Hématologie biologique en 2013:

du microscope au séquençage de nouvelle génération à

haut‐débit.

L.MauvieuxLaboratoire d’HématologieEA3430Faculté de Médecine de StrasbourgPôle de biologieCHRU Strasbourg

ACNBH

ODPC N°1495

DECLARATION D’INTERETDANS LE CADRE DE MISSIONS DE FORMATION 

REALISEES POUR L’ACNBH

42ème Colloque National des Biologistes des HôpitauxStrasbourg, 1‐4 octobre 2013

Pr Laurent MauvieuxExerçant au  CHU de Strasbourgdéclare sur l’honneur 

ne pas avoir d'intérêt, direct ou indirect (financier) avec les entreprises pharmaceutiques, du diagnostic ou d’édition de logiciels susceptible de modifier mon jugement ou mes propos, concernant le DMDIV et/ou le sujet présenté.

L’invention de la microscopieAntoni van Leeuwenhoek (1632‐1723)

Arcana Natura Detecta, Delphes, 1695

X300, résolution 1,4µm 

• Nombreux travaux de physiologie sanguine

• Elabore les principes fondamentaux de l’hématimétrie

• Caractérise les anémies

• Dr Cholera

Georges Hayem(1841 ‐1933)

Les automates d’hématologieTechnologies utilisées

Focalisation hydrodynamiqueImpédance numération et volumesRadiofréquence complexité cellulaireSpectrophotométrie mesure HbDiffraction laser numération, volumes, contenusFluorescence laser contenu, ARN, ADN, marqueurs de surfaceCytochimie (perox) contenu

Sysmex XN

La cytométrie en flux

• développée en 1968 dans l’université de Münster et commercialisé par PhyweTM

en 1969

• FACS BD 1974

• EPICS Coulter 1977

• Très forte intégration de analyseurs

18 couleurs, 5 lasers10 couleurs, 4 lasers

BD LSRFortessa ™Gallios™

• Etude des sous-populations lymphocytaires• Onco-hématologie:

– Typage des hémopathies• score de Matutes (syndromes lymphoprolifératifs), score EGIL (LA)

– Recherche des cibles thérapeutiques:• Rituximab – Mabthera® (anti-CD20)• Alembtuzumab –Campath® (anti-CD52)• Gemtuzumab (anti-CD33)

– Contenu en ADN (cycle cellulaire / LAL de l’enfant)– Diagnostic des hémoglobinuries paroxystiques nocturnes (déficit prot

Gpi)– Recherche de transporteurs de drogues (P-gp / phénotype MDR)– Fonctions plaquettaires, microparticules membranaires….

La cytométrie en flux en hématologie

3 applications récentes

• Recherche d’anomalies des protéines membranaires du globule rouge

• Recherche de l’activation fonctionnelle de p53

• Maladie résiduelle dans les leucémies

1) Sphérocytose héréditaireTest à l’Eosine 5’maléimide (EMA) 

– anémie hémolytique chronique

– déficit de protéines membranaires du GR => perte membranaire

– CCMH augmentée (>36g/dl)

– présence de sphérocytes sur le frottis sanguin 

– Examen de référence: Ektacytométrie (Kremlin‐Bicêtre)

Maladie autosomique dominante dans 75% des cas; 1/5000 naissances  

Protéine Bande 3, Ankyrin, Protéine 4.2, Spectrine

Test à l’EMA

Test à l’EMARésistance Globulaire Pink test

Sensibilité 93‐96 % 66‐74 % 91%Sensibilité 95‐99 % 71%Conservation pré‐analytique 72 heures 2 heures 2 heures

‐ Colorant fluorescent se fixant aux    protéines Band3

‐Coloration proportionnelle  à la quantité de protéine Band 3, et donc àla surface membranaire‐Un défaut de 10% de fluorescence est en faveur du diagnostic‐Quelques faux positifs: elliptocytose et pyropoikilocytose, rares dysplasies congénitales

Evèn

emen

ts

Fluorescence

Témoin

Sphérocytose

2) Etude fonctionnelle de la voie p53 dans les LLC

• p53: facteur de transcription induisant l’apoptose ou l’arrêt du cycle cellulaire en réponse àl’altération de l’ADN

• Fréquentes délétions et mutations de TP53 dans les LLC (FISH; 17p)

• Associé à:– Une instabilité chromosomique

– une résistance à la fludarabine

• Confèrent un pronostic défavorable

Fludarabine

Incorporation dans l’ADN

Cassures double brin

Activation de la voie p53

Apoptose

Etude fonctionnelle de TP53LLC après 24h de culture cellulaire en présence d’Etoposideet de Nutilin ‐3a

