le bios de la lécithine

70 Archives Iutcrrialionales de Phgsiologie, 1933, \ 01. XSS\ 11. I;asc. 1

[612.jc)7.S2] Requ Ir 1 3 juillet 1933.

LE BIOS DE LA LECITHINE

P A R

EM. JANSSENS, M. D

(Travail du laborafoire de chimie biologique, Uwiversitt de Louvaiiz Dir. : M. IDE) .

PLUS de 30 annees se s o n t passees depuis que WILDIERS a reconnu I’existence d’un (( Bios ,I necessaire a la multiplication normale de

la plupart des levures de biere, e t il y a aussi plus de 30 ans que WILDIERS (l)

a privu que l’isolement de cette substance serait difficile, parce qu’elle n’obeissait a aucune reaction de groupe ant i r ieurement reconnu.

Aujourd’hui l’existence du Bios n’est plus contestee, mais son isolement es t loin d’Ctre realise.

On a sur tout di t (( ce qu’if n’esf pas )) : il n’est en effet aucun des corps organiques connus ( z ) ou inconnus (3).

DEVLOO (4) en 1906 avait annonce qu’il trouvait du bios dans la ICci- thine commerciale e t qu’il s’y trouvait sous une forme liposoluble : pour- t a n t la Iicithine-choline pure, retiree de son precipite cadmique, ni aucun derive de cette lecithine ou de la choline elle-m@me n’etaient actifs s u r la levure. C’etait le residu lipoi’dique libere de toute Iecithine-choline, risidu soluble dans I’ether anhydre, qui contenait le bios encore actif s u r les cultures de levure.

DEVLOO saponifia ce residu et en retira la substance soluble dans I’eau e t active s u r la levure. I I emit alors la presomption qu’il existe une ICci- thine-biosine, u n compose du bios soluble dans I’ether.

Depuis lors cette question n’a plus ete t ra i t ie : seul NARAYANAN signale e n passant le fait de DEVLOO tout e n exprimant I’avis qu’il est probable- ment inexact.

Apres le travail de DEVLOO, le laboratoire du Pr. I D E a Louvain, abandon- na I’etude du bios : on estimait que seuls des chimistes professionnels seraient a m@me d’achever I’isolement du bios.

Au laboratoire voisin dirigi par le P r MALENGREAU, la purification du bios fu t reprise ; mais le travail de plusieurs annees ne donna pas de resul- t a t s dignes d’etre publiis. Toutefois on y precisa u n fait connexe, assez interessant pour Gtre rappel6 ici.

(l) E. WILDIERS, Nouvelle substance indispensable, La Cellule, 1901, XVI 11. P ) NARAYANAN, Biochem. Journ., 1930, 24 janvier. ( a ) KOGL, Die Naturwrissenschafte~i, 1933, 13 janvier. ( 4 ) R. DEVLOO, La Celble, 1906, X X V I I I .

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La vitamine B du beriberi avai t e t i decouverte entretemps e t s a prin- cipale source i t a i t aussi la levure ; or dans I’extrait de levure, vitamine B e t bios etaient si intimement associis qu’on les supposa identiques,on fit le tes t de la vitamine par l’ipreuve de bios sur la culture de levure : aucune s iparat ion chimique n’etait possible alors.

J. HOET (l) prouva alors par test biofogique que bios e t vitamine B ne pouvaient pas Etre une seule e t mEme substance. Voici cette preuve.

Beaucoup de microbes e t de moisissures peuvent se multiplier s u r milieu mineral sucre sans bios. Or on sa i t depuis longtemps que le milieu s u r lequel certains de ces microbes ou levures ont vecu, devient propre a la culture de la levure : en d’autres mots, il y a des Etres monocellulaires qui fabriquent du bios a u x d ipens d’un milieu mineral sucr i .

l o Or HOET constate qu’uneTorula fabrique ainsi du bios necessaire a la levure, mais ce bios de Torula i t a i t totalement incapable de guerir u n beriberi experimental.

Voila donc du bios different de la vitamine antiberiberique. 2 O De la levure de bikre se developpant g r k e a ce bios deTorula sur

milieu mineral, fabrique a son tour de la vitamine B,: c’est-a-dire que son extrai t guerit le beriberi experimental.

3 O Rappelons qu’AMAND (2) a demontre que la levure e n se developpant, epuise le bios qui l u i est offert dans le milieu de culture : on ne retrouve le bios ni dans le filtrat du bouillon de culture ni dans I’extrait B I’eau bouil- lante de la levure formee. En rPsumP : La levure a besoin d’une substance (( bios 1, qui n’est pas la

vitamine B, : elle n’a pas besoin de vitamine puisqu’elle peut la fabriquer elle-mEme. Le bios est donc le noyau le plus difficile a faire. La vitamine est produite par la levure pourvu qu’on lui livre du bios ; il est donc permis de se demander si l a levure ne fabrique pas sa vitamine B, a u x d ipens du bios qu’elle fait disparaitre.

