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Université François-Rabelais
FACULTE DE MEDECINE DE TOURS
Année 2015-2016 N°
Thèse
pour le
DOCTORAT EN MEDECINE
Diplôme d’Etat
Mémoire de D.E.S. de Biologie Médicale Polyvalente
Par
HOUSSIN Clément Georges Raymond Né le 26/08/1985 à Angers
Présentée et soutenue publiquement le 29juin 2016
Modification du métabolisme oxydatif dans les LMMC et les AREB
Jury Président de Jury : Monsieur le Professeur GYAN Emmanuel Membres du Jury : Monsieur le Professeur HÉRAULT Olivier Monsieur le Professeur DOMENECH Jorge Monsieur le Professeur VOURC’H Patrick Madame le Docteur RAULT Emmanuelle Madame le Docteur HALTY Christelle Monsieur le Docteur LACHOT Sébastien
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Modification du métabolisme oxydatif dans les LMMC et les AREB
Résumé :
Introduction : En utilisant le brevet WO2012085188 A1 du 28 juin 2012 «Method for diagnosing hematological disorders» (caractérisation à visée diagnostique de l’expression des gènes antioxydants, signature antioxydante dans les hémopathies ou «antioxydogramme») » (Hérault O, Vignon C, 2012) nous avons évalué le profil des gènes antioxydants de moelles osseuses de patients atteints de leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC) et d’anémie réfractaire avec excès de blastes (AREB) issues de patients du CHRU de Tours, avant intervention thérapeutique. Nous avons recherché un profil spécifique pour la LMMC versus des moelles normales puis nous avons cherché à mettre en évidence une différence entre le profil LMMC et le profil AREB Moyens et méthodes : 9 moelles osseuses de patients LMMC et 9 AREB ont été analysées avec quantification relative de 24 gènes impliqués dans le métabolisme oxydatif par RT-qPCR. Les résultats de ces quantifications ont été soumis à un test de Mann Whitney pour vérifier que les différences observées étaient statistiquement significatives. Résultats : Les quantifications de PRDX2(1), PRDX3(1-2), PRDX1(1-2-3), GPX1(2), PRDX5(2) et GLRX2(2) sont significativement différents entre le groupe LMMC et les témoins sains. Les quantifications relatives de GLRX1(1-2), PRDX2(1), TXN, PRDX3(1-2) et GPX1(2) sont significativement différentes entre le groupe LMMC et le groupe AREB. Discussion : L’antioxydogramme est un outil novateur pour étudier la réponse antioxydante des cellules médullaires de LMMC et d’AREB.
Mots clés :
-LMMC -AREB -Antioxydogramme -Oxydatif
-Peroxirédoxine -Glutarédoxine -Glutathion -Péroxydase
-ROS -Espèces réactives de l’oxygène
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Change of oxidative metabolism in CMML and RAEB
Abstract:
Inroduction: Using the method of the patent WO2012085188 A1 28th june 2012 called “Method for diagnosing
hematological disorders” (Hérault O, Vignon C, 2012), we evaluated the expression of different genes implicated
in the oxidative metabolism from bone marrows smear of CMML and RAEB patients whom are from Tours
CHRU (France) and weren’t treated yet. We looked for a difference between RAEB and CMML signatures.
Methods: The relative expression of 24 genes of 9 CMML bone marrow smears were compared with 9 RAEB
bone marrow smears by RT-qPCR. The Mann-Whitney test was used to make the comparison between the two
groups.
Results: Quantifications of PRDX2(1), PRDX3(1-2), PRDX1(1-2-3), GPX1(2), PRDX5(2) and GLRX2(2) are
different (p<0,05) between the normal and the CMML groups. Relative quantifications of GLRX1(1-2),
PRDX2(1), TXN, PRDX3(1-2) and GPX1(2) are different (p<0,05) between CMML and RAEB groups.
Discussion: Antioxidogram is a new tool of interest to explore the oxidative metabolism of CMML and RAEB
bone marrow cells.
Keywords:
-CMML -RAEB -Antioxidogram -Oxidative
-Peroxiredoxin -Glutaredoxin -Glutathion -Peroxidase
-ROS -Reactive oxygen species
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SERMENT D’HIPPOCRATE
En présence des Maîtres de cette Faculté,
de mes chers condisciples
et selon la tradition d’Hippocrate,
je promets et je jure d’être fidèle aux lois de l’honneur
et de la probité dans l’exercice de la Médecine.
Je donnerai mes soins gratuits à l’indigent,
et n’exigerai jamais un salaire au-dessus de mon travail.
Admis dans l’intérieur des maisons, mes yeux
ne verront pas ce qui s’y passe, ma langue taira
les secrets qui me seront confiés et mon état ne servira
pas
à corrompre les mœurs ni à favoriser le crime.
Respectueux et reconnaissant envers mes Maîtres,
je rendrai à leurs enfants
l’instruction que j’ai reçue de leurs pères.
Que les hommes m’accordent leur estime
si je suis fidèle à mes promesses.
Que je sois couvert d’opprobre
et méprisé de mes confrères
si j’y manque.
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Remerciements :
Aux membres du jury qui ont accepté de juger ce travail :
Monsieur le Professeur GYAN :
Vous me faites l’honneur de présider ce jury, veuillez recevoir mes remerciements et
l’expression de ma sincère estime.
Monsieur le Professeur Hérault :
Je vous remercie de m’avoir confié et dirigé ce travail de thèse, ainsi que de m’avoir
accueilli par deux fois dans votre service et votre équipe. Veuillez recevoir
l’assurance de mes sentiments les meilleurs et de ma sincère estime.
Monsieur le Professeur Domenech :
Merci d’avoir accepté de participer à ce jury et d’avoir participé à ma formation
pendant mes années d’internats. Veuillez trouver ici l’expression de ma profonde
reconnaissance.
Monsieur le Professeur Vourc’h :
Merci d’avoir accepté de participer à ce jury et de votre réactivité, vue la soudaineté
de la demande. Veuillez trouver ici l’expression de ma sincère reconnaissance.
Monsieur le Docteur Lachot :
Je te remercie d’avoir accepté de juger ce travail, comme tu me l’as demandé, je
prends un ton moins formel pour te témoigner ma reconnaissance et ma sympathie.
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Madame le Docteur Rault :
Merci Emmanuelle pour ta sympathie, ta compétence et le temps que tu m’as accordé
ainsi qu’à mes co-internes. Merci pour la relecture de lames que tu as effectué pour ce
travail. Trouve ici l’assurance de mes sentiments les meilleurs.
Madame le Docteur Halty :
Merci Christelle, pour ta sympathie, ton expertise, ton didactisme et le temps que tu
m’as accordé. Trouve ici l’assurance de mon profond respect.
A toute l’équipe du laboratoire d’hématologie biologique Bretonneau, je vous adresse
mes remerciements pour votre accueil, votre disponibilité et votre professionnalisme.
Merci Mme Estienne, pour vos précieux conseils, nos échanges et votre disponibilité.
Merci, Mr Petit, Mr Degenne.
Merci, Marion, Coralie, Emilie, Florentine, sans qui rien n’aurait été possible. Merci
pour votre travail, votre bonne humeur et votre amitié.
Merci, Agnès, Béatrice et Corinne pour votre sympathie et tous les services que vous
m’avez rendus.
Aux Services où je suis passé et aux superbes personnes qui j’y ai rencontré.
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A Bernard, promis je t’appellerai plus comme ça ;-) Yvan, Julien, Caroline, Karl,
Martin, Eve-Anne, Ellèn, Benoît, Clémence, Clément, Thomas, Vincent, Clairelyne,
Thomas, Céline.
A Sophie, tu auras toujours cette place un peu particulière dans mon cœur.
A tous ceux que je n’ai pas pris le temps de noter ici. Sachez que j’ai horreur des
adieux et des remerciements, et prenez pour vrai ce que nous avons vécu ensemble.
A mes parents, mes frères et mes sœurs, merci de votre soutien inconditionnel.
A mon Amie, mon Amante, ma Confidente, mon Emmerdeuse, pour ton soutien
indéfectible et ton amour.
A Auguste pour tes sourires et tes éclats de rires qui éclairent mes journées.
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Table des matières
I. Introduction ________________________________________________________ 15
A. Cadre de l’étude ___________________________________________________________ 15
B. L’hématopoïèse normale ____________________________________________________ 15
1. Localisation de l’hématopoïèse ______________________________________________________ 15
2. Compartiment de l’hématopoïèse ___________________________________________________ 16
3. Le microenvironnement, notion de niche hématopoïétique _______________________________ 17
4. Les facteurs de croissance hématopoïétiques et leurs récepteurs __________________________ 17
C. Généralités : Métabolisme oxydatif ___________________________________________ 19
1. Origines des ROS _________________________________________________________________ 19
2. Les espèces réactives de l’oxygène ___________________________________________________ 20
3. Le système antioxydant ____________________________________________________________ 20
4. Implication des ROS dans l’hématopoïèse _____________________________________________ 22
D. Généralités : Leucémie MyéloMonocytaire Chronique (LMMC) _____________________ 23
1. Définition _______________________________________________________________________ 23
2. Epidémiologie ____________________________________________________________________ 24
3. Présentation clinique ______________________________________________________________ 24
4. Éléments du diagnostic ____________________________________________________________ 25
5. Score pronostique ________________________________________________________________ 29
6. Diagnostic différentiel _____________________________________________________________ 32
7. Traitements _____________________________________________________________________ 34
E. Généralités : Anémie Réfractaire avec Excès de Blastes (AREB) _____________________ 34
1. Définition _______________________________________________________________________ 34
2. Epidémiologie ____________________________________________________________________ 35
3. Présentation clinique ______________________________________________________________ 35
4. Éléments du diagnostic ____________________________________________________________ 35
5. Score pronostique ________________________________________________________________ 38
6. Diagnostic différentiel _____________________________________________________________ 39
7. Traitements _____________________________________________________________________ 39
II. Moyens et méthodes _________________________________________________ 41
A. Echantillons ______________________________________________________________ 41
B. Réalisations des antioxydogrammes __________________________________________ 43
1. Décongélation ___________________________________________________________________ 43
2. Extraction des acides ribonucléiques (ARN) totaux ______________________________________ 43
3. Quantification et contrôle de la qualité des ARN ________________________________________ 43
4. Rétro-transcription des ARN ________________________________________________________ 44
5. PCR quantitative en temps réel ______________________________________________________ 44
C. Analyse statistique ________________________________________________________ 44
III. Résultats : __________________________________________________________ 45
A. Echantillons ______________________________________________________________ 45
B. Antioxydogramme, quantification relative _____________________________________ 45
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C. Analyse statistique ________________________________________________________ 45
IV. Discussion __________________________________________________________ 55
V. Bibliographie ________________________________________________________ 57
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Liste des figures
Tableau 1 : Classification LMMC selon l’OMS en 2016 ____________________________ 26
Tableau 2 : Récapitulatif score LMMC __________________________________________ 31
Tableau 3 : Syndrome myélodysplasique/néoplasie myéloproliférative selon la WHO 2016 :
Critères diagnostiques et anomalies cytogénétiques et moléculaires (9,15). _____________ 33
Tableau 4 : Classification des AREB selon le pourcentage de blaste. __________________ 36
Tableau 5 : Classification cytogénétique de l'IPSS-R _______________________________ 38
Tableau 6 : Caractéristiques des patients inclus. ___________________________________ 42
Tableau 7 : Caractéristiques des patients étudiés. __________________________________ 46
Tableau 8 : Classement des patients selon l'IPSS-R pour les AREB et le CPSS pour les
LMMC ___________________________________________________________________ 47
Tableau 9 : RQ LMMC vs moelle normale _______________________________________ 48
Tableau 10 : RQ AREB vs moelle normale ______________________________________ 49
Tableau 11 : Dispersion des ∆Ct pour les témoins sains vs patients LMMC _____________ 50
Tableau 12 : Dispersion des RQ en fonction du gène cible pour le groupe AREB vs LMMC 51
Figure 1 : Schéma représentant l'hématopoîèse ___________________________________ 18
Figure 2 : Expression relative des différents gènes pour les groupes LMMC et AREB. ____ 52
Figure 3 : Dispersion des différentes Quantifications Relatives avec une différence
statistiquement significative entre les groupes AREB et LMMC ______________________ 53
Figure 4 : Dispersion des différentes Quantifications Relatives avec une différence
statistiquement non-significative (0,05<p<0,1) entre les groupes AREB et LMMC _______ 54
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I. Introduction
A. Cadre de l’étude
Des travaux de 2011 menés par le Pr Hérault.O et le Dr Vignon.C (1) se sont attachés
à développer un outil, l’« antioxydogramme », dont l’objectif est de déterminer les niveaux
d’expressions relatifs des gènes antioxydants de moelles pathologiques comparativement à
des moelles normales.
