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www.454.com

Le séquençage Roche 454

Stéphane Fénart, Arnaud Mouchon

Roscoff, Avril 2012

Systèmes “Genome Sequencers” Une stratégie unique en séquençage nouvelle génération

Pionniers en séquençage de nouvelle génération

Premier séquenceur à haut-débit : GS20 (2004)

Systèmes “Genome Sequencers” Une stratégie unique en séquençage nouvelle génération

Longueur de séquence X 8 en moins de 5 ans

Séquençage toutes applications

Exactitude de séquence

Flexibilité et complémentarité

0

100

200

300

400

500

600

700

800

GS 20 GS FLX

standard

GS FLX

Titanium

GS FLX + Sanger NGS

Ba

se

s

GS Junior

Illumina

GAIIx

100M

1M

10M

1G

10G

100G

400 800 0

Ba

se

s

Longueur de lecture

GS FLX

Titanium

System

200 600

Helicos Séquençage d’amplicons

Haplotypage

Genotypage

Séquencage de Gènes & Régions ciblés

Métagénomique

GS Junior

System

Illumina

HiSeq2000 ABI

SOLiD

1T

Complete

Genomics

Sanger

La technologie “longues lectures” 454 La seule technique capable de remplacer la méthode Sanger

Ion Torrent

MiSeq

1. Préparation de la librairie

2. emPCR amplification Amplification clonale des fragments

3. Préparation de la PicoTiterPlate – Séquençage clonal

454 Sequencing Workflow

Un fragment – Une bille – Une lecture

Shotgun

Blunt-end Ligation

Genomes entiers

BACs, Long Range PCR

Transcrits

ncRNA, ADN Ancien

ESTs, ADN fragmenté

ss DNA Library

Amplicons

Produits de PCR de 200-500 bp (HIV, exons, 16S...)



emPCR

Sequençage

Amplification clonale en émulsion



Mélange des fragments

d’ADN de la librairie avec

les billes et de l’huile.

Création d’un

microréacteur par

émulsion

Selection

(enrichissement) des

billes ayant les

fragments d’ADN

Amplification clonale

au sein de chaque

microréacteurs


Chargement de la PicoTiterPlate Device

• Diamètre des puits : 30 µm • > 100 000 lectures obtenues en paralleles • Une seule bille de capture avec l’ADN

simple brin amplifié est déposée par puits.

Les billes de capture et les fragments d’ADN sont déposés

dans la plaque de séquençage (PicoTiterPlate device)

• Polymerase ajoute 1 nucleotide (dNTP)

• Pyrophosphate est relargué (PPi)

• Sulfurylase crée ATP à partir PPi

• Luciferase hydrolyse l’ATP et utilise la lucéférine pour émettre de la lumière.

• 4 nucleotides (TACG) sont incorporés

par flux pendant 200 cycles

• Un nucléotide complémentaire au brin

matrice va s’incorporer et générer un

signal lumineux.

• Le signal lumineux est enregistré par la

caméra CCD.

• L’intensité du signal est proportionnelle

au nombre de nucléotides incorporés.

GS Junior : la chimie Titanium

Séquençage par synthèse

Flowgram

Key sequence = TCAG permet de calibrer le signal

Flow Order

1-mer

2-mer

3-mer

4-mer TACG

T T C T G C G A A

GS Titanium Sequencing

Flowgrams

11

One read

One bead

Un Fragment, Une Bille, Une Lecture

Librairie emPCR

Pyroséquençage Analyse des résultats

One Fragment One Well

Dépôt

La technologie Roche - 454

Une technique robuste

Une technique mondialement reconnue

Robustesse des résultats

Reproductibilité

Fiabilité

Evolution de la chimie

L’assurance de résultats de qualité

Une méthode facile à acquérir

Une technique rapidement opérationnelle

>1500

publications

La sécurité des résultats

La reconnaissance des résultats et des travaux effectués

Gain de temps et de coûts

2005 06 07 08 09 10 2011


Une technique précise

L’exactitude de lecture

Qualité identique à Sanger (gold standard)

99,6% en lecture simple

99,995% en lecture consensus

(équivalent phred 50)