Une filiation entre les deux est donc possible, e t cela ne diminue pas I’interEt qu’on porte au bios.

Depuis 10 ans, I’activiti des chimistes s’est acharnee sur I’isolement d u bios, on a cru parfois pouvoir proposer line formule ; mais aucun des resultats ne s’est confirme. C‘est a peine qu’on ait disigne quelques nou- velles reactions d’isolement, presque toujours negatives e n disant (( tel ou tel riactif ne precipite pas le bios ’>.

Le fait le plus t roublant es t celui que poursuivent les chercheursde Toronto e t qu’ils semblent bien etablir par leur dernier travail (3), c’est I’existence de 3 substances au lieu d’une seule dans le bios, I’inosite e t 2 inconnues qu’ils nomment bios I IA e t bios I IB (I’inosite e tan t leur bios I).

En tout cas, I’extrait aqueux de levure est u n milange trks complexe

(l) J. HOET, Arch. inf. Physiol., 1922 et 1924, X I X et X X I I I . (z) AMAND, Disparition du bios, La Cellzdle, X X I . (s) MILLER, EASTCOTT et MACONACHIE, jozdrn. of Am. Chein. Soc., 55, p. 1502,

1933.

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de bases organiques, e t la plus grande difficult6 doit venir de la. A c 6 t i de la vitamine B, on trouve des B,, B,, I’auxine e t presque toutes les bases connues.

Devant ces difficultis notre maitre, le Prof. IDE, nous a proposi il y a 2 ans de chercher u n point de d i p a r t nouveau e t , reprenant la question posie par DEVLOO, il nous engagea a exploiter les sources lipoidiques de bios.

Cette tentat ive est ligitime. S’il existe une Iicithine-biosine A c6tC de la Iicithine-choline, comme le

supposait DEVLOO, ce serait: 18 u n point de d i p a r t beaucoup rnoins complexe que I’extrait de levure. Les Iicithines a base autre que la choline ne doivent pas t t r e nombreuses, puisque THIERFELDER e t K L E N K (l) croient meme qu’il n’en existe qu’une seule : la 1Ccithine-colamine.

Mais nous ne pouvions pas suivre la tactique de DEVLOO qui saponifie d’embl6e les lipides e t reprend ensuite les bases hydrosolubles l ibir ies par la saponification : on retombe ainsi dans toutes les difficultis qu’offrent les extraits hydrosolubles.

Plan. - Notre but fut donc de sCparer les lipides divers de la lecithine a 1’Ctat lipoidique en les conservant jusqu’a la fin sous leur forme liposoluble.

Ce plan fut suivi dans une premiere periode, puis la suite des resul- ta ts nous mit devant des faits troublants, rkduisant notablement les esperances qui presiderent a l’entreprise de notre travail.

Travaillant dans le laboratoire qui abrita WILDIERS e t DEVLOO eux-mCmes, nous croyons devoir au public, cette rectification des idees emises par nos predecesseurs, quelque decevante qu’elle soit.

I1 ne faut pas qu’un autre chercheur s’engage dans la voie ten- tante que nous avons suivie nous-mCme.

Point de dkpart. - Nous sommes parti d’un residu de lecithine d’euf, libere de toute ICcithine-choline qui nous fut prepare par la firme MERCK de Darmstadt. C’Ctait a la rigueur un simple extrait alcoolique de jaune d’ceuf sec, trait6 en solution alcoolique par le chlorure de cadmium. Apres la filtration pour Ccarter la lecithine- choline, le filtrat avait CtC additionnk de carbonate ammonique pour Ccarter I’exds de cadmium sous forme de carbonate cadmique.

Telle etait la substance qui nous fut livree par MERCK : elle ne nous donna en effet aucune reaction ni de choline ni de cadmium.

(l) Die Chemie der Cerebroside u. Phosphatide. Berlin, J. Springer, 1930.

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Ecartement de chlorure ammonique. - Cette graisse fut d’abord dissoute dans I’ether sulfurique anhydre.

Nous constatons bientdt que la solution n’est pas parfaite. Laissee au repos durant 24 heures, un depdt blanc s’est forme ; il est facile de le filtrer e t de le laver a I’ether.

Cette substance blanche, soluble dans I’eau d’ou elle cristallise par evaporation, contient du NH, en abondance e t du chlore. Elle sublime e t en dernikre analyse c’est bien du NH,Cl. C’est le resultat de la dernikre reaction executke en fabrique pour ecarter le cadmium :

Avant d’avoir identifie cette impurete, nous avions dissous la mCme lecithine dans le chloroforrne et dans 1’Cther de petrole ; le mCme pricipite blanc s’en skparait toujours : cela s’explique bien rnaintenant.

Le filtrat Cthere, absolument lirnpide, ne contenait plus que des lipides, en apparence du moins. Un test sur culture de levure en milieu sucre mineral demontrait que le bios s’y trouvait comme dans les preparations de DEVLOO.

