inserm – université pierre et marie curie pitié-salpêtrière « génétique et mécanismes des...

INSERM – Université Pierre et Marie CuriePitié-Salpêtrière

« Génétique et mécanismes des maladies de l’excitabilité musculaire et de la sclérose en plaques»

Dr Sophie NICOLE

GENETIQUE ET

HEMIPLEGIE ALTERNANTE

Génétique et hémiplégie alternante?Génétique et hémiplégie alternante?

• Très probablement car :

signes cliniques stéréotypés

pas de lien avec un facteur particulier (grossesse,

environnement,…) cas familiaux (jumeaux monozygotes)

hémiplégie alternante liée à une mutation ATP1A2, SLC1A3

et CACNA1A

• Un corps humain est composé d’organes

Corps, organes, cellules et chromosomes

Corps, organes, cellules et chromosomes

23 paires de chromosome

• Une cellule contient 23 paires de

chromosomes

• Chaque organe est composé de cellules (1 péta (1015 ) cellules dans le corps

humain)

Chromosomes, gènes et bases : ADN Chromosomes, gènes et bases : ADN

• L’ensemble des chromosomes est composé de 3,2 milliards de paires de

bases

• Les chromosomes contiennent des gènes

• L’ensemble des chromosomes humains contiendrait 30.000 gènes

• Les chromosomes sont composés de paires de bases ou ADN (Acide

DéoxyriboNucléique)

Chromosomes, gènes et bases : ADN Chromosomes, gènes et bases : ADN

• L’ensemble des chromosomes est composé de 3,2 milliards de paires de

bases

• Les chromosomes contiennent des gènes

• L’ensemble des chromosomes humains contiendrait 30.000 gènes

• Les chromosomes sont composés de paires de bases ou ADN (Acide

DéoxyriboNucléique)

BASE GENE CHROMOSOME

lettre phrase livre

Gènes et protéines Gènes et protéines

Lamaazertyuioqsdfghjklmaitresswxcvbnenousdonnebeauaqwzsxedccouptropdemlkjhgdevoirschromosome

Lamaazertyuioqsdfghjklmaitresswxcvbnenousdonnebeauaqwzsxedccouptropdemlkjhgdevoirsgène

la maitresse nous donne beaucoup trop de devoirsexons

LA MAITRESSE NOUS DONNE BEAUCOUP TROP DE DEVOIRSprotéine

Fonction cellulaire

• La protéine exerce une fonction cellulaire

• Un gène code pour une protéine

Gènes, protéines et cellulesGènes, protéines et cellules

Protéines et maladiesProtéines et maladies

• Une protéine anormale (mutée) ou absente peut être à l’origine d’une

maladie

LA MAITRESSE NOUS DONNE BEAU DE DEVOIRSprotéine

Lamaazertyuioqsdfghjklmaitresswxcvbnenousdonnebeauaqwzsxedcdemlkjhgdevoirschromosome muté

Lamaazertyuioqsdfghjklmaitresswxcvbnenousdonnebeauaqwzsxedcdemlkjhgdevoirsgène

la maitresse nous donne beau de devoirsexons

• L’anomalie dans la protéine résulte d’une mutation

dans le gèneLamaazertyuioqsdfghjklmaitresswxcvbnenousdonnebeauaqwzsxedccouptropdemlkjhgdevoirschromosome

Protéines et maladiesProtéines et maladies

• Une protéine anormale (mutée) ou absente peut être à l’origine d’une

maladie • L’anomalie dans la protéine résulte d’une mutation

dans le gène

trouver l’anomalie parmi 3,2 milliards de lettres

Comment identifier l’anomalie génétique?


• Banque d’ADN pérenne des patients et famille proche financement (envoi sang, préparation ADN et cellules, stockage)

- l’association française contre les myopathies : 20.000 euros

- l’AFHA : 30.000 euros

débutée en juin 2008. Au 30 octobre :

- 22 familles

- 72 personnes

données cliniques essentielles

- médecin suivant le patient : FICHE FAMILIALE



• Banque d’ADN pérenne des patients et famille proche financement (envoi sang, préparation ADN et cellules, stockage)

- l’association française contre les myopathies : 20.000 euros

- l’AFHA : 30.000 euros

débutée en juin 2008. Au 30 octobre :

- 22 familles

- 72 personnes

conseil scientifique en cours d’établissement

- banque (1)

- AFHA (1)

- neuropédiatre et chercheur (2-3)

Ouverte à tout projet de génétique sur l’HA

données cliniques essentielles

- médecin suivant le patient : FICHE FAMILIALE

- base de données européenne ENRAH



• Mode de transmission : dominant de novo possible

• Banque d’ADN pérenne des patients et famille proche

dominant de novo

dominant

• Etudes moléculaires de l’ADN des patients comparés à des individus

« témoins »

