illustrations chez la levure candida albicans
TRANSCRIPT
Facteurs de virulence chez les champignonsd’incidence médicale
Illustrations chez la levure Candida albicans
Th. Noël
Fiche d’identité (1)
➣ Levure commensale de l’homme
➣ Cavité orale, tractus digestif, muqueuse vaginale
➣ Pathogène opportuniste
. Mycoses superficielles (cutanéo-muqueuse, OPC, vaginites, …)
. Mycoses profondes (organes vitaux), disséminées (candidémies)
➣ 4ème agent nosocomial
➣ 40 % de mortalité associés aux candidémies
Fiche d’identité (3)
➣ Levure diploïde
➣ Pas de reproduction sexuée connue (multiplication mitose et bourgeonnement)
➣ 8 chromosomes, 16 MB / génome haploïde
➣ Génome complètement séquencé et annoté
(Candida genome database)
➣ Normalement saprophyte
(matière organique morte)
Problématique
Facteurs de virulence ?
Saprophyte Pathogène
➣ Problèmes particuliers posés par
le commensalisme et l’opportunisme
➣ Approche par génomique fonctionnelle
Méthodologie (1)
- ARN interférence : inutilisable en théorie (pas de protéine argonaute chez les champignons)
- Stratégie antisens : + (applications chez filamenteux)
- Insertion d'un fragment d'ADN par recombinaison homologue : +++ chez les levures, +/- chez filamenteux
(possible améliorer le % recombinaison : inactivation des gènes codant
KU70 et KU80, 2 protéines nécessaires au Non Homologous End Joining)
Invalider l'expression d'un gène chez champignons ?
Méthodologie (2)
1. Création de mutants nuls
2. Caractérisation phénotypique
3. Virulence sur modèle animal
Chez les levures
Système de transformation génétique« URA3 blaster »
URA3hisG hisG
Δura3/ Δura3
Electroporation
URA3 = orotidine 5’phosphate decarboxylasehisG = partie de gène de S. typhimurium
Sélection URA+ sur YNB(milieu minimum)
1
Génotype
URA3hisG hisG5’X 3’X
Gène X Allèle 1X X
Gène X Allèle 2
Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicans
Δura3/Δura3, X / X
Transformation souche homozygote Δura3par cassette URA3 blaster bordée des régions 5’ et 3’ du gène X
Intégration par double CO du gène URA3 au locus XRemplacement du 1er allèle
Création d’une souche mutante hétérozygote (URA Blaster)
1
URA3hisG hisG5’X 3’X
Gène X Allèle 2
Génotype
Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicans
Δura3/Δura3, Δx::URA3 / X
Sélection des transformants Ura+ sur YNB (milieu minimum)Analyse par Southern blot ou PCR
Confirmation de l’intégration par double CO du gène URA3 au locus X
Création d’une souche mutante hétérozygote (URA Blaster)
1
hisG
hisG
5’X
3’X
Gène X Allèle 2
XGénotype
Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicans
Δura3/Δura3, Δx::URA3 / X
Contre-sélection sur 5FO de souches ura3Analyse par Southern blot ou PCR
Vérification excision de la cassette HisG-URA3-HisG par recombinaison en HisG
[5FO = Acide 5-fluoro-orotique]
Création d’une souche mutante hétérozygote (URA Blaster)
1
hisG5’X 3’X
Gène X Allèle 2
Génotype
Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicans
Δura3/Δura3, Δx::hisG / X
Création d’une souche mutante hétérozygote (URA Blaster)
1
hisG5’X 3’X
Gène X Allèle 2
URA3hisG hisG5’X 3’XX X
Génotype
Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicans
Transformation souche homozygote Δura3par cassette URA3 blaster bordée des régions 5’ et 3’ du gène X
Intégration par double CO du gène URA3 au locus XRemplacement du 2ème allèle
Δura3/Δura3, Δx::hisG / X
Création d’une souche mutante homozygote (URA Blaster)
1
hisG5’X 3’X
URA3hisG hisG5’X 3’X
Génotype
Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicans
