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© Jean Mboma, 2018
Une étude des effets des monomères cycliques d’acides gras issus d’une huile végétale chauffée sur les
marqueurs de la stéatose hépatique, de l’inflammation et du stress oxydant chez le rat
Thèse
Jean Mboma
Doctorat en nutrition
Philosophiæ doctor (Ph. D.)
Québec, Canada
Une étude des effets des monomères cycliques d’acides gras issus d’une huile végétale chauffée sur les marqueurs
de la stéatose hépatique, de l’inflammation et du stress oxydant chez le rat
Thèse
Jean Mboma
Sous la direction de :
Pr. Hélène Jacques, directrice de recherche Pr. Paul Angers, codirecteur de recherche
iii
Résumé
Cette étude vise trois objectifs majeurs. Elle cherche d’abord à déterminer les
mécanismes par lesquels les monomères cycliques d’acides gras (MCAG) issus
de la friture des huiles végétales induisent l’accumulation des lipides dans le foie
des rats. Ensuite, elle évalue les effets des MCAG sur les marqueurs de
l’inflammation et du stress oxydant chez ces mêmes rats. Enfin, elle vise à
déterminer si ces effets peuvent être modulés par la qualité des lipides
alimentaires.
Pour atteindre ces objectifs, cette étude compare les effets des quatre diètes sur
la composition corporelle, les profils d’acides gras et de lipides hépatiques et
plasmatiques, l’activité ou l’expression d’enzymes hépatiques, les marqueurs
d’homéostasie glucidique, d’inflammation et de stress oxydant. Les quatre diètes
diffèrent par la source de lipides alimentaires et l’ajout ou non de MCAG (0,5%
des lipides alimentaires totaux) : huile de canola (CO), huile de canola avec
MCAG (CC), huile de soya (SO) et huile de soya avec MCAG (SC). Les rats sont
nourris avec ces diètes (n = 9 par groupe) pendant 28 jours et des paramètres
biochimiques sont analysés dans le foie, le plasma et les urines.
Les rats nourris aux MCAG manifestent une hausse des TG hépatiques, du
cholestérol total plasmatique et du cholestérol de VLDL+LDL, une baisse de la
phosphatidylcholine hépatique et du cholestérol des HDL plasmatique par
rapport aux rats nourris avec les diètes sans MCAG. En plus, les rats nourris
aux MCAG montrent des concentrations plus élevées en 15-F2t-IsoP et son
métabolite, le 2,3-dinor-15-F2t-IsoP, que les rats non nourris aux MCAG. Enfin,
les rats nourris avec la diète SC ont des concentrations plasmatiques et urinaires
plus élevées d’isoprostanes, de neuroprostanes et d’Interleukine-6 que ceux
nourris avec l’huile de canola et MCAG.
Cette étude montre que les MCAG perturbent l’homéostasie des lipoprotéines
iv
sanguines et causent l’accumulation des TG dans le foie des rats en lien avec
une réduction de la phosphatidylcholine hépatique. Par ailleurs, la
consommation de MCAG favorise le développement d’un stress oxydant, et cet
effet ainsi que l’impact des MCAG sur l’inflammation sont exacerbés par une
diète riche en acide linoléique (huile de soja) comparée à une diète riche en acide
oléique (huile de canola).
v
Abstract This study has three major objectives. It first seeks to determine the mechanisms
by which cyclic fatty acid monomers (CFAM), which are derived from the frying
of vegetable oils, induce the accumulation of lipids in the liver of rats. Then, it
evaluates the effects of CFAM on the markers of inflammation and oxidative
stress in these same rats. Finally, it aims to determine if these effects can be
modulated by the quality of dietary lipids.
To achieve these objectives, this study compares the effects of four diets on body
composition, hepatic and plasma fatty acid and lipid profiles, activity or
expression of liver enzymes, markers of carbohydrate homeostasis, inflammation
and oxidative stress. The four diets differ in the source of dietary lipids (canola
oil or soybean oil) and the addition of CFAM (0.0 or 0.5% of total dietary fat).
Rats were fed these diets (n = 9 per group) for 28 days and biochemical
parameters are analyzed in liver, plasma and urine.
CFAM-fed rats showed increased hepatic triglycerides and plasma total
cholesterol and VLDL+LDL cholesterol, decreased plasma HDL cholesterol and
liver phosphatidylcholine, compared to rats fed CFAM-free diets. In addition,
CFAM-fed rats showed higher concentrations of plasma 15-F2t-IsoP and 2,3-
dinor-15-F2t-IsoP than non-CFAM-fed rats. Finally, rats fed soybean oil and
CFAM had elevated plasma and urinary concentrations of isoprostanes,
neuroprostanes and interleukin-6 as compared to those fed canola oil and
CFAM. This study shows that CFAM disrupt blood lipoprotein homeostasis and
cause triglyceride accumulation in rat liver related to reduced liver
phosphatidylcholine. In addition, the consumption of CFAM promotes the
development of oxidative stress, and this effect and the impact of CFAM on
inflammation are exacerbated by a diet rich in linoleic acid (soybean oil)
compared to a diet rich in oleic acid (canola oil).
vi
Table des matières Résumé ............................................................................................................. iii Abstract ............................................................................................................. v Liste des tableaux ............................................................................................... x Liste des figures ................................................................................................. xi Liste des abréviations et sigles........................................................................... xiii Dédicace ......................................................................................................... xvii Épigraphe ....................................................................................................... xviii Remerciements ................................................................................................. xix Avant-propos .................................................................................................... xxi Chapitre 1. ......................................................................................................... 1 Introduction ....................................................................................................... 1 Chapitre 2. ......................................................................................................... 6 Revue de la littérature ......................................................................................... 6
2.1. Le syndrome cardiométabolique................................................................. 6 2.1.1. Définition du syndrome cardiométabolique .......................................... 6 2.1.2. Définition du syndrome métabolique .................................................... 6
2.2. Le syndrome cardiométabolique et la stéatose hépatique ............................ 8 2.2.1. La stéatose hépatique : définition, données épidémiologiques et lipidomique .................................................................................................. 8 2.2.2. La stéatose hépatique : pathogenèse et mécanismes ........................... 10 2.3. Le syndrome cardiométabolique, l’inflammation chronique et les cytokines inflammatoires ........................................................................................... 17
2.4. Le syndrome cardiométabolique et le stress oxydant ................................. 20 2.4.1. Le stress oxydant .............................................................................. 20 2.4.2. Les isoprostanes, marqueurs du stress oxydant ................................. 21
2.5. Le syndrome cardiométabolique et la dyslipidémie.................................... 25 2.6. Régulation de la stéatose hépatique par les gènes et les habitudes de vie .. 27
2.6.1. Facteurs génétiques .......................................................................... 27 2.6.2. Régulation par les habitudes de vie .................................................... 28 2.6.3. Facteurs nutritionnels réduisant l’inflammation chronique ................. 30 2.6.4. Les huiles végétales : une source importante d’acides gras.................. 30
2.7. Le traitement thermique des huiles végétales ........................................... 33 2.7.1. Introduction...................................................................................... 33 2.7.2. Les facteurs de la stabilité thermo-oxydative des huiles végétales ........ 34
vii
2.7.3. L’impact du traitement thermique des huiles végétales sur leur qualité nutritionnelle ............................................................................................. 34 2.7.4. Stratégies pour limiter la dégradation des huiles chauffées ................. 38 2.7.5. Les effets des huiles thermo-oxydées sur les processus physiopathologiques ................................................................................... 39
2.8. Les monomères cycliques d’acides gras .................................................... 41 2.8.1. Formation et structures des monomères cycliques d’acides gras ......... 41 2.8.2. Les effets métaboliques et physiologiques des MCAG .......................... 42
Transition 1 ...................................................................................................... 47 Chapitre 3. Hypothèses et objectifs de recherche ................................................ 48
Hypothèses principales .................................................................................. 48 Hypothèses spécifiques .................................................................................. 48 Objectif principal ........................................................................................... 49 Objectifs spécifiques ...................................................................................... 49
Transition 2 ...................................................................................................... 51 Chapitre 4. ....................................................................................................... 52 Liver and plasma lipid changes induced by cyclic fatty acid monomers from heated vegetable oil in the rat ....................................................................................... 52
4.1. Résumé .................................................................................................. 53 4.2. Abstract ................................................................................................. 54 4.3. Introduction ........................................................................................... 55 4.4. Materials and methods ............................................................................ 57
4.4.1. CFAM extraction from heated linseed oil ............................................ 57 4.4.2. Experimental diets ............................................................................ 58 4.4.3. Animals and experimental design ...................................................... 58 4.4.4. Body composition.............................................................................. 59 4.4.5. Liver lipid extraction ......................................................................... 60 4.4.6. Liver total cholesterol, triacylglycerols (TAG), phosphatidylethanolamine (PE), and phosphatidylcholine ..................................................................... 60 4.4.7. Liver fatty acid composition ............................................................... 60 4.4.8. Liver glycogen ................................................................................... 61
4.4.9. Liver PEMT activity and CT-a protein analysis .................................... 61 4.4.10. Liver histology and assessment of fat accumulation .......................... 62 4.4.11. Plasma analyses.............................................................................. 62
4.5. Statistical analysis .................................................................................. 63 4.6. Results ................................................................................................... 63
4.6.1. CFAM production .............................................................................. 63
viii
4.6.2. Effects of diets on food consumption, food efficiency, body weight gain and composition ......................................................................................... 64 4.6.3. Effects of CFAM and non-CFAM diets on liver lipid composition and function ..................................................................................................... 64 4.6.4. Effects of diets on liver lipids and phosphatidylcholine biosynthesis enzymes ..................................................................................................... 65 4.6.5. Effects of CFAM and non-CFAM diets on liver fatty acid composition... 65 4.6.7. Effects of CFAM and non-CFAM diets on plasma lipids ....................... 65 4.6.8. Effects of diets on plasma biochemical parameters ............................. 66
4.7. Discussion .............................................................................................. 66 Authors’ contributions: .................................................................................. 72 Acknowledgements ........................................................................................ 72 Conflict of interest ......................................................................................... 72 Ethical review ................................................................................................ 72 References ..................................................................................................... 82
Transition 3 ...................................................................................................... 85 Chapitre 5. Effects of Cyclic Fatty Acid Monomers from Heated Vegetable Oil on Markers of Inflammation and Oxidative Stress in Male Wistar Rats ..................... 86
5.1. Résumé .................................................................................................. 87 5.2. Abstract ................................................................................................. 88 5.3. Introduction ........................................................................................... 89 5.4. Material and Methods ............................................................................. 90
5.4.1. Chemicals ......................................................................................... 90 5.4.2. Standards ......................................................................................... 91 5.4.3. Internal standards ............................................................................ 91 5.4.4. Animals and diets ............................................................................. 91 5.4.5. Plasma fatty acid analysis ................................................................. 93 5.4.6. Extraction, analysis, and quantification of non-enzymatic lipid products
....................................................................................................................... 93 5.4.7. Analysis of non-enzymatic lipid products by microLC-MS/MS............. 95
5.5. Statistical analysis .................................................................................. 97 5.6. Results ................................................................................................... 97
5.6.1. Yield, matrix effect, and repeatability and precision of the method ...... 97 5.6.2. Food intake and body weight gain ...................................................... 98 5.6.3. Plasma fatty acid composition ........................................................... 98 5.6.4. Mediators of oxidative stress: Isoprostanes and Neuroprostanes ......... 99 5.6.5. Inflammatory markers ..................................................................... 100
ix
5.7. Discussion ............................................................................................ 100 5.7.1. Changes in plasma fatty acids ......................................................... 100 5.7.2. Soybean oil induces more urinary 15-F2t-IsoP than canola oil ........... 102 5.7.3. CFAM diets induce more plasma 15-F2t-IsoP than non-CFAM diets ... 103 5.7.4. Soybean oil and CFAM diet induces higher levels of plasma and urinary 2,3-dinor-15-F2t-IsoP, urinary 4(RS)-4-F4t-neuroprostanes, and plasma IL-6 than the other three diets ......................................................................... 103
Abbreviations Used ...................................................................................... 104 Acknowledgements ...................................................................................... 105 Funding source ........................................................................................... 105 References ................................................................................................... 115
Chapitre 6. ..................................................................................................... 119 Discussion générale ........................................................................................ 119
6.1. Synthèse des résultats et vérification des hypothèses générales .............. 120 6.2. Extraction et qualité des fractions de MCAG .......................................... 124 6.3. Les monomères cycliques d’acides gras, l’accumulation des triglycérides dans le foie : rôle de la synthèse de la phosphatidylcholine ............................ 130 6.4. Les monomères cycliques d’acides gras et la fonction hépatique .............. 134 6.5. Les monomères cycliques d’acides gras et les dyslipidémies .................... 137 6.6. Accumulation hépatique des lipides, stress oxydant et baisse de cholestérol des HDL plasmatique : conséquences cardiovasculaires des acides gras cycliques ................................................................................................................... 139 6.7. Interactions entre les huiles alimentaires et les monomères cycliques d’acides gras................................................................................................ 142 6.8. La question de la nocivité et/ou l’innocuité des monomères cycliques d’acides gras................................................................................................ 145 6.9. Forces et limites de cette étude .............................................................. 147 6.10. Perspectives futures ............................................................................ 149
6.10.1. Utiliser une diète obésogène chez l’animal ...................................... 149 6.10.2. Déterminer l’activité de la CETP ..................................................... 150
6.10.3. Mesurer l’activité de la CT-a .......................................................... 150 6.10.4. Mesurer la sécrétion des VLDL et de la bile .................................... 151
Chapitre 7. ..................................................................................................... 153 Conclusion ..................................................................................................... 153 Bibliographie des chapitres 1, 2, 3 et 6 ............................................................ 155
x
Liste des tableaux
Tableau 2.1. Un exemple de synthèse de paramètres de contrôle de qualité de
l’huile de friture dans l’Union Européenne.. ............................................. 38 Table 4.1 Formulation (g/kg) and fatty acid composition (weight%) in canola oil
(CO), canola + CFAM (CC), soybean oil (SO), and soybean + CFAM (SC) diets. ....................................................................................................... 73
Table 4.2 Isomer composition (mol%) of the CFAM fraction in Canola oil +
CFAM (CC) and soybean oil + CFAM (SC) diets ......................................... 74 Table 4.3 Food consumption, growth, liver and fecal lipids, glucose, insulin,
and body composition of rats fed canola oil (CO), canola + CFAM (CC), soybean oil (SO), and soybean + CFAM (SC). ............................................ 75
Table 4.4 Fatty acid composition (weight %) in total liver lipids of rats fed diets
containing canola oil (CO), canola oil and CFAM (CC), soybean oil (SO), and soybean oil and CFAM (SC). ..................................................................... 76
Table 5.1. Standards calibration curves ....................................................... 106 Table 5.2. Summary data for isoprostanes and neuroprostanes yield and
matrix effect. ......................................................................................... 107 Table 5.3. Fatty acid composition (weight %) in total plasma lipids of rats fed
diets containing canola oil (CO), canola oil and CFAM (CC), soybean oil (SO), and soybean oil and CFAM (SC). ................................................... 108
Table 5.4. Significant correlations between plasma IL-6, fatty acids, and plasma
and urinary isoprostanes (P<0.05). ........................................................ 109 Tableau 6.1. Comparaison de deux méthodes de production des MCAG, du
protocole expérimental et les effets des MCAG sur la consommation et le gain de poids chez le rat. ....................................................................... 128
Tableau 6.2. Comparaison des effets des MCAG sur le poids relatif du foie, le
glycogène et les lipides hépatiques. ........................................................ 132
xi
Liste des figures
Figure 2.1. Le stress oxydant et ses relations avec des conditions
physiopathologiques associées au syndrome cardiométabolique.. ............. 22 Figure 2.2. Formation d’isoprostanes à partir de l’acide arachidonique.. ........ 23 Figure 2.3. Facteurs qui contribuent à la production des radicaux libres et la
pathogenèse du syndrome métabolique. .................................................. 24 Figure 2.4. Métabolites du 15-F2t-IsoP.. ........................................................ 25 Figure 2.5. Voies de la biosynthèse des acides gras polyinsaturés oméga 6
(AGPI n-6) et oméga 3 (AGPI n-3) à partir des acides linoléique et a-linolénique, respectivement. . .................................................................. 32
Figure 2.6. Schéma de synthèse des réactions et leurs produits lors de la
thermo-dégradation des huiles végétales et ses conséquences sur la qualité du produit.. ............................................................................................. 36
Figure 4.1. Representative structures of cyclopentenyl (a) and cyclohexenyl (b)
CFAM isomers from a-linolenic acid, formed during heat treatment.. ....... 77 Figure 4.2. Liver total lipids (A), TAG (B), and histological samples fixed in
buffered formaline and stained with hematoxylin and eosin (C) and plasma ALT (D), AST (E), and AST/ALT ratio (F) of rats fed either the non-CFAM or CFAM diets.............................................................................................. 78
Figure 4.3. Liver PE (A), PC (B), PEMT activity (C), CT protein expression (D),
and representative immunoblots for the expression of CT (E) of the livers of rats fed canola oil or soybean oil with or without 0.5% CFAM diets.. ........ 80
Figure 4.4. Plasma total cholesterol (A), TAG (B), HDL-C (C), VLDL+LDL-C (D) of
rats fed canola oil or soybean oil with or without 0.5% CFAM diets.. ........ 80 Figure 4.5. Pearson correlation between liver triacylglycerols (TAG) and
phosphatidylcholine of rats fed canola oil or soybean oil with or without 0.5% CFAM diets.. ................................................................................... 81
xii
Figure 5.1. Effects of oil and cyclic fatty acid monomers (CFAM) on plasma myristic acid (MYA, A), palmitic acid (PMA, B), palmitelaidic acid (PEA, C), linoleic acid (LNA, D), a-linolenic acid (ALA, E), and total n-6 polyunsaturated fatty acids (n-6 PUFA, F) of rats fed either canola oil or soybean oil with or without 0.5% of CFAM.. ........................................... 110
Figure 5.2. Liver 15-F2t-IsoP (A), 2,3-dinor-15-F2t-IsoP (B), and 4(RS)-4-F4t-
NeuroP (C)) of rats fed either canola oil or soybean oil with or without 0.5% of cyclic fatty acid monomers (CFAM)..................................................... 111
Figure 5.3. Plasma 15-F2t-IsoP (A), 2,3-dinor-15-F2t-IsoP (B), and 4(RS)-4-F4t-
NeuroP (C)) of rats fed either canola oil or soybean oil with or without 0.5% of cyclic fatty acid monomers (CFAM)..................................................... 112
Figure 5.4. Urinary 15-F2t-IsoP (A), 2,3-dinor-15-F2t-IsoP (B), and 4(RS)-4-F4t-
NeuroP (C)) of rats fed either canola oil or soybean oil with or without 0.5% of cyclic fatty acid monomers (CFAM)..................................................... 113
Figure 5.5. Plasma IL-6 and C-reactive protein (CRP) of rats fed either canola
oil or soybean oil with or without 0.5% of cyclic fatty acid monomers (CFAM).. ................................................................................................ 114
Figure 6.1. Schéma d’extraction des monomères cycliques d’acides gras à partir
de l’huile de lin chauffée. ....................................................................... 127 Figure 6.2. Schéma de synthèse des effets des MCAG sur la stéatose hépatique,
la dyslipidémie, le stress oxydant et l’inflammation.. .............................. 145
xiii
Liste des abréviations et sigles
Sigles des organisations telles que citées dans ce travail :
AOCS American Oil Chemists’ Society CRIBIQ Consortium de recherche et innovations et bioprocédés industriels au
Québec CRSNG Conseil Canadien de recherche en sciences naturelles et génie
FCF Fondation canadienne du foie FID Fédération internationale du diabète
FQRNT Fonds Québécois de la Recherche sur la Nature et les Technologies IBMM Institut des biomolécules Max Mousseron INAF Institut de Nutrition et des Aliments Fonctionnels OMS Organisation mondiale de la santé WHO World Health Organization
Sigles associés aux acides gras et leur métabolisme, tels que cités (traduction française, là où c’est nécessaire) : AGCC Acides gras courte chaîne
AGL Acides gras libres AGMI Acides gras monoinsaturés AGPI AGPI : acides gras polyinsaturés AGS Acides gras saturés ALA a-linolenic acid (acide a-linolénique) ARA Arachidonic acid (acide arachidonique)
DHA Docosahexaenoic acid (acide docosahexaénoïque) DNL de novo lipogenesis (lipogenèse de novo) DPA Docosapentaenoic acid (acide docosapentaénoïque) EPA Eicosapentaenoic acid (acide eicosapentaénoïque)
FAME Fatty acid methyl ester (méthyle ester d’acide gras) LNA Linoleic acid (acide linoléique)
MUFA Monounsaturated fatty acid MYA Myristic acid (acide myristique) n-6 omega 6 (oméga 6) n-3 omega 3 (oméga 3)
OLA Oleic acid (acide oléique) PEA Palmitelaidic acid (acide palmitélaidique) PMA Palmitic acid (acide palmitique)
PUFA Polyunsaturated fatty acid SFA Saturated fatty acid TFA Trans fatty acid (acides gras trans)
xiv
Sigles des enzymes et facteurs, tels que cités (traduction française, là où c’est nécessaire) :
ACO Acyl-CoA oxidase CETP Cholesterol ester transfer protein CPT-1 Carnitine palmitoyl-transferase 1 CT-a CTP:phosphocholine cytidylyltransferase-a
CYP2E1 Cytochrome P450 2E1 CYP4A1 Cytochrome P450 4A1
FADS Fatty acid desaturase FAS Fatty acid synthase
LCAT Lecithine cholesterol acyltransferase PAP Phosphatidate phosphatase
PEMT Phosphatidyléthanolamine N-méthyle transférase PPARa Peroxisome proliferator activation factor a SCD-1 Stearoyl Co-A desaturase-1
SREBP1c Sterol regulatory element binding protein 1c Sigles associés aux diètes, tels que cités (traduction française, là où c’est nécessaire) :
CO Canola oil (huile de canola) CC Canola oil and CFAM (huile de canola avec 0,5% MCAG des lipides totaux)
CFAM Cyclic fatty acid monomers MCAG Monomères cycliques d’acides gras
SO Soybean oil (huile de soya) SC Soybean oil and CFAM (huile de soya avec 0,5% MCAG des lipides totaux)
Sigles associés aux à l’inflammation, tels que cités (traduction française, là où c’est nécessaire) :
COX-2 Cyclooxygenase-2 CRP C-reactive protein
hsCRP High sensitivity CRP (CRP haute sensibilité) IC Inflammation chronique
IL-6 Interleukin-6 IL-6R IL-6 receptor (récepteur de l’IL-6) TNF-a Tumor necrosis factor-a
xv
Sigles associés aux facteurs du syndrome métabolique, tels que cités (traduction française, là où c’est nécessaire) :
CL Cholestérol libre IFG Impaired fasting glucose IGF Impaired glucose tolerance
HDL High density lipoprotein (lipoprotéine de haute densité) LDL Low density lipoprotein (lipoprotéine de basse densité)
OGTT Oral glucose tolerance test (test oral de tolerance au glucose) RI Résistance à l’insuline
SCardMét Syndrome cardiométabolique SMét Syndrome métabolique
TC Total cholesterol (cholesterol total) T2DM Type 2 diabetes mellitus (diabète de type 2 mellitus) VLDL Very low-density lipoprotein lipoprotéine de très basse densité)
Sigles associés au stress oxydant, tels que cités (traduction française, là où c’est nécessaire) :
GPX Glutathione peroxidase IsoP Isoprostane
NADPH Nicotinamide dinucleotide phosphate NeuroP Neuroprostane
ROS Reactive oxygen species (radicaux libres) Sigles associés aux lipides, tels que cités (traduction française, là où c’est nécessaire) :
PC Phosphatidylcholine PE Phosphatidylethanolamine
TAG Triacylglycerols (triacylglycérols) TG Triglycérides
Sigles associés au foie et maladies du foie, tels que cités (traduction française, là où c’est nécessaire) :
ALT Alanine transaminase AST Aspartate transaminase
MFNA Maladies du foie non alcooliques NAFLD Non-alcoholic fatty liver disease SHNA Stéatose hépatique non alcoolique
xvi
Sigles associés aux analyses statistiques, tels que cités (traduction française, là où c’est nécessaire) : ANOVA Analysis of variance (Analyse de la variance)
HSD Tukey honest significant difference test (test de Tukey de la différence significative honnête)
NS Non-significant (pas de différence significative) SEM Standard error of the mean (erreur-type de la moyenne) STD Standard deviation (écart-type)
Sigles associés aux méthodes et procédures d’analyse, tels que cités(traduction française, là où c’est nécessaire) :
AUC Area under the curve (aire sous la courbe) GC Gas chromatography (chromatographie en phase gaseuse, CPG)
GC-MS GC-mass spectrometry (CPG-spectrométrie de masse) IS Internal standard (standard interne)
LC-MS/MS Liquid chromatography tandem mass spectrometry (chromatographie en phase liquide tandem spectrométrie de masse)
MRM Multiple reaction monitoring (système de suivi multiple des réactions) Autres sigles, tels que cités (traduction française, là où c’est nécessaire) :
AIN American Institute of Nutrition (Institut américain de nutrition) ATP Adénosine triphosphate CP Composés polaires
H&E Hematoxyline and Eosine TBHQ Tert-butylhydroquinone
xvii
Dédicace
Je dédie ce travail
à tous mes formateurs et maîtres,
ceux qui m’ont porté au point où j’en suis. Vivants
ou morts, de près ou de loin, ils m’ont aidé à forger
ce que je suis aujourd’hui.
xviii
Épigraphe
“Every day we are born again.
What matters is what we do of today.”
« Chaque jour nous naissons à nouveau. Ce qui
compte c’est ce que nous faisons de notre
aujourd’hui. »
Buddha
xix
Remerciements
« La gratitude est la mémoire du cœur.
Par elle, on entretient le souvenir du bienfait reçu en en faisant mention lorsque l’occasion se présente ».
Raymond Saint-Jean
Ce travail de thèse a été l’occasion d’apprentissage de cette ancienne sagesse
africaine qui souligne l’importance du travail d’équipe : « un seul doigt ne peut
enlever le pou de la tête ». Ma gratitude va d’abord à Dieu, créateur de tout et
source de tout don, qui a donné sa vie en profusion et permis que ce travail de
thèse devienne aussi une croissance en sagesse et maturité humaine.
Je suis reconnaissant à Hélène Jacques, ma directrice de thèse et de recherche.
Hélène a été patiente, assidue et bienveillante tout au long de mon cheminement.
Ses exigences m’ont fait comprendre qu’elle voulait le meilleur de et pour moi.
Je la remercie aussi pour l’exemple de vie qu’elle m’a donné : mère de famille,
épouse, directrice de programme, enseignante, chercheuse, chrétienne engagée
dans son milieu. Elle a enfilé tous ces costumes avec harmonie. Merci Hélène.
Ma reconnaissance va également à Paul Angers, qui a été pour moi le vent
derrière le dos, très positif, optimiste et un vrai soutien. Mes présentations à
Chicago et Cancun n’auraient pas été possibles sans son soutien financier. Je
remercie Nadine Leblanc qui a été mon « guide » dans la préparation du dispositif
expérimental, la conduite des expériences animales et les analyses. Son expertise
dans la confection des présentations PowerPoint m’a été précieuse.
Je remercie Thierry Durand et son équipe qui m’ont accueilli à Montpellier. Leur
expertise, qui s’est encore illustrée dans leur lecture critique de mon deuxième
article, a ajouté un grand plus à ce travail. Ma reconnaissance va aussi à René
Jacobs et son étudiante Sereana Wan pour leur expertise sur la biosynthèse de
la phosphatidylcholine.
xx
Je remercie John McGarry SJ qui reste un mentor pour moi. Je remercie la
province jésuite du Canada français qui m’a accueilli à Québec et m’a hébergé.
Je remercie aussi les provinces jésuites de France et de l’Afrique centrale qui
m’ont soutenu. En particulier, ma reconnaissance va au Père José Minaku SJ
qui a accepté de m’envoyer faire ces études et qui m’a fait une grande confiance.
Merci aux membres de la communauté jésuite de Québec, en particulier Marc
Rizzetto. Je remercie aussi la Sœur Bénigne qui, malgré son jeune âge, a été une
source de réconfort et une compagne de route. Je remercie les Sœurs de la
Congrégation Notre-Dame de Québec qui m’ont accueilli dans leur communauté
chaque fin de semaine autour de la table du Seigneur.
Je remercie l’Institut de la nutrition et des aliments fonctionnels (INAF) et le
Fonds Jean-Paul Houle qui ont subventionné en partie ma présentation à
Chicago. Ma gratitude va également aux organismes qui ont subventionné cette
recherche, dont le Conseil Canadien de recherche en sciences naturelles et génie
(CRSNG) et le Fonds Québécois de la Recherche sur la Nature et les Technologies
(FQRNT)
Je termine en remerciant ma mère pour son amour maternel, m’assurant qu’elle
sera toujours là pour moi, tant que Dieu le voudra. Mes remerciements à mes
frères et sœurs, nièces et neveux, cousins et cousines.
xxi
Avant-propos
Cette thèse est structurée et présentée sous forme de « thèse par articles ». Elle
intègre deux articles publiés dont je suis l’auteur principal. Ce projet est dirigé
par l’investigatrice principale, la Dre Hélène Jacques, Ph.D. (École de Nutrition,
Université Laval) et co-dirigé par le Dr Paul Angers, Ph.D. (Département des
Sciences des Aliments, Université Laval). Le Dr Thierry Durand, Ph.D. (Institut
des Biomolécules Max Mousseron, Université de Montpellier, France) a supervisé
mes travaux de recherche sur les marqueurs de l’inflammation. Le Dr René
Jacobs et son étudiante au doctorat Sereana Wan (Department of Biochemistry,
University of Alberta, Canada) m’ont aidé dans l’analyse de l’activité ou de
l’expression des enzymes de synthèse de la phosphatidylcholine et ont apporté
une critique scientifique pour le premier article. Le Dr André Tchernof, Ph.D.
(Institut universitaire de cardiologie et pneumologie, Université Laval) a
contribué à ce travail grâce aux analyses histologiques du foie réalisées par son
équipe de recherche.
La majorité des coauteurs a été impliquée dans la conception expérimentale du
projet, ainsi que dans l’analyse des données, les révisions et éditions des
manuscrits. J’ai contribué à la conception du plan d’expérience et au choix des
différents paramètres à analyser. Avec Nadine Leblanc, j’ai administré et conduit
l’élevage des rats, ainsi que l’ensemble des soins aux animaux. Antoine Godin et
Charlène Marcotte ont apporté leur soutien technique dans le suivi des animaux
et certaines tâches bureautiques. Avec Nadine Leblanc, j’ai procédé au sacrifice
des animaux, prélèvement des organes et plasma, et certaines analyses
biochimiques de ces derniers. J’ai réalisé la compilation de l’ensemble des
données recueillies, les analyses statistiques, la rédaction des manuscrits, ainsi
que de cette thèse. J’ai rédigé deux articles à titre de premier auteur. Le premier
manuscrit est en fait la combinaison de deux manuscrits traitant des effets des
MCAG sur, respectivement, les paramètres hépatiques et plasmatiques et il a été
xxii
publié dans Food Science and Nutrition. Le deuxième manuscrit porte sur les
effets des MCAG sur les marqueurs du stress oxydant et l’inflammation et a été
publié en ligne dans Journal of Agricultural and Food Chemistry.
Les manuscrits publiés sont les suivants :
Jean Mboma, Nadine Leblanc, Sereana Wan, René L. Jacobs, André Tchernof,
Pascal Dubé, Paul Angers, Hélène Jacques. Liver and plasma lipid changes
induced by cyclic fatty acid monomers from heated vegetable oil in the rat. Publié
dans Food Science and Nutrition, 2018 ; 1-12. DOI: 10.1002/fsn3.766.
Jean Mboma, Nadine Leblanc, Paul Angers, Amandine Rocher, Claire Vigor,
Camille Oger, Guillaume Reversat, Joseph Vercauteren, Jean Marie Galano,
Thierry Durand, Hélène Jacques. Effects of Cyclic Fatty Acid Monomers from
Heated Vegetable Oil on Markers of Inflammation and Oxidative Stress in Male
Wistar Rats. Publié le 19 juin 2018 dans Journal of Agricultural and Food
Chemistry. 2018, 66, 7172−7180. DOI: 10.1021/acs.jafc.8b01836
Les travaux de recherche suivants ont été présentés à des congrès
internationaux sous forme de présentation orale (travaux 1 et 3) ou de poster
(travail 2). Tous ces travaux ont fait l’objet d’un résumé arbitré :
1. Jean Mboma, Nadine Leblanc, Paul Angers, Hélène Jacques. Cyclic
fatty acid monomers from heated oils do not have adverse effects on
food consumption and weight gain in rats. 25th Canadian on Fats and
Oils. Canadian section of the American Oil Chemists’ Society (AOCS).
Quebec City, October 4-6, 2015.
2. Jean Mboma, Nadine Leblanc, Paul Angers, Hélène Jacques. Cyclic
fatty acids effects on rat liver and plasma fatty acid metabolism and
inflammation mediators depend on dietary lipids. Experimental Biology
xxiii
2017 (American Society for Nutrition). Chicago, April 22-26,
2017. FASEB J, April 2017, 31:971.21.
3. Jean Mboma, Hélène Jacques, Nadine Leblanc, Amandine Rocher,
Claire Vigor, Camille Oger, Guillaume Reversat, Joseph Vercauteren,
Jean Marie Galano, Thierry Durand, Paul Angers. Cyclic Fatty Acid
Monomers from Heated Vegetable Oils Increase F2-Isoprostanes
Production in the Rat. 17th AOCS Latin American Congress and
Exhibition on Fats, Oils, and Lipids. Cancun, September 11–14, 2017.
1
Chapitre 1. Introduction
La stéatose hépatique non-alcoolique (SHNA) est un spectre de pathologies
hépatiques en l’absence ou avec une consommation modérée d’alcool (<20 g et
<30 g d’alcool par jour pour les femmes et les hommes, respectivement). Ce
spectre inclut la simple accumulation des lipides dans le foie ; soit >5% du
volume du foie (Sattar et al., 2014) pouvant évoluer vers des formes plus
sérieuses telles la stéatohépatite, la fibrose et la cirrhose (Goh & McCullough,
2016). La prévalence de la SHNA va de pair avec celle de l’obésité et du syndrome
métabolique (Brunt et al., 2015 ; Rinella, 2015 ), du diabète de type 2 et des
maladies cardiovasculaires (Cusi, 2012). Par ailleurs, les pathologies associées à
la SHNA ont atteint des proportions épidémiques. Il est estimé que 20 à 30%
d’adultes vivant dans les pays riches présentent la stéatose hépatique (Goh &
McCullough, 2016 ; Neuschwander-Tetri, 2017 ) et le poids économique annuel
de ces pathologies s’élèverait à plus 100 milliards de dollars Américains, rien que
pour les États-Unis et quelques pays européens (Younossi et al., 2016). Ces
éléments indiquent à la fois le poids de ces maladies sur les budgets nationaux
de la santé, mais aussi l’urgence de trouver des solutions durables à ces
pathologies.
