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LLeess FFaauusssseess TThhrroommbbooppéénniieess

1

IINNTTRROODDUUCCTTIIOONN


2

La biologie médicale a connu des bouleversements considérables avec

l’évolution prodigieuse de ses techniques. Dans le système de santé actuel la

majorité des diagnostics médicaux sont établis à partir des analyses biologiques.

Cette évolution technologique n’est pas sans risque, d’où la nécessité d’avoir

toujours la présence d’un praticien formé et expérimenté en la qualité d’un

biologiste. Dans les laboratoires d’hématologie, les automates pour

hémogrammes permettent de mesurer le nombre d’éléments de chacune des

trois catégories de cellules que sont les globules rouges (hématies), les globules

blancs (leucocytes) et les plaquettes. La validation du taux de plaquettes indiqué

sur l’hémogramme par l’automate n’est pas systématique et devant tout cas de

thrombopénie, il faut s’assurer qu’il s’agit bien d’une vraie thrombopénie et non

d’une thrombopénie artéfactuelle. La thrombopénie artéfactuelle ou pseudo-

thrombopénie ou fausse thrombopénie est un compte plaquettaire bas observé

dans l’hémogramme, due aux conditions de réalisation de l’hémogramme et cela

lorsqu’il ya pas de diminution du taux de plaquettes in-vivo. La pseudo-

thrombopénie peut être due à plusieurs éléments comme, les conditions pré

analytiques, l’anticoagulant utilisé, les agglutinines froides, la température, la

taille des plaquettes.

Le but de cette étude est dans un premier temps de clarifier à travers une

revue de la littérature les caractéristiques pour comprendre les mécanismes des

différents éléments qui interviennent dans ce phénomène in vitro, afin dans un

second temps d’établir un arbre décisionnel en précisant la conduite à tenir

devant la découverte d’une fausse thrombopénie.


3

PPrreemmiièèrree ppaarrttiiee RRAAPPPPEELLSS

SSuurr lleess ppllaaqquueetttteess eett lleess tthhrroommbbooppéénniieess


4

I- LES PLAQUETTES SANGUINES

La mégacaryopoièse correspond à la différenciation des cellules souches

(CS) hématopoïétiques en mégacaryocytes qui sont les acteurs de la production

plaquettaire. Les progénitures mégacaryocytaires issues des CS

hématopoïétiques pluripotentes, sont capables à la fois de s’autoreproduire et de

se différencier en progénitures des lignées hématopoïétiques. Quand les CS

s’engagent dans la différenciation mégacaryocytaire, elles perdent en même

temps leur capacité d’autorenouvellement et leur propriété multipotente. Les CS

engagées sont alors appelées progéniteurs hématopoïétiques.

Le compartiment des progéniteurs est localisé dans la moelle osseuse chez

l’adulte, les progéniteurs mégacaryocytes sont des cellules non reconnaissables

morphologiquement. Après une succession de stade, les progéniteurs

mégacaryocytaires vont donner des mégacaryoblastes. Les mégacaryoblastes

déviennent morphologiquement identifiables du fait de leur augmentation de

taille, perdent leur nom de progéniteurs pour s’appeler précurseurs [1].

Le compartiment des précurseurs est le compartiment de maturation. Ce

phénomène est un processus continu qui est observé en 8 jours. Ainsi, les

mégacaryocytes sont classés en plusieurs stades de maturation. Le

mégacaryoblaste ou stade I est issu du promégacaryoblaste. Le mégacaryocyte

basophile ou stade II, le megacaryocyte granuleux ou stade III et enfin le

mégacaryocyte mature ou plaquettogénèse ou stade IV (figure 1).

La plaquettogenèse correspond à la formation et à la libération des

plaquettes à partir de la fragmentation du mégacaryocyte mature. Chaque


5

mégacaryocyte donne naissance à plusieurs centaines de plaquettes. Le lieu de

formation des thrombocytes reste objet de controverse. Pour les uns, il s’agirait

de la moelle osseuse et pour les autres, ce serait après le passage des cellules

mégacaroytaires dans la circulation pulmonaire.

Toutefois, le mégacaryocyte à ce stade, par son système de démarcation très

développé, joue un rôle essentiel dans la production des plaquettes par la

formation d’extensions appelées proplaquettes. Celle-ci débute par une genèse

microtubulaire au niveau du corps cellulaire. Ces microtubules en glissant les

uns le long des autres permettent l’élongation des bras de cytoplasme. De leur

coté, l’actine et la myosine interviennent dans la formation des renflements qui

correspondent aux futures plaquettes. La fusion de vacuoles présentes de chaque

coté de ces constrictions permettra la fragmentation des proplaquettes et la

libération des plaquettes [2].


6

Figure 1 : Image illustrant les différents stades de maturation des

mégacaryocytes de la moelle osseuse [2].


7

A-Morphologie des plaquettes

Les plaquettes possèdent des caractéristiques morphologiques observées au

microscope. En microscopie optique, les plaquettes apparaissent comme des

fragments de cytoplasme anucléés arrondis ou ovalaires, mesurant 2à 3µm de

diamètre. Leur volume varie entre 5 et 19µm3. On distingue sur les frottis

colorés au May-Grumwald-Giemsa (MGG) deux zones distinctes, l’une

centrale : le chromomère et l’autre périphérique : le halomère.

En microscopie à contraste de phase, et à l’état vivant, elles apparaissent

discoïdes, émettant des prolongements de longueur croissante qui modifient

continuellement leur forme et leur orientation. Ce sont des formes dendritiques

qui aboutissent progressivement aux formes étalées.

Figure 2 : Image illustrant des plaquettes [3].


8

B-Structure et anatomie fonctionnelle des plaquettes

Le microscope électronique, permet d’observer les différents éléments de la

plaquette. D’abord on observe la membrane, et les systèmes canaliculaires

associés à la membrane cytoplasmique. Ensuite à l’intérieur du cytoplasme, on

distingue plusieurs types d’organelles (granules denses, les lysosomes et les

microperoxysomes). A la périphérie de la cellule, se trouve groupés les

microfibrilles. Enfin, on observe que le réticulum est lisse ou granuleux et les

ribosomes sont peu abondants et que les grains de glycogène sont souvent

groupés en amas.

Les constituants biochimiques des plaquettes sont les véritables éléments de

base des propriétés physiologiques plaquettaires.

Le Glycocalix est un revêtement de surface situé à l’extérieur de la

membrane. C’est le premier site d’interaction des plaquettes avec

l’environnement extérieur. La membrane plaquettaire comporte une couche de

lipides neutres ou polaire dans laquelle peuvent se mouvoir des glycopeptides

(GP) ou d’autres protéines suffisament hydrophobes pour former des

associations lipidoprotidiques.

Les lipides sont representés par 78% de phospholipides qui sont distribués

de façon asymétrique dans la double couche membranaire. Sur la plaquette au

repos, la sphingomyéline est présente dans le feuillet externe et la

phosphatidylsérine, le phosphatidylinositol et la phosphatidyléthanolamine dans

le feuillet interne. En dehors des phospholipides, il existe des céramides, des

glycolipides neutres et acides ou des gangliosides.


9

Les protéines sont constituées en particulier des glycoprotéines. Ces GP

étaient initialement classées en trois groupes majeurs appelés GPI, II et III avec

des poids moléculaires respectifs de 150, 130, 100 kDa. La description des GP

de poids moléculaires inférieurs (GP IV, V, VI) est venue compléter la

classification initiale.

Les GPIIb et IIIa interagissent pour constituer un complexe équimolaire

d’environ 40000 à 80000 sites par plaquette et dépendant du calcium. Ce

complexe constitue le site de fixation du fibrinogéne sur la plaquette ce qui

représente une étape importante de l’agrégation plaquettaire. Ces molécules sont

representées par la fibronectine, la thrombospondine (figure 3).


10

Figure 3 : Schéma illustrant le rôle majeur de la GP IIb dans l’agrégation

plaquettaire [3].