Δura3/Δura3, Δx::hisG / Δx::URA3
Sélection des transformants Ura+ sur YNB (milieu minimum)Analyse par Southern blot
Confirmation de l’intégration par double CO du gène URA3 au locus Xau niveau du 2ème allèle
Création d’une souche mutante homozygote (URA Blaster)
1
hisG5’X 3’X
hisG
hisG
5’X
3’XX Génotype
Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicans
Contre-sélection sur 5FO de souches ura3Analyse par Southern blot ou PCR
Vérification excision de la cassette HisG-URA3-HisG par recombinaison en HisG
Δura3/Δura3, Δx::hisG / Δx::URA3
Création d’une souche mutante homozygote (URA Blaster)
1
hisG5’X 3’X
hisG5’X 3’XGénotype
Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicans
Δura3/Δura3, Δx::hisG / Δx::hisG
Création d’une souche mutante homozygote (URA Blaster)
1
hisG5’X 3’X
hisG5’X 3’XGénotype
Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicans
URA3/Δura3, Δx::hisG / Δx::hisG
Création d’une souche mutante homozygote (URA Blaster)
1
URA35’ 3’
5’ 3’
hisG5’X 3’X
hisG5’X 3’X
Gène X URA3hisG hisG
Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicans
Sélection des transformants Ura+ sur YNB (milieu minimum)Analyse par Southern blot
Confirmation de l’intégration par double CO des gènes X et URA3 au locus X
Création d’une souche révertante hétérozygote (URA Blaster)
1
hisG5’X 3’X
Gène X URA3hisG hisG
Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicansCréation d’une souche révertante hétérozygote (URA Blaster)
Génotype
Δura3/Δura3, Δx::hisG / X, URA3
Contre-sélection sur 5FO de souches ura3Analyse par Southern blot ou PCR
Vérification excision de la cassette HisG-URA3-HisG par recombinaison en HisG
1
hisG5’X 3’X
Gène X hisG
hisGX
Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicansCréation d’une souche révertante hétérozygote (URA Blaster)
GénotypeΔura3/Δura3, Δx::hisG / X, URA3
Contre-sélection sur 5FO de souches ura3Analyse par Southern blot ou PCR
Vérification excision de la cassette HisG-URA3-HisG par recombinaison en HisG
1
hisG5’X 3’X
Gène X hisG
Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicansCréation d’une souche révertante hétérozygote (URA Blaster)
Génotype
Δura3/Δura3, Δx::hisG / X
1
hisG5’X 3’X
Gène X hisG
URA35’ 3’
5’ 3’
Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicansCréation d’une souche révertante hétérozygote (URA Blaster)
Génotype
URA3/Δura3, Δx::hisG / X
1
ARG45’X-Target 3’X-Target
Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicans1
5'∆URA33'∆URA3
Disruption en une seule étape ?Stratégie Cassette UAU
Transformation souche homozygote Δura3, Δarg4par cassette UAU bordée des régions 5’ et 3’ du gène X à déléter (Target)
Sélection Arg+ sur milieu YNB minimum + uridineIntégration par double CO de la cassette UAU au locus X
Remplacement du 1er allèle
1
Sélection Arg+, Ura+ sur milieu YNB minimum Conversion génique + recombinaison intragénique URA3
Remplacement du 2ème allèle
2
Génotype
Gène X Allèle 1X X
Gène X Allèle 2
Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicans
Δarg4/Δarg4,Δura3/Δura3, X / X
Sélection Arg+ sur YNB minimum + uridine
Création d’une souche mutante (Cassette UAU)
1
ARG45’X-Target 3’X-Target5'∆URA33'∆URA3
Génotype
Gène X Allèle 2
Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicans
Δarg4/Δarg4,Δura3/Δura3, Δx::ARG4/ X
Conversion génique (non sélectionnée)
Création d’une souche mutante (Cassette UAU)
1
ARG45’X-Target 3’X-Target5'∆URA33'∆URA3
Δarg4/Δarg4,Δura3/Δura3, Δx::ARG4/ Δx::ARG4
ARG45’X-Target 3’X-Target5'∆URA33'∆URA3
ARG45’X-Target 3’X-Target5'∆URA33'∆URA3