Lors de ces résultats préliminaires il est suggéré sur un faible échantillon que les
antioxydogrammes d’anémie réfractaire avec excès de blastes (AREB) seraient très différents
de ceux des leucémies myélomonocytaires chroniques (LMMC).
Notre objectif pour ce travail de thèse est de vérifier cette hypothèse afin d’apporter un
nouvel élément discriminant pour le diagnostic différentiel entre AREB et LMMC.
B. L’hématopoïèse normale
L’hématopoïèse normale est l’ensemble des processus physiologiques qui aboutissent
au maintien constant et régulé des éléments figurés du sang à partir des cellules souches
hématopoïétiques jusqu’aux cellules spécialisées que représentent les globules rouges, les
polynucléaires neutrophiles ou encore les plaquettes.
1. Localisation de l’hématopoïèse
L’hématopoïèse primitive débute au 21ième jour de la vie embryonnaire et dérive du
mésoderme du sac vitellin, où se forment des îlots sanguins. Au sein des îlots sanguins les
cellules centrales se différencient en cellules érythroblastiques et les cellules de la périphérie
forment les premières cellules endothéliales. A partir de J28, des cellules souches
hématopoïétiques apparaissent dans la région Aorte-Gonades-Mésonéphros, qui iront ensuite
coloniser le foie, le thymus puis la rate et enfin la moelle osseuse. A la naissance la moelle
osseuse est déjà le site exclusif de l’hématopoïèse, jusqu’à l’âge de 4 ans elle persiste dans
tous les os pour finir par se localiser uniquement dans les os plats et courts chez l’adulte
(sternum, vertèbres, bassin, crâne).
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2. Compartiment de l’hématopoïèse
a) Les cellules souches hématopoïétiques
Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont des cellules souches qui sont
multipotentes, capables de donner naissance à toutes les cellules de l’hématopoïèse. Elles sont
capables d’auto-renouvellement, pour maintenir leur propre pool tout au long de la vie et sont
capables de restaurer une hématopoïèse complète après irradiation. Elles sont relativement
peu nombreuses et ne représenteraient que 0,01 à 0,05% des cellules médullaires. Les
techniques de cytométrie permettent de les identifier en fonction de l’expression ou non de
leurs antigènes. On distingue deux types de CSH :
les LT-CSH CD133+, CD34-, CD38-
les ST-CSH CD133+, CD34+, CD38-
Ce sont les LT-CSH qui donnent naissance au ST-CSH, elles sont en outre
CD90+(Thy1) et Lin-.
b) Les progéniteurs
Ils dérivent des CSH, ne sont pas identifiables au myélogramme et sont un
compartiment minoritaire dans la moelle osseuse. Ces cellules ont une moindre capacité
d’autorenouvellement, mais possèdent des capacités de prolifération importantes.
Les ST-CSH vont pouvoir se différencier en un progéniteur multipotent (MP) qui lui-même se
différenciera en progéniteur commun myéloïde (CMP ou CFU-GEMM) et progéniteur
commun lymphoïde (CLP).
Le progéniteur commun myéloïde donnera naissance au progéniteur commun granulocytaire
monocytaire (GMP) ou à un progéniteur commun mégacaryocytaire érythroblastique (MEP).
c) Les précurseurs
Ce sont les premiers éléments identifiables en microscopie optique après étalement de
moelle osseuse. Ils se différencient progressivement au fur et à mesure de leurs divisions pour
aboutir aux cellules spécialisées que sont les hématies, les polynucléaires neutrophiles,
éosinophiles et basophiles, les monocytes, les lymphocytes et les plaquettes.
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3. Le microenvironnement, notion de niche hématopoïétique
La niche hématopoïétique est constituée de l’ensemble des constituants de
l’environnement des CSH qu’ils soient de nature protéique ou cellulaire. La matrice
extracellulaire est composée de divers protéines fibreuses, protéoglycannes et glycoprotéines
qui sont synthétisés par les cellules stromales. Cette matrice a pour fonction l’adhésion des
cellules, la fixation et la présentation de cytokines. Les cellules stromales sont un ensemble
hétérogène regroupant les cellules mésenchymateuses, les ostéoclastes, les cellules
réticulaires, les fibroblastes, les cellules des sinusoïdes vasculaires, les adipocytes, les
macrophages ou encore les lymphocytes. La présence de ces cellules stromales est
indispensable à l’hématopoïèse. En effet, elles permettent par leur production de facteurs de
croissance hématopoïétiques et leur interaction cellulaire de maintenir les CSH quiescentes,
de les engager dans une lignée cellulaire, ou de favoriser la prolifération des progéniteurs ou
des précurseurs.
4. Les facteurs de croissance hématopoïétiques et leurs récepteurs
Les différents facteurs de croissance hématopoïétiques (FCH) sont produits par
différentes cellules d’origine médullaire ou non. Ainsi, on citera l’érythropoïétine
principalement synthétisée par les cellules péritubulaires du rein, la thrombopoïétine par le
foie, le GM-CSF, G-CSF, CSF-1 synthétisés par les fibroblastes, les cellules endothéliales et
les macrophages médullaires. Les FCH ont des actions qui peuvent être dirigés sur les
progéniteurs précoces en étant peu spécifique de lignée ou au contraire d’action plus restreinte
sur des lignées spécifiques. Les récepteur des FCH peuvent être de type tyrosine kinase ou
associé à des tyrosines kinases, et dont l’activation va aboutir à la transduction d’un signal qui
va activer des facteurs de transcription et ainsi induire l’expression de certains gènes. La
Figure 1 schématise la vision actuelle de l’hématopoïèse.
18
Figure 1 : Schéma représentant l'hématopoîèse
19
C. Généralités : Métabolisme oxydatif
Le métabolisme oxydatif résulte de la balance entre la production d’Espèces Réactives
de l’Oxygène (ROS) et les systèmes de lutte contre ces ROS de la cellule. Le stress oxydatif
est la résultante du dépassement des systèmes de protection de la cellule contre les ROS avec
des dommages possibles au niveau de l’ADN, des protéines et des lipides.
1. Origines des ROS
a) La mitochondrie
La majeure partie des ROS ont pour origine le métabolisme énergétique mitochondrial
ayant pour finalité la production d’adénosine triphosphate (ATP), source principale d’énergie
pour la cellule. Cette voie métabolique, la phosphorylation oxydative, se fait par les chaines
de transport d’électrons dans la membrane interne mitochondriale. La réduction tétravalente
de l’oxygène en eau se fait en plusieurs étapes successives et donne naissance à des
intermédiaires potentiellement réduits, les ROS (2).
b) La NADPH oxydase (NOX)
C’est un complexe enzymatique, situé à la membrane cytoplasmique et dans certain
granules des polynucléaires neutrophiles, qui catalyse la réduction de l’O2 en anions
superoxydes O2.-, en utilisant comme donneur d’électron le nicotinamide adénine dinucléotide
phosphate (NADPH pour la forme réduite et NADP pour sa forme oxydée). Il est
indispensable à la bactéricidie des cellules phagocytaires.
NADPH + 2O2 → NADP+ + H+ + 2 O2•-
c) Autres sources de ROS
Il existe d’autres sources de ROS dans l’organisme. On citera 2 enzymes du réticulum
endoplasmique la protéine disulfure isomérase (PDI) et ER oxidoréductase qui permettent la
production de pont disulfure comme modification post-traductionnel en produisant un
équivalent H2O2 (3,4).
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2. Les espèces réactives de l’oxygène
Le terme de ROS est retenu pour désigner les espèces chimiques oxygénées rendues
très réactives par la présence d’électrons de valence non appariés. Les principaux acteurs des
systèmes biologiques étant l’ion superoxyde O2•-, le peroxyde d’hydrogène H2O2, l’acide
hypochloreux HOCL, l’oxygène singulet 1O2, les peroxydes de lipides ROOH, l’ozone O3 et
le radical hydroxyle HO• (3).
3. Le système antioxydant
Les cellules possèdent un système antioxydant dont l’objectif est l’élimination des
ROS et la prévention des dommages cellulaires.
d) Super oxyde dismutase (SOD)
Ce sont des métalloprotéines qui font appel à un cofacteur métallique contenu dans
leur site actif. Elles peuvent utiliser dans leur site actif du Cuivre (Cu) et Zinc (Zn), du Fer
(Fe), du Manganèse (Mn) ou encore du Nickel (Ni) et catalyse la dismutation de l’anion
superoxyde O2•- en peroxyde d’hydrogène H2O2 de façon extrêmement rapide. Il en existe 3
types chez l’homme :
SOD1 : elle fait appel pour son site catalytique au couple Cu-Zn et se retrouve dans
l’espace intermembranaire des mitochondries et libre dans le cytosol des cellules.
SOD2 : elle fait appel au Mn et se retrouve dans la matrice mitochondriale ainsi qu’à
la paroi interne des mitochondries.
SOD3 : comme SOD1 elle utilise le couple Cu-Zn, mais est une protéine
extracellulaire capable de se lier à la membrane externe cellulaire ainsi qu’à la matrice extra
cellulaire et aurait donc un rôle de protection cellulaire du stress oxydatif exogène.
e) Catalase (Cat) humaine
La catalase est une enzyme héminique composée de quatre sous unités qui catalyse la
dismutation du péroxyde d’hydrogène H2O2 en eau H2O et en dioxygène O2. On la retrouve
essentiellement dans les péroxysomes et les érythrocytes.
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f) Glutathion Peroxydases(GPx)
Ce groupe d’enzyme est capable de détoxifier le peroxyde d’hydrogène ou des
hydropéroxydes d’origine lipidique en utilisant un substrat réducteur, le glutathion réduit.
g) Thiorédoxine (TXN)
C’est une protéine de 120 kDa possédant une activité oxydo-réductase dont le rôle est
le maintien des fonctions thiols libre des protéines selon la réaction :
Protéine-S2 + TXN-(SH)2 → Protéine-SH2 +TXN-S2
La thiorédoxine oxydée est-elle même réduite par la thiorédoxine reductase, une flavoenzyme
NADPH dépendante selon la réaction :
TXN-S2+NADPH+H+→ TXN-(SH)2+NADP+
Il existe plusieurs isoformes, la thiorédoxine-1 qui est cytosolique et la thiorédoxine-2 qui est
mitochondriale.
h) Glutarédoxine (GLRX)
Ce sont de petites protéines d’oxydo-réduction dont la fonction est semblable aux
thiorédoxines. Elles oscillent entre une forme réduite avec une fonction dithiol et une forme
oxydée avec un pont disulfure. A la différence du système thiorédoxine, il n’existe pas de
glutarédoxine réductase. La glutarédoxine oxydée est réduite de façon non enzymatique par le
glutathion.
i) Le glutathion
C’est un tripeptide (acide glutamique-cystéine-glycine) impliqué dans la prévention de
l’oxydation des fonctions thiols. Il sert de substrat notamment pour la glutathion peroxydase
et pour la régénération sous forme réduite de la glutarédoxine.