11

C- Fonctions plaquettaires

Les plaquettes jouent un rôle primordial de l’hémostase qui est un

phénomène physiologique qui contribue à la prévention et à l’arrêt des

saignements. Il assure le maintient de la fluidité du sang et l’intégrité des

vaisseaux. L’hémostase est subdivisée en trois étapes presque simultanées que

sont l’hémostase primaire, la coagulation et la fibrinolyse. C’est surtout les deux

premières étapes qui sont conditionnées par l’action des plaquettes sanguines.

Les plaquettes peuvent aussi amplifier une réaction inflammatoire par la

sécrétion du facteur de perméabilité vasculaire, l’aptitude à promouvoir le

chimiotactisme des polynucléaires et la synthèse des prostaglandines.

Les thrombocytes peuvent être activés par de nombreux complexes

antigène-anticorps et sont ainsi capables de fixer des Immunoglobulines (Ig) E

spécifiques antiparasitaires grâce au complexe GPIIb-IIIa [2].

Les plaquettes, par un processus similaire à celui de la phagocytose peuvent

englober des particules étrangères variées et Il est souvent difficile de faire la

distinction entre une phagocytose réelle et la fixation passive de particules à la

membrane qui borde le système canaliculaire. Elles peuvent adhérer en amas

autour des cellules métastasiques.


12

II- LES THROMBOPENIES

A- Définition

Une thrombopénie est définie par un taux de plaquettes circulant inférieur à

150×109/L (150000/mm

3) indépendamment de l'âge [5].

Elle peut être d’origine centrale par défaut de production, ou périphérique

par consommation, anomalie de répartition, ou destruction immunologique. Il

est habituellement facile de connaitre le mécanisme grâce au contexte clinique et

aux résultats des examens biologiques standards et du myélogramme obtenu par

aspiration de moelle [6].

B-Numération des plaquettes

Pour toute numération plaquettaire, il faut d’abord faire un prélèvement de

sang. Le préleveur doit être d’une qualification et d’une aptitude particulière

(biologiste, infirmière ou technicien capacitaire). Les tubes de prélèvements

utilisés contiennent l’éthylène -diamine-tétra-acétique (EDTA) comme

anticoagulant [4]. Le bouchon des tubes EDTA est de couleur violette.

L’EDTA est considéré comme l’anticoagulant le plus approprié des

plaquettes en raison de sa puissante inhibition de l’agrégation plaquettaire.

L’agglutination EDTA dépendante est surmontée par l’ajout de cations divalents

ou l’excès d’EDTA. Cet anticoagulant « sec » (évitant ainsi un facteur de

dilution rencontré avec un anticoagulant liquide) empêche le calcium de

s’ioniser par chélation. Sans calcium ionisé le phénomène de coagulation ne

peut pas se produire. L’EDTA a l’avantage de très bien conserver les globules


13

rouges et les globules blancs, et de permettre le comptage des plaquettes en

prévenant leur agrégation. Il existe deux méthodes de détermination du taux des

plaquettes.

Une méthode manuelle qui a recours au comptage en cellule au microscope

optique. Le coefficient de variation des résultats est important (10 à 30%). Une

méthode automatique qui utilise soit une méthode de variation d’impédance, soit

une méthode optique. Certains systèmes sont hybrides pour augmenter la

précision du comptage. Le coefficient de variation des résultats est faible, 1 à

5% selon les zones de valeurs. La méthode, la plus utilisée est la méthode

automatique à cause de son coefficient de variation faible. Mais il arrive

souvent, aux automates de fournir un taux de plaquettes bas et qui ne correspond

pas à la réalité in vivo, on parlera alors de fausse thrombopénie. Ces fausses

thrombopénies ou pseudo-thrombopénies peuvent être dues aux erreurs pré

analytiques (telles qu’un prélèvement difficile, un défaut d’anticoagulant par

excès de remplissage du tube, une absence d’agitation) [7]. Elles peuvent

également être la conséquence d’autres phénomènes, que nous allons

développer dans la suite de notre étude. Dans ces conditions il faut s’assurer de

la conformité du prélèvement en vérifiant l’identité, la nature de l’anticoagulant

et en recherchant un éventuel caillot (ne pas oublier de regarder dans le bouchon

ou peuvent restés collés certains caillots). Le site de la ponction veineuse peut

contribuer à une sous- estimation de la numération plaquettaire, parce que

correspondant à des échantillons dilués, par l’augmentation de la concentration

de l’anticoagulant au sein de l’échantillon (moins de sang en raison d’un

prélèvement difficile) [8].


14

La pseudo-thrombopénie est un artéfact de laboratoire et ne s’accompagne

jamais de syndrome de syndrome hémorragique. Ce diagnostic doit toujours être

éliminé avant de commencer un bilan étiologique, surtout lorsque la

thrombopénie est de découverte fortuite, sévère et non accompagné de

saignements. Devant une thrombopénie, il faut réaliser un frottis pour vérifier

l’absence ou la présence d’agrégats plaquettaires, et mettre une goutte entre

lame et lamelle pour vérifier la présence de filament de fibrine quand on

suspecte une coagulation. Il faut faire un comptage sur unopette quand le taux de

plaquettes est très sous estimé en cas de macroplaquettes. Demander un autre

prélèvement sur tube citrate en cas de pseudo-thrombopénie EDTA dépendante

ou chauffer à 37°C pendant 1h en cas de pseudo-thrombopénies non EDTA

dépendante.

C-Etiologie des thrombopénies

C-1- Les thrombopénies périphériques

Elles sont secondaires à une hyperdestruction plaquettaire ou à une anomalie

de répartition. Le myélogramme non systématique est normal avec une richesse

en mégacaryocytes normale, voire augmentée.

La durée de vie des plaquettes est raccourcie, mais n’est étudiée qu’en cas

de difficulté diagnostique [9] (Tableau I).

- Hyperdestruction plaquettaire

Elle est d’origine immunologique ou par consommation, et dans ce cas la

thrombopénie est associé à d’autres anomalies de l’hémostase.


15

- Anomalies de répartition

Elles sont presque toujours dues à un hypersplénisme. Toute splénomégalie

quelle qu’en soit la cause peut être responsable d’une augmentation de la

séquestration de plaquettes. Des thrombopénies par dilution sont observées en

cas de transfusions érythrocytaires massives. Il en est de même pour la grossesse

où une thrombopénie modérée de dilution est observée lors du dernier trimestre.


16

Tableau I: Etiologie des thrombopénies périphériques

THROMBOPENIES PERIPHERIQUES

Hyperdestruction plaquettaires

-Immunologique

Auto-immunes

PTAI

Syndrome des anti-phospholipides

Lupus

Virale

Allo immunes

Médicamenteuses

Post transfusionnelle

-Consommation plaquettaire

CIVD

PTT

Syndrome de kasabach-Merritt

Circuits extracorporels

Anomalies de repartition

Dilution

Transfusion massive

Grossesse

Splénomégalie

Cas particuliers

Syndrome pseudo-Villebrand Plaquettaire


17

C-2-Les thrombopénies centrales

-Les thrombopénies centrales constitutionnelles

Elles sont exceptionnelles, elles ne touchent que la lignée mégacaryocytaire

ou révèlent une aplasie médullaire globale comme la maladie de Fanconi.

Certaines sont associées à une thrombopathie [9, 10] (Tableau II).

- Les thrombopénies centrales acquises

Les thrombopénies centrales acquises sont liées à une aplasie médullaire ou

à une infiltration médullaire. Dans ces thrombopénies centrales, la thrombopénie

pas toujours isolée. Elle peut être associée à une pancytopénie (aplasie) ou à une

prolifération cellulaire anormale. Le myélogramme et (ou) la biopsie médullaire

retrouvent une absence ou une hypoplasie mégacaryocytaire isolée ou associée à

une aplasie-hypoplasie médullaire plus globale ou objectivent une infiltration

médullaire par une prolifération tumorale. La mesure de durée de vie des

plaquettes n’est pas indiquée et elle serait normale (8-10 jours).