La SHNA se caractérise généralement par un indice de masse corporelle élevé et
des altérations hépatiques et plasmatiques. Dans le foie, la SHNA se caractérise
par une rupture de l’équilibre entre les voies de synthèse et d’utilisation des
acides gras et des lipides (Kawano & Cohen, 2013) et s’accompagne d’une
augmentation des diglycérides, triglycérides (TG), et cholestérol libre, et d’une
baisse de phosphatidylcholine (Puri et al., 2007). Concernant les enzymes de la
fonction hépatique, il a été observé des taux élevés d’alanine transaminase (ALT)
avec des taux d’aspartate transaminase (AST) moindres que ceux d’ALT, des TG
2
élevés et de faibles taux de cholestérol de HDL peuvent être indicateurs de SHNA
(Sattar et al., 2014).
Concernant les causes alimentaires des SHNA, il a été montré que les diètes
riches en glucides, en particulier le glucose et le fructose, favorisent le
développement d’un foie gras (Cusi, 2012; Machado & Diehl, 2016;
Neuschwander-Tetri, 2010). Même si la lipogenèse hépatique est régulée par
plusieurs facteurs nutritionnels (Jump, 2011), il est reconnu que certains lipides
alimentaires favorisent la stéatose hépatique alors que d’autres la réduisent
(Ferramosca & Zara, 2014). Les acides gras polyinsaturés oméga 3 (AGPI n-3)
contenus dans le gras de poisson suppriment la stéatose hépatique chez la souris
en inhibant la synthèse des lipides et du cholestérol (Rossmeisl et al., 2014). Il
en est de même pour l’huile de krill -une bonne source d’AGPI n-3 à très longue
chaîne eicosapentaénoïque (AEP) et docosahexaénoïque (ADH)- qui réduit
l’hépatomégalie et la stéatose hépatique chez la souris (Tandy et al., 2009) et
chez le rat Wistar (Ferramosca et al., 2012). En revanche, il s’est avéré que les
rats nourris avec le lard (Ferramosca et al., 2012) ou 40% d’énergie sous forme
d’huile d’olive (Portillo et al., 2001) présentaient une augmentation de la stéatose
hépatique.
Par ailleurs, certains lipides et enzymes hépatiques peuvent moduler la stéatose
hépatique et altérer la composition plasmatique des lipides et lipoprotéines. Chez
la souris, la phosphatidylcholine (PC) protège contre la stéatose (Niebergall et al.,
2011) et une baisse du ratio de la PC à la phosphatidyléthanolamine (PE) prédit
la stéatose hépatique (Ling et al., 2012). En plus, les activités des enzymes
impliquées dans la synthèse de PC, soit la CTP:phosphocholine
cytidylyltransferase-a (CT-a) et la phosphatidyléthanolamine N-méthyle
transférase (PEMT), sont critiques au maintien des taux de PC hépatique et des
lipoprotéines plasmatiques (Jacobs et al., 2008). Ces éléments indiquent que la
qualité des lipides alimentaires ainsi que l’altération de certaines voies
3
métaboliques impliquées dans la synthèse de la PC peuvent exacerber ou
atténuer la stéatose hépatique.
Concernant les lipides alimentaires, il convient de noter qu’ils contribuent en
moyenne 30% à 33% de l’apport énergétique des Canadiens (Statistics Canada,
2015) et les huiles de canola et de soya sont les principales huiles consommées
en Amérique du Nord (Cloutier, 2017). Alors que l’huile de canola est riche en
acide oléique (62%) et possède un ratio n-6/n-3 bas (2.2), l’huile de soya est riche
en acide linoléique (61%) et exprime un ratio n-6/n-3 élevé (7.8). Ces différences
de composition ont une incidence sur les effets nutritionnels de ces deux huiles
(de Catalfo et al., 2013; Takeuchi et al., 2001; Wijendran & Hayes, 2004).
Malgré ces différences, ces deux huiles sont des sources alimentaires d’acides
gras essentiels : les acides linoléique et a-linolénique. Ces deux acides gras
servent de substrats pour les acides gras polyinsaturés (AGPI) n-6 et n-3,
respectivement. Cependant, les acides gras essentiels sont les plus affectés par
la friture des huiles végétales et leur baisse est accompagnée de la formation
d’acides gras trans (Aladedunye & Przybylski, 2009) -dont les effets délétères sur
la santé sont déjà connus (Mensink & Katan, 1990; Mozaffarian et al., 2006)- et
des monomères cycliques d’acides gras (MCAG) (Ziaiifar et al., 2008).
Des études sur les effets des MCAG sur le métabolisme lipidique et des acides
gras montrent que les MCAG induisent une accumulation des lipides dans le foie
des rats (Iwaoka & Perkins, 1976 ; Lamboni et al., 1998 ; Siess et al., 1988 ) tout
en perturbant les activités d’enzymes impliquées dans la synthèse et l’oxydation
des acides gras (Lamboni et al., 1998; Martin et al., 2000). Cependant, les
mécanismes par lesquels les MCAG induisent l’accumulation des lipides dans le
foie ne sont pas complètement élucidés. Par exemple, il est connu qu’une
altération du métabolisme des phospholipides, en particulier la
phosphatidylcholine peut induire le foie gras (Niebergall et al., 2011), mais
aucune étude n’a évalué l’impact des MCAG sur la biosynthèse de la PC. En plus,
4
même si l’accumulation des lipides dans le foie peut s’avérer protectrice
(Listenberger et al., 2003), elle peut générer un état lipotoxique (Trauner et al.,
2010). Cette lipotoxicité advient à cause d’une exposition chronique des cellules
aux concentrations élevées d’acides gras libres, TG ou cholestérol qui peut
enclencher des processus lipotoxiques impliqués dans la pathogenèse du
syndrome métabolique (Schaffer, 2003; Unger, 2002). Or cette lipotoxicité peut
induire le stress oxydant et l’inflammation (Trauner et al., 2010), mais à notre
connaissance les effets des MCAG sur ces processus pathophysiologiques n’ont
pas encore été explorés. En outre, et à notre connaissance, aucune étude n’a
évalué simultanément les effets des MCAG sur le foie, le plasma et les urines, ni
trouvé les mécanismes liant ces effets les uns aux autres. Enfin, il reste à savoir
si les effets des MCAG peuvent être modulés par les lipides alimentaires.
Compte tenu de ces lacunes, ce projet de thèse s’est proposé de mesurer les effets
des MCAG sur la réponse lipidique, inflammatoire et le stress oxydant chez le
rat. Six objectifs spécifiques guident ce projet de recherche : (1) la caractérisation
de la fraction de MCAG produite à partir de l’huile de lin et l’évaluation de ses
effets sur la consommation et la prise de poids chez le rat ; (2) la détermination
des effets des MCAG sur le contenu en lipides sur la synthèse de la
phosphatidylcholine hépatique ; (3) la détermination des effets des MCAG sur le
profil en acides gras hépatiques et la fonction hépatique ; (4) l’analyse des effets
des MCAG sur les lipides et lipoprotéines de même que le profil en acides gras
plasmatiques et les paramètres du métabolisme glucidique ; (5) la détermination
de l’impact des MCAG sur les cytokines pro-inflammatoires et les marqueurs du
stress oxydant ; et enfin (6) l’évaluation des effets respectifs des MCAG sur les
profils lipidiques, les cytokines inflammatoires et les marqueurs du stress
oxydant selon que les MCAG sont supplémentés avec l’huile de canola ou l’huile
de soya.
5
Pour présenter les résultats de ces travaux de recherche, cette thèse est divisée
en 7 chapitres, y compris cette introduction. Le deuxième chapitre est consacré
à la revue de la littérature. Cette dernière dégage les interrelations entre
différents paramètres du syndrome cardiométabolique, présente une synthèse
des résultats des travaux antérieurs sur les effets des huiles chauffées et les
MACG, et conduit à la formulation de la problématique du présent travail. Dans
le troisième chapitre, je présente les hypothèses et objectifs de recherche. Le
quatrième chapitre présente les résultats de la présente étude en lien avec les
objectifs spécifiques 1 à 4 sous forme d’article publié dans Food Science et
Nutrition. Le cinquième chapitre présente le travail qui couvre les objectifs 5 et 6
sous forme d’article publié dans Journal of Agricultural and Food Chemistry. Le
chapitre 6 est consacré à la discussion des résultats, la présentation des forces
et faiblesses de l’étude et les perspectives futures. Enfin, le chapitre 7 constitue
la conclusion générale de ce travail.
6
Chapitre 2. Revue de la littérature
Ce deuxième chapitre de la thèse vise à révéler la complexité des liens entre la
stéatose hépatique non alcoolique (SHNA) ou accumulation des lipides dans le
foie et les mécanismes impliqués dans la pathogenèse du syndrome
cardiométabolique. En plus de discuter ces liens, cette revue de la littérature vise
à souligner l’implication des facteurs nutritionnels dont les lipides et les
monomères cycliques d’acides gras (MCAG), dérivés des lipides alimentaires à la
suite du traitement thermique industriel ou domestique. Enfin, ce chapitre fait
ressortir les questions et problématiques qui sont à la base de ce projet de thèse.
2.1. Le syndrome cardiométabolique
2.1.1. Définition du syndrome cardiométabolique Wiernsperger définit le syndrome cardiométabolique (SCardMét) comme un
ensemble de désordres métaboliques précurseurs au diabète de type 2
(syndrome métabolique ou SMét – voir ci-dessous) pouvant avoir des
implications cardiovasculaires. De ce fait, le SCardMét est complexe, car il
implique des voies métaboliques dans plusieurs tissus tels le foie, le tissu
adipeux et le muscle (Wiernsperger, 2013).
2.1.2. Définition du syndrome métabolique Le syndrome métabolique (SMét) désigne la présence d’un ensemble de facteurs
de risque du diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires et des accidents
vasculaires cérébraux. Plusieurs associations et organismes dont l’Organisation
mondiale de la santé (OMS), l’American Heart Association, le Groupe européen
pour l’étude de la résistance à l’insuline et La Fédération Internationale du
Diabète (FID) ont proposé différentes définitions du SMét qui se rejoignent. Mais
dans ce travail, la définition de la FID a été choisie en raison du large consensus
autour d’elle, de la centralité de l’obésité et son lien à la prévalence du diabète
7
de type 2 (voir paragraphe 2.2.1) et du fait qu’elle inclut certains facteurs non
considérés dans les autres définitions. La FID définit le SMét comme la présence
de l’obésité centrale (tour de taille avec des spécificités ethniques) associée à
deux des facteurs ci-après :
Ø TG élevés (³ 150 mg/dL ou 1,7 mmol/L)
Ø baisse du cholestérol des HDL (< 40 mg/dL pour les hommes et < 50
mg/dL pour les femmes)
Ø hypertension (pression systolique ³ 130 mm Hg, pression diastolique ³ 85
mm Hg)
Ø glucose plasmatique à jeun élevé (³ 100 mg/dL ou 5,6 mmol/L)
En plus de ces facteurs, la FID ajoute huit autres paramètres métaboliques
qui peuvent être utilisés afin de cerner l’étiologie du syndrome métabolique :
- une distribution anormale des gras corporels (dont le gras abdominal et le
gras hépatique)
- la dyslipidémie athérogénique (niveaux élevés d’apolipoprotéine B ou de
cholestérol des lipoprotéines autres que des HDL)
- la dysglycémie (glycémie à jeun : Impaired fasting glucose (IFG) : 5,6-6,9
mmol/L et 120 minutes suivant le test oral de tolérance eau glucose
(OGTT) : Impaired glucose tolerance (IGT) : 7,8-11,0 mmol/L)
- la résistance à l’insuline
- la dérégulation vasculaire (dysfonctionnement endothélial)
- un état pro-inflammatoire : niveaux élevés de C-reactive protein haute
sensibilité (hsCRP), tumor necrosis factor-a (TNF-a), interleukine-6 (IL-6)
- un état pro-thrombotique (niveaux élevés de facteurs fibrinolytiques ou de
facteurs coagulants)
- des facteurs hormonaux (l’axe pituitaire-surrénales)
8
2.2. Le syndrome cardiométabolique et la stéatose hépatique
Selon Wiernsperger, le foie joue un rôle crucial dans la pathogenèse du syndrome
cardiométabolique (Wiernsperger, 2013). Plusieurs facteurs justifient cette
position centrale du foie dans l’ensemble d’événements métaboliques et
physiopathologiques que constitue le syndrome cardiométabolique. Le lien entre
le foie et le diabète de type 2 est établi puisque, d’une part, le foie gras et le
diabète sont associés à la résistance à l’insuline et que, d’autre part, le diabète
peut induire des lésions dans le foie (Loria et al., 2013). Dans le cadre cette thèse,
j’ai choisi de concentrer les liens entre le SCardMét et le foie sur la stéatose
hépatique. En effet, d’une part, la stéatose hépatique est la manifestation du
syndrome métabolique (Kim & Younossi, 2008) et, d’autre part, le SMét prédit la
stéatose hépatique (Hamaguchi et al., 2005).
2.2.1. La stéatose hépatique : définition, données épidémiologiques et lipidomique
La stéatose hépatique ou foie gras d’origine non-alcoolique est définie comme
une anomalie métabolique reliée à une accumulation de gras dans le foie (lipides
hépatiques >5% du poids total du foie). Le foie gras est intimement lié à l’obésité
et à la résistance à l’insuline et est considéré comme la manifestation hépatique
du syndrome métabolique (Alberti et al., 2006). Cependant, elle peut évoluer
d’une simple accumulation des lipides dans le foie vers la fibrose et la cirrhose
en passant par la stéatohépatite qui est caractérisée par, entre autres, des
lésions hépatiques et l’inflammation (Petta et al., 2009).
Selon les statistiques de l’OMS, il y avait en 2014 plus de 1,9 milliard d’adultes
(³ 18 ans) qui étaient en surpoids dont 600 millions d’obèses, soit environ 13%
de la population mondiale adulte (Seuring et al., 2015). Ce même rapport indique
presqu’un doublement de la population mondiale obèse entre 1980 (4,7%) et
2014 (8,5%) ; la proportion d’enfants obèses étant passée de 4% en 1975 à 18%
9
en 2014. Mondialement, il est estimé que 1 à 5% de la population serait affectée
par ces anomalies métaboliques, alors que 10 à 20% des personnes affectées
courent le risque de développer une stéatohépatite (Johnson & Olefsky, 2013).
La prévalence du surpoids et de l’obésité est liée mondialement à deux causes
majeures : une plus grande consommation d’aliments à haute densité
énergétique, c’est-à-dire riches en gras et en sucres, et un accroissement de la
sédentarité (Seuring et al., 2015). Un indice de masse corporelle élevé est un
facteur de risque pour certaines maladies telles les maladies cardiovasculaires,
le diabète, les troubles musculo-squelettiques et certains types de cancer (WHO,
2016).
Cette situation est une préoccupation pour les services de santé publique
puisque le surpoids et l’obésité sont globalement associés à une prévalence plus
élevée de la mortalité comparé au sous-poids (Seuring et al., 2015). Au niveau
canadien, la Fondation Canadienne du Foie (FCF) estime qu’environ 50% des
Canadiens sont en situation de surpoids et 75% des personnes obèses courent
le risque de développer la stéatose hépatique, et jusqu’à 23% ont un risque de
développer le foie gras avec possibilité d’inflammation. Par ailleurs la même
organisation estime que la stéatose hépatique non alcoolique affecte environ 2 à
6% de la population générale et 3% d’enfants, alors que les enfants obèses ont
entre 22 et 53% de risque de développer ce problème de santé (FCF, 2017).
Concernant la lipidomique de la stéatose hépatique non-alcoolique, des
changements dans les lipides et acides gras hépatiques et plasmatiques ont été
notés. Dans une étude sur la lipidomique des cas de SHNA, Puri et ses collègues
ont présenté les différentes classes de lipides et des acides gras caractéristiques
de cette pathophysiologie (Puri et al., 2007). Il ressort de cette étude que les cas
de foie gras présentent des concentrations élevées en diglycérides (DG) et TG
comparées aux populations « normales » en plus d’une augmentation de
cholestérol libre (CL). Une baisse de phosphatidylcholine hépatique était aussi
observée chez des sujets affectés par la stéatose hépatique mais aucune
10
différence n’a été observée concernant les acides gras libres (AGL). Concernant
des acides gras spécifiques, il a été montré que le foie gras n’altérait pas les
concentrations des acides linoléique et a-linolénique, alors que la stéatohépatite,
une forme plus avancée de la stéatose hépatique, s’accompagne d’une baisse en
acide arachidonique au niveau des AGL, des TG et de la PC (Puri et al., 2007).
Par ailleurs, une baisse de l’AEP dans les TG hépatiques était également mise en
évidence dans une étude (Ramsden et al., 2013).
Donc, l’accumulation des lipides dans le foie n’est pas un phénomène bénin. Elle
est à la base de changements dans la composition des lipides et acides gras
hépatiques et plasmatiques. En raison des interrelations existant entre, d’une
part, l’obésité, le diabète de type 2 et le syndrome métabolique et, d’autre part,
la stéatose hépatique, on comprend que cette dernière soit un poids dans les
budgets de santé et qu’il y ait urgence à trouver des solutions. Il convient à
présent d’examiner les facteurs génétiques et nutritionnels prédisposant de la
SHNA.
2.2.2. La stéatose hépatique : pathogenèse et mécanismes
Si des facteurs génétiques et nutritionnels ont été identifiés dans le
développement de la stéatose hépatique non-alcoolique, il convient de préciser
que cette dernière n'est habituellement associée à aucun symptôme. On la
découvre lors d'analyses de sang de routine indiquant des anormalités
métaboliques et pathologiques. Il convient à présent de recenser certains
mécanismes à la base du développement de ces anomalies. Trois hypothèses ont
été avancées pour expliquer la pathogenèse de la SHNA, soit, (1) l’hypothèse du
microbiote intestinal ou l’axe gastro-hépatique, (2) l’hypothèse des “two-hit” et
(3) la résistance à l’insuline (RI).
11
2.2.2.1. L’hypothèse de l’axe gastro-hépatique
L’hypothèse du microbiote intestinal repose sur l’association entre l’obésité et les
perturbations de la composition du microbiote intestinal (Moschen et al., 2013).
Brièvement, selon cette hypothèse les microbes du tractus gastro-intestinal ou
leurs produits affectent le foie et les tissus adipeux, provoquant ainsi la stéatose
hépatique (Moschen et al., 2013). D’un côté, des glucides complexes fermentés
par des enzymes bactériennes favoriseraient la formation des acides gras à
courte chaîne (AGCC) qui à leur tour activeraient des récepteurs, tels le Gpr43
(G-protein coupled receptor 43), qui provoquent la baisse des réponses
immunitaires aux inflammations intestinales (Moschen et al., 2013). Il convient
de rappeler que le Gpr43 est impliqué dans certaines conditions
pathophysiologiques tels l’obésité, les colites, l’asthme et l’arthrite (Ang et al.,
2015). D’un autre côté, l’augmentation de la production d’éthanol par les
enzymes bactériennes du tractus gastro-intestinal a été associée à la
pathogenèse des SHNA (Moschen et al., 2013). En résumé, l’hypothèse du
microbiote intestinal explore les voies métaboliques qui partent des régimes
alimentaires riches en lipides ou glucides complexes en passant par des
perturbations des réponses inflammatoires qui se produisent au niveau des
tissus adipeux et les déséquilibres du microbiote intestinal. Même si la littérature
scientifique abonde pour soutenir cette hypothèse, la plupart des études sur le
rôle du microbiote intestinal dans la pathogenèse des SHNA ont souvent utilisé
des modèles animaux, et il n’est pas toujours facile de traduire les résultats
obtenus au contexte humain.
2.2.2.2. L’hypothèse des « two-hit » ou « deux-coups »
Dans sa forme la plus succincte, l’hypothèse des “deux-coups » comprend la
pathogenèse des SHNA comme étant initiée par un premier “hit” ou « coup »
provoqué par la résistance à l’insuline (RI), l’obésité et un réseau d’adipokines et
cytokines qui aboutissent à l’accumulation des lipides dans le foie (Petta et al.,
12
2009). La résistance à l’insuline se développe dans ce cas comme une
conséquence de la combinaison des facteurs tels le flux des acides gras libres
dans le foie, une augmentation de la lipogenèse de novo (DNL) et le stress
oxydant. L’obésité contribue au premier “hit” par la libération des AGL et la
production des cytokines à partir des tissus adipeux. Et le réseau des cytokines
contribue au second “hit” en stimulant la réponse inflammatoire et en interférant
avec les réseaux de signalisation de l’insuline (Petta et al., 2009).
2.2.2.3. L’hypothèse de la résistance à l’insuline
L’hypothèse de la RI soutient que la RI et l’hyperinsulinémie qu’elle engendre
sont les causes majeures de la pathogenèse des SHNA. Une question se pose à
savoir si c’est le foie gras qui cause la RI ou si c’est l’inverse qui se produit
(Takamura et al., 2012). D’une part, la RI favorise la lipolyse au niveau des
adipocytes et donc une augmentation de la libération des AGL vers le foie.
D’autre part, l’hyperinsulinémie favorise la DNL (Aubert et al., 2011). Même si
les mécanismes impliqués dans la pathogenèse des SHNA ne sont pas encore
complètement élucidés, l’hypothèse de la résistance à l’insuline –à laquelle
l’hypothèse des “two-hit” se réfère- semble la plus étudiée (Hassan et al., 2014;
Kim & Younossi, 2008).
Tous ces éléments pathogéniques indiquent que la stéatose hépatique n’est pas
un phénomène isolé. Qu’elle soit associée à des perturbations du métabolisme
lipidique, des dysfonctionnements mitochondriaux ou de la résistance à
l’insuline, la stéatose hépatique est la résultante d’une conjugaison des
phénomènes métaboliques et biochimiques qui permettent d’expliquer la
complexité des mécanismes d’accumulation des TG dans le foie.
13
2.2.2.4. Mécanismes biochimiques d’accumulation des triglycérides dans
le foie
L’accumulation des lipides dans le foie peut résulter de plusieurs voies
métaboliques dont une hausse de la lipolyse au niveau des tissus adipeux et de
la synthèse hépatique des acides gras, une baisse de la synthèse/excrétion des
lipoprotéines de très faible densité (VLDL), une hausse de l’estérification des TG
et une baisse du taux de la β-oxydation mitochondriale (Ferramosca & Zara,
2014; Wei et al., 2013). Parmi ces causes, il a été suggéré que la DNL jouerait un
rôle significatif dans le développement de la SHNA (Donnelly et al., 2005; Ferre
& Foufelle, 2010; Postic & Girard, 2008).
Il convient tout d’abord de noter que, dans les conditions physiologiques
normales, le foie n’est pas considéré comme un organe de réserve des lipides. Le
foie assemble des TG à partir des acides gras et synthétise ces derniers à partir
des glucides et acides aminés quand ceux-ci sont en excès. Le foie synthétise
aussi des phospholipides, cholestérol et lipoprotéines qui sont ensuite exportés
dans le système circulatoire. Par ailleurs, l’hydrolyse des TG dans le foie produit
des acides gras qui sont b-oxydés, générant ainsi de l’énergie pour les
hépatocytes. C’est pour cela qu’il existe une circulation et une sécrétion
continues des TG et des acides gras par le foie (Poumes-Ballihaut et al., 2001).
Donc, l’accumulation des TG dans le foie résulte principalement d’un
déséquilibre entre l’apport en gras alimentaire, la production des lipides et la
DNL, et l’utilisation des lipides par la b-oxydation des acides gras et l’exportation
à jeun des TG par les VLDL (Kawano & Cohen, 2013). Par la DNL, le foie
synthétise des acides gras, qui sont ensuite estérifiés en TG, à partir des sucres
alimentaires. À présent, une exploration de chacun des mécanismes suspectés
permettra de mettre en lumière la complexité de la pathogenèse de la stéatose
hépatique.
14
2.2.2.4.1. Le rôle des acides gras libres dans la pathogenèse du foie gras
L’accumulation des lipides dans le foie est principalement associée à une
augmentation du flux des AGL vers le foie. Donnelly et collaborateurs ont montré
qu’environ 60% des TG hépatiques proviennent des AGL soit exogènes (tissus
adipeux) soit provenant de la DNL à partir du glucose (Donnelly et al., 2005).
Alors que Puri et collaborateurs n’ont pas trouvé de différence significative entre
les concentrations hépatiques en AGL des foies normaux et des foies des
personnes affectées par la SHNA (5,53±1,21 nmol/g et 5,93±1,87 nmol/g,
respectivement) (Puri et al., 2007), une autre étude a rapporté que les patients
atteints de SHNA avaient des concentrations plasmatiques élevées en AGL
provenant des tissus adipeux (Fabbrini et al., 2008). Cette situation favorise la
synthèse des TG accompagnée d’une baisse de l’exportation des TG du foie à
cause d’une baisse dans la synthèse et la sécrétion des VLDL et une baisse de la
b-oxydation (Donnelly et al., 2005; Dowman et al., 2010).
2.2.2.4.2. Le rôle de la b-oxydation dans la pathogenèse du foie gras
La relation entre la b-oxydation et l’accumulation des lipides hépatiques peut
être schématisée succinctement de la manière suivante. La b-oxydation des
acides gras fait intervenir une variété d’enzymes dont les activités sont cruciales
pour la production de l’ATP et des corps cétoniques. Il est connu que la b-
oxydation hépatique est favorisée par le glucagon (et les PPARa) pendant les
périodes de jeûne alors que l’insuline et le glucose réduisent ce processus en
favorisant la lipogenèse à travers l’augmentation de l’activité du sterol regulatory
element binding protein 1c (SREBP1c) et l’inhibition de la carnitine palmitoyl-
transferase 1 (CPT-1) (Kawano & Cohen, 2013). On peut donc remarquer qu’une
perturbation de l’un de ces processus peut conduire à l’accumulation des lipides
et une baisse de la b-oxydation.
15
Mais il convient de préciser que toutes les études n’observent pas de consensus
quant à cette conclusion. Cortez-Pinto et collaborateurs ont observé une
détérioration de la production d’ATP chez des patients affectés par les MHNA et
la RI (Cortez-Pinto et al., 1999), alors qu’une autre étude (Sanyal et al., 2001)
observe une augmentation de la b-oxydation chez les patients souffrant de la
SHNA. Il est possible que ces résultats contradictoires soient une démonstration
de la complexité des mécanismes qui sous-tendent le spectre des MHNA. Dans
le cas d’une augmentation de la b-oxydation, il est possible qu’une telle situation
conduise au stress oxydant dans le foie, favorisant le développement de la
stéatose couplée à l’inflammation à partir de la simple stéatose, comme le
suggère l’étude de Pessayre et Fromenty (Pessayre & Fromenty, 2005).
2.2.2.4.3. Le rôle de la lipogenèse de novo dans la pathogenèse du foie gras
Concernant la lipogenèse de novo, il a déjà été noté plus haut que l’accumulation
des TG dans le foie est en partie due à la baisse de la sécrétion des VLDL. L’hyper-
insulinémie due à la résistance à l’insuline favorise à la fois une baisse de la
sécrétion des VLDL et la stimulation de l’activité des enzymes impliquées dans
la DNL résultant en une production et stockage des TG (Petta et al., 2009). Pour
rappel, la contribution de la DNL à l’accumulation des TG dans le foie est en
deçà de 5% chez les sujets normaux alors qu’elle est de 26% chez les sujets
affectés par les MHNA (Schwenger & Allard, 2014). Comme la surproduction des
particules de VLDL a été observée dans des conditions de SHNA, un
accroissement de la DNL et une lipolyse des lipides intra-hépatiques et intra-
abdominaux ont été observés (Fabbrini et al., 2008). Ces données montrent que
la pathogenèse des SHNA peut aussi être reliée à une perturbation de
l’assemblage en plus de la sécrétion des VLDL (Kawano & Cohen, 2013).
On peut donc conclure que les quatre facteurs que sont le flux des AGL, la
synthèse des TG, la b-oxydation des acides gras et la sécrétion des VLDL ont un
point commun : la résistance à l’insuline. La résistance à l’insuline et son
16
corollaire, l’hyperinsulinémie, conduit doublement à l’accumulation des lipides
hépatiques. D’une part, la RI réduit le frein de l’hormone sur la lipolyse dans les
tissus adipeux qui libère des acides gras libres, résultant en un accroissement
du flux de ces derniers vers le foie. D’autre part, la RI induit une augmentation
de la synthèse des acides gras et des TG en favorisant la DNL (Aubert et al.,
2011). Dans ces conditions, on comprend que certains auteurs considèrent que
la résistance à l’insuline joue un rôle majeur dans l’accumulation des lipides
dans le foie (Aubert et al., 2011). Mais, en plus de ces mécanismes, il ne faudrait
pas négliger le rôle des mitochondries.
2.2.2.5. Perturbations du métabolisme lipidique : rôle des mitochondries
Compte tenu du rôle des mitochondries dans la b-oxydation des acides gras, des
études ont suggéré que la stéatose hépatique non-alcoolique serait un problème
résultant des dysfonctionnements mitochondriaux (Outlaw & Ibdah, 2005;
Pessayre & Fromenty, 2005; Sanyal, 2001; Sanyal et al., 2001). Des lésions
structurales, des déplétions de l’ADN mitochondrial, la baisse de l’activité des
complexes des chaînes respiratoires ainsi qu’une dérégulation de la β-oxydation
peuvent constituer des obstacles au bon fonctionnement mitochondrial. Ces
dysfonctionnements engendreraient l’accumulation des lipides dans le foie, la
génération d’espèces réactives oxydées et la production des cytokines,
enclenchant ainsi l’inflammation et la fibrose hépatique (Wei et al., 2006). Des
altérations de la fonction mitochondriale peuvent générer l’accumulation des
lipides dans le foie, en partie à cause des activités des enzymes lipolytiques et
lipogéniques. En particulier, une étude a conclu que le transporteur de citrate
mitochondrial agirait comme une sonde des changements affectant la lipogenèse
hépatique qui à son tour contribuerait au dépôt des lipides dans le foie
(Ferramosca et al., 2012; Ferramosca et al., 2008). Comme il existe une
coordination entre les activités des enzymes lipolytiques et lipogéniques
(Ferramosca & Zara, 2014), les enzymes impliquées dans ces voies métaboliques
peuvent être considérées comme des indicateurs fiables de l’homéostasie
lipidique. L’inhibition de l’acide gras synthase (fatty acid synthase, FAS, une
17
enzyme lipogénique) entraîne une accumulation de malonyl-CoA hépatique
occasionnant du même coup l’inhibition de la carnitine palmitoyltransférase
(CPT-1) qui est une enzyme lipolytique. Donc une étude des activités des
enzymes lipolytiques et lipogéniques peut mettre en lumière le mécanisme
d’accumulation des lipides dans le foie.
En conclusion, une augmentation du flux des AGL vers le foie peut conduire à
l’augmentation de la RI qui à son tour conduit à l’augmentation de la lipolyse du
tissu adipeux. En effet, dans les conditions normales, l’insuline inhibe la lipolyse
des TG du tissu adipeux qui génère des acides gras. En état de jeûne, les TG
sont hydrolysées et les acides gras sont libérés dans la circulation pour être
utilisés. Cependant, en situation postprandiale cette libération est inhibée par
l’insuline dont la sécrétion est favorisée par les sucres alimentaires (Karpe et al.,
2011). La RI ne permettant plus cette inhibition, il en résulte une augmentation
des AGL dans le foie qui peut favoriser la synthèse des TG, la peroxydation des
lipides et peut-être la production des cytokines pro-inflammatoires (Bugianesi et
al., 2006). Une augmentation du flux des AGL au foie peut non seulement
accroître les risques de développer la résistance à l’insuline, mais elle peut aussi
conduire à ce que les capacités pour la b-oxydation mitochondriale soient
dépassées, potentiellement enclenchant davantage le stress oxydant et
l’inflammation (Schreuder et al., 2008).
2.3. Le syndrome cardiométabolique, l’inflammation chronique et les cytokines inflammatoires
Comme pour plusieurs autres maladies chroniques, l’inflammation chronique
(IC) de faible grade est une des caractéristiques du syndrome cardiométabolique
et le paragraphe précédent a déjà indiqué comment l’accumulation des lipides
dans le foie peut générer un état inflammatoire. L’IC est une forme
d’inflammation qui n’élicite pas une réponse inflammatoire intense comme cela
est le cas dans d’inflammation aiguë. La FID définit l’inflammation
18
caractéristique du SMét par une élévation du CRP hautement sensible (hsCRP),
une élévation des cytokines pro-inflammatoires telles le TNF-a et l’IL-6, et une
baisse de concentration de l’adiponectine plasmatique (Alberti et al., 2006). Des
études ont montré des liens entre certaines caractéristiques du SCardMét et
l’inflammation chronique. Chez les enfants obèses ou en surpoids, il a été
observé une inflammation systémique (Visser et al., 2001). Il a été montré que
des cas d’athérosclérose et de diabète de type 2 étaient associés à l’inflammation
(Plutzky, 2004).
Il existe aussi des liens établis entre l’obésité, la RI et l’inflammation (Fernandez-
Real et al., 2003). En particulier, les sujets les plus insulinorésistants présentent
une hausse de CRP, alors que chez les individus en surpoids, les concentrations
plasmatiques d’AGL et d’AGPI n-6 étaient positivement associées aux
concentrations d’IL-6. Par ailleurs, chez des enfants et adolescents en surpoids,
il a été montré que les concentrations de CRP sont associées aux concentrations
de l’insuline à jeun (Kelly et al., 2004). En outre, une étude sur des souris obèses
(Pedersen et al., 2015) a montré que l’étendue de l’inflammation du tissu
adipeux, qui inclut une expansion accrue des macrophages et l’expression des
cytokines, est significativement favorisée par une insulinémie élevée et la baisse
de cette dernière réduit l’expression des macrophages des tissus adipeux.
La littérature abonde des études des liens entre l’accumulation des macrophages
dans les tissus adipeux et l’inflammation chez des sujets en surpoids (Olefsky &
Glass, 2010). En situation de surcharge énergétique, une augmentation du
nombre et de la taille des adipocytes peut se manifester. Une étude a montré que
l’obésité est associée à une accumulation des macrophages dans le tissu adipeux
(Weisberg et al., 2003). D’après cette même étude, la majorité de l’expression de
TNF-a et de l’expression d’une grande partie de la synthase de l’oxyde nitrique
de forme inductible (iNOS) et de l’IL-6 était produite par les macrophages du
tissu adipeux. Ces éléments conduisent à penser que l’obésité est une
19
pathophysiologie inflammatoire car l’inflammation peut être considérée comme
un lien pathophysiologique entre l’obésité et les maladies métaboliques (Lumeng
& Saltiel, 2011) et qu’elle est le médiateur entre l’obésité et la résistance à
l’insuline (Kwon & Pessin, 2013).
Dans une analyse par modélisation en équation structurelle, Chan et
collaborateurs ont montré le rôle central que joue l’obésité (et ses marqueurs : la
dyslipidémie, l’activation endothéliale) et les cytokines dans le syndrome
métabolique (Chan et al., 2002). Cette étude a montré que l’obésité, la
dyslipidémie et les cytokines sont les variables qui expliquent les différents
facteurs du syndrome métabolique. Dans le cadre de cette étude, il convient de
préciser pourquoi la mesure de l’IL-6 a été choisie comme déterminant de
l’inflammation chronique consécutive à une accumulation des lipides dans le
foie.
