapport à la réponse

une thérapeutique ciblant HER2. C’est dans l’annexedes recommandations ASCO/CAP [8] que l’on retrouve

’argumentaire. Les membres du panel ont observé que letatut HER2 positif en IHC concordant avec une amplificationar FISH s’accompagnait en général d’un fort pourcentagee cellules marquées. Parmi les articles cités, on retrouvee travail du GEFPICS fondateur de nos travaux sur HER2,oordonné par Anne Vincent-Salomon et al. [6]. Dans ce tra-

vbccndnstqlF2dlc(tgdmf6Hl

ail débuté en 2001, nous avions montré sur 119 cas qu’uneonne corrélation entre le statut HER2 réalisé par IHC suroupe en paraffine et une technique de FISH sur coupes àongélation était observée lorsque le marquage membra-aire fort ou intermédiaire était observé dans plus de 60 %es cellules marquées. Il s’agit de travaux anciens, nous’avions pas dans ce travail évalué la corrélation avec uncore à 30 % et la notion d’intensité de marquage restaitrès subjective, surtout avec certains AC générant des mar-uages peu intenses comme le CB11, ou très intenses comme’HercepTest® ou le A485 par exemple. Une étude récente derédéric Chibon et al. [36] a montré que pour des tumeurs+, avec l’AC polyclonal A485 dilué au 1/1500e générantes marquages assez intenses, l’amplification était corré-ée de facon indépendante à la présence de plus de 60 % deellules marquées et un grade Scarff Bloom et RichardsonSBR3). L’étude Crither [37] a montré que l’utilisation d’unel score à 60 % était, en dehors de centres très entraînés,énérateur d’importantes discordances avec la technique’HIS. Des faux-positifs peuvent ainsi être générés par uneauvaise interprétation de l’intensité du marquage et des

aux-négatifs correspondant à des cas présentant moins de0 % de cellules marquées sont écartés d’une vérification parIS. Actuellement, l’utilisation d’une variante du score pour

’IHC avec un seuil à 60 % en l’absence d’un contrôle systé-

Recommandations tests HER2 365

Figure 1. Exemple de fiche de réponse standard pour IHC HER2.Example of a standardized HER2 IHC answer sheet.

matique des cas à intensité non forte par HIS n’est donc pasrecommandée par le GEFPICS.

Que faire quand on a un résultat 2+ ?• Vérifier tout d’abord les témoins de la réaction.• Si le cas 2+ est confirmé : tester le cas par une technique

d’HIS.

Que faire si la technique n’est pas satisfaisante (mar-quage du tissu normal, marquage cytoplasmique intense,hétérogénéité du marquage) ?

• Vérifier tout d’abord les témoins de la réaction.• Si les témoins ne sont pas valides : refaire la technique

en vérifiant les différentes étapes, les lots d’AC et enmodifiant éventuellement des paramètres comme le pré-traitement.

• Si les témoins sont valides, il s’agit probablement d’unproblème lié aux conditions de fixation et une techniqued’HIS s’impose.

• En aucun cas, le GEFPICS ne valide le score de Gown[38,39] qui soustrait le marquage du sein normal, du mar-

366 F. Penault-Llorca et al.

F

ldm

igure 1. (Suite ).

quage observé au niveau de la tumeur, pour pallier leséventuelles insuffisances techniques de l’IHC.

Le GEFPICS attire également l’attention sur’interprétation « des cas hétérogènes ». Il existe’authentiques cas hétérogènes pour le statut HER2,ême si la règle en termes d’amplification de HER2 dans

l[càspd

es cancers du sein est plutôt une règle de « tout ou rien »8]. Sur une série de 600 cas, HER2+ à l’institut Curie, 5 % deas hétérogènes étaient observés [17]. La première chosefaire lorsque l’on rencontre un cas hétérogène est de

’assurer qu’il ne s’agit pas d’un artéfact technique lié enarticulier à une fixation non homogène du tissu. Il conviente tester d’autres plans de coupe de la tumeur et, le

Recommandations tests HER2

cas échéant, les métastases ganglionnaires, afin d’évaluerglobalement la représentativité de la population HER2 3+,qu’il faudra ensuite impérativement vérifier par HIS. Dansl’expérience des différents membres du GEFPICS, des casavec d’authentiques foyers tumoraux amplifiés, isolés etminoritaires, ont été classés en cas HER2 positifs aprèsdiscussion en RCP, alors qu’ils présentaient moins de 30 %de cellules avec amplification. La décision de traiter nes’appuie que sur la conviction personnelle du pathologisteet des cliniciens réunis en RCP que ce contingent HER2+,même minoritaire, est agressif et susceptible de donnerdes clones métastatiques. En cas de doute sur le scoredéfinitif à porter devant un tel cas, un second avis peutêtre demandé auprès d’un confrère possédant une forteexpérience et du recul dans l’évaluation du statut HER2.Le GEFPICS recommande donc s’il existe deux populationsdifférentes en IHC et HIS, que celles-ci soient décritesdans le compte rendu en rapportant la présence des deuxpopulations clonales avec leur score et leur représentationen pourcentage. Ces situations rares doivent être discutéesau cas par cas en RCP.