18

Tableau II : Etiologie des thrombopénies centrales

THROMBOPENIES CENTRALES

CONSTITUTIONNELLES

Amégacaryocytose congénitale

Avec aplasie médullaire

A transmission autosomale dominante

Aplasie médullaire congénitale (Fanconi)

Thrombopenies avec thrombopathies

Maladie de Jean-Bernard et Soulier

Maladie des plaquettes grises

Maladie de May-Hegglin

Syndrome de Wiskott-aldrich

ACQUISES

Amécaryocytose acquise

Aplasie médullaire acquise

Immunologique

Toxique

Carentielle

Dysmyelopoiése

Infiltration médullaire

Leucémie aigue

Tuberculose

Syndrome d’activation macrophagique


19

DDeeuuxxiièèmmee ppaarrttiiee LLeess ffaauusssseess tthhrroommbbooppéénniieess

oouu tthhrroommbbooppéénniieess aarrtteeffaaccttuueelllleess


20

Le chapitre suivant va nous permettre de mieux connaitre ce phénomène à

travers l’étude de ses caractéristiques, ses différents mécanismes et ses

principales circonstances d’apparition.

Les pseudo-thrombopénies se divisent en deux grands groupes : les pseudo-

thrombopénies EDTA dépendantes et les pseudo-thrombopénies EDTA

indépendantes.

I-Incidence

Le taux de prévalence de la fausse thrombopénie est estimé entre 0,07-0,2%.

Sa fréquence moyenne est estimée à 0,1% [8, 11-15].

Les pseudo-thrombopénies dues aux erreurs pré analytiques (telles qu’un

prélèvement difficile, un défaut d’anticoagulant par excès de remplissage du

tube, une absence d’agitation), aux plaquettes géantes, au satellitisme autour des

polynucléaires neutrophiles et aux agglutinines antiplaquettaires sont rares [15].

Le satellitisme des plaquettes aux polynucléaires est un phénomène rare, qui

surviendrait dans un cas sur 12000 numérations réalisées, soit 0,008% [19].

Une étude de Vicari et al [8,16-18], a donné une incidence de pseudo-

thrombopénie de 0 à 13% sur 33623 sujets visés à partir d’un hôpital général.

Cette incidence peut atteindre 1,9% pour les personnes hospitalisées. En

revanche aucune corrélation entre âge, le sexe des patients et la pseudo-

thrombopénie EDTA dépendante n’a été démontrée.


21

Une étude similaire de 20761 échantillons réalisée avec l’automate a

montré que l’incidence de la pseudo-thrombopénie est de 0,15% pour les

patients externes et de 1 ,9% pour les patients hospitalisés et pour ces patients

72% sont EDTA dépendants et 28% sont dues aux macroplaquettes [18].

La pseudo-thrombopénie à froid des plaquettes EDTA indépendante est un

phénomène rare, et se produit quand les échantillons de sang sont analysés dans

les compteurs de cellules automatisés [20].

II-Les Pseudo-thrombopénies EDTA-dépendante

La pseudo-thrombopénie est un phénomène obtenu par agglutination

plaquettaire in vitro qui est liée à l’existence d’anticorps dépendant de l’EDTA

qui vont réagir avec les plaquettes dans le tube de prélèvement pour produire des

amas plaquettaires. Ce phénomène amène l’automate à une sous estimation du

nombre de plaquettes, en plus l’agrégat plaquettaire peut être aussi grand qu’un

globule blanc et être énumérer en tant que tel par les automates, ce qui peut

entrainer aussi un faux taux de globules blancs, qu’il faudra corriger [21-31].

A-Les agrégats plaquettaires EDTA dépendantes

A-1-Caractéristiques des agrégats plaquettaires

La pseudo-thrombopénie à l’EDTA est un phénomène in vitro survenant

dans le tube de prélèvement. Il est irréversible et se voit plus souvent chez les

malades porteurs d’un syndrome inflammatoire connu ou jusque la

asymptomatique et dans des états dysimmunitaires. C’est un phénomène

irréversible. La formation d’agrégats plaquettaires est presque totale environ 20


22

minutes après prélèvement. A 90minutes, le processus est définitivement achevé

et stabilisé. En début du processus d’agrégation, la formation dans le temps de

micro agrégats peut majorer le chiffre de globules blancs de 10 à 100% (une

alarme du type « interférence » est signalée par les automates). Si les amas

plaquettaires sont transformés en macro agrégats, le taux de leucocytes au

comptage automatique redevient normal [8, 15, 23, 31-39].

Cet artéfact de laboratoire est d’origine immunologique. Il est dû à des

anticorps antiplaquettaires induisant la formation d’amas uniquement en

présence de l’EDTA (Figure 4) [40].

Figure 4 : Image illustrant une agrégation plaquettaire [40].


23

A-2-Mécanisme de formation des agrégats plaquettaires

Après une revue de la littérature [15-62], nous avons pu déterminés trois

éléments, qui jouent un rôle primordiale dans de ce phénomène, sous l’action de

l’EDTA. Ces éléments sont les immunoglobulines, les déterminants

antigéniques des plaquettes (la GPIIb-IIIa), et le calcium.

En effet, plusieurs enquêtes [21, 40-52], ont indiqué qu’une fausse

numération plaquettaire EDTA dépendante peut être causée par des agglutinines

présentes dans le plasma. Le constat est que l’anticorps contraignant pour les

plaquettes est strictement EDTA- dépendant, et se produit même en présence

d’une faible concentration d’EDTA, indépendamment de la composition

cationique de la solution d’EDTA. Les anticorps semblent appartenir à toutes les

grandes classes d’immunoglobuline. Les iso types en cause, isolés ou parfois

associés, sont de type IgG ou IgM , plus rarement de type IgA [41].

Les agglutinines IgG, IgM, IgA sont rencontrés dans les pourcentages

respectives de 30-50%, 10-63%, et 4-40% des cas de pseudo-thrombopénies

EDTA dépendante [8, 22,41-42].

Deux éléments ont été utilisés pour mettre en évidence la participation de

l’IgG dans la pseudo-thrombopénie EDTA-dépendante. D’abord, l’étude du

phénomène par le microscope électronique [42]. Ensuite la présence de

l’activité agglutinante dans la fraction euglobuline, la fraction de l’IgG et son

inhibition par IgG anti-serums donne à penser que cette agglutinine est un

anticorps IgG mais pas un IgM [15, 44].


24

L’Ig G qui a été caractérisée dans les cas de pseudo-thrombopénie EDTA-

dépendante est indépendante de la température et l’agglutination se produit

généralement en quelques minutes après échantillonnage avec l’EDTA. Elle est

plus souvent visible dans des échantillons de sang conservés à la température

ambiante. Les agrégats constatés sur frottis, sont très variables en taille

comprenant trois à cinq plaquettes, et même plus [8, 44].

L’Ig M qui a été caractérisée dans les cas de Pseudo-thrombopénie EDTA

dépendante, est dépendant de la température. En effet dans ce cas, l’agrégation

plaquettaire est accélérée par le froid [45]. Cette thermo dépendance permet

d’éviter cet artéfact en effectuant le comptage automatique immédiatement après

prélèvement. Ce phénomène n’est pas constant et pour un malade donné

l’anomalie peut disparaître en quelques semaines [11]. L’optimum thermique

quand il est précisé pouvant être de 4°C ou de 22°C. Dans 20% des cas, ils sont

actifs à 37°C. Il s’agit alors d’anticorps de type IgM entraînant la formation

d’amas plaquettaires aussi bien en présence d’EDTA qu’en présence de citrate.

Cet aspect est à rapprocher des cas d’agglutinines froides antiplaquettaires décrit

par plusieurs auteurs, la frontière entre cette entité et les pseudo-thrombopénies

strictement liées à l’EDTA est floue [45, 46].

La physiopathologie de la production de ces anticorps est mal connue, il a

été suggéré qu’elle pourrait correspondre soit à des auto anticorps ou à des

anticorps acquis, résultant de la destruction des plaquettes observés dans

certaines pathologies telle que la septicémie, la toxémie gravidique, le purpura

thrombopénique ou les myélodysplasies. Dans plusieurs cas, il a été montré que

la pseudo-thrombopénie est apparu pendant l’hospitalisation et en particulier

après une infection avec souvent les anticorps liés aux plaquettes de la plupart


25

des patients [13, 47]. La cinétique d’apparition de ces anticorps et leurs cibles

antigéniques sont aussi mal connues. Ils ne semblent pas être dirigés contre des

antigènes plaquettaires spécifiques (HPA) [21]. Ces anticorps sont considérées

comme « naturels » et pourraient avoir un rôle physiologique dans l’élimination

des plaquettes âgées [48].