Culture no 17. - 2 gr. de ICcithine (sans choline) : p x t e e n 4 jours 1.8gr.’ active (cela correspond a environ une unit6 de Wildiers, la pzrtedes 2 premiers jours i t a n t minime, les 1.8 gr. constituent la pzrte d u 3e e t 4e jour).

Culture n o 81. - Lki th ine purifiie a I’ither anhydre, perte en 5 jours 2 gr., donc active.

Test employks. - La substance de depart parfaiternent soluble dans I’kther anhydre, dans le chloroforme, dans I’alcool ethylique ou rnethylique contenait du N sous diverses formes, beaucoup de phosphore lie aux acides gras et du bios, ce qui justifiait le but du travail.

A chaque pas e t dans chaque substance skparee, nous verifions la presence de ces elements par les tests suivants :

l o Le bios, test par culture cornme WILDIERS. Dans un ballon conique, nous rnettons :

C1,Cd + (NH,),CO, = 2 NH,CI + CdCO,.

a) la substance a I’Ctude ; b) 100 cc. d’eau ; c) 10 gr. de saccharose de betterave (plus pur que le sucre de canne) ; d ) 25 cc. d’une solution minerale contenant par litre, 5 gr. de phos-

phate bipotassique, 5 gr. de phosphate bisodique, 5 gr. de sulfate rnagnesique, 5 gr. de chlorure arnmonique et 1 gr. de carbonate calcique.

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Le ballon est ferme par un bouchon en caoutchouc verifie (ne pouvant livrer aucune substance nuisible a la culture) e t portant un barboteur Crispo.

Sterilisation a I’autoclave a 1 atmosphere. Apres refoidissement, ensemencement avec au maximum, 10 gouttes

d’une emulsion de culture de levure. La souche de levure etait celle que WILDIERS avait utilisee.

Apres avoir charge de H,SO, concentre le barboteur Crispo, le ballon entier est pese et place a la couveuse maintenue a 300environ.

La perte en CO, est verifiee par pesee quotidienne.

Sans &ios, ces ballons de culture peuvent perdre apres quelques jours 0.1 gr. par jour, effet des gouttes de semence e t de la minime quantitC de bios qui l’accompagne. C’est un grand maximum.

Un ballon charge d’une unit& de bios perd plus d’un gramme par jour apres le 2 e j our.

Quand une culture perd 0.3 a 0.5 gr. par jour, avant de la declarer active, nous verifions au microscope l’absence de microbes, verifi- cation indispensable. I1 arrive qu’une semence est infectee ; alors toutes les cultures offrent la mtme allure de faqon surprenante, et au microscope on constate aussi partout le m$me parasite. N : Nous vkrifions la presence de N en mettant au bain-marie un

Cchantillon un peu concentre de la substance (environ 1 cc.) dans un tube a essai, en presence d’un granule de soude caustique 0.25 a 0.50 gr. Aprks 1 minute environ, un tube en verre portant un papier tournesol rouge, humecte d’eau distillee est porte dans le tube a essai jusqu’a proximite de la substance sans toucher aucune paroi. Des vapeurs de NH, se revelent immkdiatement e t avec grande nettete.

Comme le bios se precipite par I’acide phosphotungstique e t non par l’acide phosphomolybdique, il ne saurait t t re question pour lui que d’une base primaire ou secondaire NH ou NH, : e t cette reaction est suffisante .

P : Nous faisons la reaction qualitative du phosphate en alcalini- sant d’abord 1’Cchantillon qui a servi pour le N, s’il est trouble on fait un double Cchantillon et a l’un on additionne la solution ammo- niacale magnesienne ; I’apparition d ’un precipite net qui ne disparatt pas par l’addition d’une pincke de AmCl en poudre est considere comme attestant la presence de phosphates.

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Acides grus. - Un Cchantillon aqueux est additionnk d’une goutte de HCI concentre : I’emulsion formee doit s’eclaircir quand on la secoue avec la moitie de son volume d’ether. Les acides gras dissous dans l’ether furent repris au debut pour en faire les savons de Ca, Zn et Mg : la solubilite de ces savons dans I’alcool etait verifiee.

Buses tertiuires et quuternaires. - La presence de N etant constatee, on traitait un autre echantillon par HC1, au bain-marie. L’emulsion Cventuelle etait Cclaircie a l’ether, puis la partie aqueuse sous-jacente est additionnee de son volume de H,SO, a lo1 (, e t ensuite d’une solution d’acide phosphomolybdique. Un precipite jaune prouve la presence debases tertiaires ou quaternaires, ce qui constitue une impuretk pour nous.

Un Cchantillon chlorhydrique ne nous a jamais donne les reactions de la choline au CdCI,.

Remarque. - Nous apprimes bient6t que la reaction a I’acide phosphomolybdique ne peut pas Ctre faite en presence d’kther. L’eau distillee saturee d’ether, precipite admirablement I’acide phos- phornolybdique, comme s’il y avait une base tertiaire en presence. Seulement, si le tube contenant un pareil precipite est abandonne a I’air jusqu’au lendemain, tout le precipite aura disparu gr2ce au depart spontane de l’ether.