L’IL-6 exerce de nombreuses fonctions en raison de ses effets sur les systèmes
immunitaire et non-immunitaire (Hunter & Jones, 2015). En plus, cette cytokine
exerce, selon les contextes, un rôle à la fois pro- et anti-inflammatoire. Mais son
rôle va plus loin, ce qui en fait une cytokine pléiotropique qui affecte aussi bien
les maladies vasculaires que le métabolisme lipidique, la résistance à l’insuline,
les activités mitochondriales, le système neuroendocrinien et le comportement
neuropsychologique (Hunter & Jones, 2015). Dans des études des neutrophiles
humains, il a été montré que le CRP stimule la perte des récepteurs de l’IL-6
(Hunter & Jones, 2015). Par ailleurs, cibler l’IL-6 ou le récepteur de l’IL-6 (IL-6R)
conduit rapidement à la maîtrise de l’élévation systémique de CRP (Jones et al.,
2011). Enfin, il est connu que l’IL-6 est un indicateur plus robuste que le CRP
dans la prédiction de la mortalité cardiovasculaire (Panichi et al., 2006). Même
si l’IL-6 et TNF-a ont différentes variables explicatives et différents effets (Chan
et al., 2002), les deux cytokines sont en général élevées dans plusieurs états
inflammatoires (Scheller et al., 2011). Il reste, néanmoins, que l’IL-6 joue un rôle
crucial puisque cette cytokine facilite la transition de l’immunité innée à
20
l’immunité acquise (Scheller et al., 2011). En plus de ces liens entre l’IL-6 et les
deux autres cytokines, il convient de noter que l’inhibition de l’IL-6 altère les
activités des enzymes de la fonction hépatique (ALT et AST), la composition en
lipides sanguins (Choy et al., 2013), suggérant que l’IL-6 exerce un certain
contrôle sur le métabolisme (Scheller et al., 2011). C’est donc en raison de son
rôle pléiotropique que l’IL-6 a été choisie dans cette étude comme cytokine de
choix pour évaluer les effets des MCAG sur l’inflammation et le stress oxydant.
2.4. Le syndrome cardiométabolique et le stress oxydant
Il est reconnu que l’accumulation des lipides dans le foie favorise la production
mitochondriale des radicaux libres et des espèces réactives d’oxygène (ROS) qui
à leur tour peuvent initier le stress oxydatif (Fromenty et al., 2004). Les ROS
sont par ailleurs responsables de la peroxydation des lipides membranaires et
cette dernière peut occasionner l’altération généralisée de la fonction
membranaire (Slater, 1984). Il convient à présent de préciser plus en détails la
mise en place du stress oxydant et ses conditions pathophysiologiques associées
au syndrome cardiométabolique.
2.4.1. Le stress oxydant
Le stress oxydant peut être défini comme un déséquilibre entre la production des
radicaux libres et la capacité antioxydante en faveur des premiers. Les radicaux
libres sont des espèces moléculaires à très haute réactivité qui peuvent être
générées soit dans les conditions physiologiques normales ou sous certains
stress (Bashan et al., 2009). Une augmentation du stress oxydant peut survenir
dans les cas de flux importants de radicaux libres ou une baisse des
concentrations d’antioxydants. Une telle augmentation est considérée comme un
facteur crucial dans la pathogenèse de l’obésité, l’athérosclérose, le diabète de
type 2 et la résistance à l’insuline (Brownlee, 2001; Furukawa et al., 2004;
Houstis et al., 2006). Face aux espèces (molécules ou ions) oxydantes,
l’organisme utilise diverses enzymes anti-oxydantes telles le superoxyde
21
dismutase (Sodergren et al., 2001), le glutathione peroxydase (GPX) et des agents
non-enzymatiques comme les vitamines (vitamine C, vitamine E) et le glutathione
afin de maintenir l’équilibre redox. Le stress oxydant survient quand la capacité
antioxydante de l’organisme est dépassée par la production de radicaux libres,
situation qui est à la base de plusieurs conditions physiopathologiques comme
illustrée sur la Figure 2.1.
2.4.2. Les isoprostanes, marqueurs du stress oxydant
Les isoprostanes (F2-IsoP) sont des dérivés oxydés de l’acide arachidonique (AA)
produits de manière non-enzymatique. La formation des F2-IsoP à partir de l’AA
fait partie du processus de la peroxydation des lipides à la suite d’une attaque
des radicaux libres (Figure 2.2).
Alors qu’ils sont semblables aux prostaglandines, les F2-IsoP se forment in vivo
par un mécanisme impliquant les radicaux libres sans intervention des
cyclooxygénases (Roberts & Morrow, 2000). La particularité des F2-IsoP est que,
d’une part ils sont des molécules bioactives comme les prostaglandines et que,
d’autre part, ils sont formés in vivo (Milne et al., 2011). Par ailleurs, les F2-IsoP
sont les marqueurs in vivo du stress oxydant (Milne et al., 2005).
22
Figure 2.1. Le stress oxydant et ses relations avec des conditions physiopathologiques associées au syndrome cardiométabolique. Traduit et adapté de (Matsuda & Shimomura, 2013). Keaney et collaborateurs ont montré que, chez l’humain, l’accumulation des
lipides aussi bien que la consommation de cigarettes et le diabète sont
hautement associés au stress oxydant attesté par une production élevée de 8-
iso-prostaglandine F2a (8-iso-PGF2a ou 15-F2t-IsoP) (Keaney et al., 2003). Par
ailleurs, des études ont observé des liens entre la dyslipidémie dans le contexte
de l’obésité et le stress oxydant (Matsuda & Shimomura, 2013). Non seulement
les radicaux libres peuvent contribuer à la RI, mais ils peuvent aussi provoquer
l’inflammation du tissu adipeux. De ce point de vue, la mesure des F2-IsoP
devient aussi une mesure indirecte de la production in vivo des radicaux libres
(Figure 2.3).
Tissu adipeux
NADPH oxydase
Enzymes antioxydantesCatalase, SOD, GPX
Stress oxydant AdiponectineInflammation
Artères Cerveau Foie/muscles Cellules beta
Hypertension Dyslipidémie Diabète de type 2
Athérosclérose Cancer
Résistance à l’insuline
23
Figure 2.2. Formation d’isoprostanes à partir de l’acide arachidonique. Repris avec permission de Milne, GL, Yin, H, Hardy, KD, Davies, SS, Roberts II, J. (Milne et al., 2011) Isoprostane : Generation and Function. Chem. Rev., 111(10): 5973-5996. Copyright 2011 American Chemical Society.
24
Figure 2.3. Facteurs qui contribuent à la production des radicaux libres et à la pathogenèse du syndrome métabolique. Traduit et adapté de (Matsuda & Shimomura, 2013)
Si les F2-IsoP sont les marqueurs in vivo du stress oxydant, une étude a montré
que le métabolite de F2-IsoP – le 2,3-dinor-5,6-dihydro-15-F2t-isoprostane
(Figure 2.4)- est le marqueur urinaire le plus approprié (Dorjgochoo et al., 2012).
Mais comme cette conclusion a été tirée dans une étude sur l’évaluation des
effets des suppléments antioxydants, il serait peut-être hâtif de l’extrapoler à
tous les cas.
Tissu adipeux(viscéral)
ROS
Cytokines inflammatoires
Acides grasInsuline
GlucoseSérum
Résistance à l’insulineTNF-a, IL-6, MCP-1
Inflammation du tissue adipeuxAdiponectine
Syndrome métabolique
25
Figure 2.4. Métabolites du 15-F2t-IsoP. Adapté avec permission de Milne, GL, Yin, H, Hardy, KD, Davies, SS, Roberts II, J. (Milne et al., 2011). Isoprostane: Generation and Function. Chem. Rev., 111(10): 5973-5996. Copyright 2011 American Chemical Society.
2.5. Le syndrome cardiométabolique et la dyslipidémie
Les liens entre l'obésité et la dyslipidémie ont déjà été documentés (Bays et al.,
2013). Il est estimé que 60 à 70% des patients obèses et 50 à 60% de personnes
en surpoids présentent une dyslipidémie (Feingold & Grunfeld, 2000a, 2000b).
Cette dernière serait une résultante de la combinaison de la résistance à
l’insuline (RI) et l’état inflammatoire caractéristique de l’obésité (Klop et al.,
2013). La dyslipidémie ou anomalies lipidiques sanguines incluent des
concentrations sériques élevées en TG, cholestérol des VLDL, apolipoprotéine B
et en cholestérol non-HDL, alors que les concentrations en cholestérol des HDL
sont généralement faibles (Poumes-Ballihaut et al., 2001). Les taux élevés de TG
sont principalement causés par une production hépatique de cholestérol des
VLDL, sans toutefois exclure la possibilité qu’une baisse de l’élimination des
26
lipoprotéines riches en TG contribue à ce phénomène. Les taux de cholestérol
des LDL sont généralement normaux même s’il peut exister une concentration
élevée en petites particules denses de cholestérol des LDL. Par ailleurs, des
études montrent que l’obésité s’accompagne d’une augmentation de la synthèse
de novo des acides gras (Feingold & Grunfeld, 2000a). Ce dernier phénomène est
en général médié par l’hyperinsulinémie qui stimule l’activité du stearoyl
regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c), un facteur de transcription
connu pour son rôle dans la stimulation d’enzymes impliqués dans la synthèse
d’acides gras dans le foie. Il a aussi été montré que, dans les modèles animaux
de l’obésité, la synthèse d’acides gras au niveau intestinal est augmentée et
accompagnée d’une augmentation de la sécrétion des chylomicrons.
L’accumulation ectopique des lipides peut aussi s’accompagner d’un état
inflammatoire susceptible d’induire une dyslipidémie (Khovidhunkit et al.,
2004). En effet, des concentrations élevées de cytokines pro-inflammatoires
stimulent la production de lipoprotéines riches en TG tout en limitant leur
élimination. Les conséquences d’un état inflammatoire consécutif à
l’accumulation de gras ectopique ou à l’obésité sont encore plus marquantes
pour le cholestérol des HDL (Feingold & Grunfeld, 2010). Les cytokines pro-
inflammatoires baissent la production de l’Apo A-1, la principale protéine des
HDL. Ces mêmes cytokines baissent l’activité des récepteurs ABCA1 et ABCG1,
résultant en une baisse de l’afflux des phospholipides et cholestérol cellulaires
vers le cholestérol des HDL. Elles baissent aussi la production et l’activité de la
lecithine cholesterol acyltransferase (LCAT), limitant de ce fait la conversion du
cholestérol en esters de cholestérol dans les HDL, étape nécessaire à la formation
des particules sphériques de HDL. Elles baissent en outre les taux de la
cholesterol ester transfer protein (CETP), ce qui réduit le flux de cholestérol des
HDL vers les lipoprotéines contenant l’Apo B, les VLDL et LDL. Ces éléments
indiquent que l’obésité et les facteurs qui y sont associés, dont l’inflammation
chronique, empêchent un fonctionnement normal du transport inverse du
cholestérol vers le foie. Il est donc permis de conclure que la dyslipidémie dans
27
les cas d’accumulation des lipides dans le foie ne peut pas être considérée comme
un phénomène isolé.
2.6. Régulation de la stéatose hépatique par les gènes et les habitudes de vie
2.6.1. Facteurs génétiques
Comme indiqué dans le paragraphe précédent, certaines habitudes de vie
peuvent favoriser la prévalence de la stéatose hépatique. Cependant, ces
habitudes de vie à elles seules ne peuvent expliquer le développement de la
stéatose hépatique. L’accumulation des lipides dans le foie peut être favorisée
par des antécédents génétiques puisque la lipogenèse hépatique peut être
régulée par des facteurs génétiques (Strable & Ntambi, 2010). Concernant ces
derniers, Macaluso et collaborateurs ont recensé plusieurs gènes qui jouent
potentiellement différents rôles dans la pathogenèse de ces maladies associées
au foie gras (Macaluso et al., 2015). Benedict et Zhang (2017) ont montré que les
gènes impliqués dans la stéatose hépatique pouvaient être regroupés en sept
catégories : (1) les gènes associés à la sécrétion et l’oxydation des lipides
(PNPLA3, TM6SF2, NR1I2, PPAR-alpha, PEMT, MTTP, APOC3 and APOE); (2) les
gènes reliés au métabolisme du glucose et la RI (ENPP1/IRS1, GCKR, SLC2A1,
GOAT, TCF7L2 and PPARG); (3) les gènes associés à la stéatose et l’importation
ou la synthèse des lipides (SLC27A5, FADS1, and LPIN1); (4) les gènes associés
à la stéatohépatite et le stress oxydant (HFE, GCLC/GCLM, ABCC2 and SOD2);
(5) les gènes associés à la stéatohépatite et la réponse aux endotoxines
steatohepatitis (TLR4 and CD14); (6) les gènes associés aux cytokines (TNF-a et
IL-6) et (7) les gènes associés à la fibrose (AGTR1 and KLF6). Sans chercher à
recenser tous ces gènes, il convient toutefois de souligner le rôle de deux gènes
en particulier : le PNPLA3 et le TM6SF2. Le gène PNPLA3 a été associée à une
augmentation de TG hépatiques, mis en lumière en particulier dans la « Dallas
Heart Study ». Cette étude a montré que, parmi la population américaine (États-
Unis) affectée par les maladies du foie non alcooliques (MFNA), il y a 24%
28
d’Africains-Américains, 33% de Caucasiens and 45% d’Hispaniques. Une étude
des aspects génétiques de ces données épidémiologiques révèle que la prévalence
d’homozygotes PNPLA3 (gène de l’adiponutrine, enzyme impliquée dans le
catabolisme des TG et dont le dysfonctionnement est associé à l’accumulation
des substances lipotoxiques dans le foie) est de 2% chez les Africains-Américains,
5% chez les Caucasiens et 25% pour les Hispaniques (Preiss & Sattar, 2008).
Ces données ont porté à suspecter une association entre la prévalence
d’homozygotes PNPLA3 et la proportion des personnes présentant les MFNA.
Quant au gène TM6SF2, qui serait requis pour une sécrétion normale des VLDL
et un régulateur du métabolisme lipidique hépatique, il a été montré que sa
fréquence était élevée chez des sujets d’origine européenne, africaine et latine
américaine (Benedict & Zhang, 2017).
2.6.2. Régulation par les habitudes de vie
En plus des gènes, les habitudes de vie, dont l’inactivité physique et
l’alimentation, ainsi que la composition en acides gras de l’alimentation jouent
un important rôle dans le développement de l’obésité et le processus
d’accumulation des lipides dans le foie. Il est connu que la quantité et la qualité
des lipides apportés par l’alimentation influence le métabolisme lipidique
(Feldstein, 2010; Jump, 2011; Lee et al., 2007; Masterton et al., 2010; Santoro
et al., 2014). En particulier, les bienfaits d’huiles riches en acides gras
polyinsaturés (AGPI) ont été soulignés car ces derniers seraient inhibiteurs de la
lipogenèse hépatique (Jump, 2011) en réduisant de façon significative l’activité
et l’expression du transporteur de citrate (Ferramosca & Zara, 2014). Les AGPI
n-3 par exemple sont connus pour limiter l’accumulation des TG dans le foie (Di
Minno et al., 2002; Xin et al., 2008), alors qu’une alimentation pauvre en AGPI
n-3 ou riche en rapport n-6/n-3 est associée au foie gras (El-Badry et al., 2007).
Les acides gras saturés (AGS) causeraient des dysfonctions du foie par la
promotion du stress et l’apoptose au niveau du réticulum endoplasmique
(Pfaffenbach et al., 2010; Wang et al., 2006; We i et al., 2006). Musso et al.
29
(Musso et al., 2003) ont observé par exemple qu’une alimentation riche en AGS
et en cholestérol, mais faible en AGPI, fibres et vitamines C et E, accroît les
risques de la stéatohépatite d’origine non alcoolique. En revanche, une
alimentation riche en glucides accroît les risques de l’inflammation hépatique
tout en augmentant les lipides hépatiques, l’adiposité viscérale et les TG
plasmatiques (Macaluso et al., 2015).
Une diète déficiente en choline est reconnue pour induire l’accumulation des
lipides dans le foie en réduisant la phosphatidylcholine hépatique, et diminuant
de ce fait la sécrétion des VLDL contenant des TG. Dans les années 1950, les
expériences cliniques de Meneghello et Niemeyer ont montré que l’ajout de la
choline à une diète pouvait améliorer la stéatose hépatique chez des enfants
Chiliens sous-nourris (Meneghello & Niemeyer, 1950). Tout au début des années
2000, Leclercq et collaborateurs ont confirmé ces résultats (Leclercq et al., 2000).
Tout récemment, dans une étude chez la souris, Syed et collaborateurs ont
montré que la supplémentation en choline améliore les paramètres du
métabolisme des lipides et de la méthionine (Syed et al., 2016). Concernant les
paramètres lipidiques, cette étude montre que la supplémentation en choline n’a
pas amélioré le score de la stéatose hépatique (calculé à partir de l’infiltration
des TG dans le foie). Par ailleurs, cette même étude a mis en lumière les
différences entre les souris mâles et femelles quant à la réponse à la déficience
ou la supplémentation en choline. Les souris femelles développent plus de
stéatose quand elles sont nourries avec une diète déficiente par rapport aux
souris mâles (élévation de l’ALT et TG hépatiques). Ces contrastes soulignent à
la fois la complexité des effets de la diète sur certains désordres métaboliques,
mais aussi les facteurs qui modulent ces facteurs dont le sexe.
30
2.6.3. Facteurs nutritionnels réduisant l’inflammation chronique Si l’inflammation chronique est une composante du syndrome métabolique, il
convient de noter que certains nutriments, notamment des acides gras
alimentaires, peuvent contribuer à réduire son incidence sur la santé. Deux
études ont observé qu’une augmentation de l’acide a-linolénique induit une
baisse de CRP, de l’amyloïde A sérique et de l’IL-6 chez des patients affectés par
la dyslipidémie (Bemelmans et al., 2004 ; Rallidis et al., 2003). L’étude de Trebble
et collaborateurs montre par ailleurs que la production de l’IL-6 et TNF-a est
inhibée par une diète supplémentée en huile de poisson et co-supplémentée en
antioxydants chez des sujets sains (Trebble et al., 2003). Ces données indiquent
donc un effet favorable des acides gras oméga 3 présents dans les huiles
végétales (l’acide a-linolénique) et les huiles de poisson (AEP et ADH) sur
l’inflammation chronique.
2.6.4. Les huiles végétales : une source importante d’acides gras
Les huiles végétales sont perçues comme des sources alimentaires saines
d’acides gras puisqu’elles contiennent plus d’acides gras insaturés que les corps
gras animaux. En effet, les huiles végétales sont parmi les meilleures sources
d’AGPI, dont font partie les acides gras essentiels linoléique (n-6) et α-linolénique
(n-3), et les acides gras monoinsaturés (AGMI). Deux des huiles les plus
largement utilisées en Amérique du Nord dans l’alimentation sont l’huile de
canola et l’huile de soya (Cloutier, 2017). L’huile de canola provient des graines
de canola qui sont ensuite légèrement torréfiées, écrasées et une fois l’huile
extraite, l’huile est raffinée. Le raffinage de l’huile de canola, particulièrement
l’étape de désodorisation, peut générer jusqu’à 650 mg d’acides gras cycliques
par Kg d’huile (Lambelet et al., 2003). L’huile de canola est composée de 62 %
d’acide oléique, 22 % d’acide linoléique (n-6) et 10 % d’acide α-linolénique (n-3);
elle est aussi connue pour sa richesse en tocophérols et un ratio n-6/n-3 faible
(Gunstone, 2011; Johnson et al., 2007). Bien que les effets de l’huile de canola
31
aient été revus précédemment (Lin et al., 2013), il convient de mentionner ses
effets antioxydants (Gustafsson et al., 1994), l’amélioration de l’état
d’inflammation chronique (Molinar-Toribio et al., 2015) et la baisse des taux de
cholestérol total (Gillingham et al., 2011). En revanche, l’huile de soya est riche
en acide linoléique (56%), acide oléique (21%), acide a-linolénique (8,5%) et
présente un ratio n-6/n-3 élevé (Gunstone, 2011). Elle s’est avérée obésogène et
diabétogène chez la souris (Deol et al., 2015; Midtbo et al., 2013), alors qu’une
étude a montré qu’elle réduit l’obésité chez des rats (Zhang et al., 2007). Une
étude récente (Pei et al., 2017) montre qu’une consommation excessive d’huile
de soya peut induire un gain de poids, des taux sanguins élevés de glucose,
d’insuline, de TNF-a, d’IL-6 et de CRP haute sensibilité.
Ces huiles sont donc des sources importantes d’acides gras essentiels linoléique
et a-linolénique. Ces acides gras doivent être apportés par l’alimentation
puisqu’il n’existe pas de conversion réciproque entre les AGPI n-3 et n-6. De
plus, il existe une compétition entre ces deux familles qui peut favoriser le
métabolisme de l’une aux dépens de l’autre en raison des enzymes identiques
catalysant les deux voies métaboliques (Dias et al., 2015). Compte tenu du faible
taux de conversion de l’acide a-linoléique en ses dérivés AGPI-longue chaîne n-
3 (Cunnane & Anderson, 1997; Poumes-Ballihaut et al., 2001), son oxydation
est la voie métabolique favorisée (Li et al., 2017; Wijendran & Hayes, 2004). Ces
détails montrent encore une fois combien l’apport alimentaire de ces acides gras
essentiels est nécessaire au maintien de l’homéostasie lipidique (Figure 2.5).
Cependant, les acides gras essentiels sont les plus affectés par la friture des
huiles végétales et leur baisse est accompagnée de la formation de produits
thermo-oxydatifs tels les composés polaires, les acides gras trans, les acides gras
cycliques, et d’autres composés.
32
Figure 2.5. Voies de la biosynthèse des acides gras polyinsaturés oméga 6 (AGPI n-6) et oméga 3 (AGPI n-3) à partir des acides linoléique et a-linolénique, respectivement. * précurseurs aux eicosanoïdes et docosanoïdes ; # robuste activateur des PPARa ; § robuste suppresseur de SREBP-1c nucléaire. Traduit et adapté de Jump, 2011.
AGPI n-6 AGPI n-3
18:2 18:3 Diète
18:3 18:4
20:3 20:4
20:4* 20:5* #
22:4 22:5
24:4 24:5
24:5 24:6
22:5 22:6* §
20:2 20:3
Elovl5
FADS2
Elovl5
FADS2
Elovl5
Elovl2 ou Elovl5
FADS2
FADS1
Elovl2
FADS2
beta-oxydation
33
2.7. Le traitement thermique des huiles végétales
2.7.1. Introduction
La friture est un mode culinaire utilisé depuis longtemps par les humains pour
la cuisson des aliments. Comme tout autre mode de cuisson, la friture vise à
rendre les aliments plus palatables et plus digestibles en modifiant leurs
propriétés physico-chimiques. Comparativement aux autres modes de cuisson,
la friture possède plusieurs avantages puisqu’elle permet d’obtenir une
coloration, une texture, une saveur et un goût plus intéressants (Perkins, 2007).
On comprend dès lors que l’industrie de la restauration rapide l’ait adoptée pour
son usage facile et la simplicité de son mode opérationnel (Gertz, 2014). Huit
avantages non-nutritionnels majeurs ont été associés à la friture (Blumenthal,
1996) :
ü une meilleure saveur et texture
ü un meilleur enrobage
ü une meilleure coloration brun-doré qui améliore l’attrait du produit
ü l’addition de l’huile au produit améliore la palatabilité
ü les produits frits peuvent être facilement reconditionnés
ü les aliments frits sont en même temps blanchis
ü la friture inactive les microorganismes et détruit certains pathogènes
ü l’huile est un bon medium de transfert de chaleur
Par contre, il s’avère crucial de contrôler le processus de friture car on ne doit
pas perdre de vue que « l’huile utilisée devient une part entière de l’aliment et
contribue à la flaveur, l’apparence, la texture, la durée de vie et la valeur
nutritionnelle du produit final » (Gertz, 2014). Ces avantages techniques de la
cuisson ont aussi des conséquences nutritionnelles qu’on aurait tort de négliger :
baisse des concentrations en composés antioxydants, formation des composés
polaires et des acides gras trans, ainsi de suite. Il convient donc de déterminer
(1) les différents facteurs qui affectent la stabilité thermo-oxydative des huiles,
34
(2) les différentes réactions qui ont lieu dans le milieu de la friture et les produits
formés par ces réactions et (3) les différentes stratégies permettant de réduire la
dégradation des huiles chauffées.
2.7.2. Les facteurs de la stabilité thermo-oxydative des huiles végétales
D’après une étude récente, on peut distinguer 2 groupes de facteurs qui affectent
la stabilité des huiles de friture (Aladedunye et al., 2017). Il y a d’un côté les
facteurs externes : la température, l’oxygène, le temps de cuisson, la dimension
et la composition de l’aliment. D’un autre côté, viennent les facteurs internes liés
à la composition en acides gras de l’huile de friture et son contenu en composés
antioxydants. À ces facteurs on pourrait aussi ajouter le récipient de friture, le
type de friture (continu ou intermittent), l’utilisation ou non des filtres actifs ou
passifs et l’ajout ou non de l’huile neuve au cours de la cuisson. Ces facteurs
sont à la base des réactions qui se produisent dans le milieu de friture et
affectent la qualité de l’huile de friture et des aliments frits.
2.7.3. L’impact du traitement thermique des huiles végétales sur leur qualité nutritionnelle
Des études sur la stabilité thermo-oxydative des huiles végétales ont mis en
lumière les pertes nutritionnelles qu’occasionne ce traitement. Une étude a
observé une baisse de 69% de tocophérols après sept jours de chauffage de
l’huile de canola à raison de sept heures par jour à 185 ± 5°C, imitant ainsi un
contexte de la restauration rapide (Aladedunye & Przybylski, 2009). Les résultats
de cette étude et de celle de Choe et Min (Choe & Min, 2007) montrent aussi que
la thermo-oxydation affecte négativement les AGPI. Alors que l’huile de canola à
faible teneur en acide a-linolénique résiste bien à l’oxydation (Przybylski et al.,
2013), celle à teneur élevée se dégrade plus rapidement et produit des sous-
produits indésirables quand elle est chauffée à plus de 190°C (Frankel et al.,
1985). Ces résultats soulignent combien le contenu en acide a-linolénique est
35
déterminant pour la stabilité thermo-oxydative des huiles végétales. Et le
traitement thermique conduit à une baisse de la teneur en acide α-linolénique
de 24% à 185±5°C. Cette dégradation se produit au profit de composés nocifs à
la santé humaine tels que les composés polaires (diglycérides, TG oxydés,
dimères, polymères), des monomères cycliques d’acides gras (MCAG) et des
composés à courte chaîne qui restent dans l’huile : ceux-ci étant absorbés par
les aliments frits et finalement ingérés par le consommateur. Cela ne va pas sans
impacts pathophysiologiques.
Il est reconnu que l’évaporation qui se produit à la suite de l’immersion de
l’aliment dans l’huile chaude provoque le chauffage des traces d’eau à la surface
de l’aliment. Cette évaporation entraine l’assèchement de la surface du produit
et, en raison de la formation des bulles, accroit la surface de contact entre l’huile
et l’air, accélérant de ce fait la dégradation oxydative de l’huile (Costa et al.,
1999). Mais l’évaporation peut avoir des effets protecteurs surtout quand la
formation des bulles diminue, créant une barrière entre l’huile et l’air (Gertz,
2014). Si l’eau qui est en surface de l’aliment peut s’évaporer si vite, celle à
l’intérieur peut être chauffée jusqu’au point d’ébullition et favoriser la
gélatinisation de l’amidon et la dénaturation des protéines (Gertz, 2014). Sur le
plan culinaire, l’évaporation est responsable de l’aspect croustillant du produit
frit.
Les qualités nutritives et organoleptiques de l’huile sont affectées par différents
facteurs de la friture tels l’eau, la chaleur, et l’exposition à l’oxygène de l’air
(Ziaiifar et al., 2008). L’ensemble de ces facteurs et leurs produits de réactions
sont présentés dans la Figure 2.6 (Ziaiifar et al., 2008). Ces différentes réactions
ont pour conséquence la formation de multiples produits de dégradation de
l’huile qui sont absorbés par le produit, ce qui peut baisser sa valeur nutritive
(Gertz, 2014). Le transfert des produits de dégradation vers l’aliment frit dépend
36
de plusieurs facteurs dont les dimensions du produit, sa composition et densité,
le type et la durée d’utilisation de l’huile (Ziaiifar et al., 2008).
Figure 2.6. Schéma de synthèse des réactions et leurs produits lors de la thermo-dégradation des huiles végétales et ses conséquences sur la qualité du produit. Traduit de (Ziaiifar et al., 2008), avec permission de « John Wiley and Sons » le 15 avril 2018.
2.7.3.1. Les produits de l’hydrolyse des triglycérides
L’eau apportée par l’aliment et l’humidité de l’huile sont les facteurs favorisant
les réactions d’hydrolyse dans le milieu de friture. L’hydrolyse des TG produit
des acides gras libres (AGL), des diglycérides et des monoglycérides.
HUILE DE FRITURE
ALIMENT
EAU
Acides grastrans
Composéscycliques
DimèresTrimères
Polymères
Isomérisation Cyclisation Polymérisation
Hautes temperatures (120-200°C)
CHALEUR
Déshydratation
Prise d’huile
OXYGÈNE
Oxydation Hydrolyse
Hydroperoxydes
AldéhydesKétonesAcides
ÉpoxydesDimères-trimères
MonoglycéridesDiglycérides
GlycérolAcides gras libres
Composés polaires
37
2.7.3.2. Les produits des réactions d’oxydation
Les réactions d’oxydation se produisent par la formation des radicaux libres ou
par réaction directe entre différentes molécules ou par la décomposition des
produits d’oxydation primaire (Boatella Riera & Codony, 2000). Ces réactions
produisent des TG oxydés, des époxydes et d’autres produits d’oxydation fixe.
Certains composés volatiles tels l’hexanal, le pentane, le 2,4-decadienal et le
pentanol sont aussi issus des réactions d’oxydation. Les oligomères oxydés ainsi
que des oxydes de stérol complètent la liste des produits d’oxydation.
2.7.3.3. La polymérisation et la cyclisation
La polymérisation produit des dimères non polaires et d’autres oligomères non
polaires. Les dimères et polymères sont le plus grand groupe de composés en
termes de quantité et leur formation est favorisée par la haute température du
milieu de friture (Boatella Riera & Codony, 2000). Certains de ces composés
peuvent être oxydés (polaires) ou pas (non polaires). Les dimères non polaires
peuvent constituer jusqu'à 10-30% des huiles de friture. Il convient de signaler
aussi la présence des dérivés oxydés du cholestérol et des phytostérols dans les
huiles chauffées. Par exemple, le contenu en oxydes de stérol dans les pommes
de terre frites peut varier entre 2 et 110 mg par kg de gras, avec plus de 200 mg
d’oxystérol par kg de gras (Boatella Riera & Codony, 2000). La cyclisation est le
mécanisme par lequel, à la suite d’un réchauffement de l’huile à des
températures supérieures ou égales à 200˚C, se forme un cycle dans la structure
des acides gras insaturés. Ce dernier point sera plus développé à la section 2.8
ci-dessous.
2.7.3.4. Les composés polaires, indice chimique de la dégradation des huiles de friture
Les composés polaires (CP) incluent les produits de dégradation des huiles
chauffées tels que des TG partiellement oxydés, des lipides autres que des TG,
38
et des dimères oxydés. Les CP constituent l’indice chimique de la dégradation
des huiles chauffées (Tableau 2.1 ) et peuvent constituer un facteur prédicteur
de la qualité des aliments frits (Blumenthal, 1996). Le pourcentage total des
composés polaires est considéré par l’Union Européenne comme le critère
analytique déterminant pour évaluer la qualité des huiles de friture avec un seuil
supérieur acceptable de 25% de CP (Boatella Riera & Codony, 2000).
Tableau 2.1. Un exemple de synthèse de paramètres de contrôle de qualité
de l’huile de friture dans l’Union Européenne. Source des données : Recycled Cooking Oils: Assessment of Risks for Public Health (Boatella Riera & Codony, 2000).
Paramètres Limite d’acceptabilité
Composés polaires <25-28 %
Polymères <16-18 %
Triglycérides oxydés <6-8 %
Acides gras insolubles dans l’éther
<1-2 %
Acides gras libres <5%
Viscosité <27 mPa-sec a 50 ºC
Constante diélectrique <4
Indice carbonyle <44-55
Indice p-anisidine <150-160
Fraction insaponifiable <5-6 %
2.7.4. Stratégies pour limiter la dégradation des huiles chauffées
Comme la friture des huiles végétales peut produire des composés de
dégradation qui peuvent compromettre la qualité nutritionnelle de l’huile et des
aliments frits, des stratégies sont proposées pour mitiger les effets néfastes du
traitement thermique des huiles. Une première stratégie peut consister à réduire
la température de friture et/ou la quantité d’aliment à frire afin de baisser
39
l’intensité de la formation des bulles à la surface de l’aliment (Gertz, 2014). Une
deuxième stratégie consiste à utiliser des enrobages qui facilitent le transfert de
chaleur de l’huile vers l’aliment. Aladedunye et ses collaborateurs indiquent que
la composition en acides gras et les composés antioxydants contenus dans les
huiles végétales peuvent aussi jouer un rôle important dans la stabilité de ces
huiles (Aladedunye et al., 2017).
2.7.5. Les effets des huiles thermo-oxydées sur les processus physiopathologiques
Les huiles alimentaires thermo-oxydées (chauffées à hautes températures) sont
connues pour leurs effets néfastes sur le foie et sur le métabolisme lipidique.
Chao et al. (Chao et al., 2001) montrent que ces huiles altèrent le métabolisme
lipidique chez le rat. Ces altérations sont manifestes par le fait que ces huiles
entraînent une augmentation des ARNm de l’acyl-CoA Oxydase (ACO) et du
cytochrome P450 4A1 (CYP4A1) dans le foie des rats en plus d’une augmentation
de l’activité de la CYP4A1 des microsomes hépatiques. Sülzle et collaborateurs
ont constaté que les huiles oxydées induisent l’activation du PPARα et donc la
prolifération des peroxysomes dans le foie, entraînant aussi l’oxydation des
acides gras libres au niveau des mitochondries (Sulzle et al., 2004). Toujours en
lien avec le métabolisme lipidique, l’étude de Koch et al. ont mis en lumière les
mécanismes moléculaires impliquant les acides gras oxydés (Koch et al., 2007).
Selon les résultats de cette étude, ces acides gras entraînent une baisse de taux
plasmatique et hépatique du cholestérol. Celle-ci est causée par une sur-
activation de gènes induisant l’insuline qui à leur tour inhibent l’activation de la
SREBP-2. Cela se traduit alors par l’inhibition de la transcription des protéines
impliquées dans la synthèse et l’utilisation du cholestérol. Une étude chez la
poule montre que 2% d’acides gras oxydés provenant des huiles chauffées et
incorporés à la diète des poules, entraînent une augmentation des TG
hépatiques, l’expression de l’apolipoprotéine B-100 et une baisse des TG sériques
et une activation des PPARα (Yue et al., 2011). Une autre étude chez le porc
40
montre que les porcelets nourris à l’huile rapidement thermo-oxydée tendent à
avoir un foie plus gros que les sujets nourris à la diète sans huile thermo-oxydée
(Liu et al., 2014). La même étude révèle que les huiles thermo-oxydées affectent
négativement la croissance corporelle et le taux hépatique des TG chez les
porcelets.