L’étude [40] des plaquettes agglutinées d’un patient ayant des cellules

cancéreuses, lorsque l’anticoagulant utilisé est l’EDTA, a permis à ses auteurs

d’émettre des hypothèses. Elles ont été émises pour expliquer le fait que la

réaction entre l’anticorps et les plaquettes aient été observées seulement en

présence de l’EDTA. La première c’est que l’EDTA agit directement sur les

anticorps pour parvenir à son activation. La seconde est que l’EDTA détruit un

inhibiteur de l’anticorps. Aucune de ces hypothèses ne semble probable à la

lumière des connaissances présentes. La troisième est que la structure de

surface, et donc les déterminants antigéniques des plaquettes, peut être modifiée

par un anticoagulant. L’EDTA est bien connu pour affecter la structure des

plaquettes [50]. De cette étude et bien d’autres [40, 21], la conclusion obtenue

est que le site plaquettaire de fixation des immunoglobulines en présence de

l’EDTA est l’adhésif sur les récepteurs GPIIb-IIIa, et que la fonction

plaquettaire normale est nécessaire pour l’agglutination des plaquettes.

La glycoprotéine GPIIb-IIIa est un hétérodimère calcium-dépendant. La

suppression du calcium par chélation est la cause de la perte de la fonction du

recepteur GPIIb-IIIa [21, 48,49]. Des études [50] de plasmas et de sérums des

patients indiquent que l’agglutination des plaquettes par les agglutinines est

chélateur-dépendant. Les anticorps agglutinent les plaquettes quand on est en


26

présence de basse concentration de calcium, obtenu par le citrate, l’oxalate et

l’EDTA.

Le calcium est un constituant biologique important pour la membrane, il est

lié à des groupes multicarboxylates comme l’asparate, le glutamate et des

résidus de membrane protéine ou des groupes multi phosphates comme dans les

phospholipides et l’adénosine triphosphate. Additionné à des ions calcium, ce

dernier peut modifier la conformation de ces éléments. La concentration en ions

calcium est également importante pour certaines enzymes qui ont une incidence

sur la structure des membranes comme le cross linkage de protéines

membranaires par transamidation. A la surface du compartiment plaquettaire, le

calcium semble facilement échangeable avec le milieu environnant et la

concentration des ions calcium peut être affectée. Il est donc possible que la

chélation et l’épuisement de la membrane en calcium entraine un changement de

propriétés de la surface membranaire des plaquettes de sorte que des

« néoantigénes » formés réagissent avec les immunoglobulines. De telles

modifications membranaires semblent être causées par une rapide interaction

entre les agents de chélation et la membrane des plaquettes [28; 48; 49].

La liaison du calcium avec L’EDTA a aussi des répercussions sur la

formation du complexe GPIIb-IIIa.

L’ observation importante concernant le mécanisme d’ agrégation a été que

le sérum ou l’EDTA-plasma induit non seulement l’agglutination des plaquettes

du patient, mais induit également des agglutinations EDTA- plaquettes de la

quasi-totalité des personnes normales à l’ exception des plaquettes des patients

atteints de la maladie de Glanzmann. Cette maladie décrite pour la première fois


27

en 1918 par Glanzmann, est caractérisée par une absence d’agrégation des

plaquettes et est liée à un déficit quantitatif ou qualitatif en sites d’amarrage du

fibrinogéne (complexes GPIIb-IIIa) [2]. Ce qui suggère que la GPIIb-IIIa est

impliquée dans le phénomène de la pseudo-thrombopénie.

La constatation que l’EDTA-anticorps ne réagit pas avec des plaquettes de

patients atteints de la maladie de Glanzmann peut être utilisée dans le

diagnostic de cette maladie [40].

Un anticorps monoclonal a été mis en évidence qui ne reconnaît qu’un

épitope sur l’alpha IIb /IIIa beta intégrin, dont l’accessibilité a été porté aux

plaquettes suite à un traitement par l’EDTA [40].

Dans la pseudo-thrombopénie EDTA dépendante les anticorps plaquettaires

sont dirigés contre un déterminant antigénique de la membrane plaquettaire, site

de liaison normalement caché (cryptique) dans la GPIIb /IIIa est modifié par

l’EDTA ou exposé seulement en présence de l’EDTA [50-52].

Certains auteurs ont observé que les anticorps antiplaquettes ont été

associés à des anticorps antiphospholipides dans la plupart des patients testés

suggérant que l’anticorps antiphospholipide chargé négativement pourrait se lier

à des antigènes modifiés par l’ EDTA sur la membrane des plaquettes et pourrait

être responsable de pseudo-thrombopénies [22].

Dans la plupart des cas, aucune anomalie de la fonction plaquettaire n’a été

rapportée en association avec la pseudo-thrombopénie. Il a été démontré que les

plaquettes anormales des syndromes myéloprolifératifs sont beaucoup plus

sensibles à l’agglutination que les plaquettes normales en présence d’EDTA[8].


28

Une fois apparue, la pseudothrombopénie liée à l’EDTA a tendance à persister.

Elle peut toute fois être transitoire, en particulier dans les contextes infectieux

ou de prise médicamenteuse. En effet, les drogues comme la mexilétine,

l’abciximab , l’olanzapine et l’acide valproïque ont été signalés dans des études

comme étant liées à des pseudo-thrombopénies, mais leur physiopathologie

demeurent inexpliquées [53- 61].

Les pseudo-thrombopénies peuvent apparaître « isolées » ou inversement

« associées » à des affections auto-immunes, néoplasiques, ou infectieuses. Les

liaisons réelles avec les pathologies associées sont alors très discutées. Les

conséquences directes de la présence de ces anticorps semblent nulles : in vivo,

ils ne sont pas associés à des anomalies de l’hémostase primaire ni à des

anomalies quantitatives plaquettaires. In vitro, ils semblent sans retentissement

sur les fonctions plaquettaires. Leur signification réelle reste donc discutée. Il

pourra s’agir d’anticorps capable de reconnaître des antigènes cryptiques

plaquettaires exprimés uniquement par des plaquettes circulantes âgées ou lésées

comme dans le cas d’infections sévères favorisant leur élimination. Cependant il

est démontré in vivo qu’ils ne sont pas responsables d’un turnover plaquettaire

accru [4, 15].

Plusieurs cas ont été rapporté dans la littérature tel que la pseudo-

thrombopénie chez des patients présentant diverses infections et pathologies

(virus de la rubéole, l’hépatite A, cirrhose du foie, sepsis, mononucléose

infectieuse, syndrome de Guillain-Barré, myélomes multiples, infarctus du

myocarde, syndrome 48XXYY, syndrome immunodéficient acquis) [39, 62-92].


29

B- Satellitisme plaquettaire

B-1-Aspects morphologiques

Il s’agit d’un aspect morphologique rare à l’origine de pseudo-

thrombopénies à l’EDTA. Le satellitisme des plaquettes ou leur disposition en

rosette autour d’un globule blanc est une image facile à identifier. Elle ne peut

être confondue avec des globules blancs noyés au milieu d’une concentration

importante de plaquettes obtenue dans les plasmas riches en plaquettes.

Le globule blanc concerné par ce satellitisme est presque toujours un

polynucléaire neutrophile, mais il peut s’agir de façon exceptionnelle de

lymphocytes atypiques, de polynucléaires basophiles ou de monocytes . C’est un

phénomène souvent en relation avec un processus auto-immun, mais dans la

plupart des cas, étranger à une maladie spécifique. Sa signification clinique n’est

pas connue [8, 11, 89].

La phagocytose des plaquettes par les polynucléaires neutrophiles a été

signalée après étude microscopique optique ou électronique des rosettes. Et

pourrait être en relation avec le dysfonctionnement plaquettaire observé dans

certains cas. Lorsque se produit le satellisme plaquettaire, le taux plaquettaire est

modérément réduit conduisant à une pseudo-thrombopénie. La courbe de

distribution des plaquettes n’est pas cohérente dans la plupart des cas. Elle est

rétablie après un examen différentiel avec la courbe de distribution des globules

blancs, parce que les polynucléaires sont anormalement situé sur les graphiques.