Averti de ce fait, il suffit de laisser un echantillon charge d’ether durant une minute au bain-marie ; des traces d’ether ne gCnent plus la reaction.

Bases seconduires ( N H ) et primaires (NH,). - D’apres DEVLOO la reaction au sublime (HgCI,) + Ba(OH), est tres fidele pour ces bases, y compris le bios. Si a la solution on ajoute du sublime d’abord, puis goutte a goutte une solution de baryte caustique, e t qu’il n’y a pas de bases en presence, la baryte precipite immediatement le HgO, en rouge ; en presence de bases, le precipite est blanc ; eventuellement un precipite un peu rouge a la premiere goutte, redevient blanc en peu de temps.

Cette reaction est tres sensible et tres fidele. Beaucoup d’auteurs font la mCme reaction par le sublime + bicarbonate sodique : sans bases il ne se forme pas de precipite, tout prCcipit6 revele donc les bases en question. Le sublime a lui seul, ni le bicarbonate seul ne peuvent donner de precipite.

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Ainsi, nous etions renseignis assez fidelement sur la presence d’impuretes, le test biologique servant toujours de preuve finale pour la presence de bios.

1 ’ ~ PARTIE

Poursuite de la partie lipoi’dique active

Le residu de la lecithine de jaune d’ceuf, libere de toute lecithine- choline, est encore un magma de substances extrtmement complexes.

Les chimistes specialises dans 1’Ctude des lipides voudraient bien imposer une methode stereotypee pour I’isolement des divers eIe- ments lipoi‘diques, methode basee sur les solubilites dans les dissolvants usuels des lipides : ether, acetone, chloroforme, ether de petrole, alcools divers.

Nous pourrions pourtant leur rappeler que ce n’est pas cette methode qui a livre la lecithine-choline pure, malgre tous les efforts d’HOFMEISTER ; c’est sa precipitation par le CdCI, en solution alcoolique qui l’a livree.

Nous aurions prefere courir la chance de decouvrir un precipitant analogue pour la lecithine-biosine. Mais pareille chance ne semble pas devoir reussir souvent. Les sels mercuriques qui semblaient s’indiquer ici, precipitaient d’emblee tant de choses dans le melange Iipoidique, qu’il ne fallait pas y songer.

C’est fortuitement que nous arrivhmes a une tout autre methode, qui d’ailleurs commence a se pratiquer avec diverses variantes. C’est fortuiternent, disons nous, que nous Mmes amenes a cet artifice.

Croyant devoir ecarter beaucoup d’acides gras libres ou d’acides phosphoriques-gras, nous avions secoue la solution CthCrCe de nos lipides avec de l’eau bicarbonatee dans un entonnoir a decantation.

Enormement de substances passerent dans la partie aqueuse : e t ce n’etaient pas seulement des savons. En effet en remplaGant l’eau bicarbonatee par de l’acide acetique ‘dilue nous obtenons la mtme separation massive de substances entrant dans la partie aqueuse. Alors finalement nous nous contentons d’eau distillee d’une part et d’ether sulfurique d’autre part, et encore une fois beaucoup de substances passent dans l’eau. A partir de ce moment, nous mainte- nons cette premiere manceuvre.

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1” DECANTATION EAU-ETHER

La solution de lipides dans l’kther, filtree pour ecarter le NH,Cl, est mise dans un grand entonnoir a decantation, additionnee de son volume d’eau distillee secouee quelques fois et abandonnee 24 heures.

Generalement il y avait le lendernain seulement deux couches, l’aqueuse inferieure bien teintee de jaune brun, et la superieure etheree plus colorke encore.

La separation en 2 couches n’etait pas toujours nette, parfois la partie aqueuse conservait des substances en emulsion. Quand cette emulsion gCnait la decantation, il etait facile de la faire disparaitre en additionnant quelques centimetres cubes d’alcool qu’on laissait descendre directement dans la partie aqueuse. L’alcool en se repar- tissant dans l’eau clarifiait la zone emulsionnee.

L’addition de NaCl clarifiait aussi tres bien, mais nous apprimes bient6t que ce sel, en apparence si indifferent, modifiait complete- rnent notre milieu.

La partie aqueuse soutiree a peu pres integralement, nous repetons I’addition d’eau distillee a la partie etheree restee dans l’entonnoir : la partie aqueuse devient de rnoins en rnoins co!oree. Quand nous repetons quotidiennement cette manceuvre, apres la 3 e ou 4e fois I’eau n’est presque plus teintee et la z m e emulsionnee exige de l’alcool pour se clarifier. L’evaporation des portions aqueuses prouve aussi que l’eau entraine de rnoins en moins de substance.

Aussi nous n’utilisons que la premiere decantation sans addition d’alcool, les decantations ulterieures ne servent qu’a libkrer la portion etheree de tout ce qui est susceptible d’entrer dans l’eau.