Etudes moléculaires de l’ADNEtudes moléculaires de l’ADN

I. Approche gènes candidats: Idée sur la fonction cellulaire altérée

Migraine hémiplégique familiale

- gènes ATP1A2, CACNA1A

- faite par les équipes américaines, hollandaises et italiennes

Pas de mutation dans les cas d’ hémiplégie alternante

« typique »

Nombre gènes candidats trop important pour poursuivre

cette approche


II. Approche génomique : rechercher l’anomalie dans la totalité du

génome- anomalies microscopiques sur les chromosomes (« caryotype »)

- 1 patient aux USA: rien de trouvé

- 1 patient allemand, qui devrait être étudié (Pays-Bas)

- oriente les recherches sur une région chromosomique et les gènes présents dans cette région


II. Approche génomique : rechercher l’anomalie dans le génome

entier

- recherche d’anomalies submicroscopiques sur les chromosomes (CGH ou SNP arrays)

Plateforme Illumina « P3S »

- anomalies microscopiques sur les chromosomes (« caryotype »)




entier

sonde

ADN à tester






entier

ADN contrôle (parents)

ADN enfant





entier

avantages :

- manipulation rapide

- pas d’a priori biologique

désavantages :

- chère car nouvelle technologie

-support informatique

faites aux Etats-Unis (K. Svoboda)?


Projet de rechercheProjet de recherche

Recherche d’anomalies submicroscopiques par SNP-CGH

arrays (Illumina)- Janvier - septembre 2009 Analyse de 100 patients européens (idéal)

- 400 euros par patient : 40.000 euros

- analyses informatiques

- réalisée par Chirine El Baba (étudiante M2 : BAC + 5 ans)

- Septembre 2009 - juin 2010 Validation des remaniements candidats

- SNP-CGH arrays chez les parents si plus de 20

remaniements / patient

16.000 euros

(estimation 20 patients)

- quantitative real-time PCR 20.000

euros (estimation 50 remaniements)

- rémunération d’un doctorant (3 ans)

coût patronale de 2.400 euros/mois

soit 28.000 euros /

an

- Total coût 20.000 à

64.000 euros

Futur…Futur…

- Remaniements pathologiques candidats :

- études des gènes de la région

- recherche de mutation chez les patients sans remaniements

- Pas de remaniements pathologiques candidats :

- recherche de modifications épigénétiques

envisagée en Belgique?

- séquençage génome complet de plus en plus envisageable…

Prof Bertrand Fontaine

Chirine El Baba

Immunomarquage PLN sur fibroblastes humains Culture de fibroblastes- ensemencement 1.5.104 à 2.104 cellules par puit (100 µl maximum/puit)2 boites et 2 puits/boite par individu (3 puits pour le témoin)- après ½ journée, rajouter 1 ml de milieu/boite (milieu + 10% SVF)- laisser pousser de 4 (2.104 ) à 6 (1.5.104) jours (jusqu’à ce que cellules soient confluentes) Immunomarquage- rinçage PBS 1X- fixation PFA4% froid, 10 min à 4°C- rinçage 3X PBS1X- rapide rinçage PBS-tween 0.1%- incubation anticorps primaire. 1H00, T° ambiante

1 série avec triton : PBS-BSA3% + triton-X100 0.1%1 série sans triton : PBS-BSA3% - anti-DIII (1/50 ; clone 7B5, Zymed lab.) + anti-fibronectine (1/500 ; F3648, Sigma-Aldrich)- anti-DIII (1/50 ; clone 7B5, Zymed lab) + anti-DV (1/100; R. Timpl, lapin).

- 3 X 5min rinçages PBS-tween 0.1%, T° ambiante- incubation anticorps secondaire. 1H00, T° ambiante (PBS-BSA3%)

- anti-souris FITC (1/100 ; whole IgG, Jackson immunoresearch) + anti-lapin-TR (1/100, Jackson Lab)- 3 X 5min rinçages PBS-tween 0.1%, T° ambiante- 5 min Hoechst 1/100 dans PBS1X- rinçage 1X PBS1X- rapide rinçage H2O et montage fluoromount-G (Southern Biotechnology).

! pas de montage en vectashield car cellules se décollent.

Coût estiméCoût estimé

Euros HT Echantillon 20 familles (60 ech.)

Illumina (P3S) 304 20.000

lames CNV610-Quad 300

échantillon 2

run 1,5

Affymetrix (Strasbourg) 595 35.700

sonde 345

lames SNP 6.0 250

Agilent (Strasbourg) 823 49.380

sonde 345

lames 1 X 244K 478 (X 2?)

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