Si les satellitismes plaquettaires sont grands, ils ne seront pas détectés par les

automates. Cela dépend de la sévérité de l’agrégation. L’examen d’un frottis


30

sanguin périphérique à faible grossissement est obligatoire pour chaque

leucopénie d’un échantillon de patient inconnu ou lorsqu’ on a une chute de la

numération des globules blancs de façon spectaculaire. L’étape de l’examen à

faible grossissement est souvent nécessaire pour faire la preuve de la présence

des éléments massifs. Un faux compte de globule blanc peut être la conséquence

de la diminution de polynucléaires neutrophiles (situé au sein des massifs) ou

l’artéfact de l’agrégation plaquettaire qui donne un faux compte élevé des

globules blancs. Le phénomène décrit ci- dessus est lié à l’EDTA et se produit

in vitro, il est tout à fait différent des agrégats plaquettes globules blancs qui

apparaissent in vivo dans plusieurs conditions inflammatoires, et thrombotiques.

L’essai en cytométrie de flux a été proposé pour énumérer les agrégats

plaquettes-globules blancs [8].

Le satellitisme est observé en quelques minutes après la collecte de sang

suivie d’une migration progressive des plaquettes à un pȏ le des polynucléaires

neutrophiles après une à trois heures initiant un amas de plaquettes collé au

polynucléaire neutrophile et finalement après quatre à six heures, on aura des

amas de liaisons plaquettes-polynucléaires d’une part et des amas de liaison

plaquettes libre dans le sang d’autre part. Ainsi selon le temps écoulé après

l’échantillonnage on va observé le satellitisme ou agrégats plaquettaires.

D’autres situations liées à l’EDTA ont été décrites sous le terme de

« satellitisme », mais de telles situations correspondent soit à des massifs

lymphocytaires ou à globules rouges [8].


31

B-2-Caractéristiques et mécanismes de formation du satellitisme

plaquettaire

B-2-1-Mécanisme de type immunologique

L’EDTA à basse température altère la conformation des glycoprotéines

plaquettaires et du récepteur du fragment cristallisable (Fc) des globules blancs

par chélation d’ions calcium. Dans ce phénomène sont impliqués des auto

anticorps de type IgG dirigés contre la glycoprotéine IIb/IIIa exprimé sur la

membrane plasmatique après activation plaquettaire, mais aussi contre le

récepteur Fc gamma RIII (FcγRIII) (CD16) des leucocytes. Cette double

spécificité a été confirmée par l’absence de réactivité de ces auto anticorps vis-à-

vis de plaquettes chez des patients atteints de thrombosthénie de Glazmann et

vis-à-vis des leucocytes chez des patients ayant une absence congénitale de

récepteur FcγRIII. L’EDTA va démasquer des cryptoantigènes qui vont être

accessibles aux auto anticorps. Dans le satellitisme, le fragment Fab de l’auto

anticorps va se fixer à la glycoprotéine IIb/IIIa et le fragment Fc au récepteur

FcγRIII des leucocytes, entrainant ainsi la formation de ponts entre les

plaquettes et les globules blancs.


32

B-2-1-a-Agglutination neutrophiles-plaquettes

Le satellitisme des plaquettes aux polynucléaires survient in vitro lorsque

l’échantillon sanguin est prélevé en présence d’EDTA, conservé et analysé à

température ambiante, mais ne survient pas si le prélèvement est maintenu à

37°C dès son recueil ou si le sang est prélevé en présence d’anticoagulants autre

que l’EDTA, comme l’héparine, le citrate et l’oxalate. Cependant des cas de

satellitisme plaquettaire survenus en présence de citrate et d’héparine ont été

décrits [19].

Ce phénomène n’est pas associé à une situation clinique particulière ou à

une prise médicamenteuse [89].

En outre aucune relation n’a été établie avec les anomalies de l’hémostase,

la présence d’auto anticorps spécifiques et non spécifiques d’organes, de facteur

rhumatoïdes, de cryoglubolines ou d’agglutinines froides.

Deux mécanismes sont proposés pour expliquer le phénomène de

satellitisme plaquettaire. Le premier consiste en un mécanisme immunologique

reposant sur la présence d’un auto anticorp. En effet, le phénomène est

reproductible par incubation du sérum ou du plasma EDTA provenant d’un sujet

présentant un satellitisme plaquettaire avec le sang d’un patient normal prélevé

en présence d’EDTA. Cette hypothèse est corroborée par les travaux de

Bizarraro et al [8] regroupant 14 patients ayant présenté un satéllitisme

plaquettaire. Les résultats de cette étude suggèrent que ce phénomène est médié

par des immunoglobulines d’isotypes G reconnaissant un épitope cryptogénique,

exposé en présence d’EDTA à température ambiante et localisé à la fois sur la


33

glycoprotéine GPIIbIIIa (CD41/61) de la membrane plaquettaire et sur le

récepteur Fcγ RIII(CD16) de la membrane du polynucléaire. La survenue du

phénomène en présence du fragment fab’2 des IgG prouve que la liaison est

indépendante du fragment Fc de l’immunoglobuline et que le même reconnu au

niveau des plaquettes et des polynucléaires.

Pour le satellitisme des plaquettes autour des monocytes, des cellules

Natural Killer (NK), des polynucléaires basophiles et des polynucléaires

éosinophiles, les renseignements obtenus dans la littérature sont contradictoires.

En effet il y’a certains auteurs qui soutiennent l’existence de satellitisme

plaquettaires au lymphocytes, des monocytes et des cellules du lymphomes avec

un mécanisme impliquant des Immunoglobulines et le récepteur CD16 en tant

que médiateurs pendant que d’ autres auteurs soutiennent que bien que le

récepteur FcγRIII soit présent à la surface des monocytes, des cellules NK et

des polynucléaires neutrophiles, seuls ces derniers sont impliqués dans le

phénomène de satellitisme plaquettaire. Deux types de récepteurs FcγRIII codés

par deux gènes différents ont été décrits. Seul le récepteur FcγRIIIb présent sur

la membrane polynucléaire neutrophile posséderait l’épitote crytogénique

reconnu par les anticorps précédemment décrit, contrairement au récepteur

FcγRIIIa existant à la surface des monocytes et des cellules NK [8, 11].

De grands agrégats contenant plusieurs plaquettes observés, semblait être la

fin d’un processus évolutif amorcé par un satellitisme plaquettaire typique

autour des polynucléaires neutrophiles. Le nombre de cas signalés est faible et

les études qui traitent de cet artéfact sont rares et ne permettent pas d’avoir une

compréhension définitive sur ce mécanisme d’agglutination. Certains auteurs

décrivent des interactions plaquettes leucocytes in vivo et leur importance bien


34

reconnue dans la modulation de l’inflammation et de l’hémostase [89]. De temps

en temps et seulement dans des conditions particulières, les plaquettes peuvent

agir réciproquement avec des complexes polynucléaires neutrophiles formant

des complexes qui peuvent mener à une pseudo-thrombopénie. Le phénomène

était évident quand le sang était traité avec EDTA comme anticoagulant et

incubé à température ambiante (Figure 5).

Un film capillaire de sang exécuté sans EDTA n’a pas révélé de satellitisme

plaquettaire. Le sang avec l’oxalate d’ammonium est normal [89].

Figure 5 : Image illustrant le satellitisme plaquettaire autour de deux

polynucléaires neutrophiles [39].


35

B-2-1-b-Satellitisme plaquettaire aux lymphocytes à grains

Certains lymphocytes semblent être impliqués dans le satellitisme

plaquettaire (figure 6A et B), en effet l’étude de Espagnol et al [8, 39] met en

évidence un satellitisme plaquettaire à la fois autour des polynucléaires

neutrophiles et de lymphocytes à grains. Ces lymphocytes (de phénotype NK)

présentent le marqueur CD16, ce qui permet de conclure à la même hypothèse

mécanique que le satellitisme autour des polynucléaires neutrophiles.