Les lames d’IHC peuvent être stockées sans pertemajeure du signal, à condition que le stockage ait lieu dansl’obscurité et à température inférieure à 25 ◦C. Une pertede l’intensité du signal peut se voir au bout de quelquesannées, plus particulièrement si la révélation a été faite enAEC.

Hybridation in situ

Phase analytique

Hybridation in situ fluorescente (FISH)Trois tests FISH® sont principalement commercialisés etapprouvés par la FDA : les kits PathVysion® (Abott/Vysis,Downers Grove, IL, États-Unis) et HER2 FISH pharmDxTM

(Dako), incluant tous deux la sonde centromérique du chro-mosome 17, et ONCOR/HER2 (Ventana/Roche), comportantla sonde HER2 seule. D’autres sondes sont également dis-

ponibles (ZytoVision, Kreatech...), mais elles sont moinsrépandues et utilisées dans la littérature. L’avantage dedisposer de la sonde pour le centromère du chromosome17 est que son évaluation permet un contrôle interne de laqualité de la technique et une évaluation des éventuellesvariations du nombre de chromosomes (polysomies en casd’augmentation du nombre de chromosome 17 ou monoso-mies en cas de perte d’un des chromosomes 17).

Hybridation in situ Non fluorescente (BrISH)Plusieurs kits sont commercialisés dont les Kits de CISH(hybridation in situ chromogénique) commercialisés parZymed/Invitrogen (Spot-Light® HER2 CISHTM) et de SISH(Hybridation in situ argentique ou Silver) commercialisés parventana/Roche (Inform/HER2). Plusieurs membre du GEF-PICS ont évalués ces kits ou leurs variantes double couleur(ex : Dako : DuoCISHTM, ou Zytovision : ZytoDot®2C), pourcertaines non encore commercialisées [37,40—44]. Leurconcordance avec les techniques de FISH a été largementévaluée dans la littérature ([31] pour revue]. Leur limita-tion réside dans le fait que, pour le moment, la plupartn’est pas commercialisée en double couleur, et que lorsquel’information du nombre de chromosomes 17 est nécessaire,il faut réaliser une seconde technique d’HIS sur une coupeconsécutive. La généralisation des kits d’HIS à deux couleurset deux sondes rendra ce problème caduque.

367

La technique d’HIS est réservée à des centres spécialisés,car l’interprétation des signaux nucléaires d’une hybrida-tion est longue et minutieuse et demande une expertise. Desvariations intra- et interlaboratoires sont possibles, liées àdes variations techniques (fixation, épaisseur des coupes,prétraitements. . .) et à des difficultés d’interprétation (dif-ficulté de repérage des zones invasives, autofluorescence,difficultés liés à l’interprétation des polysomies). Le pré-traitement consiste en une étape de digestion tissulaire afinde rendre les acides nucléiques accessibles lors de la phasede dénaturation. Il s’agit de l’étape la plus critique de latechnique : en cas de surdigestion, les noyaux apparaissent« vides » et l’hybridation ne peut se faire ; en cas de sous-digestion, les acides nucléiques ne sont pas accessibles et iln’a pas non plus d’hybridation et la conclusion de l’examensera « non interprétable » [8,27,31,44]. La digestion tissu-laire est conditionnée par le fixateur utilisé et la naturemême de la tumeur. Parfois, le tissu normal ne requiert pasles mêmes conditions de digestion que le tissu tumoral. Unetechnique de FISH sera valide si les signaux sont visibles defacon uniforme dans au moins 75 % des noyaux des cellulesinvasives [8].

La technique de FISH est généralement réaliséemanuellement, ou de facon semi-automatisée (étapes dedénaturation et d’hybridation. Seule la technique Ventanaest entièrement automatisée.

Enfin, il faut noter que l’HIS est une méthode indirectede détection de la cible HER2. On détecte l’amplification dugène et non sa surexpression et il peut y avoir surexpressionsans amplification dans moins de 5 % des cas.

Phase postanalytiqueLes ADN seraient moins sensibles que les épitopes anti-géniques aux actions délétères de la fixation [8,27,45].Par ailleurs, les techniques de FISH et BrISH permettentd’obtenir des résultats quantitatifs. Ainsi, ces techniquespermettent de contrôler les cas ambigus en IHC et destandardiser la technique. Elles ont une place clé dans ladémarche d’assurance-qualité.