Profil normal(induction TP53)

Profil anormal(haut niveau basal,faible induction)

Profil anormal(aucune induction)

M Le Garff‐Tavernier et al., Blood Cancer Journal (2011)

3) Maladie résiduelle dans les leucémies aigues myéloïdes par CMF

• Virtuellement applicable à tous les patients– Y compris en l’absence de marqueurs moléculaires

• Expression des marqueurs d’immaturité (CD34; CD117; CD133)

• Expression d’antigènes aberrants:– Lignée 

– Asynchronisme de maturation

– Expression augmentée ou diminuée

• Rapide, sensible (seuil 0,1%)

LAM faible risqueMRD induction 2

mois

mois

LAM bon risque élevé

517 patients inclus27 centres

LAM risque intermédiaireMRD induction 2

Vers le futur: la cytométrie de masse ?

Scott TannerDVScience TM

Anticorps couplés à des isotopes stables de métauxEuropiumStrontium…

1

2 Dont la masse peut‐être mesurée très précisementpar spectrométrie de masse

L’idée: coupler la spectrométrie de masse atomique avec le marquage cellulaire

• Cellules marquées introduites dans torche àplasma 

• Les masses atomiques des ions des métaux sont analysés par spectrométrie de masse

• jusqu’à 100 Ac différents analysées  simultanément (100,000 cellules en 4 minutes)

DVScience Cytof II TM

Mass spectrometry analysis

• Analyse multidimensionnelle

– Immunophénotype

– Signalisation cellulaire

– Expression de cytokines…

L’étude du génome1) Cytogénétique

2) Biologie moléculaire

Etapes de la cytogénétique

• 1888: Waldeyer découvre les chromosomes

• 1902: Theodor Boveri propose que les tumeurs pourraient être liées à la mauvaise ségrégation des chromosomes

• Années 50: Utilisation de techniques de culture cellulaire

• Banding en 1969=> identification de la t(9;22) dans la LMC

• 1977: essor de la FISH

• 2004: premiers CGH‐Array (comparative genomic hybridization)

Origine génétique acquise des leucémies:remaniements génomiques

Leucémie myéloïde chroniqueFISH interphasique BCR‐ABL

Peinture chromosomique

MULTI‐FISH

Cytogénétique moléculaire

Classification  OMS (WHO) 2001/2008

CBF, RARa

Caryotype normal

Anomalies de MLL, del 5q, del 7

Biologie moléculaire des hémopathies malignes

• Approches: PCR, RT‐PCR et séquençage• Diagnostic:

– Recherche de transcrits de fusion: ex. BCR‐ABL;– Mutations ex:  JAK2 / polyglobulies primitives– Expression anormales de gènes ex: Cycline D1/ LNH du manteau  

• Pronostic– Mutation du domaine Tyr kinase d’ABL / LMC résistantes 

au GLIVEC– Mutations de FLT3, CBF dans les LAM classification WHO 2008

• Suivi des patients : maladie résiduelle:– Quantification transcrit BCR‐ABL– Recherche de clonalité lymphoide

Les limites de la « biomol »

• Onéreux, long

• Cibles en augmentation constante (hématologie et tumeurs solides)– Tests compagnons pour les traitements

– Marqueurs « théranostiques »

• Organisation des plate‐formes ont trouvéleurs limites

• Besoin d’approches plus puissantes, plus globales

Approche globalele séquençage « génome entier »Next Generation Sequencing (NGS)

• Recherche des anomalies génétiques (variants) à l’échelon du génome

• Séquençage du génome entier (whole genomesequencing)

• Séquençage direct des ARNm (RNA‐seq)• Séquençage des microARN• Séquençage des séquences d’ADN methylées(CHIP‐seq)

Séquençage « Sanger »Dideoxynucléotides bloquant l’élongation d’une matrice d’ADN

Radiomarqués:P32, P33

Fluorescentsprix Nobel de chimie en 1980

27

2010: 6K$, 2009: Illumina, Helicos40-50K$

Séquençons le Génome HumainLo

g (p

rix)

201020052000

10

8

6

4

2 2014: 1000$?, <24 hrs?

2008: ABI SOLiD60K$, 2 weeks

2007: 4541M$, 3 months

2001: Celera300M$, 3 years

2001: Human Genome Project (HUGO)3 milliard $, 10 ans

James Watson's genome2008 

Le séquençage Haut‐Débit, c’est quoi?