Génotype
Génotype
Etude fonctionnelle par invalidation chez C. albicans
Δarg4/Δarg4,Δura3/Δura3, Δx::ARG4/ Δx::URA3
Recombinaison intragénique URA3Sélectionnée sur milieu YNB minimum
Création d’une souche mutante (Cassette UAU)
1
ARG45’X-Target 3’X-Target5'∆URA33'∆URA3
5’X-Target 3’X-TargetURA3
Possibilité de créer la souche révertante hétérozygote X/Δx - Contre-sélection ura3 sur 5FO - Complémentation : apport de l'allèle X avec marqueur URA3
Souche homozygote Δx
in vitro : - croissance C et N - température - pH - adhérence - morphologie cellulaire
2. Caractérisation phénotypique
3. Virulence sur modèle animal
Injection : 105 cfu / animal veine caudale
Survie21 j
Analyse microbiologique
(quantitatif)
Analysehistologique
(qualitatif)
Tests de survie chez les sourisOF1 et BalB/c
Représentation de Kaplan-Meier, Analyse de log-rank à p ≤ 0.05
Mutant sur OF1 et BalB/c
Sauvage sur OF1
Sauvage sur BalB/c
3
Analyse microbiologique
Prélèvement organe cible[ Rein, Foie, Poumon, cerveau ]
Homogénat
Etalement sur milieu completDénombrement CFU
Mutant Sauvage
< ?> ?= ?
3
Etude histologique
Souche virulente Souche avirulente
3
Coupe histologique de reins infectéslevures colorées au PAS
Facteurs de virulence
Températurecroissance
Sécrétion
Affichage Dimorphisme
MétabolismeBiofilm
Adhérence
Température de croissance
≥ 37°C
Ex. chez levures : - Candida albicans > 37°C
- Saccharomyces cerevisiae = 30°C
(quelques espèces de filamenteux aptes à se développer à 50°C, voire 60°C)
Adhérence
- Tout premier facteur de virulence dans tout système hôte-pathogène
- Chez C. albicans, protéines groupées sous le terme « adhésines »
Adhésines
Matrice extracellulaire Mammifère
- Fibronectine
- Fibrinogène
- Laminine
- Collagènes I / IV
Adhérence
1 - Agglutinin-like sequences (Als), spécifiques C. albicans
- Als S. cerevisiae : cell/cell interaction mating- Chez C. albicans : 10 gènes- principales protéines : Als1p et Als5p
S-S-S-S-SNH2 COOH
n repeats conserved Δ(108 pb)
1299-1308 pb GPIGlycosylphosphatidylinositol
➣ rendent S. cerevisiae adhérentes➣ délétion = hypovirulence
G G G
Ser/Thr-richAffinité fibronectine
Adhérence
2 - Hyphal Wall Protein (Hwp1)
- Mannoprotéine liée de façon covalente aux ß1-6glucanes de la paroi- Spécifique du stade hyphe chez C. albicans- Facilite adhérence aux cellules epithéliales- Ligand de transglutaminases des mammifères(modifications post-traductionnelles par transamidation desglutamines ➜ cross-link lysine glutamine ➜ meilleurerésistance protéolyse)- Fixation "covalente" de C. albicans aux cellules épithéliales
Adhérence
3 - Integrin-like protein (Int1)
- Intégrines mammifères = glycoprotéines impliquéesdans interactions cellullaires, adhésion (fibronectine,laminine)- Integrin-like synthétisée par C. albicans- Epitopes communs avec intégrines des mammifères- Mimétisme pour échapper au système immunitaire- Disruption = adhérence et virulence fortement diminuées
Sécrétion
1 - Secreted Aspartyl protéinases (Saps)
- Famillle d’enzymes (protéases acides) codée par 10 gèneschez C. albicans- Aptes à dégrader in vitro plusieurs protéines mammifères :mucines (protection des muqueuses), IgA, kératine, collagène- Souches virulentes = plus de Saps que les avirulentes- Sap2 : augmentation perméabilité vasculaire ➜ disséminationhématogène- Résistance à phagocytose macrophagique (4,5,6)
Sécrétion
2 - Autres enzymes
- Phospholipases (A à D) : hydrolyse des phospholipidesParticiperaient au franchissement de la membrane plasmique descellules de mammifères par C. albicans.