La régénération du glutathion sous sa forme réduite est assurée par la glutathion réductase
(GSR) selon l’équation : GSSG+NADPH+H+→GSH+NADP+
22
4. Implication des ROS dans l’hématopoïèse
Les ROS jouent le rôle de médiateur chimique dans l’hématopoïèse normale. La
NADPH oxydase (NOX) et la mitochondrie sont les contributeurs essentiels à la génération de
ROS des CSH (4). Les voies métaboliques régulant le niveau de ROS dans les CSH sont en
cours d’investigation. L’essentiel des travaux réalisés suggèrent que la voie PTEN/PI3K/Akt
via la famille de facteur de transcription forkhead box-O (FOXO) (5) joue un rôle crucial dans
le maintien du pool de CSH. FoxO protègerait les CSH quiescentes du stress oxydatif par
l’augmentation de l’expression des gènes antioxydants ou la dérégulation de la voie H2O2-
p38MAPK. Ainsi on observe de bas niveau de ROS intracellulaire dans les LT-HSC et
l’augmentation de ceux-ci poussent les cellules souches à sortir de leur état de quiescence et
réduisent leurs capacités d’auto-renouvellement (4). L’existence d’un gradient d’oxygène
pourrait être un facteur déterminant dans les rôles des différentes niches, ainsi la niche
ostéoblastique pauvre en oxygène favoriserait un état de quiescence des CSH, alors que la
niche vasculaire favoriserait la prolifération et la différentiation des CSH (4). De plus, un
faible niveau de ROS est une des caractéristiques majeures des CSH (6,7).
23
D. Généralités : Leucémie MyéloMonocytaire Chronique (LMMC)
1. Définition
La LMMC est une maladie hématologique rare du sujet âgé. Elle se caractérise par deux
versants, l’un myélodysplasique, l’autre myéloprolifératif ce qui lui vaut d’avoir été
reclassée dans les syndromes myéloprolifératif-myélodysplasique (MDS/MPN :
Myelodyplastic Syndrome/ Myeloproliferative Neoplasm) par l’Organisation Mondiale de
la Santé (OMS). Elle est définie pour l’OMS (8) en 2008 par :
1. Une monocytose persistante >1G/L dans le sang périphérique
2. L’absence du chromosome Philadelphie ou du transcrit de fusion BCR-
ABL1
3. L’absence de réarrangement des gènes PDGFRA et PDGFRB (qui
doivent être spécifiquement recherché en cas d’éosinophilie)
4. Moins de 20% de blastes dans le sang périphérique ou au
myélogramme (les promonocytes étant inclus dans ce décompte de
blaste)
5. Des signes de dysplasie impliquant au moins une lignée myéloïde. Si
les signes de dysplasie sont minimes ou absents, le diagnostic peut
toujours être porté si :
a. une anomalie clonale acquise est présente en cytogénétique
ou en biologie moléculaire ou
b. une monocytose >3 mois et
c. exclusion des autres causes de monocytose notamment une
pathologie maligne, infectieuse ou inflammatoire
Cette pathologie est subdivisée par l’OMS en 2008 en deux entités : la LMMC-1 et la
LMMC-2 en fonction du nombre de blastes présents dans la moelle et le sang périphérique.
Pour la LMMC-1, les blastes dans le sang périphérique (incluant les promonocytes)
représentent moins de 5% du décompte et moins de 10% dans la moelle. Pour la LMMC-2,
les blastes dans le sang périphérique (incluant les promonocytes) représentent 5 à 10% du
décompte et de 10 à 19% dans la moelle ou par la présence de corps d’Auer indépendamment
du décompte.
La classification de l’OMS a récemment évolué en 2016 (9) avec de nouveaux critères
diagnostiques pour la LMMC elle est désormais définie par :
1. Une monocytose persistante >1G/L dans le sang périphérique avec les
monocytes représentant ≥10% des leucocytes
24
2. Ne remplissant pas les critères de l’OMS pour une Leucémie Myéloïde
Chronique (LMC) BCR-ABL1 positive, une myélofibrose primitive,
une polyglobulie de vaquez ou une thrombocytémie essentielle
3. Pas d’argument pour un réarrangement de PDGFRA, PDGFRB,
FGFR1 ou PCM1-JAK2 (Ils doivent être spécifiquement recherchés en
cas d’éosinophilie)
4. <20% blastes dans le sang ou la moelle
5. Dysplasie présente sur une ou plusieurs lignées myéloïdes. Au cas où
la dysplasie serait absente ou minime il est toujours possible de porter
le diagnostic si :
a. Une anomalie clonale acquise est présente en cytogénétique ou
en biologie moléculaire ou
b. La monocytose persiste depuis plus de 3 mois et
c. Les autres causes de monocytoses sont exclues
On voit donc apparaitre dans cette nouvelle classification la notion de monocytose relative et
un renforcement du concept selon lequel une monocytose peut apparaitre secondairement lors
d’une néoplasie myéloproliférative sans remettre en question ce diagnostic. On voit aussi
apparaitre trois grades (Tableau 1) dans la LMMC comme le suggérait Padron et al (10) en
2015, qui viennent renforcer le rôle pronostic du pourcentage de blaste observé au niveau
médullaire et sanguin.
2. Epidémiologie
La prévalence et l’incidence de la LMMC restent méconnues. De larges études de
population estiment que la LMMC représente environ 10% des cas de syndrome
myélodysplasique (11–13). L’âge médian du diagnostic est entre 71 et 74 ans avec une
prédominance masculine (sexe ratio entre 1,5 et 3) (11,14,15). L’incidence serait de 4 pour
100 000 habitants par an (15)
3. Présentation clinique
La présentation la plus classique de la LMMC est le reflet des cytopénies sous-
jacentes. Les patients avec une forme plutôt myélodysplasique se présentent avec fatigue,
dyspnée due à l’anémie, susceptibilité aux infections (neutropénie), et rarement des
saignements (thrombopénie) (15,16). Les patients présentant une forme plutôt proliférative
affichent le plus souvent des symptômes en rapport avec un hypercatabolisme. On note une
perte de poids importante, des sueurs nocturnes profuses ou des douleurs du quadrant
supérieur gauche de l’abdomen en rapport avec une splénomégalie. Certains patients sont
diagnostiqués avant d’être symptomatiques, à l’occasion d’un hémogramme pratiqué pour une
25
toute autre raison. Occasionnellement, on observe des lésions de « leucémie » cutanée
(leucémide) qui peuvent précéder la LMMC (15,16). La LMMC peut être secondaire à une
chimiothérapie notamment après le traitement d’une tumeur solide. Enfin, la LMMC peut se
présenter d’emblée en phase blastique comme une leucémie aiguë myéloïde (15–17).
4. Éléments du diagnostic
a) Hémogramme, frottis sanguin
La numération formule sanguine (NFS) et le frottis sanguin, premiers examens
complémentaires disponibles et parfois découvrant fortuitement la maladie, permettent une
exploration quantitative et une appréciation qualitative des trois lignées cellulaires.
Leucocytes : Une leucocytose variable entre 3 et 100 G/L. Elle permet de distinguer deux
catégories héritées de la classification FAB de 1982 :
Une forme dysplasique avec moins de 13G/L
Une forme proliférative avec plus de 13G/L
Une monocytose, par définition >1G/L et qui représente plus de 10% des
leucocytes (9)
Une éventuelle blastose sanguine ; d’après l’OMS son décompte comprend les
promonocytes, les myéloblastes, les monoblastes et les blastes (8). Elle permet de
classer d’emblée les patients en LMMC-1 si ≥2% et en LMMC-2 si ≥5% et <20%
Une myélémie : classiquement inférieure à 10%
Neutrophiles : il peut exister une neutrophilie ou au contraire une neutropénie, on
appréciera les signes de dysplasie éventuellement présents sur cette lignée.
Hémoglobine : Une anémie est fréquente, classiquement normo ou macrocytaire,
arégénérative, de la même façon on notera la présence de signe évocateur d’une dysplasie
(anisocytose, poïkilocytose, ponctuation basophile, anneaux de cabot).
Plaquettes : Une thrombopénie est possible
b) Myélogramme
Le myélogramme est classiquement hypercellulaire, avec une hyperplasie granulo-
monocytaire. On notera les signes de dysplasie présents sur les différentes lignées (critère
diagnostic). Souvent on observe un excès de monocytes (5 à 20%) dont le décompte n’est pas
26
toujours aisé du fait de la dysplasie sur la lignée granuleuse (18). On ne décrit pas
d’hyperéosinophilie comme on peut en voir lors des leucémies myéloïdes chroniques.
Lorsqu’elle est présente on prendra soin de rechercher un réarrangement de PDGFRA,
PDGFRB, FGFR1 ou la présence du gène de fusion PCM1-JAK2 après avoir éliminé la
présence d’un transcrit BCR-ABL1. Le décompte des éventuels blastes sera soigneux en y
incluant blastes, myéloblastes, monoblastes, promonocytes (8,9).
Par définition on observera moins de 5% de blastes dans la LMMC-0, de 5 à <10% de blastes
dans la LMMC-1 et moins de 20% dans la LMMC-2 (8,9). Les éléments de la classification
sont rappelés dans le Tableau 1. Pour l’érythropoïèse, elle est souvent diminuée et peut être
accompagnée d’anomalies nucléaires, de sidéroblastes en couronnes ou de précurseurs
d’aspects mégaloblastiques. Les mégacaryocytes sont généralement petits et aux noyaux hypo
ou hyperlobés dans 80% des cas (18).
La cytochimie met en évidence la butyrate estérase qui est spécifique des monocytes et des
promonocytes.
LMMC-0 LMMC-1 LMMC-2
Sang <2% de blastes 2-4% de blastes 5-19% de blastes
Moelle Osseuse
<5% de blastes 5-9% de blastes 10-19% de blastes de
blastes ou présence de corps d'Auer
Tableau 1 : Classification LMMC selon l’OMS en 2016
c) Biopsie ostéo médullaire
Alors qu’elle est réalisée en première intention aux États-Unis, la biopsie ostéo-
médullaire ne sera réalisée qu’en seconde intention après la ponction médullaire. Plus
performante que le myélogramme pour caractériser le versant hyperplasique de la moelle, elle
peut mettre en évidence une fibrose réticulinique discrète ou modérée dans 30% des cas. Des
nodules composés de cellules matures plasmocytoïdes dendritiques sont mis en évidence dans
20% des cas. Bien que fréquents ces nodules ne sont pas spécifiques de la LMMC.
27
d) Cytométrie en flux
L’immunophénotype normal des monocytes est CD4+, CD13+, CD14+, CD15+,
CD33+, CD36+, CD45+, CD64+ et HLA-DR+, CD2-, CD7- et CD56-. L’expression du
CD11b et de CD14 est variable mais globalement positive et intense. De même l’expression
de CD16 est variable mais globalement négative. Ce phénotypage peut être utile dans le
diagnostic de LMMC où la microscopie optique peut-être prise en défaut pour la
reconnaissance des monocytes, des promonocytes, et des monoblastes. De plus elle peut
mettre en évidence l’expression de marqueurs aberrants qui permet de suspecter une
monocytose d’une LMMC plutôt que d’une monocytose réactionnelle. Ainsi la présence de
plus de 2 antigènes aberrants associée à plus de 20% d’expression modérée de CD14
(habituellement fortement exprimé) aurait une spécificité de 100% et une sensibilité de 67%
(19). Plus récemment Selimoglu-Buet et al. ont démontré l’augmentation de la fraction des
monocytes dit classique CD14+/ CD16- vis-à-vis des fractions intermédiaires CD14+/CD16+
et non-classique CD14+low / CD16+. Cette distinction entre monocytes classiques,
intermédiaires et non-classiques a été approuvée par le comité de nomenclature de l’union
internationale des sociétés d’immunologie, et repose sur des profils d’expression génique
différents. La fraction dite classique représente 85% des monocytes chez un individu sain.
L’équipe de Selimoglu-Buet a démontré sur une cohorte d’essai puis une cohorte de
validation que l’augmentation de la fraction classique au-delà de 94% était un argument en
faveur d’une LMMC pour les patients présentant une monocytose depuis plus de 3 mois avec
une spécificité de 94,1% et une spécificité de 91,9% (15,20), et était indépendant du statut
mutationnel de ces LMMC. Cet immunophénotypage devient donc un outil intéressant dans la
démarche diagnostique des monocytoses chroniques du fait de sa rapidité de mise en place, du
type de prélèvement (ponction sanguine) et de son coût modéré. Il est à noter que les patients
qui répondent aux traitements hypométhylant normalisent leur fraction de monocyte classique
et donc que cet outil pourrait permettre le suivi des patients LMMC.
e) Cytogénétique
Les anomalies cytogénétiques sont fréquentes dans la LMMC. Entre 20 et 40% des
patients présentent une anomalie cytogénétique clonale (16,21). Les anomalies les plus
fréquentes sont la trisomie 8, la monosomie 7, les délétions (7q) et les anomalies du 12p.