Ainsi nous avons une portion A d’eau (saturee d’ether) et contenant beaucoup de substances e t une portion B etheree n’ayant plus guere de substances susceptibles d’entrer dans l’eau.

A contient en abondance du N, du P, des acides gras combines au phosphate et la substance active (( bios 1).

B ne donne plus que des traces de N et P et ne contient guere de bios : il se laisse saponifier integralement (au point que l’existence d’insaponifiable est douteuse), ce sont donc de simples graisses.

La quantite de simples graisses ecartees de cette faqon equivaut approxirnativement a la moitik de la masse primitive. Elle est donc sans inter& pour nous.

Nous avons donc a suivre la portion A hydro-liposoluble.

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20 PORTION HYDRO-LIPOSOLUBLE A

On pouvait suivre deux voies : traiter la solution aqueuse telle qu’on la retire du dicanteur ou l’evaporer au bain-marie pour ecarter I’eau, et traiter cet extrait qui redevient liposoluble.

La premiere voie nous servira dans la deuxieme partie de ces recherches.

Ici nous chercherons a skparer les composants en revenant a I’Ctat liposoluble.

En effet cette solution aqueuse, souvent legerement trouble, se comporte d’une faqon etrange. Mise au bain-marie a l’air, elle perd d’abord son ether dissous dans l’eau : et la solution souvent trouble se clarifie Cvidemment lors du depart de l’ether. Durant l’kvaporation de I’eau, il se produit bientbt un depbt brun-fond, presque noir qui adhere aux parois de la capsule. L’evaporation poussCe a fond laisse une matikre poisseuse de mCme teinte.

Si le sujet en avait valu la peine, nous aurions evapore soit dans le vide, soit a froid dans le vide.

Or la matikre residuelle obtenue ainsi n’est plus gukre soluble dans I’eau.

Elle est parfaitement soluble dans I’alcool methylique ou dans le chloroforme.

Reprise par I’Cther, elle laisse un residu leger qui exige beaucoup d’ether pour parfaire la solution.

Reprise par I’acetone, il reste un rCsidu non dissous notable, mais l’action de l’acetone est fort critiquee et d’autre part nos essais prou- verent aussitbt, que I’acetone laissait du bios des deux cbtes, dans le filtrat et dans le precipite.

Sous quelle forme se trouve le N de cette portion A. On peut a tout moment liberer les bases azotees par HCI concen-

trC ; or en agissant ainsi nous voyons tout de suite que les bases de ce milieu etaient au moins de deux categories : une base tertiaire ou quaternaire precipitable par l’acide phosphomolybdique, et une base precipitable par HgCf, + NaHCO,.

I1 fallait donc subdiviser ces lipides de fa$on a ecarter celui qui contient la ou les bases tertiaires.

30 SEPARATION PROVISOIRE DE DEUX LIPIDES

Le chloroforme se montra Ie meilleur dissolvant de toute la masse :

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c’est d’ailleurs aussi le meilleur dissolvant de tous ces lipides, et il est etonnant qu’on n’y ait pas plus souvent recours.

Nous dissolvons donc la masse dans un minimum de chloroforme. Cette solution chloroformique est versee goutte a goutte dans une

I1 se forme immediatement un precipite parfaitement filtrable. Or ce precipiti dans 1’Cther se montre ultirieurement parfaite-

ment soluble dans le chloroforme (naturellement) mais aussi tres soluble dans I’eau distillee : nommons le C.

Voila donc un corps insoluble dans I’ether e t parfaitement soluble dans l’eau qui s’est trouvk pourtant dans le melange primitivement soluble dans l’ether.

Les masses des deux substances, I’hydrosoluble C e t I’ethCrosoluble E sont a peu pris equivalentes.

Dksormais si on reprend chacune de ces substances pour les soumettre au melange d’kther et d’eau dans le decanteur comme on l’a fait d’abord pour la Iecithine, elles se comportent tres differem- ment : la C soluble dans le chloroforme e t I’eau, reste intkgralement dans I’eau du melange eau-ether ; la Esoluble dans I’ether reste intkgralement dans I’ether du mClange eau-ether.

C’est bien la un des cas les plus frappants de I’influence reciproque des composants d’un melange sur la solubilite apparente du tout.

Reunis, C entraine E vers l’eau dans le melange eau et ether, et rkunis encore apres evaporation, E enrraine C dans I’ether.

quantite au moins 5 fois plus grande d’ether.

40 ANALYSE PROVISOIRE DES DEUX LIPIDES : C ET E

Chacun des deux mis en presence de HCI et d’eau d a m un decanteur livre des bases N , du P e t des acides gras.

Les deux sont plus ou moins actifs sur la levure, les deux livrent des bases precipitables par I’acide phosphomolybdique et par HgCi, + Na,CO,.

I1 etait evident que la separation etait imparfaite : I’une entrainait encore 1 ’autre.

En effet la precipitation de la solution chloroformique par I’ether Ctait capricieuse. I1 n’etait pas rare qu’une solution chloroformique tombant dans I’ether ne form5t guere de trouble, e t inversement, si on verse de I’ether sur la solution chloroformique on n’obtient jamais de prkcipite. Le chloroforme, dissolvant commun de C e t E, finit par faire jouer leur influence reciproque.

