mesures par rmn des interactions, sucres et...
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MESURES PAR RMN DES INTERACTIONS, SUCRES ET PROTÉINES.
Examples d’applicationExamples d’application
UMR CNRS 6226 - ENSCRInstitut des Sciences Chimiques de Rennes« Chimie Organique et Supramoléculaire »
Laurent Legentil,
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RMN STD (Saturation Transfer Difference )
HcHc
HbHb
Hc
Hb
Ligand
Irradiation
RMN STD : Cartographie d’RMN STD : Cartographie d’épitopesépitopes
1.00 1.00 2.00
Hb
HcHa
Spectre du ligand (référence)
Hc
Ha
Hb
Ligand
HaSpectre après
European Young Investigator Workshop Mai 2011
0.30 0.90
Hb
HcSpectre STD
Hc
Ha
Hb
LigandHc
Ha
Hb
Ligand_
Protéine HaHaHa
HcHc
HaHa
HbHb
Hc
Ha
Hb
Ligand
1.00 0.70 1.10
Hb
HcSpectre après
irradiation
Hc
Ha
Hb
Ligand
100%33%
Angew. Chem. Int. Ed. 1999, 38, 1784-1788.
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RMN STD : Application aux systèmes biologiquesRMN STD : Application aux systèmes biologiques
• Interaction Récepteur-Ligand
• Interaction Enzyme– Ligand
• Compétition – Meilleur Ligand
• STD sur Cellule entière
European Young Investigator Workshop Mai 2011
Carbohydr. Res. 2004 339, 907-928.
Drug Discovery Today 2012, 17, 505-513
• STD sur Cellule entière
• STD - HRMas
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Caractérisation par RMN STD
des interactions
ββββ-Glucanes/Récepteurs
European Young Investigator Workshop Mai 2011
ββββ-Glucanes/Récepteurs
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Récepteurs Scavenger
Lactosylcéramide
CR3Dectin-1
β-Glucanes
European Young Investigator Workshop Mai 2011
Effecteurs engagés
Phagocytose
INNEACQUIS
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Evaluation des interactions par RMN STD
Cibles Moléculaires
European Young Investigator Workshop Mai 2011
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Structure caractérisée par RMN 900 MHz
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Caractérisation du Laminarihexaose RMN 900 MHz H-1aαJ1aα,2aα = 3,6 Hz
H-1aβJ1aβ,2aβ = 8,1 Hz
H-1b
J1b,2b = 8,0 Hz
H-1c
J1c,2c = 8,0 HzH-1d
J1d,2d = 8,0 Hz
H-1e
J1e,2e = 7,8 Hz
H-1f
J1ef2ef = 8,1 Hz
Evaluation des interactions par RMN STD
European Young Investigator Workshop Mai 2011
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H-1aαH-1aβ
H-1(b,c, d,e, f)
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Evaluation des interactions par RMN STD
Interaction oligoglucane/CR3, Dectin-1 avec une cryo-sonde 900 MHz
� Avec le Laminarihexaose
Spectre STD
D2O[S] 3.7 mmol
Ratio proteine/ligand 1:25
European Young Investigator Workshop Mai 2011
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Spectre de la
laminarihexaose
�Les observations de Feizi semblent être confirmées
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Evaluation des interactions par RMN STDInteraction polymère/CR3 avec une cryo-sonde 900 MHz
� Avec la Laminarine
Spectre STD
European Young Investigator Workshop Mai 2011
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Spectre de la
laminarine
�Faibles effets observables : Confirme CR3 n’est pas le récepteur principal
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Evaluation des interactions par RMN STDInteraction polymère/Dectin1 avec une cryo-sonde 900 MHz
STD laminarine/Dectin-1
European Young Investigator Workshop Mai 2011
Carbohydr. Res.2011, 346,490-1494.