Ainsi dans le score pronostic de 2011 de Such et al (21) on retrouve trois groupes
cytogénétiques aux pronostics différents. Un groupe de haut risque pour la trisomie 8, les
anomalies du 7 ou les caryotypes complexes. Un groupe de faible risque pour les caryotypes
normaux ou avec perte isolée du Y. Un groupe de risque intermédiaire pour toutes les autres
anomalies cytogénétiques. La survie à 5 ans dans les groupes cytogénétiques de haut,
intermédiaire et bas risque étaient respectivement de 4%, 26% et 35% p<0.001
28
f) Biologie moléculaire
Le séquençage de nouvelle génération a permis de mettre en évidence des anomalies
génétiques dans près de 90% des LMMC(15,16,22–24). On retrouve par ordre de fréquence
TET2 (≈ 60%), SRSF2 (≈ 50%), ASXL1 (≈ 50%), RAS (≈ 30%). ASXL1 étant la seule mutation
associé à un pronostic péjoratif pour les mutations non-sens et les mutation introduisant un
décalage du cadre de lecture.(15,24) Elles peuvent être schématiquement regroupées en cinq
groupes fonctionnels :
1. Gènes de régulation épigénétique : EZH2, ASXL1, TET2, DNMT3A, IDH1 et IDH2
2. Gènes impliqués dans la voie du splicéosome : SF3B1, SRSF2, U2AF1 (U2AF35),
ZRSR2, SF3A1, PRPF40B, U2AF2 (U2AF65) et SF1
3. Gène impliqué dans la réparation de l’ADN comme TP53
4. Gènes de récepteurs à activité tyrosine kinase et gènes de facteurs transcriptionnels :
JAK2, KRAS, NRAS, CBL, FLT3 et RUNX1
5. Mutation impliquant le complexe cohésine : STAG2, BCOR, SMC3, SMC1A ou
RAD21
Comme l’a démontré Itzykson l’acquisition de ces mutations est un phénomène
complexe et dynamique. L’accumulation des mutations est péjorative pour le pronostic (25),
on retrouve souvent une mutation de TET2 dans les cellules les plus immatures du
compartiment médullaire avec différents sous clones qui arborent de plus en plus de mutations
et qui peuvent leur conférer des avantages sélectifs leur permettant de devenir le clone
dominant. Ainsi il est possible de voir plusieurs clones présentant des mutations différentes.
Ces différents clones vont subir les différentes pressions de sélections notamment celles
imposées par les différentes chimiothérapies proposées, ainsi les clones dominants peuvent
varier chez un même patient au cours du temps.
Mutations impliquant des gènes de régulation épigénétiques impactant la méthylation et
l’hydroxyméthylation de l’ADN (TET2, DNMT3A, IDH1 et IDH2) :
TET2 (ten-eleven translocation (TET) en 4q24) appartient à la famille de protéine TET
(TET1-TET3). Les mutations de TET2 se retrouvent dans les néoplasies myéloïdes (≈15%) à
des fréquences diverses. Ainsi on citera dans la LMMC environ 60%, 15% dans les
Syndromes Myélodysplasique (SMD), 15% dans la polyglobulie de Vaquez et dans la
myélofibrose primitive, 20% dans les leucémies aigues myéloïdes secondaires et dont la
signification pronostic reste limitée (24). TET2 a une activité enzymatique dioxygénase et
catalyse la conversion de la 5-méthylcytosine (5-mC) en 5-hydroxyméthylcytosine (5-hmC).
La 5-hmC est une nouvelle base dans l’ADN génomique et pourrait être impliquée dans la
transcription ou être un processus intermédiaire dans la déméthylation de l’ADN. La 5-hmC
est préférentiellement retrouvée aux sites d’initiation de la transcription et dans le corps des
gènes (dans les exons particulièrement). Il a été montré que la mutation de TET2 impactait le
degré de méthylation de l’ADN dans son ensemble. De façon surprenante on ne retrouve pas
d’impact sur la survie ou sur le risque de transformation en leucémie aigüe du caractère muté
ou non de TET2 dans la LMMC. Au contraire la présence de la mutation de TET2 en
29
l’absence de mutation d’ASXL1 aurait un impact positif sur la survie (26) sans que l’on ne
comprenne le mécanisme sous-jacent à cette association.
Les mutations impliquants IDH1 (Isocitrate Déshydrogénase 1, localisé en 2q34) et
IDH2 (Isocitrate Déshydrogénase 2, localisé en 15q26.1) sont inhabituelles dans la LMMC
(<5%) et mutuellement exclusives avec la mutation de TET2. IDH1 et 2 participent au cycle
de Krebs en convertissant l’isocitrate en 5-alpha-cétoglutarate. La mutation confère à ces
enzymes une nouvelle fonction qui aboutit à la production du 2-hydroxyglutarate, un onco-
métabolite qui diminue l’activité de TET2.
ASXL1 (additional sex combs-like , localisé en 20q11) régule la chromatine en interagissant
avec les complexes PRC1 et PRC2 (polycomb group repressive complex). Le PRC2 contient
la H3K27 (histone 3 lysine 27) méthyltransférase, EZH2 (enhancer of zeste homolog 2) et son
partenaire EED (embryonic ectoderm development) et SUZ12 (suppressor of zeste 12
homolog), et produisent la marque H3K27 triméthyl (me3) qui est étroitement lié à
l’inactivation de promoteurs de gènes. Les mutations d’ASXL1 aboutissent à la suppression de
la triméthylation de H3K27 par le complexe PRC2 (27). De plus il a été démontré que les
mutations aboutissant à une troncation d’ASXL1 confèrent une augmentation de l’activité du
complexe ASXL1-BAP1 (BRCA-associated protein 1) (28) qui causent une diminution de
H2AK119Ub et une diminution de H3K27me3 perturbant la régulation de nombreux gènes.
La mutation d’ASXL1 (de type non-sens ou décalage du cadre de lecture) est la seule à avoir
démontré un rôle pronostic délétère indépendant des autres facteurs pronostics (23,29).
5. Score pronostique
Il existe de nombreux scores pronostiques dans la LMMC. Cependant aucun n’est
consensuel.
Un score, l’International Prognostic Scoring System (IPSS) développé en 1997, par
Greenberg (30), s’est intéressé aux LMMC dans leurs formes myélodysplasiques. Les formes
myéloprolifératives avaient été exclues de l’analyse. Les principaux éléments de ce score
sont :
Pourcentage de blastes médullaires
Nombre de cytopénie périphérique
Groupe de risque cytogénétique divisé en 4 classes
Ce score est simple à utiliser mais ne s’intéresse pas aux formes myéloprolifératives
30
Le score MDAPS (Myelodysplastic Anderson Pronostic Scoring) (13) identifie 4 facteurs de
mauvais pronostic indépendants :
Hémoglobine <120g/L
Présence de cellules immatures d’origine myéloïde circulantes
Lymphocytes circulants >2,5G/L
Plus de 10% de blastes à la ponction médullaire
Il permet de classer les LMMC en 4 groupes de survie.
Plus récemment le Spanish cytogenetic risk stratification system (21) s’intéresse à l’impact
pronostique des anomalies cytogénétiques dans le cadre de la LMMC. On y retrouve 3
groupes. Pour le groupe de faible risque on retrouvera le caryotype normal et la perte isolée
du Y. Le groupe de haut risque comprend les anomalies du 7, la trisomie 8 et les caryotypes
complexes, et enfin le groupe intermédiaire comprend toutes les autres anomalies.
En 2013, le CMML-specific prognostic scoring system (CPSS)(31) a été développé. Il
subdivise les patients en 4 sous-groupes de pronostic différent. Les éléments de ce score sont
le type de LMMC selon l’OMS, le type de LMMC selon la FAB, le groupe cytogénétique
comme défini par Such et al (21) et la dépendance transfusionnelle définie par au moins une
transfusion toute les 8 semaines sur une période de 4 mois. Les groupes de faible,
intermédiaire-1, intermédiaire-2 et haut risque ont des médianes de survie respectivement de
72, 31, 13 et 5 mois.
Différents scores ont tenté d’intégrer les anomalies génétiques dans leurs scores notamment le
score de Mayo en 2013 (32) et le score de Itzykson et al (23), qui incluaient tout deux les
mutations d’ASXL1 dans leurs scores pronostiques. Itzykson soulève le possible impact dans
une moindre mesure d’autres anomalies génétiques comme les mutations de SRSF2, RUNX1,
CBL, NRAS ou IDH2. Dans le Tableau 2 sont repris les différents scores et leurs principales
caractéristiques.
Il existe donc de nombreux scores pronostiques et pour le moment aucun n’est consensuel. On
notera cependant que les trois derniers scores ayant été établis sont validés et facilement
utilisables en pratique.
31
Tableau 2 : Récapitulatif score LMMC
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6. Diagnostic différentiel
C’est avant tout le diagnostic différentiel d’une monocytose (15,16). De fait une
monocytose sanguine peut-être réactionnelle ou clonale. Les monocytoses réactionnelles sont
de loin les plus fréquentes et sont assez banales. On évoquera :
Une infection bactérienne ou parasitaire (tuberculose, brucellose, endocardite
subaigue, leishmaniose…)
Une infection virale (mononucléose, CMV, VIH…)
Une pathologie inflammatoire chronique comme les entéropathies inflammatoires
chroniques, les maladies auto-immunes, la sarcoïdose
Une maladie de surcharge lipidique (Maladie de gaucher)
Une récupération hématologique post-aplasie
Les monocytoses clonales sont quant à elles plus rares, de pronostic beaucoup plus sombre et
témoignent d’une hémopathie maligne. Il convient ainsi de les identifier le plus tôt possible.
On se devra d’éliminer :
Un syndrome myéloprolifératif tel qu’une LMC, une myélofibrose primitive ou
splénomégalie myéloïde, un syndrome myéloprolifératif atypique ou inclassable.
Un syndrome myélodysplasique/myéloprolifératif dont fait partie la LMMC comme la
LMC atypique BCR-ABL1 négative, la LMMC juvénile ou un SMP/SMD inclassable
Une néoplasie myéloïde ou lymphoïde avec réarrangement de PDGFRA, PDGFRB,
FGFR1 ou un réarrangement de PCM1-JAK2
Une leucémie aigüe avec différenciation monocytaire
Un syndrome myélodysplasique de type AREB qui peut du fait de son versant
dysplasique mener à une fausse reconnaissance de monocytes. En effet la
dysgranulopoïèse peut se manifester sous la forme de myélocytes et métamyélocytes
dégranulés qui peuvent être identifiés comme des monocytes. Ceci n’est pas la règle,
puisque habituellement il se présente en premier lieu avec son versant cytopénique,
cependant une dysgranulopoïèse marquée sans neutropénie associé peut facilement
donné un frottis sanguin tout à fait semblable à celui d’une LMMC
Dans le Tableau 3 sont énumérées et caractérisées les différentes pathologies classées par
l’OMS en syndrome myélodysplasique/néoplasie myéloproliférative.
33
Tableau 3 : Syndrome myélodysplasique/néoplasie myéloproliférative selon la WHO 2016 : Critères diagnostiques et anomalies cytogénétiques et moléculaires (9,15).
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34
7. Traitements
L’approche est la plupart du temps symptomatique, transfusionnelle et palliative. En
effet il n’existe à ce jour pas de traitement avec indication formelle et pas de critère de
réponse clairement identifié. La conduite thérapeutique s’inspire ainsi de ce qui se fait dans
les SMD et les SMP (15). Quelques rares patients de moins de 70 ans, sans comorbidité
prohibitive et ayant un donneur HLA-compatible, peuvent bénéficier de la seule approche
potentiellement curative qu’est l’allogreffe de cellules souches sanguines périphériques avec
conditionnement atténué. Malheureusement, même après allogreffe, les récidives suggèrent la
présence de clones agressifs échappant à l’effet immunologique du greffon.
Les agents médicamenteux utilisables sont peu nombreux et ne sont pas spécifiques de la
pathologie. Pour lutter contre le versant myéloprolifératif on utilisera des traitements
cytoréducteurs tel que l’hydroxyurée, l’étoposide, le topotécan ou encore la cytarabine à
faible dose (15).
On aura recours à des traitements symptomatiques tels que l’EPO pour limiter la profondeur
d’une éventuelle anémie.