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C avait un autre caractere qui frappa d’emblee quand nous I’attaquions p a r HC1 pour le mettre ensuite dans le melange d’eau e t d’ether. Les acides gras vont dans I’ether avec le P, I’azote reste dans I’eau, mais il se forme toujours une fine couche de matidre noire qui n’est soluble ni dans I’eau ni dans I’ether et qui reste entre les deux solvants. Cette matiere noire est caracteristique de la matiere hydro-chloroformosoluble. Son insolubilite d a m I’eau e t I’ether permet de la laver e t de la recueillir a part ; elle ne contient ni N, ni P, ni bios. Elle est tres soluble dans I’alcool.

Remarquez qu’elle ne preexiste pas a I’etat libre avant I’addition de HCI a la solution aqueuse de C ; c’est donc un noyau de sa consti- tution.

La curiosite d’un chimiste-expert sera peutZtre captee par cette substance noire facile a purifier, e t encore par le lipide phosphore etrange (soluble dans I’eau e t dans le chloroforme) qui la contient.

Pour nous cette substance n’a qu’un inter& secondaire, ce n’est pas elle qui porte le bios. Tous nos efforts tendront donc a I’kcarter completement du lipide etherosoluble E.

50 PURIFICATION COMPLEMENTAIRE DE L’ETHEROSOLUBLE E

Nous ne pouvions nous declarer satisfait, tant que la precipitation phosphomolybdique n’efit disparu des bases de I’etherosoluble.

Nous cherchimes a precipiter tout le C (chloroformo-hydrosoluble) dans le melange de C et E dissous dans I’ether. Nous y sommes par- venu, au moins suffisamment pour supprimer la reaction au phosphomolybdique dans le residu, e t cela de la faqon suivante. Le tannin est Iegerement soluble dans 1’Cther ; dans une grande quantite d’ether sature de tannin, nous versimes la solution etheree du melange. Un prkcipite volumineux se produisit : ce precipitk lave a I’ether se redis- solvait dans I’eau ; attaque par HCI e t remis dans Ie decanteur charge d’eau et d’ether i l laissait apparaitre la matiere noire a la zone limite entre I’eau e t I’ether. Le tannin avait donc bien prkcipite la substance C .

Helas, nous ne pouvions plus nous liberer du tannin ni duns le prkcipitk ni duns le f i l trut kthkrk. Le tannin revele par le Fe,CI, y restait attache aux substances grasses quand nous faisions la scission par , HCI.

E t il restait assez de tannin a cGtC des bases pour g h e r le test biologique.

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60 SUBSTANCE RESINEUSE E T R A N G ~ R E DANS E

Ce n’etait pas assez de difficultes. L’CthCrosoluble E, tel que nous l’avions obtenu par la solution

chloroformique versCe dans I’Cther, contenait encore une autre impurete. La solution CthCree, Cvaporee et reprise par l’alcool, laissait un risidu insoluble, presque incolore, qui ne se dissolvait plus dans aucun dissolvant (eau, alcool, Cther, chloroforme), elle se dissolvait seulement dans une solution alcaline de soude caustique. Elle ne contenait ni N, ni P, ni acide gras, ni bios. Elle formait des paillettes dans le vase d’evaporation comme une rhine durcie.

Nouvel exemple de l’entrainement des substances, l’une par l’autre : cette insoluble avait accompagnk dans ses dissolvants aqueux, chloro-

’ formique, alcoolique et CthCrC Ies autres substances principales. Elle ne formait il est vrai qu’une portion riduite de la masse, moins d’un dixieme certainement .

70 CARACT~RES DE L’EXTRAIT ETHERE E

Tout notre inter& et notre espoir se portaient donc sur la portion Ctherosoluble libCree de la resine et de la portion hydro-chloroformosoluble .

Hejas, les tests biologiques de cette masse lipoidique restaient faibles, pas plus intenses que pour la (( lkcithine )) primitive. Nous avions donc perdu beaucoup de principe actif en route, a moins que n’intervienne pour le bios, un complexe, comme le pretend M. EASTCOTT.

Ce qui est plus grave pour l’hypothbe d’une lecithine-biosine, la reaction du phosphore comme phosphate, avait quasi disparu.

Et enfin, si le filtrat ethere au tannin ne livrait gukre de bases ternaires (ce filtrat dont nous ne pouvions arracher le tannin, et qui restait toxique pour les cultures) la substance E isolke par l’autre methode continuait de livrer un precipitk phosphomolybdique.

Absence de P, faiblesse du test biologique, impurete encore a Ccarter par une-methode a trouver, tout nous forGa de douter de l’existence d’un lipide phosphate uni au bios.

Nous aurions pu nous acharner sur ce lipide malgre cela, si entretemps les resultats de la partie suivante n’avaient ete suffisamment clairs pour nous dispenser de nouveaux efforts dans cette direction.