Santoro et al. ont montré que les métabolites oxydés dérivés de l’acide linoléique
jouent le rôle de lien pathogénique entre les lésions hépatiques et le diabète de
type 2 (Santoro et al., 2014). Non seulement les sujets affectés par la stéatose
hépatique exhibent une corrélation entre la présence des CK-18 (apparentés aux
corps de Mallory, donc biomarqueurs des lésions hépatiques) et des métabolites
oxydés dérivés de l’acide linoléique, mais en plus ces derniers sont associés à
une faible sécrétion d’insuline. Les acides gras oxydés contiennent en majorité
des mono-époxystéarates (huiles riches en AGMI) et des mono-époxyoléates
(huiles riches en AGPI) comme observé dans une étude (Berdeaux et al., 2012).
Outre que ces acides gras oxydés présentent une bonne absorption intestinale
chez les animaux et les humains (Velasco et al., 2006), la toxicité des époxylates
était déjà mise en évidence par Sugiyama et al. (Sugiyama et al., 1987). Une
étude a par ailleurs montré que les acides gras libres oxydés contribuent à la
présence des HDL pro-inflammatoires qui contiennent des lipides oxydés (Ross
et al., 2015). Il est aussi connu que les TG oxydés ainsi que des époxydes
provenant des huiles chauffées entraînent l’hypertrophie hépatique et des
dérèglement des enzymes hépatiques (Boatella Riera & Codony, 2000).
Ces données indiquent clairement que la thermo-oxydation des huiles végétales
entraîne la formation de composés aux effets délétères. Par ailleurs, les huiles
chauffées sont constituées de plusieurs sous-produits dont les effets sont
documentés et qu’il n’est pas utile de développer dans le cadre de cette thèse.
Aussi la suite de ce travail se concentre sur les MCAG issus du traitement
thermique des huiles végétales.
41
2.8. Les monomères cycliques d’acides gras
2.8.1. Formation et structures des monomères cycliques d’acides gras
Les monomères cycliques d’acides gras sont des dérivés des acides gras
insaturés (acides oléique, linoléique et a-linolénique) contenus dans les huiles
végétales chauffées à des températures supérieures ou égales à 200°C. Par
ailleurs, Berdeaux et collaborateurs (Berdeaux et al., 2007) ont observé la
formation des MCAG issus des AEP et ADH lors de la désodorisation des huiles
de poisson.
Même si des études ont suggéré que la formation des MCAG se ferait par
réarrangement péricyclique concerté (Gast et al., 1963) ou par réarrangement
radicalaire (Christie & Dobson, 2000), les limites de ces explications portent à
donner du poids à un mécanisme de formation impliquant une cyclo-addition
intramoléculaire suivie d’une migration protonique (Destaillats & Angers, 2005).
Une présentation des structures de base des MCAG issus de l’acide a-linolénique
et illustrant la cyclo-addition intramoléculaire est présentée dans la Figure 2.7.
42
Figure 2.7. Mécanismes de formation des monomères cycliques d’acides gras à partir de l’acide a-linolénique, adapté de Christie et Dobson (Christie & Dobson, 2018), avec permission de AOCS Lipid library. Les mécanismes de formation présentés dans la partie supérieure de cette figure sont ceux proposés par Destaillats et Angers (Destaillats & Angers, 2005).
2.8.2. Les effets métaboliques et physiologiques des MCAG
Une étude a observé que 60% du CO2 (témoin de l’oxydation des MCAG) sont
excrétés dans les urines 12 heures après ingestion, les autres 40% étant excrétés
dans les 48h (Iwaoka & Perkins, 1978). Cette excrétion se fait sous forme de
glucuronides et dérivés sulfate comme l’a confirmé une étude récente (Desmarais
et al., 2015). Mais les MCAG ne font pas que transiter dans l’organisme : leurs
effets ont été documentés.
A
B
A
B
Acidealpha-linolénique
Cycles à 5 atomesde Carbone
Cycles à 6 atomesde Carbone
Acide gras cycliqueà cycle à 5 atomes
de Carbone
4 isomèresde base
43
2.8.2.1. Les MCAG induisent l’hépatomégalie et l’accumulation des lipides hépatiques
Chez le rat, il a été observé un élargissement du foie avec un aspect spongieux
et de couleur jaune-blanchâtre (8-10% par rapport au contrôle) par
accumulation des lipides, des animaux nourris avec 0,15% des esters
méthyliques cycliques d’acide a-linolénique (Iwaoka & Perkins, 1976). Une autre
évaluation des effets des MCAG-linolénate sur le métabolisme et la lipogenèse a
montré qu’une diète pauvre en protéines (8-10%) et additionnée de 0,0225 ou
0,15% de MCAG réduit le taux de lipogenèse dans le foie, alors qu’une diète de
10% de protéines et 0,0225 ou 0,15% de MCAG augmente le taux de lipogenèse
dans les tissus adipeux (Iwaoka & Perkins, 1978).
Une étude sur des rates Wistar (Siess et al., 1988) a observé une augmentation
du poids relatif des foies chez les rates nourries avec 10,000 ppm de MCAG
pendant 4 semaines (5,0 ± 0,13 % du poids corporel) par rapport aux animaux
témoins (3,8 ± 0,28 % du poids corporel). Cette hypertrophie du foie a été
accompagnée d’une augmentation significative en protéine microsomale (20%) et
l’activité du cytochrome P450 (30%) pour les rates nourries avec 0,1% de MCAG
par rapport aux animaux témoins.
Après 10 semaines d’expérience, Lamboni et collaborateurs ont observé une
augmentation significative des lipides hépatiques des rats Sprague-Dawley
nourris avec l’huile de soya et 1,5g MCAG sous forme des esters méthyliques par
kg de diète (70,2 ± 1,00 mg par g de foie) par rapport au groupe témoin (57,7 ±
1,6 mg par g de foie) (Lamboni et al., 1998). Cependant, ils n’observent aucune
différence concernant le poids du foie des deux groupes de rats. En revanche, ils
constatent aussi une baisse significative du glycogène hépatique (6,75 ± 0,64 mg
par g de foie) par rapport au groupe témoin (10,65 ± 0,66 mg par g de foie). Ce
dernier résultat a été confirmé par une autre étude effectuée chez des rats Wistar
mâles nourris pendant deux semaines avec de l’huile de soya supplémentée avec
44
1g/100g de MCAG sous forme de TG (Martin et al., 2000). Cette étude a en plus
constaté que les rats nourris avec 1g/100g de MCAG présentent un foie plus
gros (18,28 ± 0,63g) par rapport aux rats du groupe témoin (14,85 ± 0,23) et ceux
nourris avec 0,1g/kg de MCAG (14,87 ± 0,35g). Les foies des rats nourris avec
1g/100g de MCAG présentent aussi un poids relatif significativement plus
important (4,82 ± 0,16 g par 100g de foie) par rapport aux témoins (3,83 ± 0,08
g/100g de foie) et aux rats nourris avec 0,1g/100g de MCAG (3,89 ± 0,08 g par
100g de foie). Ces résultats suggèrent que la dose des MCAG peut avoir un effet
sur les actions pathophysiologiques de ces derniers. Mais cette étude n’a révélé
aucune différence significative quant au ratio des lipides hépatiques totaux.
En plus, l’étude de Martin et collaborateurs (Martin et al., 2000) révèlent des
différences concernant les profils des acides gras hépatiques selon les groupes.
En particulier, elle constate une baisse significative des acides gras
monoinsaturés (AGMI) avec une diète supplémentée avec 1g/100g de MCAG
(9,96 ± 0,34g/100g) par rapport à la diète témoin (11,93 ± 0,60g/100g) alors que
le groupe nourri avec 0,1g/100g de MCAG présente une augmentation non
significative des AGMI par rapport au groupe témoin (12,99 ± 0,62g/100g). Cette
baisse des AGMI a été associée à la baisse de l’activité de la D9-désaturase
(Martin et al., 2000). Cette même étude observe une augmentation significative
de l’acide arachidonique (ARA) dans le foie des rats nourris avec 1g/100g de
MCAG (23,96 ± 0,71 g/100g) par rapport aux groupes témoin et 0,1g/100g de
MCAG (21,51 ± 0,47 g/100g et 20,19 ± 0,90 g/100g, respectivement). L’huile de
soya étant riche en acide linoléique, précurseur de l’ARA, ces résultats n’ont pas
indiqué si cette augmentation était associée à une baisse du précurseur.
Bretillon et collaborateurs ont constaté une augmentation du poids relatif du
foie des souris invalidées pour le gène PPARa (-/-) et nourries à l’huile de soya
supplémentée avec les MCAG (sous forme de TG contenant 50% de MCAG) par
rapport au groupe témoin sans MCAG (4,89 ± 0,15 vs. 4,22 ± 0,11 % du poids
45
corporel, respectivement) (Bretillon et al., 2003). La même étude observe aussi
que les souris femelles PPARa (-/-) nourries aux MCAG présentent
significativement plus de lipides hépatiques que le groupe témoin (100 ± 7 vs. 60
± 5 µg par mg de foie, respectivement). Cette étude a aussi fait ressortir la
différence sélective dans l’accumulation des lipides hépatiques selon le génotype
et le phénotype. Par exemple, des souris mâles sauvages nourries aux MCAG
présentent une accumulation significativement moindre des lipides hépatiques
(39 ± 2 µg par mg de foie) par rapport à des souris femelles PPARa (-/-) nourries
aux MCAG (100 ± 7 µg par mg de foie). Ainsi donc cette accumulation des lipides
attribuable aux MCAG peut être influencée par le sexe et le génotype.
Étant donné que les différentes études revues dans le paragraphe précédent
n’ont pas utilisé la même forme de MCAG (esters méthyliques ou TG), il n’est pas
possible d’indiquer si les résultats observés peuvent varier suivant la forme
utilisée. En revanche, qu’il s’agisse de la souris ou du rat, les MCAG entraînent
des altérations du métabolisme lipidique qui se traduisent par un foie
hypertrophié, plus de lipides hépatiques et des changements dans la
composition en acides gras hépatiques.
2.8.2.2. Les MCAG modifient les activités des enzymes lipogéniques et lipolytiques
Il est aussi connu que les MCAG affectent l’activité de certaines enzymes
hépatiques (Lamboni et al., 1998; Martin et al., 2000). L’étude de Lamboni et al.
suggère aussi que des MCAG et d’autres produits issus de la thermo-oxydation
de l’huile végétale sont responsables de la dérégulation de l’isocitrate
déshydrogénase entraînant ainsi une dysfonction du cycle de l’acide citrique
mitochondrial (Lamboni et al., 1998). Il a d’ailleurs été suggéré qu’une diète
supplémentée de MCAG induirait des changements dans la superstructure des
mitochondries (Joffre et al., 2001).
46
Les résultats de ces études suggèrent que les effets des MCAG sur l’accumulation
des lipides dans le foie pourraient être médiés par une baisse ou une
augmentation des activités de certaines enzymes lipogéniques et lipolytiques. La
baisse de glycogène hépatique pourrait suggérer que l’accumulation des lipides
dans le foie résulterait d’une lipogenèse accrue, ce que ne confirment pas les
résultats des études susmentionnées.
Cependant, aucune de ces études n’a analysé les différentes classes des lipides
hépatiques pour comparer les proportions de chacune de ces classes. Ces
données éclaireraient davantage les effets des MCAG sur l’accumulation des
lipides dans le foie. En effet, il est connu que l’accumulation des lipides dans le
foie peut être associée à un dysfonctionnement de l’assemblage et/ou l’excrétion
des VLDL (Donnelly et al., 2005; Dowman et al., 2010; Kawano & Cohen, 2013).
L’observation d’une augmentation significative des TG après administration des
MCAG pourrait alors indiquer des effets possibles des MCAG non seulement sur
la DNL, mais aussi sur le métabolisme du cholestérol.
47
Transition 1
La revue de la littérature montre que, d’une part, l’accumulation des lipides dans
le foie est un phénomène à multiples implications métaboliques et, d’autre part,
les effets des MCAG sur la stéatose hépatique ne sont pas entièrement expliqués.
Premièrement, les études évaluant les effets des MCAG n’ont pas investigué les
changements plasmatiques lipidiques, lipoprotéiques et enzymatiques
susceptibles de mettre en lumière les mécanismes sous-jacents. Deuxièmement,
certaines études antérieures ont montré que les MCAG peuvent moduler les
activités de quelques enzymes de la synthèse et de la b-oxydation des acides
gras, mais aucune n’a investigué les activités des enzymes de la synthèse de la
phosphatidylcholine, dont le contenu hépatique peut être associé à la stéatose
hépatique. Troisièmement, la stéatose hépatique peut dans certains cas induire
la lipotoxicité susceptible de causer le stress oxydant et l’inflammation. Une
étude des effets des MCAG sur ces paramètres est d’autant plus importante vu
le rôle crucial que ces résultats jouent dans la pathogenèse de l’athérosclérose
et le diabète de type 2. Quatrièmement, la revue de la littérature a montré que
les lipides alimentaires modulent le métabolisme lipidique et la stéatose
hépatique. Or, les études antérieures sur l’évaluation des effets des MCAG n’ont
utilisé que l’huile de soya dans leurs diètes. Une diversité de lipides alimentaires
serait plus à propos ; elle refléterait mieux la diversité de l’offre alimentaire
proposée sur le marché et renseignerait indirectement sur les bienfaits ou
méfaits du chauffage des huiles riches en acide a-linolénique, précurseur favori
des MCAG.
Ces questions sans réponses nous ont conduits à formuler les hypothèses et
objectifs de recherche détaillés au chapitre 3 de cette thèse.
48
Chapitre 3. Hypothèses et objectifs de recherche
Hypothèses principales
Deux hypothèses principales sont énoncées dans cette thèse :
1. Les monomères cycliques d’acides gras (MCAG) modifient le métabolisme
lipidique au foie tout en altérant des marqueurs associés à la stéatose
hépatique non alcoolique chez le rat.
2. Les réponses métaboliques aux MCAG diffèrent selon les lipides présents
dans la diète.
Hypothèses spécifiques
1) La production de MCAG à partir de l’huile de lin fournit un mélange de
MCAG avec des cycles de 5 et de 6 carbones et le processus de production
a un impact sur la qualité des fractions de MCAG.
2) Les MCAG altèrent la composition des lipides hépatiques en induisant une
accumulation des TG et une réduction de la phosphatidylcholine (PC) par
altération les voies de synthèse de la PC.
3) Les MCAG altèrent la composition en acides gras hépatiques et perturbent
la fonction hépatique.
4) Les MCAG induisent des changements dans la composition des lipides,
lipoprotéines et acides gras plasmatiques et perturbent l’homéostasie
glucidique.
5) Les MCAG induisent une augmentation de cytokines pro-inflammatoires
lesquelles sont associées au stress oxydant.
6) Les effets des MCAG sur des marqueurs du métabolisme lipidique, de
l’inflammation et du stress oxydant sont modulés par les lipides
alimentaires.
49
Objectif principal
Mesurer les effets des MCAG sur des marqueurs lipidiques, inflammatoires et de
stress oxydant reliés à la stéatose hépatique non alcoolique chez le rat et vérifier
si ces effets sont modulés par les lipides alimentaires.
Objectifs spécifiques
1) Caractériser la fraction de MCAG produite à partir de l’huile de lin et
évaluer ses effets sur la consommation et la prise de poids chez le rat.
2) Déterminer les effets des MCAG sur le contenu en lipides et sur la synthèse
de la phosphatidylcholine au niveau hépatique.
3) Déterminer les effets des MCAG sur le profil en acides gras hépatiques et
la fonction hépatique.
4) Analyser les effets des MCAG sur les lipides et lipoprotéines de même que
le profil en acides gras plasmatiques et les paramètres du métabolisme
glucidique.
5) Déterminer l’impact des MCAG sur les cytokines pro-inflammatoires et les
marqueurs du stress oxydant.
6) Évaluer les effets respectifs des MCAG sur les profils lipidiques, les
cytokines inflammatoires et les marqueurs du stress oxydant selon que les
MCAG sont supplémentés avec l’huile de canola ou l’huile de soya.
Pour réaliser ces objectifs, nous avons utilisé le modèle animal du rat Wistar
mâle et quatre diètes purifiées : huile de canola, huile de soya et chacune de ces
deux huiles avec MCAG représentant 0,5% des lipides alimentaires totaux, soit
un protocole expérimental factoriel 2 x 2. La souris est un modèle animal de
choix pour l’étude de la stéatose hépatique (Yakatashi et al., 2012) et le rat
Sprague-Dawley a été utilisé comme modèle animal de la stéatohépatite (Lieber
et al., 2004). Dans la présente étude, le rat Wistar a été utilisé parce qu’il est un
50
modèle polyvalent qui représente le mammifère standard idéal (Clause, 1993) et
approprié pour notre type d’étude. En effet, ce modèle a été utilisé pour vérifier
certains effets des MCAG et son utilisation nous permet de comparer nos
données avec celles des études précédentes. Enfin, notre étude étant
exploratoire, ce modèle de rat nous permet d’obtenir des résultats qui
permettraient de cibler l’étude des mécanismes d’action spécifiques avec des
modèles animaux plus ciblés. Par ailleurs, l’Isoflurane a été utilisé pour
l’euthanasie des rats en raison des moindres effets qu’il induit ; notamment
l’absence d’effet sur le glycogène hépatique, comparativement aux autres
méthodes qui sont susceptibles d’altérer certains paramètres biologiques des
animaux (Artwohl et al., 2005). Par exemple, l’utilisation du CO2 pourrait induire
une baisse de glycogène hépatique et de l’aspartate aminotransférase en causant
une acidose susceptible de stimuler la production d’enzymes impliquées dans
les voies glycolytiques, alors qu’aucun changement n’a été observé après
utilisation de l’Isoflurane (Artwohl et al., 2005).
51
Transition 2
La première étude, qui constitue le quatrième chapitre de cette thèse, présente
les résultats de notre recherche en rapport aux hypothèses et objectifs
spécifiques (1) à (4) et en partie (6) décrits plus haut. Ces résultats portent donc
sur : la production et la caractérisation de notre fraction de MCAG, les lipides
hépatiques et les enzymes de la voie de synthèse de la phosphatidylcholine, les
acides gras hépatiques et les enzymes de la fonction hépatique, et les paramètres
circulants suivants : les lipides, lipoprotéines, la glycémie et l’insulinémie.
Pour réaliser ces objectifs, les MCAG ont été extraits de l’huile de lin chauffée à
275 °C pendant 12h par une combinaison de chromatographie sur colonne
d’acide silicique et fractionnement à l’urée. La fraction des MCAG a été
caractérisée par chromatographie gazeuse/spectrométrie de masse (GC/MS) et
les différents isomères des MCAG ont été quantifiés par GC. Quatre diètes ont
été composées : huile de canola (CO), huile de canola contenant 0,5% de MCAG
(CC), huile de soya (SO), huile de soya contenant 0,5% de MCAG (SC). Trente-six
rats Wistar mâles ont été aléatoirement répartis dans quatre groupes (n = 9) et
nourris avec l’une des 4 diètes pendant 28 jours. La consommation de nourriture
et le poids des rats ont été mesurés quotidiennement. Les rats ont été
euthanasiés par exsanguination sous Isoflurane, les foies ont été excisés, le
plasma extrait du sang par centrifugation (10 min à 4 °C) et les carcasses ont
été broyées et lyophilisées. Les classes des lipides hépatiques ont été déterminées
par chromatographie liquide haute performance (HPLC). L’activité de la PEMT et
l’expression de la CT-a - enzymes de la voie de synthèse de la
phosphatidylcholine - ont été déterminés par l’équipe du Dr. René Jacobs de
l’Université d’Alberta à Edmonton. Les profils en acides gras hépatiques ont été
déterminés par GC et les autres paramètres ont été analysés avec des kits
commerciaux selon les instructions des fabricants. Les analyses histologiques
ont été réalisées par l’équipe du Dr. André Tchernof de l’Université Laval.
52
Chapitre 4.
Liver and plasma lipid changes induced by cyclic fatty acid monomers from heated vegetable oil in
the rat
Jean Mboma1, Nadine Leblanc1,2, Sereana Wan4, René L. Jacobs4,5, André
Tchernof1,2,6, Pascal Dubé2, Paul Angers2,3, Hélène Jacques1,2
1 Laval University, School of Nutrition, 2425 rue de l’Agriculture, Quebec City, QC, Canada
2 Laval University, Institute of Nutrition and Functional Foods, 2440 Blvd Hochelaga, Quebec City, QC, Canada
3 Laval University, Department of Food Science, 2425 rue de l’Agriculture, Quebec City, QC, Canada
4 University of Alberta, Department of Biochemistry, Edmonton, AB T6G 2S2, Canada
5 University of Alberta, Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, 4-002 Li Ka Shing Centre for Health Research Innovations, University of Alberta, Edmonton, AB T6G 2E1, Canada
6 Quebec Heart and Lung Institute, 2725, Ch. Ste-Foy, Quebec City, QC G1V 4G5, Canada
Manuscrit publié dans Food Science and Nutrition. 2018;1-12. DOI:10.1002/fsn3.766
53
4.1. Résumé
Les monomères cycliques d'acides gras (MCAG), générés par le chauffage
domestique ou industriel des huiles végétales, peuvent modifier les enzymes
hépatiques et induire une hépatomégalie et une stéatose, mais les mécanismes
sous-jacents ne sont pas clairement compris. La présente étude visait à évaluer
les effets des MCAG sur les lipides hépatiques et plasmatiques et à déterminer
si ces effets sont modulés par les lipides alimentaires. Trente-six (36) rats Wistar
mâles ont été nourris avec l'une ou l'autre des quatre diètes isoénergétiques
constituées d'huile de canola ou d'huile de soja avec ou sans 500 mg / 100 g
MCAG des lipides totaux pendant 28 jours. Les rats nourris avec les MCAG
avaient des lipides totaux hépatiques (P = 0,03) et des TG (P = 0,02) plus élevés
et des niveaux moindres de phosphatidylcholine hépatique (P = 0,02) par rapport
à ceux nourris avec les diètes sans MCAG. Les MCAG n'ont pas modifié l'activité
et l’expression hépatiques de, respectivement, la phosphatidyléthanolamine N-
méthyltransférase (PEMT) et la CTP : phosphocholine cytidylyltransférase (CT-
α). Les rats nourris avec des MCAG présentaient des taux plus élevés de
cholestérol total (TC), un ratio cholestérol TC / HDL-C également plus élevé et
moins de cholestérol HDL que les rats nourris avec les diètes sans MCAG
(P<0,05). L'alanine transaminase plasmatique (ALT) a diminué avec les MCAG.
L'insuline plasmatique, le glucose et les TG n'ont pas varié entre les quatre
groupes de diètes (P>0,05). Les rats nourris à l'huile de canola et MCAG
présentaient des taux plasmatiques plus élevés d'aspartate transaminase (AST)
et du ratio AST/ALT par rapport aux trois autres groupes. Ces résultats
indiquent que les MCAG peuvent provoquer une accumulation des TG dans le
foie résultant d’une diminution des taux de PC, mais l'effet des MCAG sur les
concentrations de PC ne semble pas passer par une altération des deux
principales voies de biosynthèse de la PC.
54
4.2. Abstract
Cyclic fatty acid monomers (CFAM) generated through domestic or industrial
heating of vegetable oils, may alter liver enzymes and induce hepatomegaly and
steatosis, but the underlying mechanisms are not clearly understood. The
present study aimed to assess the effects of CFAM on liver and plasma lipids and
to determine if these effects are modulated by dietary lipids. Thirty-six (36) male
Wistar rats were fed either of the 4 isoenergetic diets consisting of canola oil or
soybean oil with/without 500 mg/100 g CFAM of total fat for 28 days. Rats fed
CFAM had higher liver total lipids (P = 0.03), and triacylglycerols (TAG) (P = 0.02),
but less hepatic phosphatidylcholine (P = 0.02) compared to those fed the non-
CFAM diets. CFAM did not alter liver phosphatidylethanolamine N-
methyltransferase (PEMT) activity and CTP: phosphocholine cytidylyltransferase
(CT-α) protein levels. Rats fed CFAM diets had higher levels of plasma total
cholesterol (TC), higher ratio of TC to HDL cholesterol, and lower levels of HDL
cholesterol compared with rats fed non-CFAM diets (P>0.05). Plasma alanine
transaminase (ALT) was decreased with CFAM, but plasma insulin, glucose, and
TAG did not vary among the four diet groups (P<0.05). Rats fed canola oil and
CFAM had higher plasma levels of aspartate transaminase (AST) and AST/ALT
ratio compared with the other 3 diet groups. These results indicate that CFAM
may provoke an accumulation of TAG in the liver related to a decrease in PC
levels, but the effect of CFAM on PC concentrations may not occur through
impairment of the two main PC biosynthesis pathways.
55
4.3. Introduction
Hepatic accumulation of fat is an early stage of progression to non-alcoholic fatty
liver disease (NAFLD) (Vanni et al., 2010). Lipid accumulation in the liver can
result from increased adipose lipolysis, increased hepatic de novo lipogenesis
(DNL), impaired synthesis and/or secretion of VLDL cholesterol, triacylglycerol
(TAG) esterification dysfunction or impaired mitochondrial β-oxidation (Kawano
& Cohen, 2013). Typical features of hepatic steatosis and NAFLD may include
elevated TAG and fasting plasma glucose, increased or normal alanine
transaminase (ALT), and low HDL cholesterol, and can lead to insulin resistance
(IR), obesity, and type 2 diabetes mellitus (T2DM) (Yki-Jarvinen, 2014). However,
the extent of these metabolic manifestations differs with respect to dietary fat
type. For instance, diets high in trans fatty acids can increase visceral fat, liver
lipid accumulation (Dorfman et al., 2009), low-density lipoprotein (LDL)
cholesterol, and decrease high-density lipoprotein (HDL) cholesterol
(Lichtenstein et al., 1999). In hamsters, it has been found that a combination of
low monounsaturated fatty acid (MUFA) and low polyunsaturated fatty acid
(PUFA) to saturated fatty acid (SFA) ratio induces weight gain and body fat
accumulation, while a high MUFA and high PUFA/SFA ratio prevents white
adipose tissue accumulation (Liao et al., 2010).
Frying and the industrial refining of vegetable oils can generate cyclic fatty acid
monomers (CFAM) which are 18-carbon unsaturated fatty acids with internal
ring structure formed mainly from linoleic and a-linolenic acids during heating
of edible vegetable oils at temperatures of ≥ 200°C. CFAM generated from 18:3(n-
3) are composed of 16 identified isomers, with a mixture of C5- and C6-
membered rings (Dobson et al., 1995). Heated edible oils can contain up to 0.66%
CFAM of total fatty acids (Frankel et al., 1984). It has been observed that diets
containing CFAM increase either liver weight or hepatic lipid content compared
to control diets (Iwaoka & Perkins, 1976), but the underlying mechanisms are
56
not fully elucidated. Martin et al. (Martin et al., 2000) already reported that
dietary CFAM can increase the activities of liver enzymes involved in peroxisomal
β-oxidation (acyl-CoA oxidase, (ω-1)-laurate hydroxylase and ω-laurate
hydroxylase). However, in vivo studies that addressed the metabolic effects of
CFAM in rats did not document a combined effect of CFAM and different types
of dietary fat on the levels and types of lipid accumulated in the liver.
Phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine (PE), and the molecular ratio of
PC/PE play a critical role in liver health and disease (van der Veen et al., 2017).
Hepatic PC content is required both for the assembly and secretion of very low
density lipoprotein (VLDL) and chylomicrons (Skipski et al., 1967). Therefore, as
shown in mice, PC protects against the development of steatosis (Niebergall &
Vance, 2012) and a decrease in liver PC has been observed in human cases of
hepatic steatosis (Puri et al., 2007). Moreover, a recent review (van der Veen et
al., 2017) highlighted the importance of the cellular molar PC/PE ratio in the
development of hepatic steatosis. Indeed, relatively small or larger reductions in
the PC/PE molar ratio may contribute to the development of NAFLD. In the liver,
PC is biosynthesized, mainly, through the CDP-choline pathway which is
regulated by CTP: phosphocholine cytidylyltransferase (CT-a) (Vance & Vance,
2008), and via three sequential methylations of PE by PE N-methyltransferase
(PEMT) (Vance & Ridgway, 1988). Mice lacking hepatic CT-a or PEMT develop
non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), which evolves to non-alcoholic
steatohepatitis, when mice are challenged with a high-fat diet (van der Veen et
al., 2017). These observations show how both pathways are critical to liver
health. However, to our knowledge there are no studies assessing how dietary
lipids, such as CFAM, affect either of these two pathways.
Due to unresolved issues related to the effects of CFAM on hepatic fat
accumulation, the objectives of this study were to assess the effects of CFAM on
hepatic TAG, cholesterol, and phospholipids and to investigate whether these
57
effects are modulated by two different dietary fats. Canola and soybean oils were
used in this study because of their different fatty acid profiles as well as their
different n-6/n-3 ratios (canola oil: 2.2, soybean oil: 7.8), which have been shown
to have different impacts on lipid metabolism in rodents (Lee et al., 1989; Liao et
al., 2010). This study also focused on the activity of PEMT and protein expression
of CT, the two hepatic enzymes involved in phosphatidylcholine synthesis, and
other critical components of metabolic lipid processes, after CFAM
administration. We hypothesized that dietary CFAM supplementation may
increase TAG accumulation in the liver associated with impaired PC
biosynthesis.
4.4. Materials and methods
4.4.1. CFAM extraction from heated linseed oil
CFAM were extracted from heated linseed oil as previously described (Sebedio et
al., 1987). Briefly, linseed oil (Maison Orphée, Quebec City, QC, Canada) was
heated in sealed tubes under nitrogen in a HP chromatograph oven (HP 68900
series) at 275 ºC for 12 hours. After saponification and methylation, CFAM were
isolated by a combination of column chromatography and urea fractionation.
The confirmation of CFAM isomers was performed by gas chromatography-mass
spectrometry (GC-MS) after picolinyl esters of CFAM were synthesized as
previously described (Destaillats, 2002) and determination of each isomer of the
5-membered and 6-membered rings CFAM was by GC (Dobson et al., 1995). GC-
MS analyses for the confirmation of CFAM isomers structures were performed
using a gas chromatograph (Hewlett-Packard, Model 5890, Series II, Palo Alto,
CA, USA) coupled with a selective quadrupole mass detector (Agilent, model 5973
N, Palo Alto, CA). Later, CFAM-methyl esters were converted to free fatty acid by
saponification (ethanol 95% and KOH) overnight at room temperature. The
CFAM-free fatty acids were filtered with 2% bentonite and peroxides were
58
neutralized with NaS2O3. The extracts were kept at -20 ºC until incorporation in
the diet.
4.4.2. Experimental diets
Table 4.1 presents the formulation of the four (4) diet groups based on a
combination of the type of oil (canola or soybean) and the dose of CFAM (0.0 and
0.5% of total dietary lipids): canola oil (CO), canola and CFAM (CC), soybean oil
(SO) and soybean and CFAM (SC).
Fatty acid profiles of the diets were determined by gas chromatography (GC) and
are also presented in Table 4.1. The diets were formulated to be isoenergetic,
isolipidic and isonitrogenous. Total energy in diets was determined with an
adiabatic Parr 6300 calorimeter (Parr Instrument Company, Moline, IL, USA) and
was similar among the four diets (CO, 19.5 kJ/g; CC, 19.4 kJ/g; SO, 19.5 kJ/g;
SC, 19.5 kJ/g). Dietary protein content was determined by combustion (Dumas
method) using a LECO FP-528 apparatus (LECO Corporation, St. Joseph, MI,
USA) and was also found similar between the diets (CO, 19.3% (w/w); CC, 19.3%
(w/w); SO, 18.9% (w/w); SC, 19.7% (w/w). Dietary fat content was measured
with an AnkomXT10 Extractor (Ankom Technology, Macedon, NY, USA) and was
similar between the diets (CO, 10.1% (w/w/); CC, 10.3% (w/w); SO, 10.0% (w/w);
SC, 10.2% (w/w)).
4.4.3. Animals and experimental design
Thirty-six (36) male Wistar rats initially weighing ca. 150 g were housed
individually in solid-bottom cages with bedding to absorb water and urine. The
animal room was maintained at constant temperature (22 ± 2 ºC) and humidity
(45-55%) and the rats were kept at an inverted light-dark cycle with the light
being from 07.00 am to 07.00 pm. Animals were acclimated to their new
environment for 7 days and fed a rat chow (Purina Canada, Mississauga, ON)
59
and had access to tap water ad libitum. After acclimation, rats were housed in
individual cages, divided in 4 purified diet groups (Tab. 4.2) according to a 2 x 2
factorial experimental design.
After acclimation, animals were put on a 7-day adaptation period during which
they were given a gradual percentage increase of the purified diet to the chow
diet (25-75 and 50-50 for 2 days each, and 75-25 for 3 days). This was followed
by a 28-day 100% purified diet experiment. Food consumption and body weight
were recorded daily while water was given ad libitum. Food efficiency was
calculated according to the following equation:
Food efficiency = grams of daily weight gain/grams of daily food intake.
Three weeks through the experiment, animals were placed in metabolic cages
and their urine and feces were collected daily. At the end of the 28-day period,
all animals were sacrificed in a 12-hour fasting state by cardiac puncture under
isoflurane USP (Pharmaceutical Partners Canada, Richmond Hill, ON). Livers
were excised, weighed and stored directly in liquid nitrogen and thereafter at -
80ºC until analysis. After emptying the gastrointestinal tract, animal carcasses
were autoclaved, ground, lyophilized, and ground for body composition analyses.
Treatment procedures and animal care were approved by the Laval University
Animal Care Committee in accordance with the Canadian Council on Animal
Care guidelines (file #2015-004).
4.4.4. Body composition
For each rat, body composition and total energy was determined according to a
previously described method by Jacques and coworkers (Jacques et al., 2010).
Rat liver protein was determined by Leco FP-528 (St. Joseph, MI, USA) according
to the Dumas method.
60
4.4.5. Liver lipid extraction
Liver lipid extraction was performed according to Folch and collaborators (Folch
et al., 1957). Briefly, ca. 0.5 g of liver were weighed and ground with
chloroform/methanol (2:1, by vol) using a grinder (Fisher stirrer Dyna-Mix 43,
Fisher Scientific, USA). After addition of an aqueous solution of NaCl 0.78% and
shaking, the mixture was left overnight for complete separation of the two
phases. The lower phase containing total lipids was extracted, and lipids were
determined gravimetrically after evaporation of solvent under nitrogen. Liver
lipids were later stored at -20ºC for lipid classes and fatty acid analysis.