Récemment de nouveaux agents hypométhylants sont disponibles et permettent une action sur
le versant dysplasique de la pathologie (15). On y retrouve notamment la 5-azacitidine ou la
décitabine.
On soulignera l’importance de développer de nouveaux critères de réponse spécifique de la
pathologie et de développer les thérapeutiques spécifiques qui s’appuient sur les nouvelles
cibles moléculaires identifiées.
E. Généralités : Anémie Réfractaire avec Excès de Blastes (AREB)
1. Définition
L’anémie réfractaire avec excès de blaste est une pathologie fréquente du sujet âgé.
Elle appartient aux SMD qui ont pour dénominateur commun une atteinte clonale et acquise
de la cellule souche hématopoïétique avec anomalie de maturation (dysmyélopoïèse) et un
excès d’apoptose des précurseurs hématopoïétiques aboutissant à une ou plusieurs cytopénies
périphériques.
Les AREB se définissent par un syndrome myélodysplasique avec 5 à 19% de myéloblastes
au myélogramme et 2 à 19% de blastes circulant à la numération formule sanguine. Du fait de
risques évolutifs différents, notamment sur le risque de transformation en Leucémie Aigüe
Myéloïde (LAM), on distingue les AREB 1 et les AREB 2.
35
Les AREB 1 présentent 5 à 9% de myéloblastes au myélogramme et/ou 2 à 4% de blastes à la
numération formule sanguine et l’on ne rencontre pas de blaste avec des corps d’Auer.
Les AREB 2 présentent 10 à 19% de myéloblastes au myélogramme et/ou 5 à 19% de blastes
à la numération formule sanguine et/ou présentent des blastes avec des corps d’Auer (8,9).
2. Epidémiologie
Pathologie du sujet âgé, elle affecte essentiellement l’adulte après 50 ans et représente
40% des SMD.
3. Présentation clinique
Habituellement c’est une pathologie qui évolue à bas bruit, et les symptômes présentés
sont en rapport avec les différentes cytopénies périphériques. On retrouvera donc fatigue,
dyspnée due à l’anémie, susceptibilité aux infections (neutropénie), et exceptionnellement des
saignements (thrombopénie).
4. Éléments du diagnostic
a) Hémogramme, frottis sanguin
Premiers examens complémentaires disponibles et parfois découvrant fortuitement la
maladie, ils permettent une exploration quantitative et une appréciation qualitative des trois
lignées cellulaires.
Hémoglobine : Une anémie est fréquente, classiquement normo ou macrocytaire,
arégénérative, de la même façon on notera la présence de signes évocateurs d’une dysplasie
(anisocytose, poïkilocytose, ponctuations basophiles, anneaux de Cabot)
Leucocytes :
Une blastose sanguine : par définition inférieure à 20% (LAM), parfois présentant
des corps d’Auer (AREB 2)
Neutrophiles : une neutropénie est fréquente, on appréciera les signes de dysplasie
éventuellement présents sur cette lignée, notamment granularité anormale (hyper
ou hypo), hyper ou hyposegmentation nucléaire.
36
Myélémie : elle est rare et doit avant tout faire vérifier le décompte de monocytes
pour ne pas ignorer une LMMC
Monocytes : ils sont par définition <1G/L (LMMC), cependant leur distinction des
myélocytes et métamyélocytes dysplasique peut-être difficile
Plaquettes : Thrombopénie fréquente. Plaquettes géantes, macroplaquettes, ou plaquettes
hypogranulaires sont les anomalies morphologiques les plus fréquemment rencontrées.
b) Myélogramme
Classiquement hypercellulaire, le degré de dysplasie est variable. L’érythropoïèse peut
être augmentée avec une morphologie macrocytaire/mégaloblastique. Les érythroblastes
peuvent présenter des signes de dysérythropoïèses tels que les anomalies de lobulation
nucléaire ou les ponts internucléaires.
La granulopoïèse est fréquemment augmentée et présente là aussi des signes de
dysgranulopoïèse à des degrés variables. Principalement on retrouvera des polynucléaires de
petites tailles avec des noyaux hypolobés (pseudo Pelger-Huet) ou encore une
hypersegmentation nucléaire, un cytoplasme hypogranuleux et/ou des granules pseudo
Chediak-Higashi. La dysgranulopoïèse, lorsqu’elle est très marquée, peut rendre
l’identification des différents éléments compliqués, avec notamment une distinction difficile
entre monocytes, métamyélocytes et myélocytes.
La mégacaryopoïèse est quantitativement variable, plus souvent à la hausse que diminuée.
Elle a souvent tendance à se faire en bloc. La dysmégacaryopoïèse est quasi systématique
avec des mégacaryocytes de petite taille allant jusqu’aux micromégacaryocytes. Cependant on
peut observer des mégacaryocytes de toutes tailles, de même que des mégacaryocytes avec
noyaux séparés.
La classification en AREB 1 ou AREB 2 se fait sur la proportion de blaste sanguin ou
médullaire ainsi que sur la présence de blaste avec corps d’auer, rappelé dans le tableau 4
Tableau 4 : Classification des AREB selon le pourcentage de blaste.
37
c) Biopsie ostéo médullaire
Non systématique, cet examen permet d’apprécier la structure de la moelle et reste
plus performant que le myélogramme pour l’évaluation quantitative du compartiment
médullaire. Fréquemment on assistera à une délocalisation de l’érythropoïèse et de la
mégacaryopoïèse vers les espaces paratrabéculaires qui sont habituellement orientés vers la
granulopoïèse. Dans une minorité de cas on observe une moelle normo- ou hypocellulaire.
Les AREB hypocellulaires représentent une proportion minime des cas du fait que ces formes
ne présentent que rarement une augmentation des blastes et dès lors doivent être classées en
Cytopénie Réfractaire avec Dysplasie Uniligné ou Cytopénie Réfractaire avec Dysplasie
Multiligné selon les cas. Cet examen est particulièrement utile dans les formes hypoplasiques
ou lorsque l’aspiration médullaire pour la réalisation du myélogramme n’est pas optimale, à
plus forte raison que les blastes des AREB ont tendances à se répartir par bloc au sein de la
moelle. Ils se localisent à distance de l’os trabéculaire et des espaces périvasculaires ce qui est
histologiquement une Localisation Anormale des Précurseurs Immatures (LAPI).
L’immunohistochimie marquant le CD34 peut être d’une aide précieuse dans la mise en
évidence de ces LAPI.
d) Cytométrie en flux
L’immunophénotypage objective souvent une augmentation des cellules CD34+ et/ou
CD117+. Ces cellules sont habituellement positives pour le CD38, HLA-DR et aux marqueurs
associés aux cellules myéloïdes CD13 et/ou le CD33. Une expression asynchrone des
marqueurs de maturation granulocytaires CD15, CD11b et/ou CD65 peut-être présente dans la
population blastique. L’expression aberrante du CD7 sur les cellules blastiques est vue dans
20% des cas et dans 10% des cas pour le CD56 alors que l’expression d’autres marqueurs
lymphoïdes est rare.
e) Cytogénétique
30 à 50% des AREB présentent des anomalies cytogénétiques clonales telles que la
trisomie 8, la monosomie 5, 7 ou la délétion 5q, 7q ou 20q. On peut aussi observer des
caryotypes complexes. Dans le Tableau 5 les implications pronostiques des principales
anomalies cytogénétiques de l’IPSS-R sont reprises.
38
Tableau 5 : Classification cytogénétique de l'IPSS-R
f) Biologie moléculaire
Elle n’est pas recommandée pour le diagnostic d’AREB. Comme pour les autres
néoplasies myéloïdes de nombreuses données sont disponibles concernant les mutations
récurrentes dans les syndromes myélodysplasiques. Le séquençage ciblé d’un nombre limité
de gènes retrouve que 80 à 90% des SMD ont une mutation. Les gènes les plus fréquemment
mutés sont SF3B1, TET2, ASXL1, DNMT3A, RUNX1, U2AF1, TP53, EZH2. Cependant ces
même mutations peuvent être retrouvé comme mutation clonal acquise chez des individus
âgés par ailleurs sains que l’on dénommé CHIP pour Clonal hematopoiesis of indeterminate
potential. Ces patients peuvent développer un SMD secondairement et le management de ces
patients est mal codifié et incomplètement compris. Les mutation de TP53 sont associées à
une évolution agressive dans les SMD et sont prédictif d’une mauvaise réponse au traitement
par lenalidomide pour les patients avec un syndrome del (5q)
5. Score pronostique
De nombreux scores pronostiques ont été développés pour la classification des
myélodysplasies.
Comme pour la LMMC on retrouve l’IPSS de 1997 (30).
Le World Health Organization classification-based prognostic scoring system (WPSS) (33),
qui revient sur les descriptions morphologiques de la WHO, le caryotype et la dépendance
transfusionnelle pour la construction de son score. Il sépare les patients en 5 groupes de
risque : très faible, faible, intermédiaire, haut et très haut risque avec une médiane de survie
respectivement de 141, 66, 48, 26 et 9 mois.
39
L’IPSS-R (34) de 2012, qui introduit une discrimination plus fine dans la blastose médullaire, ainsi que dans la pondération des cytopénies, avec une nouvelle classification cytogénétique pour aboutir à cinq groupes de prognostic distincts. Un groupe de très faible, faible, intermédiaire, haut et très haut risque qui ont une médiane de survie respectivement de 8,8, 5,3, 3, 1,6 et 0,8 mois.
6. Diagnostic différentiel
Dans le cas d’une ou plusieurs cytopénies avec blastose sanguine se posera la question
d’un SMD, d’une LAM ou LAL. Dans le cas de cytopénie sans blastose sanguine en fonction
du caractère macrocytaire, normocytaire ou microcytaire on se devra d’éliminer de grandes
étiologies.
Dans le cas des anémies macrocytaires on éliminera en premier lieu une carence vitaminique
en B12 ou en B9, une hémolyse ou encore une insuffisance thyroïdienne. Lorsque l’anémie
est normocytaire, on exclura une insuffisance rénale, une anémie hémolytique, une anémie
inflammatoire.
La distinction entre une AREB 2 et une LMMC 2 peut être excessivement difficile en
microscopie optique du fait de l’importance de la dysplasie, et que leur distinction repose sur
le décompte des monocytes à la NFS et frottis sanguin,
Le myélogramme permettra le plus souvent d’orienter rapidement le diagnostic.
7. Traitements
Le seul traitement curatif des AREB est toujours l’allogreffe, généralement réservée
aux SMD de haut risque et sera discuté en fonction de l’âge du patient, de l’existence d’un
donneur compatible. Quelques questions demeurent, notamment sur le conditionnement de
l’allogreffe, les traitements pré-greffes (azacitidine, chimiothérapie intensive) ou encore le
moment où réaliser la greffe. (35)
A ce jour seul deux médicaments disposent d’une AMM dans les SMD. L’azacitidine, un
agent hypométhylant, est indiqué dans les SMD de risque IPSS intermédiaire-2 ou élevé. Le
lénalidomide, aux propriétées antinéoplasiques, antiangiogéniques, proérythropoïétiques et
immunomodulatrices, qui est indiqué dans les SMD de risque IPSS faible ou intermédiaires-1
avec délétion chromosomique 5q isolée.
Les autres traitements disponibles sont des traitements symptomatiques qui comprennent les
différentes transfusions pour lutter contre les cytopénies, l’érythropoïétine et la darbépoïétine
alpha dans le cadre de l’anémie, les traitements anti-infectieux dans le cadre des neutropénies
compliqué d’infection, les traitements chélateurs du fer dans le cadre des transfusions
érythrocytaires itératives.
40
Les indications de chimiothérapies intensives sont devenues, de plus en plus rare (sujet jeune
sans caryotype défavorable, notamment avant une allogreffe).
41
II. Moyens et méthodes
A. Echantillons
Pour notre projet nous avons inclus les patients du CHU de Tours dont le diagnostic
retenu était une AREB ou une LMMC et pour qui du matériel congelé au diagnostic était
disponible pour une activité de recherche. Le matériel était donc de la moelle obtenue par
ponction médullaire prélevée sur Éthylène Diamine Tétra-Acétique (EDTA) ou héparinate de
sodium puis congelé en DMSO aliquoté.