Des résultats de haute qualité

Méthode fiable

Méthode de référence (QC)

Une qualité de résultats incomparable

Gain de temps et de coûts

Q20

90,0%

91,0%

92,0%

93,0%

94,0%

95,0%

96,0%

97,0%

98,0%

99,0%

100,0%

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Position on Read (bp)

Ac

cu

rac

y

Illumina TruSeq

GS Junior

GS FLX Titanium

GS FLX +

Séq courtes


Les apports des longues séquences

Combinaison unique – longue séquence et exactitude

Chimie FLX+ Titanium = 800 bases

Pour GS Junior = améliorations prévues courant 2012

Des génomes simples aux plus complexes

Meilleure qualité d’assemblage

Lecture des séquences répétées

Détection de toutes les anomalies génétiques

Transfert des protocoles Sanger

Une seule technique = tous les résultats

Gain de temps pour l’obtention des résultats finaux

Séquences courtes

Séquences longues


La préparation d’échantillons (amplicons)

Les solutions de préparation d’échantillons

La problématique de la préparation des

échantillons résolue

Des kits, des essais, des notes d’application, …

de l’échantillon aux résultats.

Fluidigm +

Roche 454

Raindance +

Roche 454

Capture de séquences +

Roche 454

10

50

100

200

500

0

Nb

de

ré

gio

ns

ou

Nb

de

gè

ne

s

Méthodes maison

Kits Roche

100 1000

Nb d’échantillons 500

Multiplicom +

Roche 454

Améliorer le rendement du laboratoire

Répondre à la demande croissante de séquençage

Réduire le temps / coût sur le développement et sur les résultats


Rapidité et flexibilité

De l’échantillon aux résultats

1 run = 10 heures

2h d’analyse pour 40 Mbases (100.000 séquences)

Optimisation = 1 run /jour

Un séquenceur haut débit

à la fois de paillasse et de plateforme

Capable de répondre aux urgences

Flexibilité d’utilisation

Optimiser l’utilisation d’un séquenceur de plateforme pour différentes applications

Gain de temps pour l’accès aux résultats

Day 3 Data

Analysis

Day 2

Sequencing Day 1 Sample

Preparation


Une analyse des données simplifiée

L’analyse des données

3 logiciels: de Novo, reséquençage, amplicons

Assemblage d’E. Coli de novo <10 minutes

Interface graphique intuitive

Une analyse informatique facilitée

Manipulation simple des données et export ouvert

Transfert et stockage des données économiques

Analyses faciles à intégrer et à maîtriser

Script(s) spécifique(s) par application

Réduction des coûts

Bioinformaticien non nécessaire en routine

Gain de temps pour l’implémentation de la technologie

Microbiologie

Séquençage 454 exemples d’applications

Phylogénie, Biogéographie Génétique des populations

Importance de la longueur de lecture dans la

caractérisation fine des populations virales

• 3 mutations sont régulierement observées en association

avec des résistances à des cocktails de molécles

thérapeutiques M46I/L, I84V, and L90M

• Il faut donc savoir si dans la population virale portée par un

patient ces mutations se rencontrent au sein d’un même

génome ou sur des génome séparés :

• - au sein du même génome viral : le traitement aura peu de

chance de marcher + risque de sélectionner le virus résistant

• - sur différents génomes : le traitement combinant plusieurs

molécules pourra convenir

• Ces 3 mutations se rencontrent dans une séquence de

500pb : seule la technologie Roche-454 peut permettre

de savoir si elles sont sur des génomes différents ou non

Séquençage de la souche épidémique O: 109 de E. coli

Problématique

Emergence de nouveaux variants pathogènes de E. coli

identification des facteurs de virulence

May 24 June 1 2 juin 9 juin 10 juin

Dépôt des premières données

de séquençage ion torrent +

Hiseq 2000

La communauté

bioinformatique reconnait

l’échec d’indentification

des gènes de virulence Test sur

GS Junior

May 24 June 1 2 juin 9 juin 10 juin

7 runs ion torrent

> 3000 contigs

data HiSeq 2000

Analyse complexe

>450 scaffolds

3 runs GS Junior:

Analyse : 3 « clics »