L’originalité de l’observation réside dans le fait que le satellitisme touche

exclusivement les lymphocytes atypiques, ce qui permet d’évoquer une liaison

entre le satellitisme et la pathologie lymphomateuse. Un tel phénomène a déjà

été rapporté pour un contexte du lymphome du manteau sur une population de

cellules B monoclonales exprimant les marqueurs CD5 et CD20. Les cellules

lymphomateuses des patients expriment également le marqueur CD20. Ce qui

pourrait faire évoquer la présence d’un antigène crytogénique commun à

GPIIb/IIIa et à CD20. Mais CD20 est présent sur toute la ligneée B, cette

hypothèse ne permet donc pas d’expliquer le caractère exclusif du satellitisme

vis-à-vis des lymphocytes atypique. Enfin la dernière hypothèse envisagée pour

expliquer le phénomène de satellitisme plaquettaire limité aux cellules

lymphomateuses serait la reconnaissance par l’immunoglobuline monoclonale

sécrétée par les lymphocytes atypiques, d’un antigène cryptogénique exprimé

par les plaquettes. Ce cas original de satellitisme des plaquettes aux lymphocytes

atypiques constitue un autre exemple de pseudo-thrombopénie EDTA

dépendante, à coté des agglutinations des plaquettes ou du satellitisme des

plaquettes aux polynucléaires neutrophiles [91].


36

Figure 6A et B : Image illustrant le satellitisme des plaquettes autour des

lymphocytes atypiques (frottis sanguin coloré au May-Grünwald-Giemsa :

grossissement x 1 000) [39].


37

B-2-2-Mécanisme non immunologique

Le mécanisme non immunologique du satellitisme implique la

thrombospondine, mais aussi d’autres protéines des granules α des plaquettes,

telle que la P sélectine, qui sous l’effet d’un stimulus d’activation vont être

rapidement exprimées à la surface plaquettaire favorisant ainsi l’ adhésion des

plaquettes aux leucocytes[11].

En étudiant les plaquettes d’un sujet présentant un satellitisme plaquettaire,

certains auteurs ont constaté que les plaquettes impliqués dans le satellitisme

sont fortement marquées par des anticorps monoclonaux murins dirigés contre la

thrombospondine de surface et intracellulaire, alors que les plaquettes non

impliquées sont faiblement ou non marquées [11, 89].

Le stimulus d’activation est présent et est rapidement exprimé sur la surface

plaquettaire favorisant l’adhésion aux neutrophiles. Les biologistes devraient

être conscients qu’un certain nombre de thrombopénies d’étiologie incertaine

peut être artéfactuelles dans des conditions particulières telles que le satellitisme

plaquettaire.


38

III-Les Pseudo-thrombopénies EDTA indépendantes

A-Les Pseudo-thrombopénies de nature auto-immune

A-1-Les cryoglobulines

Les cryoglobulines sont constituées d’immunoglobines monoclonales ou

polyclonales ou de complexes immunoglobuliniques qui forment un précipité à

basse température. Cette précipitation est réversible et le précipité se redissout

au réchauffement. Le mécanisme de la cryoprécipitation est mal connu, faisant

intervenir des forces d’interaction moléculaires liées aux structures tertiaires ou

quaternaires des molécules. Il existe trois groupes de cryoglobulines :

Les cryoglobulines monoclonales (type I), ce sont surtout les IgM, parfois

IgG, rarement IgA. Leur concentration est souvent élevée (> 5g /l). Elles se

voient surtout au cours des hémopathies malignes et représentent 25% des cas de

cryoglobulinémies.

Les cryoglobulines mixtes monoclonales et polyclonales (type II) sont

constituées d’Ig appartenant à deux classes différentes, l’une monoclonale,

l’autre polyclonale, formant un complexe immun. Leur concentration varie de 1

à 5g /l. Elles représentent 50% des cas de cryoglobulinémies et peuvent être soit

des IgM monoclonale plus IgG polyclonales ou l’IgM a activité anti-IgG de

type facteur rhumatoïde (les plus fréquentes), soit des IgG monoclonale plus IgG

polyclonale ou l’IgG monoclonale a activité anti-IgG, soit des IgA monoclonale

plus IgG polyclonales ou l’IgA monoclonale a une activité anti-IgG (les plus

rares).


39

Enfin les cryoglobulines mixtes polyclonales (type III), ce sont le plus

souvent des complexes IgM polyclonales plus IgG polyclonales avec une

activité facteur rhumatoïde des IgM. Elles sont habituellement de faible

concentration (<1g/l). Elles représentent 25% des cas des cryoglobulinémies.

Les techniques d’immunofixation mettent en évidence des cryoglobulines faites

d’Ig polyclonales associées à des Ig oligoclonales, notamment dans les

infections virales (VIH, hépatite C).

Tous les types de cryoglobulines sont susceptibles d’interférer sur

l’hémogramme. Toutefois, l’interférence est d’autant plus probable que la

cryoglobuline précipite rapidement et à température proche de la température

ambiante. La concentration de la cryoglobuline n’est pas toujours en rapport

avec le déclenchement de l’interférence.

Dans le sérum, les particules de cryoglobulines ont un volume compris

entre 3et 25fl avec un pic de fréquence entre 5et 10 fl. Dans le sang, il n’est pas

exclu que les précipités de cryoglobulines puissent incorporer d’autres cellules,

notamment des plaquettes. Les particules les plus volumineuses englobant

éventuellement des plaquettes, peuvent fausser la numération des leucocytes.

L’interférence est habituellement levée après incubation 30 minutes à 37°C, à

prolonger si besoin (nous conseillons toutefois de ne pas dépasser 2heures pour

éviter une altération des cellules du sang).

Avec les appareils Bayer Technicon™ (détection optique des cellules du

sang fondée sur le principe de la diffraction d’un rayon lumineux), les

cryoglobulines se manifestent essentiellement par une interférence au niveau de


40

l’origine de distribution en volume des plaquettes (événements proche de 2fl)

conduisant à un volume plaquettaire moyen anormalement bas.

Avec les appareils Coulter™ (détection des cellules du sang par variation

d’impédance), le principal indice permettant de suspecter une cryoglobulinémie

est la présence d’une numération leucocytaire élevée, constamment associée à

une alarme qui signe une interférence par des éléments de faible volume détecté

au niveau de l’histogramme différentiel des leucocytes. Une incidence sur la

distribution plaquettaire est possible mais inconstante, s’accompagnant alors de

l’alarme qui signifie que la distribution en volume des plaquettes est atypique

(prédominance d’évènements de faible volume en l’occurrence). Il est à noter

que les fausses hyperleucocytoses rapportées dans la littérature avec les

appareils Coulter™ sont parfois transitoires ou intermittentes [93].

Certaines cryoglobulines IgM monoclonales (type I) ont une activité

agglutinine froide vis-à-vis des hématies (IgM kappa anti-I), et peuvent de ce

fait interférer aussi dans leur analyse.

D’un point de vue morphologique, les cryoglobulines sont habituellement

visibles à l’état frais entre lame et lamelle. Elles se présentent comme des

particules à contours irréguliers faiblement réfringents, ou plus rarement comme

des cristaux de formes variées, aiguilles, cristaux courts « écailles ». Sur frottis

coloré au MGG, elles sont rarement identifiables. Elles prennent la forme de

petits précipités grisâtres, des sphères extracellulaires bleuâtres, de particules

amorphes rosées ou de corpuscules situés dans le cytoplasme des polynucléaires

neutrophiles. La nature des inclusions contenues dans le cytoplasme des

polynucléaires neutrophiles a été étudié pour un cas de cryoglobulinémie de


41

type I constituée d’une IgG monoclonale à chaine légère lambda. La technique

d’immunomarquage utilisée a permis de montrer que ces inclusions étaient

constituées de l’immunoglobuline monoclonale gamma2lambda2

cyoprécipitante[93,94].

A-2-Activité agglutinine froide des cryoglobulines IgM monoclonale

(type1) vis-à-vis des plaquettes

L’agglutinine froide est présente dans le sérum et le plasma, c’est une

immunoglobuline qui est adsorbé par les plaquettes en absence de cations

bivalents, et réagit seulement à une température inférieure à 37°C. Elle agglutine

les plaquettes mais apparait sans effet sur la fonction plaquettaire in vivo, et elle

peut être à l’origine d’une pseudo-thrombopénie [94-97].