- Lysophospholipases : hydrolyse phosphatidylinositol,phosphatidylsérine (même rôle que phospholipases).
- Lipases : rôle dans l’utilisation des lipides de l’hôte pour unswitch métabolique (métabolisme glucosé ➜ lipidique).
Dimorphisme
. Transition morphogénétique levure - filament= hyphe vraie avec cloisons internes. C. albicans, C. dubliniensis
➢
. Transition morphogénétique levure - pseudofilaments= cellules allongées restant attachées après mitose. Candida non-albicans et albicans
➢
2 types
C. albicans SC5314 - Macrophages murins lignée J774.1
t = 0 h t = 3 h
Echapper à la Phagocytose macrophagique
Faciliter la colonisation des tissus
Rein filamentsRein pseudofilamentsvaisseau sanguinfilaments et pseudos
Facteurs déclenchant la transition morphogénétique
- Carence nutritionnelle- pH (induction pH > 7)- Température (37°C)- Sérum
Test de blastèse : filamentation de C. albicans en 3 h dans du sérum à 37°C
Perception du signal
(➚ et ➘ )(➘)
≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈
Mep2Ammonium perméase
≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈pH + sérum
≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈
Gpr1 Glucose senseur ?
Protéine G
≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈
Transduction du signalRôle des protéines G
Mep2Ammonium perméase
Gpr1 Glucose senseur ?
≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈pH
Gpa1
Gpa2Ras
Voie AMPc(adénylate cyclase)
Voie MAP kinases(MEK, Kss1)
??
Rim101
Hwp1
Glucose
≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈
Mep2Ammonium perméase
≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈pH
Gpa1
Gpa2Ras
Voie AMPc
Voie MAP kinases
?
Rim101
Cph1 (Ste12-like)(Candida PseudoHyphal regulator)
Efg1(Enhanced Filamentous growth)
Effecteurs
Facteurs de transcription
≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈
Gpr1 Glucose senseur
?
≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈
Gpr1 Glucose senseur
≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈
Effecteurs
Mep2Ammonium perméase
≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈≈ ≈ ≈ ≈ ≈ ≈pH
Cph1Efg1
Gènes filamentation+
Tup1Nrg1Rfg1
_- Cytosquelette Actine- Glucanes paroi- Lipides membranaires- Hwp1
Formation de biofilms chez Candida
- 4 étapes . qq heures . tissus, cathéter . 200 µm
- Film stratifié . Levures/ filaments . Résistance Mécanique (flux) Syst immunitaire Antifongiques
Formation de biofilms chez Candida
- 4 étapes . qq heures . tissus, cathéter . 200 µm
- Film stratifié . Levures/ filaments . Résistance Mécanique (flux) (matrice extracell) Syst immunitaire Antifongiques
- Régulation . Tyrosol + . Farnesol -
glucose, galactose, sucres aminés
Tyrosol, farnésol
AdhérenceAgglutinin-like séquenceHyphal Wall ProteinIntegrin-like proteinsMannosyl transferase
SécrétionAspartyl protéinases
Phospholipases (A-D)Lysophospholipases
Lipases
AffichagePhospholipomannane Apoptose macrophage
DimorphismeHyphes
Pseudohyphes
Résistance aux antifongiques
Métabolisme énergétiqueß-oxydation + glyoxylate
Biofilm
Facteurs de virulence Conclusion - Résumé
Métabolisme fer
Température ≥ 37°C