Évaluation du scoreIl est recommandé de disposer, pour l’interprétation de laFISH, de la lame HES qui permet de retrouver les zonestumorales invasives et de juger de l’importance de l’infiltratlymphocytaire, et de la lame d’IHC qui permet de repérerles marquages hétérogènes.

Il faut compter au moins 40 cellules (dans au moinsdeux zones différentes de la tumeur) et plus en casd’hétérogénéité, en s’assurant que l’on compte bien un seulnoyau à la fois.

Il faut donc éliminer du comptage tout ce qui peuten imposer pour des noyaux superposés, altérés, sur- ousous-digérés. Le pourcentage de noyaux interprétables pourdonner un résultat doit être d’au moins 50 %.

Attention, dans les tumeurs associées à un fort infiltratinflammatoire lymphocytaire, ce qui est souvent le cas destumeurs HER2 amplifiées, de ne pas compter les signaux desnoyaux de lymphocytes.

Un exemple de fiche de réponse à un test HIS est montrédans la Fig. 2 et de consignes pour l’interprétation dans lesFig. 3 et 4.

Cas amplifiéScore pour FISH avec sonde centromère du 17(CEP17) et HER2 : amplification définie par un rapportHER2/CEP17 supérieur à 2,2 ; score pour FISH ou BrISH avec

368 F. Penault-Llorca et al.

FS

sccs(

igure 2. Fiche de réponse standard en hybridation in situ.tandardized in situ hybridization answer sheet.

onde HER2 seule : amplification définie par un nombre deopies de HER2 supérieur ou égal à 6 (Tableau 2). Dans lesancers du sein, les amplifications se présentent le plusouvent sous la forme d’homogeneously staining regionsHSR), segments chromosomiques néoformés, uniques ou

mdsrl

ultiples, homogènes à l’échelle microscopique, constituésu gène ou groupe de gènes amplifiés ; ainsi, les amas deignaux dans les noyaux signent les amplifications. Plusarement, les amplifications de HER2 se présentent sousa forme de minuscules chromosomes, doubles au stade

Recommandations tests HER2 369

Vysi(plu

es min. D.

Figure 3. Hybridation in situ fluorescente (FISH). Kit PathVysionamplifié sous forme majoritaire de « clusters » ou agrégats de signauxning regions (HSR). B. Cas amplifié sous forme majoritaire de doublquatre copies HER2 et quatre copies CEP17, absence d’amplificatioFISH results with the kit PathVysion (Visys/Abbot).

de la métaphase (double minutes, en anglais). Ils sontextrachromosomiques et présents en de multiples copies,sous la forme de petits grains [46].

Zone grise : HER2/CEP17 compris entre 1,8 et 2,2, ou unnombre de copies de HER2 compris entre 4 et 6. Dans cecas il faut compter plus de cellules (au moins le double,voire plus). En cas de persistance dans cette fourchette dechiffres, il existe deux options.

La première option, celle des recommandationsRoyaume-uni [20,32], en accord avec les réflexions deSauter et al. [45], est, toujours après avoir compté unnombre important de cellules, de considérer les cas avecHER2/CEP17 compris entre 2 et 2,2 comme ambigus maisamplifié, et ceux avec un ratio entre 1,8 et 2 commeborderline ou ambigu mais non amplifié. Cette approchepermet de gommer la zone grise, en intégrant dans lacatégorie éligible au traitement, les patientes avec un ratioHER2/CEP17 supérieur à 2. Tous les grands essais cliniquesen métastatiques et adjuvant ont été réalisés avec un seuilpour le ratio supérieur à 2, ratio pour lequel on disposede données de corrélation positives avec la réponse autrastuzumab. [1,2,35,47].

La seconde est celle des recommandations ASCO/CAP etcanadiennes [8,21] : tester d’autres plans de coupes de la

s/Abbot (HER2 en rouge, chromosome 17 [CEP17] en vert). A. Cass de 20 copies par noyaux) correspondant à des homogeneously stai-nutes (environ 20 copies HER2 par cellules). C. Cas avec polysomie :Cas non amplifié.

tumeur et/ou métastases, et réaliser, si ce n’est pas encorefait en parallèle, un test IHC (cela n’est pas applicable enFrance où le test de triage des patientes est le test IHC). Si letest IHC est 3+, considérer le cas comme HER2+ positif. S’iln’est pas 3+, il sera considéré comme HER2 négatif, en pré-cisant que la fourchette des résultats d’HIS est dans la zonegrise. L’approche du score ASCO/CAP a été récemment criti-quée, pour les techniques HIS, mais aussi IHC, par Shah et al.[48]. Dans leur étude, en utilisant le score ASCO/CAP, 2,8 %des tumeurs initialement considérées comme HER2 positivessont retrogradées en négatives, sans que le nouveau scoren’ait montré une valeur prédictive pour une meilleure sélec-tion des patientes.