Ces échantillons ont été comparés à des prélèvements médullaires issus d’une population de 5
patients de chirurgie orthopédique indemne de pathologie hématologique. Ces échantillons
servent de référence pour l’expression des différents gènes dans une situation normale.
Les critères d’inclusion pour les prélèvements de l’étude sont :
Prélèvement de moelle réalisé sur EDTA ou héparinate de sodium et dont un aliquot
est disponible pour l’activité de recherche.
Patient ayant signé un consentement éclairé.
Patient ayant pour diagnostic retenu une AREB ou une LMMC et dont le prélèvement
est effectué avant intervention thérapeutique.
Les patients inclus sont présentés dans le Tableau 6.
42
Diagnostic
Age
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43
B. Réalisations des antioxydogrammes
Nous avons utilisé la méthode mise au point par le Pr. Hérault et le Dr.Vignon pour le
brevet « Herault O, Vignon C. (2012) «Method for diagnosing hematological disorders»
Brevet WO2012085188 A1 du 28 juin 2012 (caractérisation à visée diagnostique de
l’expression des gènes antioxydants, signature antioxydante dans les hémopathies ou
«antioxydogramme») » (36). Elle consiste en une RTqPCR dont l’objectif est d’apprécier en
quantification relative l’ARNm de 23 gènes antioxydants
1. Décongélation
Après avoir sélectionné les échantillons selon les critères énumérés au-dessus, les
aliquots de moelles congelés en DMSO ont été décongelés de façon rapide en bain marie à
37°C et lavés 3 fois au tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) selon un cycle lavage,
centrifugation lente (700g, 10 minutes).
2. Extraction des acides ribonucléiques (ARN) totaux
Le culot cellulaire de 5.106 cellules pour chaque échantillon a été mis en PBS 1X puis
dans 1mL de Trizol. Après ajout de chloroforme et agitation, les échantillons ont été
centrifugés (12000 g, 15 min, 4°C). La phase aqueuse contenant les ARN a été récupérée puis
une deuxième extraction au chloroforme a été réalisée. La précipitation de l’ARN est
provoquée en ajoutant de l’isopropanol. Après une centrifugation (12000 g, 10 min, 4°C), le
culot d’ARN a été lavé deux fois à l’éthanol 75%. Le culot d’ARN a été asséché et remis en
suspension dans 40 μL d’eau traitée par diethylpyrocarbonate (DEPC), puis congelé à –20°C
au moins une heure.
3. Quantification et contrôle de la qualité des ARN
Les ARN obtenus ont été quantifiés à l’aide du spectrophotomètre UV Nanodrop®
ND-1000 (Labtech, Paris, France). La pureté de l’échantillon d’ARN a été vérifié selon les
rapports suivants : le ratio DO260/DO280 évalue la présence de protéine (absence si entre 1,8
et 2,1), le ratio DO260/DO230 évalue la pureté de l’ARN.
La qualité de l’ARN a été vérifiée par électrophorèse capillaire sur Bioanalyzer Agilent
2100® (Agilent Technologies, Massy, France) puis en établissant le RNA Integrity Number
(RIN), prenant en compte le rapport des ARN 16S , 18S et l’ARN dégradé.
44
4. Rétro-transcription des ARN
La rétrotranscription a été effectuée avec le kit Superscript VILO™ cDNA Synthesis
(Invitrogen, Carlsbad, Californie, USA) selon les recommandations du fournisseur. La
réaction comprenait l’échantillon d’ARN, la transcriptase inverse, un inhibiteur de RNase, du
MgCl2, des amorces et des dNTP. Le mélange a été incubé à 42°C pendant 1 h, puis à 85°C
pendant 5 min pour être conservé à -20°C.
5. PCR quantitative en temps réel
La PCR quantitative a été réalisée avec un couple d’amorces (primers) spécifique de
l’ADNc à amplifier et une sonde Universal Probe Library® (UPL, Roche, Penzberg,
Allemagne) pour suivre en temps réel la réaction de PCR. La validité des couples
amorce/sonde a été vérifiée avec une efficacité proche de 2. L’expression de 28 gènes
d’intérêts ainsi que l’expression d’un gène domestique, la Glycéraldéhyde 3-phosphate
déshydrogénase (GAPDH), a été explorée en triplicate pour chaque échantillon. La
quantification a été exprimée en utilisant les Ct (Cycle thresold) et en calculant les ΔCt=Ctgène
d’intérêt-Ctgène domestique. La quantification relative pouvant être exprimée dans un système parfait,
avec une efficacité à 2, par la formule :
RQ=2-ΔΔCt où ΔΔCt=ΔCtpath-ΔCtréférence
C. Analyse statistique
Nous avons dans un premier temps comparé les antioxydogrammes du groupe LMMC
aux témoins sains avec un test de Mann-Whitney pour chaque gène cible. Nous avons étudié
la dispersion des différents ΔCt des gènes cibles par le calcul de la valeur médiane, du
premier et troisième quartile.
Afin de comparer le groupe AREB et LMMC nous avons exprimé les résultats en
quantification relative par rapport aux moelles de sujet sain en prenant comme gène
domestique la GAPDH. Puis nous avons effectué un test de Mann-Whitney sur chaque gène
cible. Nous avons évalué la dispersion des différentes quantifications relatives par le calcul de
la valeur médiane, du premier et troisième quartile pour chaque gène étudié, que nous avons
représenté sous forme de boîtes à moustaches.
45
III. Résultats :
A. Echantillons
Durant notre période de recrutement nous avons obtenu 9 échantillons pour le groupe
AREB et 9 échantillons pour le groupe LMMC. Les caractéristiques de ces populations sont
rappelées dans le Tableau 7 et le Tableau 8.
B. Antioxydogramme, quantification relative
Les résultats des témoins sont repris du brevet « Herault O, Vignon C. (2012)
«Method for diagnosing hematological disorders» Brevet WO2012085188 A1 du 28 juin
2012 (caractérisation à visée diagnostique de l’expression des gènes antioxydants, signature
antioxydante dans les hémopathies ou «antioxydogramme») » (36)
Les résultats sont exprimés en quantification relative selon la méthode RQ=2-ΔΔCt où
ΔΔCt=ΔCtpath-ΔCtréférence. On exprime donc la quantification relative de chaque gène par
rapport à des moelles normales. Les résultats des différents patients sont repris dans le
Tableau 9 et le Tableau 10.
C. Analyse statistique
Dans le Tableau 11 sont reprises les informations de dispersion des ∆Ct entre le
groupe de témoin et le groupe LMMC ainsi que le résultat du test de Mann-Whitney. On
remarque que les patients LMMC diffèrent du groupe témoin de façon statistiquement
significatives sur 6 paramètres : PRDX2(1), PRDX3(1-2), PRDX1(1-2-3), GPX1(2),
PRDX5(2) et GLRX2(2).
Dans le Tableau 12 sont reprises les principales informations de dispersion de nos
différentes quantifications relatives en fonction des gènes étudiés pour les groupes AREB et
LMMC Ainsi que le résultat du test de Mann-Whitney. On remarque que les différences
observées entre les quantifications relatives sont statistiquement significatives, avec p≤0,05,
selon un test de Mann-Whitney pour cinq gènes : GLRX1(1-2), PRDX2(1), TXN, PRDX3(1-2)
et GPX1(2). Trois autres, GLRX3, GLRX2(2) et GLRX5 ont un p compris entre 0,05 et 0,1.
Ces résultats sont repris dans les boîtes à moustaches suivantes (Figure 3Figure 3 et Figure 4).
Dans la Figure 2 est représentée l’expression relative des différents gènes pour le
groupe LMMC et le groupe AREB.
46
Tableau 7 : Caractéristiques des patients étudiés.
AREB LMMC p= (T Student)
Effectif 9 9
Age (moyenne +/-
écart type)69 +/-13 67 +/-15 0,782
<70 ans 5 3
≥70 ans 4 6
Homme 4 5
Femme 5 4
Sous-type 0 WHO / 5
Sous-type 1 WHO 6 3
Sous-type 2 WHO 3 1
Hémoglobine g/L 97,2 +/-18,4 103,2 +/-24,3 0,564
≥100 g/L 4 4
≥80-100 g/L 4 4
<80 g/L 1 1
Plaquettes G/L 153 +/-175 69 +/-52 0,199
≥100 G/L 5 2
≥50-100 G/L 2 3
<50 G/L 2 4
Leucocytes G/L 5,1 +/- 5,4 14,7 +/-10,9 0,036
≥13 G/L 1 5
<13 G/L 8 4
Neutrophiles G/L 2,9 +/-3,3 6,7 +/-5,8 0,121
≥0,8 G/L 8 8
<0,8 G/L 1 1
Monocytes G/L 0,68 +/-1,17 5,18 +/-4,74 0,023
≥1 G/L 1 9
<1 G/L 8 0
Blastes sang
périphérique % 0,44 +/-0,53 0,11 +/-0,33 0,132
<2% 9 9
2 à <5 0 0
5 à < 10% 0 0
10 à < 20% 0 0
Blastes ponction
médullaire % 10 +/-5,24 1,67+/-3,39 0,001≤2% 0 7
>2 à <5% 1 0
5 à 10% 5 2
>10% 3 0
47
Tableau 8 : Classement des patients selon l'IPSS-R pour les AREB et le CPSS pour les LMMC
AREB LMMC
Faible / 5
Intermédiaire / 2
Haut / 2
Faible / 1
Intermédiaire 1 / 5
Intermédiaire 2 / 3
Haut / 0
Très bon 2 /
Bon 5 /
Intermédiaire 2 /
Mauvais 0 /
Très faible 0 /
Faible 4 /
Intermédiaire 2 /
Haut 3 /
Très haut 0 /
Stratification
cytogénétique du risque
LMMC
Groupe CPSS
Stratification
cytogénétique du risque
IPSS-R
Groupe IPSS-R
48
Tableau 9 : RQ LMMC vs moelle normale
Pati
ent
1P
atie
nt
2P
ati
ent
3P
ati
ent
4Pa
tien
t 5
Pati
ent
6P
atie
nt
7P
ati
ent
8P
ati
ent
9m
oye
nn
e
écar
t ty
pe
de
la
mo
yen
ne
mo
yen
ne
-
écar
t ty
pe
de
la
mo
yen
ne
mo
yen
ne
+
éca
rt t
ype
de
la
mo
yen
ne
SOD
21,
39
3,2
21
,35
0,7
40
,48
0,3
20
,37
0,2
11
,16
1,0
30,
31
0,7
11
,34
GSR
0,5
11
,25
0,9
40
,67
1,6
21,
16
1,3
50
,72
2,2
21
,16
0,1
80
,98
1,3