4.4.6. Liver total cholesterol, triacylglycerols (TAG), phosphatidylethanolamine (PE), and phosphatidylcholine
Total liver lipids were separated into classes by HPLC-ELSD according to a
method previously described (Morin et al., 2004). Briefly, total lipids were
dissolved in a chloroform/methanol mixture (2:1 by vol.) to a final concentration
of 2 mg/mL. Ten µL were injected into a Waters HPLC Autosampler Model 717
plus (Waters, Milford, MA, USA) connected to a Sedex 75 ELSD detector (Sedere,
Alfortville, France). The column used was a Zorbax SIL 4.6 mm ID x 150 mm
(5µm) (Agilent Technologies, Mississauga, ON, Canada). Chloroform and
methanol were used as solvents.
4.4.7. Liver fatty acid composition
Prior to gas chromatography (GC) analysis, fatty acid methyl esters were
prepared by base-catalyzed transesterification. To 10 mg of total lipids were
added 1 ml hexane and 500 µL CH3ONa 0.5 N (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
USA). After vortexing, the mixture was put in a water bath for 15 min at 40-50
ºC. 4 ml hexane and 5 ml H2O saturated in NaCl were added and the vial was
vortexed and left still at room temperature for the separation of the two phases.
The upper phase was collected, filtered and dried in a Pasteur pipette containing
61
fat-free wool and ca. 1 cm of MgSO4. FAME were quantified by GC with a
Shimadzu GC-2010 apparatus (Santa Clara, CA, USA) equipped with a flame
ionization detector (FID) at 250 °C connected to a computer with a Shimadzu
GC-Solution software. The injector temperature was kept at 250 °C. Hydrogen
was used as the carrier gas under a constant flow (1.29 mL/min). Sample
volumes (1.0 µ L) were injected with a split ratio of 50 on a 60 m x 0.25 mm i.d.
x 0.25 µm (film thickness) BPX-70 column (SGE, Melbourne, Australia).
Temperature programming mode consisted of 60 °C isothermal for 1 min,
increased to 190 °C at 10 °C/min, isothermal for 15 min, increased to 240 °C at
5 °C/min, and held for 6 min at this temperature for a total run of 45 min.
Individual FAME were identified by comparison with known standards retention
time (GC Shimadzu FAME Method RC-32 cm/s). Liver CFAM content was
determined in the same conditions.
4.4.8. Liver glycogen
Liver glycogen was determined by a coupled enzyme assay and the absorbance
was measured by colorimetry at 570 nm wavelength using a commercial assay
kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Briefly, ca. 10 mg liver were
homogenized in 100 µl H2O on ice, boiled for 5 minutes and centrifuged at 13,000
x g for 5 minutes. Glycogen was determined in 30 µl of the supernatant.
4.4.9. Liver PEMT activity and CT-a protein analysis
Liver phosphatidylethanolamine N-methyltransferase (PEMT) activity was
determined from 5 µg of liver homogenate protein according to Jacobs and
coworkers (Jacobs et al., 2004). CTP:phosphocholine citydylyltransferase (CT-a)
protein expression was determined by Western blotting as previously described
in a previous study (da Silva et al., 2015).
62
4.4.10. Liver histology and assessment of fat accumulation
Working on dry ice, liver samples were taken from whole liver after immersion in
liquid nitrogen. Liver samples were later weighed and preserved in 10%
phosphate-buffered formalin at pH 7.0 before staining with hematoxylin and
eosin (H&E) by the pathology service of the Quebec Heart and Lung Institute.
Images were captured at x20 magnification using the Zeiss Axio Observer Z1
microscope (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany).
4.4.11. Plasma analyses
4.4.11.1. Fasted triacylglycerols, total cholesterol, VLDL+LDL cholesterol, and HDL cholesterol
Triacylglycerols (TAG) were measured by a colorimetric assay kit (Cayman
Chemical) by using the hydrolysis of TAG to glycerol and free fatty acids and the
absorbance of glycerol was measured at 540 nm. Total cholesterol was measured
by a fluorometric method using a commercial kit (Cayman Chemical). VLDL+LDL
cholesterol and HDL cholesterol were measured with a colorimetric assay kit
(Abcam, Cambridge, MA, USA).
4.4.11.2. Fasted glucose and insulin
Glucose in the plasma was measured with a colorimetric assay kit (Cayman
Chemical) using the glucose oxidase-peroxide reaction and glucose
concentration was determined by measuring the absorption at 514 nm. Insulin
was measured by ELISA using a commercial kit (EMD Millipore, Saint Charles,
MO, USA).
63
4.4.11.3. Fasted ALT and AST
Alanine transaminase (ALT) activity was measured by a colorimetric assay kit
(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) by monitoring the oxidation of NADH
to NAD+ at the absorbance of 340 nm. Aspartate transaminase (AST) activity was
measured by a colorimetric assay kit (Sigma Aldrich) according to the
manufacturer’s specifications and absorbance was measured at 450 nm.
4.5. Statistical analysis
All data are expressed as mean ± SEM. ANOVA for 2 x 2 factorial experimental
design was performed with SAS software (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) to
determine the CFAM and oil effects, as well as interactions among CFAM and
dietary oils. When significant CFAM-oil interactions were detected, a Multiple
Comparison Test, i.e. Tukey Studentized Range test (HSD), was performed to
identify differences among diet groups. Pearson correlation coefficients were
calculated between variables, using the CORR procedure (SAS). The tests were
considered significant at P £ 0.05.
4.6. Results
4.6.1. CFAM production
The CFAM fraction was composed of 16 identified isomers. The cyclopentenyl
isomers accounted for 56.8% of the fraction while the cyclohexenyl isomers
accounted for the remaining 43.2% (Tab. 4.2). The CFAM fraction used in this
study was therefore a mixture of both the 5-membered and 6-membered rings
isomers (Fig. 4.1).
64
4.6.2. Effects of diets on food consumption, food efficiency, body weight gain and composition
Data for food consumption, weight gain, food efficiency, and body composition
as well as liver protein, glycogen and cholesterol are shown in Table 4.3. At the
end of the 28-day experimental period, no differences were found between the 4
groups for food consumption and weight gain.
Although CFAM did not alter food efficiency, rats fed soybean oil had a higher
food efficiency compared with the canola oil group (P = 0.02). Regarding body
composition, rats fed the four diets had similar lean and fat mass. However, rats
fed soybean oil had significantly lower total body energy content than those fed
canola oil (P = 0.03). No difference was observed for liver protein, glycogen and
cholesterol.
4.6.3. Effects of CFAM and non-CFAM diets on liver lipid composition and function
CFAM diets did not affect relative liver weight, i.e. the ratio of liver weight to final
body weight (Tab. 4.3). Liver total lipids (P = 0.03, Fig. 4.2A) and TAG (P = 0.02,
Fig. 4.2B) were higher in rats fed CFAM diets compared to those fed the non-
CFAM diets. Fats deposits from histological samples stained with H&E were
visible in the livers of rats fed the CFAM diets (Fig. 4.2C). Alanine transaminase
(ALT) was reduced in the plasma of rats fed CFAM compared to the non-CFAM
diet groups (P<0.0001, Fig. 4.2D). There were significant interactions between oil
and CFAM on plasma alanine transaminase (AST) and AST/ALT ratio (P<0.05).
Rats fed canola oil and CFAM had higher plasma AST levels (P = 0.04, Fig. 4.2E)
and AST/ALT ratio (P = 0.02, Fig. 4.2F) compared with the other three diet
groups.
65
4.6.4. Effects of diets on liver lipids and phosphatidylcholine biosynthesis enzymes
No differences were observed for liver phosphatidylethanolamine (PE, Fig. 4.3A),
PEMT activity (Fig. 4.3C), and CT protein (Fig. 4.3D). The CFAM diets induced
lower phosphatidylcholine levels (P = 0.02, Fig. 4.3B) in the liver compared with
the non-CFAM diets. There was no significant difference in the PC/PE molar ratio
in rats fed the CFAM diets compared to those fed the non-CFAM diets (2.4 ± 0.1
for the CFAM diet groups, and 2.6 ± 0.1 for the non-CFAM diet groups).
4.6.5. Effects of CFAM and non-CFAM diets on liver fatty acid composition
Liver fatty acid composition is presented in Table 4.4. Rats fed canola oil had
more myristic acid (14:0), oleic acid (18:1n-9), vaccenic acid (18:1n-7),
eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5n-5), and total monounsaturated fatty acids
(MUFA) than those fed soybean oil. These had more linoleic acid (18:2n-6), a-
linolenic acid (18:3n-3), gondoic acid (20:1n-9), 20:2n-6, dihomo-g-linolenic acid
(20:3n-6), lignoceric acid (24:0), arachidonic acid (20:4n-6), total n-6 PUFA, and
total PUFA than the former.
The CFAM diets increased palmitelaidic acid (PEA, 16:1 9t) levels compared with
the non-CFAM diets. There was also an oil effect for this same fatty acid, with
canola oil inducing more PEA than soybean oil. When the two CFAM diets were
compared, rats fed the CC diet had roughly double the amount of CFAM in their
livers compared with those fed the SC diet (P = 0.0009).
4.6.7. Effects of CFAM and non-CFAM diets on plasma lipids
Plasma total cholesterol (Fig. 4.4A), triacylglycerols (Fig. 4.4B), HDL cholesterol
(Fig. 4.4C), and VLDL+LDL cholesterol (Fig. 4.4D) are presented in Figure 4.4.
Plasma TAG levels did not vary among the four diet groups. Rats fed the CFAM
66
diets had more plasma total cholesterol (P = 0.03) and VLDL+LDL cholesterol (P
= 0.003) than those fed the non-CFAM diets. In the latter case, there was also
an oil effect, whereby rats fed soybean oil had more VLDL+LDL cholesterol than
those fed canola oil (P = 0.04). Rats fed the CFAM diets had less HDL cholesterol
and higher total cholesterol to HDL cholesterol ratio than those the non-CFAM
diets (P = 0.01 and P = 0.0009, respectively).
4.6.8. Effects of diets on plasma biochemical parameters
No differences were observed for plasma fasting glucose and insulin (Tab. 4.3).
However, there was a strong tendency (P = 0.054) for the rats fed the soybean
diets with or without CFAM to induce higher fasting glucose compared with those
fed the canola diets with or without CFAM.
4.7. Discussion
In the past decades, the metabolic effects of dietary oils and certain types of fatty
acids have been fully described, showing therefore that those oils and fatty acids
can be associated with lipid improvements or disturbances. Though there exists
some evidence that dietary CFAM have a negative impact on the development of
fatty liver (Lamboni et al., 1998), evidence on the underlying mechanisms leading
up to fat accumulation in the liver is still limited. To the best of our knowledge,
this is the first study to assess the impact of cyclic fatty acid monomers (CFAM)
combined with two different dietary oils on markers of hepatic steatosis in
relative low-fat diet fed rats.
This study compared hepatic lipid and fatty acid response as well as liver
function and phosphatidylethanolamine N-methyltransferase (PEMT) activity
and CTP:phosphocholine cytidylyltransferase (CT-a) protein expression and
plasma lipid response across four 10% (w/w) fat diets. Two diets were based on
soybean oil with or without 0.5% (w/w) CFAM, and two based on canola oil with
67
without 0.5% (w/w) CFAM. The soybean oil diets consisted primarily of linoleic
acid whereas the canola oil diets of oleic acid. Thus, the untoward metabolic
responses observed with the CFAM diets, which included presence of CFAM in
the liver, increased liver TAG, decreased liver PC, increased plasma VLDL+LDL
cholesterol and decreased HDL cholesterol, were observed in both the soybean
and canola oil-based diets and were likely due to the presence of CFAM in the
diets. There were no changes in PEMT activity and CTa protein.
Most of the fatty acid modifications in the liver were due to the oil consumption.
As expected, rats fed the canola oil diets had more total MUFA and oleic acid in
the liver than those fed the soybean oil diets, which in turn had more linoleic,
arachidonic, α-linolenic acids. These differences can be explained both by the
fatty acid composition and the difference in n-6/n-3 ratio of the diets (Takeuchi
et al., 2001). Besides, differences were found in the accumulation of CFAM in
the liver of rats, with those fed canola oil and CFAM accumulating roughly double
the amount of those fed soybean and CFAM. Joffre and coworkers (Joffre et al.,
2004) reported that CFAM are b-oxidized at a lower rate compared to linoleic or
a-linolenic acids. Other studies have observed that feeding Wistar rats diets rich
in oleic acid (74.8 to 79.2% of total dietary fatty acids) for 4 weeks or more
resulted in high hepatic levels of lipids and increased de novo lipogenesis (Portillo
et al., 2001; Ruiz-Gutierrez et al., 1999; Takeuchi et al., 2001). Taken together,
these observations suggest that high hepatic CFAM levels in rats fed a high-oleic
acid diet (canola oil) containing CFAM could likely be a result of combined effects
of both the lower b-oxidation rate of CFAM and the lipogenic effect of a high-oleic
acid diet.
Increased liver lipid content observed with both CFAM diets in this study is
consistent with the literature (Iwaoka & Perkins, 1976; Lamboni et al., 1998),
but we found no significant effect of CFAM on plasma glucose and insulin. These
latter results suggest that lipid accumulation in the liver might not resulted from
68
disturbances in carbohydrate homeostasis (Adeli et al., 2001), due likely to the
normal physiological state of our rats. Increased hepatic lipid content is rarely
associated with increased cholesterol or phospholipid content, but more often
with increased liver TAG (Puri et al., 2007). In our study, only an increase of TAG
contributed to the increase of total hepatic fat in the CFAM groups. We also noted
a strong negative correlation (Fig. 4.5) between hepatic TAG and PC (r = -0.978,
P < 0.0001), suggesting that hepatic TAG accumulation with CFAM feeding is
related to PC metabolism. Indeed, a decrease of PC also occurred along with
increased CFAM consumption.
In this respect, an inverse relationship was found between liver CFAM and PC (r
= -0.35, P = 0.036) and PE (r = -0.36, P = 0.03) concentrations, suggesting a
deleterious impact of CFAM on hepatic phospholipid levels. Because the
increases of both hepatic CFAM and TAG were closely associated with hepatic
PC, it was plausible that the levels of increased TAG by CFAM in our
experimental conditions were partly dictated by decreased PC concentrations.
Decreased PC levels can trigger the relocation of SREBP-activating proteases
resulting in the activation of SREBP-1 and transition to the nucleus, and the
upregulation of lipogenesis (Walker et al., 2011). However, in the present study,
no significant effect of CFAM was noted on hepatic PEMT activity and CT-α
protein, suggesting that the decrease in liver PC levels observed in the present
study was independent of PC biosynthesis pathways. Moreover, the PC/PE ratio
remained stable in the present study. One of the many roles of the liver is to
maintain the normal membrane PC/PE molar ratio by stimulating PC secretion
via VLDL and HDL and/or PC degradation by phospholipases, leading to hepatic
diacylglycerol and TAG production and accumulation (Jacobs et al., 2013). It is
therefore conceivable that dietary CFAM, which elevated hepatic TAG and
decreased hepatic PC, may also have increased VLDL secretion and/or PC
degradation. The foregoing discussion indicates that the accumulation of TAG in
the liver of rats fed CFAM diets is related to a decrease in PC levels, but the exact
mechanisms linking the two events need further investigation.
69
Although it was tempting to speculate that the increase in plasma total
cholesterol (TC) and VLDL+LDL cholesterol with CFAM might be due to an
increased secretion of VLDL, the absence of CFAM effect on plasma TAG suggest
that additional processes contributed to the elevated cholesterolemia. Like trans
fatty acids (TFA) from industrial sources, CFAM are products of vegetable oils,
which had been submitted to a heat treatment at high temperatures (above
220°C), that can affect cholesterol homeostasis. Interestingly, feeding rats with
TFA from heated vegetable oils resulted in increased blood LDL cholesterol, TC
to HDL cholesterol ratio, and TAG, and decreased HDL cholesterol (Mensink &
Katan, 1990; Zock & Katan, 1992). It is noteworthy that of the 16 CFAM isomers
identified in our fraction, 8 isomers were of trans configuration. Further studies
are thus needed to test whether these isomers can alter cholesterol and
lipoprotein metabolism similar to TFA.
In the case of TFA, the decrease in plasma HDL cholesterol and increase in LDL
cholesterol were attributed, respectively, to an increased lipoprotein apoA-1
catabolism and a decreased LDL apoB-100 catabolism (Mozaffarian et al., 2006)
and an increase in CETP activity (van Tol et al., 1995). More work is required to
state whether either of these pathways contributed to the increase of VLDL+LDL
cholesterol and decrease of HDL cholesterol noted with CFAM consumption.
Alanine transaminase and aspartate transaminase are most commonly used
serum markers to assess liver function or injury (Botros & Sikaris, 2013). Beside
the presence of the metabolic syndrome and type 2 diabetes and fasting serum
insulin, raised AST levels and AST/ALT ratio are often used as independent
predictors of liver fat and NAFLD (Kotronen et al., 2009). In the present study,
we found a positive correlation between plasma AST levels and liver TAG (r =
0.33, P = 0.05), confirming that increasing AST levels are related with the
development of liver steatosis. Besides, AST and AST/ALT ratio were significantly
70
higher with the canola oil and CFAM diet as compared with the other diets,
suggesting that this diet is more prone to liver steatosis. On the other hand, the
lower levels of ALT found in rats fed CC or soybean oil and CFAM diets suggest
that steatohepatitis or injury was not present in either CFAM diet fed animals.
Interestingly, Martin and coworkers (Martin et al., 2000) found increased
CYP2E1 activity in rats fed CFAM, that has been associated with elevated serum
AST/ALT ratio (Lieber, 2004). These observations suggest that increased
AST/ALT ratio in rats fed the canola oil and CFAM diet could be associated with
increased activity of CYP2E1. However, the absence of such effects in rats fed
soybean oil and CFAM underscores the differential effects of CFAM depending
on dietary lipids.
The potential limitations of this study are the physiological nature of the diets
and the measurement of CT-α expression without its activity. Studying the CT-
α expression without the activity may be less likely to detect changes in this PC
biosynthesis pathway. Although several findings reached statistical significance,
it is likely that changes in the lipid composition of the liver and plasma lipid
response as well as liver enzymes in our low-fat fed rats may be less accentuated
with respect to obese high-fat fed rats.
This study has shown that a 4-week consumption of purified cyclic fatty acids
monomers from heated vegetable oils in a relative low-fat diet negatively affects
the cardio-metabolic health in rats by increasing liver TAG, plasma total and
VLDL+LDL cholesterol, and by decreasing PC levels and plasma HDL cholesterol.
Overall, these findings indicate that CFAM may induce steatosis and
dyslipidemia by so far, unknown mechanisms. A better understanding of the
mechanisms linking higher levels of liver TAG and lower PC warrants further
investigation. On the basis of the reducing effects of CFAM on liver PC without
modifying the molar PC/PE ratio, the possibility that CFAM would also increase
the secretion of VLDL and/or PC degradation merits further investigation.
71
Moreover, the analysis of inflammatory and oxidative stress markers could also
shed light on the effects of CFAM in rats.
72
Authors’ contributions:
The Authors' Contributions were as follows: P.A. and H.J. designed research.
J.M., N.L., P.A. and H.J. planned the study. J.M. and N.L. conducted research.
J.M. performed statistical analysis. Histological analysis was supervised by A.T.
J.M., P.A. and H.J wrote paper. P.D. determined total hepatic lipid classes by
HPLC-ELSD. H.J. had primary responsibility for final content. J.M., N.L., P.D.,
P.A. and H.J. contributed to the discussion and data interpretation. SW and RJ
determined the activity and protein of enzymes involved in the biosynthesis of
phosphatidylcholine and critically reviewed the manuscript as it relates to PC
metabolism. All authors have read and approved the final manuscript. None of
the authors has any conflicts of interest.
Parts of this study were presented in abstract form at the 25th Canadian
Conference on Fats and Oils, The Canadian section of the American Oil
Chemists’ Society (CAOCS), Québec City Qc, Canada, October 4-6th, 2015 and
the Experimental Biology 2017, Chicago, USA, April 22-26, 2017.
Acknowledgements
The authors are grateful to Antoine Godin, Charlene Marcotte, and Marie-
Frédérique Gauthier for their help during animal experiment and lab work. The
present study was supported by the Natural Sciences and Engineering Research
Council of Canada
Conflict of interest The authors declare that they do not have any conflict of interest.
Ethical review This study was approved by the Laval University Animal Care Committee in
accordance with the Canadian Council on Animal Care guidelines.
73
Table 4.1 Formulation (g/kg) and fatty acid composition (weight%) in canola oil (CO), canola + CFAM (CC), soybean oil (SO), and soybean + CFAM (SC) diets.
CO CC SO SC
Casein 180 180 180 180
Sucrose 200 200 200 200
Maize starch 420 420 420 420
Cellulose 50 50 50 50
L-Cysteine 3 3 3 3
Choline bitartrate 2 2 2 2
Vitamins mix (AIN-93-VX) 10 10 10 10
Mineral mix (AIN-93G-MX) 35 35 35 35
Lipids including CFAM (+0.02% TBHQ) 100 100 100 100
Fatty acid composition Total SFA 4.8 4.8 13.2 13.2
Total MUFA 61.3 61.3 20.5 20.5
Total n-6 PUFA 17.8 17.8 52.0 52.0
Total n-3 PUFA 8.0 8.0 6.7 6.7
n-6/n-3 2.2 2.2 7.8 7.8
CFAM* 0 0.5 0 0.5
TBHQ: tert-Butylhydroquinone, CFAM: cyclic fatty acid monomer, MUFA: monounsaturated fatty acid, PUFA: polyunsaturated fatty acid, SFA: saturated fatty acid. * The CFAM fraction of the diet contained 56.8% of 5-membered ring isomers and 43.2% of 6-membered ring isomers of the total CFAM (see Table 4.2 for a detailed description of the 16 CFAM isomers).
74
Table 4.2 Isomer composition (mol%) of the CFAM fraction in Canola oil + CFAM (CC) and soybean oil + CFAM (SC) dietsa,b
Peak Ring Double bonds % of total
CFAM Sizea Positiona Config.b Positiona Config.b
a 5 10-14 trans 12,15 E 10.7
b 5 11-15 trans 9,12 E 5.8
c 5 11-15 trans 9,12 Z 1.1
d 5 10-14 trans 12,15 Z 6.4
d’ 5 10-14 cis 12,15 E 7.4
e 5 11-15 cis 9,12 E 0.1
f 5 10-14 cis 12,15 Z 15.3
g 5 11-15 cis 9,12 Z 10.0
h 6 10-15 cis 8,12 E 6.4
i 6 10-15 trans 8,12 E 12.6
j 6 10-15 trans 8,12 Z 0.8
k 6 10-15 trans 12,16 E 8.7
l 6 10-15 cis 8,12 Z 13.2
m 6 10-15 cis 12,16 E 0.7
n 6 10-15 trans 12,16 Z 0.2
o 6 10-15 cis 12,16 Z 0.6
a Ring size and position, and position of acyclic double bond were determined by GC-MS of picolinyl derivatives. b Ring and acyclic double bond configurations were determined based on Dobson et al. (Dobson et al., 1995). Configuration of endocyclic double bond is Z.
75
Table 4.3 Food consumption, growth, liver and fecal lipids, glucose, insulin, and body composition of rats fed canola oil (CO), canola + CFAM (CC), soybean oil (SO), and soybean + CFAM (SC).
P values CO CC SO SC OIL CFAM
Initial weight (g) 274 ± 4 280 ± 4 275 ± 4 277 ± 3 NS NS
Final weight (g) 469 ± 10 479 ± 8 477 ± 7 489 ± 11 NS NS
Food consumption (g/day) 26.7 ± 0.5 27.1 ± 0.5 26.6 ± 0.5 27.1 ± 0.6 NS NS
Weight gain (g/4 weeks) 194 ± 8 199 ± 8 202 ± 4 212 ± 8 NS NS
Food efficiency (g/g) 0.26 ± 0.0 0.26 ± 0.0 0.27 ± 0.0 0.28 ± 0.0 * NS
Liver measurements
Liver (g) 16.4 ± 0.4 17.8 ± 0.6 16.1 ± 0.5 17.5 ± 0.9 NS *
Relative liver weight (g/100g) 3.5 ± 0.0 3.7 ± 0.0 3.4 ± 0.0 3.6 ± 0.0 NS NS
Liver protein (g) 11.6 ± 0.2 11.6 ± 0.4 11.5 ± 0.3 12.3 ± 0.4 NS NS
Liver glycogen (mg/g protein) 230 ± 16 236 ± 18 259 ± 26 180 ± 21 NS NS
Liver total cholesterol (mg/g protein) 9.9 ± 0.6 11.4 ± 0.8 9.2 ± 0.4 8.9 ± 1 NS NS
Plasma measurements (in fasted state)
Glucose (mg/dL) 87 ± 5 83 ± 6 102 ± 8 102 ± 8 NS NS
Insulin (ng/mL) 1.2 ± 0.1 1.6 ± 0.4 1.5 ± 0.4 1.4 ± 0.3 NS NS
Body carcass composition
Total energy (KJ/g) 28.2 ± 0.3 28.4 ± 0.1 27.8 ± 0.3 27.4 ± 0.3 * NS
Body fat mass (mg/g) 440 ± 20 452 ± 7 414 ± 16 421 ± 17 NS NS
Lean body mass (mg/g) 463 ± 23 450 ± 10 489 ±15 460 ± 18 NS NS
Data are mean ± SEM (ANOVA for 2 x 2 factorial experimental design, P<0.05, n=9). * P<0.05, NS: Not Significant.
76
Table 4.4 Fatty acid composition (weight %) in total liver lipids of rats fed diets containing canola oil (CO), canola oil and CFAM (CC), soybean oil (SO), and soybean oil and CFAM (SC).
Fatty acid Diets P values
CO CC SO SC OIL CFAM
14:0 0.5 ± 0.02 0.7 ± 0.04 0.5 ± 0.06 0.5 ± 0.06 * NS
16:0 23.5 ± 0.5 25.8 ± 1.4 22.4 ± 0.9 22.6 ± 1.3 NS NS
16:1 9t 0.6 ± 0.04 0.8 ± 0.04 0.3 ± 0.03 0.4 ± 0.04 ** *
16:1 9c 2.2 ± 0.1 3.2 ± 0.4 2.0 ± 0.4 2.2 ± 0.5 NS NS
18:0 12.3 ± 0.6 9.2 ± 0.7 11.2 ± 0.8 11.7 ± 0.9 NS NS
18:1(n-9) 26.5 ± 1.3 31.8 ± 1.4 13.9 ± 1.4 13.1 ± 1.4 ** NS
18:1(n-7) 3.0 ± 0.1 3.1 ± 0.2 2.6 ± 0.1 2.7 ± 0.2 * NS
18:2(n-6) 9.7 ± 0.3 8.9 ± 0.8 23.4 ± 1.5 22.9 ± 2.2 ** NS
18:3(n-6) 0.3 ± 0.07 0.3 ± 0.03 0.4 ± 0.07 0.5 ± 0.1 NS NS
18:3(n-3) 0.7 ± 0.1 0.8 ± 0.1 1.5 ± 0.2 1.4 ± 0.3 ** NS
20:1(n-9) 0.2 ± 0.01 0.2 ± 0.03 0.2 ± 0.02 0.2 ± 0.02 * NS
20:2(n-6) 0.08 ± 0.0 0.09 ± 0.0 0.3 ± 0.02 0.25 ± 0.02 ** NS
20:3(n-6) 0.4 ± 0.04 0.4 ± 0.04 0.3 ± 0.02 0.3 ± 0.03 * NS
20:4(n-6) 13.6 ± 0.8 9.6 ± 0.9 14.6 ± 1.2 15.0 ± 1.2 * NS
24:0 0.13 ± 0.01 0.1 ± 0.01 0.3 ± 0.05 0.3 ± 0.02 ** NS
20:5(n-3) 0.5 ± 0.04 0.6 ± 0.07 0.4 ± 0.04 0.5 ± 0.07 * NS
22:5(n-6) 0.7 ± 0.03 0.6 ± 0.05 0.7 ± 0.06 0.7 ± 0.06 NS NS
22:6(n-3) 5.3 ± 0.3 3.8 ± 0.3 5.1 ± 0.5 4.9 ± 0.4 NS NS
CFAM1 0.0 0.12 ± 0.02a 0.0 0.05 ± 0.01b
åSFA2 36.5 ± 0.7 35.8 ± 1.2 34.4 ± 1.0 35.1 ± 1.3 NS NS
åMUFA3 32.5 ± 1.5 39.2 ± 1.7 18.9 ± 1.8 18.5 ± 2.0 ** NS
åPUFAn-64 23.7 ± 1 19.3 ± 1.5 39.0 ± 1.7 38.9 ± 2.4 ** NS
åPUFAn-35 7.3 ± 0.4 5.9 ± 0.4 7.7 ± 0.5 7.4 ± 0.5 NS NS
åPUFA6 30.9 ± 1.2 25.1 ± 1.9 46.7 ± 2.1 46.4 ± 2.9 ** NS Data are mean ± SEM (ANOVA for 2 x 2 factorial experimental design, P<0.05, n=9). * P<0.05, **P<0.01, NS: Not Significant. 1CFAM: cyclic fatty acid monomers; different superscript letter indicates statistical significant difference (P = 0.0009); 2 Sum of the saturated fatty acids; 3 Sum of the monounsaturated fatty acids; 4 Sum of the polyunsaturated fatty acids (PUFA) n-6; 5 Sum of the PUFA n-3; 6 Sum of the total PUFA.
77
Figure 4.1. Representative structures of cyclopentenyl (a) and cyclohexenyl (b) CFAM isomers from a-linolenic acid, formed during heat treatment. The chromatogram (c) shows the peaks of the 16 cyclopentyl (peaks a to g) and cyclohexenyl (peaks h to o) CFAM isomers. CFAM: cyclic fatty acid monomers.
a
b
a
c
d
d’
e
fg
onm
l
k
j
ih
c
x104
Retention time (min)
Inte
nsity
b
78
Figure 4.2. Liver total lipids (A), TAG (B), and histological samples fixed in buffered formaline and stained with hematoxylin and eosin (C) and plasma ALT (D), AST (E), and AST/ALT ratio (F) of rats fed either the non-CFAM or CFAM diets. All data are means ± SEM. Bars with differing small letters are significantly different (ANOVA for 2 x 2 factorial experimental design, p<0.05, n = 9). ALT: alanine transaminase, AST: aspartate transaminase, CFAM: cyclic fatty acid monomers, TAG: triacylglycerols.
79
Figure 4.3. Liver PE (A), PC (B), PEMT activity (C), CT protein expression (D), and representative immunoblots for the expression of CT (E) of the livers of rats fed canola oil or soybean oil with or without 0.5% CFAM diets. All data are means ± SEM. (ANOVA for 2 x 2 factorial experimental design, p<0.05, n = 9). Bars with differing letters are significantly different. PE: phosphatidylethanolamine, PC: phosphatidylcholine, PEMT: phosphatidylethanolamine N-methyltransferase, CT: CTP: phosphocholine cytidylyltransferase.
80
Figure 4.4. Plasma total cholesterol (A), TAG (B), HDL-C (C), VLDL+LDL-C (D) of rats fed canola oil or soybean oil with or without 0.5% CFAM diets. All data are means ± SEM. (ANOVA for 2 x 2 factorial experimental design, p<0.05, n = 9). Bars with differing letters are significantly different. HDL-C: high density lipoprotein – cholesterol, VLDL-C: very low-density lipoprotein – cholesterol, TAG: triacylglycerols.
81
Figure 4.5. Pearson correlation between liver triacylglycerols (TAG) and phosphatidylcholine of rats fed canola oil or soybean oil with or without 0.5% CFAM diets. All data are means ± SEM.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 10 20 30 40 50Liver phosphatidylcholine (nmol/mg protein)
Live
r tria
cylg
lyce
rols
(mg/
g pr
otei
n)N: 36r = 0.978P <0.0001
82
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85
Transition 3
Les résultats présentés au chapitre précédent montrent que notre fraction
des MCAG est un mélange de 16 isomères aux proportions inégales. L’effet
global de nos fractions de MCAG a été confirmé par plusieurs résultats.
Indépendamment du type d’huile alimentaire, les MCAG induisent une
accumulation des TG dans le foie, une baisse de la phosphatidylcholine
hépatique, une élévation du cholestérol total (TC) plasmatique et une baisse
des HDL. L’élévation des taux plasmatiques de l’aspartate transaminase
(AST) et du ratio AST/alanine transaminase (ALT) avec la diète huile
de canola et MCAG (CC) vient de montrer un effet sélectif des MCAG selon
le type de lipides alimentaires. En revanche, les MCAG n’ont pas eu d’effet
sur le glucose et l’insuline plasmatique, suggérant l’inaltération de
l’homéostasie glucidique.
Ces résultats indiquent que les MCAG ont une incidence sur la santé
cardiométabolique. Et on sait qu’il existe des liens pathophysiologiques
entre l’accumulation des lipides dans le foie, l’obésité, l’inflammation
chronique et le syndrome cardiométabolique. Nous voulions alors vérifier si
les désordres métaboliques observés dans le chapitre précédent étaient
accompagnés d’une altération des marqueurs de l’inflammation et du stress
oxydant. Pour réaliser l’objectif spécifique (5) et une partie de l’objectif
spécifique (6) de ce projet de recherche, nous avons utilisé le même
dispositif expérimental que précédemment. Les urines ont été récoltées
grâce à des cages métaboliques. Les cytokines ont été analysées dans le
plasma avec des kits commerciaux. Les isoprostanes et neuroprostanes,
marqueurs du stress oxydant, ont été analysés par chromatographie liquide
tandem spectrométrie de masse (microLC-MS/MS).
86
Chapitre 5.