Des ambigus et d’interprétation délicate surviennentégalement lorsque qu’il existe une discordance entre le ratioHER2/CEP17 et le nombre total de copies d’HER2.

Dans les rares cas où le nombre total de copies deHER2 est supérieur à 6 mais le ratio inférieur à 2, il estplus logique de raisonner sur le nombre absolu de copiesd’HER2 et de considérer le cas comme amplifié. Ces cascomprennent les situations de co-amplification de la régiondu centromère du chromosome 17.

Dans les cas où le nombre de copies de HER2 est infé-rieur à 4 mais avec un ratio supérieur à 2, il est également

370 F. Penault-Llorca et al.

FaR

pcc3

t

CLsdmt

igure 4. Règles d’interprétation d’une technique d’hybridation in situvec permission.ules of interpretation of in situ hybridization technique. SISH Ventana

lus logique de prendre en compte le nombre absolu deopies d’HER2. Cela se voit en particulier lors de monosomieomplète ou de monosomie partielle soit à partir de plus de0 % de cellules avec une seule copie du chromosome 17.

On ne connaît pas spécifiquement, dans ces deux situa-ions, la réponse aux thérapeutiques ciblant HER2.

as des tumeurs aneuploïdesa présence d’un nombre anormal de copies du chromo-ome 17 peut avoir un impact important sur l’interprétationes examens d’HIS. Une polysomie (trisomies = trois chro-osomes 17, tétrasomies = quatre chromosomes 17 et plus),

otale ou partielle (issues de translocations déséquili-

baaet1[

pd

sd

Tableau 2 Score pour l’hybridation in situ [8].In situ hybridization score [8].

FISH, CISH ou SISH double sonde (sondes HER 2 et chromosome

Amplification Le rapport HER2/chromosome 1(agrégats de signaux)

Absence d’amplification Le rapport HER2/chromosome 1

Cas borderline Entre 1,8 et 2,2, recompter surSi confirmé, cas borderline, l’amRCR

CISH, SISH, FISH monosonde (sonde HER2 uniquement)

Amplification Plus de 6 signaux HER2 présents

Absence d’amplification De 1 à 3,99 signaux HER2 présen

Réponse à différer Si nombre de signaux HER2 entranalyse du centromètre du chro

FISH : hybridation in situ fluorescente ; CISH : hybridation in situ ccentromère du chromosome 17.

. Sonde SISH Ventana HER2/CEP17, d’après le manuel d’utilisation,

HER2/CEP17, with permission.

rées) est définie comme un nombre de chromosomesugmenté en dehors de toute amplification. On concoitinsi que le chromosome 17 et le gène HER2 soientntraînés dans ces anomalies de nombre. Ces surreprésen-ations d’HER2 liées à de multiples copies de chromosomes7 ne donnent pas lieu à de véritables amplifications46].

La connaissance du statut du chromosome 17 est indis-ensable afin d’interpréter correctement ce phénomène ete ne pas surdiagnostiquer une amplification [49].

On doit évoquer une aneuploïdie lorsque le compte designaux se trouve dans la zone grise ou si le nombre de copiese HER2 est compris entre 4 et 6. En cas de test effectué

17—CEP17)

7 (R) est supérieur à 2,2 ou présence de clusters

7 est inférieur à 1,8

plus de noyaux et réanalyser l’IHCplification est possible mais non assurée. Discussion en

par noyau ou présence de clusters (agrégats de signaux)

ts par noyau

e 4 et 6 : effectuer une technique d’hybridation avecmosome 17

hromogénique ; SISH : hybridation in situ argentique ; CEP 17 :

Recommandations tests HER2

avec la sonde HER2 seule, cela devrait imposer un nouvelexamen HIS incluant la sonde centromérique du 17.

Si le nombre de copies de HER2 est superieur à six,quelque soit le nombre de signaux CEP17, le cas est à consi-dérer comme amplifié.

Cependant, il faut noter qu’il n’existe pas de définitionconsensuelle de la polysomie [8,32,44]. Peu de donnéescliniques sont disponibles quant à la réponse clinique autrastuzumab des tumeurs aneuploïdes [35].

Démarche d’assurance qualité (AQ)

InterneL’inclusion de témoins externes, la vérification destémoins internes, le contrôle des résultats des nouveauxlots et la tracabilité des techniques sont indispen-sables.

Une démarche interne d’AQ, sous la forme d’un autocon-trôle, c’est-à-dire la réalisation systématique et régulièrede nouveaux tests pour des cas déjà évalués et choi-sis de facon aléatoire pour s’assurer de sa concordance.Le test peut être effectué soit par le service, soit parune autre structure. Le GEFPICS recommande que tousles 100 cas testés par IHC, cinq à dix cas 0 ou 1+ et 2 à3 cas 3+ soient testés par HIS afin de valider la techniqued’IHC.