4
GLR
X1(1
-2)
1,0
01
,49
0,8
61
,01
1,0
30,
94
1,3
80
,72
1,0
11
,05
0,0
80
,97
1,1
3
PRD
X2
(1)
0,0
80
,06
0,1
00
,03
0,5
60,
32
0,4
70
,37
0,7
80
,31
0,0
90
,22
0,4
0
PRD
X5
(1-3
)0,
21
2,7
71
,74
0,8
80
,83
1,7
21
,09
1,0
55
,41
1,7
40,
52
1,2
32
,26
SOD
10,
16
1,3
81
,33
0,3
80
,96
1,2
90
,87
1,0
11
,82
1,0
20,
17
0,8
51
,19
TNX
0,4
22
,34
2,5
30
,98
1,7
91,
63
1,7
91
,26
2,0
41
,64
0,2
21
,42
1,8
6
PRD
X3
(1-2
)1,
10
3,6
72
,88
2,0
14
,48
4,0
62
,79
2,9
76
,11
3,3
40,
49
2,8
63
,83
CA
T1,
08
0,7
20
,93
0,3
9/
//
//
0,7
80,
10
0,6
80
,88
GPX
70,
32
4,9
41
,57
0,3
91
,86
1,1
51
,51
1,8
21
,25
1,6
50,
45
1,1
92
,10
GPX
1(1
)1,
13
1,0
23
,27
2,1
83
,96
10,
08
3,4
74
,58
29
,73
6,6
03,
03
3,5
79
,63
PRD
X1
(1-2
-3)
0,8
41
,63
5,3
01
,26
14,3
01
5,2
21
1,1
47
,82
33
,54
10,1
23,
45
6,6
61
3,5
7
GPX
4(1
-2-3
)0,
78
2,4
82
,69
0,6
11
,74
3,5
02
,17
1,0
31
2,6
23
,07
1,2
41
,83
4,3
1
GPX
32,
27
2,8
31
,16
0,6
50
,73
0,2
50
,79
0,4
60
,07
1,0
20,
31
0,7
11
,33
TXN
20,
68
1,6
80
,79
0,5
61
,89
2,2
82
,13
1,3
23
,29
1,6
20,
30
1,3
31
,92
PRD
X4
0,1
11
,11
2,1
70
,48
2,7
73,
53
2,9
23
,03
5,4
22
,39
0,5
51
,84
2,9
4
GPX
1(2
)1,
45
4,5
15
,46
2,1
83
,87
9,0
11
,26
2,4
59
,66
4,4
31,
04
3,3
95
,47
PRD
X5
(2)
0,3
55
,44
3,1
36
,61
2,0
45,
84
3,0
22
,65
14
,08
4,8
01,
34
3,4
66
,13
GLR
X30,
65
1,7
51
,25
1,3
91
,93
1,6
41
,72
1,3
32
,94
1,6
20,
21
1,4
11
,83
PRD
X2
(3)
0,2
30
,66
0,4
10
,48
1,6
42,
48
1,2
21
,35
2,4
01
,21
0,2
80
,93
1,4
9
GLR
X2(2
)1,
43
11
,18
14
,53
5,0
05
,91
9,4
04
,93
6,2
01
3,8
58
,05
1,4
86
,56
9,5
3
PRD
X6
11,
75
0,6
41
,35
8,8
50
,89
1,1
50
,76
0,6
81
,67
3,0
81,
39
1,6
94
,47
GLR
X50,
09
1,2
02
,10
0,2
60
,69
1,6
21
,01
1,4
52
,96
1,2
70,
30
0,9
61
,57
GLR
X2(1
)0,
60
0,2
90
,18
0,7
70
,69
/0
,31
1,0
4/
0,5
50,
10
0,4
50
,66
RQ
49
Tableau 10 : RQ AREB vs moelle normale
Pa
tien
t 10
Pa
tien
t 1
1P
ati
ent
12
Pa
tien
t 1
3P
ati
ent
14
Pa
tien
t 1
5P
ati
ent
16
Pa
tien
t 1
7P
ati
ent
18
mo
yen
ne
éca
rt t
ype
de
la
mo
yen
ne
mo
yen
ne
-
éca
rt t
ype
de
la
mo
yen
ne
mo
yen
ne
+
éca
rt t
ype
de
la
mo
yen
ne
SOD
20
,85
0,5
50
,20
0,0
70
,69
0,3
22
,13
0,9
20
,81
0,7
30
,20
0,5
20
,93
GSR
0,7
60
,33
0,5
90
,19
0,5
30
,82
1,1
51
,50
2,1
00
,88
0,2
00
,68
1,0
9
GLR
X1(1
-2)
0,5
00
,21
0,4
90
,10
0,9
60
,83
1,0
50
,35
0,4
60
,55
0,1
10
,44
0,6
6
PR
DX
2(1
)2
,30
0,2
00
,46
0,9
70
,32
0,3
90
,49
4,4
41
,25
1,2
00
,46
0,7
41
,66
PR
DX
5(1
-3)
1,7
60
,81
0,4
01
,06
2,8
41
,19
1,1
93
,72
0,4
31
,49
0,3
71
,12
1,8
6
SOD
11
,48
1,0
80
,43
0,6
01
,19
0,7
62
,74
6,0
80
,46
1,6
50
,60
1,0
42
,25
TX
N1
,59
0,4
60
,45
0,3
30
,93
1,4
21
,14
1,6
31
,49
1,0
50
,18
0,8
71
,22
PR
DX
3(1
-2)
0,6
30
,88
1,2
50
,31
0,6
01
,79
1,4
74
,26
1,2
91
,39
0,3
91
,00
1,7
8
CA
T3
,18
0,0
80
,15
0,1
80
,70
0,3
20
,99
1,2
10
,24
0,7
80
,33
0,4
51
,11
GP
X7/
1,2
90
,69
0,6
70
,78
0,8
01
,37
5,3
21
,52
1,5
50
,52
1,0
32
,07
GP
X1(1
)3
8,9
60
,16
0,0
51
,39
2,7
80
,22
13
,21
14
,56
0,5
87
,99
4,3
13
,68
12
,30
PR
DX
1(1
-2-3
)4
,59
0,5
90
,20
0,5
31
2,8
70
,77
7,5
65
8,8
10
,78
9,6
36
,31
3,3
21
5,9
5
GP
X4(1
-2-3
)1
0,7
60
,41
0,0
60
,68
2,1
20
,80
5,3
14
,37
0,5
92
,79
1,1
71
,62
3,9
6
GP
X31
,49
0,4
10
,66
0,4
51
,31
0,2
40
,43
0,2
31
,81
0,7
80
,20
0,5
90
,98
TX
N2
3,2
30
,45
0,2
50
,92
1,1
90
,79
2,8
54
,66
0,7
31
,68
0,5
11
,17
2,1
8
PR
DX
43
,31
1,2
40
,44
2,6
12
,55
0,9
34
,99
16
,43
0,4
63
,66
1,6
71
,99
5,3
3
GP
X1(2
)1
,96
0,4
30
,22
0,6
51
,15
0,5
63
,95
3,5
40
,69
1,4
60
,46
1,0
01
,93
PR
DX
5(2
)1
0,3
10
,29
0,6
52
,19
12
,09
1,8
25
,53
6,8
00
,36
4,4
51
,49
2,9
65
,94
GLR
X32
,18
0,0
20
,17
0,2
10
,90
0,4
71
1,9
30
,71
0,1
51
,86
1,2
80
,58
3,1
4
PR
DX
2(3
)3
,23
0,0
30
,83
1,0
60
,40
0,5
83
,66
5,0
00
,14
1,6
60
,61
1,0
52
,26
GLR
X2(2
)5
,40
0,1
70
,24
1,3
64
,10
5,2
21
0,8
79
,01
2,4
34
,31
1,2
53
,06
5,5
6
PR
DX
63
,83
0,2
21
,39
2,0
01
,49
0,2
61
2,9
82
,13
0,3
52
,74
1,3
41
,40
4,0
7
GLR
X58
,91
1,9
30
,25
1,9
05
,70
2,3
32
,80
3,2
40
,56
3,0
70
,90
2,1
73
,97
GLR
X2(1
)1
,58
0,7
00
,87
0,3
30
,26
1,3
10
,63
12
,45
1,8
32
,22
1,2
90
,93
3,5
1
RQ
50
Tableau 11 : Dispersion des ∆Ct pour les témoins sains vs patients LMMC
Normale LMMC Normale LMMC Normale LMMC Normale LMMC Normale LMMC Normale LMMC
Min 0,59 0,72 3,15 2,71 2,91 3,36 3,29 4,45 4,10 2,56 4,64 4,79
1er Quartile 1,83 1,98 3,42 3,43 3,46 3,90 3,71 5,17 4,10 4,20 5,05 5,24
Médiane 2,80 2,85 3,92 3,65 3,91 3,92 3,72 5,72 5,23 4,87 5,75 5,64
3ième Quartile 2,84 3,85 4,35 4,34 4,65 4,02 4,29 7,73 5,68 5,18 6,35 5,86
Max 3,98 4,66 4,45 4,82 4,75 4,41 5,45 9,02 5,87 7,27 6,48 8,32
p (Mann-Whitney)
Normale LMMC Normale LMMC Normale LMMC Normale LMMC Normale LMMC Normale LMMC
Min 4,77 4,32 4,47 3,09 4,88 5,92 5,40 5,96 4,36 2,16 5,46 2,07
1er Quartile 5,17 4,63 5,61 3,68 5,65 6,09 5,72 6,78 6,23 4,86 6,26 3,30
Médiane 5,81 4,82 5,93 4,13 6,33 6,32 5,91 7,28 6,73 5,26 6,93 4,17
3ième Quartile 5,97 5,32 6,19 4,22 6,50 6,73 6,59 8,11 8,84 5,93 7,64 6,43
Max 6,57 6,92 6,31 5,56 6,79 7,37 7,75 8,90 9,11 7,03 9,40 7,39
p (Mann-Whitney)
Normale LMMC Normale LMMC Normale LMMC Normale LMMC Normale LMMC Normale LMMC
Min 5,40 3,64 6,92 6,37 6,86 6,25 7,07 6,27 7,23 5,96 8,79 6,55
1er Quartile 6,87 5,87 7,76 7,65 7,62 6,88 8,68 7,11 8,90 6,78 9,07 7,82
Médiane 7,40 6,18 7,98 8,32 8,30 7,23 8,71 7,24 9,80 7,28 10,58 8,72
3ième Quartile 8,26 7,25 8,18 9,00 8,49 8,31 9,08 8,56 10,00 8,11 11,21 8,96
Max 8,56 8,00 8,50 11,66 8,58 8,81 10,00 11,94 10,23 8,90 12,18 11,86
p (Mann-Whitney)
Normale LMMC Normale LMMC Normale LMMC Normale LMMC Normale LMMC Normale LMMC
Min 8,71 8,93 10,18 10,50 10,59 7,97 10,87 9,09 11,26 11,11 12,41 13,25
1er Quartile 9,80 9,68 11,99 11,10 11,09 8,35 12,15 11,91 12,57 11,98 12,88 13,77
Médiane 10,66 9,77 12,32 11,52 11,65 9,20 12,85 12,45 12,67 12,42 13,11 14,04
3ième Quartile 11,20 10,08 12,35 12,87 11,77 9,51 13,28 13,05 12,73 13,21 13,78 15,05
Max 12,06 11,11 12,42 13,96 14,06 11,32 14,09 13,30 14,15 16,16 14,36 15,82
p (Mann-Whitney)
SOD 2 GSR GLRX1(1-2) PRDX2(1) PRDX5(1-3) SOD1
0,182 0,004
GPX4(1-2-3) GPX3
0,438 1,000 1,000 0,007 0,593 0,898
0,240 0,518 0,438 0,298 0,028
PRDX1(1-2-3)
0,042
PRDX5(2)
TXN PRDX3(1-2) CAT GPX7 GPX1(1)
GLRX3 PRDX2(3) GLRX2(2) PRDX6 GLRX5
0,073
0,556 0,518 0,147 0,042
GLRX2(1)
TXN2 PRDX4 GPX1(2)
0,298 0,898 0,004 0,518 0,797
51
Tableau 12 : Dispersion des RQ en fonction du gène cible pour le groupe AREB vs LMMC
AREB LMMC AREB LMMC AREB LMMC AREB LMMC AREB LMMC AREB LMMC
Min 0,072 0,210 0,186 0,514 0,101 0,720 0,203 0,033 0,405 0,207 0,428 0,158
1er Quartile 0,317 0,368 0,533 0,716 0,345 0,943 0,390 0,080 0,815 0,879 0,604 0,867
Médiane 0,688 0,737 0,757 1,155 0,486 1,011 0,494 0,324 1,186 1,091 1,076 1,010
3ième Quartile 0,851 1,346 1,147 1,345 0,830 1,025 1,250 0,474 1,761 1,742 1,478 1,329
Max 2,126 3,217 2,097 2,216 1,047 1,491 4,444 5,411 3,722 5,411 6,080 1,820
p (Mann-Whitney)
AREB LMMC AREB LMMC AREB LMMC AREB LMMC AREB LMMC AREB LMMC
Min 0,330 0,417 0,313 1,100 0,078 0,394 0,674 0,323 0,052 1,018 0,202 0,839
1er Quartile 0,456 1,264 0,634 2,793 0,175 0,636 0,758 1,150 0,223 2,181 0,587 1,630
Médiane 1,139 1,788 1,255 2,973 0,317 0,822 1,042 1,507 1,385 3,468 0,778 7,825
3ième Quartile 1,493 2,039 1,466 4,061 0,993 0,964 1,405 1,818 13,214 4,576 7,558 14,301
Max 1,634 2,531 4,263 6,114 3,182 1,077 5,322 4,945 38,962 29,733 58,810 33,544
p (Mann-Whitney)
AREB LMMC AREB LMMC AREB LMMC AREB LMMC AREB LMMC AREB LMMC
min 0,063 0,613 0,231 0,072 0,253 0,558 0,443 0,107 0,225 1,259 0,293 0,354
1er Quartile 0,594 1,034 0,415 0,456 0,732 0,789 0,927 1,107 0,558 2,180 0,650 2,650
Médiane 0,802 2,170 0,452 0,731 0,924 1,676 2,551 2,766 0,694 3,869 2,190 3,127
3ième Quartile 4,371 2,686 1,309 1,162 2,848 2,129 3,313 3,027 1,962 5,456 6,802 5,840
max 10,763 12,623 1,813 2,830 4,659 3,294 16,427 5,419 3,950 9,660 12,091 14,084
p (Mann-Whitney)
AREB LMMC AREB LMMC AREB LMMC AREB LMMC AREB LMMC AREB LMMC
min 0,019 0,650 0,027 0,226 0,171 1,430 0,217 0,638 0,252 0,090 0,258 0,175
1er Quartile 0,171 1,325 0,398 0,481 1,359 4,996 0,353 0,757 1,901 0,691 0,628 0,298
Médiane 0,467 1,643 0,832 1,224 4,099 6,199 1,492 1,147 2,326 1,198 0,865 0,600
3ième Quartile 0,902 1,750 3,231 1,638 5,396 11,175 2,126 1,668 3,240 1,620 1,578 0,726
max 11,926 2,940 5,000 2,483 10,868 14,530 12,978 11,745 8,914 2,961 12,449 1,041
p (Mann-Whitney)
0,047 0,008 0,414 0,606 0,387 0,113
0,063 0,513 0,063 0,931 0,094 0,114
0,436 0,546 0,730 0,931 0,008 0,666
SOD 2 GSR GLRX1(1-2) PRDX2(1) PRDX5(1-3) SOD1
TXN PRDX3(1-2) CAT GPX7 GPX1(1) PRDX1(1-2-3)
0,489 0,258 0,008 0,050 1,000 0,796
GPX4(1-2-3) GPX3 TXN2 PRDX4 GPX1(2) PRDX5(2)
GLRX3 PRDX2(3) GLRX2(2) PRDX6 GLRX5 GLRX2(1)
52
Figure 2 : Expression relative des différents gènes pour les groupes LMMC et AREB.