• Approche miniaturisée:– Densité de séquences: ~10.000/ mm2

• Massivement parallèle:– Plusieurs millions de séquençage simultanés possibles, voire plusieurs milliards…

• Productions de quantités impressionnantes de données: de 35 millions de bases à 600 Gb par réaction de séquençage (« run »)

Taille du génome humain ~3 Gb de paires de nucléotides

Approche 454 (Roche Ltd)

Etapes principales

• Fragments d’ADN capturés sur une bille

• PCR en émulsion (huile/eau)

• Réaction de pyroséquençage: production de photons capturés par une caméra CCD

• Production d’un « flowgram »

Solexa/ Illumina• Fragments d’ADN 

capturés sur une surface solide

• Chaque brin est multiplié(clusters)

• Chaque cluster correspond à 1 séquence

• Capture par caméra CCD

Approche semi‐conducteurs Proton /PGM (Life technologies™)

Incorporation d’un nucléotide

Génération d’un proton H+

1 proton = 1 base, signal intégré dans un microprocesseur

Particularités du NGS• « profondeur » de séquençage

• « Etiquettes » des ADN: Multiplexage (=> 96)

• Ciblage possible des régions séquencées:– « amplicons »

– « Capture » de séquences par sondes biotinylées

• Combinaisons pour optimiser la capacité de séquençage:– nombre de cibles

– nombre d’ADN différents

– Profondeur de séquençage souhaitée

Analyses des données

• Importance d’une équipe:

– Techniciens

– Biologistes

– Bio‐informaticiens

– Informaticiens

1) Données brutes: format “Fastq”+

%.7786867:778556858746575058873/347777476035

@HWUSI‐EAS582_157:6:1:1:1606/1

NCTGGCACCTTGATTTTGGACTTCCCAGCCTCCAGAACTGTGAG

+

Score de qualité

Sequence

Nom de l’appareil

Cellule de séquençage

Zone de la cellule de séquençage

Coordonnées –x‐ du cluster

Coordonnées –y ‐ du cluster

Index de multiplexage

Simple ou double lecture

2) Alignement des séquences

• A partir de séquences de référence du génome humain (Hg19)

• algorithmes – Bowtie

– Smith‐Waterman 

– BWA 

• Production d’un fichier « .bam »

3) Recherche de « variants »génétiques

• Ré‐analyse informatique du patient précédent: – identification d’une mutation de l’AA 723 de DNMT3A (DNA methyl transférase 3) 

– Décalage du cadre de lecture => codon stop prématuré

Analyse des mutations de DNMT3A chez 188 patients

Survie chez les patients atteints de LAM selon le statut de DNMT3A

• 200 patients avec cytogénétique intermédiaire ou favorable étudiés (génomes entiers de leucémies séquencés ou exome)

• Séquençage de l’ARNm, de l’ADN méthylé(CHIP Seq)

• + contrôle génome constitutionnel

Résultats• 2315 variants génétiques identifiés

• 270 insertions ou délétions de petite taille

• MAIS:

‐Seuls 23 gènes sont le siège de mutations récurrentes (mutations « driver »)

‐En moyenne 3 mutations driver nécessaires pour qu’une LAM surviennent

‐ jusqu’à 3 sous‐clones identifiés (50% avec 1 sous clone)

• Autres mutations: « passenger »

Catégorisation des anomalies génétiques des LAM

1) Fusions génétiques impliquant des facteurs de transcription

2) Gènes suppresseurs de tumeurs

3) Gènes impliqués dans la méthylation de l’ADN 

4) Gènes impliqués dans le transduction du signal 

5) Gènes de la différenciation myéloïde

6) Gènes modifiant la chromatine

7) Cohésines

8) Spliceosome

Conclusions

• L’Hématologie en 2013:– Repose toujours sur une routine de qualité:

• Automates performants

• Revue raisonnée des frottis sanguins /bonne coloration

– Prise en charge en milieu spécialisé des hémopathies malignes

• diagnostic: faisceau d’arguments cliniques et biologiques

– Orientation affirmée vers une médecine de + en + personnalisée

Merci pour votre attentionLaboratoire d’Hématologie des HUSA Eischen

AC Galoisy

L Miguet

C Mayeur Rousse

L Monier

Laboratoire de rechercheEA3430D. GuenotN. Perrusson

Plate‐forme hospitalière de séquençage de l’Institut régional du Cancer de Strasbourg