13 scaffolds

Résultats

Séquences courtes génèrent des assemblages très fragmentés

Caractérisation précise

des facteurs

virulence/résistance

Microbiologie



Génétiques des populations :

analyse de la diversité intra- et inter-populations

Analyse de la diversité :

étude des fréquences alléliques

Ex : polymorphisme de taille de marqueurs microsatellites…

polymoprhisme mitochondrial ou nucléotidique…

- Approche « classique » :

Nombreux runs de séquenceurs capillaires…

Nombreuses analyses de fragments (Genscan, etc)

ou de séquences Sanger à relire

- Approche « NGS » :

PCR avec « tag » (MID) par population

Séquençage 454 : un run !

Tableau de variants = allèles rencontrés dans chaque population et leur fréquence.

Accès aux séquences (plus de problème d’homoplasie)

Ex : 20 populations – 50 individus diploïdes/ pop – 10 marqueurs

= 2000 séquences à analyser

=> 1 run de GS Junior = 100.000 séquences = couverture 50x


analyse de la diversité intra- et inter-populations

5 Long-Range PCR sur le génome

mitochondrial complet (15kb)

Analyse simultanée = 1 run GS Jr

226 variants répartis sur l’ensemble

des populations


développement rapide de nouveaux marqueurs

Séquençage direct (pas d’étape de clonage)

Filtrage bio-informatique des séquences contenant des motifs répétés…

Obtention de nouveaux microsatellites

Microbiologie



Analyses phylogénétiques, phylogéographiques…

Avec les approches « classiques » :

Limites techniques : difficultés de travailler sur séquences nucléaires…

(clonage obligatoire)

Ces limites imposent les choix des séquences analysées !

- Séquences chloroplastiques ou mitochondriales analysées en priorité

- Pas d’information de diversité nucléotidiques nucléaires!

- Analyses de polymorphisme de taille (µsats) mais inférence

phyologénétiques difficiles…

Avec approche « NGS » :

Levée des contraintes techniques => séquençage clonal !!!

Accès à un plus large choix de séquences

Roche 454 => séquences longues => haplotypage / génotypage fiable

Analyses phylogénétiques, phylogéographiques…

“A crucial advantage is that the high coverage of clonally amplified sequences

simplifies haplotype determination, even in highly polymorphic species. This

targeted nextgeneration approach can greatly increase the use of nuclear DNA

sequence loci in phylogeographic and population genetic studies by mitigating

many of the time, cost, and analytical issues associated with highly

polymorphic, diploid sequence markers.“

Puritz et al (PloS One, 2012)

En résumé…

>100.000 séquences / run

Stockage des données aisé : 1 run = 10Gb

Facilité de prise en main = uniquement du pipetage!

1 workflow = plusieurs applications (shotgun, amplicons)

Robustesse = pas de laser, pas d’éléments mobiles

Longues séquences = haplotypage, génotypage, assemblage facilités

et transfert facile de projets « sanger »

Pas de licence logiciel = Linux !

Rapidité = 1,5 jours de labo – 10h de run

Fiabilité = 1ère technologie de séquençage à Haut-débit

> 30 GS Juniors

- en hôpitaux (Toulouse, Lille, Marseille, Bordeaux, Nantes,

Montpellier, La Pitié, HEGP )

- en biotech / Pharma

- en recherche (INRA, CNRS, INSERM)

(4 sites supplémentaires en préparation)

Les domaines d’application

- Oncologie / Génétique humaine

- Microbiologie

- Ecologie / génétique des populations

- Plantes

- Interactions hôtes/pathogènes

- ADN ancien…

Le GS Junior en France

GS Systems :

des machines et des hommes !!!

- Accompagnement à l’installation et validation de votre séquenceur dans votre laboratoire.

- Formation complète sur site et accompagnement sur les premières manipulations.

- Accompagnement au développement de nouvelles applications.

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- Un support application avec des spécialistes français Puces/Séquençage (4 Chefs de Projets “terrain” et un Chef de Produit).

- Un support “applications” Europe (hotline) : >15 spécialistes en séquençage.

- Un support SAV machine régionalisé avec intervention selon les “contraintes” du Diagnostic.

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