Une étude de Watkins et Shulman [97] décrit le phénomène d’agglutination

plaquettaire responsable de la pseudo-thrombopénie chez cinq patients. Cette

agglutination est causée par une protéine anormale qui s’attache aux plaquettes à

une température inférieure à 37°C et qui a les caractéristiques physiques et

immunologiques des immunoglobulines. Cette protéine n’a aucun effet

démontrable sur la fonction plaquettaire in vivo. La présence d’un agent

agrégeant a été mise en évidence devant la discordance des comptes

plaquettaires sur automate et au microscope. Après le constat de l’agglutination

à la température ambiante, une attention particulière a été faite pour déterminer

l’agglutinine responsable. Deux des cinq patients ont un carcinome métastasique

sans anomalie protéique détectée. Les trois autres ont des pathologies associées

à un taux élevé de gammaglobulines et de cryoprotéines. Un certain nombre de

substances de bas poids moléculaire sont connus pour agglutiner les plaquettes


42

in vitro : adenosine diphosphate, adenosine triphosphate, norépinéphrine, 5-

hydroxytriptamine et epinephrine hydrochloride. Mais les agglutinines décrites

chez ces patients sont des substances qui ont un poids moléculaire élevé, et dont

le mécanisme ne dépend pas de la présence de calcium, ni de magnésium pour

agir. Le type d’anticoagulant utilisé n’a donc aucun effet sur l’agglutination.

L’agglutinine froide décrite est présente dans le sérum, ne requière pas de

pH acide pour son activité, elle réagit en absence de cations divalents en

s’adsorbant sur les plaquettes par ses propriétés physicochimiques coïncidant

avec les protéines de type immunoglobuline, et il est prouvé que c’est une

gammaglobuline par des techniques immunologiques.

Le mécanisme est aussi immunologique, mais non imputable à L’EDTA. La

formation d’agrégats plaquettaires est sous la responsabilité d’un auto anticorps

de type agglutinine froide qui apparait dans les maladies auto-immunes. Il s’agit

d’une thrombocytoagglutinine, car elle est dirigée contre les plaquettes.

L’agglutination des plaquettes EDTA-indépendante, est un phénomène

spontané rare et moins souvent décrit. Les agglutinines froides ont été

caractérisées par les techniques d’ELISA, immunostaining et western blott.

Aucun cas d’hémorragie, ou de thrombose n’a été rapporté en relation avec la

pseudo-thrombopénie EDTA indépendante. De précédentes études ont suggéré

l’association entre l’agglutinine froide et des maladies infectieuses. En général

la plupart des agglutinines froides ne sont pas bien caractérisés. La présence

d’agglutination plaquettaire a précédemment été visualisée seulement par

comptage manuel et par des compteurs cellulaires automatiques. Grace à

l’utilisation du cytomètre en flux, il a été possible de visualiser l’agglutination


43

plaquettaire à des températures inférieures à 37°C. L’anticorps responsable de

l’agglutination à froid a un titre relativement bas (réactif à la dilution 1,5 à

22°C).Dans l’étude initial du phénomène de Watkins et Shulman [110], en

compatibilité avec des études précédentes, la classe d’immunoglobuline qui a

été identifié responsable de l’attache des plaquettes et l’anticorps du sérum

comme étant IgM. Watkins et Shulman ont déterminé que l’anticorps avait un

poids moléculaire supérieur à 100kDa. En utilisant la technique de blocage

compétitif, dans une analyse de cytométrie en flux, il a été démontré

l’agglutination des plaquettes EDTA indépendante. Dans le cas actuel pourrait

être bloquée antérieurement par une addition d’Anticorps monoclonal dirigés

contre la GPIIbIIIa (antiCD41), soutenant plus loin le complex GPIIb comme le

site d’attache pour les agglutinines froides. Il a été déterminé que les plaquettes

du patient fonctionnaient essentiellement normalement. Donc ce qui met l’étude

en accords avec des rapports précédents qui n’indiquait pas d’hémorragie, ni de

thrombose en relation avec les agglutinines froides. Des études d’amplitude

thermique de ce cas étudié ont indiqués que l’anticorps avait peu d’activité au-

dessus de 30°C. C’est probablement pour cela que ces patients ne subiront pas

de complications cliniques avec les agglutinines froides. Il peut cependant poser

un problème dans les circonstances inhabituelles, comme la chirurgie cardiaque

avec hypothermie.


44

B-Les Pseudo-thrombopénies de nature physique

-Les macrothrombocytes ou plaquettes géantes

Par mécanisme physique il est question d’anomalies de détection des

plaquettes du fait de leur taille ou de leur volume. Les comptages par

impédancemétrie ignorent les méga ou macrothrombocytes. L’automate XE-

2100™ de Sysmex utilise une double mesure optique (une diffraction à petit

angle renseignant sur le volume et une émission de fluorescence), permettant

ainsi de supprimer ce type de piège dans la majorité des cas. En dernier recours,

seule la numération en cellule de comptage au microscope optique permet de

contrôler la numération plaquettaire [11] (Figure 7).

Dans des cas normaux et dans plusieurs situations pathologiques, certaines

plaquettes ont un grand volume. Les automates considèrent les particules ayant

un volume compris entre 30 et 36fl comme des plaquettes. En prenant en compte

ces automates et les échantillons sanguins certaines plaquettes pourront être

oubliées. Dans les situations pathologiques comme les syndromes

myélodysplasiques il faudra faire attention aux plaquettes qui sont de taille

proche des globules blancs et risquent d’être énumérer comme tel. La présence

des plaquettes géantes héréditaires peuvent être à l’origine de pseudo-

thrombopénies [99].

Cependant la non prise en compte des macroplaquettes est un défi réel dans

les états de thrombopénie comme la bonne numération plaquettaire est d’une

importance pour les hématologistes. Dans tous les cas une amélioration

considérable doit être faite pour différencier les larges plaquettes des autres


45

particules. Si on a un grand nombre de plaquettes l’alternative est l’utilisation

des marqueurs immunologiques qui requière l’utilisation de cytomètre en flux

avec une éventuelle utilisation en routine au laboratoire [8].

Figure 7: Image illustrant un frottis sanguin coloré au MGG (grossissement

X100) montrant une plaquette géante [99].

C-Les Pseudo-thrombopénies de nature chimique

Dans ce type de phénomène, les plaquettes in vitro chez un malade donné se

constituent aussi en agrégats. C’est un phénomène non immunologique,

indépendant de l’EDTA ou du citrate conventionnel utilisé en coagulation et

irréversible. La formation d’agrégats dans ce cas est due à une augmentation du

pH dans le tube au cours du temps correspondant à un phénomène

d’alcalinisation du milieu. Pour avoir un comptage exact, il faut prélever le sang

sur un tube avec un citrate spécial dit « citrate acide » [11,100].


46

TTrrooiissiièèmmee ppaarrttiiee CCoonndduuiittee àà tteenniirr ddeevvaanntt uunnee ffaauussssee tthhrroommbbooppéénniiee


47

I-Réalisation d’un frottis sanguin

Elle est systématique devant toute thrombopénie. Le frottis sanguin consiste

en la réalisation d'un étalement monocellulaire des éléments sanguins (figure 8).

Dans tous les cas, il faut réaliser un frottis sanguin coloré au MGG pour d’ une

part apprécier la morphologie plaquettaire et la taille (anisocytose

physiologique, macro plaquettes et plaquettes géantes) et d’autres part

rechercher des amas plaquettaires (figure 9) et enfin analyser les éléments

leucocytaires et érythrocytaires.

Figure 8 (A,B,C,D) : Etapes de réalisation d’ un frottis sanguin[101].

Placer une petite goutte de sang frais à une extrémité d'une lame de

microscope (A). A l'aide d'une seconde lame placée à un angle de degré, toucher

légèrement à la goutte jusqu'à ce que le sang s'étende sur toute la largeur de la

seconde lame (B). Puis, faire glisser la seconde lame rapidement jusqu'à l'autre


48

extrémité de la première lame (C). Le résultat devrait être un frottis mince avec

une bordure irrégulière tel qu'illustré (D).