Effects of Cyclic Fatty Acid Monomers from Heated Vegetable Oil on Markers of
Inflammation and Oxidative Stress in Male Wistar Rats
Jean Mboma1, Nadine Leblanc1,3, Paul Angers2,3, Amandine Rocher4, Claire Vigor4, Camille Oger4, Guillaume Reversat4, Joseph Vercauteren4,
Jean Marie Galano4, Thierry Durand4, Hélène Jacques1,3
1 École de Nutrition, Université Laval, 2425 rue de l’Agriculture, Québec, QC, Canada
2 Département des Sciences et Technologies Alimentaires, Université Laval, 2425 rue de l’Agriculture, Québec, QC, Canada
3 Institut des Nutrition et des Aliments Fonctionnels, 2440 Blvd Hochelaga, Québec, QC, Canada
4 Institut des Biomolécules Max Mousseron (IBMM), UMR 5247, CNRS, Université de Montpellier, ENSCM, Faculty of Pharmacy, Montpellier, France
Manuscrit publié dans Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2018, 66, 7172−7180, DOI: 10.1021/acs.jafc.8b01836
87
5.1. Résumé Cette étude évalue les effets des monomères d'acides gras cycliques (MCAG),
issus de l'huile végétale chauffée, sur les marqueurs du stress oxydatif et
de l’inflammation. Des rats mâles Wistar ont été nourris avec des diètes à
base de l’huile de canola ou d’huile de soya avec ou sans 0,5% de MCAG
pendant 28 jours. Les marqueurs du stress oxydatif ont été déterminés à
l'aide de la microLC-MS/MS et les marqueurs de l’inflammation avec des
kits ELISA. Une ANOVA pour un dispositif expérimental factoriel 2 x 2 a été
réalisée pour déterminer les effets « MCAG » et « huile » ainsi que les
interactions entre ces deux facteurs à P£ 0,05. Lorsque des interactions
significatives ont été détectées, un test de comparaison multiple post hoc a
été effectué en utilisant le test de Tukey Honestly Significant Difference
(HSD). Les MCAG ont induit des concentrations plasmatiques plus élevées
de 15-F2t-IsoP (huile de canola plus MCAG, CC: 396 ± 43 ng / mL et huile
de soya plus MCAG, SC: 465 ± 75 ng / mL vs huile de canola, CO: 261 ± 23
ng / mL et huile de soya, SO: 288 ± 35 ng / mL, P<0,05). Les rats nourris
avec la diète SC avaient une concentration plasmatique de 2,3-dinor-15-
F2t-IsoP plus élevée (SC: 145 ± 9 ng / mL vs. CC: 84 ± 8 ng / mL, CO: 12 ±
1 ng / mL et SO : 12 ± 1 ng / mL, P<0,05), 2,3-dinor-15-F2t-IsoP urinaire
(SC: 117 ± 12 ng / mL vs. CC: 67 ± 13 ng / mL, CO: 15 ± 2 ng / mL, et SO:
18 ± 4 ng / mL, P<0,05), et l’IL-6 plasmatique (SC: 57 ± 10 pg / mL vs. CC:
48 ± 11 pg / mL, CO: 46 ± 9 pg / mL, et SO: 44 ± 4 pg / mL, P<0,05) que
les trois autres groupes. Ces résultats suggèrent que la consommation des
MCAG est associée à une augmentation des marqueurs du stress oxydatif,
et ces effets sont exacerbés lorsque les MCAG sont supplémentés avec une
diète riche en acide linoléique.
Mots-clés : monomères cycliques d’acides gras, huile de canola, huile de soya, inflammation, stress oxydant Note : Quelques parties de cette étude ont été présentées à l’American Oil Chemists’ Society (AOCS) Latin American Congress and Exhibition on Fats, Oils, and Lipids. Cancun, Mexico, September 11-14, 2017.
88
5.2. Abstract
This study assesses the effects of cyclic fatty acid monomers (CFAM) from
heated vegetable oil on markers of oxidative stress and inflammation. Male
Wistar rats were fed either canola oil or soybean oil diets with or without
0.5% CFAM for 28 days. Markers of oxidative stress were determined using
microLC-MS/MS and markers of inflammation with ELISA kits. ANOVA for
2 x 2 factorial experimental design was performed to determine the CFAM
and oil effects as well as interactions among CFAM and dietary oils at
P£0.05. When significant interactions were detected, a post hoc multiple
comparison test was performed using the Tukey Honestly Significant
Difference (HSD) test. CFAM induced higher plasma levels of 15-F2t-IsoP
(canola oil plus CFAM, CC: 396 ± 43 ng/mL and soybean oil plus CFAM,
SC: 465 ± 75 ng/mL vs. canola oil, CO: 261 ± 23 ng/mL and soybean oil,
SO: 288 ± 35 ng/mL, P<0.05). Rats fed the SC diet had higher plasma 2,3-
dinor-15-F2t-IsoP (SC: 145 ± 9 ng/mL vs. CC: 84 ± 8 ng/mL , CO: 12 ± 1
ng/mL, and SO: 12 ± 1 ng/mL, P<0.05), urinary 2,3-dinor-15-F2t-IsoP (SC:
117 ± 12 ng/mL vs. CC: 67 ± 13 ng/mL, CO: 15 ± 2 ng/mL , and SO: 18 ±
4 ng/mL, P<0.05), and plasma IL-6 (SC: 57 ± 10 pg/mL vs. CC: 48 ± 11
pg/mL, CO: 46 ± 9 pg/mL, and SO: 44 ± 4 pg/mL, P<0.05) than the other
three diet groups. These results suggest that CFAM consumption is
associated with increased markers of oxidative stress, and those effects are
exacerbated when CFAM are supplemented with a high-linoleic acid diet.
KEYWORDS: cyclic fatty acid monomers, soybean oil, canola oil,
inflammation, oxidative stress
Note: Parts of this work were presented at the American Oil Chemists’
Society (AOCS) Latin American Congress and Exhibition on Fats, Oils, and
Lipids. Cancun, Mexico, September 11-14, 2017.
89
5.3. Introduction
Deep frying affects the quality of vegetable oils due to various chemical
reaction products it generates (Choe & Min, 2007; Gertz, 2014), some of
which may be undesired toxic compounds (Thurer & Granvogl, 2016). The
effects of some of the generated compounds have been studied. Mice fed a
high-fat diet with polar compounds from deep-frying of palm oil displayed
impaired liver function, lipid metabolism, and glucose tolerance (Li et al.,
2017). Cyclic fatty acid monomers (CFAM), present at relatively low levels
ranging from 100 mg to 6600 mg per 100 g of total fatty acids in commercial
frying oils (Frankel et al., 1984; Gere et al., 1985; Sebedio et al., 1987),
increase liver triacylglycerols (TAG) and alter fatty acid synthesis and
oxidation (Lamboni et al., 1998; Martin et al., 2000). Liver TAG
accumulation is a complex phenomenon (Trauner et al., 2010) as liver TAG
synthesis can be protective (Baskin-Bey et al., 2007), but can also trigger
lipotoxicity and induce oxidative stress and inflammation (Malhi & Gores,
2008; Schaffer, 2003). However, no study has endeavored to evaluate the
relationship between dietary CFAM and oxidative stress and inflammation.
F2-isoprostanes (F2-IsoP) are a class of prostaglandin-like compounds that
are generated from arachidonic acid through non-enzymatic pathways and
they are considered the gold-standard marker for the quantification of in
vivo oxidative stress in humans (Roberts, 2000). Although F2-IsoP levels are
not easily affected by dietary lipids (Gopaul et al., 2000), some compounds
such as cocoa extract (Jalil et al., 2008) and some dietary fatty acids do
affect the formation and excretion of F2-IsoP. Replacing a diet rich in
saturated fatty acids (SFA) with linoleic acid (Sodergren et al., 2001) as well
as replacing oleic acid with vaccenic acid (Turpeinen et al., 2002), resulted
in increased levels of F2-IsoP. In premenopausal women, a significant
inverse association between levels of F2-IsoP and long-chain n-3 fatty acids
90
was found, but trans fats were positively associated with F2-IsoP (Anderson
et al., 2016). A study among midlife women found that SFA, linoleic and
oleic acids are associated with high levels of markers of oxidative stress
(Tomey et al., 2007). Beside F2-IsoP, other oxidized lipids have been
identified, such as F4t-neuroprostanes (NeuroP), which are generated from
non-enzymatic oxidation of docosahexaenoic acid (DHA) and have been
implicated in neurodegenerative conditions (Signorini et al., 2013).
However, there is no study documenting the effects of CFAM from heated
vegetable oils on markers of oxidative stress using liquid chromatography
tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).
The present study was designed to determine whether CFAM added to either
canola oil (high-oleic) diet or soybean oil (high-linoleic) diet can increase the
risk of oxidative stress in rats. In view of this objective, we evaluated
concentrations of various markers of oxidative stress in the liver, plasma
and urine of an experimental dietary rat model, and the concentrations of
Il-6 and CRP, physiological markers of subclinical systemic inflammation in
the plasma (Pradhan et al., 2001).
5.4. Material and Methods
5.4.1. Chemicals
Methanol, acetonitrile, and chloroform (respectively, MeOH and ACN:
LC/MS grade, and CHCl3: HPLC grade) were purchased from Fischer
Scientific UK (Loughborough, UK). Hexane HPLC grade and ethanol
absolute LC-MS grade were purchased from Sigma Aldrich (Saint Quentin
Fallavier, France) while ethyle acetate (HPLC grade) was obtained from VWR
(EC). Water (H2O) and isopropanol used in this study were of LC/MS grade.
KOH, formic acid, and NH4OH 28% were used in our experiments.
91
5.4.2. Standards
Standards used in this study are already described in a previous study by
Dupuy and colleagues (Dupuy et al., 2016). All the following standards were
synthesized according to our published procedures (Guy et al., 2014; Oger
et al., 2010): ent-16(RS)-9-epi-ST-D14-10-PhytoF, ent-9(RS)-12-epi-ST-D14-
13-PhytoF, ent-16(RS)-13-epi-ST-D14-9-PhytoF, ent16-F1t-PhytoP, ent-16-
epi-16-F1t-PhytoP, 9-F1t-PhytoP, 9-epi-9-F1t-PhytoP, ent-16-B1t-PhytoP, ent-
9-L1t-PhytoP, 16(RS)-16-A1t-PhytoP, 2,3-dinor-15-F2t-IsoP, 2,3-dinor-15-
epi-15-F2t-IsoP, ent-2,3-dinor-5,6-dihydro-dinor-15-F2t-IsoP, 15-F2t-IsoP,
15-epi-15-F2t-IsoP, 5-F2t-IsoP, 10- F4t-NeuroP, 10-epi-10F4t-NeuroP, 4(RS)-
4-F4t-NeuroP. Just as for our internal standards, these standards’ purity
was assessed by HPLC and contained <5% impurity.
5.4.3. Internal standards
Of the three internal standards, d4-15-F2t-IsoP (³98% purity) was purchased
from Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI, USA), and C21-15-F2t-IsoP and d4-
epi-10-F4t-NeuroP were synthesized according to our published procedures
(Guy et al., 2014; Oger et al., 2010) and both had less than 5% impurity
content as confirmed by our HPLC analysis.
5.4.4. Animals and diets
Thirty-six (36) male Wistar rats initially weighing ca. 150 g were acclimated
to their new environment for 7 days and fed a rat chow (Purina Canada,
Mississauga, ON). After acclimation, rats were housed in individual cages
and randomly assigned one of the four diets groups and had a 7-day
adaptation period followed by a 28-day experimental period. Twenty days
through the experiment, rats were put in metabolic cages and urine was
92
collected every six-hour for 24 hours in tubes that immersed in ice. All the
collections of the day were pooled, 50 µL of BHT 0.005% in methanol was
added and stored first at -20ºC thereafter at -80ºC until analysis. At the end
of the 28-day period, all animals were sacrificed by cardiac puncture under
isoflurane USP (Pharmaceutical Partners Canada, Richmond Hill, ON),
plasma was recovered from whole blood after centrifugation (2000 rpm, 10
minutes, at 4ºC) and stored immediately in liquid nitrogen and further at –
80ºC until analysis.
Prior to the formulation of diets, cyclic fatty acid monomers (CFAM) were
isolated from linseed oil heated at 275ºC for 12 hours as previously
described (Sebedio & Grandgirard, 1989). Four purified diets were
constituted as a combination of source of dietary fat (10% canola oil or
soybean oil) and the addition of CFAM (0.0 or 0.5% CFAM of total dietary
fat): canola oil (CO), canola oil and CFAM (CC), soybean oil (SO), and
soybean and CFAM (SC). Each of the 4 diets contained 18% protein (casein),
20% sucrose, 42% maize starch, 5% cellulose, 0.3% L-Cysteine, 0.2%
choline bitartrate, 1% vitamins mix (AIN-93-VX0) and 3.5% mineral mix
(AIN-93-MX). The 4 diets were isoenergetic (CO, 19.5 kJ/g; CC, 19.4 kJ/g;
SO, 19.5 kJ/g; SC, 19.5 kJ/g), isolipidic (CO, 19.3% (w/w); CC, 19.3%
(w/w); SO, 18.9% (w/w); SC, 19.7% (w/w)), and isonitrogenous (CO, 10.1%
(w/w/); CC, 10.3% (w/w); SO, 10.0% (w/w); SC, 10.2% (w/w)). Canola oil
and soybean oil fatty acid profiles were as follows, respectively (weight% of
total fatty acids): saturated fatty acids or SFA (4.8 and 13.2),
monounsaturated fatty acids or MUFA (61.3 and 20.5), linoleic acid or
18:2n-6 (17.8 and 52), a-linolenic acid or 18:3n-3 (8 and 6.7). The ratio of
n-6 to n-3 was 2.2 for canola oil and 7.8 for soybean oil.
93
Treatment procedures and animal care were approved by the Laval
University Animal Care Committee in accordance with the Canadian
Council on Animal Care guidelines (file #2015-004).
5.4.5. Plasma fatty acid analysis
Prior to fatty acid analysis, total lipids were extracted from 200 µL plasma
according to Folch and coworkers (Folch, Lees, & Sloane Stanley, 1957) and
fatty acids were analyzed with a gas chromatograph (Shimadzu GC-2010,
Santa Clara, CA, USA) according to our methods as previously described
(Desmarais et al., 2015).
5.4.6. Extraction, analysis, and quantification of non-enzymatic lipid products
For the analysis of F2-IsoP, we use liquid chromatography tandem mass
spectrometry (LC-MS/MS) which is the most appropriate technique to
determine F2-IsoP levels as immunoassay can generate artefactual issues
(Halliwell & Lee, 2010). In all the extraction processes we used Oasis Max
(30 µm, 60 mg) extraction plates (Waters, Milford, MA, USA) which were
found to be suitable for LC-MS/MS per Dupuy and colleagues (Dupuy et
al., 2016).
5.4.6.1. Extraction from urine
Sample preparation. 1 mL urine is placed in a Pyrex tube with 1 mL of formic
acid 40 mM (pH 4.5) to homogenize the pH of the sample and 5 µL of internal
standards (5 ng). The mix is then vortexed. Isoprostanes extraction. The
extraction begins with the conditioning of the SPE column with 2 x 1 mL
methanol and 2 x 1 mL formic acid 20 mM. After the column is conditioned,
samples are charged on the column and the column is cleaned with 2 x 1
94
mL of, respectively: NH3 2%, methanol:formic acid 20 mM (30:70, v/v),
hexane, hexane:ethyl acetate (70:30, v/v). Isoprostanes are eluted with
hexane:ethanol:acetic acid (70:29.4:0.6, v/v/v). The solvent is then dried
under a stream of nitrogen at 40ºC for 30 minutes and 100 µL of mobile
phase (water:acetonitrile, 83:17, v/v, with each containing 0.1% formic
acid) is added, vortexed, left 15 minutes, vortexed again and 80 µL are
placed in a vial for microLC-MS/MS analysis.
5.4.6.2. Extraction from plasma
Dupuy and colleagues noted that ³200 µL of mouse plasma were enough
for the analysis of few isoprostanes (Dupuy et al., 2016). To get a broader
profile of the non-enzymatic oxidized lipid products, we used 400 µL
plasma. Prior to the isoprostanes extraction process, 400 µL rat plasma
were placed in tubes for hydrolysis with 20 µL BHT 0.005% in methanol,
950 µL KOH 1M in H2O and 5 µL of internal standards (1 ng/µL). The tubes
were mounted on a mixer with a programmable mixing cycle (PTR-30,
Grant-bio) and then placed in an incubator (IKA KS 4000i control) for 30
minutes at 40ºC. After incubation, 1 mL of formic acid 40 mM was added
to each tube. Isoprostanes were then extracted as described in section
5.4.6.1.
5.4.6.3. Extraction from liver
Lipid extraction. Prostanoids were extracted from ca. 200 mg of liver in
grinding matrix tubes (Lysing matrix D, MP Biochemicals, Illkirch, France)
with 50 µL BHT 1% in methanol and 1 mL methanol:water EGTA 5 mM
(2:1). Tubes were then placed in a FastPrep-24 (MP Biochemicals) and
tissues were ground for 30 seconds at a speed of 6.5 m/s. Lipids were
extracted as previously described (Folch et al., 1957). The ground tissue
was transferred in centrifuge polypropylene tubes with 5 mL
95
chloroform:methanol (2:1), 1 mL NaCl 0.9%, 5 µL of internal standards (1
ng/µL), vortexed and centrifuged at 3500 rpm for 10 minutes at room
temperature. The organic phase was recovered in new pyrex tubes and the
solvent dried under a stream of nitrogen at 40ºC for about an hour and half.
5.4.6.4. Hydrolysis
Lipids were hydrolyzed with 1 mL KOH 1M in methanol, in the same
conditions as for plasma lipids. After hydrolysis, 2 mL formic acid 40 mM
were added, and isoprostanes were extracted as described in section
5.4.6.1.
5.4.7. Analysis of non-enzymatic lipid products by microLC-MS/MS
5.4.7.1. LC parameters
The analysis was conducted on an Eksigent (Sciex Applied Biosystems,
Flamingham, MA, USA) micro-HPLC equipped with CTC Analytics AG
(Zwingen, Switzerland) and coupled to a QTRAP 5500 system (AB SCIEX,
Concord, ON, Canada). An HALO C18 column (10 X 0.5 mm, 2.7 µm,
Eksigent, Dublin, CA, USA) was used for the micro-HPLC analysis. The LC
mobile phase consisted of a mixture of solvent A (H20 added with 0.1%
formic acid) and B (ACN/MeOH, 80:20, v/v added with 0.1% formic acid)
delivered at 0.03mL.min-1. The binary gradient is as follows: at time 0, 83
% A and 17% B; at 9.5 minutes, 78% A and 22% B; at 11.5 minutes, 70%
A and 30% B; at 15 minutes, 70% A and 30% B and then at 16 minutes,
5% A and 95% B for 2.3 minutes, for a total run time of 21 minutes. The
sample injection volume was 5 µL.
96
5.4.7.2. MS/MS conditions
The MS/MS was operated in the electrospray ionization (ESI) negative mode
with a source voltage kept at -4.5kV and N2 used as curtain gas. For each
analyte, the collision energy was optimized to maximize the ion currents of
the precursor to produce ion dissociation. The analytes were detected by
MS/MS using multiple reaction monitoring (MRM). All the MRM for our
analytes have already been reported by Dupuis and colleagues (Dupuy et
al., 2016).
5.4.7.3. Quantification of non-enzymatic lipid products
The quantitation of prostanoids was done with MultiQuant 3.0 software (AB
SCIEX). Prior to the quantification, calibration curves were obtained from
the ratio of the areas under the curves of isoprostanes and those of the
internal standard (IS) as a function of the ratio of the concentration of
isoprostanes and IS. The linear regressions obtained for all the standards
are presented in Table 1.
5.4.7.4. Extraction yield and matrix effect
The yield gives the percentage of any given analyte recovered after solid
phase extraction (SPE), while matrix effect refers to the difference in mass
spectrometric response for analyte in standard solution versus the response
of the same analyte in a biological matrix. Two concentrations of standards
were used to calculate these two parameters: 32 pg/µL (C32) and 256 pg/µL
(C256). For each concentration, duplicate samples were prepared before
and after column extraction and a standard solution into starting mobile
phase was also prepared and used as quality control. The yield for each
concentration corresponds to the ratio between the area under the curve of
the analyte before and after extraction. The matrix effect is the ratio, for
97
each concentration, between the AUC of any analyte after extraction and
the AUC of the standard solution.
5.5. Statistical analysis
All the results are expressed as mean ± SD (n = 9). ANOVA for 2 x 2 factorial
experimental design was performed with SAS software (SAS Institute Inc.,
Cary, NC, USA) to determine the CFAM and oil effects, as well as
interactions among CFAM and dietary oils. For plasma IL-6, a logarithmic
transformation of data was applied (Log10(x + 1)) to achieve the homogeneity
of variance. When significant interactions were observed between oil and
CFAM, a multiple comparison test, i.e. Tukey Honest Significant Difference
(HSD) test was used to determine differences between the groups. Pearson
correlation coefficients were calculated between variables. The level of
significance was set at P£0.05.
5.6. Results
5.6.1. Yield, matrix effect, and repeatability and precision of the method
Yields and matrix effects are expressed as mean in % ± SD % and presented
in Table 2. Extractions from urine had the highest yields and lowest
variation compared to extractions from liver and plasma, suggesting a
putative impact of the hydrolysis step on the extraction process. In order to
determine the linear range in the quantification process, we used 15
concentrations ranging from 3.125x10-3 to 512 pg.µL−1 prepared in
triplicate and injected. This allowed us to establish calibration curves and
calculating the linear regression equation. The detector response was linear
across the range tested. LOD and LOQ were also determined and ranged,
98
respectively, from 0.16 to 0.63 pg injected and between 0.16 and 1.25 pg
injected. These values depended on the type of isoprostanoids but were
quite homogenous.
5.6.2. Food intake and body weight gain
No changes were observed between the four diet groups for daily food intake
or weight gain (P>0.05).
5.6.3. Plasma fatty acid composition
As per data presented in Table 3, canola oil induced higher plasma levels of
oleic acid, total MUFA and EPA than soybean oil, and rats fed soybean oil
had higher levels of plasma arachidonic acid (ARA) and total PUFA than
canola oil (P<0.05). The CFAM diets induced lower levels of DPAn-6, DHA,
22:5n-6/22:6n-3 ratio, and total n-3 PUFA than the non-CFAM diets
(P<0.05).
Dietary lipids modulated the effects of CFAM on 6 plasma fatty acids levels.
Rats fed the soybean oil and CFAM (SC) diet had more LNA (Fig. 1D) and
PUFAn-6 (Fig. 1F) than those fed the 3 other diets (P<0.05). Rats fed the
soybean oil (SO) diet had more LNA (Fig. 1D) and PUFAn-6 (Fig. 1F) than
those fed the two canola oil diets, and less MYA (Fig. 1A) than the 3 other
groups (P<0.05). Rats fed the canola oil and CFAM diet (CC) had less ALA
(Fig. 1E) and PUFAn-6 (Fig. 1F) and more PEA (Fig. 1C) than those fed the
3 other diets (P<0.05). Rats fed the CO diet had also more PMA (Fig. 1B)
than those fed the SO and CC diets. Plasma PEA levels (Fig. 1C) were lower
in the CO group compared with the 3 other groups.
99
5.6.4. Mediators of oxidative stress: Isoprostanes and Neuroprostanes
Liver isoprostanes and neuroprostanes. Our results show that there was
neither oil nor CFAM effect on liver 15-F2t-IsoP (Fig. 2A) and liver 4(RS)-F4t-
NeuroP (Fig. 2C) (P>0.05). However, rats fed CFAM tended (P = 0.053), to
have lower 2,3-dinor-15-F2t-IsoP (fig. 2B) metabolite of 15-F2t-IsoP,
compared to those fed the non-CFAM diets.
Plasma isoprostanes and neuroprostanes. We observed a CFAM effect
on plasma 15-F2t-IsoP (Fig. 3A), with the CC and SC diets inducing higher
levels than the CO and SO diets (P<0.05). There was a statistical interaction
between oil and CFAM on plasma 2,3-dinor-15-F2t-IsoP (Fig. 3B), with rats
fed the SC diet having more than the other three diet groups (P<0.05) and
rats fed the CC diet inducing more than those fed the CO and SO diets
(P<0.05). There was neither oil nor CFAM effect on plasma 4(RS)-F4t-NeuroP
(P>0.05).
Urinary isoprostanes and neuroprostanes. We observed an oil effect on
urinary 15-F2t-IsoP (Fig. 4A), rats fed soybean oil having higher levels than
those fed canola oil (P<0.05). We observed a statistical interaction between
oil and CFAM on 2,3-dinor-15-F2t-IsoP (Fig. 4B), showing that rats fed
soybean oil and CFAM had more than those fed the 3 other diets and rats
fed the canola oil and CFAM diet inducing more than those fed the CO and
SO diets (p<0.05). There was also a significant statistical interaction
between oil and CFAM on 4(RS)-F4t-NeuroP (Fig. 4C): rats fed the soybean
oil and CFAM diet had higher levels compared to those fed one of the other
three diet groups.
100
5.6.5. Inflammatory markers
There was a significant statistical interaction between oil and CFAM on
plasma IL-6 (Fig. 5A) as rats fed soybean oil and CFAM had higher plasma
levels compared to those fed either one of the other three diet groups
(P<0.05). We found no difference for plasma C-reactive protein (CRP) (Fig.
5B).
5.7. Discussion
The present study aimed to assess the effects of cyclic fatty acid monomers
(CFAM) on markers of inflammation and oxidative stress and to evaluate
whether those effects can be modulated by dietary lipids. Our results
showed that rats fed the soybean oil and CFAM (SC) diet had higher
concentrations of LNA, PUFAn-6, and IL-6 in plasma as well as higher 2,3-
dinor-15F2t-IsoP in plasma and urine and higher 4(RS)-F4t-NeuroP in urine
than those fed the 3 other diets (P<0.05). To the best of our knowledge, this
study is the first study to report deleterious effects of CFAM on markers of
oxidative stress and inflammation when incorporated in a high-linoleic acid
diet in rats.
5.7.1. Changes in plasma fatty acids
Changes observed in plasma fatty acids among the four diet groups resulted
either from oil and/or CFAM effect (Tab. 3) or from interactions between oil
and CFAM (Fig. 1). The high levels of linoleic acid (LNA, 18:2n-6) and n-6/n-
3 ratio (2.2 and 7.8, respectively for dietary canola oil and soybean oil) may
account for the high plasma n-6/n-3 ratio and high concentrations of LNA
and arachidonic acid (ARA), and total n-6 PUFA found in rats fed soybean
oil diet with or without CFAM. Dietary LNA can further be metabolized in
101
many tissues by a series of desaturation and elongation steps to particularly
ARA, and possibly docosapentaenoic acid (DPAn-6, 22:5n–6). These fatty
acids serve as components of membrane structural lipids and are
immediate precursors to eicosanoids and isoprostanes via enzymatic and
non-enzymatic pathways, respectively. In addition, ARA is the most
abundant polyunsaturated fatty acid (PUFA) in neural tissue and in the
brain (Brenna & Diau, 2007; Diall, 2015) and the role of ARA as an
eicosanoid precursor is major in a variety of immune and inflammatory
responses (Meng et al., 2015). High proportions of oleic acid found in
plasma of rats fed canola oil compared to those fed soybean oil can have a
dietary cause since canola oil diets contained roughly 3 times more oleic
acid than soybean oil (61.3 weight% of total fatty acids for canola oil vs.
20.5 for soybean oil). These results show that dietary lipids affect circulating
fatty acid levels as previously reported (Liao et al., 2010).
DPAn-6 and DHA are respectively the end products in the biosynthetic
pathways of the n-6 and n-3 fatty acids, respectively, from LNA and a-
linolenic acid and fatty acid desaturases (FADS), i.e. D-6 and D-5, are rate
limiting in those pathways (Mathias et al., 2012). The lower levels of DPAn-
6, DHA, and DPAn-6/DHA ratio in the plasma of rats fed the CFAM diets
suggest some alteration of the biosynthetic pathways of those two fatty
acids. It has been demonstrated that D-6 desaturase (FADS2) is the rate-
limiting enzyme for the conversion of linoleic acid and a-linolenic acid to,
respectively, g-linolenic acid (18:3n-6) and stearidonic acid (18:4n-3) (Stoffel
et al., 2014; Stoffel et al., 2008). In fact, it has been found that trans fatty
acids (TFA) and high cholesterol levels, among other factors, impair the
activity of FADS2. Lower plasma levels of DPAn-6 and DHA observed in this
study suggest some similarities between CFAM and other products of
thermo-oxidation of vegetable oils such as TFA on the biosynthetic
pathways leading to DPA and DHA. Interestingly, there were 46.3% trans
102
isomers in our CFAM fraction, but this study cannot determine whether the
above effects were solely due to those trans isomers.
5.7.2. Soybean oil induces more urinary 15-F2t-IsoP than canola oil
The observation that soybean oil induced more urinary 15-F2t-IsoP, a
marker of oxidative stress, than canola oil is consistent with literature.
Although isoprostanes were not measured in their study, Rom and
coworkers (Rom et al., 2017) found that soybean oil can induce oxidative
stress by increasing lipid peroxides and stimulating macrophage foam cell
formation. Our results are also in accord with those found by Gustafsson
and coworkers who observed that, compared to soybean oil, canola oil
increased gamma-tocopherol, an antioxidant, in serum of hyperlipidemic
subjects (Gustafsson et al., 1994). Moreover, it has also been found that
intakes of omega-6 polyunsaturated fatty acids (n-6 PUFA) higher than the
median was associated with increased serum level of 8-isoprostane F2α (15-
F2t-IsoP) in subjects with type 2 diabetes mellitus with certain ApoA2
genotypes (Zamani et al., 2017). Furthermore, a study found that rats fed
an n-6 PUFA-rich oil had significantly reduced HDL-cholesterol and high
lipid peroxidation compared to those fed an n-3 PUFA-rich diet (Benson &
Devi, 2009). Interestingly, we found higher levels of ARA –precursor to 15-
F2t-IsoP– in rats fed soybean oil compared with those fed canola oil (Tab.
3) and there was a positive correlation between ARA and LNA and urinary
15-F2t-IsoP (ARA: r=0.50, P=0.002; LNA: r=0.51, P=0.001). In contrast,
plasma oleic acid (OLA), the major fatty acid in our canola oil, was
negatively correlated with urinary 15-F2t-IsoP (r=-0.69, P<0.0001).
Therefore, our results strongly suggest that soybean oil is a pro-oxidant
oil as compared to canola oil.
103
5.7.3. CFAM diets induce more plasma 15-F2t-IsoP than non-CFAM diets
Deep-fried oils have been reported to induce liver and serum lipid
peroxidation in rats (Eder, 1999; Garrido-Polonio et al., 2004). Using
cultured porcine endothelial cells, Flickinger and colleagues observed that
CFAM –which are products of heat treatment of vegetable oils– increased
the production and secretion of prostacyclin (PGI2) which derives from
arachidonic acid (ARA) through the enzymatic cyclooxygenase pathway
(Flickinger et al., 1997). Because F2-isoprostanes derive from ARA under
oxidative stress conditions, our results on plasma 15-F2t-IsoP suggest that
CFAM may enhance the production of isoprostanes via a free radical non-
enzymatic mechanism involving the peroxidation of ARA.
5.7.4. Soybean oil and CFAM diet induces higher levels of plasma and urinary 2,3-dinor-15-F2t-IsoP, urinary 4(RS)-4-F4t-neuroprostanes, and plasma IL-6 than the other three diets
The CFAM diets induced higher plasma levels of 15-F2t-IsoP than the non-
CFAM diets. Furthermore, the soybean and CFAM (SC) diet induced more
plasma and urinary isoprostanes and plasma IL-6 than the canola oil and
CFAM (CC) diet. The elevated levels of 2,3-dinor-15-F2t-IsoP, which is the
metabolite of 15-F2t-IsoP, in plasma and urine as well as 4(RS)-4-F4t-NeuroP
in urine of rats fed the SC diet indicate a general oxidative status which is
associated to inflammation (Wood et al., 2005) as evidenced by the positive
correlations between plasma IL-6 and plasma and urinary 2,3-dinor-15-F2t-
IsoP (r=0.45, P=0.006 and r=0.47, P=0.004, respectively, Tab. 4). Thus, our
results suggest that high levels of IL-6 observed in the plasma of rats fed
the SC diet resulted from a combination of factors related to dietary and
plasma fats: First, rats fed the SC diet had high levels of linoleic acid (LNA),
and some oxidized forms of LNA such as 9-HODE are known to have pro-
104
inflammatory properties (Ramsden et al., 2013). Second, rats fed the
soybean oil diets had high levels of arachidonic acid (ARA) and its non-
enzymatic oxidized metabolites, i.e. plasma and urinary 15-F2t-IsoP and
2,3-dinor-15-F2t-IsoP than those fed the canola oil diets. Third, rats fed
CFAM diets had lower levels of DPAn-6 and DHA (Tab. 3) than those fed
non-CFAM diets. DPAn-6 reduces the activity of cyclooxygenase-2 (COX-2)
and is a potent inhibitor of pro-inflammatory PGE2 production and, when
combined with DHA, DPA-n-6 enhances the anti-inflammatory activity of
DHA (Nauroth et al., 2010; Zhang et al., 2017). Therefore, our results
strongly suggest that CFAM amplify the pro-oxidant and pro-inflammatory
effect of soybean oil and might greatly account for the high levels of 2,3-
dinor-15-F2-IsoP and IL-6 in plasma of rats fed soybean oil and CFAM diet.
Our results show that CFAM are associated with increased production of
markers of oxidative stress in vivo and this effect is exacerbated when CFAM
are supplemented with a n-6 PUFA-rich diet. On a nutritional level, this
observation reinforces the need for a better selection of vegetable oils for
frying, favoring oils with lower PUFA content.
Abbreviations Used
CFAM: cyclic fatty acid monomers, DHA: docosahexaenoic acid, DPA:
docosapentaenoic acid, LNA: linoleic acid, ARA: arachidonic acid, OLA: oleic
acid, PUFA: polyunsaturated fatty acid, SFA: saturated fatty acid, TFA:
trans fatty acid, IL-6: interleukin-6, CRP: C-reactive protein, IsoP:
isoprostane, NeuroP: neuroprostanes, FADS: fatty acid desaturase, CO:
canola oil, CC: canola oil and CFAM, SO: soybean oil, SC: soybean oil and
CFAM, LC-MS/MS: liquid chromatography tandem mass spectrometry.
105
Acknowledgements
We would like to thank Antoine Godin and Charlène Marcotte for their help
in animal experiment and results recording.
Parts of this paper were presented at the 17th AOCS Latin America
Conference on Oils and fats. Cancun, September 11-14, 2017.
Funding source
This study was supported by the Natural Sciences and Engineering
Research Council of Canada (NSERC).
106
Table 5.1. Standards calibration curves
Compound Linear regression r IS
ent-16(RS)-9-epi-ST-D14-10-PhytoF Y = 3.08779 x 0.99988 D4-10-F4t-NeuroP ent-9(RS)-12-epi-ST-D14-13-PhytoF Y = 0.98618 x 0.99983 D4-10-F4t-NeuroP ent-16(RS)-13-epi-ST-D14-9-PhytoF Y = 3.07013 x 0.99994 D4-10-F4t-NeuroP ent16-F1t-PhytoP Y = 0.18298 x 0.99982 D4-10-F4t-NeuroP ent-16-epi-16-F1t-PhytoP Y = 0.22860 x 0.99985 D4-10-F4t-NeuroP 9-F1t-PhytoP Y = 1.07221 x 0.99977 D4-10-F4t-NeuroP 9-epi-9-F1t-PhytoP Y = 1.30677 x 0.99976 D4-10-F4t-NeuroP ent-16-B1t-PhytoP Y = 2.94248 x 0.99894 D4-10-F4t-NeuroP ent-9-L1t-PhytoP Y = 3.21413 x 0.99931 D4-10-F4t-NeuroP 16(RS)-16-A1t-PhytoP Y = 0.49741 x 0.99970 D4-10-F4t-NeuroP 2,3-dinor-15-F2t-IsoP Y = 1.15680 x 0.99991 D4-10-F4t-NeuroP 2,3-dinor-15-epi-15-F2t-IsoP Y = 0.90891 x 0.99972 D4-10-F4t-NeuroP ent-2,3-dinor-5,6-dihydro-dinor-15-F2t-IsoP
Y = 3.78958 x 0.99974 D4-10-F4t-NeuroP
15-F2t-IsoP Y = 0.24073 x 0.99868 D4-10-F4t-NeuroP 15-epi-15-F2t-IsoP Y = 0.35380 x 0.99983 D4-10-F4t-NeuroP 5-F2t-IsoP Y = 0.21236 x 0.99977 D4-10-F4t-NeuroP 10- F4t-NeuroP Y = 0.96412 x 0.99985 D4-10-F4t-NeuroP 10-epi-10F4t-NeuroP Y = 0.21099 x 0.99968 D4-10-F4t-NeuroP 4(RS)-4-F4t-NeuroP Y = 0.08500 x 0.99816 D4-10-F4t-NeuroP
IS: Internal Standard
107
Table 5.2. Summary data for isoprostanes and neuroprostanes yield and
matrix effect.