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82 EM. JANSSENS

I Ime PARTIE

Soudure insuffisante entre le bios et les lipides

Dans la premiere partie nous avons exploit6 la portion aqueuse du decantage de la (( lecithine n, apris l’avoir &aport% ; aprks Cvapo- ration le risidu avait perdu sa solubilitk dans l’eau.

Nous n’avions jamais renonce a traiter cette partie aqueuse telle qu’on la retirait du decanteur et qui avait I’immense avantage de s’offrir sous une forme hydrosoluble.

D’emblCe sous cette forme hydrosoluble, les substances entrainees par l’eau se montrkrent trbs sensibles aux agents chimiques.

l o Le CaCl, en solution, ajoute a cette partie aqueuse du decantage, y provoquait immkdiatement et a froid une separation en masse de savons insolubles dans I’eau. La masse savonneuse surnageait et emportait tous les acides gras et tout le phosphore. L’eau sous- jacente ne donnait plus aucune reaction d’acide gras, ni de phosphate, mais elle contenait tout l’azote et tout le bios.

La partie savonneuse ne donnait plus aucune manifestation de bios. Le CaCl? avait donc separe toutes les bases aussi bien que le ferait l’acide chlorhydrique.

20 Le NaCl agissait aussi radicalement que le CaCl, ; le sel sodique ne prkcipitait pas les lipides mais le melange sale Ctant secoue avec de l’ether, celui-ci entrainait tous les lipides et tout le P et ne laissait dam l’eau que des substances facilement solubles. Le bios etait encore une fois exclusivement dans l’eau, les lipides n’en contenait pas traces.

Ces faciles dissociations par les chlorures ne nous impressionnerent pas trop, d’abord : les chlorures trks ionises sont capables de realiser a peu pres ce que ferait le HCI.

Mais ulterieurement devant les resultats de la premiere partie, nous reprimes ces experiences.

30 L’acide acetique, si peu ionisk, faisait instantanement, mCme en solution diluee et a froid, ce que realisait HCl, CaCl, et NaCl ; tout le bios passait dans I’eau acidulee, et tous les lipides se laissaient enlever par 1’Cther. 40 Alors nous eiimes recours a des agents moins actifs encore. Nous fimes de l’ace‘tate de Calcium absolument neutre. Or la solution

de cet acetate separait les elements comme le chlorure calcique.

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Puis nous employimes le gluconate calcique SANDOZ tel qu’il se livre en capsules c’est-a-dire avec une surcharge de CO, pour le tenir en solution. Le resultat fut le mCme : separation instantanie et totale du bios e t de toutes les bases.

50 Enfin nous appliquiimes I’acitate de plomb en solution : lipides plombiques insolubles d’une part et phosphates combines, et d’autre part une solution aqueuse de bases.

Apres la liberation du Pb des deux parties la partie lipique etait sans bios, fa partie aqueuse contenait tout 1’N e t tout le bios.

CONTROLE SUR LA LECITHINE-CHOLINE

I1 est bien reconnu que de longues hydrolyses dans l’eau chaude, dans les acides dilues ou les bases dilukes detachent facilement la choline. Mais il nous importait de savoir si les reactifs neutres,que nous avions employes sur nos lipides, detacheraient aussi la choline de la lecithine vraie.

Or la lecithine-choline(iso1ee par le CdCl ) traitee par la decantation eau et ether se comporte autrement que notre melange de lipides.

La majeure partie reste dans I’ether et une partie seulement forme emulsion dans I’eau ; celle-ci s’accentue a mesure qu’on secoue I’ether et l’eau.

Y avait-il la deux substances differentes ? Non. Nous avons repris la partie qui s’etait mise en emulsion d’une

part, et la partie qui Ctait restee dans I’ether d’autre part, en eva- porant le dissolvant de part e t d’autre. Les deux parties CvaporCes a sec se comportaient de la mCme faGon en face des dissolvants connus, alcool, ether, chloroforme e t acetone. Nous remettons aussi chacune des deux parties dans le decanteur avec de I’eau et de 1’Cther ; or la lecithine-choline qui sortait de I’ether de la premiere decantation donnait autant d’emulsion que celle qui sortait de la premiere emulsion.

Mais puisqu’il y avait de la lecithine en emulsion, nous ajoutimes dans un dkcanteur du NaCl, puis dans un autre du CaCl., ou de I’acC- ta te de plomb. La presence de traces de choline devait nous Ctre revklee par I’acide phosphomolybdique.

C’est ici que nous apprimes a connaitre la cause d’erreur due a I’Cther. La partie aqueuse sortant du decanteur etait saturee d’ether ; quand on y ajoutait de suite de I’acide phosphomolybdique, comme

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84 EM. JANSSENS

on pouvait le faire aprks l’action du NaCl, 1’Cther contenu dans l’eau prkcipitait l’acide phosphomolybdique e t nous laissa croire durant quelques jours que la 1Ccithine-choline Ctait aussi dissocike.

