Expression du système endothéline et effet sur la prolifération dans la

muqueuse et le bulbe olfactif de rat

Réunion BoB du 19 mai 2010Présentation par Arthur de Fouchier

Système endothéline :3 peptides connus : Et-1, Et-2, Et-32 RCPG : EtA et EtBAntagonistes : Bq788 et Bq123 (respectivement) Synthèse sous forme de prépro-Et, clivés par furine pour donner Big-Et puis clivés par Ece-1 pour donner les Et actives.

Effet Vasoconstricteur dans un nombre important de tissusNotamment système nerveux

Maria Vidovic et al (2008) et Wei-Min Zhang et al (2008) : Preuves d’effets prolifératifs et anti-apoptotique de l’endothéline sur différent tissus et cellules

Rappel des données :

Mac Cumber et al (1989) :Expression de recepteurs à l’endothéline dans la muqueuse olfactive d’embryons de rats

Rappel des données :

ET binding sites in the 19-day rat fetus.(B) ET binding Sites.Cb, cerebellum; H, heart; I, intestine; Li, liver; Lu, lung; M, meninges; NM, nasal mucosa; P, penis.

Rappel des données :Système endothéline est exprimé dans les cellules de la

muqueuse olfactive

Endothelin-related mRNAs from adult rats OM (OM adult), and newborn rats (P0–P7) OM cells prepared at the time of culture (0 DIV), or after 7 and 17 days in vitro (7 and 17 DIV) (n3 independent cultures for each). PCR products for ETA, ETB, ECE-1, ET-1 and ET-3 mRNAs were detected on 1.5% agarose gels stained with Ethidium Bromide. Negative controls consisting of PCR without DNA matrix were systematically performed (C lane).

Résultats Immunohistochimie :

Cellules non-neuronales

Neurones

Neurones

Elodie Gouadon et al. (2010)

Rappel des données :Elodie Gouadon et al. (2010) :

Preuves d’effets de l’endothéline sur des cultures primaires de muqueuse olfactive.

(Graph?/ Schéma)Iman Laziz (Publication en cours) :

Preuves d’effets anti-apoptotique de l’endothéline.

Et-AEt-A

Et1Et-BEt-B

Et1

Et-BEt-BEt1

Et-Et-AA

Et1

Questions posées par ces données

Sites de synthèse de l’endothéline et de l’enzyme de conversion dans la MO?

Types cellulaires?

Effets de l’endothéline sur la prolifération des cellules de la MO?

Matériels et méthodesHybridations In Situ pour Et-1, Et-3 et Ece-1 sur des coupes de

muqueuses olfactives, et de bulbe olfactif. Contrôle par OMP.Préparation des sondes :

PCR à partir d’ADN génomique de rat et d’amorces spécifiquesLigation avec plasmides pGEMtTransfection dans bactérie Xl2-blueExtraction plasmidesSynthèse sondes par transcription in vitro Dig-dUTP (Sp6, T7)

Contrôle marquages des sondes :

Matériels et méthodes

Hybridation in situ de sondes OMP7 sur des coupes de muqueuse olfactive et de

bulbe olfactif de ratCtrl : sans sonde

S : Hybridation avec sondes sens.A-S : Hybridation avec sondes anti-sens.

BO : Bulbe OlfactifMi : Cellules Mitrales

EPL : Zone Plexiforme ExterneGl : Glomerules

MO : Muqueuse olfactiveSM : Sous-muqueuse

CN : Cavité NasaleEO : Epithélium Olfactif

Test protocole d’HIS :

Le transcrit OMP est bien détecté dans la MO par le protocole d’HIS utilisé.

CN

EO

SM

Mi

EPL

Gl

BO

MO

Résultats – HIS ET-1

Hybridation in situ de sondes Et-1 sur des coupes de muqueuse olfactive et de bulbe olfactif de rat. Ctrl : sans sonde, S : Hybridation avec sondes sens,A-S : Hybridation avec sondes anti-sens.

Le transcrit Et-1 est présent au niveau apical et médian de l’EO.Dans le BO, l’expression du transcrit Et-1 est détectée au niveau des cellules periglomérulaires. Le marquages des cellules mitrales semble peu spécifique.

MOBO

Résultats – HIS Et-3

On observe surtout un marquage non-spécifique.Mélange sonde suspecté ou expression d’Et-3 dans les deux sens?

Hybridation in situ de sondes Et-3 sur des coupes de muqueuse olfactive et de bulbe olfactif de rat. Ctrl : sans sonde, S : Hybridation avec sondes sens, A-S : Hybridation avec sondes anti-sens.

MO

BO

Résultats – HIS Ece-1Dans l’EO, le transcrit Ece-1 est exprimé dans une majorité des cellules medianes.Dans le BO, le marquage avec Ece-1 semble spécifique seulement au niveau des cellules periglomérulaires

Hybridation in situ de sondes Ece-1 sur des coupes de muqueuse olfactive et de bulbe olfactif de rat. Ctrl : sans sonde, S : Hybridation avec sondes sens, A-S : Hybridation avec sondes anti-sens.

MO BO BO

Résultats – Cultures CellulairesCultures cellulaires Cultures type « Denise »

Etude prolifération :3H-T

Mesure chiffrée de la prolifération.BrdU

Quantification du pourcentage de cellules en phase S.

Ki67Antigène marqueur de prolifération.

RésultatsQuantification prolifération par 3H-T:

Résultats

Cultures en boites B12 : Aucun effet prolifératif de l’endothéline dans les conditions expérimentales.Effet prolifératif des Bq?

Soit, l’endothéline a des effets anti-prolifératifs et il y a une production locale d’endothéline saturante.

Soit l’endothéline a des effets différentiateur.Soit Bq a un effet sur une autre voie.

Cultures en boites P96 :Cultures se développent bienEn sérum 10% : Et-1 et Bq ont un effet prolifératif.En sérum 2%, Et-1 semble avoir un effet négatif sur la prolifération

Théorie différentiation

Résultats

Marquage BrdU sur culture de 7J

Marquage Ki67 sur culture de 7J

Aucune analyse pour le moment

PerspectivesExpression du système endothéline :

HIS avec co-marquageFISH + Immunohistochimie par fluorescenceco-marquage avec réactions colorimétriques

Marquage de coupes successivesUne coupe HISUne coupe immunofluorescence avec marqueurs de types

cellulaires

Effets sur la prolifération :Besoin de confirmer les résultats par d’autres culturesTest théorie différentiation par marquages en immunofluorescence de cultures