La réalisation de statistiques régulières des tests effec-tués dans chaque structure, classées par taille tumorale,grade SBR, envahissement ganglionnaire, éventuellementclasses d’âge et niveau d’expression sera effectuée. Celapermet, en comparaison avec les données statistiques, des’assurer de la bonne concordance globale des résultats.

ExternePour faire suite à nos précédentes recommandations et auxrecommandations qui ont pu être réalisées par différentessociétés savantes, en tenant compte également des don-nées des tests AQ nationaux et internationaux, le GEFPICSrecommande que la participation a un test AQ externe soit

obligatoire pour les tests HER2.

Le GEFPICS propose que les éléments devant être pris encompte pour la validation par l’organisme AQ soient :• l’activité de la structure, avec un « seuil minimal » souhai-

table de 250 tests annuels pour l’IHC et 100 pour l’HIS. Cesseuils pourraient être atteints progressivement. À noterque les recommandations Royaume-uni portent le seuil à250 pour l’IHC et IHS et les canadiens à 200 pour la tech-nique d’IHC ;

• le nombre de tests AQ soit de deux par an pour l’IHC etl’HIS, assortis d’un test supplémentaire pour les struc-tures n’ayant pas obtenu des résultats satisfaisants ;

• la technique soit recueillie sous forme de questionnaire ;• les tests à effectuer par la structure incorporent des

tumeurs ou cellules d’expressions différentes soit un scoreIHC 0, 1+, 2+ et 3+ et des ratios inférieurs à 1,8, entre1,8 et 2,2, supérieur à 2,2 pour la réalisation des tests ;

• les règles d’interprétation des tests soient diffusées etconnues de tous ;

• l’évaluation des tests par le panel se fasse dans le respectde l’anonymat de la structure ;

• le résultat final soit donné par une cotation assortie d’uneappréciation détaillée ;

• les marquages obtenus par le système d’AQ puissent êtreaccessibles par le laboratoire testé (site internet parexemple) ;

371

Tableau 3 Synthèses des recommandations.Summary of recommendations.

Techniques de détermination du statut HER2

Les techniques sont réalisées sur bloc de paraffinepour tout carcinome infiltrant du sein au diagnosticL’IHC reste la première option pour l’évaluation dustatut HER2Si nécessaire, une technique d’hybridation in situFISH ou BrISH est utilisée (cas 2+)La technique IHC est calibrée sur les résultats de l’IHSLa réalisation de 250 tests par an en IHC et de100 tests par an en HIS est un minimum recommandéL’adhésion à des procédures d’assurance qualité estindispensable et obligatoire

FISH : hybridation in situ fluorescente ; IHC : immunohistochi-mie ; HIS : hybridation in situ ; BrISH : Brightfield in situhybridization.

• que le panel qui interprète les tests soit constitué uni-quement ou à majorité de pathologistes et coordonné parceux-ci.

Place de l’AFAQAPDepuis 2001, l’AFAQAP propose de manière régulière descontrôles qualité annuels concernant la détermination IHCdes RO, RP ou de HER2. Depuis 2006, ces contrôles qualitéont été complétés par des contrôles qualité d’HIS sur HER2.En octobre 2008, le Conseil d’Administration de l’AFAQAP,où sont représentés les sociétés savantes et les principauxgroupements professionnels de la spécialité, a estimé quela participation aux contrôles qualité concernant RO, RP etHER2 devrait être obligatoire à partir de 2009 pour toutestructure pratiquant ce type d’examen. Cette obligationprofessionnelle a été introduite dans le texte des recom-mandations de bonnes pratiques en anatomie et cytologiepathologiques (RBPACP) v2 [50]. À partir de 2009, deux

vagues de tests IHC pour RO, RP et HER2 et deux vaguesde tests HIS sur HER2 ont été proposées aux pathologistes.Quant aux quelques structures ayant montré une faiblessedans les résultats de leur contrôle qualité IHC, elles sontinvitées depuis 2008 à participer à un contrôle complémen-taire.

Un module d’apprentissage en ligne (e-learning) permet-tant d’évaluer ses connaissances dans l’interprétation dessignaux d’HIS pour HER2 été mis en ligne en 2009. Il estaccessible gratuitement à l’ensemble des pathologistes.

D’autres organismes proposent des tests d’AQ disponiblesen Europe : l’UKNEQAS et le Nordic.