Mais la disparition des prCcipitCs molybdiques apres quelques heures dans les tubes d’essai abandonnis a l’air nous firent verifier les operations a blanc et nous rkvelerent l’action fallacieuse de 1’Cther.

Des lors la prkcaution de chasser I’Cther par une minute de bain- marie nous mit a l’abri d’erreur et nous dCmontra a I’evidence que pas trace de choline n’ktait Zibkrke ni par NaCl, ni par CaCl,, ni par 1’acCtate de plomb.

CONCLUSION

11 faut des lors admettre que la soudure qui unit le bios aux lipides n’est pas comparable a la soudure qui unit la choline a son lipide.

La separation immediate en presence d’un acide comme l’acide acitique et en presence de tous les sels metalliques ne tolere qu’une interprktation : la base biosique s’y trouve combinee a un acide gras- phosphor6 sous forme de sel ou de savon. L’acide faible libere l’acide gras et forme un acetate de biosine soluble, les chlorures ou glyconate calciques forment le savon calcique des acides gras et laissent en solutioq un chlorure ou glyconate de biosine : reactions immkdiates et completes.

Ce ne serait pas encore un ma1 redhibitoire si la biosine etait seule a faire ces savons ; mais nous avons vu qu’une base prgcipitable a l’acide phosphomolybdique y voisine constamment.

Donc le rCsidu gras de l’extrait alcoolique de l’ceuf contient un melange de bases combinies aux acides gras. Ces bases partiellement ternaires et secondaires constitueraient des lors un melange aussi difficile a traiter que le melange de bases qu’on extrait par l’eau chaude de la levure elle-mCme.

Du moment oit nous ne trouvons pas une lkcithine-biosine comme source du bios, il n’y a plus aucune raison de travailler le complexe lipo’idique de l’ceuf plutbt que les autres sources de bios.

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LE BIOS DE LA L ~ C I T H I N E 85

RCsu mC

Les tableaux suivants rksumeront I’ensemble de nos rkactions avec leurs rksultats.

Licithine risiduelle, sans licithine-choline, avec bios

soluble dam I’ither, I’alcool, le chloroforme I

decantke dans ether + eau dist.

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I I

A. Partie entratnt; dans l’eau N , P, acides gras, bios

B. Partie restie dans l’ither ni P, ni N, ni bios

I graisses entikrement saponifiables ivaporie, dissoute dans un minzmum de chloroforme

I versie dans I’ether

I Solution ithirie E.

I C. Prtcipitd (certainement incomplet)

trks soluble dans chloroforme Acide gras, N, bios, pas de P. trks soluble dans l’eau combinaison au tannin soluble

dans I’Cther, non dissociable, insoluble dans I’ether P, N , Acides gras ( N ternaire et secondaire)

Com binaison au tannin. insoluble dans 1’Cther

n’a plus de bases ternaires substance noire (par dissociation)

I I

non dissociable ivaporie + alcool mith.

i i insoluble, resineux soluble

sans N, ni P, ni bios bios faible soluble seulement dans NaOH

A. Partie entrainee dans I’eau, bios, non evaporCe

f solution de NaCl ou Ca gluconate ou P b acitate ou aride ardtique I I

I Partie insoluble surnaqeante

I Partte aqueuse : bios, N (ternaire

pas d’acides qras, pas de phosphates. e t secondaire) Ac. gras, P, ni N, ni bios

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86 EM. J A NSSENS

Conclusions gknkrales

La (( lecithine )) de jaune d’ceuf libCree de toute lecithine-choline, garfaitement soluble dans l’kther, le chloroforme, etc. contient du bios. Ce residu lipidique est riche en N. P. et acides gras.

Mais le bios, se separe des noyaux gras et phosphores imrnkdiate- m n t au contact de sels neutres NaCl, CaCI,, acetate calcique, gluconate calcique, acetate plombique ou tique.

I1 se comporte donc comme un sel lkcithine-choline n’abandonne guere influences neutres.

d’acides dilues HCl, ac. ace-

d’un acide gras alors que la de choline sous les mCmes

Pour faire agir ces agents, les lipides charges de bios sont obtenus sous une forme dissoute dans l’eau, griice a la mkthode de decantation du melange eau + ether.

Les efforts pour separer sous forme lipidique le compose charge de bios n’a pas donne de rksultats satisfaisants : le bios (non precipitable par I’acide phosphomolybdique) est presque toujours accompagnk de bases ternaires (precipitables par l’acide phosphomolybdique). Toutes ces bases semblent donc s’y trouver sous forme de savons (voir resume p. precedente).

Le bios contenu dans les graisses du jaune d’ceuf ne s’y trouve donc pas sous la forme d’une lecithine vraie ; il s’y trouve sous la forme de sel ou de savon et il y a d’autres bases sous la mCme forme.

Des lors, l’espoir de trouver dans le jaune d’ceuf une lkcithine- biosine comme source de bios moins complexe, ne peut plus Ctre conserve.

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le bios de la lécithine

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