Yield Matrix effect
Compound Mean (%)
STD%
Mean (%) STD%
Liver
d4 15-F2t-IsoP (IS) 84 9 75 2 d4 10-epi-F4t-NeuroP (IS) 64 18 72 1
15-F2t-IsoP 100 5 85 2 2,3-dinor-15-F2t-IsoP 105 9 73 2
4(RS)-F4t-NeuroP 103 8 56 7
Plasma
d4 15-F2t-IsoP (IS) 75 8 59 5 d4 10-epi-F4t-NeuroP (IS) 100 7 70 4
15-F2t-IsoP 79 5 68 3 2,3-dinor-15-F2t-IsoP 33 6 82 2
4(RS)-F4t-NeuroP 91 7 69 3
Urine
d4 15-F2t-IsoP (IS) 90 4 104 9 d4 10-epi-F4t-NeuroP (IS) 90 3 69 6
15-F2t-IsoP 99 7 77 6 2,3-dinor-15-F2t-IsoP 94 5 77 4
4(RS)-F4t-NeuroP 101 7 66 7 IS: Internal Standard, IsoP: Isoprostanes, NeuroP: neuroprostanes
108
Table 5.3. Fatty acid composition (weight %) in total plasma lipids of
rats fed diets containing canola oil (CO), canola oil and CFAM1 (CC), soybean oil (SO), and soybean oil and CFAM (SC).
Data are mean ± SD (ANOVA, P<0.05, n = 9). * P<0.05, **P<0.01, NS: Not Significant. 1CFAM: cyclic fatty acid monomers; 2 data for myristic, palmitic, palmitelaidic, linoleic, and a-linolenic acids and total n-6 PUFA are presented in Figure 4. 3Sum of the saturated fatty acids; 4 Sum of the monounsaturated fatty acids; 5 Sum of the PUFA n-3; 6 Sum of the total PUFA.
Fatty acid2 Diet P values
CO CC SO SC OIL CFAM
16:1 9c 1.8 ± 0.3 2.3 ± 0.3 1.7 ± 0.3 1.4 ± 1.2 NS NS
18:0 8.8 ± 0.9 10.0 ± 1.5 9.2 ± 1.2 9.0 ± 1.8 NS NS
18:1(n-9) 23.7 ± 2 23.9 ± 1.8 9.3 ± 1.8 10.7 ± 2.0 ** NS
18:1(n-7) 2.0 ± 0.3 2.4 ± 0.6 1.9 ± 0.3 1.7 ± 0.6 * NS
20:1(n-9) 3.4 ± 0.6 3.0 ± 0.6 2.9 ± 0.6 2.9 ± 1.2 * NS
20:4(n-6) 16.5 ± 3.0 14.4 ± 1.8 21 ± 3 20.0 ± 4.8 * NS
20:5(n-3) 1.4 ± 0.6 1.4 ± 0.6 0.8 ± 0.2 0.9 ± 0.3 * NS
22:5(n-6) 2.4 ± 0.6 1.5 ± 0.6 2.8 ± 0.9 1.8 ± 0.9 NS *
22:6(n-3) 3.2 ± 1.2 2.5 ± 0.6 5.3 ± 1.8 3.5 ± 1.8 NS *
åSFA3 29.1 ± 1.8 29.0 ± 2.1 28 ± 1.8 29.6 ± 2.4 NS NS
åMUFA4 31.4 ± 3.0 33.3 ± 3.0 16.6 ± 2 17.4 ± 2.7 ** NS
åPUFA n-35 8.4 ± 1.8 6.2 ± 0.9 10.4 ± 2 7.9 ± 2.4 NS *
åPUFA6 37.1 ± 3.0 32.5 ± 3.0 50 ± 3 51.6 ± 3.0 ** NS
22:5n-6/22:6n-3
0.7 ± 0.0 0.5 ± 0.0 0.5 ± 0.6 0.5 ± 0.0 NS *
109
Table 5.4. Significant correlations* between plasma IL-6, fatty acids, and plasma and urinary isoprostanes (P<0.05).
Plasma 15-F2t-IsoP
Plasma 2,3-dinor-
15-F2t-IsoP
Urinary 15-F2t-
IsoP
Urinary 2,3-dinor-
15-F2t-IsoP
Urinary 4(RS)-F4t-NeuroP
IL-6 r = 0.47 P = 0.004
r = 0.45 P =
0.0062 -
r = 0.47 P =
0.0038
r = 0.43 P = 0.009
Oleic acid - - r = -0.69 P<0.0001 - r = -0.46
P = 0.005 Linoleic acid - - r = 0.51
P = 0.0015 - r = 0.39 P = 0.02
Arachidonic acid - - r = 0.50
P = 0.002 - r = 0.44 P = 0.007
* r = Pearson correlations coefficients, - non significant correlations.
110
Figure 5.1. Effects of oil and cyclic fatty acid monomers (CFAM) on plasma myristic acid (MYA, A), palmitic acid (PMA, B), palmitelaidic acid (PEA, C), linoleic acid (LNA, D), a-linolenic acid (ALA, E), and total n-6 polyunsaturated fatty acids (n-6 PUFA, F) of rats fed either canola oil or soybean oil with or without 0.5% of CFAM. Data are mean ± SD. Data with different letter are significantly different (ANOVA followed by a post hoc Tukey Honestly Significant Different (HSD) test, P£0.05, n =9).
Pla
sm
a M
YA
(w
eig
ht%
)
A
b
a
a
a
Pla
sm
a L
NA
(w
eig
ht%
)
D
c
b
aa
Pla
sm
a tota
l n-6
PU
FA
(w
eig
ht%
)
F
d
c
b
a
Pla
sm
a P
EA
(w
eig
ht%
)
C
b
c
aa
Pla
sm
a A
LA
(w
eig
ht%
)
E
b
a
aa
Pla
sm
a P
MA
(w
eig
ht%
)
B
ba,b
aa
0
8
16
24
Non-CFAM CFAM
Canola oil Soybean oil
0.0
0.4
0.8
1.2
Non-CFAM CFAM
Canola oil Soybean oil
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Non-CFAM CFAM
Canola oil Soybean oil
0
5
10
15
20
25
30
35
Non-CFAM CFAM
Canola oil Soybean oil
0
1
2
3
4
Non-CFAM CFAM
Canola oil Soybean oil
0
10
20
30
40
50
Non-CFAM CFAM
Canola oil Soybean oil
111
Figure 5.2. Liver 15-F2t-IsoP (A), 2,3-dinor-15-F2t-IsoP (B), and 4(RS)-4-F4t-NeuroP (C)) of rats fed either canola oil or soybean oil with or without 0.5% of cyclic fatty acid monomers (CFAM). Data are mean ± SD. (ANOVA, P£0.05, n =9).
Liv
er
15
-F2
t-Is
oP
(pg
/mg)
Liv
er
2,3
-din
or-
15
-F2
t-Is
oP
(pg/m
g)
A B
4(R
S)-
4-F
4t-N
euro
P (
pg/m
g)
C
0
50
100
150
200
250
Canola oil Soybean oil
Non-CFAM CFAM
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
Non-CFAM CFAM
Canola oil Soybean oil
0
20
40
60
80
Non-CFAM CFAM
Canola oil Soybean oil
112
Figure 5.3. Plasma 15-F2t-IsoP (A), 2,3-dinor-15-F2t-IsoP (B), and 4(RS)-4-F4t-NeuroP (C)) of rats fed either canola oil or soybean oil with or without 0.5% of cyclic fatty acid monomers (CFAM). Data are mean ± SD. Data with different letter superscripts are statistically different (ANOVA followed by a post hoc Tukey HSD test, P£0.05, n = 9).
C
Plas
ma
2,3-
dino
r-15
-F2t
-IsoP
(ng/
mL) B
c
b
aaPlas
ma
15-F
2t-Is
oP (n
g/m
L)
A
BA
0
150
300
450
600
750
Non-CFAM CFAM
Canola oil Soybean oil
0
40
80
120
160
200
Non-CFAM CFAM
Canola oil Soybean oilPl
asm
a 4(
RS)
-4-F
4t-N
euro
P (n
g/m
L)
0
40
80
120
160
Non-CFAM CFAM
Canola oil Soybean oil
113
Figure 5.4. Urinary 15-F2t-IsoP (A), 2,3-dinor-15-F2t-IsoP (B), and 4(RS)-4-F4t-NeuroP (C)) of rats fed either canola oil or soybean oil with or without 0.5% of cyclic fatty acid monomers (CFAM). Data are mean ± SD. Data with different letter superscripts are statistically different (ANOVA followed by a post hoc test Tukey HSD P£0.05, n = 9).
aa
b
b
Urin
e 15
-F2t-Is
oP (n
g/m
L)
A
0
40
80
120
160
200
Non-CFAM CFAM
Canola oil Soybean oil
c
b
aa
Urin
e 2,
3-di
nor-1
5-F 2
t-Iso
P (n
g/m
L)
0
35
70
105
140
175
Non-CFAM CFAM
Canola oil Soybean oil
B
Urin
e 4(
RS
)-F4t
-Neu
roP
(ng/
mL)
b
aa a
C
0
15
30
45
60
75
90
Non-CFAM CFAM
Canola oil Soybean oil
114
Figure 5.5. Plasma IL-6 and C-reactive protein (CRP) of rats fed either canola oil or soybean oil with or without 0.5% of cyclic fatty acid monomers (CFAM). Data are mean ± SD. Data with different letter superscripts are statistically different (ANOVA followed by the post hoc Tukey HSD test, P£0.05, n = 9).
Plas
ma
IL-6
(pg/
mL)
b
a
a
a
A
Plas
ma
C-re
activ
e pr
otei
n (m
g/L)
B
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Non-CFAM CFAM
Canola oil Soybean oil
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Non-CFAM CFAM
Canola oil Soybean oil
aaa
115
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119
Chapitre 6. Discussion générale
Les résultats de ce projet de recherche rejoignent certaines problématiques
de santé actuelles. Au niveau mondial, l’Organisation mondiale de la santé
vient de lancer son guide pour l’élimination des acides gras trans de
l’alimentation humaine à l’horizon 2023 (OMS, 2018). Or ces acides gras
trans proviennent de l’hydrogénation partielle des huiles utilisées pour la
friture, mais aussi de la friture des huiles végétales comme illustré à la
Figure 2.6.
Concernant le Canada, la consommation des lipides a progressé de 31,3%
en 2004 à 32,2% en 2015 (Statistique Canada, 2017). Chaque jour, il y a
18 millions de visites au restaurant par les Canadiens et, par ailleurs, la
restauration contribue à 4% du produit intérieur brut du Canada (Elliott,
2017). Selon les projections, l’industrie de la restauration connaîtra une
croissance annuelle de 3,9% au Canada entre 2017 et 2021, alors que la
restauration rapide connaissait une croissance de 5,3% en 2017 (Elliott,
2017). Cette croissance est soutenue par la demande, le rebond dans la
confiance des consommateurs et l’augmentation du tourisme. Par ailleurs,
il était estimé en 2005 que l’économie de la friture commerciale rapportait
jusqu’à 83 milliards de dollars Américains (Choe & Min, 2007). On sait
aussi que la restauration rapide recourt à la friture comme moyen de
cuisson des aliments en raison de sa simplicité (Gertz, 2014). Mais la friture
peut aussi comporter des dangers toxicologiques à cause de l’émission des
fumées contenant des particules délétères à la santé (Singh et al., 2017), en
particulier des composés aromatiques polycycliques (Singh et al., 2016),
alors que l’exposition prolongée aux fumées des fritures peut entrainer le
cancer des poumons (Pan et al., 2008). On sait que les recommandations
concernant le point de rejection des huiles de friture ne portent que sur les
120
composés polaires totaux (<24%) et les TG polymérisés (<12%) (Gertz, 2014).
Ces éléments, qui n’incluent pas les monomères cycliques d’acides gras
(MCAG), rendent d’autant plus actuels les résultats de cette thèse. Il
convient donc à présent de présenter synthétiquement les résultats obtenus
et leurs implications pathophysiologiques en rapport aux hypothèses et
objectifs de ce projet de thèse.
6.1. Synthèse des résultats et vérification des hypothèses générales
Hypothèses générales :
Deux hypothèses principales ont été énoncées dans cette thèse :
1) Les monomères cycliques d’acides gras (MCAG) modifient le
métabolisme lipidique au foie tout en altérant des marqueurs
associés à la stéatose hépatique non alcoolique chez le rat.
2) Les réponses métaboliques aux MCAG diffèrent selon les lipides
présents dans la diète.
Objectif général :
Déterminer les effets des MCAG sur la réponse lipidique et inflammatoire,
et le stress oxydant, marqueurs associés à la stéatose hépatique, chez le rat
et vérifier si ces effets sont modulés par les lipides alimentaires.
En vue d’atteindre l’objectif général et de vérifier les deux hypothèses
générales de cette thèse, nous avons utilisé un modèle animal (rat Wistar
mâle) nourri avec quatre différentes diètes purifiées : huile de canola (CO),
huile de canola et MCAG (CC), huile de soya (SO) et l’huile de soya et MCAG
(SC). La mesure de la réponse lipidique s’est faite par la détermination des
profils lipidiques hépatiques par chromatographie liquide haute
performance (HPLC), des profils des lipides et lipoprotéines plasmatiques
121
grâce à des kits commerciaux, des profils des acides gras hépatiques et
plasmatiques par chromatographie sur phase gazeuse (GC). La mesure de
la réponse inflammatoire a été réalisée par la mesure des cytokines
inflammatoire (IL-6 et CRP) et des enzymes de la fonction hépatique, soit
l’alanine transaminase (ALT) et l’aspartate transaminase (AST) à l’aide des
kits commerciaux. L’évaluation du stress oxydant a été réalisée par la
mesure de deux isoprostanes (15-F2t-IsoP et son métabolite, le 2,3-dinor-
15-F2t-IsoP) et d’un neuroprostane (4(RS)-F4t-NeuroP) dans le foie, le
plasma et l’urine. Pour mesurer ces marqueurs du stress oxydant, nous
avons eu recours à la chromatographie liquide en tandem avec la
spectrométrie de masse (micro-LC-MS/MS). Brièvement, après broyage du
foie et hydrolyse des isoprostanes estérifiés (cas du foie et du plasma),
l’extraction des isoprostanes a été faite à l’aide d’une colonne SPE. Après la
micro-LC-MS/MS, la quantification des isoprostanes a été réalisée grâce au
logiciel MultiQuant. La modulation des effets des MCAG par des lipides
alimentaires a été réalisée par la vérification statistique des interactions
significatives entre les types d’huiles et la dose des MCAG (0,0 ou 0,5% des
lipides alimentaires totaux).
Certains résultats obtenus dans cette étude ont confirmé les observations
faites dans des études antérieures sur les effets des MCAG. Comme Iwaoka
et Perkins (Iwaoka & Perkins, 1976), Siess et collaborateurs (Siess et al.,
1988) et Lamboni et collaborateurs, nous avons observé que les MCAG
induisent une accumulation des lipides dans le foie des rats (Lamboni et
al., 1998). Nos résultats, en accord avec ces études antérieures, indiquent
donc que, bien purifiés, les MCAG augmentent les taux des lipides
hépatiques, indépendamment de la qualité des lipides alimentaires. Par
ailleurs, l’hépatomégalie observée antérieurement (Iwaoka & Perkins, 1976;
Siess et al., 1988) n’a pas été reproduite dans la présente étude. Martin et
collaborateurs (Martin et al., 2000) ont observé une baisse d’acides gras
122
monoinsaturés (AGMI) avec les MCAG, alors que dans notre étude la
différence concernant les AGMI était due au facteur « huile » et non aux
MCAG. La différence dans les doses de MCAG et l’utilisation comparative de
deux huiles dans la diète de base dans la présente étude pourraient
expliquer ces différences. En effet, l’utilisation de deux huiles dans la
présente étude a fait ressortir l’effet accentué des MCAG en présence d’huile
de soya sur les marqueurs inflammatoires et de stress oxydatif. Ces
résultats divergents suggèrent que la forme dans laquelle les MCAG sont
administrés aux rats ainsi que le choix d’huile utilisée dans la diète de base
sont des facteurs à prendre en compte pour évaluer les effets des MCAG.
Les données plasmatiques et urinaires, les lipides fécaux, les isoprostanes
et neuroprostanes, les interactions entre les MCAG et les huiles végétales
constituent les contributions novatrices de cette étude. Concernant les
données plasmatiques, nous avons observé que les MCAG induisent plus
de cholestérol total, moins de cholestérol des HDL et d’alanine
transaminase (ALT). Aucun effet des MCAG n’a été observé sur les TG,
glucose, l’insuline et le CRP plasmatiques. Une concentration élevée de l’IL-
6 a été observée chez les rats nourris avec l’huile de soja supplémentée de
MCAG (SC), alors qu’une concentration élevée d’aspartate transaminase
(AST) et un ratio AST/ALT élevé ont été observés chez les rats nourris avec
l’huile de canola et MCAG (CC). Les rats nourris avec les MCAG manifestent
des concentrations élevées en isoprostanes, mais ceux nourris avec la diète
SC avaient de taux plus élevés comparés à ceux nourris avec la diète CC.
Nos résultats plasmatiques -en particulier les concentrations inchangées de
glucose et insuline- permettent de suggérer que l’hyperinsulinémie n’est pas
la cause de l’accumulation des TG dans les foies des rats nourris aux
MCAG.
123
Ces résultats montrent que l’objectif principal de ce projet de recherche a
été atteint. Quant à la vérification de l’hypothèse générale, nos résultats
montrent que les MCAG induisent l’accumulation des TG dans le foie tout
en réduisant les concentrations hépatiques de la phosphatidylcholine.
Cependant, nous n’avons pas été en mesure de déterminer le mécanisme
précis par lequel cet effet des MCAG est exercé. En effet, nos résultats ont
montré que les MCAG n’ont pas affecté l’activité de la
phosphatidyléthanolamine N-méthyle transférase (PEMT) et l’expression de
la CT-a, les deux enzymes impliquées dans la synthèse de la PC. Nos
résultats indiquent des changements dans les profils en cholestérol total et
cholestérol de HDL plasmatiques induits par les MCAG, mais ces derniers
n’ont pas affecté les TG plasmatiques. Les concentrations plasmatiques
élevées d’isoprostanes chez les rats nourris avec les MCAG indiquent un
effet des MCAG sur l’induction du stress oxydant, mais cet effet est exacerbé
par l’huile de soya (diète SC), riche en acide linoléique. Quant aux cytokines
inflammatoires, il a été constaté une élévation des concentrations
plasmatiques de l’IL-6 chez les rats SC, alors que les MCAG n’ont pas affecté
les taux de CRP plasmatique. Concernant les concentrations plasmatiques
de l’IL-6 et les isoprostanes, nous avions observé des interactions entre le
type de lipides alimentaires et la dose des MCAG. Ces interactions
statistiques indiquent donc que les effets des MCAG sur certains processus
pathophysiologiques peuvent être modulés par les lipides alimentaires. Si
donc, les MCAG induisent une accumulation des TG dans le foie
indépendamment du type des lipides alimentaires, il n’en va pas de même
concernant l’inflammation, le stress oxydant et certains acides gras
plasmatiques (voir Fig. 5.2 pour les détails des acides gras concernés). En
conclusion, nos deux hypothèses générales ont été vérifiées partiellement et
certains de nos résultats ont permis de les réajuster.
124
Il convient à présent de discuter ces résultats plus en détail en lien avec les
hypothèses et objectifs spécifiques énoncés dans le troisième chapitre de ce
travail.
6.2. Extraction et qualité des fractions de MCAG
Hypothèse spécifique 1 :
La production de MCAG à partir de l’huile de lin fournit un mélange de
MCAG avec cycles de 5 et de 6 carbones et le processus de production a un
impact sur la qualité des fractions.
Objectif spécifique 1 :
Caractériser la fraction de MCAG produite à partir de l’huile de lin et évaluer
ses effets sur la consommation et la prise de poids chez le rat.
Les MCAG sont principalement produits à partir des acides linoléique et a-
linolénique, mais ils peuvent également être générés à partir de l'acide
oléique (Christie & Dobson, 2000). Les MCAG générés à partir de l'acide
linoléique sont majoritairement constitués d'isomères cyclopentyles (cycles
à 5 atomes de carbone, C5), tandis que ceux générés à partir de l'acide a-
linolénique sont un mélange d'isomères C5 et cyclohexyle (cycles à 6 atomes
de carbone, C6), en proportions presque égales. Les MCAG formés à partir
de l'acide oléique sont des acides gras cycliques saturés.
Une première question s’est posée. Devions-nous produire des MCAG
endogènes ou exogènes ? Comme l'huile de canola utilisée dans notre étude
était riche en acide oléique (61,3%) et contenait quelques pourcentages
d'acides linoléique (17,8%) et a-linolénique (8%), la composition de la
fraction MCAG dérivée du chauffage de cette huile aurait des cycles saturés
et probablement plus d'isomères C5 de MCAG. Une fraction MCAG préparée
125
à partir de l’huile de soya (20,5% d'acide oléique, 52% d'acide linoléique et
6,7% d'acide a-linolénique) aurait certainement une teneur plus élevée en
isomères C5 de MCAG, quelques acides gras cycliques saturés et des
isomères C6 de MCAG. Pris ensemble, ces considérations indiquent que la
fraction de MCAG préparée à partir de l'huile de canola serait
principalement constituée de MCAG saturés et que celle préparée à partir
de l’huile de soya serait pour la plupart des isomères C5 de MCAG. Ainsi
donc, si des MCAG générés de manière endogène étaient isolés à partir de
l’huile de canola ou de soya et supplémentés aux diètes, leurs effets sur les
marqueurs de stress oxydant, l’inflammation et les profils lipidiques
auraient pu être différents. En effet, il a été observé que l’huile de tournesol
chauffée (riche en acide linoléique) et l'huile de tournesol à haute teneur en
acide oléique génèrent deux fois plus d'isomères C5 de MCAG que des
isomères C6 (Romero et al., 2006). Ainsi, la fraction de MCAG générée de
manière endogène à partir de l’une de nos deux huiles aurait entraîné une
modification de l'équilibre entre les isomères C5 et C6 de MCAG, en faveur
des premiers. On sait que les acides gras C5 tendent plus à s’accumuler
dans les tissus que les acides gras C6 (Ribot et al., 1992). En outre, la
plupart de ces acides gras C5 ou C6 générés de manière endogène seraient
des acides gras saturés et on a constaté qu'ils étaient associés à des niveaux
élevés de marqueurs du stress oxydatif (Tomey et al., 2007). En nous basant
sur leur structure et leur incorporation préférentielle dans les tissus, nous
pouvons supposer que la fraction de MCAG générée de manière endogène à
partir de l’huile de canola ou de soya aurait induit des niveaux de stress
plus élevés que ceux générés par le traitement thermique de l’huile de lin
(qui contient des isomères C5 et C6 en proportion quasi égale). Cependant,
dans la présente étude, nous voulions vérifier les effets d’une fraction de
MCAG avec des isomères C5 et C6 dans des proportions à peu près égales.
Nous avons donc contrôlé leur production à partir de l’huile de lin, une
huile riche en acide α-linolénique.
126
Par conséquent, pour vérifier la première hypothèse spécifique énoncée ci-
dessus, un protocole a été mis en place pour l’extraction des MCAG (Fig.
6.1). Ce protocole se résume globalement en une combinaison de la
chromatographie sur colonne d’acide silicique et du fractionnement à l’urée
comme décrit précédemment (Sébédio et al., 1987).
Après identification et quantification de différents isomères de MCAG, ces
derniers ont été purifiés par un triple processus. D’abord, les fractions de
MCAG ont été passées par une pompe à vide afin de les débarrasser des
traces de solvants organiques. Ensuite, elles ont été passées dans une
solution de Na2SO3 afin d’éliminer de possibles peroxydes. Enfin, nos
fractions ont été filtrées avec 2% de bentonite pour les débarrasser
d’impuretés. Avant d’être incorporées aux diètes, les MCAG ont été
saponifiés afin d’obtenir des acides gras libres.
127
Figure 6.1. Schéma d’extraction des monomères cycliques d’acides gras à partir de l’huile de lin chauffée.
En accord avec la littérature (Rojo & Perkins, 1987; Sebedio et al., 1987),
nos fractions de MCAG issues de l’huile de lin chauffées contenaient des
structures à cycles à 5 carbones (45%) et des structures à cycles à 6
carbones (41%) comme illustré au chapitre 4 de cette thèse (Fig. 4.1 et Tab.
4.2), 3% d’acide linoléique et 11% de divers acides gras.
Huile de lin fraîche
Mise en ampoules sous courant de N2
Ampoules d’huile scellées sous N2
Chauffage à 275 °C pendant 12h
Huile chauffée
Saponification
Acides gras libres
Estérification
Méthyles esters d’acides gras, MEAG
Chromatographie sur colonne d’acide silicique
Fraction non polaireFraction polaire
Fraction libreFraction avec l’urée
Fractionnement à l’urée
H2O + HCl 3%Extraction à l’hexane
H2O + HCl 3%Extraction à l’hexane
MEAG à chaîne linéaire Monomères cycliques d’acides gras, MCAG
Synthèse d’esters picoliniques
Esters picoliniques de MCAG
GC GC-MS
Identification d’isomères de MCAGQuantification des MCAG
128
Tableau 6.1. Comparaison de deux méthodes de production des MCAG, du protocole expérimental et les effets des MCAG sur la consommation et le gain de poids chez le rat.
Présente étude Desmarais et al.
(2015)
Méthode de production des MCAG
Huile de lin chauffée, 275 °C, 12h,
chromatographie et fractionnement à
l’urée.
Synthèse chimique multi-étapes
Méthode de purification des fractions de MCAG
Neutralisation des
peroxydes (Na2SO3), filtrage avec du
bentonite et pompe à vide
Chromatographie sur couche mince
suivie des méthodes analytiques dont la
spectrométrie de masse
Pureté des fractions de MCAG
86% >90%
Forme des MCAG administrés aux rats
Acides gras libres Acides gras libres
Proportion des MCAG dans la diète
0,5% des lipides totaux
0,5% des lipides totaux
Durée de l’expérimentation 28 jours 3 jours
Modèle animal Rat Wistar Rat Sprague-Dawley
Jours d’adaptation aux diètes purifiées
7 0
Effet des MCAG sur la consommation
Effet des MCAG sur le gain de poids
MCAG : monomères cycliques d’acides gras,
Contrairement à Desmarais et collaborateurs qui avaient observé une
baisse de consommation et de gain de poids chez les rats nourris avec les
MCAG après trois jours d’expérimentation (Desmarais et al., 2015), nous
n’avons observé aucune différence significative entre les groupes de rats
129
(Tableau 6.1). D’une part, l’utilisation des MCAG synthétiques produits par
une synthèse chimique multi-étapes dans l’étude de Desmarais (avec une
pureté de 90%) et, d’autre part, la triple purification de nos fractions de
MCAG et l’ajout d’une semaine d’adaptation aux diètes purifiées dans notre
étude pourraient expliquer ces différences. En particulier, concernant la
purification des fractions, nous avions d’abord neutralisé les peroxydes
éventuels avec le Na2SO3 ; ensuite nous avions filtré les fractions avec 2%
de bentonite afin d’éliminer d’éventuelles impuretés et enfin, nos fractions
avaient été passées à la pompe à vide afin d’éliminer des traces de solvant.
Nos résultats suggèrent que le soin mis dans la production des MCAG peut
jouer un rôle crucial dans l’évaluation des effets des MCAG, confirmant
ainsi notre première l’hypothèse spécifique. Il reste que, dans cette étude, il
n’a pas été possible d’associer un type d’isomères de MCAG à des effets
spécifiques.
130
6.3. Les monomères cycliques d’acides gras, l’accumulation des triglycérides dans le foie : rôle de la synthèse de la phosphatidylcholine
Hypothèse spécifique 2 :
Les MCAG altèrent la composition des lipides hépatiques en induisant une
accumulation des TG et une réduction de la phosphatidylcholine par
altération les voies de synthèse de PC.
Objectif spécifique 2 :
Déterminer les effets des MCAG sur le contenu en lipides hépatiques et sur
la synthèse de la phosphatidylcholine hépatique.
Pour vérifier l’hypothèse spécifique 2, nous avons déterminé le profil des
lipides hépatiques et mesuré le glycogène hépatique. Contrairement à deux
études précédentes qui avaient observé une baisse de glycogène hépatique
avec les MCAG (Lamboni et al., 1998; Martin et al., 2000), nous n’avons
observé aucun effet des MCAG sur le glycogène hépatique (Tableau 6.2).
Cette différence pourrait être expliquée par les unités utilisées pour
l’expression du glycogène hépatique qui était exprimé en poids sur poids du
foie (µg/g) dans les deux études susmentionnées. En effet, dans la présente
étude, nous avions aussi observé une baisse significative de glycogène
hépatique par les MCAG quand celui-ci était exprimé de la même manière
que dans les études précédentes. Les résultats donnaient en effet les
données suivantes, en µg/g de foie : 162 ± 22 pour le groupe huile de canola,
132 ± 23 pour l’huile de canola et MCAG, 185 ± 17 pour l’huile de soya et
126 ± 14 pour l’huile de soya et MCAG (PMCAG<0,05). En revanche, en
exprimant le glycogène hépatique en poids sur poids de protéines
131
hépatiques totales, nous avons remarqué qu’il n’y avait pas de différences
entre les groupes (Tableau 4.3).
Il est connu qu’une accumulation de glycogène peut contribuer à
l’hypertrophie du foie (Murakami et al., 1997). Par ailleurs, les particules de
glycogène hépatiques sont associées à des protéines qui modulent leurs
fonctions biologiques dont, entre autres, la gestion des flux de glucose, le
maintien de la structure et la régulation de la dimension des particules de
glycogène (Stapleton et al., 2010). Ces observations suggèrent qu’il est plus
approprié d’exprimer le glycogène en poids sur poids de protéines
hépatiques. Ceci est d’autant plus pertinent que nos résultats hépatiques
ont été corroborés par l’absence d’effet des MCAG sur le glucose et l’insuline
plasmatiques. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que les MCAG n’ont
pas altéré le métabolisme glucidique et nous conduisent à penser que
l’accumulation des TG hépatiques observée dans cette étude ne résulte pas
d’une altération de l’insulinémie comme observée précédemment (Aubert et
al., 2011).
Nous avons observé que les MCAG induisent des concentrations élevées de
TG hépatiques et une baisse de phosphatidylcholine hépatique. Ces deux
résultats sont en accord avec la littérature puisque des cas de stéatose
hépatique non-alcoolique (SHNA) ont été associés à une élévation des TG
hépatiques et une baisse de PC hépatique (Puri et al., 2007). Des études ont
déjà montré que les monomères cycliques d’acides gras interfèrent avec des
activités enzymatiques pour induire des changements dans la composition
en acides gras hépatiques. En particulier, une étude a montré une baisse
de la teneur en acides gras monoinsaturés (AGMI) dans le foie des rats
Wistar suite à la baisse de l’activité de stearoyl-CoA desaturase (SCD1)
après supplémentation de la diète des rats avec 1 g de MCAG par 100 g de
diète (Martin et al., 2000). Dans la présente étude, la baisse de
phosphatidylcholine hépatique n’a pas été accompagnée de changements
132
de l’activité de la PEMT et l’expression de la CT-a, les deux enzymes
impliquées dans sa synthèse, suggérant que le résultat observé n’était pas
dû à une altération des voies de synthèse de PC.
Tableau 6.2. Comparaison des effets des MCAG sur le poids relatif du foie, le glycogène et les lipides hépatiques.
Présente étude
Lamboni et al. (2015)
Martin et al. (2000)
Méthode de production des MCAG
Huile de lin chauffée, 275 °C,
12h, chromatographie et fractionnement
à l’urée.
Huile de lin chauffée, 275 °C,
12h, chromatographie et fractionnement à
l’urée.
Huile de lin chauffée, 275
°C, 12h, chromatographie
et fractionnement
à l’urée
Forme des MCAG administrés aux rats
Acides gras libres
Méthyles esters d’acides gras, hydrogénés
TG
Proportion des MCAG dans la diète
0,5% des lipides totaux 0,15% de la diète 1% de la
diète
Durée de l’expérimentation
4 semaines 10 semaines 2 semaines
Modèle animal Rat Wistar Rat Sprague-
Dawley Rat Wistar
Effet des MCAG sur le glycogène hépatique*
Effet des MCAG sur les lipides hépatiques
Effet des MCAG sur le poids relatif du foie**
MCAG : monomères cycliques d’acides gras ; * le glycogène est exprimé en mg par gramme de protéines hépatiques dans la présente étude et en mg par g du
poids du foie ; ** c’est le ratio entre le poids du foie et le poids de l’animal.
133
Il peut donc être suggéré que la baisse de PC à la suite de l’ingestion des
MCAG passe par des mécanismes autres que ces voies de synthèse, même
s’il reste à savoir si la mesure de l’activité (et non l’expression de la protéine)
de CT-a aurait donné les mêmes résultats.
Compte tenu des éléments discutés ci-dessus, il peut donc être suggéré que
les MCAG pourraient affecter les flux à travers ces deux voies de synthèse,
mais les données de cette étude ne permettent pas de spécifier la manière
dont ces altérations se produisent. La corrélation négative entre les
concentrations hépatiques de TG et de phosphatidylcholine (r = -0,98,
P<0,0001, Fig. 4.5) illustre bien la relation entre ces deux paramètres,
suggérant un lien plus que statistique.
Cependant, même si les mécanismes par lesquels les MCAG réduisent les
concentrations hépatiques de PC ne sont pas élucidés, il est fort probable
que cette baisse de PC hépatique ne soit pas un phénomène isolé. Nos
résultats indiquent la concomitance de l’élévation des TG hépatiques et la
baisse de PC hépatique à la suite de la consommation des MCAG chez les
rats. Cependant, l’absence de la baisse de l’activité ou expression de l’une
ou l’autre des enzymes impliquées dans la synthèse de PC montre que notre
hypothèse 1 a été vérifiée partiellement.
134
6.4. Les monomères cycliques d’acides gras et la fonction hépatique
Hypothèse spécifique 3 :
Les MCAG altèrent la composition en acides gras hépatiques et perturbent
la fonction hépatique.
Objectif spécifique 3 :
Déterminer les effets des MCAG sur le profil en acides gras hépatiques et la
fonction hépatique.
Pour vérifier notre troisième hypothèse spécifique, nous avons procédé à
l’analyse des profils hépatiques en acides gras par chromatographie en
phase gazeuse et la mesure de l’alanine transaminase (ALT) et l’aspartate
transaminase (AST) plasmatiques avec des kits commerciaux.