Au total, à l’ère de la médecine personnalisée, le patho-logiste joue un rôle clé dans la sélection des bons patientspour les bons traitements. Dix ans après la première AMMdu trastuzumab, la détection du statut HER2 est devenu unstandard au diagnostic du cancer du sein. Cependant, ils’agit d’un test délicat et la mobilisation de la spécialitéautour de la qualité de ce test témoigne de son implicationdans la chaîne du soin en cancérologie (Tableau 3).

Conflit d’intérêt

Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêt.

3

R

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

72

éférences

[1] Smith I, Procter M, Gelber RD, Guillaume S, FeyereislovaA, Dowsett M, et al. HERA study team. 2-year follow-up oftrastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positivebreast cancer: a randomised-controlled trial. Lancet 2007;369:29—36.

[2] Perez EA, Suman VJ, Davidson NE, Sledge GW, KaufmanPA, Hudis CA, et al. Cardiac safety analysis of doxorubi-cin and cyclophosphamide followed by paclitaxel with orwithout trastuzumab in the North Central Cancer Treat-ment Group N9831 adjuvant breast cancer trial. J Clin Oncol2008;26:1231—8.

[3] Paik S, Bryant J, Tan-Chiu E, Romond E, Hiller W, Park K, etal. Real-world performance of HER2 testing — National SurgicalAdjuvant Breast and Bowel Project experience. J Natl CancerInst 2002;94:852—4.

[4] Reddy JC, Reimann JD, Anderson SM, Klein PM. Concor-dance between central and local laboratory HER2 testingfrom a community-based clinical study. Clin Breast Cancer2006;7:153—7.

[5] Perez EA, Suman VJ, Davidson NE, Martino S, Kaufman PA,Lingle WL, et al. HER2 testing by local, central, and refe-rence laboratories in specimens from the North Central CancerTreatment Group N9831 intergroup adjuvant trial. J Clin Oncol2006;24:3032—8.

[6] Vincent-Salomon A, MacGrogan G, Couturier J, Arnould L,Denoux Y, Fiche M. Calibration of immunohistochemistry forassessment of HER2 in breast cancer: results of the FrenchMulticentre GEFPICS Study. Histopatology 2003;42:337—47.

[7] Penault-Llorca F, Balaton A, Sabourin JC, Le Doussal V. Évalua-tion immunohistochimique du statut HER2 dans les carcinomesmammaires infiltrants : mise au point du protocole techniqueet de la lecture des résultats — recommandations. Ann Pathol2002;22:150—7.

[8] Wolff AC, Hammond ME, Schwartz JN, Hagerty KL, AllredDC, Cote RJ, et al. American Society of Clinical Oncology;College of American Pathologists. American Society of Cli-nical Oncology/College of American Pathologists guidelinerecommendations for human epidermal growth factor receptor2 testing in breast cancer. J Clin Oncol 2007;25:118—45.

[9] Carlson RW, Moench SJ, Hammond ME, Perez EA, BursteinHJ, Allred DC, et al. NCCN HER2 Testing in Breast CancerTask Force. HER2 testing in breast cancer: NCCN Task Force

report and recommendations. J Natl Compr Canc Netw 2006;4:S1—22.

10] Gonzalez-Angulo AM, Litton JK, Broglio KR, Meric-Bernstam F,Rakkhit R, Cardoso F, et al. High-risk of recurrence for patientswith breast cancer who have human epidermal growth factorreceptor 2-positive, node-negative tumors 1 cm or smaller. JClin Oncol 2009;27:5700—6 [Epub 2009 Nov 2].

11] Carlson RW, Allred DC, Anderson BO, Burstein HJ, Carter WB,Edge SB, et al. NCCN Breast Cancer Clinical Practice GuidelinesPanel. Breast cancer. Clinical practice guidelines in oncology.J Natl Compr Canc Netw 2009;7:122—92.

12] Penault-Llorca F, Schreiner C, Bergougnoux L, Pelen N,Rousselle-Koch B. Évaluation de la surexpression del’oncoprotéine HER2 auprès des anatomopathologistes ensituation réelle sur 2079 cas de cancers du sein en situationadjuvante. Ann Pathol 2008;28(1S):128—30.

13] Leary AF, Hanna WM, Van de Vijver MJ, Penault-Llorca F,Ruschoff J, Osamura RY, et al. Value and limitations of measu-ring HER2 extracellular domain in the serum of breast cancerpatients. J Clin Oncol 2009;27:1694—705.

14] Rakha EA, Ellis IO. An overview of assessment of prognosticand predictive factors in breast cancer needle core biopsy spe-cimens. J Clin Pathol 2007;60:1300—6.

15] Anonyme: recommandations pour la pratique clinique de Saint-Paul de Vence. Oncologie 2005;7:342—79.