Laminarihexaose
Forte réponse
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European Young Investigator Workshop Mai 2011
Dectin-1
Face interactive
Forte reconnaissance protons anomère α/βdu sucre réducteur
Reconnaissance probable au niveau d’une poche hydrophobe de Dectine 1 : Interaction avec la face hydrophobe du polysaccharide
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Conclusions
� Effets STD observés avec le polysaccharide
Pas d’interaction in vitro entre le laminarihexaose et les
récepteurs
Pas d’interaction in vitro entre le laminarihexaose et les
récepteurs
European Young Investigator Workshop Mai 2011
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� Ces études préliminaires n’ont pas permis d’établir
les paramètres structuraux pour une meilleur efficacité
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Caractérisation par RMN STD
des interactions
enzyme/ligand
European Young Investigator Workshop Mai 2011
enzyme/ligand
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Furanosyl-1-PGalp-1-P
Nucléotidyltransférases
Interaction Enzyme– Ligand : Vérification de la ver satilité d’une enzyme ; La nucléotidyltransférase
European Young Investigator Workshop Mai 2011
Nuclétotides-sucresUDP-αααα-D-Galp
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Uridyltransférases
Utilisation de Utilisation de nucléotidyltransférasesnucléotidyltransférases
(N-acétyl-D-glucosamine)(2-azido-2-désoxy-D-galactose)
(D-xylose)
European Young Investigator Workshop Mai 2011
Obtention d’une gamme d’UDP-sucres
� de configurations variées
� de conformations (1C4 or 4C1) variées
Chem. Commun. 2004, 2706-2707.
(L-fucose)(D-mannose)
Système pluri-enzymatiques
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Uridyltransférases
UDP-Glcp2Pi
Pyrophosphataseinorganique
PPi
mélange αααα,ββββ
VerstalitéVerstalité d’une d’une nucléotidyltransférasenucléotidyltransférase
European Young Investigator Workshop Mai 2011
Glc-1-PUTP
UDP-glucose pyrophosphorylase
Galactose-1-phosphateuridyltransférase
���� Reconnaissance de furanosyl 1-phosphates variés ?
- Encombrement- Electronégativité- Sélectivité αααα/β β β β ? R= H, CH3, CH2OH, CH2F
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RMN STD (Saturation Transfer Difference)
H3 (Gal)
100%
100%
61%
87%
34%
32%27%
35%
65%
UDP-Galp
nd
nd
nd
H6/6’(Gal)
100%
78%
90%
31%23%
27%UDP-αααα-D-Galf
Criblage de substrat par STDTampon Tris deutéré pH 6,8
[S] 1,5 µmolRation proteine/ligand : 1:100
European Young Investigator Workshop Mai 2011
H6’ (Uri)H1’(Rib)H
5’(Uri)H1(Gal)
H2’/3’
(Rib)
H4’(Rib)
H5’(Rib)
H5 (Gal)
32%27%
H6/6’(Gal)
H2’/3’
(Rib)
H4’(Rib)
H5’(Rib)
31%23%
H6’ (Uri)
H1’(Rib)H
5’(Uri)
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UDP-ββββ-D-Galf
100%
82%10%
90%
15%
21%
90%26%
90%
25%
28%
100%
10%UDP-6F-ββββ-D-Galf
Utilisation d’une uridyltransférase : Conclusion
European Young Investigator Workshop Mai 2011
UDP-αααα-L-Araf
28%
100%
77%22%
75%
21%
30%9%
UDP-6F-αααα-D-Galf86%20%
90%
18%
34%
100%
�Interactions avec l’enzyme par la partie nucléosidiq ue���� Effets STD similaires pour les composés 1,2- cis et 1,2-trans
���� Substrat de l’enzyme
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mélange αααα,ββββ
3 enzymes
UDP-Glcp (cat.)UTP (1 équiv.)
R= H, CH3, CH2OH, CH2F
Uridyltransférases
Utilisation d’une uridyltransférase : Conclusion
European Young Investigator Workshop Mai 2011
R Série Conversion (%) Sélectivité
CH2OH D-Gal 40 1,2-cis (αααα)H L-Ara 22 1,2-cis (ββββ)CH3 D-Fuc 12 1,2-cis (αααα)CH2F 6F-D-Gal 42 1,2-cis (αααα)
Eur. J. Org. Chem. 2008, 5988-5994.
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RMN STD compétitive :
Criblage ligands pour un
récepteur
European Young Investigator Workshop Mai 2011
récepteur
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Criblage d’une bibliothèque combinatoire dynamique pour l’inhibition de la β-Galactosidase
Liaison hemithioacetal reversible : formation (ou l’hydrolyse) plus rapide que le temps de
relaxation
European Young Investigator Workshop Mai 2011
Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 589-593.