En abscisse les différents gènes cibles, en ordonné les quantifications relatives par rapport à des moelles normales. La courbe en haut en gras représente les valeurs moyennes des quantifications relatives pour le groupe LMMC, la courbe en bas en gras représente les valeurs moyennes des quantifications relatives pour le groupe AREB. Une valeur de 1 correspondant à une quantification identique entre la pathologie considérée et la moelle normale.
53
Figure 3 : Dispersion des différentes Quantifications Relatives avec une différence statistiquement significative entre les groupes AREB et LMMC
54
Figure 4 : Dispersion des différentes Quantifications Relatives avec une différence statistiquement non-significative (0,05<p<0,1) entre les groupes AREB et LMMC
55
IV. Discussion
Nous avons cherché dans ce travail à mettre en évidence une signature de
l’antioxydogramme différente pour les AREB et les LMMC. Nous avons dans un premier
temps comparé les antioxydogrammes de moelles osseuses normales avec les
antioxydogrammes de patients LMMC. Après analyse statistique il apparait que 6 gènes cibles
sont exprimés de façon différentes entre ces 2 groupes, à savoir : PRDX2(1) dont l’expression
est diminué et, PRDX3(1-2), PRDX1(1-2-3), GPX1(2), PRDX5(2) et GLRX2(2) dont
l’expression est augmentée. On peut ainsi affirmer que la gestion de l’équilibre oxydatif est
différente entre les moelles normales et les moelles de patients LMMC, sans que l’on puisse
présumer des différentes voies de régulation en action sous-jacentes. Cependant certain
d’entre eux comme PRDX2 ont déjà été décrit comme impliqué dans diverse hémopathies
malignes. Ainsi, on retrouve par exemple PRDX2 qui est surexprimé dans les lymphomes B
de type Burkitt (37) et dont l’inhibition est responsable in vitro d’un taux de prolifération
moindre. PRDX2 est aussi surexprimé dans les polynucléaires neutrophiles des patients avec
une CRDM (38). Il a aussi été noté que dans les LAM la région promotrice du gène PRDX2
avait souvent un défaut d’acétylation des histones 3 avec pour conséquence une diminution de
l’expression de PRDX2. Ceci corrélait avec un pronostic plus sombre pour ces LAM (39). De
plus Harris et al. ont démontré que le glutathion (GSH), l’un des plus puissant système anti-
oxydant intra cellulaire, était indispensable dans l’initiation d’un cancer mais non dans une
tumeur établie et ceci partiellement due à une augmentation d’un autre système anti-oxydant
la thioredoxine (TXN). Enfin ils démontrent l’impact négatif de l’inhibition du système GSH
et TXN sur la croissance tumorale (40). Le système TXN est aussi un pivot de maintien de
l’équilibre redox d’une cellule et il est impliqué dans la régulation de facteur de transcription
tel que FOXO4, NFκB, FOXO1. L’équilibre redox n’est plus seulement envisagé comme
système simpliste : excès de ROS conduisant à un risque accrue de modification de l’ADN et
donc participant à l’oncogenèse mais plus comme un système excessivement complexe et
encore aujourd’hui mal compris dont les voies métaboliques et de signalements peuvent être
détournés par les cellules tumorale afin d’obtenir un gain de survie. Ceci étant un phénomène
dynamique avec des étapes clés a différents moments. L’antioxydogramme se propose comme
un outil pour photographier le niveau d’expression de ces différents acteurs afin d’identifier
des signatures différentes.
Ensuite nous avons comparé les moelles osseuses de patient AREB aux moelles
osseuses de patient LMMC. Après analyse statistique il apparait que 5 expressions de gènes
sont différentes avec un p≤0,05 à savoir GLRX1(1-2), PRDX2(1), TXN, PRDX3(1-2) et
GPX1(1-2). Cependant, les différences qui existent sont de faible amplitude et il existe des
zones de chevauchement entre les deux groupes. On notera que la petite taille des groupes est
un obstacle pour l’établissement d’une corrélation forte. Initialement PRDX2(1) et GLRX5
étaient pressentis comme de bons candidats du fait des travaux précédents menés par
C .Vignon (1). Ces résultats ne sont pas confirmés pour GLRX5, bien que l’on observe des
tendances différentes entre les deux groupes (Figure 4) et un p compris entre 0,1 et 0,05.
56
Compte-tenu de ces éléments l’antioxydogramme pourrait être utile dans les cas complexes
pour discriminer AREB et LMMC.
L’antioxydogramme se présente comme un outil novateur permettant de mettre en
évidence l’état des éléments de réponse au stress oxydatif qui est un déterminant majeur de la
niche hématopoïétique et de la niche leucémique. Il fournit ainsi une photographie des
éléments transcriptionnels de réponse au stress oxydatif.
57
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60
Vu, le Directeur de Thèse
Vu, le Doyen
de la Faculté de médecine de TOURS
61
62
Thèse 2015 – 2016
D O C T O R A T e n M E D E C I N E
Diplôme d’Etat
D.E.S. de Biologie médicale Présentée et Soutenue le 29/06/2016
NOM : HOUSSIN Prénoms : Clément Georges Raymond Date de naissance : 26/08/1985 Nationalité : Français Lieu de naissance : Angers (49) Domicile : 12 rue du pin, 44300 Nantes Téléphone : 06.87.78.61.75 Directeur de Thèse : Pr HERAULT Olivier Titre de la Thèse : Modification du métabolisme oxydatif dans les LMMC et les AREB
JURY Président : Pr GYAN Emmanuel, Professeur des Universités, Praticien Hospitalier, CNRS, TOURS
Membres : Pr HERAULT Olivier, Professeur des Universités, Praticien Hospitalier, CNRS, TOURS Pr DOMENECH Jorge, Professeur des Universités, Praticien Hospitalier, TOURS Pr VOURC’H Patrick, Professeur des Universités, Praticien Hospitalier, TOURS Dr LACHOT Sébastien, Praticien hospitalier, TOURS Dr RAULT Emmanuelle, Praticien hospitalier, TOURS Dr HALTY Christelle, Ingénieur CHU, Docteur en Biologie-Santé Avis du Directeur de Thèse Avis du Directeur de l’U.F.R. à Tours, le Signature Signature
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RESUME Introduction : En utilisant le brevet WO2012085188 A1 du 28 juin 2012 «Method for diagnosing hematological disorders» (caractérisation à visée diagnostique de l’expression des gènes antioxydants, signature antioxydante dans les hémopathies ou «antioxydogramme») » (Hérault O, Vignon C, 2012) nous avons évalué le profil des gènes antioxydants de moelles osseuses de patients atteints de leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC) et d’anémie réfractaire avec excès de blastes (AREB) issue de patients du CHRU de Tours, avant intervention thérapeutique. Nous avons recherché un profil spécifique pour la LMMC versus des moelles normales puis nous avons cherché à mettre en évidence une différence entre le profil LMMC et le profil AREB Moyens et méthodes : 9 moelles osseuses de patients LMMC et 9 AREB ont été analysées avec quantification relative de 24 gènes impliqués dans le métabolisme oxydatif par RT-qPCR. Les résultats de ces quantifications ont été soumis à un test de Mann Whitney pour vérifier que les différences observées étaient statistiquement significatives. Résultats : Les quantifications de PRDX2(1), PRDX3(1-2), PRDX1(1-2-3), GPX1(2), PRDX5(2) et GLRX2(2) sont significativement différents entre le groupe LMMC et les témoins sains. Les quantifications relatives de GLRX1(1-2), PRDX2(1), TXN, PRDX3(1-2) et GPX1(2) sont significativement différentes entre le groupe LMMC et le groupe AREB. Discussion : L’antioxydogramme est un outil novateur pour étudier la réponse antioxydante des cellules médullaires de LMMC et d’AREB.
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Académie d’Orléans – Tours Université François-Rabelais
Faculté de Médecine de TOURS
HOUSSIN Clément Georges Raymond 64 pages – 12 tableaux – 4 figures Résumé : Introduction : En utilisant le brevet WO2012085188 A1 du 28 juin 2012 «Method for diagnosing hematological disorders» (caractérisation à visée diagnostique de l’expression des gènes antioxydants, signature antioxydante dans les hémopathies ou «antioxydogramme») » (Hérault O, Vignon C, 2012) nous avons évalué le profil des gènes antioxydants de moelles osseuses de patients atteints de leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC) et d’anémie réfractaire avec excès de blastes (AREB) issue de patients du CHRU de Tours, avant intervention thérapeutique. Nous avons recherché un profil spécifique pour la LMMC versus des moelles normales puis nous avons cherché à mettre en évidence une différence entre le profil LMMC et le profil AREB Moyens et méthodes : 9 moelles osseuses de patients LMMC et 9 AREB ont été analysées avec quantification relative de 24 gènes impliqués dans le métabolisme oxydatif par RT-qPCR. Les résultats de ces quantifications ont été soumis à un test de Mann Whitney pour vérifier que les différences observées étaient statistiquement significatives. Résultats : Les quantifications de PRDX2(1), PRDX3(1-2), PRDX1(1-2-3), GPX1(2), PRDX5(2) et GLRX2(2) sont significativement différents entre le groupe LMMC et les témoins sains. Les quantifications relatives de GLRX1(1-2), PRDX2(1), TXN, PRDX3(1-2) et GPX1(2) sont significativement différentes entre le groupe LMMC et le groupe AREB. Discussion : L’antioxydogramme est un outil novateur pour étudier la réponse antioxydante des cellules médullaires de LMMC et d’AREB. Mots clés : -LMMC -Peroxirédoxine -ROS -AREB -Glutarédoxine -Espèces réactives de l’oxygène -Oxydatif -Glutathion Peroxydase Jury : Président : Monsieur le Professeur GYAN Emmanuel Membres : Monsieur le Professeur HÉRAULT Olivier Monsieur le Professeur DOMENECH Jorge Monsieur le Professeur VOURC’H Patrick Monsieur le Docteur LACHOT Sébastien Madame le Docteur RAULT Emmanuelle Madame le Docteur HALTY Christelle
Date de la soutenance : 29 juin 2016