16] Vincent-Salomon A, Jouve M, Genin P, Fréneaux P, Sigal-Zafrani B, Caly M, et al. HER2 status in patients with breastcarcinoma is not modified selectively by preoperative chemo-

[

[

[

[

[

[

[

F. Penault-Llorca et al.

therapy and is stable during the metastatic process. Cancer2002;94(8):2169—73.

17] Cottu PH, Asselah J, Lae M, Pierga JY, Diéras V, Mignot L, etal. Intratumoral heterogeneity of HER2/neu expression and itsconsequences for the management of advanced breast cancer.Ann Oncol 2008;19:595—7.

18] Tapia C, Savic S, Wagner U, Schönegg R, Novotny H, Grilli B,et al. HER2 gene status in primary breast cancers and matcheddistant metastases. Breast Cancer Res 2007;9:R31.

19] Werner M, Chott A, Fabiano A, Battifora H. Effect of formalintissue fixation and processing on immunohistochemistry. Am JSurg Pathol 2000;24:1016—9.

20] Dowsett, Hanby AM, Laing R, Walker R. NationalHER2 Consultation Steering Group HER2 testing in theUK: consensus from a national consultation. J Clin Pathol2007;60:685—9.

21] Hanna W, O’Malley FP, Barnes P, Berendt R, Gaboury L,Magliocco A, et al. Updated recommendations from the Cana-dian National Consensus Meeting on HER2/neu testing in breastcancer. Curr Oncol 2007;14:149—53.

22] Middleton LP, Price KM, Puig P, Heydon LJ, Tarco E, SneigeN, et al. Implementation of American Society of ClinicalOncology/College of American Pathologists HER2 GuidelineRecommendations in a tertiary care facility increasesHER2 immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridi-zation concordance and decreases the number of inconclusivecases. Arch Pathol Lab Med 2009;133:775—80.

23] Arrêté du 13 juillet 2006, modifiant l’arrêté du 5 janvier1993 SOCT0611483A incluant les « travaux exposant auformaldéhyde » dans la liste des substances, préparationset procédés cancérogènes aux sens du deuxième alinéade l’article R 231-56 du Code du travail : disponible surhttp://www.legifrance.gouv.fr/affichTexte.do?cidTexte=JORFTEXT000000820123&dateTexte=.

24] Réflexions AFAQAP sur les substituts au formol: disponiblesur http://www.afaqap.org/ecrire/upload/200712281010240.formol%20et%20substituts-bilan%202007.pdf.

25] Jacobs TW, Gown AM, Yaziji H, Barnes MJ, Schnitt SJ.Specificity of HercepTest® in determining HER2/neu statusof breast cancers using the United States Food and DrugAdministration-approved scoring system. J Clin Oncol 1999;17:1983—7.

26] Lebeau A, Deimling D, Kaltz C, Sendelhofert A, Iff A, LuthardtB, et al. HER2/neu analysis in archival tissue samples of human

breast cancer: comparison of immunohistochemistry and fluo-rescence in situ hybridization. J Clin Oncol 2001;19:354—63.

27] Cayre A, Mishellany F, Lagarde N, Penault-Llorca F. Comparisonof different commercial kits for HER2 testing in breast can-cer: looking for the accurate cut-off for amplification. BreastCancer Res 2007;9(5):R64.

28] DiVito KA, Charette LA, Rimm DL, Camp RL. Long-term pre-servation of antigenicity on tissue microarrays. Lab Invest2004;84:1071—8.

29] Atkins D, Reiffen KA, Tegtmeier CL, Winther H, Bonato MS,Störkel S. Immunohistochemical detection of EGFR in paraffin-embedded tumor tissues: variation in staining intensity due tochoice of fixative and storage time of tissue sections. J Histo-chem Cytochem 2004;52:893—901.

30] Oyama T, Ishikawa Y, Hayashi M, Arihiro K, Horiguchi J. Theeffects of fixation, processing and evaluation criteria on immu-nohistochemical detection of hormone receptors in breastcancer. Breast Cancer 2007;14:182—8.

31] Penault-Llorca F, Bilous M, Dowsett M, Hanna W, OsamuraRY, Rüschoff J, et al. Emerging technologies for assessingHER2 amplification. Am J Clin Pathol 2009;132:539—48.

32] Walker RA, Bartlett JM, Dowsett M, Ellis IO, Hanby AM, JasaniB, et al. HER2 testing in the UK: further update to recommen-dations. J Clin Pathol 2008;61:818—24.

33] Jacobs TW, Gown AM, Yaziji H, Barnes MJ, Schnitt SJ. HER2/neuprotein expression in breast cancer evaluated by immunohis-tochemistry. A study of interlaboratory agreement. Am J ClinPathol 2000;113:251—8.

[

[

[

[

[

[

[

[

[

[

Recommandations tests HER2

34] Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, etal. Current perspectives on HER2 testing: a review of NationalTesting Guidelines. Mod Pathol 2003;16:173—82.