Concernant les profils en acides gras hépatiques, nous avons observé peu
de différences significatives comparativement à une étude antérieure
(Martin et al., 2000). Comme montré précédemment (Tableau 4.4), les
MCAG n’ont induit que plus d’acide palmitélaidique (16:1 9t) dans le foie
alors que le facteur « huile » a induit 15 différences significatives.
Contrairement à l’étude de Martin et collaborateurs (Martin et al., 2000),
nous n’avons pas observé d’effet des MCAG sur les concentrations en acide
oléique (18:1n-9) hépatique. En revanche, des effets « huile » ont été
observés. L’huile de canola, riche en acide oléique (61,3%, voir Tableau 4.1)
et contenant 8% d’acide a-linolénique (18:3n-3), a induit plus d’acides
oléique, vaccénique (18:1 n-7), dihomo-g-linolénique (20 :3n-6) et AEP
(20 :5 n-3) hépatiques que l’huile de soya. Cette dernière, riche en acide
linoléique (52%, voir Tableau 4.1) et contenant 6,7% d’acide a-linolénique,
a induit plus d’acides linoléique, a-linoléique, arachidonique (20:4n-6) et
135
lignocérique (24:0) que l’huile de canola. Ces résultats montrent que les
effets des MCAG sur les profils en acides gras hépatiques sont moins
importants que ceux induits par les lipides alimentaires. Cette conclusion
confirme des études antérieures (Liao et al., 2010 ; Takeuchi et al., 2001)
et permet de minimiser les effets délétères des MCAG sur le profil en acides
gras du foie. Une particularité de notre étude est la démonstration que les
MCAG s’accumulent plus dans le foie des rats nourris avec l’huile de canola
qu’avec l’huile de soya (Tableau 4.4). Les possibles explications de ce
résultat ont été avancées dans le quatrième chapitre de cette thèse.
Brièvement, ce résultat s’expliquerait par le fait que l’acide oléique étant
préférentiellement estérifié en TG et l’huile de canola, riche en acide oléique,
aurait favorisé cette estérification préférentielle aux dépens de l’élimination
des MCAG.
Concernant la fonction hépatique ou, plus précisément, l’évaluation des
dommages hépatocellulaires (Botros & Sikaris, 2013), les résultats
présentés dans la Figure 4.2 montrent que les MCAG réduisent les
concentrations plasmatiques d’ALT alors que les concentrations d’AST sont
élevées dans le plasma des rats nourris avec l’huile de canola et MCAG. Si
on prend à part les résultats de l’ALT -qui n’est présente que dans le
cytoplasme des hépatocytes (Botros & Sikaris, 2013) et peut être déversé
dans le sang- nos données tendraient à indiquer que les MCAG n’affectent
pas négativement la fonction hépatique. Mais l’accumulation de lipides
observée dans les coupes histologiques du foie (Fig. 4.2) ne permet pas de
prendre les résultats de l’ALT de façon isolée. La corrélation négative entre
l’ALT plasmatique et les taux de MCAG hépatiques (r = -0,39, P = 0,02)
montre que, dans nos conditions expérimentales, ces deux paramètres
varient en sens opposé. En revanche, les corrélations positives entre l’AST
et le ratio AST/ALT, d’une part, et les taux de MCAG hépatiques, d’autre
part (r = 0,46, P = 0,004 ; r = 0,59, P = 0,0001, respectivement) permettent
136
de rendre compte, en partie, des concentrations élevées d’AST et du ratio
AST/ALT élevé chez les rats nourris avec l’huile de canola et MCAG. L’AST
et le ratio AST/ALT peuvent être utilisés comme marqueurs des dommages
musculaires (Hakkinen & Alen, 1989; Koutedakis et al., 1993) et/ou de
l’accumulation des TG dans le foie (Lazo & Clark, 2008). Donc, les rats
nourris à l’huile de canola et MCAG pourraient, en accumulant plus de
MCAG hépatiques que les rats nourris avec les autres diètes, présenter l’un
ou les deux phénomènes physiologiques comparativement aux autres
groupes de rats.
En effet, ces rats présentent des concentrations hépatiques élevées en
MCAG comme indiqué dans le Tableau 4.4. Par ailleurs, les taux
plasmatiques d’AST tendent à corréler négativement avec les concentrations
de phosphatidylcholine hépatique (r = -0,32, P = 0,055). Pris ensemble, ces
résultats indiquent que les MCAG exercent un effet délétère sur la fonction
hépatique au sens large, et ce, proportionnellement aux niveaux
d’accumulation de MCAG dans le foie des rats.
En résumé, et en rapport à l’hypothèse spécifique sous discussion, les effets
des MCAG alimentaires sur le profil en acides gras hépatiques sont
moindres par rapport à ceux causés par les lipides alimentaires. En outre,
plus ils s’accumulent dans le foie, moins l’effet des MCAG est bénéfique à
la fonction hépatique.
137
6.5. Les monomères cycliques d’acides gras et les dyslipidémies
Hypothèse spécifique 4 :
Les MCAG induisent des changements dans la composition des lipides,
lipoprotéines et acides gras plasmatiques et perturbent l’homéostasie
glucidique.
Objectif spécifique 4 :
Analyser les effets des MCAG sur les lipides et lipoprotéines de même que
le profil en acides gras plasmatiques et les paramètres du métabolisme
glucidique.
En vue de vérifier notre hypothèse spécifique 4, nous avons mesuré les
lipides et lipoprotéines plasmatiques, réalisé des profils en acides gras
hépatiques, mesuré les concentrations de glucose et insuline plasmatiques
et vérifié s’il y avait des liens entre certains résultats hépatiques et
plasmatiques.
Les résultats de l’analyse de glucose et d’insuline plasmatiques n’ayant pas
montré de différences significatives, il peut être suggéré que la configuration
de notre dispositif expérimental (durée de l’expérimentation et utilisation
d’une diète non-obésogène) n’a pas permis d’observer un effet majeur des
MCAG sur le métabolisme glucidique. Ces données plasmatiques sont par
ailleurs en accord avec les données sur le glycogène hépatique qui n’ont pas
révélé de différence significative.
Les résultats de l’analyse des acides gras plasmatiques ont été largement
discutés dans le cinquième chapitre de ce travail. Aussi, pour éviter les
répétitions, cette partie de la discussion se focalise sur la dyslipidémie.
Dans leurs directives pour la gestion des dyslipidémies, Capatano et
138
collaborateurs définissent les dyslipidémies comme des concentrations
élevées de lipides et de lipoprotéines plasmatiques qui sont des facteurs de
risque des maladies cardiovasculaires (Catapano et al., 2016), comme le
cholestérol total (TC), les TG et le cholestérol des VLDL+LDL (VLDL+LDL-C),
et des concentrations faibles du cholestérol des HDL (HDL-C). Dans la
présente étude, nous avons observé des concentrations plasmatiques
élevées en TC et VLDL+LDL-C et des concentrations réduites de HDL-C. Ces
dyslipidémies montrent, d’une part, que les MCAG peuvent constituer des
produits lipidiques défavorables à la santé cardiovasculaire et que, d’autre
part, ils perturbent le métabolisme du cholestérol et des lipoprotéines. Dans
leur étude sur la lipidomique des maladies du foie gras, Puri et
collaborateurs ont observé des concentrations plasmatiques élevées en TC
chez les sujets affectés par la stéatose hépatique et la stéatohépatite
comparés aux sujets contrôle (Puri et al., 2007). À la lumière de cette
observation, les concentrations élevées de TC plasmatiques observées dans
notre étude seraient associées aux concentrations hépatiques élevées en
TG. Effectivement, nous avions observé une corrélation positive entre les
TG hépatiques et le TC plasmatique (r = 0,35, P = 0,039). Il est donc permis
de suggérer que les dyslipidémies observées dans notre étude ne sont pas
des phénomènes isolés, mais pourraient résulter des perturbations
lipidiques observées dans le foie des rats nourris aux MCAG. Cependant,
une mesure de la sécrétion des VLDL hépatiques auraient pu montrer si
nos résultats plasmatiques sont causés par une altération de ce processus
et si ce dernier résulte de la baisse de PC hépatique. Donc, notre hypothèse
4 a été vérifiée, mais les détails mécanistiques sous-jacents mériteraient
d’être élucidés plus finement.
139
6.6. Accumulation hépatique des lipides, stress oxydant et baisse de cholestérol des HDL plasmatique : conséquences cardiovasculaires des acides gras cycliques
Hypothèse spécifique 5 :
Les MCAG induisent une augmentation de cytokines pro-inflammatoires,
lesquelles sont associées au stress oxydant.
Objectif spécifique 5 :
Déterminer l’impact des MCAG sur les cytokines pro-inflammatoires et les
marqueurs du stress oxydant.
L’hypothèse spécifique 5 de ce projet de thèse a été vérifiée grâce à la mesure
d’isoprostanes et de neuroprostanes hépatiques, plasmatiques et urinaires.
En plus, nous avons mesuré l’IL-6 et le CRP plasmatiques pour déterminer
si les MCAG sont pro-inflammatoires.
L’accumulation des TG dans les foies des rats nourris avec les MCAG,
indépendamment du type des lipides alimentaires, peut être associée à la
baisse du PC hépatique, au stress oxydant et à la baisse du HDL-cholestérol
plasmatique. Martin et collaborateurs ont observé une baisse du
phosphatidate phosphatase (PAP) avec 1g de MCAG par 100g de diète
(Martin et al., 2000). Les PAP catalysent la déphosphorylation de l’acide
phosphatique pour produire les diglycérides (DG) et le phosphore
inorganique (Carman & Han, 2006). Les DG servent de substrat pour la
synthèse des TG, de la PC et de la phosphatidyléthanolamine (PE) (Carman
& Henry, 1999). Par ailleurs, les PAP sont impliqués dans la régulation
transcriptionnelle de la synthèse des phospholipides (Santos-Rosa et al.,
2005). La production des TG à partir des DG est favorisée pendant la phase
stationnaire alors que celle du PC est favorisée par la phase de croissance
140
exponentielle cellulaire chez la levure (Han et al., 2006). Et il a été observé
qu’une mutation du gène codant pour les PAP1 pouvait réduire
significativement le contenu cellulaire en PC pendant la phase de croissance
exponentielle (Han et al., 2006). Ces observations indiquent qu’il peut
exister une interrelation entre l’accumulation des TG et la baisse de PC
hépatiques. La corrélation très forte entre les TG et le PC hépatique tend à
confirmer cette conclusion (Fig. 4.5).
Chez l’humain, une étude a montré que l’accumulation des lipides
hépatiques est corrélée à la concentration urinaire du 8-épi-PGF2a ou 15-
F2t-IsoP, marqueur du stress oxydant (Keaney et al., 2003). Chez la souris,
Furukawa et collaborateurs ont observé que les souris obèses avaient des
taux de stress oxydant plus élevés que les souris normales (Furukawa et
al., 2004). Il n’est donc pas surprenant que, dans cette étude, les rats
nourris avec les MCAG aient à la fois des concentrations élevées de TG
hépatiques et d’isoprostanes plasmatiques et urinaires. En confirmation de
ces données, des corrélations positives ont été observées entre les lipides
totaux et TG hépatiques, d’une part, et le 15-F2t-IsoP et le 2,3-dinor-15-F2t-
IsoP, d’autre part (respectivement : r=0,49, P=0,003 ; r=0,37, P=0,028, pour
les lipides totaux ; r=0,45, P=0,006 ; r=0,33, P=0,046, pour les TG). Une
étude sur les implications de l’élévation du stress oxydant en cas d’obésité
a conclu que le stress oxydant pourrait réduire les concentrations
sanguines de cholestérol des HDL tout en limitant les propriétés anti-
athérogéniques de ce dernier (Matsuda & Shimomura, 2013). Dans la
présente étude, nous avons observé une corrélation négative entre le
cholestérol des HDL plasmatique d’une part, et le 2,3-dinor-15-F2t-IsoP
plasmatique et urinaire, d’autre part (r = -0,40, P = 0,016 ; r = -0,35, P =
0,036, respectivement). En revanche, des corrélations positives ont été
observées entre le cholestérol total (TC) et le cholestérol de la fraction
VLDL+LDL d’une part, avec le 2,3-dinor-15-F2t-IsoP plasmatique, d’autre
141
part (respectivement, r = 0,52, P = 0,0013 ; r = 0,62, P<0,0001). Donc,
l’accumulation des TG dans le foie des rats nourris aux MCAG est non
seulement associée au stress oxydant, mais elle a aussi des implications
cardiovasculaires puisque de faibles concentrations sanguines du
cholestérol des HDL sont reconnues comme un puissant indicateur des
maladies cardiovasculaires (Gordon et al., 1977). En plus, le cholestérol des
HDL joue un rôle déterminant dans le transport inverse de cholestérol (Tall,
1998), facilitant ainsi l’élimination du cholestérol corporel. Il est par ailleurs
connu que le cholestérol des HDL joue un rôle anti-inflammatoire par lequel
il protège contre la modification oxydative du cholestérol des LDL (Watson
et al., 1995). À la lumière de ces observations, il est légitime de considérer
que les MCAG exerceraient, à long terme, un effet délétère sur la santé
cardiovasculaire.
Ces résultats montrent que notre hypothèse spécifique 5 a été vérifiée, avec
la seule précision que l’IL-6 plasmatique était élevée seulement chez les rats
nourris avec la diète SC. En plus, les marqueurs du stress oxydant
plasmatique et urinaire étaient plus élevés chez les rats nourris avec la diète
SC comparée à la diète CC. Donc, les effets des MCAG sur l’inflammation et
le stress oxydant sont clairement favorisés par une diète riche en acide
linoléique (huile de soya) comparativement à une diète riche en acide
oléique (huile de canola).
142
6.7. Interactions entre les huiles alimentaires et les monomères cycliques d’acides gras
Hypothèse spécifique 6 :
Les effets des MCAG sur des marqueurs du métabolisme lipidique, de
l’inflammation et du stress oxydant sont modulés par les lipides
alimentaires.
Objectif spécifique 6 :
Évaluer les effets respectifs des MCAG sur les profils lipidiques, les
cytokines inflammatoires et les marqueurs du stress oxydant selon que les
MCAG sont supplémentés avec l’huile de canola ou l’huile de soya.
L’utilisation de deux huiles (canola ou soya) dans les diètes nous a permis
de vérifier l’hypothèse spécifique 6. Cette étude a mis en lumière un aspect,
qui n’était pas considéré dans les études précédentes, sur les effets des
monomères cycliques d’acides gras (MCAG) : l’interaction entre les effets des
MCAG et des lipides alimentaires. Il convient donc de préciser la
signification de ces interactions et de dégager les conséquences
nutritionnelles qui en découlent. Tout d’abord, les différences d’effet des
MCAG selon qu’ils sont associés à une diète riche en acide oléique (huile de
canola) ou en acide linoléique (huile de soya) suggèrent que les effets de ces
acides gras sur la b-oxydation et la lipogenèse modulent les effets des
MCAG. L’huile de canola, riche en acide oléique, pourrait être considérée
globalement comme lipogénique (Ferramosca & Zara, 2014). Le ratio élevé
d’AST/ALT des rats nourris avec l’huile de canola et les MCAG (CC) appuie
partiellement cet effet lipogénique de l’acide oléique. Par ailleurs, l’étude de
Zhou et collaborateurs (Zhou et al., 2016) a montré que l’huile de canola
chauffée altère le métabolisme des glycérolipides chez le rat Wistar mâle,
tout en baissant l’activité des Lipin1 (ou PAP). Comme une déficience en
143
Lipin1 est associée au foie gras (Langner et al., 1989), tout en favorisant
l’accumulation du phosphatidate dans les tissus périphériques (Nadra et
al., 2008), il est possible que les concentrations élevées d’AST et le ratio
AST/ALT élevé chez les rats nourris avec la diète CC résultent de la
combinaison de tous ces facteurs.
Ensuite, les rats nourris à la diète huile de soya et MCAG (SC) ont plus
d’isoprostanes (IsoP) dans leur plasma et urine par rapport aux rats nourris
avec la diète CC. Il a déjà été montré que les rats Wistar mâles ont une
production élevée de marqueurs du stress oxydant (niveaux de nitrites et
de nitrates, niveaux des lipides hydroperoxydes, l’activité de la catalase,
l’activité d’enzymes impliquées dans le métabolisme du glutathion) quand
ils sont nourris avec une diète contenant de l’huile de soya ou de pépins de
raisin (riches en acide linoléique) par rapport à l’huile d’olive (riche en acide
oléique) (de Catalfo et al., 2013). Chez l’humain, une diète riche en acide
linoléique comparée à une diète riche en acide oléique augmente le stress
oxydant évalué par les concentrations urinaires de 8-iso-PGF2a ou 15-F2t-
IsoP (Sodergren et al., 2001). Comme l’augmentation du stress oxydant
dans cette dernière étude était accompagnée d’une baisse de métabolites de
l’oxyde nitrique (NO), une dysfonction endothéliale peut être suspectée.
Ces interactions confirment notre sixième hypothèse spécifique et indiquent
que les effets des MCAG ne peuvent pas être considérés en dehors de la
matrice lipidique avec laquelle ils sont ingérés. Du point de vue nutritionnel,
ces résultats font ressortir l’importance du choix des huiles végétales pour
la friture selon leur composition en acides gras qui affecte leur impact
métabolique subséquent. Une huile de friture riche en acide oléique et a-
linolénique (précurseur favorisé des MCAG) aurait donc davantage tendance
à favoriser l’accumulation des lipides dans le foie. En revanche, une huile
riche en acide linoléique et a-linolénique serait favorable au stress oxydant
144
et à un état pro-inflammatoire. Il apparaît donc que les MCAG ont tendance
à exacerber les effets délétères des acides gras alimentaires, mais il reste à
vérifier si cette conclusion est valable pour d’autres types d’acides gras tels
les acides gras saturés ou les acides gras polyinsaturés à longue chaîne que
l’on retrouve majoritairement dans le poisson.
Avant d’aborder la question de l’innocuité et/ou nocivité des MCAG, il
convient de présenter une synthèse des effets de ces acides gras sur certains
processus pathophysiologiques, tels que suggérés par les éléments
présentés dans cette discussion générale.
145
Figure 6.2. Schéma de synthèse des effets des MCAG sur la stéatose hépatique, la dyslipidémie, le stress oxydant et l’inflammation. Signification des couleurs des flèches : trait fort, effet des MCAG indépendamment de l’huile alimentaire ; trait mince : effets des MCAG supplémentés avec l’huile de canola ou l’huile de soya. Les flèches en pointillés indiquent des mécanismes suspectés.
6.8. La question de la nocivité et/ou l’innocuité des monomères cycliques d’acides gras Dans leur travail sur les effets des MCAG sur les rates gestantes et les
jeunes ratons, Bretillon et co-auteurs ont montré une insulinopénie
résultant de la baisse de la consommation alimentaire des rates gestantes
nourries avec les MCAG et non un effet direct des MCAG (Bretillon et al.,
2008). Ces résultats s’ajoutent à ceux obtenus dans des études antérieures
Huile végétale
ChaufféeT >180 °C
MCAG alimentaires
PC hépatique
TG hépatiques
Stéatose hépatique
TCVLDL+LDL
HDL
Stress oxydant
Peroxydation des lipides
Lésions hépatiques Inflammation
MCAG hépatiques
ASTAST/ALT
+ Huile de canola + Huile de soya
++
146
(Crampton et al., 1951, 1953, 1956; Sébédio et al., 1996) qui avaient
observé une mortalité élevée des rats nourris avec des fractions de MCAG.
Ces études ont permis de montrer que les concentrations élevées de MCAG
utilisées dans des études initiales avaient pu causer les effets délétères
observés. Dans la présente étude, nous avons observé une baisse d’alanine
transaminase (ALT) chez les rats nourris avec les MCAG comparés aux rats
nourris avec les diètes non-MCAG. Cette observation suggère un effet
protecteur des MCAG. Mais cette protection est indirecte puisqu’elle
résulterait de l’accumulation hépatique des TG qui peuvent être
cytoprotecteurs puisque la synthèse des TG diminue les concentrations en
acides gras libres hépatiques qui sont lipotoxiques (Listenberger et al.,
2003). Cependant, ces résultats ne peuvent pas être pris séparément.
En effet, dans leur majorité, les résultats de la présente étude indiquent la
nocivité des MCAG, en particulier en raison de leurs effets sur les lipides
hépatiques, le cholestérol total (TC) et lipoprotéines plasmatiques, la baisse
de DPA et DHA plasmatiques, et la production élevée d’isoprostanes
plasmatiques et urinaires. Comme indiqué dans la discussion du premier
article ci-dessus au quatrième chapitre de ce travail, la similitude entre les
MCAG et les acides gras trans quant à leurs effets sur l’augmentation du
TC et cholestérol de la fraction VLDL+LDL et la baisse du cholestérol des
HDL semble indiquer un effet néfaste à long terme des MCAG. Ces données
suggèrent des implications cardiométaboliques délétères puisque les
dyslipidémies sont rarement des manifestations de santé
cardiométabolique. Il est intéressant de noter que l’accumulation des TG
dans le foie (stéatose hépatique) observée dans la présente étude n’est pas
associée à un surplus de gras corporel (Tableau 4.3) ou une
hyperinsulinémie (Tableau 4.3), indiquant qu’elle est provoquée par les
MCAG et non par l’obésité ou la résistance à l’insuline. La baisse des acides
gras ADP n-6 et ADH observées dans cette étude a déjà été observée
antérieurement (Martin et al., 2000). Compte tenu de l’importance de l’ADH
147
pour la santé cérébrale et la production d’eicosanoïdes anti-inflammatoires,
ces effets des MCAG ne sont pas favorables à la santé.
6.9. Forces et limites de cette étude
Une des forces de cette étude est son dispositif expérimental : l’expérience
factorielle. Celle-ci a l’avantage de tester plus d’un facteur à la fois et
d’évaluer les possibles interactions, sans négliger la puissance statistique
qu’elle offre. Dans des situations de vie réelle, les MCAG étant ingérés dans
des matrices alimentaires variées, l’utilisation de deux huiles alimentaires
dans notre expérience factorielle nous rapproche ainsi plus de la réalité. En
lien avec cette première force, il convient aussi de souligner les effets
comparatifs des deux huiles (canola et soya). La plupart des études ayant
évalué les effets des MCAG ont utilisé l’huile de soya, appropriée pour les
études avec le rat (Reeves et al., 1993). Mais vu que la formation des MCAG
peut se produire avec n’importe quelle huile contenant leurs précurseurs,
dont l’acide a-linolénique, l’utilisation de ces deux huiles nous rapproche
davantage des conditions domestiques réalistes, surtout au Canada où ces
deux huiles sont majoritairement utilisées (Statistics Canada, 2015). Une
troisième force de cette étude est d’utiliser à la fois des données hépatiques
et plasmatiques. Par exemple, l’absence d’effet des MCAG sur le glucose et
l’insuline plasmatique nous a permis d’éliminer la résistance à l’insuline
des causes de l’accumulation des TG dans les foies des rats nourris avec
les MCAG. Une quatrième force de cette étude est qu’elle a bénéficié de la
collaboration et de l’expertise des équipes spécialisées dans leurs domaines
respectifs : l’équipe du professeur Jacobs de l’Université d’Alberta se
spécialise dans le métabolisme de la phosphatidylcholine, alors que l’équipe
du docteur Durand de l’Université de Montpellier est reconnue
mondialement dans la synthèse et l’analyse d’isoprostanes. L’équipe du
148
docteur Tchernof nous a apporté son expertise dans les analyses
histologiques.
Concernant les faiblesses de cette étude, la durée de l’expérience aurait pu
être rallongée pour permettre d’observer l’évolution de l’accumulation des
lipides dans le foie. On sait que la stéatose hépatique peut évoluer vers des
formes pathologiques plus sérieuses marquées par l’inflammation et des
lésions hépatiques (Petta et al., 2009). Une plus longue expérience aurait
pu permettre d’observer la présence ou l’absence de cette évolution et de
déterminer si les huiles alimentaires modulent cette progression. Même si
l’utilisation des rats Wistar mâles facilitait la conduite des expériences,
l’absence de femelles constitue une deuxième faiblesse de cette étude. En
effet, une étude a montré qu’une diète supplémentée de MCAG double
l’activité de l’acyl-CoA oxydase (ACO) chez les souris femelles sauvages alors
que ce même effet n’est pas observé chez les souris mâles sauvages
(Bretillon et al., 2003). L’utilisation des rats mâles et femelles auraient pu
faire ressortir des différences et aurait pu contribuer aussi à complexifier
notre dispositif expérimental par l’apport d’un facteur supplémentaire
(facteur « sexe des rats »), améliorant ainsi la puissance de nos tests
statistiques. Pour davantage affiner notre dispositif expérimental, nous
aurions pu également extraire des MCAG de l’huile de tournesol, riche en
acide linoléique produisant majoritairement des MCAG à cycles de 5
carbones (Sebedio et al., 1987) et mesurer leurs effets métaboliques en
comparaison des MCAG à cycles de 5 et 6 carbones.
149
6.10. Perspectives futures
6.10.1. Utiliser une diète obésogène chez l’animal
Une première voie que l’on pourra explorer afin de cerner davantage les
effets des MCAG serait l’utilisation d’une diète obésogène. Cette dernière
pourrait être une diète riche en gras (high fat diet, HFD) ou une diète
déficiente en méthionine et choline (MCD) ou une diète déficiente en choline
(Lawlor et al., 2014). Une diète HFD contient environ 32-60% d’énergie sous
forme de gras et induit l’obésité chez les rongeurs et permet de réduire la
durée de l’expérimentation (Teodoro, Varela, Rolo, & Palmeira, 2014). Les
effets de la diète HFD chez le rat incluent un gain rapide de poids, une
accumulation des lipides dans différents organes, en particulier le foie, et
la résistance à l’insuline (Samuel et al., 2004). L’administration d’une diète
HFD permettrait d’étudier les effets interactifs entre les MCAG et la diète
HFD pour voir si la HFD exacerberait l’effet des MCAG sur l’accumulation
des lipides dans le foie. Une diète MCD favorise la stéatose hépatique,
l’oxydation des lipides et l’expression des gènes inflammatoires chez la
souris (Lee, Yan, Ng, Kakar, & Maher, 2007; Sahai et al., 2004) et des
niveaux élevés de cholestérol chez le rat (Hussein et al., 2007). Les rats
nourris avec une diète CD développent la stéatose hépatique, la fibrose
hépatique (Pickens, Ogata, Soon, Grenert, & Maher, 2010), la dysfonction
mitochondriale hépatique, des niveaux élevés de TG dans le foie (Teodoro et
al., 2014), le stress oxydant et la stéatohépatite (Takeuchi-Yorimoto et al.,
2013). L’utilisation de la diète MCD ou CD permettrait donc de vérifier si les
marqueurs du stress oxydant induit par les MCAG sont exacerbés par le
type de diète et de comparer ces diètes à une diète riche en acide linoléique
supplémentée avec les MCAG.
150
6.10.2. Déterminer l’activité de la CETP
On pourra aussi analyser l’activité de la protéine de transfert des esters de
cholestérol (cholesteryl ester transfer protein CETP) pour évaluer si elle est
impliquée dans l’augmentation des concentrations plasmatiques de
cholestérol total et VLDL+LDL chez les rats nourris avec les MCAG. En effet,
dans la présente étude nous avons émis l’hypothèse que l’augmentation du
cholestérol total et LDL+VLDL plasmatiques pourrait résulter d’une
altération du transport inverse de cholestérol, qui serait mis en évidence
par la baisse de cholestérol HDL. Le mécanisme via l’activité de la CETP
pourrait être impliqué. En particulier, la CETP favorise l’enrichissement
réciproque de cholestérol de la fraction VLDL+LDL à partir des HDL et
inversement l’enrichissement en TG des HDL à partir des VLDL (Tall, 1995).
En transférant ainsi des esters de cholestérol (CE) de HDL vers des
lipoprotéines riches en apolipoprotéine B (VLDL+LDL), la CETP réduit les
concentrations plasmatiques de cholestérol des HDL et accroît celles de
cholestérol des VLDL et LDL (Tall, 1995). Il est par ailleurs connu que
certains acides gras libres issus de l’hydrolyse des TG alimentaires peuvent
stimuler l’activité de la CETP (Tall, 1995). Donc, mesurer l’activité de la
CETP pourrait mettre en lumière les effets des MCAG sur le cholestérol
lipoprotéique plasmatique.
6.10.3. Mesurer l’activité de la CT-a
Dans cette étude, nous avons analysé l’expression de CT-a, il serait
intéressant de déterminer l’activité de cette enzyme. L’expression d’une
enzyme mesure la synthèse de cette enzyme ou, dans notre cas, l’abondance
relative de la protéine enzymatique à un moment donné, déterminée par
Western blot. L’activité d’une enzyme est mesurée en déterminant la
quantité de cette enzyme sous forme active. En nous référant au tableau
4.3 de cette thèse, l’activité d’une enzyme (telle que la PEMT) détermine
151
donc le nombre de moles d’un substrat converti par unité de temps et par
mg de protéine. La température, le pH, la concentration de l’enzyme ou du
substrat ainsi que la présence de certains activateurs ou inhibiteurs
peuvent augmenter ou réduire l’activité d’une enzyme. Donc une enzyme
peut bien être synthétisée (expression), mais encore faut-il qu’elle soit active
et que le substrat soit transformé par l’enzyme. Ainsi, l’activité d’une
enzyme apporte des éléments supplémentaires que son expression ne peut
déterminer. Ceci est d’autant plus important que des études ont montré
qu’il n’existe pas toujours de corrélation entre l’activité et l’expression d’une
enzyme (Duschak et al., 2001; Miyamoto et al., 2001). Par ailleurs, l’activité
de la CT-a peut être régulée par plusieurs facteurs. Certains acides gras et
les diglycérides peuvent augmenter l’activité de la CT-a alors que certains
lipides tels les alkyles phospholipides inhibent l’activité de la CT-a en
empêchant, probablement, l’interaction entre l’enzyme et la bicouche
lipidique (Cornell & Ridgway, 2015). Ces éléments indiquent donc qu’il
serait pertinent de mesurer l’activité de la CT-a.
6.10.4. Mesurer la sécrétion des VLDL et de la bile
Il pourrait être intéressant aussi de déterminer si les MCAG affectent la
sécrétion des VLDL hépatiques pour vérifier si l’accumulation des TG
hépatiques est liée à une baisse de la sécrétion de ces lipoprotéines
hépatiques. En effet, une baisse de phosphatidylcholine hépatique perturbe
la sécrétion des lipoprotéines, en particulier des VLDL. Chez des rats
nourris avec une diète déficiente en choline, il a été montré qu’une baisse
de PC hépatique de 25% était accompagnée d’une augmentation de 650%
de TG hépatiques, comparativement à des rats nourris avec une diète
supplémentée de choline (Yao & Vance, 1990). Chez des modèles animaux
de l’altération de la synthèse de PC, il a été montré que ces animaux
accumulent des TG hépatiques consécutivement à une sécrétion des VLDL
altérée (Cole et al., 2012). Si Puri et ses collègues ont déjà montré que des
152
cas de stéatose hépatique étaient associés à une baisse de PC (Puri et al.,
2007), la mesure de la sécrétion des VLDL permettrait de déterminer si cette
baisse de PC cause une perturbation du métabolisme des lipoprotéines, en
particulier les VLDL. En relation avec cette dernière conclusion, il serait
aussi pertinent de mesurer la sécrétion de la bile par les hépatocytes. En
effet, la bile peut contenir entre 140 et 810 mg/dL de PC et entre 97 et 310
mg/dL de cholestérol (Boyer, 2013) et la sécrétion de la bile provoque la
perte d’une large portion de PC (van der Veen et al., 2017). Il n’est donc pas
impossible qu’une augmentation de sécrétion de la bile soit à la base de la
baisse de PC observée dans la présente étude.
153
Chapitre 7. Conclusion
Dans un contexte où la restauration rapide et la restauration en dehors du
foyer font de plus en plus partie de la vie des citoyens, et compte tenu du
recours à la friture aux niveaux domestiques et industriels, cette étude a le
mérite de lever le voile sur certains effets délétères d’un des constituants
des huiles végétales chauffées : les monomères cycliques d’acides gras
(MCAG). Autant des études ont déjà montré les effets délétères des huiles
thermo-oxydées et des composés polaires issus de ces huiles sur la santé,
cette étude a mis en lumière certains effets délétères d’un constituant de
ces huiles qui n’apparaît dans aucune législation, à notre connaissance.
Cette étude confirme les observations antérieures concernant l’induction de
l’accumulation des lipides dans le foie des rats nourris avec les MCAG.
Étant donné la progression possible de l’accumulation des TG dans le foie
vers des formes pathologiques plus marquées comme la stéatohépatite ou
la cirrhose, il n’est pas superflu d’insister sur la qualité et le temps de friture
des huiles végétales.
En examinant les liens entre l’accumulation des TG hépatiques et la baisse
de la phosphatidylcholine hépatique, cette étude apporte un éclairage
nouveau sur les mécanismes à la base de l’accumulation des TG à la suite
de l’ingestion des MCAG. L’analyse plasmatique des lipides, lipoprotéines et
enzymes de la fonction hépatique a révélé des liens entre les perturbations
engendrées par l’accumulation des TG hépatiques et des altérations
plasmatiques telles la dyslipidémie et les effets des lipides alimentaires dans
la modulation des effets des MCAG. Ces éléments indiquent des similitudes
frappantes entre les effets des MCAG et la stéatose hépatique non
154
alcoolique, en particulier l’accumulation des TG et les niveaux élevés d’AST
et ratio élevé d’AST/ALT (cas de l’huile de canola avec MCAG) et les
concentrations plasmatiques élevées d’IL-6 (cas de l’huile de soya avec
MCAG). Donc, il n’y a pas que la déficience en choline ou les diètes riches
en gras ou sucres qui peuvent induire la stéatose hépatique. Cette étude
démontre également qu’une faible dose de monomères cycliques d’acides
gras (0,5% des lipides alimentaires totaux) est capable de perturber le
métabolisme lipidique, d’induire une accumulation de TG dans le foie, de
baisser la phosphatidylcholine hépatique, d’élever le cholestérol total
plasmatique, de baisser les HDL et de favoriser l’élévation des marqueurs
du stress oxydant dans le plasma et les urines. Tous ces phénomènes sont
associés à une détérioration de la santé cardiométabolique.
Ainsi, cette étude a fait un pas de plus dans la compréhension des
conséquences physiologiques des effets des MCAG incorporés dans des
huiles différentes. Elle a ainsi montré que, associés à une diète riche en
acide linoléique (huile de soya), les MCAG peuvent favoriser le
développement d’un état d’inflammation chronique, tel que manifesté par
une concentration plasmatique accrue de l’interleukine 6 (IL-6), alors qu’ils
élèvent les concentrations plasmatiques d’AST quand ils sont associés à
une diète riche en acide oléique (huile de canola).
Comme on peut bien le constater, cette étude a d’une part avancé la science
en mettant en lumière certains mécanismes pathophysiologiques initiés par
la consommation des MCAG et, d’autre part, elle peut apporter un éclairage
additionnel aux familles aussi bien qu’aux industriels sur les risques
provoqués par une sur-cuisson des huiles végétales prolongée à des
températures ³180 °C sur la santé.
155
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