β-Galactosidase
Système dynamique
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Criblage d’une bibliothèque combinatoire dynamique pour l’inhibition de la β-Galactosidase
European Young Investigator Workshop Mai 2011
Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 589-593.
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Criblage d’une bibliothèque combinatoire dynamique pour l’inhibition de la β-Galactosidase
Interaction spécifique Interaction non spécifique
European Young Investigator Workshop Mai 2011
Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 589-593.
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Criblage d’une bibliothèque combinatoire dynamique pour l’inhibition de la β-Galactosidase
European Young Investigator Workshop Mai 2011
Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 589-593.
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Reconnaissance spécifique antigène - anticorps
• Processus de réinnervation• Action sur l’activité synaptique et la plasticité des cellules nerveuse
Trisaccharide antigénique présenté par HNK-1 (Human natural killer-1)
European Young Investigator Workshop Mai 2011
J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 426-434.
nerveuse
Cible de l’anticorps anti-HNK-1
Maladie autoimmune
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Reconnaissance spécifique antigène - anticorps
European Young Investigator Workshop Mai 2011
J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 426-434.
Elucidation de la topologie du complexe épitope -anticorps
STD-TOCSY
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Reconnaissance spécifique antigène - anticorps
Elucidation de la topologie du complexe épitope -anticorps
On-resonance
STD
Anticorps HNK-1 412 : 30 µMLigand : 600 µM
Zone claire d’intéraction :Interactions forte au niveau du GlcAPeu d’’interaction sur la partie lactose
European Young Investigator Workshop Mai 2011
J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 426-434.
Off-resonance
On-resonance
Superposition des signaux :Identification des protons proches du récepteur difficile
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Reconnaissance spécifique antigène - anticorps
Elucidation de la topologie du complexe épitope -anticorps
STD - TOCSYTOCSY
European Young Investigator Workshop Mai 2011
J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 426-434.
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Caractérisation par RMN STD
des interactions
Inhibiteurs/Recepteurs
European Young Investigator Workshop Mai 2011
Inhibiteurs/Recepteurs
membranaires
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RMN STD sur cellule entière
European Young Investigator Workshop Mai 2011
De brevet WO 2012/077087
Récepteur inconnu ou difficile à isoler
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Arabinogalactane AG 30 monomers of Galf
β-(1,5) and β-(1,6) bonds
Galactane fragment of AG :
Mycobacterial membrane :
Galactofuranose in Mycobacterium
Crucial component of mycobacterial membraneEssential for survivance
European Young Investigator Workshop Mai 2011
http://www.birmingham.ac.uk/staff/profiles/biosciences/alderwick-luke.aspx
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0.30 mg/mL 90 µg/mL
Inhibition de la croissance de M. smegmatis
MIC : 0.78 mg/mL 0.80 mg/mL 0.40 - 0.55 mg/mL2.7 mM 2.0 mM 1.2 - 1.5 mM 1. 0 mM 0.3 mM
European Young Investigator Workshop Mai 2011
� Les thioimidates ne provoquent pas d’inhibition
� Longueur minimale de la chaîne alkyle requise
� Furanosides meilleurs que les pyranosides
� Groupements polaires en C-6 plus efficaces : liaisons hydrogène ?
� MIC ethambutol : 3 µg/mL
0.40 - 0.55 mg/mL
Takayama, K. et al. Antimicrob. Agents Chemother. 1989, 33 (9), 1493-1499.