35] Hofmann M, Stoss O, Gaiser T, Kneitz H, Heinmoller P, GutjahrT, et al. Central HER2 IHC and FISH analysis in a trastuzu-mab (Herceptin®) Phase II monotherapy study: assessment oftest sensitivity and impact of chromosome 17 polysomy. J ClinPathol 2008;61:89—94.

36] Chibon F, de Mascarel I, Sierankowski G, Brouste V, Bonnefoi

H, Debled M, et al. Prediction of HER2 gene status in HER22+ invasive breast cancer: a study of 108 cases comparingASCO/CAP and FDA recommendations. Mod Pathol 2009;22:403—9.

37] Roger P, Lannes B, Balaton A, Hayem C, Campana F, ArnouldL, et al. HER2 status determined on preoperative biopsiesand in operative specimens: concordance among immunohis-tochemistry (IHC) fluorescence in situ hybridization (FISH) andchromogenic in situ hybridization (CISH) techniques in the CRI-THER Study. Mod Pathol 2007;22(Suppl. 1):65A.

38] Gown AM, Goldstein LC, Barry TS, Kussick SJ, Kandalaft PL, KimPM, et al. High concordance between immunohistochemistryand fluorescence in situ hybridization testing for HER2 statusin breast cancer requires a normalized IHC scoring system. ModPathol 2008;21:1271—7.

39] Hanna WM, Hammond E, Taylor CR, Dabbs DJ, Penault-LlorcaF, Bloom KJ, et al. Re: High concordance between immunohis-tochemistry and fluorescence in situ hybridization testing forHER2 status in breast cancer requires a normalized IHC scoringsystem [letter]. Mod Pathol 2008;21:1278—80.

40] Denoux Y, Arnould L, Fiche M, Lannes B, Couturier J, Vincent-Salomon A, et al. HER2 gene amplification assay: is CISH analternative to FISH? Ann Pathol 2003;23:617—22.

41] Arnould L, Denoux Y, MacGrogan G, Penault-Llorca F, FicheM, Treilleux I, et al. Agreement between chromogenicin situ hybridisation (CISH) and FISH in the determina-tion of HER2 status in breast cancer. Br J Cancer 2003;88:1587—91.

[

[

[

[

[

[

[

373

42] Dowsett M, Hanna WM, Kockx M, Penault-Llorca F, RuschoffJ, Gutjahr T, et al. Standardization of HER2 testing: resultsof an international proficiency-testing ring study. Mod Pathol2007;20:584—91.

43] Nitta H, Hauss-Wegrzyniak B, Lehrkamp M, Murillo AE, Gaire F,Farrell M, et al. Development of automated brightfield doublein situ hybridization (BDISH) application for HER2 gene andchromosome 17 centromere (CEN 17) for breast carcinomasand an assay performance comparison to manual dual color

HER2 fluorescence in situ hybridization (FISH). Diagn Pathol2008;3:41.

44] Penault-Llorca F, Cayre A. Actualité des tests HER2 dans le can-cer du sein. Bull Cancer 2004;91(Spécial):S211—5.

45] Sauter G, Lee J, Bartlett JM, Slamon DJ, Press MF. Guidelines forhuman epidermal growth factor receptor 2 testing: biologic andmethodologic considerations. J Clin Oncol 2009;27:1323—33.

46] Couturier J, Vincent-Salomon A, Mathieu MC, Valent A, Bern-heim A. Diagnostic de l’amplification du gène HER2 dans lescancers du sein : le point de vue génétique. Pathol Biol2008;56:375—9.

47] Dowsett M, Procter M, McCaskill-Stevens W, de Azambuja E,Dafni U, Rueschoff J, et al. Disease-free survival according todegree of HER2 amplification for patients treated with adju-vant chemotherapy with or without 1 year of trastuzumab: theHERA Trial. J Clin Oncol 2009;27:2962—9 [Epub 2009 13].

48] Shah SS, Ketterling RP, Goetz MP, Ingle JN, Reynolds CA,Perez EA, et al. Impact of American Society of ClinicalOncology/College of American Pathologists guideline recom-mendations on HER2 interpretation in breast cancer. HumPathol 2010;41:103—6 [Epub 2009 16].

49] Dal Lago L, Durbecq V, Desmedt C, Salgado R, Verjat T, Lespa-gnard L, et al. Correction for chromosome-17 is critical for thedetermination of true HER2/neu gene amplification status inbreast cancer. Mol Cancer Ther 2006;5:2572—9.

50] Recommandations de bonnes pratiques en ACP : (disponiblesur http://www.afaqap.org/ecrire/upload/201001181206340.RBPACP%20v2 2009-web.pdf).