Frottis Normal Amas de Plaquettes

Figure 9 : Image illustrant les frottis colorés au MGG montrant un frottis

normale (A) et des amas plaquettaires (B) [101].

II-Détermination du type de pseudo-thrombopénie

Le prélèvement de sang sur un anticoagulant autre que l’EDTA (citrate de

sodium, héparinate de lithium, oxalate d’ammonium ou citrate de sodium avec

un pH plus acide peut être proposé) permet de déterminer le type de pseudo-

thrombopénie. Ainsi nous aurons une pseudo-thrombopénie EDTA- dépendante

si le compte plaquettaire redevient normal avec disparition des amas


49

plaquettaires après observation sur frottis, et une pseudo-thrombopénie EDTA-

indépendante si le compte plaquettaire reste bas et le maintient des amas

plaquettaires après observation sur frottis.

A-Prélèvement sur tube citrate à 10%

Le citrate de sodium neutralise les ions calcium en le liant pour former un

complexe non ionisé (citrate de calcium). Le citrate de sodium à 10% permet

d’effectuer quasi toutes les analyses sur plasma pour l’exploration de

l’hémostase. Comme c’est un anticoagulant liquide il est important que les tubes

soit correctement rempli afin de respecter le facteur de dilution.

B-Prélèvement sur tube héparine

Cet anticoagulant naturel est utilisé en thérapeutique inhibe la coagulation

en agissant comme une antithrombine en empêchant la transformation de

prothrombine (facteur II de la coagulation) en thrombine (facteur II activé). Les

tubes héparinés sont rarement utilisés (figures 12 et 13).


50

Figure 10 : Image illustrant un frottis obtenu après usage de l’EDTA [10].

Figure 11: Image illustrant un frottis après usage de l’héparine de lithium

avec le même échantillon [10].


51

C-Autres investigations d’une pseudo-thrombopénie induite par

l’EDTA

L’utilisation de la théophilline à une concentration supérieure à 7mg/ml chez

des patients normaux a produit un compte plaquettaire similaire à celui de la

mixture théophilline-héparine et de l’EDTA. Chez les patients qui ont présenté

une pseudo-thrombopénie avec l’EDTA, après traitement avec la théophylline

le compte plaquettaire est normal et demeure inchangé six heures après le

prélèvement. Une observation au microscope a permis d’observer des agrégats

plaquettaires sur les frottis ou l’anticoagulant utilisé est l’EDTA. Par contre

aucune agrégation dans le sang ou l’anticoagulant est la théophylline. La

conclusion est que la théophylline peut être utilisée pour l’investigation d’une

pseudo-thrombopénie quand on utilise un automate [102, 103].

Certaines études ont fait mention de l’utilisation du sulfate de magnésium

MgSO4 comme anticoagulant pour la numération plaquettaire en cas de pseudo-

thrombopénie EDTA dépendante [106].

En outre, d’autres éléments comme les antibiotiques comme la kanamycine,

et les aminoglycosides ont été répertoriés par des auteurs comme ayant des

capacités de dissociation de l’agrégation plaquettaire [104-111].


52

III- Comptage manuel

Un comptage au microscope optique (cellule de Malassez après dilution à

l’aide du système unopette) peut s’avérer nécessaire en cas d’impossibilité de

l’automate à réaliser la numération plaquettaire, en particulier en cas de

macroplaquettes non comptabilisées. Bien que cette méthode ait été longtemps

reconnue comme le gold standard pour compléter les plaquettes, elle nécessite

un certain apprentissage (les plaquettes apparaissent comme des éléments

réfringents peuvent être confondus avec des débris cellulaires) et reste sujette à

une grande variabilité. D’ailleurs, le coefficient de variation rapporté dans la

littérature est situé entre 15 et 25% ce qui en fait une technique peu

reproductible.

IV-Comptage immunologique

Le comptage immunologique des plaquettes par cytométrie en flux est

maintenant proposé comme nouvelle méthode de référence. Le principe repose

sur une analyse cellulaire après marquage des plaquettes par un anticorps

spécifique (anti-GPIIbIIIa, anti-GPIb) couplé à un fluorochrome. La

quantification des plaquettes s’effectue alors, en faisant un rapport entre les

événements marqués et soit les hématies, soit des billes mises en quantité

connue dans le tube. Cette méthodologie est décrite comme plus sensible et

reproductible. Elle est utile et son utilisation est proposée afin d’affiner la

précision des valeurs rendues en cas de thrombopénie.


53

V-Conduite à tenir devant une pseudo-thrombopénie EDTA-

dépendante

La réalisation du frottis sanguin et le changement d’anticoagulant sont les

deux éléments qui permettent de constater avec certitude la pseudo-

thrombopénie EDTA- dépendante.

L’observation du frottis sanguin et l’analyse du cytogramme de comptage

des plaquettes (en particulier la courbe de répartition de la taille ou de volume

de la population plaquettaire) permettront de déterminer s’il s’agit d’agrégats

plaquettaires ou de satéllitisme plaquettaire.

L’observation du frottis, le comptage manuel ou immunologique et

recomptage automatique en utilisant un autre anticoagulant sont les procédures

recommandées pour pouvoir valider le compte plaquettaire. Il faut tenir compte

du facteur de dilution si l’anticoagulant utilisé est le citrate.

VI-Conduite à tenir devant une pseudo-thrombopénie EDTA

indépendante

Dans le cas de la réalisation de frottis après un changement d’anticoagulant

qui maintient la présence d’amas plaquettaires, et le compte plaquettaire bas, il

est recommandé de chauffer le tube de prélèvement à 37°C pendant une demie

heure au bain marie. Un compte plaquettaire manuel ou immunologique et par

l’automate doit être effectué, si le phénomène persiste.


54

VII-Arbre décisionnel pour la prise en charge des fausses

thrombopénies.

Compte plaquettaire bas

Réalisation d’un frottis sanguin

Amas plaquettaires sur EDTA

Numération des plaquettes sur tube

citrate

Persistance des Amas

Diagnostic de Pseudo-thrombopénie

EDTA-indépendante

Chauffer le tube à 37°C au

bain marie 30 minutes

Absence des Amas et/ou le taux des

plaquettes augmente

Diagnostic de Pseudo-thrombopénie

à l’ EDTA

Tenir compte du facteur de

dilution

Disparition des Amas Persistance des Amas

Comptage manuel et

immunologique

Diagnostic d’une

thromboagglutinine

Possible : observation des

plaquettes géantes

Diagnostic :

Micro caillots

Problémes de prélèvement

Rendre : Amas plaquettaires

Refaire le Prélèvement


55

CONCLUSION

Au terme de notre travail, nous pouvons conclure que la numération

automatique des plaquettes bien qu’elle soit plus précise que les méthodes

manuelles, peut entrainer des erreurs par défaut que sont les pseudo-

thrombopénies. C’est un phénomène in vitro survenant dans le tube de

prélèvement qui n’entraine aucun risque pour le patient, c’est un artéfact de

laboratoire qui ne s’accompagne jamais de phénomène hémorragique.

Leur méconnaissance peut aboutir à des décisions d’ordre clinique inutiles

et nocives. En effet des pseudo-thrombopénies méconnues à l’EDTA ont

entrainés des investigations complémentaires dont la ponction médullaire, des

bilans d’auto-immunité itératifs, des traitements inefficaces au long cours par les

corticoïdes, voire même des cas extrêmes de splénectomie. Cependant, la

conséquence la plus fréquente est une interruption d’intervention chirurgicale ou

un report des examens invasifs par découverte d’une thrombopénie dans le bilan

préopératoire [11].

Le biologiste doit donc toujours rester vigilant à ce phénomène de fausse

thrombopénie. C’est un piège diagnostique à connaitre. Pour pouvoir se

prémunir contre ces pièges, des procédures strictes peuvent être proposées.

C’est dans cette démarche que s’est inscrit notre travail, qui après avoir expliqué

les mécanismes de ce phénomène, a proposé un arbre décisionnel. Ainsi en

présence d’agrégats plaquettaire qu’ils soient EDTA dépendant ou non EDTA

dépendant, la procédure en plusieurs étapes nous permet d’obtenir le taux réel

des plaquettes.

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