2.7 mM 2.0 mM 1.2 - 1.5 mM 1. 0 mM 0.3 mM
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Spectre de résonance « off »
RMN « STD » : Saturation Transfer Difference
Inhibition de la croissance de M. smegmatis
D2O[S] 2 µM
Cellule : 20 mg Masse humide
European Young Investigator Workshop Mai 2011
Spectre de résonance « on »
Différence des deux spectres
Applicable aux cellules entières de M. smegmatis
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OO
OH
HO
HO
HO
100%
70%
48%
10%
0%
9%
16%
11%
MIC 1.0 mM
Inhibition de la croissance de M. smegmatis
European Young Investigator Workshop Mai 2011
H-1
H-2H-3
OCH2
OCH2
H-4H-5, H-6a, H-6b
CH3OCH2CH2 (CH2)5
-D-galactofuranoside de n-octyle
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MIC 2.7 mM
O
HO
HO
OH
O
OH
100%
72%
48%
9%
0%
9%
14%
14%
Inhibition de la croissance de M. smegmatis
European Young Investigator Workshop Mai 2011
H-1
H-2H-3
OCH2
H-6aH-6b
CH3OCH2CH2 (CH2)5
-D-galactopyranoside de n-octyle
H-4H-5
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Pas d’inhibition
Inhibition de la croissance de M. smegmatis
European Young Investigator Workshop Mai 2011
Chaîne octyle responsable de l’effet STD, mais n-octanol non inhibiteur :un cycle furanose/pyranose semble nécessaire
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OMeO
OH
HO
HO
HO
-D-galactofuranoside de méthyle
Pas d'effets STD
Pas d’inhibition
Inhibition de la croissance de M. smegmatis
European Young Investigator Workshop Mai 2011
Cycle furanique sans effets STD, ni activité inhibitrice : nécessité d’une chaîne octyle
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Paroi mycobactérienne :
� Interaction de type lipophilemodulée par la tête polaire
� Glycoside d’alkyle requis
Inhibition de la croissance de M. smegmatis
European Young Investigator Workshop Mai 2011
http://www.birmingham.ac.uk/staff/profiles/biosciences/alderwick-luke.aspx
� Mode d’action : perturbation de la couche d’acide mycolique, ou dégradation et reconnaissance d’entités sucres modifiées ?
� Reconnaissance spécifiquenon exclue
� Molécules marquées nécessaires
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Lipophosphoglycane LPG :
Major cytoplasmic glycolipidVirulence factorAnchor at the gut’s wall of the phlebotome
Cell membrane of Leishmania:
Galactofuranose in Leishmania
European Young Investigator Workshop Mai 2011
Fragment of LPG core
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=glyco2&part=ch40
PG
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GalfOct and 6-NH2-GalfOct significantly decrease parasite growth in vitro…
OC8H17O
OH
HO
HO
H2N
IC50 = 8.96 ± 2.5 µM IC50 = 41.6 ± 8.3 µM
European Young Investigator Workshop Mai 2011
Antimicrob. Agent and Chemother., 2014, 58, 2156-2166
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But not the octyl galactopyranoside
European Young Investigator Workshop Mai 2011
A polar moiety at C-6 position is essential for activity
Specificity of the furanose ring
No surfactant effect (IC50 < CMC )
Antimicrob. Agent and Chemother., 2014, 58, 2156-2166
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Applicable aux cellules entières de L. Donovani
RMN « STDD » : Saturation Transfer Double Difference
Inhibition de la croissance de Leishmania
Deuterated PBS (pH 7,5)[S] 2 µM
Cellule : 2.108 cellules par tube
Interaction avec la membrane du parasite pour tous les ligands
European Young Investigator Workshop Mai 2011
pour tous les ligands testés
Effet STD légèrement plus élevé pour les
furanosides d’alkyle
Spécificité
furanose
Spécificité pour le
furanose
Antimicrob. Agent and Chemother., 2014, 58, 2156-2166
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Prochaine étape : RMN STD
couplé à l’HR-MAS
European Young Investigator Workshop Mai 2011
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Interaction du co-transporteur SGLT1 avec son ligand
Pré-requis pour une bonne STD sur cellule entière :
Cellule en suspensionAgrégation faible
Non applicable aux cellules issues de tissu, aux cellules végétales, … qui s’aggrègent et
retombent rapidement au fond du tube
European Young Investigator Workshop Mai 2011Chem. Eur. J, 2011, 17, 13395-13399
Solution : RMN Haute Résolution à l’angle Magique
Force centrifuge empêche toute sédimentation
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Interaction du co-transporteur SGLT1 avec son ligand
Modèle cellulaire : transporteur SGLT1 du glucose à travers la membrane apicale
Inhibiteur compétitif :
European Young Investigator Workshop Mai 2011Chem. Eur. J, 2011, 17, 13395-13399